UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOLOGA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA CELULAR

Factibilidad del vector de expresin de pTREX-GFP5(S65T) como

herramienta para la obtencin de lneas fluorescentes estables de

Trypanosoma evansi

Presentado por:

Br. Ali Agudelo

Tutoras: Dra. Palmira Guevara

Dra. Nereida Parra

LABORATORIO DE GENTICA MOLECULAR

IBE-UCV

LABORATORIO DE FISIOLOGA DE PARASITOS

IVIC/MPPEUCT

Caracas, Julio 2015

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____________________________________________________RESUMEN

La Tripanosomiasis animal causada por Trypanosoma evansi es una enfermedad que

presenta una distribucin amplia, extendindose en el sur y centro de Amrica, frica, el

sudeste asitico (Lun y Desser, 1995). La evolucin de la enfermedad causada por T. evansi

vara considerablemente de acuerdo con la susceptibilidad del hospedador y la virulencia de

la cepa. Los sntomas se caracterizan por fiebre y anemia en la fase aguda, seguido de

emaciacin, edema, caquexia y aumento del tamao de los ndulos linfticos y del bazo en

la fase crnica (Luckins y col. 1999).

La aplicacin de herramientas de gentica reversa se plantea como un avance en el objetivo

de estudiar las relaciones parsito-hospedador, la posibilidad de la invasin de clulas del

husped, caracterizar el tropismo del parasito en los distintos rganos del husped y

tambin, si la evaluacin de la efectividad de drogas tripanocidicas in vivo como in vitro

sera ms eficiente que mediante las tcnicas disponibles actualmente. Esto se plantea

mediante la produccin de lneas fluorescentes estables en Trypanosoma evansi.

La transfeccin de los parsitos se har usando el plsmido pTREXn-GFP5(S65T) el cual

posee como marcador selectivo la resistencia a la gentamicina y como gen reportero la

protena verde fluorescente. Para ello se deber primero estimar el IC50 a la gentamicina y

estandarizar el protocolo de transfeccin.

El objetivo del trabajo sera evaluar entonces la factibilidad de transfectar T. evansi con un

plsmido diseado para T. cruzi apelando a la potencia de la presin selectiva como

promotor de la insercin del ADN exgeno al ADN cromosomal del parsito.

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___________________________________________1._INTRODUCCIN

Las enfermedades tropicales desatendidas han ganado la atencin de lo pases potencias

econmicas en los ltimos aos. Estas enfermedades son causadas por parsitos, bacterias o

virus, considerados hasta hace poco como aquellas para las cuales el financiamiento a la

investigacin escasea en relacin al impacto de las patologas producidas (WHO 2010). La

tripanosomiasis humana, animal y la leishmaniasis, causada por protozoarios parsitos de la

familia trypanosomatidae, son algunas de estas enfermedades tropicales desatendidas, todas

con un impacto socioeconmico alto.

1.1 Tripanosomiasis animal por Trypanosomaevansi.

La tripanosomiasis causada por Trypanosoma evansi presenta una distribucin amplia,

extendindose en el sur y centro de Amrica, frica, el sudeste asitico (Lun y Desser,

1995). En Venezuela,la tripanosomiasis atribuida a T. evansi est ampliamente distribuida

en diferentes regiones del pas, existen reportes de una seroprevalencia de 40% en caballos

criollos de 3 hatosdel estado Apure (Forlano y col. 2011)

Esta parasitosis afecta una variedad de animales domsticos (caballos, bfalos,

bovinos, camellos y perros), as como a la fauna silvestre, siendo el chigire o capibara

(Hydrochoerus hydrochaerus) uno de los reservorios del parsito en Amrica del Sur.(Arias

y col. 1997). La evolucin de la enfermedad causada por T. evansi vara considerablemente

de acuerdo con la susceptibilidad del hospedador y la virulencia de la cepa (Brun y col.

1998). En el continente americano la enfermedad es ms severa en caballos, bfalos y

perros; mientras que los bovinos son afectados de una forma moderada. Por otro lado en

frica los camellos son ms afectados. Los cuadros clnicos de esta tripanosomiasis se

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caracterizan por fiebre y anemia en la fase aguda, seguido de emaciacin, edema, caquexia

y aumento del tamao de los ndulos linfticos y del bazo en la fase crnica (Luckins y col.

1999).

El parsito es transmitido por insectos hematfagos de los gneros Tabanus,

Stomoxys, Atylotus y Lyperosia (Hoare, 1972). Tambin puede transmitirse por va oral

mediante la ingestin de carne o sangre contaminada y por murcilagos vampiros

(Desmodus rotundus) (Losos y col., 1986). En el murcilago el parsito puede pasar por la

mucosa oral y desarrollar la fase crnica de la enfermedad manteniendo niveles de

parasitosis que facilitan la dispersin de transmisin a travs de grandes distancias en

periodos cortos de tiempo, hecho imposible en la transmisin mediante la mosca, debido a

que la infectividad disminuye a medida que se seca el contenido estomacal del insecto.

1.2 Ciclo de vida.

El ciclo de vida de T. evansi es simple, ya que solo interviene un vector y el

hospedador, sin cambios morfolgicos del parsito en ninguno de stos. La transmisin es

fundamentalmente mecnica. Durante la picadura o mordedura del vector, dependiendo si

el vector es un insecto o un murcilago, el parsito pasa desde las partes bucales, hacia el

torrente sanguneo del hospedador donde contina su multiplicacin por fisin binaria

(figura 1). El ciclo se completa cuando el hospedador es nuevamente picado o mordido y el

vector extrae sangre contaminada con tripanosomas que sern inoculados en otro animal

durante la prxima picadura/mordedura (Parra 2011).

