イネにおける澱粉代謝関連酵素の応用分子細胞生物学的研究

誌名誌名 応用糖質科学

ISSNISSN 21856427

著者著者 三ツ井, 敏明

巻/号巻/号 9巻1号

掲載ページ掲載ページ p. 3-10

発行年月発行年月 2019年2月

農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センターTsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research CouncilSecretariat

応用糖質科学第 9巻第 1号 3-10(2019) G-

A-si

.I

1.

＿._-Applied Molecular and Cell Biological Studies of Starch-degrading Enzymes in Rice*

イネにおける澱粉代謝関連酵素の応用分子細胞生

物学的研究＊

一受賞論文一

三ツ井敏明（みついとしあき）1,* *

Toshiaki Mitsui1・* *

1新潟大学自然科学系（農学部）

951-2181新潟市西区五十嵐 2の町 8050

1 Faculty of Agriculture, Niigata University 8050 lkarashi-2, Nishi-ku, Niigata 950-2181, Japan

要旨：澱粉は陸上植物に普遍的にそして豊富に存在する貯蔵多糖である．植物における澱粉代謝

の研究は発芽穀類種子において精力的に行われているが，この澱粉分解に関与する酵素は種々の

アミラーゼでありなかでも中心的な役割を果たしているのが a—アミラーゼである. a-アミラーゼは分泌性酵素であり，発芽穀類種子では胚盤上皮細胞及びアリューロン層細胞において合

成され，澱粉貯蔵組織である胚乳に分泌される．イネ cアミラーゼについては分泌性糖蛋白質

の生合成，細胞内輸送並びに分泌制御という観点を中心に研究が繰り広げられ，一方で，イネ

aグミラーゼ Amyl-Iを含むいくつかの糖蛋白質や膜蛋白質が，分泌経路から膜交通を介して葉

緑体やアミロプラスト等のプラスチドに輸送されて局在化することが見出された．近年，高温登

熟による玄米の白滑化等の品質低下は農業現場で大きな問題となっている．イネの主要 a—アミラーゼがプラスチドに局在化し，機能するという事実は，イネ高温登熟による玄米の白濁化等，

澱粉代謝が関わる生理現象の真の理解につながるものと考えられる．

キーワード： a-アミラーゼ，イネ，玄米白濁，プラスチド，膜交通＊＊＊

1. はじめに

歴史的に澱粉質の作物における a—アミラーゼの研究は，

基礎研究と醸造という応用科学の双方から大きな注目を集

めてきた特に，イネ (Oryzasativa), オオムギ (Hordeum

vulgare)及びコムギ (Triticumaestivum)等の発芽穀類種子

について多くの研究が行われたすなわち，ジベレリン及

びアブシジン酸という植物ホルモンによる¢ァミラーゼ

発現制御機構曰）， a-アミラーゼ多遺伝子ファミリーバ），分

泌糖蛋白質の生合成及び細胞内輸送叫酵素分泌における

Ca2+の役割8-10), 環境ストレスが酵素の分泌• 生合成に及ぼ

す影響'―13)等，これらの解明理解に多くの努力が注がれ

たそして，最近のイネ aグミラーゼの細胞生物学的研

究により，高等植物細胞にこれまで議論されてこなかった

新奇な膜交通システムが存在することが明らかになっ

た14,15)_ この発見は，植物澱粉分解酵素研究を新たな展開

へと導いた．

2. イネ aーアミラーゼの構造的特徴

a—アミラーゼ (EC3.2.1.1)は，全ての原核生物及び真核

生物に存在し，澱粉及びグリコーゲンなどのグルカンポリ

マーの a-1,4—グリコシド結合を加水分解するエンド型加水

分解酵素である. Carbohydrate-Active enZymesデータベー

ス (http://www.cazy.org/) では，すべての a—アミラーゼを

4種のグリコシド加水分解酵素 (GH)ファミリー (GH13,

57, 119, 126)の一つに分類している. a-グルコシダー

ゼ，イソアミラーゼ，プルラナーゼなどの多くの a—グル

カン加水分解酵素は， a-アミラーゼとともに GH13に入

る. GH13内の全体的な配列同一性は非常に低いが，ほと

んどのメンバーは基本的な足場として高度に保存された

(~la), バレル構造を持っている 16)_ 酵素活性を確認したイ

ネa-アミラーゼは， GH13_6イネ，コムギ及びオオムギの

ホモロググループに属する 17) (図 1).

