FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DA

UNIVERSIDADE DE COIMBRA

Licenciatura em Biologia 2007/2008

Detecção de lípidos em sementes de grão-de-bico

(Cicer arientinum L.)

Técnica histológica normal com negro de Sudão B

Grupo P1 L2:

Ana C. S. Alves, N.º 2007103940

Inês B. Costa, N.º2007108806

João F. S. Martins, N.º 2007102700

Melissa P. Alves, N.º2007107970

Coimbra, 24 de Janeiro de 2008

ÍNDICE

1_Introdução …………………………………………………………………………. 3

2_ Materiais e Métodos ………………………………………………………………. 13

3_Resultados …………………………………………………………………………. 16

4_ Discussão | Conclusão …………………………………………………………….. 17

5_Bibliografia ………………………………………………………………………… 19

2

Figura_1 | Grãos- de-bico (castanhos-claro e verdes)

1_INTRODUÇÃO

Este trabalho teve como objectivo a observação de lípidos, recorrendo para o

efeito a sementes de grão-de-bico.

O grão-de-bico, de nome científico Cicer arietinum

L., é uma leguminosa, da família das fabáceas (Fabaceae),

sub-família Faboideae 1. Esta família (Fabaceae) possui

aproximadamente 700 géneros e 17000 espécies de

plantas, com uma distribuição geográfica cosmopolitana e

um importante uso económico (Heywood, 1996).

É uma planta arbustiva; herbácea; anual; que se

desenvolve e produz bem em condições de clima frio a

ameno e em solos férteis, não sujeitos a inundação e com

boa disponibilidade de água durante todo o

desenvolvimento vegetativo e frutificação; ainda assim

apresenta boa tolerância à seca 2. A propagação é por

sementes e o plantio é feito directamente no campo. A colheita ocorre 110 a 140 dias

após a semeadura, quando as vagens secam 2.

Atinge cerca de 60cm de altura. Tem caule anguloso e sulcado. As suas folhas

são compostas de 9 a 19 folíolos, formato oval, com 1,6cm de comprimento. As cores

das flores, conforme as variedades, podem ser brancas, avermelhadas ou azuladas. Os

frutos (vagens) são pendentes ou erectos, cilíndricos e contêm uma a duas sementes

cada. As sementes apresentam grande variação na forma, tamanho e cor, relacionada às

diferentes variedades2. Podem ser de cor castanho-claro (ou também verdes), são

arredondadas, tendo uma pequena “espora” 1. A planta é hermafrodita (tem os dois

sexos na mesma flor) e autoférteis (o pólen fecunda a flor da mesma planta que

produziu) 2.

O grão-de-bico, originariamente proveniente do Sudeste da Turquia 2, é

actualmente cultivado mundialmente 2, muito distribuído sobretudo na Índia e no

Mediterrâneo 1. Em Espanha e em Portugal usam-no muito nos seus pratos nacionais de

uso quotidiano 2.

3

É um legume com importantes qualidades culinárias e nutritivas 1. Tem como

principais componentes as vitaminas A, B, B2, B5, C; minerais como cálcio, ferro,

fósforo, zinco, cobre, enxofre, potássio, magnésio e manganês 3; proteínas (que

abrangem cerca de 80% do peso total das semnetes secas) 4. A proteína do grão tem sido

considerada de melhor valor nutricional entre as leguminosas 4.

Apesar de ser o mais elevado das leguminosas secas, tem um baixo teor de

lípidos, sendo predominantemente monoinsaturados. Desta forma, o valor energético,

apesar de moderado, é dos mais elevados do grupo das leguminosas secas. Além disso,

destaca-se o conteúdo em fibra alimentar 5. A grande quantidade de celulose contida na

casca estimula o funcionamento dos intestinos 1.

O grão-de-bico tem importantes propriedades medicinais. É afrodisíaco,

antibiótico, anti-inflamatório, diurético, energizante, mineralizante, nutritivo, tónico e

vitamínico 3.

