Univerztet u Beogradu

Mašinski fakultet

SEMINARSKI RAD

Faktor koji utiče na preciznost neinvazivnog merenja glukoze u krvi kratkom talasnom dužinom bliske infracrvene spektroskopije kod

određivanja glikemijskog indeksa hrane

Predmet: Spektroskopija

2

Uvod

Razmatraju se pokušaji da se razviju neinvazivni senzori za određivanje nivoa glukoze u krvi kao što su bliska infracrvena spektroskopija (NIR), optička koherentna tomografija, fotoakusticna spektroskopija, fotoakusticna spektroskopija i kolorimetri. Među ovim tehnologijama, NIR spektroskopija je najaktuelnija zato što NIR zračenje (700-1400 nm)

Osnovne studije o merenju koncentracije glukoze u vodenim i biološkim matricama, krvnom serumu, krvnoj plazmi i punoj krvi su potvrdile pouzdanost NIR mikroskopije. Korišćen je NiR kratke talasne duzine od 700 do 1100 nm za merenje prodiranja spektra u prst. ....

Materijali i metode

Eksperimentalni opseg

Eksperimentalni rad uključuje dve faze. U prvoj fazi identifikuju se četri faktora koji utiču na preciznost neinvazivnog merenja, a zatim se poređenjem u dve metode za svaki faktor utvrđuje se jedan ogovarajući. Četri ispitivana faktora su zapravo područja na telu izmerena NIR spektroskopijom pomoću interaktivne sonde. U drugoj fazi istraživanje se zasniva na korišćenju modela rešenja za tumačenje neivazivnog kalibracionog modela koji je razvijen u prvoj fazi i na proveri mogućnosti korišćenja NIR spektorskopije za merenje glukoze u krvi.

Prva faza: neinvazivno merenje glukoze u krvi

Da bi se razvio i uporedio kalibracioni model vrši se test tolerancije na ugljene hidrate. U pojedinačnom testu ispituje se zdrava osoba, koja nije dijabetičar izgladnjivanjem preko noći najmanje 8 časova i unošenjem porcije hrane koja sadrži 50 g ugljenih hidrata. NIR spektri i koncentracije glukoze u krvi iz uboda prsta subjekta su mereni u intervalima od 10, 15 I 30 minuta u periodu od tri sata. Koncentracije šećera u krvi u Eksperimentu 1 su izmerene pomoću aparata “Glucocard Diameter” zbog njegove velike preciznosti. Komercijalno dostupan NIR spektrofotometar, “NIRSystems 650” opremljen interaktivnom sondom, je korišćen za merenje ljudskog tkiva. NIR sonda je postavljena vertikalno iznad oblasti koja se meri i NIR difuzne refleksije spektra se skupljaju u talasnim dužinama u oblasti od 700 do 1200 nm na intervalima od 2 nm. Kao referentni material koristi se teflon. Pre akvizicije spectra temperatura merne oblasti i sonde je uravnotežana na 31°C dovođenjem u kontakt sa termostatičkim aluminijumskim blokom u periodu od oko 30 s. Urađeno je 50 skenova u trajanju od oko 25 s.

Podaci su analizirani pomoću programa „The Unscrambler“ . Primenjuju se Savitzky – Golay polinomalna i parcijalna regresija. Uklanjaju se tačke izvan oblasti skeniranja zavisno od “Cook” vrednosti distance za šta se obično koristi procena tačke podataka na najmanju regresiju kvadrata. Kvalitet statističkog režima kalibracije koji se zasniva na testovima tolerancije je dovedem u pitanje jer vremenski zavisna spektralna akvizicija može dovesti do slučajne

3

vremenske kalibracije. Da bi se izbegao ovaj problem kalibracija setova uzoraka se uzima iz nekoliko testova, zatim se validacijom procenjuju razvijeni kalibracioni modeli. Statističke karakteristike skupova uzoraka za kalibraciju, prikazani su u Tabeli 1.