穀類 cアミラーゼは分子サイズや等電点で区別するこ

とができる多様な多型を示す．イネ a—アミラーゼの場合，

少なくとも 17個のプロテオフォーム 18)が発芽イネ種子や

胚由来カルス的I)において同定されている．イネ aーアミ

ラーゼ遺伝子は，推定上の遺伝子を含めると少なくとも

10種類あり 22-24>, 系統的に Amyl, Amy2, Amy3サブファ

ミリーに分類されている叫また，遺伝子と酵素アイソ

フォームとの間の関係は，蛋白質配列決定，質量分析及び

＊本原稿は， 日本応用糖質科学会平成 30年度大会の学会賞受賞講演で一部発表された．

＊＊連絡先 (Tel.025-262-6641, Fax. 025-262-6641, E-mail: t.mitsui@agr.niigata-u.ac.jp)

***Key words: a-amylase, grain chalkiness, membrane traffic, plastid, rice

◆4◆ 応用糖質科学第 9巻第 1号 (2019)

T riticum aestivum Amy3

● Oryza saliva Amy3E

● Oryza sativa Amy3D

Hordeum vulgare AMY1 .2

● OryzasativaAmy1A

● Oryza sativaAmy2A

991 ヨ←Brachypodium distachyon LOC100835083

97 Avena fatua alpha-Amy2A

，州Triticum aestivum Arny2

93 Hordeum vulgare AMY1 .1

Cuscuta reflexa AMY2

Vitis vinifera VITISV 004485

1001

Monocots

■ Arabidopsis thaliana AMY1 Camellia sinensis AOAOKOPUB6

100'Camelia sinensis AOAOKOPVH7

Solanum tube「osumalpha-Amylase

■A「abidopsisthaliana AMY2

Vitis vinifera VITISV 031847

Eudicots

}""'ms Vigna angula「isVigan.03G296000

B「achypodiumdistachyon LOC100824346 J Monocots Brachypodium distachyon LOC100821502 J Monocots

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]~~ Geobacillus stearothermophilus amyS

Bacillus licheniformis amyS

Streptococcus mutans amy

]BacteM

100 Archaea

I I 0.1

図 1. a—アミラーゼアイソザイムにおける系統関係

系統樹は a-アミラーゼの 48アミノ酸配列を用いた近隣結合法による系統関係の推定結果を示す．進化距離はポアソン補正法に基づいて計算され，スケールバーは 1サイトあたりのアミノ酸置換率 0.1を示す●と■はそれぞれ，イネとシロイヌナズナのアイソザイムを示す．一連の解析並びに図の作成には MEGA7'1>を用いた．

エピトープ特性によって部分的に明らかにされている20,21).

Amyl-IはAmylA,AmyII-3はAmy3E,AmyII-4はAmy3D,

AmyII-5はAmy3B, AmyII-6はAmy3Cにコードされてい

る. AmyII-4には特に多くのプロテオフォームが見られ

る．プロテオフォームの生成は，脱アミノ化翌プロトン

化26)及び Ca2+の結合27)等による翻訳後修飾によって生ずる

ものと考えられているが，詳細な生成機構の解明はなされ

ていない．

AmylAにコードされる Amyl-Iは，イネ，特に発芽種子

において量的，質的に最も重要な a—アミラーゼである 19.28)_

興味深いことに， Amyl-I は他の穀類 a—アミラーゼでは見

られない凡結合型糖鎖を有する. Amyl-IのNー結合型糖

鎖の結合部位は 1箇所 (Asn240-Gly241-Thr242)で，その

糖鎖の構造と機能についても解析された29,30). 糖鎖結合部

位の変異導入実験から Amyl-Iの糖鎖は酵素蛋白質の熱安

定性に関わることが明らかになった呵発芽イネ種子から

生成された Amyl-Iの糖鎖構造については，キシロース残

基を有する複合型糖鎖が 53.0%を占め，高マンノース型

糖鎖は 37.3%であった29). 近年，急速に進歩した高感度，

高解像度のグライコブロッティングー質量分析法を用いて

Amyl-Iの糖鎖構造を再解析したところ，数十種類の糖鎖が

検出され，以前の分析では見出されなかったフコース含有

三ツ井：イネ澱粉代謝関連酵素の応用分子細胞生物学 ◆5◆

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□ N—アセチルグルコサミン0 マンノース

ヤキシロース

< フコース

〇ガラクトース

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讐臼CL.99LC

99・V"°z

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95.LN 81

LV.OL9l

1800 2000

質醤電荷比

(m/z)

