Upload
trina
View
55
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Familiární hyperbilirubinémie. Milan Jirsa Laboratoř Experimentální Hepatologie CEM I KEM Praha. Degradace hemu, typy žloutenek. Převážně nekonjugovaná (premikrosomální typ). Převážně konjugovaná (postmikrosomální typ). Familiární nekonjugované hyperbilirubinémie. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Familiární hyperbilirubinémieFamiliární hyperbilirubinémie
Milan Jirsa
Laboratoř Experimentální Hepatologie CEM IKEM Praha
Degradace hemu, typy žloutenekDegradace hemu, typy žloutenek
Převážně nekonjugovaná (premikrosomální typ)
Převážně konjugovaná (postmikrosomální typ)
1. Familiární hyperbilirubinémie Gilbertova typu2. Crigler-Najjarův syndrom I. typu
Familiární nekonjugované hyperbilirubinémieFamiliární nekonjugované hyperbilirubinémie
Familiární konjugované hyperbilirubinémieFamiliární konjugované hyperbilirubinémie
1. Dubin-Johnsonův syndrom2. Rotorův syndrom
Mikrosomální konjugační aparátMikrosomální konjugační aparát
Bilirubin UDPG glukosiduronát transferáza
Benigní hyperbilirubinémieBenigní hyperbilirubinémieGilbertova typuGilbertova typu
• Autosomálně recesívně nědičná benigní metabolická odchylka postihující 5-10% populace
• Familiární žloutenka, často jen ikterus sklér, zhoršení při stresu, hladovění a fyzické námaze
• Někdy v anamnéze protrahovaná novorozenecká žloutenka
• Hodnoty sérového bilirubinu do 100 mol/l• Zpomalená clearance nepřímého bilirubinu• Veškeré další laboratorní nálezy opakovaně v normě
Benigní hyperbilirubinémieBenigní hyperbilirubinémieGilbertova typuGilbertova typu
• Diagnóza: per exclusionem bez použití invazívních vyšetřovacích metod
• Léčba: není třeba• Prognóza: pravděpodobně lepší než normální populace (Vítek L., Jirsa M. et al., Atherosclerosis 160, 2002, 449-56)
Crigler-Najjarův syndromCrigler-Najjarův syndromI. Typ:
• Autosomálně recesívně dědičná fatální novorozenecká převážně nekonjugovaná žloutenka• Hodnoty sérového bilirubinu bez léčby 350 – 650 mol/l• Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy• Úmrtí v raném věku následkem poškození CNS
II. Typ (Ariasův syndrom):• Autosomálně recesívně dědičná závažná novorozenecká převážně nekonjugovaná žloutenka• Hodnoty sérového bilirubinu bez léčby 100 – 350 mol/l• Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy
Crigler-Najjarův syndromCrigler-Najjarův syndrom• Diagnóza: u I. typu jasná již v novorozeneckém věku, II.
typ může diagnóze uniknout (Vítek L, Bosma P, de Boer A, Jirsa M et al., Čas Lék Česk 135, 1996, 114-116)
• Léčba: u I. typu intenzívní fototerapie, transplantace jater v dětském věku, zkouší se transplantace hepatocytů a genoterapie, u II. typu v raném dětském věku fototerapie, později bez léčby
• Prognóza: u I. typu špatná, u II. typu po překonání kritického období v dětském věku dobrá
Příčina familiárních nekonjugovanýchPříčina familiárních nekonjugovanýchhyperbilirubinémií:hyperbilirubinémií:
Defekt v genu UGT1A1 nebo v jeho promotoru
Uspořádání Uspořádání UGT1AUGT1A lokusu lokusu
Lokus na 2q37 obsahuje 13 genů rodiny UGT1A
Mutace v genu Mutace v genu UGT1A1UGT1A1 vyvolávající vyvolávajícíCrigler-Najjarův syndromCrigler-Najjarův syndrom
Kadakol et al., 2000
37
17
tgccatatatatatatataagtaggagagggcgaacctctggcaggagcaaaggcgccatgGCT
TATA box
Začátek transkripce
1.exon
TATA box v promotoru TATA box v promotoru UGT1A1UGT1A1
