Familiární hyperbilirubinémieFamiliární hyperbilirubinémie

Milan Jirsa

Laboratoř Experimentální Hepatologie CEM IKEM Praha

Degradace hemu, typy žloutenekDegradace hemu, typy žloutenek

Převážně nekonjugovaná (premikrosomální typ)

Převážně konjugovaná (postmikrosomální typ)

1. Familiární hyperbilirubinémie Gilbertova typu2. Crigler-Najjarův syndrom I. typu

Familiární nekonjugované hyperbilirubinémieFamiliární nekonjugované hyperbilirubinémie

Familiární konjugované hyperbilirubinémieFamiliární konjugované hyperbilirubinémie

1. Dubin-Johnsonův syndrom2. Rotorův syndrom

Mikrosomální konjugační aparátMikrosomální konjugační aparát

Bilirubin UDPG glukosiduronát transferáza

Benigní hyperbilirubinémieBenigní hyperbilirubinémieGilbertova typuGilbertova typu

• Autosomálně recesívně nědičná benigní metabolická odchylka postihující 5-10% populace

• Familiární žloutenka, často jen ikterus sklér, zhoršení při stresu, hladovění a fyzické námaze

• Někdy v anamnéze protrahovaná novorozenecká žloutenka

• Hodnoty sérového bilirubinu do 100 mol/l• Zpomalená clearance nepřímého bilirubinu• Veškeré další laboratorní nálezy opakovaně v normě

Benigní hyperbilirubinémieBenigní hyperbilirubinémieGilbertova typuGilbertova typu

• Diagnóza: per exclusionem bez použití invazívních vyšetřovacích metod

• Léčba: není třeba• Prognóza: pravděpodobně lepší než normální populace

(Vítek L., Jirsa M. et al., Atherosclerosis 160, 2002, 449-56)

Crigler-Najjarův syndromCrigler-Najjarův syndrom

I. Typ:• Autosomálně recesívně dědičná fatální novorozenecká převážně nekonjugovaná žloutenka• Hodnoty sérového bilirubinu bez léčby 350 – 650 mol/l• Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy• Úmrtí v raném věku následkem poškození CNS

II. Typ (Ariasův syndrom):• Autosomálně recesívně dědičná závažná novorozenecká převážně nekonjugovaná žloutenka• Hodnoty sérového bilirubinu bez léčby 100 – 350 mol/l• Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy

Crigler-Najjarův syndromCrigler-Najjarův syndrom

• Diagnóza: u I. typu jasná již v novorozeneckém věku, II. typ může diagnóze uniknout (Vítek L, Bosma P, de Boer A, Jirsa M et al., Čas Lék Česk 135, 1996, 114-116)

• Léčba: u I. typu intenzívní fototerapie, transplantace jater v dětském věku, zkouší se transplantace hepatocytů a genoterapie, u II. typu v raném dětském věku fototerapie, později bez léčby

• Prognóza: u I. typu špatná, u II. typu po překonání kritického období v dětském věku dobrá

Příčina familiárních nekonjugovanýchPříčina familiárních nekonjugovanýchhyperbilirubinémií:hyperbilirubinémií:

Defekt v genu UGT1A1 nebo v jeho promotoru

Uspořádání Uspořádání UGT1AUGT1A lokusu lokusu

Lokus na 2q37 obsahuje 13 genů rodiny UGT1A

Mutace v genu Mutace v genu UGT1A1UGT1A1 vyvolávající vyvolávajícíCrigler-Najjarův syndromCrigler-Najjarův syndrom

Kadakol et al., 2000

37

17

tgccatatatatatatataagtaggagagggcgaacctctggcaggagcaaaggcgccatgGCT

TATA box

Začátek transkripce

1.exon

TATA box v promotoru TATA box v promotoru UGT1A1UGT1A1

Dubin-Johnsonův syndromDubin-Johnsonův syndrom

• Familiární převážně konjugovaná hyperbilirubinémie• Hepatomegalie• Ukládání lysosomálního pigmentu příbuzného melaninu

v hepatocytech• Koproporfyrinurie s převahou izomeru I• Zpomalené vylučování bromsulfoftaleinu, indocyaninové

zeleně a dalších barviv aniontové povahy• Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy

ABCC2/MRP2/cMOATABCC2/MRP2/cMOAT

• Kanalikulární transportér pro konjugovaný bilirubin, glukosiduronáty, sulfáty a jiné multivalentní organické anionty

• Exprimovaný v apikální membráně hepatocytů a enterocytů v duodenu a v proximálním jejunu

Upraveno podle Kullak-Ublick et al., J.Hepatol. 2000

• je lokalizovaný na 10q24 (45 kb) a sestává ze 32 exonů• kóduje ABC transportér o MW 190 kDa