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En algunos animales silvestres como los chigires o capibaras no se evidencian signos

clnicos de la enfermedad, por lo que pueden ser considerados como reservorios del

parsito (Arias y col.1997).

An cuando T. evansi es consideradoun patgeno nicamente para animales, recientemente

se han reportado casos de infecciones en humanos en el continente asitico (Joshiy col.

2005).

Figura 1. Esquema del ciclo de vida de Trypanosomaevansi.Tomada conmodificaciones de

http://www.vet.uga.edu/VPP/clerk/womack/index.php

T. evansi solo presenta las formas sanguneas que son similares de los tripomastigotes de

T. brucei. La especie generalmente es monomrfica por lo tanto las cepas de distintas reas

geogrficas y diferentes huspedes son indistinguibles, estos tripanosomas de forma

alargada miden entre 1433 m de largo con un ancho de 1.52.2 m. Los tripomastigotes

poseen un flagelo libre y un kinetoplasto pequeo subterminal (Hoare, 1972).

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1.3Taxonoma y relaciones filogenticas

Los tripanosomas son parsitos obligatorios de todas las clases de vertebrados y son

transmitidos generalmente por vectores artrpodos y sanguijuelas. Hoare en 1972

subdividi los tripanosomas de mamferos en dos secciones Salivaria y Estercoraria

dependiendo de su modo de desarrollo en el vector. El grupo como un todo es caracterizado

por presentar variacin antignica, fenmeno estudiado en las especiesde T. brucei, T.

evansi, T. equiperdum, T. vivax, entre otras. Tambin se ha hecho un esfuerzo enorme en

identificar cepas morfolgicamente idnticas de los tripanosomatidos indirectamente

mediante la caracterizacin de isoenzimas y directamente comparando polimorfismos entre

secuencias de ADN del kinetoplasto y nuclear (Stevens y col. 2001) concluyendo que el

gnero Trypanosoma representan un grupo monofiletico y que T.evansi y T. equiperdum

son derivados recientes de T. brucei. Esto concuerda con los resultados obtenidos de la

reciente secuenciacin del genoma nuclear de T. evansi y el anlisis comparativo con la

cepa de referencia de T. b. brucei ha mostrado que 94.9% de las secuencias codificantes

propuestas (CDS) tienen un ortlogo en T. evansi, y que 94.6% de los ortlogos no

repetitivos tienen una identidad nucleotdica igual o mayor al 95%, revelando una extensiva

similaridad con T. brucei, apoyando al argumento que propone clasificar a T. evansi como

una subespecie de T. brucei.(Carnes y col. 2015)

El anlisis del ADN del kinetoplasto de T. evansi ha mostrado que los minicrculos son

homogneos, atribuido a la ausencia de reproduccin sexual y evidenciado la ausencia de

maxicrculos, lo que implica una prdida de la capacidad del parsito de realizar la

fosforilacin oxidativa impidiendo la generacin de ATP. En consecuencia no es posible el

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desarrollo del T. evansi en la mosca tse-ts impidiendo la transmisin por este vector.

(Borst y col., 1987)

1.4 Genoma, gentica y expresin en tripanosomtidos, el caso de T. evansi

El genoma de T. evanside 25,43 Mpb, recientemente reportado por Carnes y col,

(2015), est distribuido en 13 cromosomas y 100 minicromosomas de 50 a 100 kb. Se han

identificado 8.919 genes codificantes de protenas, 1.190 pseudogenes y 65 genes de ARN

de transferencia. Los minicromosomas se caracterizan por portar los genes de las variantes

de las glicoprotenas de superficie (VSGs) (Gibson 1999) y por la presencia de elementos

altamente repetitivos o copias de ADN satlite de 177-500 pb de tamao En la mayora de

los eucariotas la polimerasa I es la encargada de transcribir los RNA ribosomales, la

polimerasa II los ARN mensajeros y los ARN pequeos no codificantes y la polimerasa III

transcribe los ARN de transferencia. T.evansi al igual que otros tripanosomas, emplea la

polimerasa I para transcribir las protenas VSG (Clayton y col. 2002). Este proceso debe ser

regulado con precisin para que se exprese solamente una variante en cada parsito.

En cuanto a la expresin, en los tripanosomtidos el genoma generalmente diploide

est organizado en agrupaciones de genes en tndem (policistrnicos), con decenas a

cientos de secuencias codificadoras de protenas libres de intrones, no relacionadas en

funcin, organizadas secuencialmente en la misma hebra y mantenidas separadas entre s

por secuencias intergnicascortas (IS) (El-Sayed y col. 2005). Estos arreglos son transcritos

por la RNA polimerasa II dando como resultado transcritos policistrnicos. A diferencia de

los operones bacterianos que contienen genes relacionados con un mismo proceso

biolgico, estas unidades transcripcionales de los tripanosomtidos no tienen relacin

aparente. Adems pueden mostrar diferentes patrones de expresin a pesar de estar todos

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codificados en un mismo policistrn (Berriman y col. 2005). La maduracin de los mRNA

involucra reacciones de trans-splicing (Figura 2).El complejo trans-spliceosomal es

responsable de la poliadenilacin del gen aguas arriba y la adicin del splice leader (SL),

primero separando mRNAs individuales de los transcritos primarios policistrnicos, para

seguidamente aadirun segmento corto 39 nucletidos de RNA con un residuo metilado

llamado cap, al extremo 5 del gen aguas abajo. Esta reaccin de transesterificacin

requiere la presencia de un dinucletido AG aceptor del splicingo edicin en el extremo

3 de la regin intergnica del pre-RNA, conocido como sitio de empalme (splice-site),

donde se lleva a cabo la adicin de la secuencia lder (Liang y col. 2003). Debido a este

mecanismo inusual de produccin de mRNAs, el sitio de inicio de la transcripcin parece

ser poco importante para la regulacin gentica. Incluso pareciera que la transcripcin por

parte de la polimerasa II es constitutiva (Martinez-Calvillo y col. 2003).