A planta é um excelente adubo verde, porque produz muitas folhas e ramos e as

suas raízes, através dos nódulos, fixam o nitrogénio atmosférico 2. As suas folhas são

usadas na alimentação animal (forragem) 2.

Não menos importante, é a simbologia, a relação do grão com a morte. Os

gregos da Época Clássica comiam grãos nos banquetes fúnebres. Na região de Niza é

tradição comer grãos na Quarta-feira de Cinzas, na Sexta-feira Santa e no Dia de Todos

os Santos. A mesma tradição existe em numerosos lugares de Espanha, durante a Sexta-

feira Santa, quando se come uma suculenta sopa de grãos 6.

Depois de analisado o grão, abordaremos os lípidos, uma vez que o seu estudo é

essencial para a compreensão deste trabalho.

Os lípidos (do grego Lypos) 5 são compostos orgânicos, a maioria biomoléculas;

formados principalmente por carbono (C), hidrogénio (H) e oxigénio (O, em menor

quantidade); também podem conter azoto (N), fósforo (P) e enxofre (S).

Apesar das diversas características químicas, apresentam propriedades físicas

comuns: são hidrofóbicas (insolúveis em água), dissolvendo-se em substâncias

orgânicas como por exemplo: álcool, benzeno, clorofórmio acetona, sulfureto de

carbono e tetracloreto de carbono. Estas propriedades gerais dos lípidos devem-se ao

4

predomínio de longas cadeias hidrocarbonadas. Alguns lípidos (pelo facto de possuírem

um grupo polar), são capazes de se ligarem à água por ligações de hidrogénio (De

Robertis & De Robertis, 1996). Por esta razão, afirmar que os lípidos são insolúveis em

água é enganoso, uma vez que alguns lípidos são tão solúveis em água como em

solventes orgânicos.6

Habitualmente os lípidos são chamados de gorduras, uma designação incorrecta

uma vez que as gorduras são apenas um tipo de lípidos de origem animal. 7

Os ácidos gordos são a unidade básica da maioria dos lípidos e consistem em

moléculas hidrocarbonadas de cadeia longa com um número par de átomos de carbono

(12 a 22) e um grupo

carboxilo terminal. 7

Dividem-se em dois grupos:

o Saturados: possuem ligações simples, são por isso flexíveis;

o Insaturados (ou Poli insaturados): na cadeia há ligações duplas ou triplas, o que os

torna rijos.8

Propriedades físico-químicas:

1. Carácter anfipático: uma vez que o ácido gordo é formado por um grupo carboxilo e

uma cadeia hidrocarbonada, esta ultima possui a característica hidrofóbica

responsável pela sua insolubilidade em água;

2. Ponto de fusão: depende do comprimento da cadeia e do número de insaturações,

sendo os insaturados os que requerem menos energia para fundir-se;

3. Estérificação: os ácidos gordos podem formar ésteres com grupos álcool de outras

moléculas;

4. Auto-oxidação: os ácidos gordos insaturados podem oxidar-se espontaneamente,

resultando aldeídos onde existiam ligações covalentes duplas;

5. Saponificação: por hidrólise alcalina, os ésteres (formados por estérificação), dão

origem a um sal.7

Devido ao carácter anfipático (zona polar e zona apolar), os lípidos em contacto

com a água auto organizam-se. A zona apolar (hidrofóbica), tende a minimizar o

5

Figura_2 | Estrutura molecular de um ácido gordo.

Figura_4 | Fosfolípido (lecitina).

Figura_3 | Esquema de uma micela (esquerda) e uma bicamada (direita).

contacto com a água, enquanto que a zona polar (hidrofílica), se orienta no sentido

oposto.

Dependendo do meio e do tipo de lípidos envolvidos (bem como da sua

concentração), formam-se:

o Micelas: esferas com uma única camada de

lípidos;

o Bicamadas lipídicas: duas camadas de

lípidos que se podem dobrar formando

esferas vazias – membrana plasmática.

