Fiziologija heterofermentativnog soja Leuconostoc

Fiziologija heterofermentativnog soja Leuconostocmesenteroides LMG 7954 pri različitim uvjetimauzgoja šaržnim postupkom u laboratorijskom mjerilu

Gruičić Ana-Marija

Masters thesis Diplomski rad

2019

Degree Grantor Ustanova koja je dodijelila akademski stručni stupanj University of Zagreb Faculty of Food Technology and Biotechnology Sveučilište u Zagrebu Prehrambeno-biotehnološki fakultet

Permanent link Trajna poveznica httpsurnnskhrurnnbnhr159615416

Rights Prava Attribution-NoDerivatives 40 International

Download date Datum preuzimanja 2022-02-04

Repository Repozitorij

Repository of the Faculty of Food Technology and Biotechnology

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

PREHRAMBENO-BIOTEHNOLOŠKI FAKULTET

DIPLOMSKI RAD

Zagreb rujan 2019 Ana-Marija Gruičić

1157BPI

Fiziologija heterofermentativnog soja

Leuconostoc mesenteroides LMG 7954

pri različitim uvjetima uzgoja

šarţnim postupkom u

laboratorijskom mjerilu

Rad je izraĎen u Laboratoriju za biokemijsko inţenjerstvo industrijsku mikrobiologiju

i tehnologiju piva i slada u Zavodu za biokemijsko inţenjerstvo Prehrambeno-biotehnološkog

fakulteta Sveučilišta u Zagrebu pod mentorstvom prof dr sc Anite Slavice

Zahvaljujem svojoj mentorici prof dr sc Aniti Slavici na danoj prilici i njenoj

bezrezervnoj pomoći podršci i vrijednim savjetima tijekom planiranja i izvoĎenja

eksperimenata te pisanja ovoga rada

Zahvaljujem prof dr sc Mladenu Brnčiću na iskazanom povjerenju prilikom

ustupanja opreme bez koje ne bi bilo moguće izraditi ovaj rad

Veliku zahvalu dugujem dr sc Mariji Duvnjak i doc dr sc Kristini Kljak Zavod za

hranidbu životinja Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu za ustupanje HPLC ureĎaja i

veliku pomoć tijekom razvoja HPLC metode čiji su rezultati od iznimne važnosti za ovaj rad

Zahvala ide i članovima Laboratorija za biokemijsko inženjerstvo industrijsku

mikrobiologiju i tehnologiju piva i slada Marini Vnučec i Ljiljani Blažević a posebice

članovima Laboratoriju za opću mikrobiologiju i mikrobiologiju namirnica Ivi Čanak Željku

Jakopoviću i Deniju Kostelcu za ustupanje opreme i pomoć pri izvedbi eksperimenata

Veliko hvala mojoj obitelji i prijateljima što su uvijek uz mene

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Diplomski rad

Sveučilište u Zagrebu

Prehrambeno-biotehnološki fakultet

Zavod za biokemijsko inţenjerstvo

Laboratorij za biokemijsko inţenjerstvo industrijsku mikrobiologiju i tehnologiju piva i slada

Znanstveno podrucje Biotehničke znanosti

Znanstveno polje Biotehnologija

Fiziologija heterofermentativnog soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 pri različitim

uvjetima uzgoja šarţnim postupkom u laboratorijskom mjerilu

Ana-Marija Gruičić 1157BPI

Saţetak U istraţivanjima u ovom radu utvrĎen je utjecaj koncentracije otopljenog kisika na rast soja

Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 u kemijski djelomično definiranoj podlozi (Vandamme i sur

1987) pri 28plusmn10degC i opadajućoj pH vrijednosti suspenzije tijekom uzgoja šarţnim postupkom u

laboratorijskom mjerilu Razvijena je i optimirana ionsko-izmjenjivačka HPLC metoda kojom je

popraćena aktivnost ovog soja u različitim uvjetima uzgoja šarţnim postupkom L mesenteroides

LMG 7954 uspješno raste u hranjivoj MRS podlozi kemijski djelomično definiranoj hranjivoj podlozi

kao i u smjesi visokog osmotskog tlaka saharozaglicerol Ovaj soj moţe transportirati i metabolizirati

glukozu saharozu (glukozu i fruktozu) i glicerol Glavni proizvodi metabolizma ovih ugljikohidrata i

alkohola su bakterijska biomasa i laktat te znatno manje koncentracije acetata i etanola U smjesi

saharozaglicerol ova Gram-pozitivna bakterija raste slijedeći eksponencijalni trend a zatim linearni

trend Ova vaţna fiziološka karakteristika kvalificira ovaj soj za industrijsku primjenu u podlogama s

visokim početnim koncentracijama supstrata Primjenom ultrazvuka i dodatkom Tween-a-80

permeabilizirane su stanice ovog soja i to tijekom njihova rasta u smjesi saharozaglicerol Obje

metode utječu na metabolizam supstrata u stanicama ove (navodno) mikroaerofilne

heterofermentativne bakterije mliječne kiseline kako je to utvrĎeno HPLC metodom Nadalje

identificiran je dodatni pik u kromatogramima koji ukazuje na mogućnost proizvodnje -

glukozilglicerola s pomoću ovog soja

Ključne riječi fiziologija α-glukozilglicerol HPLC Leuconostoc mesenteroides LMG 7954

permeabilizacija stanica

Rad sadrţi 71 stranicu 25 slika 20 tablica 47 literaturnih navoda 13 priloga

Jezik izvornika hrvatski

Rad je u tiskanom i elektroničkom (pdf format) obliku pohranjen u Knjiţnica Prehrambeno-

biotehnološkog fakulteta Kačićeva 23 Zagreb

Mentor profdrsc Anita Slavica

Stručno povjerenstvo za ocjenu i obranu

1 Prof dr sc Renata Teparić

2 Prof dr sc Anita Slavica

3 Prof dr sc Mladen Brnčić

4 Prof dr sc Blaţenka Kos (zamjena)

Datum obrane 30 rujna 2019

BASIC DOCUMENTATION CARD

Graduate Thesis

University of Zagreb

Faculty of Food Technology and Biotechnology

Department of Biochemical Engineering

Laboratory of Biochemical Engineering Industrial Microbiology and Malting and Brewing

Technology

Scientific area Biotechnical Sciences

Scientific field Biotechnology

Physiology of heterofermentative strain Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 under

different conditions of batch cultivation in the laboratory scale


Abstract In investigation described in this work effect of dissolved oxygen on the growth of strain

Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 in chemically semi-defined broth (Vandamme et al 1987)

was determined at 2810degC and decreasing pH value of suspension during batch cultivation in the

laboratory scale Ion-exchange HPLC method was developed and optimized in order to follow activity

of the strain under different conditions of the batch cultivation L mesenteroides LMG 7954 grew in

MRS broth the chemically semi-defined broth and sucroseglycerol mixture with high osmotic

pressure The strain is able to transport and metabolize glucose sucrose (glucose and fructose) and

glycerol The main end-products of metabolism of those carbohydrates and alcohol are bacterial

biomass and lactate while significantly lower concentration of acetate and ethanol were detected In

the sucroseglycerol mixture this Gram-positive bacterium grew first exponentially and then followed

linear trend This physiological characteristic can be very useful in industrial application of the strain

especially in the cultivations with high initial concentration of substrate(s) Cells of this strain were

permeabilized when growing in the sucroseglycerol mixture by using ultrasound treatment and

addition of Tween-80 Metabolism of the substrates in the cells of these (apparently) microaerophilic

heterofermenative lactic acid bacterium was affected by both methods as determined by HPLC

method Furthermore additional peak was identified within HPLC chromatograms which indicates

possibility for production of -glucosyglycerol by the strain

Keywords cell permeabilization α-glucosyglycerol HPLC Leuconostoc mesenteroides LMG 7954

physiology

Thesis contains 71 pages 25 figures 20 tables 47 references 13 supplements

Original in Croatian

Graduate Thesis in printed and electronic (pdf format) version is deposited in Library of the

Faculty of Food Technology and Biotechnology Kačićeva 23 Zagreb

Mentor PhD Anita Slavica Full Professor

Reviewers

1 PhD Renata Teparić Full Professor

2 PhD Anita Slavica Full Professor

3 PhD Mladen Brnčić Full Professor

4 PhD Blaţenka Kos Full Professor (substitute)

Thesis defended 30th September 2019

Sadrţaj stranica

1 UVOD 1

2 TEORIJSKI DIO 3

21 FIZIOLOGIJA VRSTA Leuconostoc mesenteroides 3

22 PROIZVODNJA -GLUKOZILGLICEROLA 4

23 SAHAROZA FOSFORILAZA 5

24 PERMEABILIZACIJA STANICA BAKTERIJA I NJIHOVA POTENCIJALNA UPOTREBA U

INDUSTRIJSKOJ PROIZVODNJI 7

241 Permeabilizacija bakterijskih stanica ultrazvukom 8

242 Permeabilizacija bakterijskih stanica kemijskim metodama 8

3 EKSPERIMENTALNI DIO 11

31 MATERIJALI 11

311 Radni mikroorganizam 11

312 Hranjive podloge za odrţavanje čuvanje i uzgoj bakterijske kulture 12

313 Kemikalije 12

314 UreĎaji 14

3141 Magnetska miješalica 14

3142 Centrifuga 14

3143 Spektrofotometar 15

3144 Ultrazvučna kupelj 15

3145 Sustav za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti (HPLC) 16

3146 Ostala oprema 16

32 METODE 17

321 Priprema inokuluma za uzgoj bakterijskog soja u laboratorijskom mjerilu 17

322 Priprema kemijski djelomično definirane hranjive podloge za uzgoj bakterijskog soja u

laboratorijskom mjerilu 18

323 Karakterizacija krivulje rasta i procjena specifične brzine rasta bakterijskog soja Leuconostoc

mesenteroides LMG 7954 pri mikroaerofilnim i aerobnim uvjetima uzgoja šarţnim postupkom u


324 Uzgoj bakterijskog soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 pri aerobnim uvjetima

permeabilizacija uzgojenih stanica i njihova fiziologija u smjesi saharozaglicerol 19

325 Permeabilizacija stanica bakterijskog soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 20

3251 Permeabilizacija stanica ultrazvučnom metodom 20

3252 Permeabilizacija stanica površinski aktivnim sredstvom - Tween-om-80 21

326 Razvoj metode za analizu izuzetih uzoraka tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti

(HPLC) 21

3261 Ionsko-izmjenjivačka tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti 22

327 Analitičke metode 22

3271 Praćenje rasta bakterijske biomase 22

3272 Ionsko-izmjenjivačka tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC) 23

32721 Priprema uzoraka za analizu 23

32722 Analiza prireĎenih uzoraka HPLC metodom 23

32723 Izrada baţdarnih dijagrama 24

328 Analiza eksperimentalno dobivenih podataka 26

3281 Procjena specifične brzine rasta bakterije Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 26

4 REZULTATI I RASPRAVA 27

41 KARAKTERIZACIJA KRIVULJE RASTA I PROCJENA SPECIFIČNE BRZINE RASTA

BAKTERIJSKOG SOJA Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 PRI MIKROAEROFILNIM I AEROBNIM

UVJETIMA UZGOJA ŠARŢNIM POSTUPKOM U LABORATORIJSKOM MJERILU 29

42 UZGOJ BAKTERIJSKOG SOJA Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 PRI AEROBNIM UVJETIMA

PERMEABILIZACIJA UZGOJENIH STANICA I NJIHOVA FIZIOLOGIJA U SMJESI

SAHAROZAGLICEROL 35


4211 Fiziologija soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 pri odabranim uvjetima 42


4221 Permeabilizacija stanica s 03 (volvol) Tween-a-80 48




5 ZAKLJUČCI 66

6 LITERATURA 68

7 PRILOZI 73

71 PROCJENA VRIJEDNOSTI ZA SPECIFIČNU BRZINU RASTA () BAKTERIJSKOG SOJA

Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 TIJEKOM UZGOJA U KEMIJSKI DJELOMIČNO DEFINIRANOJ

PODLOZI PRI RAZLIČITIM KONCENTRACIJAMA OTOPLJENOG KISIKA (MIKROAEROFILNI I

AEROBNI UVJETI UZGOJA ŠARŢNIM POSTUPKOM) 73

72 PROCJENA SPECIFIČNE BRZINA RASTA () BAKTERIJSKOG SOJA Leuconostoc mesenteroides

LMG 7954 TIJEKOM UZGOJA U (1) KEMIJSKI DJELOMIČNO DEFINIRANOJ HRANJIVOJ

PODLOZI I (2) REAKCIJSKOJ SMJESI SAHAROZAGLICEROL ndash KONTROLNI UZORAK 75


Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 TIJEKOM UZGOJA U (1) U KEMIJSKI DJELOMIČNO