Las secuencias intergnicas son la fuente de las regiones no transcritas o

untranslated regions (UTR) las cuales determinan la estabilidad del mRNA, as como la

eficiencia de traduccin.La expresin de genes, ya sea en etapas especficas del desarrollo o

de forma constitutiva, est en su mayora definida por las secuencias intergnicas de

manera post-transcripcional (Clayton y col.2002).

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Figura 2. Mecanismo de trans-splicing para el procesamiento de ARNmmonocistrnico en

tripanosomtidos.

(A) El sitio de corte GU 5 en el RNA del splice leader y el aceptor3 AG en el pre-mRNA estn indicados.

BP, branchpoint;Py segmento polipirimdinico. El valo oscuro en el extremo 5del RNA del SL indica la

estructura cap. (B)Reaccion de transesterificacin(C) El resultado de la transesterificacin es un ARNm

maduro concapping y poliadelinacin y un ARN ramificado que ser degradado. SS: Splicig site; Py: Track

de pirimidinas; SL: splice leader.(tomado con modificaciones de Liang 2003).

1.5. Herramientas genticas.

Aplicar la gentica clsica no es posible en T. evansi ya que al igual que otras

especies de kinetoplastidios, la reproduccin sexual en los tripanosomas es muy poco

frecuente, representando una limitacin para el abordaje a los estudios genticos.En

consecuencia,el enfoque que debe aplicarse es la gentica reversa.

La gentica reversa es un enfoque viable gracias a la tecnologa del ADN recombinante.

Trabaja en la direccin opuesta de la gentica clsica ya que se comienza a partir de una

protena o ADN del gen sobre el cual no se tiene informacin y entonces se busca la

B

C

Y- structuraintermedia

Primer paso.

Segundo paso.

ARNm

Degradacin

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manera de obtener un gen mutante, logrando luego un fenotipo mutante. Algunas

herramientas de la gentica reversa incluyen: la transfeccin estable o temporal con

vectores de expresin utilizando promotores homlogos y genes de resistencia a

antibiticos para la seleccin (ejemplo el gen de la neomicin fosfotransferasa que confiere

resistencia al antibitico G418), la expresin condicional de genes utilizando elementos

regulatorios heterlogos como la polimerasa del virus T7 y el gen represor del opern de la

tetraciclina, la produccin de mutantes por desplazamiento del gen salvaje a travs del

knockout del gen mediante recombinacin, el ARN de interferencia (RNAi), el rescate

funcional de mutantes mediante complementacin con el gen salvaje, la mutagnesis

mediada por transposones (Cross, 2008).

Buena parte de este conjunto de herramientas ha sido desarrollado para el estudio de los

tripanosomtidos (Tabla 1) permitiendo el anlisis funcional degenes, para evaluar el

tropismo o la resistencia a frmacos.

Con la secuenciacin completa del genoma de T. brucei (Berriman y col. 2005), se ha

vuelto rutinario el diseo de oligonucletidos y la amplificacin de las secuencias laterales

apropiadas para el knockout de genes por recombinacin homloga (Asbroek y col. 1990) y

es posible utilizar el procedimiento knockout funcional mediante la interferencia del ARN

para bajar el nivel de expresin de genes individuales o familias de genes (Ngo 1998).

Hasta hace relativamente poco, se crea que los mecanismos involucrados en la

transformacin de T. brucei eran distintos de los otros tripanosomatidos, posiblemente por

los diferentes requisitos para la replicacin autnoma. La transformacin estable parece

estar mediada exclusivamente por la integracin del vector (Asbroek y col. 1990) y en los

ensayos de expresin transitoria, es esencial un promotor fuerte. Aun cuando se ha logrado

la transformacin de T. brucei con vectores episomales las lneas son inestables y el vector

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se pierde rpidamente al quitar el factor selectivo del medio (Kelly 1995). La

transformacin estable de los tripanosomas usualmente se realiza mediante electroporacin

con un pulso corto de alto voltaje seguido de seleccin con antibiticos. En las formas

procclicas de T. brucei, este mtodo puede tener eficiencias alrededor de 10-3

10-6

(McCulloch 2004). En contraste, las formas sanguneas son considerablemente ms

difciles de transfectar, ya que la tasa de supervivencia de las clulas es baja y la

recombinacin homloga parece ser menos eficiente. Se han hecho intentos de mejorar la

eficiencia de la transformacin en las formas sanguneas mediante el uso de diferentes

condiciones de cultivo, buffers y parmetros de electroporacin (Li, 1996). Sin embargo, la

eficiencia de la transformacin estable (10-7

10-8

) est varios rdenes de magnitud por

debajo en comparacin con las formas procclicas. Existen otras tcnicas como por ejemplo

la biobalstica con la cual se pueden obtener mayores tasas de transformacin estable para

las formas sanguneas (Hara 2002), pero como este mtodo requiere un trabajo ms intenso

adems de equipos especiales, la electroporacin ha quedado como el mtodo usual para la

transfeccin de tripanosomas.