Atendendo a que possuem na sua composição

ácidos gordos (lípidos saponificáveis) ou por outro lado não os possuem (lípidos

insaponificáveis), podemos dividir os lípidos em dois grupos:5 e 7

1. Lípidos saponificáveis

Simples (ou neutros)

a. Glicéridos: lípidos simples formados por glicerol estérificado e por um, dois

ou três ácidos gordos (mono, di ou triglicéridos). Tendo em conta a

temperatura de fusão classificam-se como: azeites, manteigas e sebos. Os

azeites encontram-se em plantas oleaginosas como a semente de girassol,

milho, soja e outras. 9

b. Céridos (ceras): são ésteres de um ácido de cadeia longa, sólidos a temperatura

ambiente e que têm como função impermeabilizar, encontrando-se por isso na

pele, pêlo e penas nos animais (exoesqueleto no caso dos insectos), e

formando uma película nas plantas. A mais conhecida é a cera de abelha.10

Complexos

a. Glicerolípidos: formados por ácidos gordos ligados a dois

grupos álcool da glicerina (possui três); dividem-se em:

o Glicolípidos: se ao terceiro grupo álcool da glicerina

se liga um glícido. Encontram-se nas membranas de

bactérias e células vegetais.

o Fosfolípidos: se é o ácido fosfórico a ligar-se ao

grupo álcool. Os fosfolípidos têm um importante

6

interesse biológico por serem importantes componentes estruturais das

membranas celulares.

b. Esfingolípidos: estrutura derivada da ceramida (formada por ácidos gordos

ligados à esfingosina); podem ser:

o Esfingoglucolípidos: resultam da união da

ceramida com um conjunto de monossacarídeos (por exemplo glucose e

galactose). Fazem parte das membranas celulares especialmente da

plasmática onde se intercalam com fosfolípidos.

o Esfingofosfolípidos: resultantes de reacções

envolvendo a ceramida e o ácido fosfórico entre outros. Estão presentes no

tecido nervoso (bainhas de mielina).11

2. Lípidos insaponificáveis

Nesta classe encontram-se substâncias muito variadas, como as vitaminas D, E e

K, os compostos isoprénicos e as

prostaglandinas. Os compostos isoprénicos

constituem um importante grupo de

compostos orgânicos presentes tanto em

animais como nas plantas. Resultam da

condensação de unidades de isopreno, um

hidrocarboneto insaturado com 5 átomos de

carbono. Entre os compostos isoprénicos,

destaca-se o grupo dos esteróides, do qual

fazem parte diversas hormonas (androgénios,

estrogénios, etc.) e o colesterol. Este faz parte

das membranas biológicas às quais confere resistência, por outro lado é o

precursor de muitos esteróides.12

Funções dos lípidos

Os lípidos desempenham diferentes tipos de funções biológicas:

a. Função de reserva energética: são a principal reserva de energia dos animais, já

que uma grama produz 9,4 Kcal nas reacções metabólicas de oxidação (as

proteínas e os glícidos só produzem 4,1 Kcal/g);

7

Figura_5 | Colesterol na bicamada lipídica

b. Função estrutural: formam as bicamadas lipídicas das membranas celulares.

Além disto recobrem e proporcionam consistência aos órgãos, protegem

mecanicamente estruturas ou são isolantes térmicos como o tecido adiposo;

c. Função catalizadora (hormonal): facilitam determinadas reacções químicas e os

esteróides têm funções hormonais;

d. Função transportadora: são absorvidos no intestino graças à emulsão dos sais

biliares e ao transporte de lípidos pelo sangue e linfa;

e. Função relaxante: acumulam-se no tecido adiposo formando grandes tecidos

gordurosos que se manifestam no aumento de peso em caso de sedentarismo.7

Depois de apresentadas as biomoléculas descreveremos a técnica utilizada.

O primeiro passo da histoquímica foi dado sensivelmente há 170 anos atrás

quando Rrenchma Respail usou iodo para colorir e identificar o amido. Desde este

primeiro passo até aos dias de hoje, as técnicas histológicas sofreram evoluções, sendo

hoje largamente utilizadas na identificação e localização de vários compostos nas mais

diversas amostras e nos mais variáveis campos de aplicação (High, 1984).