Slika 1. Glucocard Diameter i NIRSystems 650

Tabela 1. Statističke karakteristike skupova uzorka krvi za kalibraciju u prvoj fazi

Eksperiment 1. Oblast merenja NIR spektroskopijom

Kao potencijalne oblasti za NIR merenje porede se zglob i dlan ruke. Koristi se velika sonda koja se prilikom spektralne akvizicije ručno pridržava. Analiza glukoze u krvi vrši se po završetku akviczicije spektra. Za četri dana prikupljeno je 40 skupova podataka za svaku oblast merenja.

4

Slika 2. Dva tipa interakcione sonde

Eksperiment 2. Veličina interaktivne sonde

Kod interaktivne metode dubina prodiranja zračenja može se kontrolisati podešavanjem rastojanja između osvetljene stane i fiber-optickog snopa iluminatora. Porede se rezultati dobijeni iz male i velike sonde što je prikazano na Slici 2. Spektri na dlanu ruke su izmereni kao i u prvoj Eksperimentalnoj metodi i za 4 dana prikupljeno je 39 skupova podataka sa obe sonde.

Eksperiment 3. Postavljanje sonde

Sonda se mora pravilno podesiti da bi se postigla pravilna akvizicija spektra. Posebno, varijacije pritiska u kontaktu i položaju sonde utiču na rasipanje zračenja u tkivima što je rezultirano spektralnim promenama kao što su pomeranje bazne linije i promene jačine apsorpcije. U ovom eksperimentu porede se dve metode postavljanja sonde. U prvoj je sonda pridržavana ručno, u drugoj je fiksirana za sto (Slika 3). Temperatura sonde održava se na 31°C pomoću digitalnog temperaturnog kontrolera. Analiza glukoze u krvi vrši se po završetku akvizicije spektra. Prikupljeno je 37 skupova podataka uzastopnog merenja za svaku od metoda, u trajanju od dva dana kod fiksirane sonde i četri dana kod ručnog držanja sonde.

5

Eksperiment 4.Vremenska razlika između spektralne akvizucije i analize nivoa glukoze u krvi

Tokom testa tolerancije koncentracija glukoze u krvi se brzo menjala. U preliminarnom eksperimentu primećena je promena od 15 mg dL -1 za 2 minuta. Vremenska razlika između akvizicije spektra i analize glukoze u krvi može da izazove povećanje greške. U ovom eksperimentu porede se sekvencijalne i simultane analize prolikom vremenske razlike izmedju akvizicije spektra i analize glukoze u krvi iznosi približno 30 s i manje od 1 s. Spektri dlana ruke su mereni velikom sondom fiksiranom za sto. Prikupljeno je 62 skupova podata tokom sekvencijalnog merenja za dva dana, i isto toliko simultanim merenjem u trajanju od 4 dana.

Druga faza: Istraživanje strukture kalibracije i mogućnost NIR merenja pomoću modela rešenja

Jednostavna priprema

Matrica uzorka sastoji se od glukoze i goveđeg serumskog albumina (BSA) i homogenizovanog mleka u 0,1 mol L -1 fosfatnog bufera (ph 7,4). BSA je korišćen za model proteina u krvi , a mleko za rasipanje zračenja. U kratkotalasnij NIR regiji (700-1100 nm), signali glukoze su slabi, pa se zato povećva dužina optičkog puta povećanjem rasipanja radijacije. Korišćen je potpuni faktorski eksperimentalni dizajn u različitim koncentracijama ove dve komponente: faktora glukoze na 10 nivoa (1 mmol L - 1 , 3 mmol L- 1 , 5 mmolL- 1 , 7 mmolL- 1 , 9 mmolL- 1 , 11 mmolL- 1 ,13 mmolL- 1 , 15 mmolL - 1 , 17 mmolL- 1

or 19 mmolL- 1), BSA na 4 nivoa ( 2 gdL-1, 3 gdL-1, 4 gdL-1, 5 gdL-1 ). Za glukozu 1 mmol L-1 je jednak 18.0 mg dL-1. Ovi opsezi koncentracija pokrivaju nivoe koji se najčešće nalaze u humanim kliničkim uzorcima. Koncentracija mleka je konstantna. Imamo ukupno 40 uzoraka (10x4). Rastvori glukoze i BSA dobijeni su razblaživajem čistog reagensa sa fosfatnim puferom propremljenog sa vodom i prečišćenog pomoću „Milli- Q system-a“

6

Akvizicija spektra

Zabeležen je spektar modela rešenja u režimu prolaska pomoću epruveta, slično kao u prethodnom eksperimentu sa mlekom. Za NIR spektrofotometar korišćen je „NIR System s6500“. Debljina stakla epruvete iznosi 1,2 mm, a unutrašnji prečnik 17,6 mm. Kao referentni materijal korišćene su aluminiju keramičke ploče debljine 3 mm. Pre akvizicije spektra temperatura uzorka je kontrolisana pomoču evilibrium epruveta.