Tsuji et al., Gastroenterology 1999

Gen Gen ABCC2/MRP2/cMOATABCC2/MRP2/cMOAT

ABCC2ABCC2 a mutace v tomto genu popsané u a mutace v tomto genu popsané u nemocných s Dubin-Johnsonovým syndromemnemocných s Dubin-Johnsonovým syndromem

Upraveno podle Toh et al., Am.J.Hum.Genet. 1999

Rotorův syndromRotorův syndrom

• Familiární převážně konjugovaná hyperbilirubinémie• Koproporfyrinurie s převahou izomeru I• Zpomalené vylučování bromsulfoftaleinu,

indocyaninové zeleně a dalších barviv aniontové povahy

• Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy

• Na rozdíl od Dubin-Johnsonova syndromu chybí lysosomální pigment v hepatocytech

Pracovní hypotéza:Pracovní hypotéza:

Rotorův syndrom je vyvolán dosud neznámou mutací v genu ABCC2/MRP2/cMOAT nebov jeho promotoru

Pacient F.J. – anamnézaPacient F.J. – anamnéza

RA:• Rodiče žloutenku nikdy neměli, 4 zdravé sestry, dcera v.s. Gilbertův syndrom

OA, NO:• Od narození ikterus sklér

• Intermitentní žloutenka při chřipce či fyzické námaze

• V 7 letech hospitalizován pro žloutenku (st.p. hepatitidě?)

• V 18 letech hospitalizován pro žloutenku, neodveden

• Před 5 lety hosp. pro embolii a. centralis retinae, zjištěna

konjugovaná hyperbilirubinémie, hodnoty trvale okolo 150 mol/l

• Od té doby trvale ikterický

Pacient F.J. – lab. nálezy, USG a ERCPPacient F.J. – lab. nálezy, USG a ERCP

Chromatografie izomerů koproporfyrinu v moči

• Převážně konjugovaná hyperbilirubinémie

• Všechna ostatní běžná vyšetření v normě

(KO, JT + další biochemické testy včetně vyšetření

žlučových kyselin v séru, imunologie, screening na

hemolýzu aj.)

• Intermitentně mírně zvýšený odpad porfyrinů

(max. 502 g / 24hodin), chromatograficky

výlučně koproporfyrin, z toho 2/3 izomer I,

1/3 izomer III

• USG jater a žluč. cest bez patol. nálezu

• ERCP bez patol. nálezu

Pacient F.J. – cholescintigrafiePacient F.J. – cholescintigrafie

zdravý jedinec pacient F.J.

Závěr: Ojedinělý nález extrémně závažné poruchy chromoexkrečních funkcí jater (prim. MUDr. J. Urbánek, Ústav nukleární medicíny VFN Praha)

Pacient F.J. – histologické vyšetřeníPacient F.J. – histologické vyšetření

Vzorek jaterní tkáně (cetrozonální oblast) s normální histologií a cytologií. Nápadná je absence lipopigmentu v hepatocytech.

Hematoxylin & Eosin, zvětšeno 150 x

Pacient F.J. – imunohistochemické vyšetření Pacient F.J. – imunohistochemické vyšetření ABCC2/MRP2/cMOAT v játrechABCC2/MRP2/cMOAT v játrech

C F.J.

Vzorky jaterní tkáně z pacienta s minimální hepatopatií bez cholestázy (C) a pacienta F.J. V obou případech je imunohistochemicky prokazatelná přítomnost ABCC2 na biliárním pólu hepatocytů.

Protilátka M2III-6, zvětšeno 150 x

Pacient F.J. – určení sekvence Pacient F.J. – určení sekvence ABCC2ABCC2zz genomové DNA genomové DNA

Izolace genomové DNA z periferních leukocytů

PCR amplifikace jednotlivých exonů

Agarosová elektroforéza

Izolace produktů z gelu

Sekvenační PCR s univerzálními značenými primery

Sekvenování

Pacient F.J. – určení sekvence Pacient F.J. – určení sekvence ABCC2ABCC2zz genomové DNA genomové DNA

Pacient F.J. – heterozygotní synonymní Pacient F.J. – heterozygotní synonymní polymorfismus v exonu 28polymorfismus v exonu 28

GTACGATGGYTACAGTGTBases 272273274275276277278279280281282283284285286287288

3972T+C(I1324I) ę

1324 Isoleucin

Promotor ABCC2/MRP2Promotor ABCC2/MRP2

Úvod• Oblast –517 až –197 je rozhodující pro bazální transkripci a vazbu pro

játra specifických transkripčních faktorů AP1, SP1, HNF1, HNF3• Proximální promotor (cca 1200 bp) je zodpovědný za expresi ABCC2

stimulovanou dimery FXR, PXR a CAR s RXR

• Žádná mutace v oblasti promotoru ABCC2 asociovaná s hyperbilirubinémii není známa