DEFINIRANOJ HRANJIVOJ PODLOZI I (2) REAKCIJSKOJ SMJESI SAHAROZAGLICEROL

TIJEKOM TRETMANA ULTRAZVUKOM 76


LMG 7954 TIJEKOM UZGOJA U (1) U KEMIJSKI DJELOMIČNO DEFINIRANOJ HRANJIVOJ

PODLOZI I (2) REAKCIJSKOJ SMJESI SAHAROZAGLICEROL TIJEKOM TRETMANA TWEEN-OM-

80 (03 VOLVOL) 77

74 PROCJENJENA SPECIFIČNE BRZINA RASTA () BAKTERIJSKOG SOJA Leuconostoc

mesenteroides LMG 7954 TIJEKOM UZGOJA U (1) U KEMIJSKI DJELOMIČNO DEFINIRANOJ

HRANJIVOJ PODLOZI I (2) REAKCIJSKOJ SMJESI SAHAROZAGLICEROL TIJEKOM TRETMANA

TWEEN-OM-80 (05 VOLVOL) 78

75 BAŢDARNI DIJAGRAMI 79

Uvod

1

1 UVOD

Fiziologija soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 samo je u nekoliko detalja

opisana u literaturi (Holzapfel i sur 2009) S obzirom na dostupne podatke ovaj navodno

mikroaerofilni heterofermentativni soj bakterije mliječne kiseline iskazuje aktivnost saharoza

fosforilaze (EC 2417 Goedl i sur 2007 Goedl i sur 2008 Goedl i sur 2010a Goedl i

sur 2010b) Njegova primjena i to u obliku cjelovitih permeabiliziranih stanica takoĎer je

nepoznata u znanstvenoj literaturi Nedostaci ali i prednosti primjene peremabiliziranih

stanica L mesenteroides LMG 7954 mogu se samo predvidjeti (Vučenović 2018) ali ih je

potrebno eksperimentalno utvrditi najprije u laboratorijskom a zatim i u većem mjerilu

Stoga je ovaj diplomski rad imao nekoliko ciljeva

Ponajprije je bilo potrebno okarakterizirati krivulju rasta i procijeniti specifičnu brzinu

rasta () soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 i to pri mikroaerofilnim i aerobnim

uvjetima šarţnog uzgoja u prikladnoj hranjivoj podlozi u laboratorijskom mjerilu Na ovaj se

način utvrdilo postojanje i trajanje različitih faza rasta posebice eksponencijalne faze za koju

je karakterističan omjer ukupnih kataboličkih i anaboličkih reakcija Nadalje bilo je potrebno

utvrditi koje supstrate ovaj soj moţe transportirati i metabolizirati kao i krajnje proizvode

metabolizma transportiranih supstrata u odabranim uvjetima Ukratko bilo je potrebno dati

glavne fiziološke odrednice za ovaj bakterijski soj Karakterizacija utjecaja smjese saharoze i

glicerola pri njihovim visokim početnim koncentracijama (redom c = 08 mol L-1

i c = 20 mol

L-1

) na rast i aktivnost L mesenteroides LMG 7954 takoĎer je vaţan cilj ovog rada Na ovaj

bi se način utvrdila prikladnost ovog soja za primjenu u industrijskoj proizvodnji kada se

obično podrazumijeva primjena relativno visokih početnih koncentracija jednog ili više (tzv

jeftinih) izvora ugljika i energije Osim toga cilj ovog rada bio je permeabilizirati stanice L

mesenteroides LMG 7954 i to tako da ove stanice ostanu ţive i zadrţe svoju aktivnost ali i da

rastu u smjesi saharoze i glicerola koja ima relativno visoki osmotski tlak Zbog toga je bilo

potrebno testirati jednu relativno blagu fizikalnu metodu permeabilizacije bakterijskih stanica

kao i jednu relativno grubu kemijsku metodu za permeabilizaciju stanica ovog soja PredviĎen

je tretman za permeabilizaciju stanica poraslih do sredine eksponencijalne faze rasta i to

ultrazvukom i površinski aktivnom tvari Tween-80 Za ostvarivanje svih opisanih ciljeva

najvaţnije je bilo primijeniti brzu jednostavnu i učinkovitu metodu za analizu uzoraka Zbog

toga je kao jedan od najvaţnijih ciljeva ovog rada bio razviti i optimirati HPLC metodu

Uvod

2

kojom će se moći analizirati uzorci vrlo kompleksnog sastava i kojom će se kroz samo jednu

analizu utvrditi identitet i koncentracija supstrata i krajnjih proizvoda metabolizma

Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO

21 FIZIOLOGIJA VRSTA Leuconostoc mesenteroides

Prema putevima metabolizma ugljikohidrata kao glavnih izvora ugljika i energije

bakterije mliječne kiseline mogu se razvrstati u dvije glavne grupe - homofermentativne i

heterofermentativne bakterije mliječne kiseline Homofermentativni metabolizam

podrazumijeva konverziju jednog mola glukoze (heksoze) do dva mola mliječne kiseline i dva

mola ATP-a (Axelsson 2004) Kod heterofermentativnih bakterija mliječne kiseline ovaj je

molarni odnos supstrata i krajnjih proizvoda metabolizma drukčiji jer se iz jednog mola

glukoze pridobiva jedan mol mliječne kiseline jedan mol etanola ili acetata jedan mol CO2 i

jedan mol ATP-a Omjer proizvedenog etanola i acetata varira i ovisi o redukcijskom

potencijalu stanice bakterije mliječne kiseline koja je aktivna u odreĎenim uvjetima (John i

sur 2007)

Vrste Leuconostoc mesenteroides smatraju se fakultativno anaerobnim bakterijama

mliječne kiseline za koje je karakterističan heterofermentativni metabolizam ugljikohidrata

(Hayek i Ibrahim 2013) U usporedbi s velikom većinom preostalih rodova iz skupine

bakterija mliječne kiseline bakterije iz roda Leuconostoc postiţu veću specifičnu brzinu rasta

i potrošnju glukoze tijekom uzgoja pri aerobnim uvjetima nego pri anaerobnim ili

mikroearofilnim uvjetima uzgoj (Condon 1983) Smatra se da je razlog tomu što je pri

aerobnim uvjetima kisik dostupan u relativno visokim koncentracijama i tada se koristi kao

glavni krajnji akceptor elektrona Pri tome se pridobiva više metaboličke energije (ATP-a) i u

opisanim uvjetima pridobiva se dva mola (a ne uobičajenih jedan mol) ATP-a što je jedan od

najvaţnijih preduvjeta za anaboličke reakcije tj za veći prirast biomase u opisanim uvjetima

(Adams i Moss 2000) Pri aerobnim uvjetima uzgoja bakterije iz roda Leuconostoc

proizvode veće koncentracije acetata nego etanola jer je u ovim uvjetima okarakterizirana

veća aktivnosti specifične NADH-zavisne oksidaze kao i acetat kinaze nego pri smanjenim

koncentracijama kisika Nasuprot tomu pri aerobnim uvjetima aktivnost fosfat-

acetiltransferaze i alkohol dehidrogenaze manje su nego pri mikroaerofilnim uvjetima (Cogan

i Jordan 1993) Kao i pripadnici drugih rodova koji se svrstavaju u grupu bakterija mliječne

kiseline smatra se da bakterije iz roda Leuconostoc ne mogu provoditi reakcije citratnog

ciklusa i nemaju sustav citokroma Dakle ove bakterije ne mogu regenerirati reducirane

Teorijski dio

4

koenzime u reakcijama oksidativne fosforilacije u kojima se takoĎer pridobiva metabolička

energija Zbog toga bakterije iz ove grupe pa tako i bakterije iz roda Leuconostoc

metaboličku energiju pridobivaju fosforilacijom na nivou supstrata i to tijekom fermentacije

ugljikohidrata i proizvodnje krajnjih proizvoda metabolizma ugljikohidrata - laktata etanola

iili acetata i CO2

Nadalje smatra se da bakterije iz roda Leuconostoc ne mogu sintetizirati aldolazu pa

sukladno tomu ne mogu provoditi sve reakcije glikolize Zbog toga se u stanicama bakterija iz

ovog roda glukoza razgraĎuje drugim metaboličkim putevima Tako obično razgradnja

glukoze započinje oksidacijom i dekarboksilacijom ove heksoze do ksiluloza-5-fosfata

Nastali meĎuspoj se u reakciji koju katalizira fosfoketolaza prevodi u gliceraldehid-3-fosfat i

acetil-fosfat Iz nastalog trioza-fosfata (gliceraldehid-3-fosfat) moţe se reakcijama glikolize

proizvesti laktat dok se acetil-fosfat moţe razgraditi do acetata iili etanola Ukoliko bakterija

iz roda Leuconostoc kao supstrat koristi pentoze najprije se ovi supstrati izomeriziraju i

fosforiliraju u ksilulozu-5-fosfat nakon čega slijedi niz reakcija koji je istovjetan reakcijama

razgradnje heksoza (Gaspar i sur 2013) tj pentoze se razgraĎuju do laktata etanola iili

acetata i ugljikovog dioksida kako je već prije ovdje gore opisano

22 PROIZVODNJA -GLUKOZILGLICEROLA

Vrste iz roda Leuconostoc mogu sintetizirati saharoza fosforilazu (EC 2417) Ovaj

enzim katalizira pregradnju saharoze u četverostranoj reakciji u kojoj izmeĎu ostalih krajnjih

proizvoda moţe nastati i -glukozilglicerol Ovaj visokovrijedni spoj pribraja se u skupinu

osmolita koji su zasebna skupina organskih spojeva glukozidne strukture a njihovom

proizvodnjom ili transportom izvana stanice se štite od visokog osmotskog tlaka ekstremnih

temperatura i drugih oblika stresnih uvjeta (Goedl i sur 2008) Razlog njihove zaštitne uloge

je u njihovoj fiziološkoj učinkovitosti reguliraju ravnoteţu vode u stanici štite proteine od

denaturacije i stabiliziraju supramolekularne biološke strukture kao što su lipidne membrane

(Lentzen i sur 2006 Santos i sur 2007 Goedl i sur 2008)

Dodavanjem osmolita kao vanjskih stabilizatora proteinima u otopini smanjuje se

potreba za modifikacijom samih proteina i to u smislu povećanja raspona ključnih parametara

u okviru kojih zadrţavaju svoju poţeljnu enzimsku aktivnost i nativni oblik (Polizzi i sur

2007) Izuzetno je veliki potencijal stabilizirajućeg djelovanja -glukozilglicerola na proteine

Teorijski dio

5

u (koloidnim) otopinama kao što je to stanica ali i na membrane stanice Osim toga istraţene

su i mogućnosti primjene ovog spoja u terapeutske svrhe (Colombo i sur 2000 Nitta i sur

2007)

Glikozolirani šećerni alkoholi i njihovi derivati koji se upotrebljavaju kao

niskokalorijski zaslaĎivači dokazani su inhibitori nastanka zubnog plaka (Havukkala 1991)

TakoĎer glukozilirani oligosaharidi iskazuju inhibitorno djelovanje prema aktivnosti α-

amilaze i α-glukozidaze što zapravo upućuje na moguću primjenu ovih spojeva u terapeutske

svrhe pri regulaciji koncentracije glukoze u krvi (Yoon i Robyt 2003)

Primjena -glukozilglicerola već je uvrijeţena u kozmetičkoj industriji u kojoj se

primjenjuje prvenstveno kao visokoučinkoviti hidratizirajući spoj Smatra se da ovaj spoj

pospješuje hidrataciju tretirane koţe u većoj mjeri od tradicionalno primjenjivanog i

prihvaćenog glicerola (Goedl i sur 2010a Schrader i sur 2012) Zbog opisane primjene

enzimski katalizirana proizvodnja -glukozilglicerola dobro je okarakteriziran i industrijski

primijenjen postupak tvrtke bdquobitop AGldquo Ovako proizveden -glukozilglicerol prepoznat je

pod komercijalnim imenom Glycoinreg i opisan kao jedan od aktivnih sastojka kozmetičkih

preparata dostupnih na trţištu (Jan Dekker International 2009)

23 SAHAROZA FOSFORILAZA

Saharoza fosforilaza (EC 2417) izolirana je i okarakterizirana iz relativno malog

broja bakterija kao što su Bifidobacterium adolescentis (van den Broek i sur 2004)

Leuconostoc mesenteroides (Goedl i sur 2007 Kawasaki i sur 1996 Koga i sur 1991 Lee

i sur 2006) Pseudomonas saccharophila (Silverstein i sur 1967 Weimberg i Doudoroff

1954 Tsai i sur 1980) i Streptococcus mutans (Russell i sur 1988 Robeson i sur 1983

Ferretti i sur 1988) Primarnu strukturu ovog enzima čini 500 aminokiselina Njegova

kvarterna struktura kako je to opisano u znanstvenoj literaturi moţe ali i ne mora biti

formirana Ovisno o vrsti mikroorganizma iz kojeg se ovaj enzim izolira saharoza fosforilaza

moţe biti funkcionalni monomer ili dimer Eksperimentalno je utvrĎeno da aktivnost ovoga

enzima nije ovisna o odreĎenom kofaktoru ili ko-supstratu te da iskazuje visoku

regiospecifičnost (Goedl i sur 2007) Prema podacima iz literature najveća koncentracija

