FAMILIA CORYNEBACTERIACEAE

INTRODUCCION:

La familia Corynebacteriaceae esta formada por un género, Corynebacterium que contiene bacilos rectos o ligeramente curvados, aerobios y facultativos. También se ven formas en maza. Las bacterias permanecen unidas después de la división crepitante, lo que tiene como consecuencia disposiciones de las células en ángulo, o una disposición en empalizada en la que se alinean hileras de células unidas por sus caras laterales. Debido a que la separación celular no suele ser compIeta en las primeras fases de la división, se presentan en L. X. V. Y. en empalizada o adoptando una configuración especial que recuerda las letras chinas. Son inmoviles. No esporulados y con alguna ligera tendencia a la ramificación. Son catalasa-positivos, y a pesar de considerarse como anaerobios facultativos, crecen mejor en aerobiosis y producen un velo superficial en los medios líquidos. No son acido-alcohol resistentes, pero presentan rasgos comunes con micobacterias y nocardias, ya que su pared contiene ácido mesodiaminopimélico, arabinosa, galactosa y ácidos micólicos. Aunque algunas especies son saprofitos inocuos, muchas corinebacterias son patógenas de plantas y animales. Por ejemplo, C. diphtheriae es el agente causante de la difteria en humanos, el cual produce una potente exotoxina causante de la difteria humana.

OBJETIVOS:

Estudiar y conocer las características generales y su clasificación de la familia Corynebacteriaceae.

Estudiar las características diferenciales y especies del genero Corynebacterium.

Estudiar los aspectos morfológicos, fisiológicos, antigénicos y determinantes de patogenicidad de la especie C. diphtheriae.

FAMILIA CORYNEBACTERIACEAE

Una familia de bacilos Gram positivos de morfología irregular, crecimiento aeróbico, no esporulados y no son ácido-alcohol resistentes, compuestos de varillas generalmente no móviles, a veces con cuentas o bandas con gránulos metacromáticas. Contiene el género Corynebacterium 

CLASIFICACION CIENTIFICA:

Según el Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática 2da edición ubica a Corynebacterium en el volumen 4: Bacterias Gram positivas con alto contenido de G+C.

Clasificación científica

Dominio: Bacteria

Filo: Actinobacteria

Clase : Actinobacteria

Subclase: Actinobacteridae

Orden : Actinomycetales

Suborden: Corynebacterineae

Familia: Corynebacteriaceae

Género: Corynebacterium

Manual de Bergey de Bacteriología determinativo 9na edición:

Categoría II: Bacteria Gram (+) con pared celular. Grupo 20: Bacilo Gram (+) no esporulantes irregulares.

GENERO CORYNEBACTERIUM:

La diferenciación entre el género Corynebacterium de otras bacterias corineformes está en la positividad de la catalasa, la negatividad de la motilidad, citrato, hidrólisis de gelatina y esculina; no esporuladas;  son aerobias o anaerobias facultativas, quimioorganotrofos.

La tinción de Gram muestra bacilos Gram positivos rectos o irregulares ligeramente curvados con lados no paralelos y a veces con extremos ensanchados, dando el típico aspecto de maza, cuyo tamaño oscila entre 2-6 micrómetros de longitud y 0,5 micrómetros de diámetro, a menudo con la típica

forma de V (lo que también se denomina “forma de letras chinas”), aunque también aparecen formas elipsoidales.

Tinción de Gram (izda.) y microscopía de barrido (dcha.) de Corynebacterium spp.

Este género incluye especies con metabolismo fermentativo y no fermentativo u oxidativo. Algunas especies son lipófilas, es decir, requieren la presencia de lípidos para su desarrollo en medios de cultivo. Con respecto a los requerimientos nutricionales, todos ellos necesitan biotina para su crecimiento y algunas cepas requieren además tiamina y ácido p-aminobenzoico (PABA).

La bacteria crece en caldo simple, medio de Loeffler, agar sangre y telurito potásico (AST), formando colonias pequeñas grisáceas de aspecto granuloso, traslúcidas con centros opacos, convexas con bordes continuos. El color tiende a ser blanco amarillento en los medios de cultivo de Loeffler. En AST, el organismo puede formar colonias grises con centros negros y bordes dentados dando la apariencia de flores (C. gravis), otras tienen bordes contínuos (C. mitis), mientras que otras tienen bordes intermedios entre continuas y dentadas (C. intermedium).