図2. イネ Amyl-I の aoWR 蛍光標識 N—グリカンのマススペクトル

イネ Arnyl-1の凡グ リカンをアーモンドグライコペプチダーゼ Aによ って切断し，グライコプロッ ト/MALDI-TOF-MS法62)を用いて解析した

1400 1600 2200 2400

グリカン，すなわちMan,GlcNAc,Fuc,Xyl,,Man,GlcNAc,Fuc,Xyl,,

Man心lcNAc.Fuc,Xyl,,Man,GlcNAc,Fuc,Xyl,, Man,GlcNAc,Fuc,

の存在も確認された30)(図 2). また，Amyl-1の糖鎖構造

は，高温等の環境条件によって変動することが観察されて

いる32,33).

最近，大腸菌で発現，精製された Amyl-Iの結晶構造が

2.2Aの分解能で解かれた27)_ オオムギ q ァミ ラーゼ

AMYi及びAMY2は， Amyl-Iとそれぞれ 73%及び 80%

のアミノ酸配列類似性を示す ． オオムギ a—アミラ ー ゼと

同様に， Amyl-Iポリペプチド鎖は， (p/a)sバ レル構造を

形成するセン トラルドメイン (Aドメイン），ループ ドメ

イン (Bドメイン）及び 5本鎖の逆平行 Bシー ト (C ドメ

イン）の C末端ドメインより成っている そして，イネ

Amyl-I"'とオオムギ AMYJ34>の立体構造を用いたスーパー

インポーズ分析から両者の主鎖構造の類似性が認められ

た GH13a—アミラーゼにおいて加水分解活性は "Asp-Glu

-Asp"によってもたらされる35>_Amyl-Iでは Asp203-Glu

228-Asp314であり， AMYiでは Aspl 80-Glu205-Asp29 lで

一方，Amyl-I中の Gly72及びLeu321はオオ ム ギ

a—アミラーゼにおいて保存されていないこれらの残基は

それぞれサブサイ ト-3及び +2に位置し"', イネとオオム

ギの酵素の基質認識機構にわずかな差があることを示唆し

さらに，Amyl-Iの活性中心の反対側にある凡結

合型糖鎖結合部位においては AMYiとは明らかに構造的

な違いがあることが明らかになった.AMYlでは保存さ

れていない Asn263,Thr307, Asn342, Pro373, Ala374の

立体配座から， N-グリコシル化はAmyl-Iの三次元構造に

必要であると推察される結晶学的研究で用いた組換え

Amyl—！ は N-結合型糖鎖を持たない ． したがって，

ある ．

ている

の酵素及び蛋白質機能を理解するためには，

する三次元構造のさらなる研究が必要である ．

AMYトマルトヘプタオース複合体は，活性中心に結合

した一つのマルトオ リゴ糖分子と分子表面の二つの部位に

結合した二つの分子を含む叫 これら二つの表面結合部位

(SBSl及び SBS2)は， 澱粉との結合に積極的に関与して，

澱粉加水分解の効率を改善する .Amyl-I及び AMYiにお

ける活性部位及び2つの SBSのまわりのモチーフの重ね

合わせ分析から，これらの主鎖構造がほぽ同一であること

が示された. SBSIを構成するアミノ酸残基 Trp301と

Trp302, 並びに SBS2のアミノ酸残基 Tyr403とHis4l8に

ついてはその側鎖の配向までもが良く 一致しており，両

SBSの機能が類似していることを示唆している .AMYl

の SBSIは澱粉顆粒付着の初期部位であり ，SBS2はアミ

ロペクチンの a-1,6分岐点付近に結合し，支え部位として

機能する．すなわち，これらの二つの SBSは，AMYlを

澱粉顆粒表面に局在化させるために協調して作用し，

SBS2はアミロペクチンの分解において活性部位と相乗的

に作用すると考え られている呵 しかし典味深いことに，