A técnica histológica normal tem como objectivo tratar as células mortas,

fazendo com que nestas sejam preservadas a sua estrutura e composição química num

estado semelhante ao que possuíam enquanto vivas, podendo desta forma ser

observadas ao Microscópio Óptico.

Esta técnica possui como etapas: a fixação, a desidratação, a impregnação e

inclusão, microtomia e, por último, a coloração.

A preparação do material biológico para a observação microscópica é morosa,

correndo o risco das enzimas celulares destruírem parte das estruturas que se pretendem

observar. Para impedir este processo procede-se, em primeiro lugar, à fixação

citológica. Esta é uma etapa que envolve uma série de reacções químicas e que tem

como objectivo evitar a autólise das células (High, 1984. Hoopwood, 1994), assim

como o ataque bacteriano da amostra, preservar a estrutura e composição química dos

componentes celulares de modo semelhante ao estado vivo, endurecer os tecidos,

tornando-os mais resistentes às etapas seguintes e aumentar a afinidade das estruturas

celulares para os corantes citológicos, com o objectivo da coloração ser facilitada (Dinis

et al., 2006).

8

A fixação é um processo que pode ser físico ou químico. Na fixação física são

usados o frio – utilizado em criotécnicas – e o calor – usado em bacteriologia,

microbiologia, entre outros. A fixação química é a mais utilizada em histologia,

podendo ser realizada por fixadores simples ou misturas fixadoras. Os primeiros

fixadores utilizados foram fixadores simples, como os álcoois, a acetona, ácidos ou sais,

mas como apresentam vários inconvenientes, começaram a utilizar-se misturas

fixadoras, com o objectivo de um maior aproveitamento das qualidades de cada um e

minimizar as suas características menos boas. (Dinis et al., 2006).

Outros factores são importantes para além da escolha do fixador mais apropriado

para uma boa fixação. A fixação é afectada por outros factores como: o pH da solução

fixadora, a osmolaridade, a concentração do fixador e o tempo de fixação. Por estas

razões, os fixadores são, normalmente, preparados em solução tampão, que funcionam

como veículos dos fixadores ajudando a manter as condições de maneira mais

semelhante possível ás células vivas (Dinis et al., 2006).

Após a fixação, as amostras de material são lavadas várias vezes na solução

tampão usada como veículo do fixador e, posteriormente desidratadas.

Esta nova etapa, a desidratação, permite a remoção da água dos tecidos pela

passagem do material por soluções alcoólicas – agentes de desidratação – de

concentração crescente, iniciando nos 70%, seguindo para os 80%, 90%, 95% e,

finalmente, 100%. A remoção da água dos tecidos é muito importante, pois há

necessidade de impregnar e incluir as amostras de material num meio que possibilite a

realização de cortes, o suficientemente finos, para serem observados ao Microscópio

Óptico, uma vez que grande parte dos meios de inclusão não são solúveis em água

(Dinis et al., 2006).

Seguidamente faz-se a impregnação, onde o agente desidratante usado é

substituído pelo meio de inclusão, que vai sendo progressivamente adicionado às

amostras de material, em misturas cada vez mais concentradas deste e menos do

desidratante. Os tecidos devem ser embebidos num meio consistente que confere

resistência à amostra, tendo como objectivo conseguir os cortes suficientemente finos

para que se proceda à sua visualização microscópica.

9

O meio de inclusão mais vulgarmente utilizado em microscopia óptica é a

parafina, o seu ponto de ebulição está entre 56 e 58ºC. O material é colocado nos

moldes de plástico – cassetes – onde é colocada também a parafina fundida. Se o meio

de inclusão não for solúvel no desidratante, é necessário recorrer a uma pré-

impregnação utilizando um solvente intermediário. (Dinis et al., 2006).

