FG 4.2 - Analisis Aplikasi Protein 1

5/28/2018 FG 4.2 - Analisis Aplikasi Protein 1

1/46

Analisis & Aplikasi Protein

Benedict Ryan

Lita LiantiM. Teguh GumelarMonica WinataTaufik H. Abdullah

Yulianto


2/46

Analisis Kuantitatif


3/46

Metode SpektroskopiMengukur absorbansi protein pada 220 nm (UV) yangdisebabkan oleh ikatan peptida.

Banyak senyawa lain yang juga menyerap sinar pada

220 nm : derajat interferensi cukup besar

Asam amino aromatik : 280 nm


4/46

Metode KjeldahlKuantifikasi nitrogen dalam senyawaDapat digunakan jika proporsi nitrogen dalam protein diketahui (biasanya16%).

Zat pengotor yang mengandung nitrogen harus dihilangkan :Mempresipitasi proteinterlebih dahulu

Presisi dan akurasi tinggi

Source of

protein

Proportion of nitrogen

% total weight

Conversio

n factor

Meat 16 6,25Blood plasma 15,3 6,54

Milk 15,6 6,38

Flour 17,5 5,7

Egg 14,9 6,68


5/46

Metode Kjeldahl1. DIGESTION : Sampel dioksidasi menjadi garam amonia dengan

memanaskannya bersama H2SO4pekat. (CuSO4sebagai katalis)

2. NEUTRALIZATION : Garam amonia dikonversi menjadi gasamonia dengan pemanasan dan penambahan NaOH, kemudiandidestilasi.

3. TITRATION


6/46

Metode BiuretReagen : CuSO4, Na-K-tartrate dan KI dalam larutan NaOH

-CONH- pada protein membentuk kompleks berwarnaungu.

Intensitas warna sebanding dengan jumlah ikatan peptida

Kuantifikasi dilakukan dengan mengukur absorbansipada545 nm


7/46

Metode Lowry10X lebih sensitif dari metode biuret.

Analytical range : 1g 1mg protein

Menggunakan reagen Folin & Ciocalteu (Mengandung

phosphotungstic & phosphomolybdic acid, suatu reagen untuk

mendeteksi fenol)

Metode :1.Sampel diberi reagen seperti pada metode biuret

2.Sampel diberi reagen Folin & Ciocalteu

3.Ukur absorbansi pada 600 nm

Kompleks Cu-Protein mereduksi Folin & Ciocalteu menjadi warnabiru.


8/46

BradfordAssay

Metode yang paling sering digunakan, karenakemudahannya, sensitivitasnya dan ketahanannya terhadapinterferensi.

Metode :

1. Sampel diberi reagen (Coomasie Blue G250 + larutan

asam)2. Ukur absorbansi pada 595 nm.

Coomasie Blue dalam kondisi asam berwarna merah-coklatdan menjadi warna biruketika berikatan dengan protein

Kekurangan : reagen cenderung menempel pada wadah


9/46

o um eocy up a ePolyacrilamide Gel Electropohoresis(SDS PAGE)

Dapat digunakan untuk mengukur beratmolekul (Mr) protein

Metode1. Mencampurkan sampel dengan larutan berisi

buffer (tris) , SDS dan -mercaptoethanol.

2. Elektroforesis gel

3. Memberi pewarna (Coomasie Blue)

SDS mendenaturasi protein, memutus ikatandisulfida, dan menambah muatan negatif padaprotein.

-mercaptoethanol membantu mendenaturasiprotein (memecah ikatan disulfida)

Protein dengan Mrkecil bergerak lebih cepat(Molecular sieving)


10/46

Analisis Kualitatif


11/46

Analisis Struktur Protein


12/46

Teknik Menganalisa Struktur Protein

KristalografiX-Ray

NMR

CD-Spektroskopi ProteinSekuensing


13/46

Kristalisasi X-Ray

KristalisasiProtein

- Mengubahprotein menjadikristal

Menembakkansinar X-Ray

- Menembakansinar x ke protein

sehingga akanterjadi difraksisinar x

KomputasiStruktur Protein

-Menerjemahkandifraksi yangdiakibatkan olehprotein menjadi

struktur 3D darisuatu protein


14/46

Nuclear Magnetic Resonance (NMR)