Desde el punto de vista quimio taxonómico, las bacterias del género Corynebacterium contienen en su pared arabinosa, galactosa y ácido meso-diaminopimélico (m-DAP), ácidos micólicos de cadena corta con 22 a 36 átomos de carbono, a excepción de C. amycolatum, C. atypicum y C. kroppenstedtii. Los principales ácidos grasos celulares son el ácido palmítico, oleico y esteárico.

El contenido habitual de guanina más citosina (G+C) en el ADN del género Corynebacterium está en un rango entre 51 y 63 mol %, indicando la gran diversidad de este género. La relación filogenética fue establecida en 1995 (Ruimy et al., 1995; Pascual et al., 1995) creándose una amplia base de datos para futuros estudios comparativos de la secuenciación del gen 16S rARN, y poder incluir o excluir miembros en este género.

De las 68 especies de corinebacterias descritas en total: 31 se han aislado de forma exclusiva en humanos, 24 nunca en humanos (15 solo en

animales y 9 solo en vegetales o ambiente) y 14 en humanos y además en animales o vegetales y/o ambiente, que se exponen a continuación:

C. diphtheriae

C. amycolatum (mastitis en vaca)

C. aquaticum

C. bovis (pielonefritis y mastitis en bóvidos)

C. caspium

C. equi

C. glutamicum

C. haemolyticum

C. jeikeiun

C. parvum (también llamada Propionibacterium acnes)

C. pseudodiptheriticum (también llamada C. hofmannii)

C. pseudotuberculosis (équidos, bóvidos, óvidos)

C. pyogenes

C. urealyticum

C. renale

C. striatum

C. tenuis

C. ulcerans (mastitis en vaca, exudado nasofaríngeo de perro y gato).

C. xerosis (cerdo y cabra)

C. mucifaciens (polvo del ambiente en granjas)

Dos subespecies: C. afermentans subsp. afermentans y C. afermentans subsp. lipophilum.

Biotipos de C. diphtheriae: gravis, mitis, intermedius.

Corynebacterium diphtheriae :

Corynebacterium diphtheriae, también conocido como bacilo de Klebs-Löffler es el bacilo causante de la difteria, fue descubierto en 1884 por el patólogo Edwin Klebs y el bacteriólogo Friedrich Löffler.Según el Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática 2da edición, ubica a Corynebacterium diphtheriae en el volumen 4: Bacterias Gram positivas con alto G+C.I. HABITAT: Se encuentran en el suelo y el agua; en el ser humano la localidad primaria es en el tracto respiratorio superior, también en la mucosa y piel del hombre y de los animales.

II. ASPECTOS MORFOLOGICOS:

C. diphtheriae es un microrganismo Gram positivo delgado en forma de bastón que no es acido resistente y no forma esporas, no capsulado.

Las células miden entre 1.5 y 5um de largo y de 0.5 a 1 um de ancho.

En frotis teñidos aparecen en empalizadas o como células individuales que yacen en ángulos agudos unos con otras en formaciones en V y en L. Estas presentaciones similares a letras chinas son causadas por el movimiento quebrado que se produce cuando dos células se dividen.

Cuando proliferan en medios de nutrición complejos con velocidad máxima, los bacilos diftéricos son uniformes. En cambio, cuando proliferan en medios sub óptimos, como por ejemplo suero coagulado de Loffler o medio con huevo coagulado de Pai, las células son pleomórficas y se tiñen de forma irregular con azul de metileno o con azul de toluidina.

Son frecuentes las formas en cuentas y barras, así como los engrosamientos en forma de palo de golf. Los gránulos metacromáticos (de Babes-Ernst) responsables del aspecto en cuentas representan cúmulos de polifosfatos polimerizados.

Coloración Gram para Corynebacterium diphtheriae

III. ASPECTOS FISIOLOGICOS:

Características de su cultivo: C. diphtheriae es un microrganismo aerobio y anaerobio facultativo pero crece mejor en condiciones aerobias. Se requieren medios complejos para el aislamiento primario y la caracterización.

La mayor parte de las cepas crecen como una película seria en la superficie de los medios líquidos.