Procede-se a microtomia. Nesta etapa utilizam-se

micrótomos do tipo Minot, que possuem uma navalha fixa,

diante da qual se move um disco rotativo que contém o bloco

do material envolto em parafina; uma manivela lateral que faz

com que esse bloco se movimente verticalmente avançando

para a navalha de acordo com um avanço predefinido, o qual

determina a espessura do corte. As espessuras podem variar de

5 a 20 μm (Dinis et al., 2006). Se a inclusão estiver bem feita,

após cada movimento da lâmina do micrótomo sai um corte e o que se segue vai colar-

se ao anterior pela aresta vizinha, de forma a se constituírem assim, fitas ou ténias de

cortes (High & Lake, 1994). Posteriormente as ténias são colocadas em lâminas de

vidro com a sua parte brilhante voltada para baixo, para serem observadas ao

microscópio óptico após a coloração (Dinis et al., 2006).

A maioria dos tecidos é incolor, o que torna dificultada a tarefa da visualização

microscópica, é então necessário proceder à coloração dos tecidos para tornar os seus

componentes mais visíveis e destacados (Junqueira & Carneiro, 1971).

Na coloração torna-se necessário remover a parafina e re-hidratar os cortes,

sendo a sequência utilizada a inversa da desidratação. A coloração depende da afinidade

entre o corante e o tecido, isto devido a forças de atracção, como interacções

hidrofóbicas, interacções reagente – reagente, ou devido a interacções reagente – tecido,

como é o caso das forças de Van der Waals, atracção de Coulomb, pontes de hidrogénio

ou ligações covalentes (High & Lake, 1994).

A coloração é feita à base de misturas de substâncias químicas – corantes, sendo

a maioria deles soluções de substâncias aromáticas, e como tal, apresentam anéis de

benzeno (anéis aryl). Os corantes possuem na sua constituição um ou mais grupos de

cromóforos – responsáveis pela cor do corante, alterando a energia da nuvem de

electrões do anel aromático, fazendo com que o corante absorva radiação na gama da

10

Figura_6 | Micrótomo

tipo Minot.

luz visível – e um grupo auxócromo – responsável pela dissociação electroquímica e

ligação do corante a componentes celulares, melhorando ou intensificando a cor de um

determinado composto (Dinis et al., 2006).

Em histologia, grande parte dos corantes comportam-se como ácidos ou como

bases, e, tendem a formar ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos.

Estes componentes se têm afinidade por corantes básicos denominam-se basófilos, e, se

têm afinidade por corantes ácidos são denominados acidófilos (Junqueira & Carneiro,

1971).

Os lípidos são, geralmente, identificados por corantes que se dissolvem

avidamente nas gorduras – lisocromos. Estes não são corantes na verdadeira acepção da

palavra, dado que não possuem o grupo auxócromo. Trata-se, assim, de um processo

mais físico que químico – difusão preferencial. Tecidos contendo gotículas lipídicas são

colocados em soluções alcoólicas saturadas de corantes muito lipossolúveis e

fracamente álcool-solúveis. Devido à característica acima descrita, após um certo

período de tempo o corante utilizado transfere-se do álcool para os lípidos dos tecidos

corando-os (Dinis et al., 2006). Os corantes mais utilizados são o Óleo de Vermelho O

(Horobin, 1994), o Sudão IV, o Sudão III e o negro Sudão B. Existem também várias

outras técnicas descritas que nos permitem identificar o colesterol e os seus ésteres,

fosfo e glicolípidos (Junqueira & Carneiro, 1971).

O negro Sudão B (C26H24N4O) é um lisocromo usado para corar triglicéridos e

outros lípidos em secções congeladas e algumas glicoproteínas em secções parafinadas.

A sua aparência é de um pó castanho-escuro ou preto, com um máximo de

absorção entre 596 – 605 ηm e ponto de fusão entre 120 a 124ºC. A sua coloração

presente nos tecidos é de um azul-escuro ou preto.13

São conhecidas outras utilidades do corante negro Sudão B, uma delas para o

melhoramento das impressões digitais, uma vez que é útil para detectar gorduras que

11

Figura_7 | Estrutura química do Negro Sudão B.

estão contaminadas com óleo13, outra utilidade é ao nível da medicina, em que é

possível, através deste corante a diferenciação entre a leucemia miéloide aguda e a

leucemia linfóide aguda.14

12

2_ MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 | Materiais

Material vegetal utilizado: Cicer arietinum L. (grão-de-bico).