Amyl-1においては， SBSIポケットに結晶化試薬に由来す

る酒石酸分子が観察され（図 3),その B因子値は Amyl-1

と酒石酸との間の特異的結合を示すものであった．この結

合は水素結合によるものではなく， SBSlのトリプトファ

ンのインドール環と酒石酸との低親和性特異的結合であ る

ことが示唆された叫 これ らの知見は， SBSlが澱粉分解

のみならず，他の生理現象に関与することを示唆して

糖鎖側鎖を有

しヽる．

Amyl-I

◆6◆

3. 膜交通を介した糖蛋白質のプラスチド局

在化メカニズム

a—アミラーゼが哺乳類及び植物における典型的な分泌酵

素であることは広く知られている発芽穀類の種子では，

a—アミラーゼは胚盤上皮細胞及びアリューロン層細胞にお

いて発現 ・合成され，澱粉が貯蔵されている胚乳に分泌さ

れるアリューロン層における GA応答性 a-アミラーゼ

産生及びその調節機構がオオムギ及びコムギにおいて精力

的に進められた一方で，イネ胚盤上皮細胞ではもっぱら

Amyl-1糖蛋白質の生合成及び細胞内輸送に関する研究が

行われた四分泌性糖蛋白質 Amyl-1は粗面小胞体で N末

図3. イネ Amyl-Iの結晶構造

SBSIに結合している酒石酸分子は棒球モデル，その電子密度はオミッ トマ ップで示す赤色球酸素 ；黄色球炭素 オレンジ色球はカルシウムイオン．

応用糖質科学第 9巻第 1号 (2019)

端にシグナルペプチドを持つ前駆体として合成され，翻訳

過程においてシグナルペプチドの切断 ・糖鎖前駆体の付加

が行われた後輸送小胞によりゴルジ体に運ばれるその

後， ゴルジ体において糖鎖修飾及び細胞膜への輸送のため

の選別を受け， トランス側から分泌小胞を介して細胞外に

分泌される .N-グリコシル化は，小胞体 (ER)における新

生ポ リペプチドの Asn-X-Ser/Tlu・ 配列における前駆体グリ

カンの Asn残基への移動によって開始され，続いて，ゴ

ルジ装置がN—グリカンのプロセシング及び熟成に関与す

る,s>_N結合型糖鎖の修飾も含め，イネ糖蛋白質 Amyl-1

の分泌は，温度呵 Ca'+,o.39), や遊離糖濃度10)などの環境条

件で制御されることも明らかにされた．

続いて，形質転換イネを用いた Amyl-Iの機能解析が行

われ， Amyl-1発現抑制体 (Amyl-1K0)の系統において，種

子の発芽及び幼植物の生育は野生型 (WT)と比較して著

しく遅れることが観察された期待どおりに，この

Amyl-1K0の発芽遅延はショ糖添加で回復したことから，

Amyl-1K0の胚乳における貯蔵澱粉の分解能低下による炭

素供給の減少によるものと考えられだり しかし予期しな

かったことに， Amyl-1発現の抑制が緑葉の澱粉含有量を

有意に増加させたこのことは緑葉細胞のプラスチド

（葉緑体）における澱粉分解にも心アミラーゼが関与する

ことを 示唆 するものである 14)_ イネ Amyl-1強発現体

(Amyl-1°c)とWTの培養細胞を電子顕微鏡で観察したと

ころ，WT細胞においては澱粉貯蔵オルガネラであるアミ

ロプラス トに澱粉がしつかりと満たされていたが，

Amyl一門細胞のアミロプラスト内には異常な澱粉顆粒の

トランジットペプチド-@)

f

小胞体亡令 ． トランスゴルジ

分泌経路図4.イネ Amyl-Iのプラスチドターゲティング機構

トランジ ットペプチドを有するプラスチド蛋白質は Toe/Tic膜透過複合体を通ってプラスチド内に入るが小胞体で合成された Amyl-I糖蛋白質は，ゴルジ装置において糖鎖修飾を受けた後，膜交通を介してプラスチドに移入する Amyl-Iの糖鎖構造． ■,N-アセチルグルコサミン； 0, マンノース； C>'フコース；＊，キシロース