En medio con suero coagulado de Loeffler, útil para el aislamiento primario del microrganismo, luego de 12 a 24 hs de incubación a 37°C aparecen diminutivas colonias brillantes, de color blanco grisáceo.El medio de Loffler también es útil porque no permite el crecimiento de los estreptococos y los neumococos que pueden estar presentes en la muestra clínica.

Cuando se incorporan sales de telurito a los medios utilizados para el aislamiento primario también se reducen el número de contaminantes. En el medio de telurito las colonias de C. diphtheriae adoptan un color negro o gris característico y se pueden diferenciar tres tipos principales de colonias: Gravis, Mitis, Intermedius.

Las colonias de las cepas gravis son grandes y planas, 1.5-2.5 mm; de color gris a negro, con superficie opaca, centro elevado, bordes irregulares.

Los microrganismos mitis producen colonias de tamaño mediano que son mas pequeñas, 1.5 – 2 mm; negras, brillantes, mas convexas y redondas.

Las colonias de cepas intermedius son muy pequeñas, 0.5-0.75 mm; lisas o rugosas, centro elevado, borde sinuoso, grisácea.

El ion telurito atraviesa la membrana celular hacia el citoplasma, donde es reducido a telurio metálico y precipitado. No existe una relación constante a la severidad de la enfermedad y los tres tipos de colonias.

Medio Agar Sangre: C. diphtheriae var. Intermedius: más pequeñas, planas, cremosas,

transparentes, no hemolíticas. C. diphtheriae var. Mitis y C. diphtheriae var. Gravis: más grandes,

convexas, débil beta hemólisis.

Corynebacterium diphtheriae en Agar Columbia con 5% de sangre de carnero citratada. Cultivo de 24 horas, 37°C en una atmósfera enriquecida con 5% de dióxido de carbono

Medio Agar Sangre Cistina Telurito:Corynebacterium diphtheriae reduce el telurito del medio a telurito metálico, el cual precipita y produce el desarrollo de colonias negras, gris acero, de 1 a 3 mm de diámetro. El aspecto de las colonias es orientador de los posibles biotipos.

C. diphtheriae var. Intermedius: Colonias negras planas y pequeñas. C. diphtheriae var. Mitis y C. diphtheriae var. Gravis : Colonias negras, más

grandes, convexas, lisas y brillantes

Medio Agar Tinsdale:Este medio de cultivo se utiliza para la detección de la enzima cistinasa y es de utilidad para la identificación presuntiva de C. diphtheriae.El medio agar Tinsdale contiene telurito y cistina. La cistinasa produce sulfuro de hidrógeno a partir de la cistina, el cual reacciona con el telurito formando un “halo marrón difuso” alrededor de una colonia negra, luego de incubar a 37 ºC durante 24-48 hs. Otras especies de corinebacterias pueden dar colonias negras, pero sin la formación del halo marrón.

Izquierda: C. diphtheriae, produce sulfuro de hidrogeno con formación de halo marrón alrededor de la colonia.Derecha: C. xerosis, no produce sulfuro de hidrogenoMetabolismo de C. diphtheriae:

Oxidativo- fermentativo. Catalasa (+). Ureasa (-). Gelatinasa (-). Fermentación de glucosa (+). F. de maltosa (+). F. de sacarosa (-). F. de lactosa (-). Reducción de nitratos (+). F. de trehalosa (-). Producción de cistinasa en el medio Tinsdale (+).

Resistencia: C. diphtheriae es mas resistente a la acción de la luz, la desecación y el congelamiento de la mayor parte de los bacilos no formadores de esporas. Los microrganismos pueden resistir por lo menos 14 semanas en fragmentos secos de seudomembranas. Sin embargo, los gérmenes son destruidos con facilidad y rapidez al ser expuestos a 100°C durante un minuto o a 58°C durante 10 minutos. Son susceptibles a casi todos los desinfectantes de uso habitual.