Postup• Metodou PCR byly z gDNA amplifikovány 3 fragmenty pokrývající 1824

bp promotoru

• Sekvenováním bylo zjištěno pořadí bází -1 až -1607

Pacient F.J. – heterozygotní polymorfismus Pacient F.J. – heterozygotní polymorfismus v promotoru ABCC2/MRP2v promotoru ABCC2/MRP2

GGAAGACRGAACCGGAGGB ases 464465466467468469470471472473474475476477478479480

G-995G+A ę

Význam: nejspíš žádný, polymorfismus nalezen u 16% kontrol

ZávěrZávěr

1. Vrozená hyperbilirubinémie u našeho nemocného není podmíněna žádnou z dosud známých mutací v genu ABCC2/MRP2/cMOAT

2. V genomové DNA jsme nenalezli žádnou mutaci v ABCC2, která by vysvětlovala fenotyp onemocnění

Další postupDalší postup1. Sekvenovat cDNA s cílem vyloučit rozsáhlé delece a zjistit

expresi obou alel na úrovni transkripce2. Upřesnit lokalizaci ABCC2 v hepatocytech konfokální

mikroskopií (defekt radixinu?)3. Vyšetřit expresi MRP3 (defekt mikrosomální

X-glukosiduronát translokázy?)

Mikrosomální konjugační systémMikrosomální konjugační systém

X-glukosidutonát translokáza

Složení žlučeSložení žluče

Podle Carey MC, Cahalane MJ: Enterohepatic circulation. In: Arias IM, Jakoby WB, Popper H, Schachter D, Schafritz DA, editors. The liver: biology and pathobiology. Raven Press New York 1988, 573-616.

HDL

LDL

VLDL

ER: synthesis

GOLGI

TGN

SR-B1

LDL-R

NPC?

CE

peroxisomes

BSEPBS

MDR3PC

ACAT2

Lipid droplets:CE storage

SCP-2

endolysomal pathway

FC

FC

CE

NPC?

Kanalikulární transportéryKanalikulární transportéry

?

?

ABCG5/G8

FC

NCEH

CYP7A1

ABCC2/MRP2bilirubin

transportér choroba vyvolaná jeho defektem

ABCB11/BSEP PFIC2 = progresívní familiární intrahepatální cholestáza 2. typu

ABCB4/MDR3 PFIC3Cholestatická cirhóza mladistvýchIntrahepatální pozdně těhotenská cholestáza (ICP)Familiární cholelitiáza

ABCG5/G8 Sitosterolémie

ABCC2/MRP2 Dubin-Johnsonův syndromRotorův syndrom?

ATP8B1/FIC1 PFIC1 = Bylerova chorobaGrónská familiární cholestázaBRIC = benigní rekurentní intrahepatální cholestáza

Defekty v genech kódujících kanalikulárních Defekty v genech kódujících kanalikulárních transportéry a jejich následky transportéry a jejich následky

Benigní rekurentní intrahepatální cholestáza Benigní rekurentní intrahepatální cholestáza (BRIC, syndrom Summerskill- Walsheův)(BRIC, syndrom Summerskill- Walsheův)

• Autosomálně recesívní intrahepatální cholestáza• Ataky žloutenky provázené úporným svěděním a

přechodnou hepatomegalií• První ataka obvykle do konce 2. dekády, trvání ataky

týdny až řadu měsíců, počet atak 1 až 30 za život• Laboratorně hyperbilirubinémie, zvýšená aktivita ALP a

koncentrace a sérových žluč. kyselin, normální S-GMT a cholesterol

• Prognóza většinou dobrá, asi 6% progreduje v cirhózu

Protein ATP8B1/FIC1Protein ATP8B1/FIC1

• Exprimovaný v apikální membráně hepatocytů, enterocytů v distálním ileu, acinárních buněk pankreatu, nízká exprese v řadě dalších tkání

• Funkce neznámá, hypotézy:flipáza membránových fosfolipidůtransportér hydrofobních žlučových kyselin

iontový kanál

Gen Gen ATP8B1/FIC1ATP8B1/FIC1

• je lokalizovaný na 18q21, zaujímá 98kb• sestává z 27 exonů• kóduje ATPasu o MW 140 kDa

mutace exon důsledek citace

T1982C 17 I661T Bull 1998

CT2286-4AA ? Bull 1998

2384del9 20 795delGNR Bull 1998

Splice site 24 Skipped exon van Ooteghem 2002

Mutace v genu Mutace v genu ATP8B1/FIC1 ATP8B1/FIC1 asociované s BRICasociované s BRIC