Dubin-Johnsonův syndromDubin-Johnsonův syndrom• Familiární převážně konjugovaná hyperbilirubinémie• Hepatomegalie• Ukládání lysosomálního pigmentu příbuzného melaninu
v hepatocytech• Koproporfyrinurie s převahou izomeru I• Zpomalené vylučování bromsulfoftaleinu, indocyaninové
zeleně a dalších barviv aniontové povahy• Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy
ABCC2/MRP2/cMOATABCC2/MRP2/cMOAT
• Kanalikulární transportér pro konjugovaný bilirubin, glukosiduronáty, sulfáty a jiné multivalentní organické anionty
• Exprimovaný v apikální membráně hepatocytů a enterocytů v duodenu a v proximálním jejunu
Upraveno podle Kullak-Ublick et al., J.Hepatol. 2000
• je lokalizovaný na 10q24 (45 kb) a sestává ze 32 exonů• kóduje ABC transportér o MW 190 kDa
Tsuji et al., Gastroenterology 1999
Gen Gen ABCC2/MRP2/cMOATABCC2/MRP2/cMOAT
ABCC2ABCC2 a mutace v tomto genu popsané u a mutace v tomto genu popsané u nemocných s Dubin-Johnsonovým syndromemnemocných s Dubin-Johnsonovým syndromem
Upraveno podle Toh et al., Am.J.Hum.Genet. 1999
Rotorův syndromRotorův syndrom• Familiární převážně konjugovaná hyperbilirubinémie• Koproporfyrinurie s převahou izomeru I• Zpomalené vylučování bromsulfoftaleinu,
indocyaninové zeleně a dalších barviv aniontové povahy
• Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy
• Na rozdíl od Dubin-Johnsonova syndromu chybí lysosomální pigment v hepatocytech
Pracovní hypotéza:Pracovní hypotéza:
Rotorův syndrom je vyvolán dosud neznámou mutací v genu ABCC2/MRP2/cMOAT nebov jeho promotoru
Pacient F.J. – anamnézaPacient F.J. – anamnéza
RA:• Rodiče žloutenku nikdy neměli, 4 zdravé sestry, dcera v.s. Gilbertův syndrom
OA, NO:• Od narození ikterus sklér• Intermitentní žloutenka při chřipce či fyzické námaze• V 7 letech hospitalizován pro žloutenku (st.p. hepatitidě?)• V 18 letech hospitalizován pro žloutenku, neodveden • Před 5 lety hosp. pro embolii a. centralis retinae, zjištěna konjugovaná hyperbilirubinémie, hodnoty trvale okolo 150 mol/l• Od té doby trvale ikterický
Pacient F.J. – lab. nálezy, USG a ERCPPacient F.J. – lab. nálezy, USG a ERCP
Chromatografie izomerů koproporfyrinu v moči
• Převážně konjugovaná hyperbilirubinémie• Všechna ostatní běžná vyšetření v normě (KO, JT + další biochemické testy včetně vyšetření
žlučových kyselin v séru, imunologie, screening na
hemolýzu aj.)
• Intermitentně mírně zvýšený odpad porfyrinů (max. 502 g / 24hodin), chromatograficky výlučně koproporfyrin, z toho 2/3 izomer I, 1/3 izomer III• USG jater a žluč. cest bez patol. nálezu• ERCP bez patol. nálezu
Pacient F.J. – cholescintigrafiePacient F.J. – cholescintigrafie
zdravý jedinec pacient F.J.
Závěr: Ojedinělý nález extrémně závažné poruchy chromoexkrečních funkcí jater (prim. MUDr. J. Urbánek, Ústav nukleární medicíny VFN Praha)
Pacient F.J. – histologické vyšetřeníPacient F.J. – histologické vyšetření
Vzorek jaterní tkáně (cetrozonální oblast) s normální histologií a cytologií. Nápadná je absence lipopigmentu v hepatocytech.
Hematoxylin & Eosin, zvětšeno 150 x
Pacient F.J. – imunohistochemické vyšetření Pacient F.J. – imunohistochemické vyšetření ABCC2/MRP2/cMOAT v játrechABCC2/MRP2/cMOAT v játrech
C F.J.
Vzorky jaterní tkáně z pacienta s minimální hepatopatií bez cholestázy (C) a pacienta F.J. V obou případech je imunohistochemicky prokazatelná přítomnost ABCC2 na biliárním pólu hepatocytů.
