・Tophat-fusion、Chimerascan を用いて融合遺伝子検出の感度と偽陽性数を比較

・Tophat-fusion は異なる染色体間、Chimerascan は同一染色体内の融合遺伝子を、検出しやすい傾向が示唆

・両ソフトで既知融合遺伝子 CCDC6-RET とWNK1-B4GALNT3 の検出を確認

解析レポート 1701

次世代シーケンサを用いた融合遺伝子の探索

～　甲状腺乳頭癌で発現している融合遺伝子の解析例　～

　　

1．目的　がん組織においてゲノム配列の逆位や挿入、転座などに

より、複数の遺伝子が融合することがある。このようにし

てできた融合遺伝子は、発がんと大きな関係があることが

知られている。例えば、EML4-ALK 融合遺伝子は、細胞増殖

にかかわるチロシンキナーゼ ALK 遺伝子が EML4 遺伝子と融

合することで高いキナーゼ活性を獲得し、発がんを誘導す

ることが知られている [1]。また、融合遺伝子はがん組織

に特異的に発現することから、分子標的薬のターゲットと

して大きな注目を集めている。近年、がん治療薬の開発を

目的として、次世代シーケンサを用いた融合遺伝子の同定

が盛んに行われている。本稿では、融合遺伝子の解析によ

く用いられる Tophat-fusion [2] と Chimerascan [3] を用

いた解析事例を紹介する。これら 2 種類のソフトウェアは

さまざまな融合遺伝子の研究で幅広く利用されてきただけ

でなく、他のソフトウェアと比較して検出感度が良いこと

でも知られている [4]。　　　　　　　　　　　　　　　　

2．使用したデータ

3．解析手法

3.1.　ソフトウェアの性能評価

ポイント

サンプル

正常 1

正常 2

正常 3

正常 4

腫瘍 1

腫瘍 2

腫瘍 3

腫瘍 4

腫瘍 5

腫瘍 6

腫瘍 7

ID 総リード数 リード長 (bp)

NS118

TS116

TS115

TS112

TS111

TS110

NS130

NS129

NS119

TS125

TS117

75,709,146

26,874,920

59,005,897

54,806,207

66,171,386

61,528,113

64,693,617

53,584,485

48,757,235

27,191,476

84,083,688

75

99

99

75

100

75

75

75

75

75

75

表 1. 使用した RNA-seq データ

　ソフトウェアの性能評価に用いるデータとして、The

Cancer Genome Atlas (TCGA) で同定された融合遺伝子のリ

スト [5] からランダムに 100 種の融合遺伝子を抽出した。

それら遺伝子の配列から、ART[6] を用いてシミュレーショ

ンデータ（fastq ファイル）を作成した。fastq ファイルは、

Paired-end でリード長が 75bp、100bp、各融合遺伝子由来

の リ ー ド の Coverage が x5, 10, 20, 30, 50, 80, 100,

150, 200 となる RNA-seq データをそれぞれ用意した。

組織のデータとして、Costa らの論文 [7] で公開された、

甲状腺正常組織の RNA-seq データ 4 サンプルと、甲状腺乳

頭癌の RNA-seq データ 7 サンプルを用意した。各サンプル

のリード長、リード数は表 1 に示した。　　　　　　　　　

　Tophat-fusion と Chimerascan を用いたときの融合遺伝子

の検出感度 (True-positive) と偽陽性数 (False-positive)

をシュミレーションデータを用いて調査した（図 1）。

Tophat-fusion では、75bp より 100bp のリード長で検出感度

が高かった。一方で、Chimerascan では、Coverage が X10 以

上の条件で、リード長に依存せず高い検出感度を示した。ま

た、Coverage が増加すると偽陽性数が増加する傾向にあった。

　2 つのソフトウェアを比較した結果、検出感度では

Chimerascan が、偽陽性数の少なさでは Tophat-fusion が優

れていた。これは、Tophat-fusion では、Blast 検索により

偽遺伝子をはじめとする類似性の高い配列にマッピングされ

たリードを排除しており、Chimerascan と比較してマッピン

グエラーによって同定されていしまう候補を除外しているた

めだと考えられる。加えて、リードスルー（終止コドンで停

止せずに翻訳を続けること）で生じる融合遺伝子を除外して

いることもその一因であると考えられる。　　　　　　　　

　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

　解 析 に は、そ れ ぞ れ Tophat-fusion、Chimerascan、

Bowtie [8]、Blast [9]、Circos [10] を利用した。また、マッ

ピング時には hg19 のリファレンスゲノムを利用した。遺伝

子のアノテーションは Tophat-fusion で提供されている

RefSeq と Ensembl の情報 [11] を利用した。　　　　　　　

解析レポート 1701

4.　腫瘍組織における融合遺伝子の同定

図 1. 同定された融合遺伝子の割合と偽陰性の数

サンプル

腫瘍 1

腫瘍 2

腫瘍 3

腫瘍 4

腫瘍 5

腫瘍 6

腫瘍 7

CCDC6-RET

CCDC6-RET

CCDC6-RET

CCDC6-RET

CCDC6-RET

融合遺伝子

WNK-B4GALNT3

CCDC6-RET

23

90

44

60

144

91

69

Tophat-fusion Chimerascan

16

77

33

54

139

81

56

サンプル

正常 1

正常 2

正常 3

正常 4

腫瘍 1

腫瘍 2

腫瘍 3

腫瘍 4

腫瘍 5

腫瘍 6

腫瘍 7

Tophat-fusion Chimerascan 両ソフトに共通

78

44(40)

47(43)