Teorijski dio

6

saharoza fosforilaze u stanicama vrsta Leuconostoc mesenteroides postiţe se oko polovice

eksponencijalne faze rasta (Vandamme i sur1987)

Tri su moguće reakcije koje katalizira ovaj enzim (i) prijenos glukozila s donora (npr

saharoze) na fosfat u reakcijama sinteze ili fosforolize koja se odvija u prisutnosti

anorganskog fosfata zatim (ii) hidroliza donora glukozila (npr saharoze na glukozu i

fruktozu) i (iii) transglukozilacija u kojoj se glukoza od donora prenosi na akceptor npr

glicerol (Goedl i sur 2010b) Eksperimentalno je utvrĎeno da su u reakcijama

transglukozilacije ponajbolji donori supstrata (glukozila) saharoza glukoza-1-fosfat i D-

glukopiranozil-1-fluorid dok je spektar mogućih akceptora glukozila vrlo širok (Mieyal i sur

1972 Goedl i sur 2008) Glicerol D-ksilitol i L-arabitol ističu se kao akceptori glukozila s

visokim glukozilacijskim potencijalom dok se u akceptore sa zadovoljavajućim

glukozilacijskim potencijalom mogu pribrojiti L-sorboza D-ksiluloza i L-ribuloza Reakcija

glukozilacije glicerola (ili nekog drugog akceptora glukozila) koju katalizira saharoza

fosforilaza odvija se kroz dva koraka (Slika 1)

Slika 1 Shematski prikaz reakcije koju katalizira saharoza fosforilaza u kojoj je saharoza

donor glukozila a glicerol akceptor glukozila (prilagoĎeno iz Goedl i sur 2010)

U prvom koraku dolazi do hidrolize donora glukozilne skupine (npr saharoze) i

formira se kompleks β-glukozil-enzim Ovaj prijelazni kompleks se raspada jer nakon toga

slijedi prijenos glukozilne grupe iz kompleksa β-glukozil-enzim na akceptor što je u ovom

slučaju 2-OH skupina glicerola (Slika 1) Kompetitivna reakcija opisanom prijenosu

glukozilne skupine s kompleksa β-glukozil-enzim na akceptor jest hidroliza donora glikozila

(saharoze) na glukozu (i fruktozu) i slobodan enzim Ova kompetitivna reakcija moţe bitno

Teorijski dio

7

umanjiti uspješnost reakcije transglukozilacije - reakcije koju se ţeli provesti ukoliko se ţeli

proizvesti industrijski interesantan -glukozilglicerol (Goedl i sur 2010)

Literaturni podaci ukazuju na mogućnost učinkovite proizvodnje -glukozilglicerola u

opisanoj reakciji s visokim prinosima (85) ukoliko se u reakcijskoj smjesi u kojoj reakciju

katalizira saharoza fosforilaza koriste relativno visoke koncentracije donora i akceptora

glikozila - saharoze od 08 mol L-1

a glicerola od 20 mol L-1

MeĎutim kod integriranih

postupaka proizvodnje -glukozilglicerola u kojima se biokataliza integrira s postupcima

izolacije i pročišćavanja ovog proizvoda (tzv down stream procesi) uputno je smanjiti krajnji

prinos proizvoda s 85 do 72 radi smanjenja koncentracije glicerola koji pri kraju reakcije

koju katalizira sharoza fosforilaza ostaje neglikoliziran U tom slučaju preporuča se

provoĎenje ove enzimski katalizirane transglukozilacije uz početnu koncentraciju glicerola od

10 mol L-1

dok bi koncentracija saharoze u ovoj reakcijskoj smjesi trebala ostati 08 mol L-1

(Goedl i sur 2010)

24 PERMEABILIZACIJA STANICA BAKTERIJA I NJIHOVA POTENCIJALNA

UPOTREBA U INDUSTRIJSKOJ PROIZVODNJI

Upotreba cjelovitih stanica kao biokatalizatora ima niz prednosti pred upotrebom

različitih enzimskih pripravaka i to iz ovih razloga (1) izolacija i pročišćavanje enzima

saharoza fosforilaze kao i drugih enzima koji se koriste u biotehnološkoj industriji skup je i

dugotrajan niz postupaka (2) nema potrebe za regeneracijom kofaktora koja se odvija u

stanici tijekom odvijanja metabolizma kao u slučaju saharoza fosforilaze i (3) stabilnost

enzima u stanici veća je od stabilnosti pročišćenog enzima u otopini Unatoč pobrojenim i

ekonomski vaţnim prednostima primjena permeabiliziranih stanica bakterija uglavnom

izostaje u biotehnološkoj industrijskoj proizvodnji zbog niza ograničavajućih čimbenika Kod

enzimski kataliziranih reakcija koje se odvijaju u citoplazmi permeabiliziranih bakterijskih

stanica oteţan je prijenos mase (supstrata u citoplazmu i proizvoda iz citoplazme u

vanstanični prostor) zbog barijera - stanične stijenke i membrane Primjenom prikladnih

metoda za permeabilizaciju stanica kojima se neće bitnije narušiti struktura stanice bakterije i

tako uzrokovati gubitak staničnog integriteta moguće je povećati učinkovitost procesa u

kojima se kao biokatalizatori koriste permeabilizirane stanice bakterija Na raspolaganju su

Teorijski dio

8

raziličite metode za permeabilizaciju stanica - fizikalne i kemijske metode kao i metode

genetičkog inţenjerstva (Zhao i sur 2014)

241 Permeabilizacija bakterijskih stanica ultrazvukom

Primjena ultrazvuka prvotno je okarakterizirana kao metoda dezintegracije stanica

Gram-negativnih bakterija MeĎutim daljnja istraţivanja ove fizikalne metode ukazala su na

mogućnost primjene ultrazvuka kao načina permeabilizacije bakterijskih stanica ali i način

poboljšanja rasta Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija Konvekcijski prijenos tvari

otopljenih u okolini stanice (supstrata) u tzv stagnantnom sloju tekućine i pojava tzv

mikrostrujanja tekućine (pa tako i tvari otopljenih u tekućini) uslijed pojave kavitacijskih

mjehurića (Nyborg 2001) mehanizam je kojim se pojašnjava pozitivan učinak ultrazvuka na

aktivnost stanica Mikrostrujanje je posljedica koja se javlja pri naizmjeničnim ciklusima

niskog i visokog tlaka kada dolazi do naizmjenične ekspanzije i smanjenja mjehurića plina u

otopini

Bitno je naglasiti da je za potrebe permeabilizacije stanica bakterija vaţno postići

uvjete stabilne kavitacije kada se mjehurići plina u otopini tj suspenziji neće smanjiti do

veličine koja vodi ka njihovoj imploziji (Pitt i Ross 2003) Dakle potrebno je primijeniti

ultrazvuk niskog intenziteta kako su to u svom radu opisali Runyan i suradnici koji su 2006

proveli istraţivanje o povećanju permeabilnosti vanjske membrane bakterije Pseudomonas

aeruginosa uz podešavanje temperature i frekvencije ultrazvuka redom pri 37degC i 70 kHz

Dostupna su i istraţivanja provedena s Gram-negativnom bakterijom Escherichia coli i Gram-

pozitivnoj bakteriji Lactobacillus rhamnosus Dobiveni rezultati upujuću na formiranje

prijelaznih proširenja u membrani bakterijskih stanica a koji su reverzibilno uzrokovani

primjenom ultrazvuka niskog intenziteta (Ananta i sur 2005)

242 Permeabilizacija bakterijskih stanica kemijskim metodama

Upotreba organskih otapala kao permeabilizacijskog sredstva nosi epitet jedne od

najučinkovitijih metoda za permeabilizaciju bakterijskih stanica Glavni razlog tomu su

jednostavnost izvedbe postupka i relativno niski troškovi koje iziskuje ova metoda (Choi i

Teorijski dio

9

sur 2004) Mehanizam povećanja permeabilnosti vanjske stanične membrane objašnjava se

promjenama u njezinoj strukturi uslijed dolaska u kontakt s molekulama organskog otapala

Kao posljedica opisanog mehanizma dolazi do preraspodjele (bdquoispadanjaldquo) fosfolipida iz

membrane (engl falling out lipids Felix 1982 Richard i sur 2000) Od organskih se otapala

najčešće za permeabilizaciju stanica koriste toluen kloroform etanol dietil-eter i dimetil-

sulfoksid (Flores i sur 1994 Drishnan i sur 2000) Iako se ova metoda permeabilizacije

smatra jednom od najučinkovitijih metoda ima bitan nedostatak a to je gubitak vijabilnosti

stanica (Choi i sur 2004) Ova se metoda smatra učinkovitom kod Gram-pozitivnih i Gram-

negativnih bakterija

Krishnan i suradnici su 2000 uspješno permeabilizirali stanice bakterije Lactobacillus

plantarum i to dodatkom 1 (volvol) dietil-etera a u istom su se istraţivanju po ovaj

mikroorganizam učinkovitima pokazali primjene toluena i etanola Permeabilizacijom stanica

bakterije Ochrobactrum anthropi bavili su se Choi i suradnici 2004 i na temelju rezultata

provedenih istraţivanja zaključili da primjena kloroforma (05 volvol) i toluena (20

volvol) pripada meĎu učinkovitije metode permeabilizacije stanica biokatalizatora

Dosutupna su i istraţivanja koja ističu primjenu mliječne kiseline kao sasvim

zadovoljavajućeg permeabilizacijskog sredstva kod stanica Gram-negativnih bakterija Time

su se 2000 pozabavili Alakomi i suradnici i dokazali da se primjenom mliječne kiseline u

koncentraciji od 50 mmol L-1

mogu uspješno permeabilizirati stanice bakterija Escherichia

coli Pseudomonas aeruginosa i Salmonella enterica

Još jedna učinkovita i primijenjena metoda permeabilizacije bakterijskih stanica jest

upotreba površinski aktivnih tvari odnosno surfaktanata Slično kao i organska otapala

površinski aktivne tvari permeabiliziraju membranu bakterijskih stanica tako da ostvaruju

interakcije s molekulama membrane Površinski aktivna sredstva jednostavnija su i sigurnija

za upotrebu od organskih otapala (Cortez i Roberto 2012) Tip surfaktanta koji treba

upotrijebiti i njegova koncentracija ovise o sastavu stanične membrane Primjerice saponin

ostvaruje interakcije s kolesterolom membrane i neće biti učinkovito sredstvo za

permeabilizaciju membrana koje imaju nizak udio kolesterola (Jamur i Oliver 2009)

Surfaktanti stupaju u reakciju s proteinima stanične membrane imitirajući okolinu

fosfolipidnog dvosloja Kationski surfaktanti mogu s proteinima ostvariti elektrostatske i

hidrofobne interakcije dok su neionske površinski aktivne tvari kao što su Triton X-100

Tween-20 i Tween-80 ograničeni samo na primjenu kod hidrofobnih membrana U većinskoj

su upotrebi upravo neionski surfaktanti budući da u zadovoljavajućoj mjeri ometaju

Teorijski dio

10

interakcije lipid-lipid i lipid-protein a ne konkuriraju interakcijama protein-protein kako je to

slučaj kod kationskih surfaktanata (Cortez i Roberto 2012)

Brojna istraţivanja pokazala su da je upotreba površinski aktivnih sredstava učinkovita

za permeabilizaciju membrana Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija Van den Werf i

suradnici još su 1994 dokazali da se proizvodnja D-malata pomoću bakterije Pseudomonas

pseudoalcaligenes odvija uz značajno bolji prinos u prisustvu 05 (volvol) Tritona X-100

Canovas i suradnici posvetili su 2005 paţnju proučavanju utjecaja Tritona X-100 Tweena-20

i Tweena-80 na proizvodnju L-karnitina s pomoću Gram-negativne bakterije Escherichia coli

i došli do zaključka o zamjetnom povećanju prinosa nakon dodatka 20 (volvol) bilo koja

od tri navedena surfaktanta

Tween-80 sadrţi oleinsku kiselinu koja potiče rast stanica i metaboličku aktivnost

bakterija mliječne kisline Tako dodana oleinska kiselina moţe se ugraditi u staničnu

membranu i konvertirati u ciklopropansku masnu kiselinu za koju se smatra da povećava

fluidnost membrane Ovo je mehanizam na kojem se zasniva permeabilizacijski učinak

Tweeena-80 i pozitivan učinak na rast bakterija mliječne kiselina kod primjene ovog

površinski aktivnog sredstva (Hayek i Ibrahim 2013)

Eksperimentalni dio

11

3 EKSPERIMENTALNI DIO

31 MATERIJALI

311 Radni mikroorganizam

U eksperimentima opisanim u ovom radu korištena je bakterija Leuconostoc

mesenteriodes LMG 7954 iz Zbirke mikroorganizama Zavoda za biokemijsko inţenjerstvo

Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu

Slika 2 Mikroskopska slika bakterije Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 obojene po

Gramu Preparat je promatran pod imerzijskim objektivom svjetlosnog mikroskopa Olympus

CH20 (Olympus Tokyo Japan) pri povećanju od tisuću puta

Eksperimentalni dio

12

312 Hranjive podloge za odrţavanje čuvanje i uzgoj bakterijske kulture

Čista kultura bakterijskog soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 odrţava se

čuva i uzgaja u hranjivoj De Man Rogosa i Sharpe (MRS) podlozi (De Man i sur 1960)

Sastav hranjive MRS podloge je prikazan u Tablici 5 Za uzgoj ovoga soja u laboratorijskom

mjerilu korištena je kemijski djelomično definirana hranjiva podloga u kojoj je saharoza

glavni izvor ugljika i energije (Vandamme i sur 1987) Sastav ove hranjive podloge prikazan

je u Tablici 6

313 Kemikalije

Tablica 1 Porijeklo i čistoća kemikalija potrebnih za pripremu kemijski djelomično

definirane podloge za uzgoj bakterijskog soja

kemikalija kemijska

formula čistoća proizvoĎač

saharoza C12H22O11 pa Gram-mol Hrvatska

kvaščev ekstrakt - za upotrebu u

biotehnologiji Liofilchem Italija

kalijev dihidrogen fosfat KH2PO4 tehnički Kemika Hrvatska

magnezijev sulfat heptahidrat MgSO4 7H2O pa Kemika Hrvatska

manganov sulfat monohidrat MnSO4 H2O pa Merck Njemačka

ţeljezov sulfat heptahidrat FeSO4 7H2O pa Kemika Hrvatska

tiamin-hidroklorid C12H18Cl2N4OS pa Merck Njemačka

natrijev L-askorbat C6H2NaO6 pa Merck Njemačka

Eksperimentalni dio

13

Tablica 2 Porijeklo i čistoća kemikalija potrebnih za pripremu reakcijske smjese za sintezu

α-glukozilglicerola

kemikalija kemijska formula čistoća proizvoĎač


glicerol C3H8O3 pa Kemika Hrvatska

natrijev hidroksid NaOH pa Kemika Hrvatska

Tablica 3 Porijeklo i čistoća kemikalija potrebnih za pripremu uzoraka i za analizu

pripremljenih uzoraka tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (engl High

Pressure Liquid Chromatography HPLC)

kemikalija kemijska


cinkov sulfat heptahidrat ZnSO4 middot 5 H2O pa Merck Njemačka

sumporna kiselina H2SO4 pa za HPLC Fluka Njemačka

Tablica 4 Porijeklo i čistoća preostale kemikalije koja je korištena u eksperimentima

kemikalija kemijska


polisorbat (Tween-80) C64H124O26 pa Merck Njemačka

Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji

3141 Magnetska miješalica

Slika 3 Magnetska miješalica Cimarec and Poly (Multipoint Stirrer Thermo Fischer

Scientific Waltham Massachusetts SAD) na kojoj je uzgajan bakterijski soj u kemijski

djelomično definiranoj hranjivoj podlozi u Erlenmeyerovim tikvicama od 100 mL pri brzini

okretaja magnetića od 250 rpm

3142 Centrifuga

Slika 4 Centrifuga Centric 150 (Tehtnica Ţelezniki Slovenija) za izdvajanje supernatanta od

biomase bakterijskog soja iz uzoraka izdvojenih tijekom uzgoja L mesenteroides LMG 7954

kao i za izdvajanje supernatanta od taloga tijekom pripreme uzoraka za analizu HPLC

metodom Izuzeti uzorci centrifugirani su kroz 5 min pri 13 000 g Izdvojeni supernatant

spremljen je pri -20degC do analize HPLC metodom

Eksperimentalni dio

15

3143 Spektrofotometar

Slika 5 Spektrofotometar Helios Epsilon (Thermo Fischer ScientificWaltham

Massachusetts SAD) koji je korišten za odreĎivanje optičke gustoće suspenzije (OD) pri

valnoj duljini svjetlosti () od 608 nm

3144 Ultrazvučna kupelj

Slika 6 Ultrazvučna kupelj Elmasonic P 300 H (Elma Singen Njemačka) Ova je

ultrazvučna kupelj korištena u eksperimentima onako kako je to opisano u poglavlju 3251

Eksperimentalni dio

16

3145 Sustav za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti (HPLC)

Slika 7 Sustav za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti (HPLC)

HPLC sustav SpectraSystem (Thermo Separation Products Inc Waltham SAD)

sastoji se od kvaterne gradijentne pumpe (P4000) sustava za otplinjavanje (SCM 1000)

automatskog sustava za injektiranje uzoraka i grijača kolone (AS3000) te UVVis (UV2000)

fluorescencijskog (FL3000) i refraktometrijskog (RI-150) detektora Podaci se prikupljaju i

obraĎuju ChromQuest 50 softwareom (Thermo Fisher Scientific Waltham SAD)

3146 Ostala oprema

o termostat (ST-05 Instrumentaria Zagreb Hrvatska)

o ultrazvučna kupelj za pripremu (degaziranje) mobilne faze Sonorex TK 52

(BANDELIN electronic GmbH amp Co KG Berlin Njemačka vrijeme otplinjavanja

dva puta kroz 15 min pri frekvenciji od 35KHz)

o analitička vaga Shimadzu (Shimatzu Kyoto Japan)

o autoklav Sutjeska (Jugoslavija)

o svjetlosni mikroskop Olympus CH20 (Olympus Tokyo Japan)

o filteri veličine pora 020 μm (LLG-Syringe filters nylon 02 μm Sigma-Aldrich St

Louis SAD)

o standardni laboratorijski pribor

o osobno računalo (operativni sustav MS Windows 7 Home MS Office 2010)

Eksperimentalni dio

17

32 METODE

321 Priprema inokuluma za uzgoj bakterijskog soja u laboratorijskom mjerilu

Čista kultura soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 nacijepljena je u epruvetu sa

sterilnom ohlaĎenom hranjivom MRS podlogom (V = 80-100 mL sastav podloge je

prikazan u Tablici 5) i ovako prireĎena suspenzija je inkubirana kroz narednih 12 sati u

termostatu pri temperaturi od 28degC

Tablica 5 Sastav MRS podloge za odrţavanje čuvanje i uzgoj bakterijskog soja

sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100

kvaščev ekstrakt 50

D-glukoza 200

Tween 80 10

kalijev hidrogenfosfat 20

natrijev acetat trihidrat 050

triamonijev citrat 20

magnezijev sulfat heptahidrat 02

manganov sulfat monohidrat 0050

Eksperimentalni dio

18



Sastojci prikazani u Tablici 6 u odjeljku A odvagani su i otopljeni u odgovarajućem

volumenu demineralizirane vode kako bi njihova konačna koncentracija odgovarala

koncentraciji prikazanoj u Tablici 6 Ovako prireĎena otopina sterilizirana je u autoklavu kroz

20 minuta pri 121degC

Svjeţa otopina pripremljena je od sastojaka iz odijeljka B u Tablici 6 i sterilizirana

filtracijom (filteri veličine pora 020 μm LLG-Syringe filters nylon 02 μm Sigma-Aldrich

St Louis Missouri SAD)

Nakon hlaĎenja sterilne otopine A otopine A i B su pomiješane kako bi se postigle

koncentracije svih sastojaka kako je to opisano u radu Vandamme i sur (1987)

Tablica 6 Sastav kemijski djelomično definirane podloge za uzgoj bakterijskog soja

sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000


kalijev dihidrogenfosfat 100

odjeljak B



ţeljezov sulfat heptahidrat 001

tiamin-hidroklorid 001

natrijev L-askorbat 005

Eksperimentalni dio

19

323 Karakterizacija krivulje rasta i procjena specifične brzine rasta bakterijskog soja

Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 pri mikroaerofilnim i aerobnim uvjetima uzgoja

šarţnim postupkom u laboratorijskom mjerilu

U 100 mL kemijski djelomično definirane hranjive podloge u Erlenmeyerovim

tikvicama (300 mL) nacijepljen je svjeţe uzgojen inokulum (50 mL inokuluma udjel

inokuluma 5 volvol) Uzgoji su provedeni pri mikroaerofilnim uvjetima (bez miješanja) i

aerobnim uvjetima (na magnetskoj mješalici pri brzini okretaja magnetića od 250 rpm) u

termostatu pri temperaturi od 28010degC Porast bakterijske biomase praćen je izdvajanjem

uzoraka u aseptičnim uvjetima u pravilnim vremenskim intervalima i odreĎivanjem optičke

gustoće (OD608) ovako izuzetih uzoraka kako je to prikazano u poglavlju Rezultati U

izuzetim uzorcima praćena je i promjena pH vrijednosti suspenzije koja je prema potrebi

podešavana dodatkom otopine NaOH (c = 10 mol L-1

) i odrţavana u rasponu vrijednosti

izmeĎu 40 i 50 pH jedinica


permeabilizacija uzgojenih stanica i njihova fiziologija u smjesi saharozaglicerol

Bakterijski soj Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 najprije je uzgojen u kemijski

djelomično definiranoj hranjivoj podlozi kako je to opisano u poglavlju 323 i to do t = 40

h uzgoja pri istovjetnim uvjetima kako je to učinjeno prilikom karakterizacije krivulje rasta i

procjene specifične brzine rasta ovog soja Nakon toga uzgojena suspenzija u aseptičnim

uvjetima je prebačena u smjesu saharozaglicerol Ova smjesa sadrţavala je sastojke u

koncentracijama prikazanim u Tablici 7

Eksperimentalni dio

20

Tablica 7 Koncentracija saharoze i glicerola u reakcijskoj smjesi

sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20

Reakcijska smjesa ukupnog volumena 50 mL pripremljena je izuzimanjem alikvota

bakterijske suspenzije i dodavanjam odgovarajućih volumena sterilnih i ohlaĎenih otopina

saharoze i glicerola U ovako prireĎenoj reakcijskoj smjesi praćen je daljnji rast bakterijskog

soja u odabranim uvjetima (nakon t = 40 h) kako je to prikazano u poglavlju Rezultati

Ovako provedeni uzgoji nanovo su prireĎeni kao kontrolni uzorci za eksperimente u kojima

su stanice bakterijskog soja permeabilizirane dvjema odabranim metodama (poglavlja 3251

i 3252)

325 Permeabilizacija stanica bakterijskog soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954

3251 Permeabilizacija stanica ultrazvučnom metodom

Reakcijska smjesa koja je prireĎena u aseptičnim uvjetima od (i) svjeţe uzgojene

suspenzije stanica ovog bakterijskog soja u kemijski djelomično definiranoj hranjivoj podlozi

(t = 00-40 h) (ii) otopine saharoze i (iii) otopine glicerola kako je to opisano u poglavlju

324 povrgnuta je tretmanu ultrazvukom u ultrazvučnoj kupelji (poglavlje 3144)

PrireĎena reakcijska smjesa tretirana je konstantno kroz 40 h pri temperaturi vode u kupelji

35degC frekvenciji valova od 37 kHz i snazi ultrazvuka od 90 W Nakon ukupno 40 h tretmana

ultrazvukom reakcijska smjesa je preko noći vraćena na magnetsku miješalicu (pH 40-50

28010degC 250 rpm) a naredno jutro opet tretirana u ultrazvučnoj kupelji (35degC 37 kHz 90

W) kroz ukupno 25 h Eksperiment je ukupno trajao 258 h

Eksperimentalni dio

21

3252 Permeabilizacija stanica površinski aktivnim sredstvom - Tween-om-80

Osim fizikalne metode permeabilizacije stanica ove Gram-pozitivne bakterije

(poglavlje 3251) eksperimentalno je utvrĎen utjecaj kemijske metode - dodatka površinski

aktivne tvari (Tween-80) na stanice bakterijskog soja L mesenteroides LMG 7954

Nakon uzgoja bakterijskog soja i prireĎivanja smjese saharozaglicerol prireĎena je

reakcijska smjesa koja se sastojala od (i) suspenzije bakterijskih stanica (ii) saharoze (iii)

glicerola (vidi poglavlje 3251) i (iv) Tween-a-80 Odabrane su dvije koncentracije Tween-

a-80 - 03 (volvol) i 05 (volvol) Utjecaj Tween-a-80 praćen je kroz narednih 200 h

uzgoja bakterijskog soja na magnetskoj miješalici (pH 40-50 28010degC 250 rpm)

Reakcijska smjesa je preko noći ostavljena na magnetskoj miješalici te je kroz naredni dan

nastavljeno praćenje utjecaja površinski aktivne tvari na fiziologiju stanica ovog soja u

odabranim uvjetima Eksperiment je ukupno trajao 240 h od čega su bakterijske stanice bile

izloţene Tweenu-80 konstantno kroz ukupno 200 h (nakon t = 40 h)

326 Razvoj metode za analizu izuzetih uzoraka tekućinskom kromatografijom visoke

učinkovitosti (HPLC)

