FISHFISHHibridização in situ por

Fluorescência

Cristina Grumann

FISHO que é?O que é?• É a técnica de citogenética molecular

mais comumente utilizada.• Utiliza sondas de DNA marcadas com

fluorescência para detectar anomalias cromossômicas que estão além do poder de resolução da citogenética de rotina, como microdeleções e rearranjos cromossômicos complexos.

FISHO que faz?O que faz?• Detecta seqüências específicas de ácidos

nucléicos pela formação de um duplex de um fragmento de ácido nucléico de fita simples modificado (sonda) e sua seqüência complementar (seqüência alvo) no espécime fixado.

• A sonda de DNA reconhece e se hibridiza com sua seqüência complementar no cromossomo.

FISH - Vantagens

• Pode ser aplicada tanto para células em pró-metáfase, metáfase como em interfase, o que permite fazer diagnósticos citogenéticos mais acurados, tanto para anormalidades constitucionais, quanto para mudanças cromossômicas adquiridas como no caso de células cancerosas. É também um instrumento valioso para mapeamento gênico.

• Pesquisas de aneuploidias podem ser feitas mais rapidamente. Não há necessidade de crescimento em culturas das células.

• Tecidos preservados podem ser investigados.

• Pode ser aplicado para lâminas padrões de citogenética, mas também para tecidos fixados em formol, amostras de sangue e de medula óssea.

FISH - Vantagens

• Quanto às bandas:– Identificação de alterações além da

resolução visual (microdeleções).– Visualização de rearranjos

cromossômicos em regiões camufladas pelas bandas (rearranjo crítico).

– Rearranjos de difícil interpretação como rearranjos dentro do cromossomo.

FISH - Vantagens

• Preparação das sondas:

- Método direto: ligação com fluorocromo;

- Método indireto: moléculas sinalizadoras - biotina, digoxigenina - conjugam-se com outra molécula ligada ao fluorocromo (avidina ou anticorpos).

FISH - Etapas

FISH - Etapas

• Preparação dos cromossomos.

• Preparação das lâminas.

• Desnaturação da sonda e do DNA cormossômico aquecimento em solução de formamida (70C).

• As sondas então colocadas sobre as lâminas que são incubadas a 37C “overnight” em câmara úmida e escura.

• Durante esse período, a sonda se liga à região alvo do cromossomo e ocorre a hibridização.

FISH - Etapas

• No dia seguinte, a lâmina é lavada para a remoção das sondas em excesso.

• Contracoloração (counterstainig) Adição de soluções que irão colorir o resto do material cromossômico.

– Mais usadas: DAPI (azul), propidium iodice (vermelho)

FISH - Etapas

• Visualização:– em microscópio epifluorescente.– filtros específicos para o os

fluorocromos e “couterstaining”.

FISH - Etapas

FISH - Tipos de Sondas

Sondas centroméricas ou alfa satélites - para seqüências de DNA repetitivo localizadas no centrômero ou região pericentromérica.

• Adequada para diagnóstico de aneuploidias.

Sonda Centromérica

Sonda Centromérica

Sonda Centromérica

Em vermelho, cromossomo X e em verde, o Y

Sonda Centromérica

FISH - Tipos de Sondas

Sondas de seqüência única para o cromosssomo sondas específicas para deteminado loco ou gene.

• Deleções e duplicações submicroscópicas.

Sondas de Seqüência Única

FISH - Tipos de Sondas

Sondas para cromossomo inteiro “pintura cromossômica”

• Rearranjos complexos;• Identificação da origem de material

cromossômico adicional (cromossomos em anel).

Sonda “Painting”

Em vermelho, o cromosomo 4

Sonda “Painting”

FISH - Tipos de Sondas

Cariotipagem por espectro multicolorido

• Detecção de pequenos rearranjos cromossômicos constitucionais ou adquiridos, como no câncer.

Espectro Multicolorido

• Detecção de aneuploidias– Aneuploidias dos cromossomos X e Y e trissomias

do 21, 13 e 18 são responsáveis por 90% das anomalias cromossômicas.

– Diagnóstico em poucas horas.– Análise linfócitos do sangue periférico e amostras de

vilosidades coriônicas, células do líquido amniótico ou cordão umbilical (em diagnóstico pré-natal).