Analiza podataka

Skup kalibracija sastoji se od 40 uzoraka, svaki sa različitom koncentracijom glukoze i koncentracije BSA. Podaci su analizirani pomoću „Unsclamber“ programa. Primenjeni su Savitzky-Golay drugi izvod i PLS regresija.

Rezuktati i diskusije

Prva faza: neinvazivno merenje glukoze u krvi

Slika 3. NIR spektar dlana ruke izmeren pod optimalnim uslovima, (a) original spektar i (b)drugi izvod spektra

7

Na slici 3 (a) prikazan je tipičan NIR spektar pod optimalnim uslovima. U drugom izvodu spektra (b) apsorpcija uočena na 760 i 964 nm pripisuju se dioksigenovanom hemoglobinu i vodi.

...........

Rezultati PLS regresije za svaki eksperiment prikatzani su u Tabeli 2. U pogledu merenja NIR spektroskopije uočeno je da je dlan ruke daje bolje rezultate od zgloba. Struktura svake oblasti, posebno stanje krvnih sudova utiče na rezultate. Koža dlana dobija krv iz mreže arterija iz malog prsta i hipotenara. Ova bogata vaskularna mreža rezultira homogenizacijom informacija iz ove oblasti. U slučaju zgloba, međutim, prisustvo vidljivih vena preko kože može izazvati varijacije spektra ukoliko se merna površina blago pomera.

Tabela 2. Parcijalna kalibracija najmanjih kvadrata i provera rezultata kod neinvazivne analize glukoze u krvi

Što se tiče veličine interakcione sonde, utvđeno je da je veća sonda više odgovara za neinvazivna merenja jer je potrebna veća dužina optičkog puta za mrenje slabih signala iz glukoze. Zaključuje se i da se stabilniji spektri dobijaju prilikom fisirane sonde za sto nego kod ručnog pridžavanja.

Što se tiče akvizicije spektra i vremenske razlike između akvizicije i analize glukoze u krvi, spektralna akvizicija mora da se obavlja gotovo istovremeno da bi se dobile ispravne vrednosti.

Najbolji PLS model pokazuje koeficijent višestruke determinacije [R 2]od 0,85 i standardnu grešku za unakrsnu proveru 9,7 mgdL-1. Unakrsna provera merenja NIR spektorskopijom prikazana je na Slici 4. pomoću tačkastog dijagrama. Tačnost ovog modela je izutzetna u poređenju sa prethodnim istraživanjima kao što su merenja na prstu i podlaktici. Jedan od razloga za poboljšanu tačnost jeste veća dužina optičke putanje. Merenja na dlanu velikom interakcionom sondom obezbeđuju dužu optičku putanju, za razliku od merenja prsta. U ovom istraživanju najvažnije pitanje je zapravo da li NIR spektroskopija može izmeriti nivo glukoze u krvi reda 0,01 % [10 mgi L -1]. Da bi se odgovorilo na ovo pitanje, vrše se eksperimenti o kojima se daljem tekstu raspravlja.

8

Slika 4.Tačkasti dijagram unakrsne provere kod merenja glukoze u krvi NIR spektroskopijom

Druga faza: Istraživanje strukture kalibracije i mogućnost NIR merenja pomoću modela rešenja

Tabela 3. prikazuje rezultate PLS kalibracije glukoze u rastvoru. Kalibracioni model koji smo razvili može se uspečno koristiti za koncentraciju određivanja glukoze. Da bi smo ispitali da li model kalibracije zaista koristi informacije koje se odnose na apsorpciju glukoze u krvi ispitali smo tačkaste dijagrame koeficijenta regresije. Koeficijenti regresije su procenjeni pomoću PLS regresije i oni se najčešće koriste za identifikaciju apsorpcionih traka, ili talasnih dužina koje imaju značajan doprinos.