U okviru ovog istraţivanja optimirana je HPLC metoda kojom se kroz samo jednu

analizu postigla identifikacija i odreĎivanje koncentracije svih sastojaka supernatanata

izuzetih i prireĎenih uzoraka Ovdje je prije svega bilo potrebno (a) odrediti koncentraciju

saharoze tj glukoze i fruktoze u vanstaničnom prostoru zatim (b) potrošnju ovih triju izvora

ugljika i energije (saharoze glukoze i fruktoze) ali i fruktoze kao potencijalnog akceptora

elektrona tijekom rasta L mesenteroides LMG 7954 u odabranim uvjetima kao i (c)

koncentraciju krajnjih proizvoda metabolizma (laktata acetata i etanola) u vanstaničnom

prostoru ovog heterofermentativnog soja Osim toga predviĎena je aktivnost saharoza

fosforilaze pa smo ovom HPLC metodom planirali identificirati dodatni pik u

kromatogramima uzoraka kod kojih je eventualno došlo do reakcije sinteze -

glukozilglicerola Kako standard za ovaj spoj nije komercijalno dostupan u ovom radu smo se

oslonili na vrijeme zadrţavanja (ili retencijsko vrijeme tR min) ovog spoja s ukupno devet

ugljikovih atoma koji bi se trebao eluirati s ionsko-izmjenjivačke kolone nakon saharoze

Eksperimentalni dio

22

(spoj sa dvanaest ugljikovih atoma) i prije glukoze (spoj sa šest ugljikovih atoma) U svim

kontrolnim uzorcima istraţena je mogućnost pojave ovog pika i sličan pik sa istovjetnim

vremenom zadrţavanja i bilo kakvog intenziteta većeg od bazne linije nije zamijećen

Tijekom razvoja HPLC metode istraţen je utjecaj brzine protoka mobilne faze (F =

01-06 mL min-1

) temperature grijača kolone (35deg-50degC) i tlaka u analitičkoj koloni koji je

odrţavan ispod 700 bar Glavni kriterij pri odabiru kombinacije protoka mobilne faze

temperature grijača kolone i tlaka u analitičkoj koloni je bio odvajanje pikova na baznoj liniji

i simetričan oblik pikova od kojih se svaki eluirao unutar vremena od maksimalno 10 min

3261 Ionsko-izmjenjivačka tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti

U ovom istraţivanju korištena je ionsko-izmjenjivačka kolona MetaCarb 87H (Agilent

Technologies Santa Clara California SAD) dimenzija 078 30 cm s kationskim punilom sa

H+ ionima Mobila faza je bila 001 M H2SO4 uz protok od 04 mL min

-1 a prije analize je

degazirana u ultrazvučnoj kupelji kako je to već prije opisano (poglavlje 3146)

Razdvajanje sastojaka prireĎenih uzoraka odvijalo se pri temperaturi grijača kolone od 40degC

a eluirani spojevi detektirani su fluorescencijskim i refraktometrijskim detektorom

327 Analitičke metode

3271 Praćenje rasta bakterijske biomase

Porast biomase bakterijskog soja L mesenteroides LMG 7954 u svim odabranim

uvjetima opisanim u ovom radu praćen je odreĎivanjem optičke gustoće (OD608) izuzete

suspenzije pomoću spektrofotometra Helios Epsilon (Thermo Fischer ScientificWaltham

Massachusetts SAD) Mjerenje je provedeno tako da se je u pravilnim vremenskim

intervalima u aseptičnim uvjetima izuzeo alikvot suspenzije (V 3 mL) Uzorak i njegovo

prvo decimalno razrjeĎenje u sterilnoj demineraliziranoj vodi (10-1

) preneseni su u staklene

Eksperimentalni dio

23

kivete (promjer kiveta 10 mm Hellma Optik GmbH Jena Njemačka) i odreĎena je njihova

optička gustoća (OD608) upravo onako kako je to prikazano u poglavlju Rezultati

Kao pokazatelj porasta stanica ove Gram-pozitivne bakterije i njezine fiziologije u

odabranoj hranjivoj podlozi kao i u reakcijskoj smjesi saharozaglicerol visokog osmotskog

tlaka praćena je i pH vrijednost suspenzije pH papirići su se koristili i to zbog očuvanja

aseptičnih uvjeta (Macherey-Nagel mjerno područje 1-14 rezolucija 1 (Anonymous2018))

Nakon odreĎivanja OD608 nekoliko kapi suspenzije nanešeno je na pH papirić poloţen na

staničevinu i usporedbom nijansi na priloţenoj pH skali procijenjena je promjena boje

papirića tj pH vrijednost izuzete suspenzije

3272 Ionsko-izmjenjivačka tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC)

32721 Priprema uzoraka za analizu

Supernatant izuzetih uzoraka izdvojen je od bakterijske biomase centrifugiranjem

(poglavlje 3142) Alikvotu supernatanta volumena 5000 μL dodano je 5000 μL otopine

cinkovog sulfata heptahidrata ( = 1000 g L-1

) kako bi se istaloţili proteini iz prireĎenog

supernatanta Dobivena smjesa je centrifugirana kroz 20 min pri 13 000 g (centrifuga Centric

150 Tehtnica Ţelezniki Slovenija) Izdvojeni je supernatant otpipetiran i tako odvojen od

istaloţenih sastojaka i neotopljenog cinkovog sulfata heptahidrata koji je dodan u suvišku

Nakon toga supernatant je profiltriran kroz filter veličine pora 020 μm (LLG-Syringe filters

nylon 02 μm Sigma-Aldrich St Louis SAD) Dobiveni filtrat je razrijeĎen

demineraliziranom vodom i analiziran HPLC metodom

32722 Analiza prireĎenih uzoraka HPLC metodom

Prije analize prireĎenih uzoraka prireĎene su otopine standarda i analizirane

optimiranom HPLC metodom kako je to opisano u Tablici 8 u poglavlju 32723 Nakon

toga svi prireĎeni uzorci su razrijeĎeni demineraliziranom vodom preneseni u vijale i

postavljeni u automatski sustav za injektiranje uzorka Načinjena je sekvenca s prikladnim

brojem uzorkovanja Kod uzoraka kod koji su dobiveni neodgovarajući kromatogrami s

previsokim intenzitetom pikova ovi su uzorci još razrijeĎeni i HPLC analiza je ponovljena

Eksperimentalni dio

24

32723 Izrada baždarnih dijagrama

OdreĎeno je retencijsko vrijeme (vrijeme zadrţavanja tR min) i izraĎeni su baţdarni

dijagrami za saharozu glukozu fruktozu oba steroizomera (D- i L-) mliječne kiseline

glicerola octene kiseline i etanola Pripremljene su otopine ovih spojeva u pet različitih

koncentracija (Tablica 8) i analizirane HPLC metodom Baţdarni dijagrami za svaki spoj

izraĎeni su na temelju vremena zadrţavanja svakog spoja (tR min) koncentracije injektirane

otopine ( g L-1

) i površine ispod eluiranog pika (A mV2) Dobivene jednadţbe pravaca

korištene su pri procjeni koncentracije sastojaka uzoraka koji su analizirani optimiranom

HPLC metodom (Tablica 9) Vrijednosti za koncentraciju svakog sastojka prireĎenog uzorka

korigirane su s obzirom na razrjeĎenje analiziranih uzoraka

Tablica 8 Koncentracije spojeva u otopinama za izradu baţdarnih dijagrama

R

br

koncentracija (g L-1

)

Saharoza glukoza Fruktoz

a mliječna kiselina glicerol

octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667

dvije otopine s istovjetnom koncentracijom glukoze zasebno su analizirane kako bi se utvrdila

ponovljivost HPLC metode

Eksperimentalni dio

25

Tabica 9 Vrijeme zadrţavanja i jednadţbe baţdarnih pravaca za odreĎene sastojke hranjivih

podloga i reakcijskih smjesa

sastojak tR (min) jednadţba baţdarnog pravca R2 (-)

saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997

fruktoza 569 A = 1 000 000 γ ndash 52 266 09981

L-mliječna kiselina 681 A = 157 769 γ ndash 16 836 09984

D-mliječna kiselina 720 A = 411 185 γ ndash 55 517 09977

ukupna mliječna kiselina - A = 568 953 γ ndash 72 353 09979

glicerol 737 A = 1 000 000 γ ndash 119 014 09985

octena kiselina 847 A = 499 532 γ + 105 410 09968

etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964

Osim ovdje opisanih tR odreĎena su i vremena zadrţavanja svih preostalih sastojaka

hranjivih podloga kako bi se utvrdila moguća interferencija sa drugim sastojcima i krajnjim

proizvodima metabolizma bakterijskog soja L mesenteroides LMG 7954 u odabranim

uvjetima Tako su HPLC metodom analizirane otopine peptona mesnog ekstrakta kvaščevog

ekstrakta Tween-a-80 i različitih soli (K2HPO4 KH2PO4 CH3COONa 3 H2O triamonijeva

citrata MgSO4 7 H2O MnSO4 H2O MgSO4 7 H2O MnSO4 H2O FeSO4 7H2O tiamin-

HCl natrijev L-askorbat) Analitički je utvrĎeno da pobrojeni sastojci ne interferiraju sa

sastojcima hranjive podloge ili suspenzije koji su prikazani u gornjoj tablici kao ni krajnjim

proizvodima metabolizma ovog bakterijskog soja Zbog toga podaci za ovdje pobrojene

sastojke nisu prikazani u ovom radu

Eksperimentalni dio

26

328 Analiza eksperimentalno dobivenih podataka

3281 Procjena specifične brzine rasta bakterije Leuconostoc mesenteroides LMG 7954

Vrijednosti spektrofotometrijski odreĎene optičke gustoće suspenzije stanica (OD608) i

to samo tijekom eksponencijalne faze rasta su linearizirane i grafički prikazane u ovisnosti o

vremenu uzgoja (t) Specifična brzina rasta (μ) bakterijskog soja Leuconostoc mesenteroides

LMG 7954 odgovara koeficijentu smjera pravca

Nelinearizirani matematički izraz ovisnosti OD608 (X) o vremenu (t) opisan je

jednadţbom [1] koja nakon linearizacije poprima oblik jednadţbe [2] (Doran 1995)

[1]

(

) [2]

gdje je

X - optička gustoća uzorka (OD608) u vremenu t

X0 - optička gustoća uzorka (OD608) u vremenu t = 00 h

μ - nagib pravca tj specifična brzina rasta [h-1

] soja u odabranim uvjetima

t - vrijeme proteklo od početka uzgoja do vremena izuzimanja uzorka [h]

Grafički prikazi procjene specifične brzine rasta (μ) ovog soja pri različitim eksperimentalnim

uvjetima dani su u poglavlju 7 Prilozi

Rezultati i rasprava

27

4 REZULTATI I RASPRAVA

Jedan od primarnih ciljeva ovog diplomskog rada je bio okarakterizirati krivulju rasta i

procijeniti specifičnu brzinu rasta () bakterijskog soja Leuconostoc mesenteroides LMG

7954 pri mikroaerofilnim i aerobnim uvjetima šarţnog uzgoja u laboratorijskom mjerilu

(poglavlje 41) Fiziologija ovog (navodno) heterofermentativnog soja bakterija mliječne

kiseline (Holzapfel i sur 2009) nije istraţena i ovi osnovni podaci kao što je utjecaj

koncentracije otopljenog kisika na rast i aktivnost bakterijskih stanica nisu dostupni u

znanstvenoj literaturi Dobiveni podaci i biokinetički parametri bili su polazište za daljnje

eksperimente kako je to opisano nadalje u ovom radu Tako je jedan od narednih ciljeva ovog

istraţivanja bio utvrditi utjecaj smjese saharoze i glicerola pri njihovim relativno visokim

početnim koncentracijama (redom c = 08 mol L-1

i c = 20 mol L-1

) na rast i aktivnost ovog

bakterijskog soja Nadalje bilo je potrebo utvrditi utjecaj permeabilizacije stanica L

mesenteroides LMG 7954 u smjesi saharoze i glicerola na preţivljavanje i aktivnost ovog soja

u odabranim fiziološkim uvjetima U tu svrhu odabrana je jedna fizikalna metoda

permeabilizacije bakterijskih stanica poraslih do sredine eksponencijalne faze rasta - tretman

ultrazvukom (poglavlje 421) kao i jedna kemijska metoda za permeabilizaciju bakterijskih

stanica poraslih do sredine eksponencijalne faze rasta - tretman površinski aktivnom tvari

Tween-80 (poglavlje 422)

Fiziološke karakteristike ovog bakterijskog soja takoĎer su slabo istraţene i opisane u

literaturi Stoga je jedan od ciljeva ovog rada bio okarakterizirati metabolizam ugljikohidrata

(glukoze iz hranjive MRS podloge zatim saharoze iz kemijski djelomično definirane podloge

i smjese saharozaglicerol) ali i glicerola iz ove smjese (poglavlja 4211 i 4221) Tako bi

se dobio uvid o mogućnostima eventualne industrijske primjene soja L mesenteroides LMG