1.6 Vectores de expresin en Tripanosomatdeos

Un vector de expresin debe tener todos los elementos que le permitan la expresin

eficiente de genes especficos. Inicialmente, para el mantenimiento episomal del vector se

necesita un origen de replicacino de lo contrario la funcin insertada se pierde en las

sucesivas divisiones celulares. En Tripanosomatdeos estos elementos son un promotor

fuerte que puede ser especie especfico (con frecuencia se ha utilizado el promotor de los

genes ribosomales), las seales de trans-splicing y poliadenilacion, para la maduracin

efectiva del ARNm; las regiones conservadas y no traducidas (UTRs) que regulan la

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estabilidad del ARNm y la expresin estadio especifica (Figura 2). Si se busca lograr la

integracin del transgen al genoma para una expresin estable se debe tener en cuenta

tambin la inclusin de unos segmentos de tamao apropiado que permitan la

recombinacin homloga.

Figura 2. Plsmido pLUN100.Este contiene una regin intergnica de la -tubulina que contiene la

secuencia blanco de la endonucleasa MluI permite la linealizacin del plsmido con la finalidad de facilitar la

integracin al genoma por recombinacin homloga. Tambin tiene el promotor de PARP (Protena

prociclicica acidica repetitiva), adems del gen de la neomicin fosfotransferasa y el de la luciferasa cada uno

precedido de un sitio de empalme el cual permite la maduracin apropiada de ambos transcritos. Ambas

protenas una vez expresadas le otorga la resistencia a la presin selectiva del antibitico G418 y la

fluorescencia inducida.

T. brucei posee algunas caractersticas que hacen favorable su estudio mediante las

herramientas de la gentica reversa: es fcil de cultivar in vitro, se puede transfectar

eficientemente usando electroporacin, existen actualmente hasta 6 marcadores de

resistencia a antibiticos tiles en la seleccin, posee un sistema intrnseco de ARN de

interferencia y se ha logrado la expresin de sistemas inducibles mediante el uso de

polimerasa de bacterifago T7 y el sistema del represin de la tetraciclina (Cross, 2008).

La similitud de secuencias de T. evansi a esta especie filogenticamente ancestral

(Carnes y col., 2015), apoya la idea que las herramientas de la gentica reversa sean

factibles para el estudio de T. evansi.

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Tabla 1. Resumen de herramientas de gentica reversa aplicadas en

tripanosomatidos.

T. brucei T. cruzi Leishmania T. evansi

Transfeccin transitoria +++ + ++ ND

Transfeccin estable +++ ++ +++ ND

Vectores de expresin:

Episomales + ++ +++ ND

Cromosmicos +++ + +++ ND

Regulables +++ - + ND

Marcador selectivo:

Positivo 6 3 8 ND

Negativo 1 1 2 ND

Gene Knock-out +++ ++ +++ ND

Cruces sexuales/ formacin de hbridos

+ + +* -

Clonamiento posicional Posible ND - ND

RNAi (Knock-out funcional) +++ ND - ND

Rescate funcional + ND +++ ND

Mutagnesis por transposones

+ - ++ ND

Tamao del Genoma (MB) 35 40 35 251

# de cromosomas 11 >30 ~36 131

El smbolo + indica que un mtodo ha sido establecido, el nmero de + refleja una aproximacin a cun

bien funciona o su aplicacin en una especie determinada. ND, no determinado (Tomado con modificaciones

de Beverly 2003)* (Akopyants, 2009)1(Carnes y col 2015)

.

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____________________________________________2.ANTECEDENTES

La transformacin usando genes reporteros ha permitido avances en las ltimas

dcadas con respecto al entendimiento de muchas caractersticas de la biologa de los

parsitos Tripanosomatdeos y su relacin con los huspedes a nivel celular y de tejido. La

construccin de vectores de expresin estable, en forma episomal o para su insercin en el

genoma, permiti obtener lneas transformante estables expresando diferentes genes

reporteros en Leishmania, T. brucei y T. cruzi que fueron aplicados para abordar

experiencias a nivel subcelular, celular y de interaccin parsito-vector.

Los primeros intentos exitosos datan de 1991 con la expresin de -galactosidasa y

-glucuronidasa como enzimas reporteras en Leishmaniatropicausando el vector de

expresin pX63NEO. Con ello se demostr que era posible la expresin transitoria de

ambas enzimas en las cuales resultaron tener una mayor sensibilidad que la comnmente

usada CAT (cloranfenicol acetiltransferasa)(Lebowitzy col., 1991).La bioluminiscencia

mediada por la expresin estable de la enzima luciferasa de lucirnaga fue utilizada por

primera vez en 1992 paradeterminar las seales de importacin de protenas al glicosomaen

formas procclicas de T. brucei(Sommer,1992).

A finales de los noventa, se introduce el uso de la autofluorescencia de la protenas

de fluorescencia verde GFP (por sus siglas en ingls Green FluorescentProtein),

originalmente de la medusa Aquorea victoriapara lograr lneas fluorescentes estables y

estudiar el desarrollo de los parsitos en los vectores. Utilizando el vector pXGFP5(S65T)-

R-promotor de forma episomal, Guevara y col (2001) obtuvieron lneas estables de

Leishmaniadonovanipermitiendo evaluar el desarrollo de esta especie del viejo mundo en

http://monitoria-parasito.blogspot.com/2010/06/protozoarios-tripanosomatideos.html

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especies de vectores deAmrica (Lu. longipalpis, Lu. ovallesis,Lu. youngi), provenientes

de colonias y aislados de la naturaleza, demostrando el potencial de esta aproximacin para

determinar capacidad vectorial. Posteriormente, Guevara y col. (2005) lograron la

expresin de las protenas GFP y DsRed en cepas deT. cruziy Trypanosoma rangeli

empleando dos vectores de expresin, el pTREX-n y pBsCalB1/CUB01, con ello se pudo

avanzar en el estudio del ciclo en el vector Rhodnius prolixus en infecciones simples y

mixtas(Figura 3).

