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バイオプロピレン生産を目指した

プロパノール発酵技術の開発

大阪府立大学 大学院 生命環境科学研究科

応用生命科学専攻

教授 片岡 道彦

背景

糖

バイオマス エタノール

ブタノール

燃焼 エネルギー使用

CO2

バイオプロセス

エタノール等のバイオ燃料

⇒ 燃焼により、すぐにCO2が排出される

化石資源依存型社会から資源循環型社会へ

バイオ燃料

2

背景

ポリ乳酸等のバイオポリマー

⇒ 長期間のCO2固定が可能となる

化石資源依存型社会から資源循環型社会へ

ポリ乳酸

CO2固定

糖

バイオマス 乳酸

リサイクル

リユース 燃焼

エネルギー使用

CO2

バイオプロセス ケミカルプロセス

バイオポリマー

3

バイオプロパノール発酵生産の目的

プロピレン

ポリプロピレン

CO2固定

糖

バイオマス プロパノール

リサイクル

リユース 燃焼

エネルギー使用

CO2

バイオプロセス ケミカルプロセス

化石資源依存型社会から資源循環型社会へ

すでにポリマーとして普及しているポリプロピレンの生産

⇒ バイオマスからのプロパノール生産プロセスの開発

化石資源

約 5 kg-CO2/kg

ナフサ分解法

約 2 kg-CO2/kg

バイオプロピレン

年間生産量

50Mt-PP

4

既存の組換えE. coliを用いたプロパノール生産系

Acetoacetyl-CoA

Acetoacetate

Acetone

Isopropanol

Acetate

Acetyl-CoA

CO2

Pyruvate 2 x

Acetyl-CoA 2 x

CO2

Hanai, T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 73:7814-8 (2007)

Jojima, T. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 77:1219-24 (2008)

Shen, CR. et al., Metab. Eng., 10:312-20 (2008)

Atsumi, S. et al., Appl. Environ. Microbiol., 74:7802-8 (2008)

Max 1.0 mol/mol glucose

ABE発酵菌の イソプロパノール 生合成系を E. coliに移植

CO2

Glucose

Glycolysis

DHAP GAP

Pyruvate 2 x

Propanol

5

6

従来技術とその問題点

ABE発酵菌のイソプロパノール生合成経路を移植した組換え大腸菌を用いる方法があるが、

生合成経路中にCO2放出反応があり、

大腸菌の生育等に必要なエネルギー等を

差し引くと、

グルコースからの対糖収率が最大でも0.6〜0.7

モル／モル程度にとどまると考えられる。

新規1-プロパノール発酵生産経路の概略

Max 2.0 mol/mol glucose

To TCA cycle

Reducing power

ATP

Max 1.25 mol/mol glucose

1×Glucose + 0.375×O2

1.25×1-Propanol +1×H2O + 2.25×CO2 + 1.75×ATP

CO2放出のない 新たなプロパノール 生合成系を設計

Glucose

NAD(P)H

NAD(P)H

Pi

Glycolysis

DHAP GAP

MG

LA HA

1,2PD

PA 1-Propanol

NAD(P)H

NAD(P)H NAD(P)H

H2O

CoB12

Glucose

Glycolysis

DHAP GAP

1-Propanol

7

8

新技術の特徴・従来技術との比較

• すでに報告のあるイソプロパノール発酵技術とは異なり、CO2放出を伴わないプロパノール生合成経路を設計。

• 対糖収率において、従来技術より1.5〜2倍の向上が期待できる。

• バイオマス由来のポリプロピレンのCO2排出量は、化石資源由来のものの半分以下。

新規1-プロパノール発酵生産経路の概略

To TCA cycle

Reducing power

ATP

Max 1.25 mol/mol glucose

1×Glucose + 0.375×O2

1.25×1-Propanol +1×H2O + 2.25×CO2 + 1.75×ATP

CO2放出のない 新たなプロパノール 生合成系を設計

Glucose

NAD(P)H

NAD(P)H

Pi

Glycolysis

DHAP GAP

MG

LA HA

1,2PD

PA 1-Propanol

NAD(P)H

NAD(P)H NAD(P)H

H2O

CoB12

Glucose

Glycolysis

DHAP GAP

1-Propanol

9

DHAP

(R)-1,2-PD

(S)-1,2-PD

(R)-LA

(S)-LA

HA MG

Glucose

Sporobolomyces salmonicolor由来

Aldehyde reductase II

(arII)

