Tiziana Alberiotiziana.alberio@uninsubria.it

c/o Lab. di Biochimica e Proteomica Funzionale, 1° piano

Fisiopatologia del Sistema Immunitario

Fisiopatologia del Sistema ImmunitarioModulo di BiochimicaModulo di Biochimica

1 e 2 – Le molecole del sistema immunitario: Ig, MHC, TCR

3 – Il Complemento 4 – Citochine e Recettori

Le molecole del Sistema Immunitario

Le molecole del Sistema Immunitario

Regioni variabiliRiconoscimento dell’antigene

Regioni costantefunzione effettrice Catena

leggeraCatena pesante

Nucleo strutturale simmetrico: 2 catene leggere 24 kDa

2 catene pesanti 55 o 70 kDa

Ponti disolfuro

Catene leggere (L) e pesanti (H)

Catene leggere (L) e pesanti (H)

La struttura della molecola è garantita da:Interazioni non covalenti tra domini IgPonti disolfuro tra L e H e tra le regioni C di H (cerniera)

VH

CH1CH2

CH3

VLCL

hinge

Struttura generale di un anticorpo

Struttura generale di un anticorpo

Riconoscimento dell’antigene e funzioni effettrici: funzioni spazialmente separate e indipendenti

Esperimenti di clivaggio proteolitico

Esperimenti di clivaggio proteoliticocerniera: zona più suscettibile

all’attacco proteolitico (tra Cγ1 e Cγ2) La proteolisi con papaina genera:Fab antigen-binding, mantiene la capacità di legare l’AgFc, frammento cristallizzabile

La proteolisi con pepsina interessa la regione C-term della cerniera e genera:Fab’ (Fab+cerniera)F(ab’)2 se vengono mantenuti S-S

Fab e F(ab’)2 utili sperimentalmente: legano

l’Ag ma non hanno funzione effettrice

Il dominio immunoglobulinicoIl dominio immunoglobulinico

≈ 110 a.a. che ripiegano in maniera indipendente 2 strati di foglietto β planare (β sandwich) ciascuno composto da 3-5 β-strands (5-10 a.a.) antiparalleli motivo a chiave greca

Stabilizzato da: ponti disolfuro interazioni idrofobiche tra i due foglietti βConservazione di specifici residui (es. Cys e Trp)

La superfamiglia delle immunoglobuline

La superfamiglia delle immunoglobuline

tutte le molecole che contengono il dominio Ig; mediano funzioni di riconoscimento, adesione e legameomologia di sequenza tutti i geni che codificano per domini Ig si sono evoluti da un gene ancestore comuneEvento precoce: duplicazione genica, con divergenza esoni V e C. Evoluzione: 1) Divergenza “V e C” e TCR (sequenza). 2- Capacità di riarrangiare il DNA (per riconoscimento Ag) La funzione dipende dall’interazione tra domini Ig

MHC

TCR

Ab

C e V in catene leggere (L) e pesanti (H)

C e V in catene leggere (L) e pesanti (H)

V= N-termC= C-term

H: V → 1 dominio C → 3 o 4 domini

L: V → 1 dominio C → 1 dominio

V: la sequenza a.a. differenzia gli Ab prodotti da un clone di linfociti B

Segmenti ipervariabili o CDRSegmenti ipervariabili o CDRComplementarity Determining Region: ≈ 10 a.a.CDR3 il più variabile

N-term C-term

Regioni ipervariabili o CDRRegioni ipervariabili o CDR

Le CDR formano delle anse esposte sulla superficie, strutture chimiche uniche → SPECIFICITA’

Sequenze conservate adiacenti → ripiegamenti del dominio Ig

Cause della diversificazioneCause della diversificazione1) Ricombinazione somatica del DNA: diversità combinatoria

L H

Organizzazione genomica nei geni delle catene leggere e pesanti nell’uomo

Diversi esoni per i diversi domini H

Cause della diversificazioneCause della diversificazione2) Diversità giunzionale

3) Inserzione della regione N

V J

V JOH

V GTCAATG J

TdT inserisce nucleotidi

Rottura del DNA

+

V GTCAATG JLigazione

Introne

Catena H Catena L

Segmenti regione V

1000 300

Segmenti regione D

15 -

Segmenti regione J

4 4

Diversità giunzionale

+++ +

Inserzione regione N

++ -

Mutazione Somatica

+ +

totale 1000x15x4= 6 x 104

300x4= 1.2 x 103

associazione 7.2 x 107

Elisione di nucleotidi (nucleasi)