2.2 | Métodos

Técnica histológica normal.

2.2.1 | Fixação:

Fixação química do material biológico com FAA, formalina aceto-álcool

(5mL de formalina comercial, 5mL de álcool acético glacial e 90mL de etanol a 50%).

Este processo demora 48 horas, com subsequente lavagem com água destilada.

2.2.2 | Desidratação:

10-30 Minutos em álcool a 70%;

10-30 Minutos em álcool a 80%;

10-30 Minutos em álcool a 90%;

30 a 45 Minutos em álcool a 95% (2 vezes);

45 a 60 Minutos em álcool a 100% (2 vezes).

2.2.3 | Impregnação e Inclusão:

Inclusão de amostras de material em parafina.

2.2.3.1 | Pré-impregnação:

Imersão do material biológico numa mistura 2:1 de Etanol e Isoparafina H,

durante algumas horas.

Imersão do material biológico numa mistura 1:1 de Etanol e Isoparafina H,

durante algumas horas.

Imersão do material biológico numa mistura de 1:2 de Etanol e Isoparafina

H, durante algumas horas.

13

Imersão do material biológico em Isoparafina H pura, durante o mesmo

período de tempo.

Adição de pedaços de parafina (agente impregnante) à Isoparafina H (agente

pré-impregnante) até à sua saturação.

2.2.3.2 | Impregnação:

Saturação da Isoparafina H com Parafina;

Inclusão do material em parafina pura fundida, em moldes

de plástico – cassetes.

2.2.4 | Microtomia

Colocação correcta do material

devidamente impregnado no micrótomo

tipo Minot.

Obtenção de cortes semi-finos da

amostra – ténias.

Disposição das ténias em lâminas;

Disposição das lâminas numa placa de aquecimento;

Colocação das lâminas na estufa;

Uso de DPX para colocar as lamelas;

Colocação das preparações na estufa.

2.2.5 | Coloração

Coloração dos lípidos com negro Sudão B.

2.2.5.1 | Hidratação:

Desparafinação à chama;

Lavagem com Isoparafina H utilizando um conta-gotas;

14

Figura_8 | Molde de plástico para inclusão – Cassete.

Figura_9 | Visualização da obtenção de ténias no Micrótomo de tipo Minot.

Disposição das lâminas numa tina com ranhuras com Isoparafina H por 5

minutos;

Passagem por: Isoparafina H, Isoparafina H com etanol, etanol absoluto,

etanol a 95%, etanol a 90%, etanol a 80% e etanol a 70%;

Lavagem em água corrente durante 15 minutos.

2.2.5.2. | Negro de Sudão B:

Preparação da solução de negro Sudão B: 0,25g de Negro de Sudão B em

100mL de etanol a 70%;

Filtração da solução antes de usar.

Revestimento das lâminas com a solução de Negro de Sudão B por 30

minutos;

Lavagem em etanol a 70% durante 5 minutos;

Lavagem em água bidestilada;

Passagem por: etanol a 70%, etanol a 80%, etanol a 90%, etanol a 95%,

etanol absoluto;

Secagem na estufa a 30oC;

Montagem em DPX.

2.3 | Finalização

Observação das preparações ao microscópio;

Obtenção das fotografias.

15

3_RESULTADOS

2

3

4

6 7 5

8

3.1_Legenda | Figura_10 3.2_ Legenda | Figura_11

1_Gotas lipídicas 5_Membrana Celular

2_Parede Celular 6_Parede Celular

3_Citoplasma 7_Gotas lipídicas

4_Espaço intercelular 8_Citoplasma

16

1

Figura_10 | Corte de grão (x1440)

Figura_11 | Corte de grão (x550)

4_DISCUSSÃO | CONCLUSÃO

Uma vez terminado todo o procedimento do protocolo, foi possível observar as

gotículas lipídicas podendo assim ser comprovado o sucesso da experiência e evidenciar

a eficácia do método histológico normal.