Escherichia coli由来

Glycerol dehydrogenase

(gldA)

Escherichia coli由来

Methylglyoxal synthase

(mgsA)

グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種

10

pKKArMeGe

(5039 bp)

Ptac

mgsA

arII

gldA

Ptac

Ptac

pKK

223-3

pKK

223-3

pKK

ArMeGe

Aerobic Microaerobic

Produced

1,2-PD (mM) N.D. 1.3 N.D. 20.6

Vector

Aeration

0

50

100

150

200

250

Co

nce

ntr

atio

n (

mM

)

1,2-PD

Lactate

Formate

Acetate

EtOH

Succinate

pKK

ArMeGe

グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種

100 mM Glucose, 48 hr

Consumed glucose is 100 mM

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HA MG DHAP

Glucose

グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種（まとめ）

1,2-PD

Escherichia coli由来

Methylglyoxal synthase

(mgsA)

Sporobolomyces salmonicolor由来

Aldehyde reductase II

(arII)

Escherichia coli由来

Glycerol dehydrogenase

(gldA)

1-Propanol

Glucoseから1,2-Propanediolを発酵生産する菌の育種を目的として、想定経路を構築し、各反応を触媒する酵素遺伝子のスクリーニングによる選抜を行った。

これら酵素遺伝子を導入した組み換えE. coliをGlucose含有培地で微好気的に培養することにより、100 mM (= 18.0 g/L)のGlucoseより20.6 mM (= 1.57 g/L)の1,2-

Propanediolを培養液中に蓄積した。 12

新規1-プロパノール発酵生産経路の概略

To TCA cycle

Reducing power

ATP

Max 1.25 mol/mol glucose

1×Glucose + 0.375×O2

1.25×1-Propanol +1×H2O + 2.25×CO2 + 1.75×ATP

CO2放出のない 新たなプロパノール 生合成系を設計

Glucose

NAD(P)H

NAD(P)H

Pi

Glycolysis

DHAP GAP

MG

LA HA

1,2PD

PA 1-Propanol

NAD(P)H

NAD(P)H NAD(P)H

H2O

CoB12

Glucose

Glycolysis

DHAP GAP

1-Propanol

13

1,2-PDを1-プロパノールへ変換する菌の探索

1,2-PD

Glycerol

Propionaldehyde

3-Hydroxypropionaldehyde

1-Propanol

1,3-Propanediol

Glycerol dehydratase 1,3-Propanediol oxidoreductase

14

Conversion of 1,2-PD to 1-propanol using Shimwellia blattae ATCC33430

0

10

20

30

40

50

60

Glc Gly Glc+Gly

Co

nce

ntr

atio

n (

mM

)

Culture conditions

M9 minimum medium containing 5 g/L

10 g/L

50 mM

Yeast extract

CaCO3

1,2-PD

Sugar :

100 mM (= 18 g/L) Glucose

and/or

200 mM (≒ 18 g/L) Glycerol

37ºC, 48 hr

0

5

10

15

20

25

0

12

24

36

48

60

0 20 40 60 80 100

Glu

co

se

, G

lyce

rol (m

g/m

L)

!-P

ropanol, 1

,2-P

D (

mM

)

Time (h)

1,2PD

Glycerol

Glucose

1-Propanol

1-Propanol

1,2-PD

15

dhaK dhaN dhaM dhaL dhaD dhaR dhaH dhaG

dhaT dhaI dhaB dhaC dhaE

dhaF

GeneGene productGeneGene product

dhaKDihydroxyacetone kinasedhaGGlycerol dehydratase reactivation factor small subunit

dhaNPhosphoenolpyruvate-protein kinasedhaT1,3-Propanediol dehydrogenase

dhaMDihydroxyacetone kinasedhaIAdenosyl transferase large subunit

dhaLHypothetical proteindhaBGlycerol dehydratase large subunit

dhaDGlycerol dehydrogenasedhaCGlycerol dehydratase medium subunit

dhaRGlycerol metabolism operon regulatory proteindhaEGlycerol dehydratase small subunit

dhaHAdenosyl transferase small subunitdhaFGlycerol dehydratase reactivation factor large subunit