7954

Sukladno literaturnim podacima (Goedl i sur 2007 Kawasaki i sur 1996 Koga i

sur 1991 Lee i sur 2006) odreĎene L mesenteroides vrste iskazuju aktivnost saharoza

fosforilaze (EC 2417) Ovaj citoplazmatski enzim se u svom pročišćenom obliku

industrijski primjenjuje u proizvodnji -glukozilglicerola U ovim istraţivanjima planiralo se

utvrditi mogućnost primjene permeabiliziranih stanica soja L mesenteroides LMG 7954 u

proizvodnji ovog visokovrijednog spoja koji se primarno koristi u kozmetičkoj industriji

Zbog toga samo razvili i optimirali novu HPLC metodu kojom smo tijekom samo jedne


28

analize identificirali i odredili sve sastojke prireĎenih uzoraka (supstrate i krajnje proizvode

metabolizma bakterijskog soja) i utvrdili mogućnost proizvodnje -glukozilglicerola u

odabranim uvjetima Kako standard za ovaj spoj nije komercijalno dostupan tijekom razvoja i

optimiranja ove HPLC metode odredili smo vremena zadrţavanja svih spojeva i drugih

sastojaka hranjivih podloga i reakcijskih smjesa (smjesa saharozaglicerol i smjesa

saharozaglicerolTween-80) koje smo koristili u istraţivanjima S obzirom na sve provedene

eksperimente i postavke HPLC metode sa velikom sigurnošću moţemo tvrditi da ova

bakterija posjeduje aktivnost saharoza fosforilaze kako je to pokazano u poglavlju Rezultati i

rasprava MeĎutim samo se nakon izolacije pročišćavanja i detekcije proizvedenog spoja (-

glukozilglicerola) moţe tvrditi da je proizvedeni spoj upravo -glukozilglicerol

Ovo je istraţivanje značajna nadogradnja prethodnom istraţivanju (Vučenović 2018)

ali i izvrstan temelj za daljnja istraţivanja u ovoj istraţivačkoj grupi


29

41 KARAKTERIZACIJA KRIVULJE RASTA I PROCJENA SPECIFIČNE BRZINE

RASTA BAKTERIJSKOG SOJA Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 PRI

MIKROAEROFILNIM I AEROBNIM UVJETIMA UZGOJA ŠARŢNIM

POSTUPKOM U LABORATORIJSKOM MJERILU

U ovom poglavlju prikazana je krivulja rasa bakterijskog soja L mesenteroides LMG

7954 pri mikroaerofilnim (Slika 8) i aerobnim uvjetima (Slika 9) uzgoja šarţnim postupkom

u laboratorijskom mjerilu pri konstantnoj temperaturi i uz opadanje pH vrijednosti suspenzije

(Slika 10)

U Tablici 10 procijenjeno je vrijeme trajanja lag faze rasta (faza prilagodbe) i

eksponencijalne faze rasta bakterijskog soja pri odabranim uvjetima Iz eksperimentalnih

podataka procijenjene su vrijednosti za specifičnu brzinu rasta () L mesenteroides LMG

7954 pri opisanim uvjetima

Ovdje opisane ekperimentalne vrijednosti bile su temelj za planiranje eksperimenata

permeabilizacije stanica (poglavlje 42)


30

Slika 8 Promjena optičke gustoće (OD608) suspenzije (diams lijeva y-os) tijekom uzgoja

bakterijskog soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 u kemijski djelomično definiranoj

hranjivoj podlozi pri mikroaerofilnim uvjetima i prvog razrjeĎenja ove suspenzije (10-1

desna y-os)

Na temelju eksperimentalnih podataka (Slika 8) moţe se zaključiti da vrijednosti za

OD608 za suspenziju i njezino prvo decimalno razrjeĎenje (10-1

) ne pokazuju linearnu

meĎuovisnost kao što je i očekivano s obzirom da se radi o bakteriji mliječne kiseline i

njezinom karakterističnom rastu u nakupinama Ovo je bio glavni razlog zašto ovo

istraţivanje nije dodatno prošireno eksperimentima s odreĎivanjem suhe tvari bakterijske

biomase i brojem poraslih kolonija bakterijskog soja na odgovarajućoj čvrstoj hranjivoj

(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31



hranjivoj podlozi pri aerobnim uvjetima i prvog razrjeĎenja ove suspenzije (10-1

desna y-

os)

Usporede li se prve dvije slike u ovom poglavlju (Slika 8 i 9) moţe se zaključiti da

ovaj bakterijski soj raste slično pri mikroaerofilnim i aerobnim uvjetima Dakle kisik nema

negativan utjecaj na porast biomase tj energetski metabolizam u stanicama L mesenteroides

LMG 7954 kako se u odreĎenom broju znanstvenih radova opisuje Novija istraţivanja npr

ona Nevesa i sur (2005) ukazuju na vaţnu ulogu kisika kao krajnjeg akceptora elektrona u

reakcijama reoksidacije reduciranih kofaktora Reoksidacija kofaktora uz kisik kao krajnji

akceptor elektrona smatra se učinkovitijom od drugih redukcijsko-oksidacijskih reakcija u

kojima se se odvija reoksidacija kofaktora kako je to opisano u Teorijskom dijelu ovog rada

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32

Slika 10 Promjena temperature (θ diams) i pH vrijednosti suspenzije (pH ) tijekom aerobnog

uzgoja soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 u kemijski djelomično definiranoj

hranjivoj podlozi pri aerobnim uvjetima

Vrlo slične vrijednosti za temperaturu i pH vrijednost suspenzije odreĎene su i kod

uzgoja ovog soja pri mikroaerofilnim uvjetima pa stoga nisu nanovo prikazane

00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33

Tablica 10 Trajanje faza rasta bakterijskog soja L mesenteroides LMG 7954 tijekom uzgoja

u kemijski djelomično definiranoj podlozi (Vandamme i sur 1987) pri temperaturi od

28010degC pH vrijednosti izmeĎu 40 i 50 pH jedinica i različitim koncentracijama

otopljenog kisika (mikroaerofilni i aerobni uvjeti uzgoja šarţnim postupkom)

uvjeti uzgoja

mikroaerofilni aerobni

faza rasta t (h)

lag (faza prilagodbe) 20 10

eksponencijalna 30 30

Procjena trajanja dviju faza rasta načinjene su na temelju eksperimentalnih podataka

OD608 za izuzetu suspenziju (Slike 8 i 9) Eksperimentalni podaci dobiveni za OD608 za prvo

razrjeĎenje suspenzije (10-1

) nisu uzeti u obzir jer je iz dobivenih podataka teško razlučiti

trajanje faza rasta ovog soja (Slike 8 i 9)

Iz vrijednosti koje su prikazane u Tablici 10 moţe se zaključiti da kisik povoljno

utječe na rast tj na prelazak iz lag faze rasta (faze prilagodbe na drugu hranjivu podlogu

suspenzija je precijepljena iz hranjive MRS podloge u kemijski djelomično definiranu

hranjivu podlogu) u eksponencijalnu fazu rasta soja L mesenteroides LMG 7954 Pri

mikroaerofilnim i aerobnim uvjetima eksponencijalna faza rasta ovog soja traje relativno

kratko (30 h) i vrlo brzo (samo nakon 50 h odnosno 40 h od prebacivanja iz hranjive MRS

podloge u kemijski djelomično definiranu hranjivu podlogu) stanice ulaze u stacionarnu fazu

rasta Zanimljivo je da je u oba slučaja značajni pad pH vrijednosti suspenzije zabiljeţen već

nakon 20 h uzgoja dakle odmah na početku eksponencijalne faze rasta (Slika 10) Pri tome

je vaţno napomenuti da je najniţa pH vrijednost suspenzije pri kraju obaju uzgoja šarţnim

postupkom (t gt 240 h) iznosila 40 pH jedinice Dakle proizvodnja visokih koncentracija

mliječne iili octene kiseline s pomoću ovog soja u odabranim uvjetima ne moţe se očekivati


34

Tablica 11 Procijenjena vrijednosti za specifičnu brzinu rasta () bakterijskog soja L

mesenteroides LMG 7954 tijekom uzgoja u kemijski djelomično definiranoj podlozi

(Vandamme i sur 1987) pri temperaturi od 28010degC pH vrijednosti izmeĎu 40 i 50 pH

jedinica i različitim koncentracijama otopljenog kisika (mikroaerofilni i aerobni uvjeti uzgoja

šarţnim postupkom)

uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141

prvo decimalno razrjeĎenje suspenzije (10-1

) 0103 0134

Procijena specifične brzine rasta () načinjena je na temelju eksperimentalnih

podataka OD608 za izuzetu suspenziju (100) kao i za prvo razrjeĎenje izuzete suspenzije (10

-1)

kako bi se pobliţe okarakterizirao ovaj biokinetički parametar i to iz što više eksperimentalnih

podataka Grafički prikazi za procjenu specifične brzina rasta () prikazani su u poglavlju 7

Prilozi (Slike 26 i 27)

Šarţni uzgoji bakterijskog soja L mesenteroides LMG 7954 pri mikroaerofilnim i

aerobnim uvjetima ponovljeni su tri puta Rezultati prikazani u ovom radu predstavljaju

srednje vrijednosti eksperimentalnih podataka koji su dobiveni tijekom ova tri uzgoja a koja

su provedeni u istovjetnim i ponovljivim uvjetima kako je to opisano u poglavlju

Eksperimentalni dio

Na temelju vrijednosti koje su procijenjene za ovaj biokinetički parametar moţe se

zaključiti o povoljnom utjecaju kisika na rast bakterijske biomase ovog soja Specifična brzina

rasta L mesenteroides LMG 7954 pri aerobnim uvjetima je za oko 30 veća od vrijednosti

procijenjene pri mikroaerofilnim uvjetima (Tablica 11) Vaţno je napomenuti da se ove

vrijednosti () procijenjene za suspenziju (100) kao i za prvo razrjeĎenje izuzete suspenzije

(10-1

) pri istovjetnim uvjetima (mikroaerofilnim ili aerobnim) šarţnog uzgoja razlikuju za

manje od oko 5 što je izvanredan rezultat s obzirom na karakterističan rast ove bakterije

mliječne kiseline


35

42 UZGOJ BAKTERIJSKOG SOJA Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 PRI

AEROBNIM UVJETIMA PERMEABILIZACIJA UZGOJENIH STANICA I

NJIHOVA FIZIOLOGIJA U SMJESI SAHAROZAGLICEROL

Nakon što je utvrĎen povoljan utjecaj kisika na rast L mesenteroides LMG 7954 u

odabranim uvjetima (poglavlje 41) planirani su daljnji eksperimenti koji su svi redom

provedeni pri aerobnim uvjetima

Velika većina podataka o permeabilizaciji bakterijskih stanica iz znanstvene literaure

opisuje postupke peremabilizacije stanica optimirane za Gram-negativne bakterije (Runyan i

sur 2006 Ananta i sur 2005 Choi i sur 2004) Kako nismo pronašli prikladne optimirane

postupke permeabilizacije stanica Gram-pozitivnih bakterija isplanirali smo primjenu dviju

metoda za permeabilizaciju stanica L mesenteroides LMG 7954 koje su prethodno porasle

do sredine eksponencijalne faze rasta - fizikalnu i kemijsku metodu Za fizikalnu metodu

odabrana je blaga metoda tretmana ultrazvukom (35degC 37 kHz 90 W poglavlje 421) dok

je za kemijsku metodu odabran tretman površinski aktivnom tvari - Tween-om-80 (03 i 05

volvol poglavlje 422) U ovim poglavljima prikazani su rezultati HPLC analize

odgovarajućih uzoraka čime je zapravo opisan metabolizam supstrata tj fiziologija ovog soja

pri odabranim uvjetima kao i mogućnost proizvodnje -glukozilglicerola (poglavlja 4211 i

42211 i 42221)


36


Nakon karakterizacije krivulje rasta i procjene specifične brzine rasta () soja L

mesenteroides LMG 7954 provedeni su eksperimenti permeabilizacije stanica bakterijskog

soja L mesenteroides LMG 7954 najprije ultrazvučnom metodom (ovo poglavlje) a zatim

kemijskom metodom (poglavlje 422)

Suspenzija stanica bakterijskog soja je svjeţe uzgojena u kemijski djelomično

definiranoj hranjivoj podlozi do sredine eksponencijalne faze rasta (t = 40 h) kako je već

prije opisano (poglavlje 41) a zatim je suspenzija prebačena u smjesu saharozaglicerol (08

mol L-1

20 mol L-1

) i uzorci su tretirani u ultrazvučnoj kupelji (Elmasonic P 300 H Elma

Singen Njemačka) pri 35degC frekvenciji ultrazvučnih valova od 37 kHz i snazi ultrazvuka od