Protilátka M2III-6, zvětšeno 150 x
Pacient F.J. – určení sekvence Pacient F.J. – určení sekvence ABCC2ABCC2zz genomové DNA genomové DNA
Izolace genomové DNA z periferních leukocytů
PCR amplifikace jednotlivých exonů
Agarosová elektroforéza
Izolace produktů z gelu
Sekvenační PCR s univerzálními značenými primery
Sekvenování
Pacient F.J. – určení sekvence Pacient F.J. – určení sekvence ABCC2ABCC2zz genomové DNA genomové DNA
Pacient F.J. – heterozygotní synonymní Pacient F.J. – heterozygotní synonymní polymorfismus v exonu 28polymorfismus v exonu 28
GTACGATGGYTACAGTGTBases 272273274275276277278279280281282283284285286287288
3972T+C(I1324I) ę
1324 Isoleucin
Promotor ABCC2/MRP2Promotor ABCC2/MRP2
Úvod• Oblast –517 až –197 je rozhodující pro bazální transkripci a vazbu pro
játra specifických transkripčních faktorů AP1, SP1, HNF1, HNF3• Proximální promotor (cca 1200 bp) je zodpovědný za expresi ABCC2
stimulovanou dimery FXR, PXR a CAR s RXR• Žádná mutace v oblasti promotoru ABCC2 asociovaná s
hyperbilirubinémii není známa
Postup• Metodou PCR byly z gDNA amplifikovány 3 fragmenty pokrývající 1824
bp promotoru• Sekvenováním bylo zjištěno pořadí bází -1 až -1607
Pacient F.J. – heterozygotní polymorfismus Pacient F.J. – heterozygotní polymorfismus v promotoru ABCC2/MRP2v promotoru ABCC2/MRP2
GGAAGACRGAACCGGAGGBases 464465466467468469470471472473474475476477478479480
G-995G+A ę
Význam: nejspíš žádný, polymorfismus nalezen u 16% kontrol
ZávěrZávěr1. Vrozená hyperbilirubinémie u našeho nemocného není
podmíněna žádnou z dosud známých mutací v genu ABCC2/MRP2/cMOAT
2. V genomové DNA jsme nenalezli žádnou mutaci v ABCC2, která by vysvětlovala fenotyp onemocnění
Další postupDalší postup1. Sekvenovat cDNA s cílem vyloučit rozsáhlé delece a zjistit
expresi obou alel na úrovni transkripce2. Upřesnit lokalizaci ABCC2 v hepatocytech konfokální
mikroskopií (defekt radixinu?)3. Vyšetřit expresi MRP3 (defekt mikrosomální
X-glukosiduronát translokázy?)
Mikrosomální konjugační systémMikrosomální konjugační systém
X-glukosidutonát translokáza
Složení žlučeSložení žluče
Podle Carey MC, Cahalane MJ: Enterohepatic circulation. In: Arias IM, Jakoby WB, Popper H, Schachter D, Schafritz DA, editors. The liver: biology and pathobiology. Raven Press New York 1988, 573-616.
HDL
LDL
VLDL
ER: synthesis
GOLGI
TGN
SR-B1
LDL-R
NPC?
CE
peroxisomes
BSEPBS
MDR3PC
ACAT2
Lipid droplets:CE storage
SCP-2
endolysomal pathway
FC
FC
CE
NPC?
Kanalikulární transportéryKanalikulární transportéry
?
?
ABCG5/G8
FC
NCEHCYP7A1
ABCC2/MRP2bilirubin
transportér choroba vyvolaná jeho defektem ABCB11/BSEP PFIC2 = progresívní familiární intrahepatální
cholestáza 2. typuABCB4/MDR3 PFIC3
Cholestatická cirhóza mladistvýchIntrahepatální pozdně těhotenská cholestáza (ICP)Familiární cholelitiáza
ABCG5/G8 SitosterolémieABCC2/MRP2 Dubin-Johnsonův syndrom
Rotorův syndrom?ATP8B1/FIC1 PFIC1 = Bylerova choroba
Grónská familiární cholestázaBRIC = benigní rekurentní intrahepatální cholestáza
Defekty v genech kódujících kanalikulárních Defekty v genech kódujících kanalikulárních transportéry a jejich následky transportéry a jejich následky
Benigní rekurentní intrahepatální cholestáza Benigní rekurentní intrahepatální cholestáza (BRIC, syndrom Summerskill- Walsheův)(BRIC, syndrom Summerskill- Walsheův)
• Autosomálně recesívní intrahepatální cholestáza• Ataky žloutenky provázené úporným svěděním a
přechodnou hepatomegalií• První ataka obvykle do konce 2. dekády, trvání ataky
týdny až řadu měsíců, počet atak 1 až 30 za život• Laboratorně hyperbilirubinémie, zvýšená aktivita ALP a
koncentrace a sérových žluč. kyselin, normální S-GMT a cholesterol
• Prognóza většinou dobrá, asi 6% progreduje v cirhózu
Protein ATP8B1/FIC1Protein ATP8B1/FIC1
• Exprimovaný v apikální membráně hepatocytů, enterocytů v distálním ileu, acinárních buněk pankreatu, nízká exprese v řadě dalších tkání