Figura 3. Plsmido pTREXn-GFP5(S65T).Este contiene dos genes marcadores selectivos AMP y NEO que

le otorgan resistencia a la ampicilina y el G418 respectivamente. Tambin tiene un gen reportero el de la

protena verde fluorescente inserto en el sitio de clonamiento multiple. Los factores que permiten una

expresin eficiente son el promotor ribosomal de T. cruzi, la regin hx1 que es una seal para el transplicing

al igual que las regiones intergenicas del locus de la enzima GAPDH (gliceraldehido 3-fosfato

deshidrogenasa).

Estos genes reporteros han sido usados progresivamente desde entonces porque son

de fcil visualizacin/deteccin, estables, de costo accesible y de baja toxicidad, adems de

no ser expresados en clulas de mamferos. Una de las principales ventajas de la utilizacin

de parsitos expresando fluorescencia in vivo es que no requieren fijacin y permiten una

visualizacin en tiempo real para el seguimiento de las infecciones in vitro e in vivo.

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La obtencin de lneas de parsitos fluoresciendo de manera estable proporciona

una poderosa herramienta para el descubrimiento y desarrollo de nuevas drogas as como

para la visualizacin in vivo de los procesos biolgicos de infeccin y tropismo tisular

durante la infeccin en los huspedes mamferos con tcnicas no invasivas. Recientemente

Canavaciy col (2010) evaluaron la eficacia de drogas antiparasitarias en ensayos tanto in

vitro como in vivo, usando cepas de T. cruzi expresando la protena fluorescente Td-tomato

a partir del vector pTREX-n, Los autores demostraron que los ensayos realizados con

parsitos fluorescentes culminados en dos semanas, fueron equivalentes a las pruebas

tradicionales que requieren ms de cuarenta das. El procedimiento con parsitos

fluorescentes in vivo permiti el rpido descarte de drogas consideradas prometedoras en

ensayos in vitro y cuya eficiencia result nula o inferior a los tratamientos actuales una vez

evaluadas en el ensayo in vivo.

En el Laboratorio de Fisiologa de Parsitos en el Instituto Venezolano de

Investigaciones Cientficas (IVIC) se desarrolla una lnea de trabajo que aborda la

caracterizacin parasitolgica, inmunolgica e histoqumica de varias cepas venezolanas de

T. evansipara profundizar en el estudio de las interaccines parsito-hospedador. Los

trabajos de caracterizacin realizados por Perrone en 2003, cubrieron la evaluacin del

comportamiento parasitolgico, la comparacin de los patrones antignicos e

isoenzimticos, as como la comparacin de los electrocariotipos de varias cepas de T.

evansi, estableciendo diferencias significativas en la virulencia de al menos 9 aislados de T.

evansi.

Mediante la aplicacin de la tcnica de amplificacin aleatoria de polimorfismos del

ADN (RAPD)Perrone y col (2009) se logr confirmar que los aislados de T.evansi TeAp-

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N/D1 y TeGu-N/D1 estn ubicados taxonmicamente en grupos distintos, ms cercanos a

T. brucei y T. equiperdum. La caracterizacin se ha ampliado a la evaluacin del tropismo y

los cambios patolgicos estructurales que las cepas de T. evansi ocasionan en los ratones.

El anlisis de estructuras celulares por medio de la aplicacin de microscopia electrnica,

(Tejero y col 2009) detect cambios en la morfologa de las mitocondrias y gotas lipdicas

de hepatocitos de ratn (Mus musculus) infectados con T.evansi obtenido de un equino

infectado naturalmente en el estado Guarico, En 2011 Parra compar el comportamiento

parsitologico de varios aislados de T. evansi, encontrando que TeAp-N/D1 es el ms

virulento y patognico. Tambin evalo comparativamente perfiles proticos mediante

inmunoblot con lo que se pudo identificar protenas relacionadas con la virulencia del

parsito.

Conociendo la experiencia del Laboratorio de Gentica Molecular del Instituto de

Biologa Experimental, (IBE) Facultad de Ciencias, UCV, en el manejo de las

herramientas de gentica reversa, particularmente en la produccin de lneas fluorescentes

estables en tripanosomas, surge la necesidad de producir las lneas antes mencionadas con

Trypanosoma evansi con el objetivo de estudiar a profundidad las relaciones parsito-

hospedador, la posibilidad de la invasin de clulas del husped, determinar el tropismo del

parasito en los distintos rganos del husped y tambin, si la evaluacin de la efectividad de

drogas tripanocidicas in vivo como in vitro sera ms eficiente que mediante las tcnicas

disponibles actualmente en el Laboratorio de Fisiologa de Parsitos del IVIC. Por esta

razn se considera importante transfectar la cepa venezolana Teva1 de T. evansi

previamente caracterizada bioqumica, molecular y parasitolgicamente, explorando la

factibilidad de los vectores de expresin disponibles.

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_________________________________________________3. OBJETIVOS

Objetivo general:

Determinar la factibilidad del vector de expresin pTREX-GFP5(S65T) como

herramienta para la obtencin de lneas fluorescentes estables de cepas venezolanas

de la especie Trypanosoma evansi.

Objetivos especficos:

Confirmar la identidad de la cepa venezolana TeAp-N/D1 de Trypanosoma evansi.

Determinar el IC50 al antibitico G418 en la cepa venezolana TeAp-N/D1de

Trypanosoma evansi.