三ツ井：イネ澱粉代謝関連酵素の応用分子細胞生物学

蓄積と澱粉顆粒間に大きな隙間が見られた．さらに，

Amyl-Iに対する特異抗体を用いたコロイド金免疫電子顕

微鏡観察の結果から， AmyI-1°E細胞のアミロプラストと

膜小胞に Amyl-Iの顕著な集積を示す多数の免疫金微粒子

が検出され，一方， WT細胞でもアミロプラスト内にわず

かながら金微粒子が検出された15)_ 加えて，高圧急速凍結

細胞の微細構造観察から，ゴルジ層版及びゴルジ由来の膜

小胞がプラスチド包膜に密着し，取り込まれる様子が捉え

られた15)_

Amyl-Iのプラスチド局在性を検証するために，緑色蛍

光蛋白質で標識した Amyl-I(Amyl-1-GFP)を発現するイ

ネ及びタマネギ細胞のイメージング解析を行ったところ，

AmyI-1-GFP蛍光の大部分がプラスチドに存在することが

見出された．次に， AmyI-1-GFPが分泌経路からプラスチ

ドヘ輸送・局在化するのかどうかを調べるために， ER-ゴ

ルジ体間の小胞輸送を阻害する AFRI及びSARIGTPase

のドミナントネガティブ及び構成的活性変異体の影響を見

たところ，これらによって Amyl-1-GFPのプラスチドター

ゲティングはほぼ完璧に押さえられた15). このような糖蛋

白質のプラスチドターゲティングはイネ Amyl-I以外でも

報告されている．シロイヌナズナ炭酸脱水酵素40)及びイネ

ヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラー

ゼ叫ま， N-グリコシル化され，緑葉及び懸濁培養細胞中の

葉緑体に局在したまた，これらの糖蛋白質のプラスチド

への局在化は ER-ゴルジ体間の小胞輸送の阻害剤であるブ

レフェルジン A (BFA炉感受性であった． ゴルジ膜局在化

シグナルを連結した赤色蛍光蛋白質 ST-mRFP43>でゴルジ体

膜を蛍光標識し， 3次元のタイムラプスイメージング解析

を行ったところ，ゴルジ膜小胞がプラスチド内に取り込ま

れ，ストロマに広がって行く様子が観察された15)_ これら

の結果は， Amyl-Iのプラスチドターゲティングにおいて

は，新規な膜交通機構が関与することを強く示唆してい

る44>_ Amyl-Iのプラスチドターゲティングの仮説モデル

を圏 4に示した．

プラスチド外から移入される多くのプラスチド蛋白質は

トランジットペプチドを持つ前駆体として合成され， この

前駆体はプラスチド包膜に存在する Toe-Tic複合体という

膜透過装置を介してプラスチド中へ輸送される45,46)_ しか

し， Amyl-Iの前駆体配列には ER膜を透過し内腔に移行

するためのシグナルペプチドが含まれるが， トランジット

ペプチドはない．一連の Amyl-I断片と GFPの融合蛋白質

の一過性発現及び局在性の確認実験から，完全な A及び

Bドメインを含む Amyl-I(△ 370-428)断片ではプラスチ

ド局在性は失われないが，その C末端配列をさらに切除

するとプラスチド局在性が徐々に失われ, Amyl-I (/",,301-

428)断片ではもはやプラスチド局在性を示さなくなっ

た15>_ Trp301から Gln369のペプチド領域には，酵素蛋白

質表面の澱粉結合部位 SBS1 (Trp301-Trp302), 基質結合サ

ブサイト及び活性部位クレフトの触媒残基 (His313,

Asp314, Gln319) が含まれていた27,47)_ イネ a—アミラーゼ

◆7◆

アイソフォームのアミノ酸配列アライメントで確認された

Trp301-Gln369領域の 12のユニークなアミノ酸残基から

Trp302, Thr307及びGly354を選択し，部位特異的突然変

異誘発実験が行われた. Gly354はSBSlのほぼ反対側の

酵素蛋白質表面に， Thr307は蛋白質内部に位置する．

Trp302, Thr307, Gly354の全ての置換変異は Amyl-1のプ

ラスチドターゲティングを抑制したことから，微細な表面

立体構造の変化がプラスチドターゲティング能力に影響を

及ぽすものと推察された15).