90 W Preko noći suspenzija stanica u smjesi saharozaglicerol nije ostavljena u ultrazvučnoj

kupelji zbog zagrijavanja uzorka ali je naknadno tretirana naredno jutro kroz još 23 h kako

je to prikazano na Slici 11 Na ovoj slici prikazan je rast stanica bakterijskog soja koje su

tretirane ultrazvukom dok je na Slici 12 prikazan porast bakterijske biomase u kontrolnom

uzorku (bez tretmana ultrazvukom) Ovdje je zanimljivo da je došlo do jačeg zakiseljavanja

suspenzije nakon tretmana ultrazvukom (pH 30 Slika 13) nego u kontrolnom uzorku (pH

3-40 eksperimentalni podaci nisu prikazani) U Tablici 12 prikazane su vrijednosti

procijenjene za specifičnu brzinu rasta () za stanice tretirane ultrazvukom i za kontrolni

uzorak Zbog karakterističnog rasta stanica soja L mesenteroides LMG 7954 najprije u

kemijski djelomično definiranoj hranjivoj podlozi (eksponencijalna faza rasta 1) a zatim i u

smjesi saharozaglicerol (eksponencijalna faza rasta 2) procijenili smo dvije vrijednosti za


37

Slika 11 Rast bakterijske biomase (OD608 diams lijeva y-os) tijekom uzgoja soja Leuconostoc

mesenteroides LMG 7954 u (1) kemijski djelomično definiranoj hranjivoj podlozi (t = 00-37

h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerol tijekom tretmana ultrazvukom (t = 41-81 h

2A) zatim tijekom uzgoja na magnetskoj miješalici bez tretmana ultrazvukom (t = 81-235 h

2B) i tijekom ponovnog tretmana ultrazvukom (t = 235-258 h 2C) Vrijednosti za OD608 za

prvo decimalno razrjeĎenje (10-1

desna y-os) prikazane su po istom principu

Nakon kratke lag faze (t = 10 h) i eksponencijalnog rasta u kemijski djelomično

definiranoj hranjivoj podlozi (eksponencijalna faza rasta 1 t = 10-40 h t = 30 h) ovaj soj

se odmah prilagoĎava na uvjete u smjesi saharozaglicerol bez lag faze rasta i opet počinje

rasti eksponencijalnim trendom (eksponencijalna faza rasta 2 t = 41-81 h t = 40 h)

Opisani trend porasta biomase ukazuje na robusnost ovog bakterijskog soja u uvjetima

visokog osmotskog tlaka Zanimljivo je da u smjesi saharozaglicerol nema karakteristične

stacionarne faze rasta kako je to opisano u preliminarnim eksperimentima karakterizacije

krivulje rasta soja L mesenteroides LMG 7954 (poglavlje 41) već u ovim uvjetima nakon

tzv eksponencijalne faze rasta 2 (t = 41-81 h t = 40 h) soj nastavlja rasti linearnim

trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38


mesenteroides LMG 7954 u kontrolnom uzorku u (1) kemijski djelomično definiranoj

hranjivoj podlozi (t = 00-43 h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerol bez tretmana

ultrazvukom (t = 43-242 h) Vrijednosti za OD608 za prvo decimalno razrjeĎenje (10-1


Za razliku od stanica tretiranih ultrazvukom (Slika 11) stanice u kontrolnom uzorku

nakon prebacivanja u smjesu saharaozaglicerol ne rastu eksponencijalno već bi se ovaj trend

mogao opisati linearnim porastom bakterijske biomase (Slika 12) Dakle tretman

ultrazvukom ima pozitivan učinak na porast bakterijske biomase soja L mesenteroides LMG

7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39

Slika 13 Promjena temperature (θ diams) i pH vrijednosti suspenzije (pH ) tijekom uzgoja soja

Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 u (1) u kemijski djelomično definiranoj hranjivoj

podlozi (t = 00-37 h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerol tijekom tretmana ultrazvukom

(t = 41-81 h 2A) tijekom rasta na magnetskoj miješalici (t = 81-235 h 2B) i tijekom

ponovnog tretmana ultrazvukom (t = 235-258 h 2C)

Zbog vrlo sličnih vrijednosti za temperaturu i pH vrijednost suspenzije koje su

eksperimentalno odreĎene u uzorku tretiranom ultrazvukom i u kontrolnom uzorku (bez

tretmana ultrazvukom) ove vrijednosti nisu zasebno (nanovo) prikazane

00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40

Tablica 12 Procijenjene vrijednosti za specifičnu brzinu rasta () bakterijskog soja L mesenteroides LMG 7954 tijekom uzgoja u (1) u kemijski

djelomično definiranoj hranjivoj podlozi (eksponencijalna faza 1 t = 17-37 h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerol tijekom tretmana

ultrazvukom (eksponencijalna faza 2 t = 41-81 h) Grafički prikaz procjene za specifične brzina rasta () dan je u poglavlju 7 Prilozi (Slike 28

i 29)

Smjesa

kemijski djelomično definirana hranjiva podloga

(eksponencijalna faza 1)

saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074

kontrolni uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41

Vrijednosti u Tablici 12 zorno prikazuju da se ovaj soj izvanredno prilagoĎava uvjetima u

smjesi saharozaglicerol i procijenjena u ovoj smjesi visokog osmotskog tlaka ( = 0124 h-

1) je vrlo slična vrijednosti procijenjenoj za kemijski djelomično definiranu hranjivu podlogu

( = 0134-0141 h-1

Tablica 11) u kojoj je soj uzgajan bez tretmana ultrazvukom


42

4211 Fiziologija soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 pri odabranim uvjetima

Razvijena je i optimirana HPLC metoda pomoću koje je odreĎena koncentracija

odreĎenih relevantnih sastojaka nekih uzoraka i to kako bi se djelomično popratila fiziologija

stanica ovog soja u odabranim uvjetima Svi rezultati HPLC analize nisu prikazani u ovom

radu

U ovom poglavlju prikazana je promjena koncentracije saharoze (Slika 14) kao

izvora ugljika i energije za rast i odrţavanje stanica ovog bakterijskog soja ali i kao donora

glukoze u reakciji koju katalizira saharoza fosforilaza (transglukozilacija)

Promjena koncentracije glicerola prikazana je na Slici 15 Glicerol takoĎer moţe biti

izvor ugljika i energije bakterijskim stanicama a u smjesu je dodan prvenstveno kao akceptor

glukoze u reakciji koju kataliza saharoza fosforilaza

U Tablici 13 prikazane su promjene koncentracije glukoze fruktoze D- i L-laktata

kao i ukupnog laktata zatim acetata i etanola Promjena koncentracije glukoze ukazuje na

hidrolizu saharoze i to u smislu potrošnje saharoze kao izvora ugljika i energije za rast i

odrţavanje bakterijskog soja ali i kao jednog od supstrata u reakciji transglukozilacije

Fruktoza nastala hidrolizom saharoze moţe biti izvor ugljika i energije ali i akceptor

elektrona u odreĎenim metaboličkim reakcijama koje sukladno literaturi mogu provoditi

bakterije mliječne kiseline Mliječna kiselina acetat i etanol trebali bi biti krajnji proizvodi

metabolizma ugljikohidrata (saharoze glukoze i fruktoze) i eventualno glicerola (kao izvora

ugljika) u stanicama L mesenteroides LMG 7954

Praćenjem svih pobrojenih koncentracija u izvjesnoj mjeri moţe se opisati fiziologija

L mesenteroides LMG 7954 u odabranim uvjetima


43

Slika 14 Promjena koncentracije saharoze (saharoza diams) tijekom uzgoja soja Leuconostoc



2A) tijekom uzgoja na magnetskoj miješalici bez tretmana ultrazvukom (t = 81-235 h 2B) i

tijekom ponovnog tretmana ultrazvukom (t = 235-258 h 2C) Vrijednosti za promjenu

koncentracije saharoze u kontrolnom uzorku (bez tretmana ultrazvukom saharoza ) prikazane

su po istom principu radi lakše usporedbe ovih vrijednosti

Koncentracija saharoze opada u kemijski djelomično definiranoj podlozi (Slika 14 1)

od početnih 102736 g L-1

(t = 00 h) do 78876 g L-1

(t = 41 h) Nakon prebacivanja

suspenzije u smjesu saharozaglicerol = 08 mol L-1

20 mol L-1

(Slika 14 2) koncentracija

saharoze takoĎer opada i to od visoke početne koncentracije od 325710 g L-1

do 98788 g L-1

do kraja uzgoja Slične promjene zabiljeţene su kod kontrolnog uzorka U ovom potonjem

slučaju koncentracija saharoze smanjila se od početnih 340000 g L-1

do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44

Slika 15 Promjena koncentracije glicerola (glicerol diams) tijekom uzgoja soja Leuconostoc


h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerol tijekom tretmana ultrazvukom (t = 41-81 h 2A)

tijekom uzgoja na magnetskoj miješalici bez tretmana ultrazvukom (t = 81-235 h 2B) i


koncentracije glicerola u kontrolnom uzorku (bez tretmana ultrazvukom glicerol ) prikazane


Heterofermentativni soj L mesenteroides LMG 7954 ne proizvodi glicerol u kemijski

djelomično definiranoj hranjivoj podlozi pri aerobnim uvjetima (1) kako je to utvrĎeno

HPLC analizom izuzetih uzoraka Dakle ovaj soj ne provodi heterofermentaciju već se

tijekom razgradnje saharoze iz kemijski djelomično definirane podloge proizvodi samo laktat

U smjesi saharoza glicerol (2) koncentracija glicerola opada od početne 180859 g L-1

do

136865 g L-1

na kraju uzgoja Dakle glicerol se iz ove smjese s visokom početnom

koncentracijom saharoze i glicerola troši a za pretpostaviti je da se radi o reakciji

transglukozilacije IznenaĎuje da koncentracija glicerola u kontrolnom uzorku pada od

početnih 184000 g L-1

do 0000 g L-1

Dakle ovaj bakterijski soj moţe transportirati i

metabolizirati glicerol kao izvor ugljika i energije

0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45

Tablica 13 Promjena koncentracije glukoze fruktoze D- i L-laktata kao i ukupnog laktata

zatim acetata i etanola tijekom uzgoja soja Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 u (1)

kemijski djelomično definiranoj hranjivoj podlozi (t = 00-37 h) i (2) reakcijskoj smjesi

saharozaglicerol tijekom tretmana ultrazvukom (t = 41-81 h) tijekom uzgoja na

magnetskoj miješalici bez tretmana ultrazvukom (t = 81-235 h) i tijekom ponovnog tretmana

ultrazvukom (t = 235-258 h) Vrijednosti za promjenu koncentracije saharoze u kontrolnom

uzorku (bez tretmana ultrazvukom) prikazane su po istom principu radi lakše usporedbe ovih

vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat

acetat Etanol D-laktat L-laktat

ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46

Glukoza je detektirana u uzorku i kontrolnom uzorku tijekom cijelog uzgoja ali u

različitim koncentracijama od kojih su veće one kod stanica permeabiliziranih ultrazvukom

(Tablica 13 A i B) Dakle soj L mesenteroides LMG 7954 iskazuje aktivnost invertaze (EC

2417) Slično je i sa fruktozom kao proizvodom hidrolize saharoze (Tablica 13 A i B)

Ovaj soj proizvodi D- i L-laktat meĎutim koncentracija proizvedenog laktata puno je

veća u kontrolnom uzorku nego kod ultrazvukom permeabiliziranih stanica Iz ovog bi se

moglo zaključiti da ultrazvuk moţe utjecati na regulaciju metabolizma u stanicama ovog soja

Acetat i etanol se kod uzgoja ultrazvukom permebiliziranih stanica javljaju tek u

linearnoj fazi rasta (t gt 37 h Tablica 13 A i B) Tada je koncentracija saharoze u reakcijskoj

smjesi vrlo visoka i permeabilizirane stanice osim laktata počinju proizvoditi acetat a nešto

kasnije i etanol Proizvodnja acetata moţe se povezati s povećanim prinosom metaboličke

energije (ATP) a etanol s reoksidacijom kofaktora

U kontrolnom uzorku koncentracija proizvedenog acetata je značajno manja dok

etanol nije detektiran (Tablica 13 B)


47

Odmah na početku uzgoja L mesenteroides LMG 7954 u smjesi saharozaglicerol uz

tretman ultrazvukom (t = 41 h) analitički (HPLC metodom) je utvrĎena pojava dodatnog

pika (engl shoulder) i to nakon eluiranja saharoze (spoj sa dvanaest ugljikovih atoma tR =