Determinar el porcentaje de sobrevivencia de la cepa venezolana TeAp-N/D1 de

Trypanosoma evansi a las condiciones de electroporacin utilizadas para la

transfeccin en tripanosomatideos.

Aislar y caracterizar el vector pTREXn-GFP5(S65T).

Normalizar las condiciones del protocolo de transfeccin en tripanosomtidos para

T. evansi.

Transfectarla cepa venezolana TeAp-N/D1de Trypanosoma evansi con el vector

pTREXn-GFP5(S65T)

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_________________________________4. MATERIALES Y MTODOS

4.1.Material biolgico, cultivo y aislamiento

Cepas de parsitosTeAp-N/D1:

Se usar la cepa de Trypanosoma evansi MEQU/VE/03/TeAp-N/D1 aislada

originalmente de un caballo infectado del estado Apure otorgada por el Laboratorio de

Fisiologa de Parsitos del Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas (IVIC).

Cultivo de parsitos:

El criopreservado de la cepa TeAp-N/D1 de Trypanosoma evansi ser descongelado

a temperatura ambiente y posteriormente se inocularn los parsitos en ratas por va

intraperitoneal para su reactivacin. Cuando las parasitemias alcancen valores aproximados

de 107 parsitos/mLde sangre, los animales anestesiados sern sacrificados por puncin

cardaca en presencia de EDTA 10% y la sangre obtenida representar el material

parasitolgico inicial inculo experimental para el cultivo.La sangre extrada ser

inmediatamente sometida a cromatografa de intercambio inico en condiciones de

esterilidad para la purificacin de los parsitostal como se describe a continuacin.

Purificacin de parsitos por cromatografa de intercambio inico:

Se utilizar latcnica de cromatografa de intercambio inico en columna de DEAE-

Celulosa equilibrada en tampn fosfato salino glucosado, pH 8, de acuerdo al mtodo

deLanham y Godfrey (1972). El empaquetamiento de la columna de DEAE-Celulosa se

har bajo condicionesde esterilidad, en campana de flujo laminar, utilizando tampn fosfato

salino ytampn fosfato salino glucosado estril. Los parsitos eludos de la columna se

20

centrifugarn a 1500 g x 10 minutos, se eliminar el sobrenadante y luego se resuspendern

en 2 ml de tampn fosfato salino glucosado para la posterior cuantificacin del rendimiento

de la purificacin.

Determinacin de Viabilidad Celular (Mtodo de Azl de tripano):

En un tubo pequeo se mezclara 50 Lde la suspensin celular estril (2-10 x

106clulas/mL) con 50 uLde solucin Azl de tripano0,2 % (P/V) en PBS. Se colocar

inmediatamente la suspensin en un hemocitmetro y se dejar decantar las clulas por 1

minuto. Luego se observar al microscopio a 40 X dentro de los 3 minutos siguientes a la

coloracin, contando clulas muertas (azules) y clulas vivas (no teidas). Finalmente se

calcular el nmero de clulas viables por mL y el porcentaje de clulas viables (viabilidad)

(Hunt 1987).

Cultivo del parsitoT. evansi

Los parsitos(1.25 x 106clulas/mL en 5mL)sern cultivados y mantenidos en medio

de crecimiento: MEM (Medio mnimo esencial con sales de Earle, suplementado con

aminocidos no esenciales), glucosa lmg/mL, NaHCO3 2,2 mg/mL, HEPES 10 mM, L-

glutamina 2 mM, Piruvato de Sodio 2 mM, 2-Mercaptoetanol 0,2 mM, Hipoxantina 0,2

mM, suero de caballo 20% (previamente inactivado por calor), 100 UI de penicilina, 50

g/mLgentamicina pH 7,3.En una atmosfera de CO2 al 5% mantener a 37C(Protocolo

modificado de Kaminsky y col (1998).

21

4.2Identificacin molecular

ADN genmico de T. evansi ser extrado a partir de un sedimento de 109

tripanosomas siguiendo el protocolo de un estuche comercial para el aislamiento de ADN

genmico BDtractTM de Biotech. Consiste en la lisis de las membranas citoplasmticas y

nuclear con detergentes aninico y no inicos, remocin de ARN contaminante con una

solucin de ARNasa, precipitacin de las protenas por saltingout y precipitacin del

ADN genmico con isopropanol. Luego del lavado con isopropanol, el ADN se disolvi en

100L de agua destilada(Perrone, 2003).

Las reacciones de PCR sern ejecutadas en un termociclador(MJ Research, modelo

PTC-200) con un volumen final de 15L por cada 100ng de ADN genmico. El cebador

usado ser el mini A 5-GGGTTTTTTAGGTCCGAG-3 y el mini B como antisentido 5-

CCGAAAATAGCACGTG-3 (Njiru y col., 2006)Las condiciones de la reaccin son las

siguientes: MgCl2 2,5 mM, dNTPs 800 M, Taq Polimerasa (Platinum

invitrogen)0,5U/ensayo, Mini A 0,2 M, Mini B 0,2 M, buffer taq 10% V/V.

4.3 Determinacin del IC50 de T. evansi a G418.

Se cultivarn varios viales de parsitos suplementados con concentraciones

crecientes del antibitico G418, con un rango de concentracin de 0 a 500 g/mL por un

periodo de 10 a 12 das consecutivos dichos cultivos sern monitoreados mediante cmara

de Neubauer para determinar la concentracin con la cual se inhibe el crecimiento del 50%

de los parsitos con respecto al control. El valor de IC50 se obtendr por regresin lineal.