Sampel sebelumnya

harus dimurnikan dan

diekstraksi terlebih

dahulu Memanfaatkan sifat

magnetik dari ikatan inti

protein yang

mengandung hidrogendan carbon


15/46

Circular Dichroism (CD) Spectrocopy

Untuk menentukkan struktursekunder dari protein

Menggunakan instrumendextrorotory dan levorotoryuntuk membelokkan struktur

protein Sampel bisa berupa larutan

dalam jumlah yang cukupbesar

Tidak bisa memberikan letakbelokan dari struktur sekunderprotein

Biasa diaplikasikan dengansinar-UV dan cahaya tampak


16/46

Protein Sequencing

Mengambil Sampelyang Ingin di Uji

MenentukanSusunan AsamAmino StrukturPrimer Protein

MembuatPermodelan Fungsi

dan Struktur 3Dprotein


17/46

Metode Permodelan Struktur 3D

Protein

Permodelan Komparativ Protein

Permodelan Homologi Protein threading

Pendekatan de novo


18/46

Analisis Kualitatif Lainnya


19/46

Uji Ninhidrin

Digunakan untuk mendeteksi

keberadaan amonia atau

amina primer & sekunder

Dapat digunakan pada

seluruh jenis asam amino

Menghasilkan warna ungu

yang disebut dengan

Rheumanns Purple


20/46

Mekanisme Reaksi yang Terjadi:


21/46

Uji Xantoproteic

Digunakan untuk menguji keberadaan

senyawa aromatik yang terdapat dalam suatu

asam amino

Asam amino yang biasa digunakan: tirosin,

triptofan, fenilalanin, dan asam glutamat

Akan menghasilkan warna kuning-orange


22/46

Hasil yang diperoleh dari Uji Xantoproteic:


23/46

Uji Kelarutan

Tujuan: Untuk menentukan tingkat kelarutanasam amino

Asam amino yang dapat digunakan pada

percobaan: glisin, tirosin, sistein, dan asamglutamat

Karena kelarutan suatu zat akan bergantung

terhadap kelarutan pH, maka uji kelarutandapat dilakukan dengan menentukan sifatasam/basa yang dikandung larutan tersebut.


24/46

Prosedur:

Masukkan sedikit sampel asam

amino, kemudian dipanaskan

Masukkan kertas lakmus ke dalam

larutan tersebut untuk menentukan

sifat asam/basa asam amino

Lakukan hal serupa dengan larutan

HCl dan NaOH sebagai

pembanding


25/46

Uji Endapan

1. Karena adanya Garam Netral

Dikenal juga dengan nama salting-out method Larutan yg dapat digunakan: Amonium sulfat

Dapat diterapkan pada seluruh jenis protein/asam amino

Proses: Garam yang dimasukkan ke dalam sampel akan

mengikat air sehingga protein menjadi bersifat hidrofobik.

Oleh sebab itu, akan timbul endapan dari larutan ini.


26/46

Uji Endapan

2. Karena adanya Logam Tujuan: Menguji keberadaan logam di dalam sampel

Ion logam yang dapat teruji: Hg2+, Pb2+, Ag+, Tl+, Cd2+

Cara kerja: Masukkan larutan yang mengandung logam kedalam sampel protein. Nantinya, akan timbul endapanberwarna putih yang menunjukkan bahwa sampelmengandung logam yang dimasukkan tersebut.

Proses: Ion negatif pada protein akan berikatan denganion logam (positif) sehingga akan timbul endapan putih

Dapat diterapkan pada seluruh jenis protein.


27/46

Western Blotting

Digunakan untuk mendeteksi adanya proteintertentu.

Elektroforesis gel memisahkan protein

berdasarkan struktur 3D Menggunakan gel elektroforesis yang ditransfer

pada nitroselulosa

Protein akan dilacak dengan menggunakan

antibodi yang spesifik terhadap protein target Protein akan memisahkan diri berdasarkan

kemampuan protein tersebut berikatan denganantibodi


28/46

Western Blotting

VP ITC


29/46

Isothermal Titration Calorimetry

Mengukur sifat termodinamik interaksiantar makromolekul dalam larutan

Menentukan konstanta kesetimbangan,perbandingan mol reaksi dan entalphiikatan

VP-ITC

DLS


30/46

Dynamic Light ScatteringMendeteksi sifat hidrodinamik

makromolekul

Oligomerasi

Agregasi

DLS

BIAcore 2000


31/46

Surface Plasmon ResonanceMemperlihatkan proses interaksi sebagai

fungsi waktu antara ligand diam pada

permukaan sensor chip dan analit dalamlarutan

Memberikan informasi specificity ikatan,kinetik dan afinitas

BIAcore 2000


32/46

Aplikasi Protein


33/46

Industri Obat-Obatan

Cairan Albumin

Protein Therapeutics

Green Fluorescent

Protein


34/46

Cairan Albumin

Albumin bermanfaat dalam pembentukan jaringan sel

baru. Dalam kedokteran, albumin dimanfaatkan untuk

mempercepat pemulihan jaringan sel tubuh yang

terbelah

Sedangkan dalam produk farmasi, antara lain, dimanfaatkan

untuk pengocokan (whipping), ketegangan, atau penenang

dan sebagai emulsifier. Kadar albuminpun bisa menurunkarena faktor medis, dan ini dapat dijumpai pada penderita

penyakit hati kronik, ginjal, saluran cerna kronik dan infeksi

tertentu.