IV. ASPECTOS ANTIGENICOS:C. diphtheriae es una especie heterogénea desde el punto de vista antigénico. En pruebas de aglutinación con suspensiones de células enteras se observan un gran número de tipos serológicos. Los tres tipos principales de colonias gravis, mitis e intermedius reflejan diferencias en la superficie celular y constituyen los principales biotipos del microrganismo. Dentro de cada uno de estos biotipos se encuentran un grupo más o menos separado de serotipos aglutinantes. También se han detectado diferencias adicionadas en los componentes de la superficie celular por medio de pruebas más sensibles de tipificación con bacteriófagos y producción de bacteriocina. No obstante, y sin importar el tipo, todas las cepas toxigenicas producen una toxina que es idéntica desde los puntos de vista biológicos e inmunológicos. ANTIGENO K: Los antígenos responsables de la especificidad del tipo de las cepas de C. diphtheriae son proteínas termolábiles, los antígenos k, localizados en las capas superficiales de la pared. Estos antígenos desempeñan un papel importante de la inmunidad antibacteriana y en la hipersensibilidad, aparte de la inmunidad antitóxica. Es probable que la aparición de tipos antigénicos diferentes de C. diphtheriae explique el desarrollo de diphtheria en pacientes inmunizados que presentan un nivel detectable de antitoxina circulante. Los antígenos k localizados sobre la superficie, junto con el factor cordón glicolipídico, son los principales determinantes de la invasibilidad y la virulencia de los bacilos diftéricos.

ANTIGENO O: El antígeno O termostable es un antígeno de grupo común a las corinebacterias parasitas del ser humano y de lo animales. Se trata de un polisacárido que contiene arabinogalactanos y es el antígeno responsable de la reactividad cruzada con micobacterias y nocardias. Las células de las corinebacterias y todos sus componentes subcelulares son antígenos excelentes.

Cuando se las administra a los animales con agentes inmunizantes, también actúan como adyuvantes. V. DETERMINANTES DE PATOGENICIDAD:

Existen varios factores de patogenicidad: El antígeno K. cord factor. Hialuronidasa, neuraminidasa y ADNasa. Que contribuyen a que la bacteria invada la superficie de las membranas mucosas de las vías respiratorias altas, desde donde liberan la toxina. Aunque no produce hemolisina difusible, en medios de agar-sangre puede dar una pequeña zona de hemolisis situada debajo o alrededor de las colonias. Esta hemolisina no tiene un papel demostrado en la patogénesis de la enfermedad.

Antígeno K: Es antifagocitario.

Cord factor: Es un glicolípido tóxico (6,6' diester de trehalosa), que posee los ácidos micolicos característicos de C. diphtheriae: Acido corinemicólico (C32H6203) y corinemicolénico (C32H6403)' Su actividad farmacológica es similar al cord factor aislado de Mycobacterium tuberculosis. En el ratón lesiona las mitocondrias, disminuye los procesos de respiración y fosforilación, y ocasiona la muerte celular.

Hialuronidasa y ADNasa: Son factores de difusión que contribuyen al edema, necrosis y hemorragia.

Neuraminidasa: Degrada los residuos de acido N-acetilneuramínico, que existen en las células de epitelio y favorece, por tanto, la colonización.

Exotoxina

La síntesis de toxina diftérica esta en relación con un mecanismo controlado por el gen de un fago, que convierte la bacteria receptora en lisogena y Ie confiere al mismo tiempo el carácter toxigénico. Existe, por tanto, correlación entre lisogenia y toxinogenesis. La presencia del carácter tóxico se debe a que llevan un gen estructural responsable de él, el gen tox. Las cepas toxigénicas (tox +) son portadoras del profago B y las no toxigenicas (tox-) pueden convertirse en toxigenicas por lisogenización con el fago temperado.

En definitiva, la toxina se produce por las cepas de C. diphtheriae lisógenas para el bacteriófago B, que es el que lleva el gen estructural tox. El gen tox se ha detectado también en otros corinebacteriófagos diferentes genéticamente, que hace suponer que el gen tox esta muy difundido en la población de corinebacteriófagos. La regulación de la síntesis de la toxina diftérica es compleja.Las cepas de C. diphtheriae toxigenicas varían ampliamente en su capacidad de producir aquella. Además, esta influida por las condiciones ambientales y del medio de cultivo. La síntesis y liberación de toxina se inhiben cuando se incrementa el contenido de hierro inorgánico.