22

4.4 Transformacin, aislamiento y caracterizacin del vector pTREX-GFP5(S65T)

Preparacin de clulas competentes por CaCl2

El protocolo a seguir, ser tomado de Sambrook y col. (1989)conalgunas

modificaciones. Se utilizar la cepaEscherichiacoliDH10B de (Gibco-BRL): F-mcrA

(mrr-hsdRMS-mrcBC) 80dlacM15 lacX74 deoRrecA1 endA1 araD139 (ara, leu)

7697 galUgalK -rpsLnupG Inicialmente se inocularn 2 mLde caldo LB con una colonia

aislada de la cepa mencionada, el cultivo se dejar crecer con agitacin durante toda la

noche a una temperatura de 37C, pasado el tiempo de incubacin, se agregarn 8 mL de

caldo LB fresco al precultivo y se someter a incubacin por una hora adicional (a 37C

con agitacin). Seguidamente, las clulas sern recuperadas por centrifugacin a 4000g, a

4C por 10 minutos. El sedimento celular ser lavado con solucin salina (NaCl 0.85%)

estril, y luego se recuperarn nuevamente por centrifugacin, manteniendo las mismas

condiciones de centrifugacin del paso anterior. Este sedimento ser resuspendido en una

solucin de CaCl2 50mM estril a 4C, y luego se someter a incubacin en hielo durante 1

hora. Posteriormente las clulas sern recuperadas por centrifugacin a 4000g por 10

minutos, y se resuspendern en 500L de CaCl2 50mM estril a una temperatura de 4C.

Esta suspensin celular se utilizar inmediatamente para llevar a cabo la transformacin.

Transformacin de clulas competentes.

El protocolo de transformacin bacteriana ser tomado de Sambrook y col. (1989)

conciertas modificaciones. Se tomarn 100L de la suspensin de clulas competentes, las

cuales sern mezcladas con aproximadamente 10ng de ADN plasmdico (pTREX-

GFP5(S65T)), en un volumen que no exceder los 10L. Esta mezcla ser incubada en

hielo por 1 hora. Transcurrido este tiempo se aplicar un choque trmico a 45C por 90

23

segundos. Inmediatamente las clulas sern resuspendidas en 1mL de LB e incubadas por 1

hora a 37C con agitacin. El cultivo ser centrifugado por 2 minutos a 5000g y el

sedimento celular ser resuspendido en 200 Lde LB para luego ser sembrados en dos

placas de Agar LB,100L de cultivo en cada placa, suplementadas con

estreptomicina(40g/mL) y ampicilina (100g/mL), las placas se incubarn durante toda la

noche a una temperatura de 37C.

Aislamiento de ADN plasmdico a gran escala.

La metodologa a seguir ser tomada, con algunas modificaciones, de Birnboim y

Doly (1979) (referido en Sambrook y col., 1989). Inicialmente se inoculararn 4mL de

caldo LB con una colonia aislada del recombinante de inters, y se dejar crecer hasta

saturacin a 37C con agitacin durante toda la noche. Este precultivo ser amplificado en

200mL de medio super rico (Na2HPO4 0.6%; KH2PO4 0.3%; NaCl 0.05%; NH4Cl 0.1%;

caldo LB 10mL/100mL de medio; glucosa 0.2%; Mg2SO4 0.025%; CaCl2 0.0015%;

casaminocidos 0.1%) a 37C y con agitacin hasta que alcance una D.O. 560nm de 1.0. A

continuacin ser enriquecido con caldo LB fresco (10mL/100mL), casaminocidos (0.1%

concentracin final) y glucosa (0.5% concentracin final), y se incubar por 30 minutos a

37C con agitacin. Pasado este tiempo se aadir Cloranfenicol hasta una concentracin

final de 50 mg/mL, y se mantendr la incubacin a 37C por 14 horas. Las clulas sern

recuperadas por centrifugacin a 4000g por 15 minutos. El sedimento celular se lavar con

10mL de solucin salina estril (NaCl 0.85%) y se someter a centrifugacin a 4000g por

15 minutos. El sedimento celular ser resuspendido en 2.5mL de Solucin de Lisis I

(glucosa 50mM; Tris-HCl pH 8.0; EDTA 10mM) y se incubar por 10 minutos en hielo.

Luego sern aadidos 6mL de Solucin de Lisis II (SDS 1%; NaOH 0.2N), mezclando

24

cuidadosamente por inversin e incubando en hielo por 15 minutos. Seguidamente se

aadirn 4.5mL de Solucin de Lisis III (Acetato de Sodio 3M; pH 5.2), mezclando

suavemente e incubando en hielo por 20 minutos. El sobrenadante ser recuperado y los

cidos nucleicos que all se encuentran sern precipitados con la adicin de igual volumen

de Isopropanol, mantenindose a 4C por 30 minutos. El sedimento de cidos nucleicos se

obtendr mediante la centrifugacin a 12000g por 30 minutos para luego proceder al secado

y resuspensin en 1mL de tampn TE (Tris-HCl 10mM pH 8.0; EDTA 1mM). A esta

solucin se la aadir RNAsa A (10mg/mL en 5mM de Acetato de Sodio pH 4.8 hervida

por 10 minutos) a una concentracin final de 50g/mL, y se someter a incubacin a 37C

por 30 minutos, seguido de una segunda incubacin a 37C con Proteinasa K a una

concentracin final de 10g/mL. Posteriormente se aadir igual volumen de solucin

LiCl2 5M y se incubar en hielo durante 30 minutos. Despus esta mezcla se centrifugar a

12000g por 20 minutos. El sobrenadante recuperado ser sometido a extraccin con igual

volumen de una mezcla Cloroformo: Fenol (1:1), seguido de una extraccin con igual

volumen de una mezcla de Cloroformo: Alcoholisoamlico (24:1), en ambos casos, la

mezcla ser centrifugada a 12000g por 30 minutos. El ADN contenido en el sobrenadante

ser precipitado con 2.5 volmenes de Etanol 99%, una solucin de Acetato de Sodio 0.3M

pH 5.2 y 1L de glicgeno (2% v/v), para luego centrifugar a 12000g por 15 minutos.