DhaBCE

(apoenzyme)

1,2-PD PA

DhaBCE

(inactive)

Inactivation

1-Propanol DhaT

ATP

ADP

X-Cbl

Ado-H

Cbl(I)

AdoCbl

ATP

PPPi

Cobalamin reductase(s)

DhaBCE

(holoenzyme)

NAD(P)H NAD(P)+

DhaFG

DhaHI

CoB12

1,2-PDを1-プロパノールに変換する菌株の育種

Toraya, T., Cell. Mol. Life Sci., 57:106-27 (2000) 16

0

10

20

30

40

50

60

○

×

×

×

1.3

○

○

×

×

0.7

○

×

○

×

1.0

○

×

×

○

1.2

○

○

○

×

0.3

○

○

○

○

1.2

dhaBCE

dhaFG

dhaHI

dhaT

OD660

Co

nce

ntr

atio

n (

mM

)

100 mM

50 mM

5 μg/mL

96 hr

Glucose

1,2-PD

CoB12

1-Propanol

PA

1,2-PD

Co

nce

ntr

atio

n (

mM

)

pRSF_Eb

DhaBCEF

pCDF_Eb

DhaITGH ○

× ○

×

○

○

100 mM Glucose, 70 mM 1,2-PD,

5 μg/mL CoB12, 72 hr

1-Propanol

1,2-PD

1,2-PDを1-プロパノールに変換する菌株の育種

17

0

40

80

120

160

200

0

4

8

12

16

20

0 50 100 150Time (h)

1-P

rop

ano

l, 1

,2-P

D (

mM

)

Glu

cose

(m

M)

1,2-PD

Glucose

1-Propanol

Plasmids CoB12

Concentration (mM)

Consumed

glucose 1,2-PD 1-Propanol

pKKArMeGe ○ 126.1 19.4 N.D.

pKKArMeGe

pCDF_EbDhaITGH

pRSF_EbDhaBCEF

× 120.6 17.2 N.D.

○ 115.1 1.9 16.9

200 mM Glucose, 5 μg/mL CoB12, 96 hr

培養時間 144 h

消費グルコース 132.6 mM (≑23.9 g/L)

1-プロパノール生成 19.9 mM (≑1.2 g/L)

対グルコース変換率 0.15 mol/mol (0.05 g/g)

組換えE. coliを用いた1-プロパノールの発酵生産

18

19

想定される用途

• バイオマスからのプロピレン・ポリプロピレン生産

• バイオマス由来の燃料添加剤の発酵生産

• バイオマス由来の多目的溶媒の発酵生産

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実用化に向けた課題

• グルコースから1-プロパノールの生産を確認。しかし、1-プロパノールの収量・対糖収率が不十分。

• 現在、1-プロパノール生合成経路の強化や副産物への変換経路の削除を検討中。

• 1-プロパノールの発酵生産条件の最適化についても検討中。

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企業への期待

• バイオマスからのプロピレン生産を目指したプロパノール発酵技術の共同開発。

• 発酵生産技術の開発経験を持つ企業との共同研究を希望。

• 本技術によるバイオマス由来のプロパノールのプロピレン製造以外への用途開発。

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本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：1-プロパノールの製造方法

• 出願番号 ：特願2007-298136

• 出願人 ：協和発酵ケミカル他

• 発明者 ：片岡道彦、浦野信行、清水昌

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産学連携の経歴

• 1991年-1999年 第一ファインケミカル社と共同研究

☞ D-パントラクトンの酵素法による生産（1999年）

• 1995年-2000年 カネカ社と共同研究

☞ キラルアルコールの酵素法的生産（2000年）

• 2007年-2011年 文科省-JST ターゲットタンパクプログラムに採択

• 2012年- JST-ALCAプロジェクトに採択

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お問い合わせ先

大阪府立大学

産学官研究連携戦略室 コーディネータ

野村 幸弘

ＴＥＬ 072－254－ 8263

ＦＡＸ 072－254－ 7475

e-mail nomura@iao.osakafu-u.ac.jp