Este conjunto de técnicas tem sido utilizado durante anos. Com passar do tempo

foram modificados quer reagentes, quer o material utilizado. Um desses casos é o uso da

Isoparafina H, em vez de Xilol; esta mudança deve-se à menor toxicidade do primeiro.

Outra das alterações feitas foi a montagem em DPX, deixando-se assim em desuso o

bálsamo de Canadá. Esta alteração está relacionada com o facto do antigo reagente ser

mais tóxico, menos transparente, menos solúvel e demorar mais tempo a secar. O DPX

tem, porém, uma desvantagem relacionada com a formação de bolhas de ar. Por esta

razão deve ser extrema a preocupação com este inconveniente, pois a sua ocorrência

pode comprometer a visualização da preparação.

A fixação dos lípidos poderia ser melhor conseguida caso se utilizasse uma

técnica a frio. O mesmo podia ter acontecido coma desidratação, sendo uma alternativa

a esta a criodessecação.

Durante a desidratação é possível que os lípidos tivessem sido lavados das

células. Para minimizar este efeito, esta etapa deveria ser o mais curta possível e

realizada a uma temperatura de 4ºC (Sanderson, 1994).

Outra alteração introduzida ao método histológico normal ocorreu durante a

impregnação, visto que foram utilizados moldes de plástico, em vez de barras de

Leuckart.

A escolha do corante foi adequada mas, poderia optar-se por um corante mais

específico. Uma alternativa ao negro Sudão B seria o Óleo de Vermelho (Horobin,

1994).

A realização de uma experiência controlo, uma preparação com o material

biológico sem o corante, iria permitir-nos confirmar se de facto, estávamos sob a

presença ou não, de lípidos na semente.

Uma outra questão que levantou problemas durante a identificação foi a focagem

das fotografias. Esse problema foi causado pela falta de experiência, podendo apenas ser

resolvido com recurso à insistência e prática repetida. Também relacionada com as

fotografias pode referir-se que, algumas fotografias ficaram comprometidas devido a

17

erros diversos, dado isto, a atribuição aos grupos das respectivas fotos foi feita mediante

um processo diferente daquele que era de esperar, sendo então disponibilizados grupos

de fotografias que os diversos grupos puderam requisitar, sem a prévia identificação de

grupos como outrora se tinha realizado.

Apesar de alguns inconvenientes e com recurso a novas técnicas, o objectivo do

trabalho foi alcançado, podendo agora provar a existência de lípidos em sementes de

grão.

18

5_BIBLIOGRAFIA

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8. http://www.lipidlibrary.co.uk/Lipids/whatlip/índex.htm

9. http://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%ADpido

10. http://www.um.es/molecula/lipi01.htm

11. http://www.um.es/molecula/lipi02.htm

12. http://www.um.es/molecula/lipi04.htm

13. http://www.um.es/molecula/lipi03.htm

14. http://www.dbio.uevora.pt/jaraujo/biocel/lipidos.htm

15. http://en.wikipedia.org/wiki/Sudan_Black_B

16. http://www.cursocitologia.br/html/estudo/Coloracao.htm

Imagens da capa – http://www.gradinamea.ro/_files/Image/articole/5/naut.jpg

- http://www.jardirom.net/icicerarietinum02.jpg

Figura_1 | http://pt.wikipedia.org/wiki/Gr%C3%A3o-de-bico

Figura_2 | http://www.dbio.uevora.pt/jaraujo/biocel/lipidos.htm

Figura_3 | http://www.um.es/molecula/lipi01.htm

Figura_4 | http://www.um.es/molecula/lipi03.htm

Figura_5 | http://www.um.es/molecula/lipi05.htm

Figura_6 | http://www.gmi-inc.com/CliniLab/microm_hm325_microtome.jpg

Figura_7 | http://en.wikipedia.org/wiki/Sudan_Black_B

Figura_9 | http://www.conganat.org/7congreso/imagenes_trabajos/9CVHAP/768-PICT3960.JPG

Figura_10 | Fotografia tirada na aula de MTCF.

Figura_ 11 | Fotografia tirada na aula de MTCF.

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