4. 玄米の白濁化メカニズム

IPCC第 5次報告書 (http://www.climatechange20l3.org)

によれば， 2003~2012年の世界平均地上気温は 1850~

1900年と比べて 0.78℃上昇しており，気候システムの温

暖化については疑う余地はない．将来予測では，可能な限

りの温暖化対策を前提としたシナリオで 0.3~1.7℃，非常

に高い排出が続くシナリオにおいては 2.6~4.8℃ の気温

上昇が示唆されている．気候温暖化は作物生産の多くの側

面に影響を与える48). イネは熱帯原産であるにもかかわら

ず，その登熟過程では高温感受性を示す．登熟期の平均気

温が26℃ を超えると， しばしば重量が減少した白濁粒が

発生し49,50), 精米の効率を低下させる51). 高温登熟による玄

米の白濁化は様々な要因が複雑に絡み合って生ずるものと

考えられるが，最終的な現象としては胚乳細胞における澱

粉顆粒の形成不全である．多角形澱粉顆粒（図 5A)'2>が桐

密に充填されている通常の半透明玄米とは対照的に，高温

登熟障害粒では澱粉集積に異常があり，澱粉顆粒間にでき

た隙間により光が複雑に屈折そして乱反射することによっ

てその部分が白く濁り不透明になる．白濁粒の澱粉顆粒構

造は丸みを帯びていて，顆粒表面には小孔が見られること

もある（図 5B)52l. これは，発芽穀類種子の澱粉分解様式

に酷似しており，澱粉分解酵素の関与が推察された．

玄米の白濁化メカニズムを理解するため，包括的なトラ

ンスクリプトーム，プロテオーム，及びメタボローム解析

が行われた12,13,53-55). 登熟期の高温ストレスは，アミロース

合成に不可欠な顆粒結合澱粉合成酵素 I(GBSSI)やアミ

ロペクチン分枝構造形成に重要な澱粉分枝酵素 Ilb(BEIIb)

遺伝子の発現を抑制する一方で，一連の a-アミラーゼ遺

伝子発現や澱粉分解活性が顕著に誘導されることが分かっ

たまた，マルトオリゴ糖を含む可溶性糖が白濁粒に蓄積

されていた52.54.55)_ これらの事実は，登熟期間の高温ストレ

スが澱粉の合成と分解のバランスを乱し，成長する胚乳細

胞中の澱粉顆粒形成の異常をきたすことを示唆している．

発芽イネ種子では，胚盤上皮細胞及びアリューロン層細胞

において種々の a—アミラーゼアイソフォームが合成され，

胚乳に分泌されるが，登熟期においては胚乳組織で a-ア

ミラーゼ遺伝子 (AmylA(Amyl-1), Amy3C (AmyII-6)及

びAmy3D(AmyII-4))の発現が誘導されることが確認され

た56). この空間的発現パターンは白濁部位と一致すること

◆8◆

｀ 図5. 玄米の整粒中心部位 (A)と白濁粒白濁部位 (B)の走査電子顕微鏡画像

スケールは ] Q~LITI.

から，これらの a—アミラーゼの高温誘導が玄米品質の低

下の引き金となるという考えを支持している．

玄米白濁化における心アミラーゼの働きの重要性を検

証するため，恒常的または胚乳特異的プロモーターの制御

下で八つの a—アミラーゼ遺伝子のそれぞれを熟成胚乳中

で強発現する形質転換イネを作製し，玄米形質を調べたと

ころ，通常の登熟温度条件においても Amy3E 以外の a— ア

ミラーゼの強発現は，著しい白濁化をもたらした56,51). 予

想に反して， AmyII-3(Amy3E)は，おそらく無傷澱粉に

対する比活性が低いために，白濁化を生じさせることがで

きなかったものと推察されたまた， 10 種類の a—アミ

ラーゼの追伝子間で塩基配列が高度に保存されている部分

による RNA 干渉法を用いて大部分の a—アミラーゼ逍伝子

の発現を抑制した造伝子組換えイネが作出された．いくつ

かの心アミラーゼ発現抑制系統を解析したところ， a-ア

ミラーゼ遺伝子群の発現抑制の程度に応じて，高温登熟に

よる白濁粒の発生が減少することが認められた55).