35/46

Protein Therapeutic

Protein terapeutik dapat digunakan sebagai perawatan medis

sangat efektif (terapi protein) untuk berbagai macam penyakit

di mana protein yang baik kurang atau kekurangan (hormon

pertumbuhan dan insulin), atau protein terapi digunakan

untuk menghambat proses biologis (antibodi yang memblokir

pasokan darah ke tumor)


36/46

Green Fluorescent ProteinKomponen Biosensor

GFP telah banyak digunakan dalam pelabelan spermatozoa dari

berbagai organisme untuk tujuan identifikasi seperti pada

Drosophila melanogaster, di mana ekspresi GFP dapat digunakan

sebagai penanda untuk karakteristik tertentu. GFP juga dapat

dinyatakan dalam struktur yang berbeda memungkinkan perbedaan

morfologi.


37/46

{Aplikasi Protein

di Industri}Pemanfaatan Protein sebagai bahan baku atautambahan dalam kegiatan di bidang Industri


38/46

Protein Function : Structure

Movement

Defense Storage

Signal

Catalyst

Protein and its Function


39/46

Protein Application inIndustry

Biocatalyst (enzyme)

Emulsifier Sensoring Absorbing water Etc.

Protein in Industry

Detergent

Meat based

Pulp & Paper

RawMaterial

Addedvalue

AuxiliaryAgent


40/46

Bio-Detergent Industry

Protein as raw material

Enzymatic product

Proteases (e.g. blood stain)

Lipases (e.g. Butter)

Amylases (e.g. chocolate)

Cellulases (modifiy cellulose fibrils)

Clolor brightening Softening

Particulate soil removal

Powder

Liquid


41/46

Meat based products :Protein as added value

High added value : Sausage

Meatball

Burger pattiies

Meat loaf

Low added value :

Minced beef

Beef cube Minced chicken

Boneless chicken

Raw Meat

Wh S P i ?


42/46

Proportional with animal protein Contain all amino acid for growth

25% of fat contents is unsaturated

Why Soy Protein?

Soy Protein Isolate

Soy Protein Concentrate

Textured Soy Protein


43/46Inside Soy Protein Isolate

Glycinin (11S Globulin, 34% SPI)

-conglycinin (7S, 27% SPI) -conglycinin (Trimer of 170 kD)

7S Globulin

Aglutinin (7S)

Lipoxygenase (7S) -amylase (7S)

Soy tripsin inhibitors (2S)

hidrophyllic

hidrophobic


44/46

Pulp & Paper IndustryXylanase

Cellulase Lipase

Cellulase Esterase


45/46

Daftar Pustaka

Wilde, Pete. __.Emulsifiers, Thiickeners and Stabilisers. Institute for Food Research.http://www.food-research.info/talks/Pete_Wilde.pdf (diakses 11/3/2013).

Pitrucelli, Silvanna dan Anon, Maria Cristina. 1995. Soy Protein Isolate and TheirComponent Interactions. J.Agric.Food Chem. 1995, 43, 1762-1767.

Redaksi Biotech. ___. The Detergent Industry. http://www.im-biotech.com/enzymes/detergents/ (diakses 11/3/13).

Nielsen, Per H., et al. 2007. Environmental Assessment of Enzyme AssistedProcessing in Pulp and Paper Industry. LCA Case Studies.

Anonim. ___. Properties of Glycinin. http://www.food-allergens.de/symposium-vol1%282%29/data/soy/glycinin.htm (diakses 11/3/13)

Suryanto, Edi. 2011. Penggunaan Protein Kedelai Pada Industri Olahan Daging.Fakultas Peternakan UGM : Foodreview Ed.Maret.

Kuchel, Philip dan Ralston, Gregory B. 2006. Biokimia : Schaums easy outlines.Jakarta : Erlangga.


46/46

Terima Kasih

Documents

FG 4.2 - Analisis Aplikasi Protein 1