Finalmente se realizarn lavados del sedimento con Etanol 70%, para dejarlo secar y

resuspenderlo en un volumen no mayor de 300L de tampn TE (Tris-HCl 10mM pH 8.0;

EDTA 1mM).

4.5Digestin de ADN con enzimas de restriccin.

25

El ADN plasmdico ser digerido con enzimas de restriccin como parte de la

caracterizacin y anlisis del vector de expresin y los recombinantes obtenidos. Estas

reacciones se llevarn a cabo bajo las condiciones recomendadas por la casa comercial en

cuanto a: concentracin de la enzima por microgramo de ADN a digerir, concentracin

final del tampn, temperatura y tiempo de incubacin. Generalmente estas reacciones se

llevarn a cabo en un volumen final de 15L para digestiones no preparativas, y en el caso

de digestiones preparativas el volumen final ser de 50 L. Con el fin de eliminar el RNA

presente, se le aadir RNAasa A (10mg/mL de 5mM de Acetato de Sodio pH 4.8 hervida

por 10 minutos) a la reaccin hasta alcanzar una concentracin final de 50g/mL.

4.6Anlisis de ADN mediante electroforesis en geles de agarosa.

Con la electroforesis se evaluar la integridad y la concentracin del ADN aislado,

viendo el tamao de los fragmentos de ADN producto de la digestin con enzimas de

restriccin. La concentracin de agarosa ser de 0,8g/mL. Inicialmente las muestras sern

cargadas en los bolsillos de los geles luego de ser mezcladas con tampn de carga 6x (Azul

de Bromofenol 0.25%; Cianol Xileno 0.25%; Sacarosa 40%), utilizando una relacin

muestra:tampn de 5:1. Las corridas electroforticas se realizarn en tampn TAE 1x (Tris-

Acetato 40mM; EDTA 1mM pH 8.0) utilizando un voltaje no mayor a 5V/cm. Luego de la

corrida, los geles sern teidos en Bromuro de Etidio (0.5mg/mL) (Sambrook y col. 1989)

y el ADN ser visualizado bajo luz Ultravioleta con la ayuda de un transiluminador

acoplado a un sistema Gel-Doc 1000 (BioRad) a una longitud de onda de 302nm. El

registro de las imgenes se llevar a cabo con un sistema de digitalizacin de imgenes

utilizando el programa de computacin QuantityOne (BioRad).

26

4.7Electroporacin, seguimiento y seleccin de lneas transfectantes estables.

Las experiencias de transfeccin de parsitos se realizarn siguiendo el protocolo de

Hariran y col. (1993) (revisado de Campelo2006), con algunas modificaciones. Las clulas

de Trypanosoma evansi provenientes de la purificacin por columna DEAE sern ajustadas

a una concentracin de 107-10

8 clulas/mL mediante lavados en solucin salina estril

(NaCl 0.85%) dos veces. El sedimento celular ser resuspendido en medio LIT sin hemina

(Triptosa 1.5%; Infusin de Hgado 0.2%; Extracto de Levadura 0.5%; Glucosa 0.4%; NaCl

0.9%; KCl 0.04%; Na2HPO4 0.75% pH 7.4) a una concentracin final de 8.9 x 108-10

9

clulas/mL. Un volumen de 350L de esta suspensin celular ser colocado en cubetas de

electroporacin BTX de 2mm pre-incubadas en hielo por 10 minutos. Las clulas sern

mezcladas con 200g de ADN plasmdico de pTREXn-GFP5(S65T) en un volumen no

mayor a 40L. La mezcla ser incubada en hielo por 10 minutos para luego proceder a la

electroporacin utilizando el Gene Pulser II BioRad, bajo las siguientes condiciones: un

pulso simple de 300V, 1000-1500F y 25-100 de resistencia. Posterior a la

electroporacin las clulas sern incubadas 10 minutos en hielo y luego transferidas a viales

de 5mL de medio de crecimiento(descrito en la seccin 2.5) sin antibitico e incubadas a

28C por 48 horas. Pasado este tiempo, las clulas se recuperarn por centrifugacin a

3000g y se resuspendern en 5mL de medio de crecimiento con el antibitico G418, a una

concentracin final de 500g/mL. Los cultivos sern incubados por 1 semana a 28C.

Cumplido este lapso los parsitos sern transferidos a un medio de crecimiento sin droga

por 1 semana, repitindose este ciclo hasta obtener poblaciones estables que expresen el

marcador GFP.

27

______________________________________5. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Abr. May. Jun. Jul. Ago. Sep. Oct. Nov. Dic. Ene. Feb. May

Presentacin de TEG

Confirmacin de la identidad de la

cepa mediante PCR

Escribir tesis y preparar defensa

Presentacin del seminario II

Transfeccin

Presentacin del seminario I

Normalizacin del protocolo de

tranfeccin

2015 2016

Aislamiento y caracterizacin del

vector

Determinacin de IC50 a G418

Clculo de la viabilidad de los

parsitos electroporados

Revisin bibliogrfica

28

_____________________________________________________________6. Factibilidad

La investigacin ser llevada a cabo con recursos y asesora del laboratorio de Fisiologa de

Parsitos del IVIC y as como tambin la disposicin del Laboratorio de Gentica

Molecular del IBE.

29

________________________________________________________7. REFERENCIAS

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