El modelo que a nivel molecular se ha propuesto reflejar la regulación de la producción de toxina es el siguiente:

C. diphtheriae posee un gen (ctr) que lleva la información estructural para la síntesis de un aporrepresor tox (ar). En presencia de hierro puede formarse un complejo represor hierro (rte) y unirse específicamente al locus operador tox del fago. En condiciones de escaso contenido de hierro, el complejo hierro-represor puede disociarse y el gen tox deja de estar reprimido.

Propiedades

La toxina diftérica se produce y se libera hacia el exterior en forma de una simple cadena polipeptídica, de peso molecular de 61.000 daltons. Esta cadena, que integra no es toxica, posee dos puentes disulfuro, uno de los cuales se hidroliza fácilmente por la tripsina y proteasas bacterianas, lo cual hace que la toxina adquiera propiedades tóxicas y aparezcan dos fragmentos A y B. En el fragmento B existe un puente disulfuro, que, cuando se rompe, da lugar a dos cadenas y consiguiente perdida de la mayor parte de la toxicidad.

Las propiedades biológicas de los dos fragmentos A y B son distintas, pero ambos son necesarios para la acción toxica en las células animales y cultivos celulares.El fragmento A tiene un peso molecular de 21.000, es el fragmento enzimáticamente activo que penetra en el interior de las células y es, además, responsable de la inhibición de la síntesis proteica.

El fragmento B es esencial para la unión de la toxina a las células eucariotas y el paso del fragmento A al citoplasma.Los animales varían en su sensibilidad a la toxina diftérica. Esta es letal para el hombre, conejo y cobayo. Las ratas y ratones son más resistentes, posiblemente a causa de que sus células muestran algún defecto en la unión de la toxina a los receptores de la membrana celular o en el transporte al interior de la célula del fragmento A.

Modo de acción:

Aunque no se conoce la naturaleza de los receptores de la membrana celular ni el mecanismo por el que el fragmento A atraviesa esta, ciertos datos indican que el receptor específico puede ser una glicoproteína que contiene un oligosacárido. Se ha sugerido que se produce una interacción entre estos receptores específicos de la membrana (HB-EGF) y el residuo terminal COO- del fragmento B. A continuación se produce un cambio estructural en la toxina, que la hace hidrofóbica, permitiendo la inserción del fragmento B en la membrana, el cual abrirá un canal par el que posteriormente se introduce el fragmento A hacia el citoplasma. El fragmenta B permanece por fuera de la membrana.

La toxina diftérica por medio de su fragmento A inhibe la síntesis proteica de las células eucariotas sin inhibición de otras funciones metabólicas ni daño evidente de la membrana celular. El fragmenta A inhibe la elongación de la cadena polipeptídica, siempre y cuando exista nicotinamida-adenin-dinucleótido (NAD), inactivando el factor de elongación 2 (FE-2), que es necesario para la translocación del polipeptidil- tRNA desde el receptor al sitio donante de los ribosomas eucarióticos. El fragmento A, al inactivar el factor FE-2, cataliza una reacción que libera nicotinamida libre, mas un complejo inactivo de FE-2-ADPR (adenosin-difosfo-ribosa).La reacción que cataliza, en definitiva, la toxina diftérica es la siguiente: FE-2 + NAD~ ADPR - FE-2 + nicotinamida + H

El fragmento A cataliza la transferencia de ADP-ribosa desde el NAD al factor de elongación 2 (EF-2) de la célula eucariota. Se inhibe la función de EF-2 en la síntesis de proteínas, lo que causa la muerte de la célula.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

Prescott, L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. MICROBIOLOGÍA. McGraw-Hill

Interamericana. 7ª edición. Madrid. 1999

JOKLIK, W.K; H.P. WILLET (1997) Microbiología de Zinsser. Ed. Panamericana. Buenos Aires.

MADIGAN, MICHAEL T; MARTINKO, JOHN M.; PARKER, JACK. 2004. Microbiología de Brock. 10 ª edición. Prentice Hall.

Pumarola A, Rodriguez-Torres A, García-Rodriguez JA, Piédrola-Angulo G. Microbiología y parasitología médica.2da ed. Barcelona: Salvat; 1990.

http://www.bacterio.cict.fr/c/corynebacterium.htlm.

http://alumnatbiogeo.blogspot.com/2008/11/microbiologa-hasta-qu-punto-somos.html