Pacient M.K. – anamnézaPacient M.K. – anamnéza

RA: negativní

OA, NO:

• Nar. 1972, protrahovaná novorozenecká žloutenka

• V 10 měsících žloutenka po varicele, závěr nejasný, léčba kortikoidy

• 1975 2měsíční ataka žloutenky

• 1976 roční ataka, chir. revize žluč. cest: bez patol. nálezu

• 1990 po sinusitidě další ataka, vyloučena IHE, nor. ERCP, závěr nejasný,

opět léčen kortikoidy

• 1990-98 3x jaterní biopsie

• 1998 další ataka, hosp. na Ústavu klin. Imunologie LFHK

Pacient M.K. – lab. nálezy, USG a ERCPPacient M.K. – lab. nálezy, USG a ERCP

• FW 50/86

• KO: anémie, leuko 12

• Hyperbilirubinémie, ALP 14,4 kat/l, celk. žluč. kyseliny 220 mol/l

• GMT opakovaně normální

• Fe, transferin, Cu, ceruloplasmin, alfa1-AT v normě

• Imunologická vyšetření v normě

• USG jater a žluč. cest bez patol. nálezu

• ERCP bez patol. nálezu

• 4. jaterní biopsie: intrahepatální cholestáza bez známek přestavby

Pacient M.K. – určení sekvence Pacient M.K. – určení sekvence ATP8B1ATP8B1zz genomové DNA genomové DNA

Izolace genomové DNA z periferních leukocytů

PCR amplifikace jednotlivých exonů

Agarosová elektroforéza

Izolace produktů z gelu

Sekvenační PCR s univerzálními značenými primery

Sekvenování

Pacient M.K. – heterozygotní bodová mutace Pacient M.K. – heterozygotní bodová mutace v 17. exonu v 17. exonu ATP8B1ATP8B1

AGAAGTCAAAGGAACATCB ases 240241242243244245246247248249250251252253254255256

T1982T+C

ę

M.K. kontrola

...GCTACAAGGAAAtTGAAGAAAAAGAATTTACA...

...CGATGTTCCTTTAACTTCTTTTTCTTAAATGT...

Tsp509ITsp509I

95 bp 14 bp

Pacient M.K. – heterozygotní delecePacient M.K. – heterozygotní deleceve 24. exonu ve 24. exonu ATP8B1ATP8B1

G C A T G G G G W C M T M R C A K C T GBases188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205206

Mutovaná alela: G G G G A C A T C G A T G …Normální alela : G G G G T C C T A A C A T …

del3122TCCTA

ę

Pacient M.K. – heterozygotní delecePacient M.K. – heterozygotní deleceve 24. exonu ve 24. exonu ATP8B1ATP8B1

Restrikční analýza

...TTGTAAGCTTGTTGCATGGGGTCCTAACATCGATGATCCTCTTCTTCATA...

...AACATTCGAACAACGTACCCCAGGATTGTAGCTACTAGGAGAAGAAGTAT...

EcoO109I

715 bp 220 bp

Pacient M.K. – vyšetření rodinyPacient M.K. – vyšetření rodiny

Restrikční analýza mutace v 24. exonu

Restrikční analýza mutace v 17. exonu

MK

ZávěrZávěr

1. Studovaný nemocný je složený heterozygot pro dvě různé mutace v genu ATP8B1/FIC1

2. Bodová mutace T1982C (I661T) je známá mutace asociovaná s fenotypem BRIC

3. Delece del3122TCCTA je dosud nepopsaná mutace, jejímž důsledkem je posunutí čtecího rámce, záměna většiny ze 73 aminokyselin a předčasné ukončení transkripce (stop kodon v pozici 1113 místo 1252)

Další postupDalší postup1. Určit sekvenci obou alel 24. exonu z klonovaných fragmentů

genomové DNA2. Vyšetřit expresi mutované alely u matky a bratra

PoděkováníPoděkování

IKEM Praha:

L. BudišováP. TaimrS. Hejtmánková

Ústav dědičných metabolických poruch UK 1.LF Praha:

M. HřebíčekL. DvořákováM. Elleder

Ústav klinické biochemie UK 1.LF Praha:

L. Vítek

I. interní klinika UK 1.LF a VFN Praha:

M. Brodanová

Ústav klinické imunologie a alergologie UK LF Hradec Králové:

P. Wurm

I. interní klinika UK LF Hradec Králové:

P. Hůlek

?Máte v péči nemocné s chronickou cholestázou či s vysokou (>100mol/l) hyperbilirubinémií nejasné etiologie?

Nabízíme možnost jejich genetického vyšetření.

Kontakt: MUDr. Mgr. Milan Jirsa, CSc. Laboratoř experimentální hepatologie IKEM e-mail: Milan.Jirsa@medicon.cz