41(34)

59(49)

56(46)

35

6

88

12(11)

70(68)

183

69(19)

200(143)

122(64)

122(63)

116(50)

125(55)

94(43)

93

61

134

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

5.　融合遺伝子のゲノム上での位置関係

※（）内は正常組織で同定された融合遺伝子の候補を除いた検出数

表 3. 融合遺伝子の検出数と両ソフトでの一致数

ソフトウェア

Tophat-fusion

Chimerascan 292

264

総数

263

81

同一染色体内 異なる染色体間

29

183

表 2. 同定された既知の融合遺伝子と有効リード数

表 4. 同一染色体・異なる染色体間の融合遺伝子の数

　腫瘍組織から得られた計 8サンプルの RNA-seq データか

ら同定されたすべての融合遺伝子の位置関係を図 2に示し

た。同一染色体上での融合遺伝子を青線で、異なる染色体

間での融合遺伝子を赤線で示した。

　Tophat-fusion では異なる染色体間の融合遺伝子がより検

出される傾向があり、一方で Chimerascan では同一染色体

内の融合遺伝子がより検出される傾向があった（表 4）。　

　組 織 の RNA-seq デ ー タ に 対 し て、Tophat-fusion と

Chimerascan を用いて融合遺伝子を同定した。まず、論文中

で報告された既知の融合遺伝子が検出の有無を検討した。

その結果、いずれのサンプルにおいても、両ソフトウェア

に よ っ て 論 文 中 で 報 告 さ れ た CCDC6-RET お よ び

WNK1-B4GALNT3 融 合 遺 伝 子 を 同 定 で き た ( 表 2)。

　次に、Tophat-fusion および Chimerascan を用いて同定さ

れたすべての融合遺伝子の比較を行った (表3)。その結果、

Chimerascan では Tophat-fusion よりも多くの融合遺伝子が

同定された。

そこで、偽陽性を減らす目的で、正常組織で検出された融

合遺伝子を腫瘍組織で検出された融合遺伝子から差し引い

た。その結果、Chimerascan では検出された融合遺伝子の候

補数を約 1/2 まで絞り込むことができた。またこのとき、

論文中で報告された CCDC6-RET および WNK1-B4GALNT3 融合

遺伝子は候補遺伝子に残っていることも確認できた。　　

解析レポート 1701

　Tophat-fusion では異なる染色体間で生まれた融合遺伝子が

より検出される傾向があり、一方で Chimerascan では同一染色

体内で生まれた融合遺伝子がより検出される傾向があることが

分かった（表 6）。　

1. 　Soda, M., Choi, Y. L. et al. (2007). Identification of the 　　　

　　transforming EML4‒ALK fusion gene in non-small-cell lung

　　cancer. Nature, 448(7153), 561-566.

2. 　Kim, D., & Salzberg, S. L. (2011). TopHat-Fusion: an algorithm

　　for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol,

　　12(8), R72.

3. 　Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., & Maher, C. A. (2011). 　　　　

　　ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in

　　sequencing data. Bioinformatics, 27(20), 2903-2904.

4. 　Carrara, M., Beccuti, M., Lazzarato, F., Cavallo, F., Cordero, F.,

　　Donatelli, S., & Calogero, R. A. (2013). State-of-the-art 　　　

　　fusion-finder algorithms sensitivity and specificity. BioMed

　　research international, 2013.

5. Yoshihara, K., Wang, Q., Torres-Garcia, W., Zheng, S.,

Vegesna 1. R., Kim, H., & Verhaak, R. G. W. (2014). The

landscape and therapeutic relevance of cancer-associated

transcript fusions. Oncogene.

6. Huang, W., Li, L., Myers, J. R., & Marth, G. T. (2012). ART: a

next-generation sequencing read simulator. Bioinformatics,

28(4), 593-594.

7. 　Costa, V., Esposito, R. et al. (2015). New somatic mutations

　　and WNK1-B4GALNT3 gene fusion in papillary thyroid 　　

　　carcinoma. Oncotarget, 6(13), 11242.

8. 　Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg SL. Ultrafast and

memory-efficient alignment of short DNA sequences to

the human genome. Genome Biol 10:R25.

9. Kent WJ: BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome

Res. 2002, 12: 656-664.

10. Circos: an Information Aesthetic for Comparative

Genomics. Genome Res (2009) 19:1639-1645

11. http://ccb.jhu.edu/software/tophat/fusion_tutorial.shtml6.　まとめ

7. 参考文献・ソフトウェア

Tophat-fusion

Chimerascan

図 2. Circos プロット

　Tophat-fusion と Chimerascan を用いたときの融合遺伝子

の検出感度および偽陽性数を調べた結果、融合遺伝子の検

出感度では Chimerascan が、偽陽性数の少なさでは Topfat

-fusion が優れていた。

次に、これらのソフトウェアを用いて融合遺伝子の同定を

行った結果、両ソフトウェアでも論文中で報告されている

既知の融合遺伝子 CCDC6-RET と WNK1-B4GALNT3 を同定する

ことができた。また、正常組織のデータから得られた融合

遺伝子の候補を腫瘍組織で得られた遺伝子から差し引くこ

とで、既知の融合遺伝子を取りこぼすことなく候補となる

融合遺伝子の数を絞り込むことができた。　

　最後に、各ソフトウェアの特性として、今回使用したデー

タでは、Tophat-fusion は異なる染色体間の融合遺伝子を検

出しやすい傾向にあり、一方で Chimerascan では同一染色

体内の融合遺伝子を検出しやすい傾向にあると考えられる。

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