5 classi, che si differenziano per la regione C della catena pesante:IgM Catena IgD Catena IgG Catena IgA Catena IgE Catena

Classi o isotipi delle IgClassi o isotipi delle Ig

IgG1 Catena

IgG2 Catena

IgG3 Catena

IgG4 Catena

IgA1 Catena

IgA2 Catena

uguale sequenza a.a. all’interno della stessa classe o

sottoclasse

SottoclassiSottoclassi

4C

4C

3C

3C

3C

Diverse funzioni EFFETTRICI

Classi delle IgClassi delle Ig

Funzioni EffettriciFunzioni EffettriciPorzione Fc1- viene riconosciuta da specifici R2-può attivare il complemento3- permette il trasporto attivo dell’Ab (latte, secrezioni, circolo fetale...)

IgM e IgA formano polimeriIgM e IgA formano polimeri

IgM e IgA possono formare multimeri Le IgM formano pentameri nel plasma Le IgA formano dimeri nelle secrezioni mucose (necessario per il trasporto attraverso gli epiteli)Contengono una coda C-term di 18 a.a. con un residuo Cys necessario alla polimerizzazione Un polipeptide aggiuntivo (J: joining) di 15 kDa favorisce la polimerizzazione legando la Cys

Lo switch isotipicoLo switch isotipico

Nel corso delle risposte umorali, il clone di linfociti B stimolato dall’Ag può produrre anticorpi di isotipo diverso (switch isotipico):CH cambia V, e quindi la specificità, no

VDJ riarrangiato si collega ad un gene C più a valle e il DNA frapposto viene eliminato

Regioni di scambio, 5’ di ciascun locus CH con sequenze ripetute altemente conservate

Linfocita B maturo: contemporanea espressione sulla membrana di IgM e IgD, mediante splicing alternativo e poliadenilazione selettiva

Linfocita B attivato: a seconda dello stimolo potrà produrre IgE, IgA o IgG

Occupazione di CD40Citochine

Lo switch isotipicoLo switch isotipico

Classi o isotipi delle IgClassi o isotipi delle Ig

2 classi (o isotipi), che si differenziano per la regione C-term della catena leggera: κ λ

Ogni molecola anticorpale possiede o 2κ o 2λCκ e Cλ sono omologhe tra loro e omologhe a Vκ e a Vλ

Non sono note differenze funzionali60% κ e 40% λ nell’uomo

Sito di legame per l’antigeneSito di legame per l’antigene

VHVL

Ag

Ab

VL+ VH

2 per ogni molecola di anticorpo

Legame all’antigeneLegame all’antigeneLa flessibilità degli anticorpi (grazie alla regione CERNIERA) permette il legame a porzioni di antigeni multivalenti distanti

Cerniera: ≈ 10/60+ a.a.La sequenza assume una conformazione casuale; la molecola fa una torsione tra CH1 E CH2La flessibilità è influenzata anche dalla capacità di VH di ruotare attorno a CH1

Legame all’antigeneLegame all’antigene

Legame reversibile e non covalenteIl contributo di ciascuna forza dipende dalla struttura del sito di legame e da quella del determinante antigenico

forza di legame tra un singolo sito combinatorio e un epitopo antigenico. Si esprime come costante di dissociazione (Kd). Tra 10-7 e 10-11 M.

AFFINITA’:

AVIDITA’: forza di legame complessiva tra Ag e Ab (aumento geometrico) (rilevante per IgM)

isotipi: Riconosciute da Ab anti-isotipo le immunoglobuline dello stesso isotipo di una specieallotipi: L’Ab riconosce in modo specifico solo alcune Ig dello stesso isotipo della stessa specie. Le differenze sono dovuti a diversi alleli per la regione C (polimorfismi)idiotipi: L’Ab riconosce in modo specifico la regione V dell’Ig

L’Ab come AgL’Ab come Ag