Table 3.

9

Slika 5.(a) Pokazuje poređenja između prvog izvoda glukoze u prahu i hidratizovane glukoze izračunate oduzimanjem spektra vode iz spekra vodenog rastvora glukoze. Pik dobijen na 920 nm, dodeljen CH vibracijama, posmatran je u spektru obe glukoze (praha i hidrata). Pik na 928 nm za hidratizovanu glukozu je verovatno vezan za OH vibraciju atoma vodonika. Slika 5 (b) prikazuje dijagram koeficijenta regresije za kalibracioni model. Pikovi uočeni na 922 nm i 990 nm poklapaju se sa apsorpcionim trakama hidratizovane glukoze. Apsorpcione trake na 920 nm su korišćene za određivanje koncentracije glukoze u plazmi goveda i u određivanju materija vezanih za ugljene hidrate u hrani kao što su suve materije luka i šećera sadržanog u breskvi i pomorandži. Standardne greške predviđanja (SEP) sugerišu da je NIR spektroskopija sposobna za određivanje glukoze u krvi red 0,001 %.

Slika 6 prikazuje koeficijent regresije neinvazivnog PLS kalibracionog modela koji je razvijen u prvoj fazi istraživanja. Pikovi posmatrani na 918 nm i 984 nm se poklapaju otprilike sa onima iz modela rešenja i odnose se na CH i OH vibracije hidratizovane glukoze. Stoga je potvrđeno da neinvazivna kalibracija modela sadrži informacije o apsorpciji glukoze. Pik koji se pojavljuje na 746 nm može se odnositi na stanje oksidacije hemoglobina. U ovom talasnom regionu, oksi i deoksihemoglobina pokazuje različita svojstva apsorpcije. I to nam govori da se stanje oksidacije hemoglobina odnosui na koncentraciju glikoze u krvi. Kada se talasna dužina regiona između 700 nm i 800 nm ukloni ne mogu se dobiti dobri rezutati, stoga je 746 nm talsne dužine takođe važno za kalibracioni model koji mo razvili. Naravno dobrar kalibracioni model se ne može dobiti isključivo pomoću talsnog regiona dužine 746 nm. Iako ovaj model kalibracija pokazuje veliku preciznost pokazuje i velika odstupanja kada se primenjuje različitim danima jer model nije globalan. Male varijacije u uslovima merenja kao što su pomeranje prilikom pritiska sondom i drugi faktori povećavaju predviđenu grešku. Nije lako održati ove faktore konstantnim n bilo kojoj lokaciji u bilo koje vreme. Kod određivanja glikemijskog indeksa ih je manje teško održati konstantnim jer je moguće postaviti dlan ruke tako da se ne pomera tokom testa tolerancije i zahteva samo vrednosti na osnovnim linijama, stoga je lakse primeniti ovaj postupak kod ovog određivanja glikemijskog faktora.

10

11

Zaključak

Faktori koji utiču na preciznost neinvazivnog merenja glukoze u krvi su identifikovani i ispitani u određenim odgovarajućim uslovima za analizu. Najbolji PLS model je dobijen skupljanjem spektra sa dlana ruke velikom interakcionom sondom fiksiranom za sto i pomoću bliske simultane akvizicije spektra i analizom glukoze u krvi. Potvrdili smo da naš kalibraconi model neinvazivne kratkotalasne dužine NIR spektroskopije koristi informacije koje se odnose na apsorpciju glukoze. Preciznost najboljeg modela je klinički prihvatljiva. Merenja na dlanu ruke se relativno lako obavljaju i imaju prednosti u praktičnoj primeni. Takođe je neophodno da s ekoristi velika interakciona sonda. Lakše je primeniti ovaj metod za određivanje glikemijskog indeksa, nego kliničkog praćenja jer je lakše održati konstante vrednosti faktora koji utiču na neinvazivne metode merenja . u bliskoj budućnosti, nadamo se određivanju glikemijskoh indeksa u u hrani, predstavljenom metodom.

12