• Funkce neznámá, hypotézy:flipáza membránových fosfolipidůtransportér hydrofobních žlučových kyselin
iontový kanál
Gen Gen ATP8B1/FIC1ATP8B1/FIC1
• je lokalizovaný na 18q21, zaujímá 98kb• sestává z 27 exonů• kóduje ATPasu o MW 140 kDa
mutace exon důsledek citaceT1982C 17 I661T Bull 1998
CT2286-4AA ? Bull 19982384del9 20 795delGNR Bull 1998Splice site 24 Skipped exon van Ooteghem 2002
Mutace v genu Mutace v genu ATP8B1/FIC1 ATP8B1/FIC1 asociované s BRICasociované s BRIC
Pacient M.K. – anamnézaPacient M.K. – anamnéza
RA: negativní
OA, NO:• Nar. 1972, protrahovaná novorozenecká žloutenka• V 10 měsících žloutenka po varicele, závěr nejasný, léčba kortikoidy• 1975 2měsíční ataka žloutenky• 1976 roční ataka, chir. revize žluč. cest: bez patol. nálezu• 1990 po sinusitidě další ataka, vyloučena IHE, nor. ERCP, závěr nejasný, opět léčen kortikoidy • 1990-98 3x jaterní biopsie• 1998 další ataka, hosp. na Ústavu klin. Imunologie LFHK
Pacient M.K. – lab. nálezy, USG a ERCPPacient M.K. – lab. nálezy, USG a ERCP
• FW 50/86• KO: anémie, leuko 12• Hyperbilirubinémie, ALP 14,4 kat/l, celk. žluč. kyseliny 220 mol/l• GMT opakovaně normální• Fe, transferin, Cu, ceruloplasmin, alfa1-AT v normě• Imunologická vyšetření v normě• USG jater a žluč. cest bez patol. nálezu• ERCP bez patol. nálezu• 4. jaterní biopsie: intrahepatální cholestáza bez známek přestavby
Pacient M.K. – určení sekvence Pacient M.K. – určení sekvence ATP8B1ATP8B1zz genomové DNA genomové DNA
Izolace genomové DNA z periferních leukocytů
PCR amplifikace jednotlivých exonů
Agarosová elektroforéza
Izolace produktů z gelu
Sekvenační PCR s univerzálními značenými primery
Sekvenování
Pacient M.K. – heterozygotní bodová mutace Pacient M.K. – heterozygotní bodová mutace v 17. exonu v 17. exonu ATP8B1ATP8B1
AGAAGTCAAAGGAACATCB ases 240241242243244245246247248249250251252253254255256
T1982T+Cę
M.K. kontrola
...GCTACAAGGAAAtTGAAGAAAAAGAATTTACA...
...CGATGTTCCTTTAACTTCTTTTTCTTAAATGT...
Tsp509ITsp509I
95 bp 14 bp
Pacient M.K. – heterozygotní delecePacient M.K. – heterozygotní deleceve 24. exonu ve 24. exonu ATP8B1ATP8B1
G C A T G G G G W C M T M R C A K C T GBases188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205206
Mutovaná alela: G G G G A C A T C G A T G …Normální alela : G G G G T C C T A A C A T …
del3122TCCTAę
Pacient M.K. – heterozygotní delecePacient M.K. – heterozygotní deleceve 24. exonu ve 24. exonu ATP8B1ATP8B1
Restrikční analýza
...TTGTAAGCTTGTTGCATGGGGTCCTAACATCGATGATCCTCTTCTTCATA...
...AACATTCGAACAACGTACCCCAGGATTGTAGCTACTAGGAGAAGAAGTAT...
EcoO109I
715 bp 220 bp
Pacient M.K. – vyšetření rodinyPacient M.K. – vyšetření rodiny
Restrikční analýza mutace v 24. exonu
Restrikční analýza mutace v 17. exonu
MK
ZávěrZávěr1. Studovaný nemocný je složený heterozygot pro dvě různé
mutace v genu ATP8B1/FIC12. Bodová mutace T1982C (I661T) je známá mutace asociovaná
s fenotypem BRIC3. Delece del3122TCCTA je dosud nepopsaná mutace, jejímž
důsledkem je posunutí čtecího rámce, záměna většiny ze 73 aminokyselin a předčasné ukončení transkripce (stop kodon v pozici 1113 místo 1252)
Další postupDalší postup1. Určit sekvenci obou alel 24. exonu z klonovaných fragmentů
genomové DNA2. Vyšetřit expresi mutované alely u matky a bratra
PoděkováníPoděkování
IKEM Praha:L. BudišováP. TaimrS. Hejtmánková
Ústav dědičných metabolických poruch UK 1.LF Praha:M. HřebíčekL. DvořákováM. Elleder
Ústav klinické biochemie UK 1.LF Praha:L. Vítek
I. interní klinika UK 1.LF a VFN Praha:M. Brodanová
Ústav klinické imunologie a alergologie UK LF Hradec Králové:P. Wurm
I. interní klinika UK LF Hradec Králové:P. Hůlek
? Máte v péči nemocné s chronickou cholestázou či s vysokou (>100mol/l) hyperbilirubinémií nejasné etiologie?
Nabízíme možnost jejich genetického vyšetření.
Kontakt: MUDr. Mgr. Milan Jirsa, CSc. Laboratoř experimentální hepatologie IKEM e-mail: [email protected]