– Utilização de sondas de seqüência única ou alfa satélite.

– Contagem dos sinais fluorescentes na célula interfásica.

FISH - Aplicações

• Diagnóstico pré-implantação– Possível com os avanços no campo da

fertilização “in vitro”.– Remoção de 1 ou 2 blastômeros em

embriões de 3 dias. – Permite diagnóstico de alterações

cromossômicas ou gênicas.– Seleção de sexo do embrião (em

doenças ligadas ao X).

FISH - Aplicações

• Diagnóstico pré-implantação

Obs: Limitação da alta freqüência de mosaicismo na fase inicial do desenvolvimento humano com aneuploidias e poliploidias.

FISH - Aplicações

Trissomia do 21

FISH - Aplicações

• Síndromes de Microdeleções– Deleções pequenas e de difícil detecção.– Diagnóstico mais preciso.– Análise dos cromossomos em metáfase

ou interfase.– Usadas duas sondas: uma cromossomo-

específica e outra loco-específica.

Exemplos:

– Síndrome de Williams (7q-) - deleção de gene da elastina.

– Síndrome de Prader- Willi/Angelman(15q-).

– Síndrome do Miado do gato - cri-du-chat (5p-).

– Deficiência de esteróide-sulfatase (Xp-).

FISH - Aplicações

Síndrome de Williams

Em verde o cromossomo 7 e, em vermelho, o gene da elastina

Deficiência de Esteróide-sulfatase

Deficiência de esteróide-sulfatase- Microeleção no cromossomo X

• Leucemias– Avaliação da origem clonal.– Caracterização das alterações

cromossômicas e estruturais diagnóstico, prognóstico e tratamento.

– Detecção de doença residual mínima.– Identificar recaída da doença.– Monitoramento pós-transplante: quando

doador e receptor são de sexos diferente para verificação da proporção de células XX e XY.

FISH - Aplicações

• Leucemia Mielóide Crônica (LMC)- Avaliação da presença do crossomomo Philadelphia - translocação entre 9 e 22- não visualizada em 5% das análises da citogenética padrão.

FISH - Aplicações

• Leucemia Linfóide Crônica– Trissomia do 12 em 30% dos casos.– 14 q+ em 20%.– Alterações do 13 em 20%.– Deleção 6q em 10%.

FISH - Aplicações

• Leucemia Mielóide Aguda– Leucemia promielocítica aguda: rearranjo

PML/RAR- t(15;17).– Leucemia mielomonocítica aguda: pesquisa da

inversão do cromossomo 16– Leucemia monocítica aguda: pesquisa de

alterações envolvendo o gene MLL.– Leucemias com monossomia 7, 5 ou trissomia

8 para detecção de doença residual no controle pós terapia.

– Leucemia mielóide aguda com Ph ou BCR/ABL.

FISH - Aplicações

• Leucemia Linfóide Aguda– Cromossomo Ph.

– Rearranjo do gene MLL.

– Hiperdiploidia.

– Rearranjo dos genes TEL/AML1

FISH - Aplicações

• Câncer de Mama– FISH é utilizado para demonstrar a

amplificação de genes. – A superexpressão de oncogenes tem

papel importante na progressão de vários tumores.

– 25-30% dos tumores de mama e ovário tem amplificação do gene HER2/neu.

FISH - Aplicações

– HER2/neu é um proto-oncogene localizado no cromossoma 17 e que codifica uma oncoproteína transmembrana, a p185HER2.

– A presença do HER2/neu determina rápida proliferação do tumor e muita agressividade.

– Através de sondas de DNA complementares marcadas com fluorocromo, pode-se visualizar um número aumentado de cópias do gene em relação às 2 normalmente existentes.

FISH - Aplicações

Cromossomo 17 em verde e os genes Her2 em laranja.

Bibliografia

• ROONEY D.E., CzZEPULKOWSKI B.H.. Human Cytogenetics -Essencial Data. Reino Unidio. Ed. Wiley, 1997.

• Http://www.meds.com/molmime/ leukemia/guide/1660s13.jpg

• http://www.institutofleury.org.br/site/calandra

• http://www.mostgene.org/gd/gdvol13a.htm

• http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-84842005000200008&lng=en&nrm=iso&tlng=pt

• http://www.slh.wisc.edu/cytogenetics/procedures/fish/index.php