2009年度（登熟平均温度 24.4℃)と 2010年度 (28.0

℃)の一般圃場に収穫されたコシヒカリを用いた iTRAQ

標識プロテオーム解析58)では，高温登熟で生じた白濁部位

において 935個の蛋白質が同定され， 6l個の蛋白質が整

粒と比較して 2倍以上の発現変動を示した 特に，低分子

応用糖質科学第 9巻第 1号 (2019)

醤熱ショック蛋白質や cアミラーゼの顕著な増加が観察

された白濁部位における心アミラーゼ蛋白質の増加は

特異抗体を用いたイムノブロッティングによっても確認さ

れた平温登熟と高温登熟で生じた白濁部位の a—アミ

ラーゼアイソフォームの発現パターンは異なっていた 13)こ

とは興味深い．平温登熟と高温登熟における玄米の白濁化

には異なる a—アミラーゼアイソフォームが関与するもの

と推察される．

高温登熟耐性品種“ゆきん子舞”の登熟種子プロテオー

ム解析が行われ，高温登熟耐性に関わる因子として Mn型

スーパーオキシドジスムターゼ (MSDl)が見出 された59)_

MSDJ遺伝子の発現を恒常的に高めると高温登熟耐性が向

上し，登熟種子胚乳特異的に MSDJ発現を 抑制すると高

温ス トレス感受性が増すことが確認された.MSDJを強発

現するイネでは野生型に比べて高温環境下において多くの

活性酸素消去系の酵素蛋白質やストレス応答蛋白質の誘導

が格段に高まっており，このことが嵩温登熟耐性をもたら

していると考えられたなぜ， MSDJの高い発現によって

このような誘導が活発になるのかおそらく， MSDlに

よって生成される H,O,がシグナル分子として働いている

のであろう．我々は， H,O,プライミング処理によ って高

温登熟による一連の a—アミラーゼ遺伝子の発現誘導そし

て玄米白濁化が軽減されることを確認している．

玄米の白濁化は澱粉代謝系ではない酵素 ・蛋白質の発現

異常に よって平温条件下でも起こる48)_ 例えば FLOURY

ENDOSPERM2(FL02), GLUTELIN PRECURSOR MUTANT6

(GLUP6)や GLUTELIN PRECURSOR ACCUMULATION3

(GAP3)などがあげられる .FL02は後期胚発生に関与す

る蛋白質また GLUP6や GAP3はゴルジ体から 液胞への

貯蔵蛋白質の輸送に関わる因子であるさらに，オー ト

ファジー機能欠損が玄米の白濁化を起こすことが報告され

ている 60)_ このように玄米の白濁化は極めて複雑であり，

今後，様々な視点での詳細解析が必要であることは言う ま

でもない

5. おわりに

a—アミラ ーゼは，医学，農業産業界の様々な分野で広

く使用されている酵素であり多くの側面で研究されてい

る上述のように，イネ a—アミラーゼは，澱粉及び澱粉

関連分子だけでなく広範な生体内分子と相互作用するこ

と，分泌経路から膜交通を介したプラスチド局在化，熱ス

トレスによって発生する玄米白濁化に関与すること 等，新

たな発見があったこのイネ 心アミラ ーゼ に関する分

子 ・細胞レベルにおける新しい知見は，a-アミラーゼの生

理機能の多様性と，玄米の澱粉 ・蛋白質の品質を制御する

ための戦略についての新しい視点を提供するものである

a—アミラーゼ研究の新領域への展開を期待したい ．

三ツ井：イネ澱粉代謝関連酵素の応用分子細胞生物学

謝辞

栄えある日本応用糖質科学会学会賞をいただき，身に余

る名誉であり，たいへん身の引き締まる思いであります．

ご推薦頂きました北村義明東日本支部長，中野博文学会賞

選考委員長をはじめ選考委員，そして松井博和元会長，林

清会長，西尾俊幸副会長，井ノ内直良副会長，学会員の皆

さまに心から感謝申し上げます．

イネ a—アミラーゼに関する研究は，私が大学院生のと

きに故・赤澤発名古屋大学名誉教授から与えられたテーマ

であり，私のライフワークとなっています．新潟大学に赴

任してからも，故・伊賀上郁夫新潟大学名誉教授のご厚意

によってイネ a—アミラーゼ研究を続けることができ，ニ

人の恩師に巡り会えたことは私にとって幸運でした．これ

までに得られた研究成果は，無論，私のみによって得たも

のではなく，中野明彦先生，落合秋人先生， Javier

Pozueta-Romero博士，山川博幹博士をはじめ多くの共同研

究者及び協力者のご支援・ご協力があってこそ成し得たも

のですこの場をお借りしてお礼申し上げます．そして，

新潟大学自然科学系（農学部）生物化学研究室で苦楽をと

もにした卒業生・在学生に改めて感謝の意を表します．

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