461 min) Vrijeme zadrţavanja ovog dodatnog pika (tR = 483 min) ne odgovara niti jednom

sastojku hranjivih podloga koje su korištene u ovom radu kao ni krajnjim proizvodima

metabolizma supstrata u stanicama soja L mesenteroides LMG 7954 Kako se ovaj dodatni

pik eluira izmeĎu pika saharoze i pika glukoze (spoj sa šest ugljikovih atoma tR = 529 min)

pretpostavili smo da bi to trebao biti spoj sa devet ugljikovih atoma kao što je -

glukozilglicerol (C9H18O8) Standard za -glukozilglicerol nije komercijalno dostupan i vrlo

teško ga je pripraviti sintezom i to čistoće potrebne za HPLC analizu Zbog svega pobrojanog

nije bilo moguće HPLC metodom odrediti vrijeme zadrţavanja ovog spoja tj njegova

standarda

Osim toga s obzirom na reakcije prikazane na Slici 1 u ovom diplomskom radu teško

je tumačiti promjenu koncentracije tj površinu ispod ovog dodatnog pika (-

glukozilglicerol) Dakle povećanje ali i sniţenje koncentracije ovog spoja rezultat je nekoliko

reakcija (Slika 1) a teţe ih je popratiti u suspenziji permeabiliziranih stanica gdje su

supstrati za rast stanica soja L mesenteroides LMG 7954 i supstrati i mogući proizvodi

(povratnih) enzimskih reakcija

Tablica 14 Promjena površine (A mV2) dodatnog pika (tR = 483 min) tijekom uzgoja soja

Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 u (1) kemijski djelomično definiranoj hranjivoj

podlozi (t = 00-37 h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerol tijekom tretmana

ultrazvukom (t = 41-81 h 2A) tijekom uzgoja na magnetskoj miješalici bez tretmana

ultrazvukom (t = 81-235 h 2B) i tijekom ponovnog tretmana ultrazvukom (t = 235-258 h

2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48


Osim fizikalnom metodom istraţena je mogućnost permeabilizacije stanica

kemijskom metodom i to Tween-om-80 Odabrane su dvije koncentracije Tween-a-80 -03

(poglavlje 4221) i 05 volvol (poglavlje 4222)

4221 Permeabilizacija stanica s 03 (volvol) Tween-a-80

Promjena koncentracije biomase (OD608) soja L mesenteroides LMG 7954 tijekom

uzgoja u kemijski djelomično definiranoj hranjivoj podlozi i nakon prebacivanja u smjesu

saharozaglicerolTween-80 prikazana je na Slici 16 Istovjetni podaci za kontrolu (bez

Tween-a-80) prikazani su na Slici 17 Promjena temperature i pH vrijednosti obaju uzoraka

uzorka tretiranog Tween-om-80 i kontrolnog uzorka prikazane su na Slici 18

U Tablici 15 usporeĎene su vrijednosti procijenjene za specifičnu brzinu rasta ()

bakterijskog soja u uzorku i kontrolnom uzorku


49

Slika 16 Rast bakterijske biomase (OD608 diams) tijekom uzgoja soja Leuconostoc mesenteroides

LMG 7954 u (1) kemijski djelomično definiranoj hranjivoj podlozi (t = 00-43 h) i (2)

reakcijskoj smjesi saharozaglicerolTween-80 (03 volvol t = 53-242 h) Vrijednosti za

OD608 za prvo decimalno razrjeĎenje (10-1

) prikazane su po istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50


LMG 7954 u kontrolnom uzorku u (1) kemijski djelomično definiranoj hranjivoj podlozi (t =

00-43 h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerol (bez tretmana s 03 volvol Tween-a-80

t = 53-242 h) Vrijednosti za OD608 za prvo decimalno razrjeĎenje (10-1

) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51



podlozi (t = 00-43 h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerolTween-80 (03 volvol t =

53-242 h)

I u ovom setu eksperimenata odreĎene su vrlo slične vrijednosti za temperaturu i pH

vrijednost suspenzije u kontrolnom uzorku (bez tretmana s 03 volvol Tween-a-80) pa ove

eksperimentalne vrijednosti nisu nanovo prikazane

00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52

Tablica 15 Procijenjena specifične brzina rasta () bakterijskog soja L mesenteroides LMG 7954 tijekom uzgoja u (1) u kemijski djelomično

definiranoj hranjivoj podlozi (eksponencijalna faza 1 t = 21-43 h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerol Tween-80 (03 volvol)

(eksponencijalna faza 2 t = 63-93 h) Grafički prikaz procjene za specifične brzina rasta () dan je u poglavlju Prilozi (Slike 28 i 30)

Smjesa



saharozaglicerolTween-80


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53


Kao i kod tretmana bakterijskih stanica ultrazvukom i ovdje kod tretmana bakterijskih

stanica Tween-om-80 (03 volvol) praćena je koncentracija saharoze (Slika 19) i glicerola

(Slika 20) dok su u Tablici 16 prikazane promjene koncentracije glukoze fruktoze laktata

acetata i etanola


54


mesenteroides LMG 7954 u (1) kemijski djelomično definiranoj hranjivoj podlozi (t = 00-

433 h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerolTween-80 (03 volvol t = 53-242 h)

Vrijednosti za promjenu koncentracije saharoze u kontrolnom uzorku (bez tretmana Tween-

om-80 saharoza ) prikazane su po istom principu radi lakše usporedbe ovih vrijednosti

Promjena koncentracije saharoze u uzorku i kontrolnom uzorku vrlo je slična Tako je

u kemijski djelomično definiranoj hranjivoj podlozi koncentracija saharoze opala od 102736

g L-1

do 73830 g L-1

(u kontrolnom uzorku od 102736 g L-1

do 78876 g L-1

) dok je u smjesi

ova promjena bila od početnih od 340000 g L-1

do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u

kontrolnom uzorku od 340000 g L-1

do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55



h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerolTween-80 (03 volvol t = 53-242 h)

Vrijednosti za promjenu koncentracije glicerola u kontrolnom uzorku (bez tretmana Tween-

om-80 glicerol ) prikazane su po istom principu radi lakše usporedbe ovih vrijednosti

Kao i u prethodnom eksperimentu glicerol se ne proizvodi u kemijski djelomično

definiranoj hranjivoj podlozi dok u smjesi saharozaglicerolTween-80 opada od početnih

184000 g L-1

do 143725 g L-1

na kraju uzgoja Za razliku od uzorka tretiranog Tween-om-

80 u kontrolnom uzorku je sav glicerol utrošen Dakle u prisutnosti površinski aktivne tvari u

smjesi s visokim početnim koncentracijama saharoze i glicerola potrošnja glicerola je

reducirana Slična istraţivanja nisu dostupna u znanstvenoj literaturi pa se ne moţe

pretpostaviti uzrok opisanoj pojavi

0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56




saharozaglicerolTween-80 (03 volvol t = 53-242 h)

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

Osim nakon ukupno 93 h uzgoja koncentracija glukoze i fruktoze stalno raste u

vanstaničnom prostoru Koncentracija laktata varira tijekom uzgoja dok su koncentracije

acetata i etanola minimane i to nakon 43 h (83 h) i 93 h uzgoja i manje su od 10 g L-1

Dakle utjacaj Tween-a-80 drugačiji je od utjecaja ultrazvuka na fiziologiju stanica soja L

mesenteroides LMG 7954


57

Nakon t = 43 h uzgoja bakterijskog soja L mesenteroides LMG 7954 u smjesi

saharozaglicerolTween-80 (03 volvol) analitički (HPLC metodom) je utvrĎena pojava

dodatnog pika (-glukozilglicerol)




53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58


U ovom poglavlju istraţen je utjecaj većeg udjela (05 volvol) Tween-a-80 na

aktivnost soja L mesenteroides LMG 7954 Primjena koncentracije biomase prikazana je na

Slikama 21 (uzorak) i 22 (kontrola) promjena temperature i pH vrijednosti suspenzije na

Slici 23 dok su procijenjene vrijednosti za specifičnu brzinu rasta prikazane u Tablici 18






0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)



eksperimentalne vrijednosti nisu prikazane

00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61


definiranoj hranjivoj podlozi (eksponencijalna faza 1 t = 208-433 h) i (2) reakcijskoj smjesi saharozaglicerolTween-80 (05 volvol)


Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62


Fiziologija ovog bakterijskog soja u odabranim uvjetima moţe se djelom opisati na

temelju rezultata prikazanih na slikama u ovom poglavlju (Slike 24 i 25) kao i u Tablicama

19-20 Dobiveni rezultati u skladu su s već opisanim rezultatima u poglavlju 4221 gdje je

opisan utjecaj nešto niţe koncentracije Tween-80 (03 volvol) na aktivnost L

mesenteroides LMG 7954 u smjesi saharozaglicerolTween-80






0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat

acetat Etanol D-laktat L-laktat ukupni laktat

008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI

Na temelju rezultata koji su opisani u ovom radu moţe se zaključiti kako slijedi

1 Koncentracija otopljenog kisika pozitivno utječe na rast Leuconostoc mesenteroides

LMG 7954 i specifična brzina rasta () ovog soja u kemijski djelomično definiranoj

podlozi (Vandamme i sur 1987) pri 2810degC i opadajućoj pH vrijednosti suspenzije

(60-30) pri aerobnim uvjetima uzgoja šarţnim postupkom u laboratorijskom mjerilu

veća je za oko 30 od koja je procijenjena pri mikroaerofilnim uvjetima rasta ovog

soja u istovjetnim uvjetima

2 Okarakterizirana je krivulja rasta L mesenteroides LMG 7954 i utvrĎeno je trajanje

faze prilagodbe (tlag = 10-20 h) i eksponencijalne faze rasta (teksp = 30-40 h) u

opisanim uvjetima nakon čega stanice ovog soja ulaze u stacionarnu fazu rasta (tstac)

3 Razvijena je i optimirana ionsko-izmjenjivačka HPLC metoda kojom je popraćena

aktivnost L mesenteroides LMG 7954 u različitim uvjetima uzgoja šarţnim

postupkom Ovom metodom tijekom samo jedne analize moguće je odrediti

koncentracije različitih supstrata i krajnjih proizvoda metabolizma ove

heterofermentativne bakterije mliječne kiseline

4 Soj L mesenteroides LMG 7954 uspješno raste u hranjivoj MRS podlozi kemijski

djelomično definiranoj hranjivoj podlozi kao i u smjesi visokog osmotskog tlaka

saharozaglicerol Dakle ovaj soj moţe transportirati i metabolizirati glukozu

saharozu i glicerol Prije transporta saharoza se hidrolizira na glukozu i fruktozu kako

je to eksperimentalno utvrĎeno Glavni proizvodi metabolizma ovih ugljikohidrata

(glukoze i saharoza) i alkohola (glicerol) su bakterijska biomasa i D- i L-laktat te

ovisno o uvjetima u kojima se stanice uzgajaju znatno manje koncentracije acetata i

etanola Nakon precjepljivanja svjeţe uzgojenih stanica ove Gram-pozitivne bakterije

u smjesu saharozaglicerol stanice nanovo rastu slijedeći eksponencijalni trend a

zatim linearni trend bez stacionarne faze rasta Ova fiziološka karakteristika

kvalificira ovaj soj za industrijsku primjenu u podlogama s visokim početnim

koncentracijama supstrata

5 U istraţivanjima opisanim u ovom radu stanice soja L mesenteroides LMG 7954

permeabilizirane su dvjema metodama - primjenom ultrazvuka i dodatkom Tween-a-

Zaključci

67

80 (03 i 05 volvol) Ultrazvuk znatno blaţe djeluje na rast stanica ovog soja od

Tween-a-80 Tako je specifična brzina rasta stanica tijekom tretmana ultrazvukom (micro =

0124 h-1

) slična specifičnoj brzini rasta u kontrolnom uzorku (bez tretmana

permeabilizacije micro = 0141 h-1

) dok stanice znatno slabije rastu u smjesi u prisutnosti

Tween-a-80 (micro = 0047 h-1

) Obje metode permeabilizacije primijenjene su tijekom

rasta soja u smjesi saharozaglicerol i HPLC metodom okarakteriziran je utjecaj ovih

metoda na utrošak supstrata (saharoze i glicerola) kao i proizvodnju krajnjih proizvoda

metabolizma (laktata aceatat i etanola) s pomoću stanica ove (navodno)

mikroaerofilne heterofermentativne bakterije mliječne kiseline Osim toga

identificiran je dodatni pik u kromatogramima koji ukazuje na mogućnost proizvodnje

-glukozilglicerola pomoću ovog soja

Literatura

68

6 LITERATURA

Adams M R Moss M O (2000) Food Microbiology 2izd The Royal Society of

Chemimstry Cambridge

Ananta E Voigt D Zenker M Heinz V Knorr D (2005) Cellular injuries upon

exposure of Escherichia coli and Lactobacillus rhamnosus to high-intensity ultrasound J

Appl Microbiol 99 271-278

Anonymous (2018) Indikator papir pH lthttpsagrologistikahrhr_HRmjerni-

instrumentitesteriindikator-papir-phgt Pristupljeno 26 kolovoza 2019

BRENDA (2018) - The Comprehensive Enzyme Information System lthttpswwwbrenda-

enzymesorggt Pristupljeno 6 rujna 2019

Canovas M Torroglosa T Iborra JL (2005) Permeabilization of Escherichia coli cells in

the biotransformation of trimethylammonium compounds into l-carnitine Enzyme Microb

Technol 37 300-308

Choi K O Song SH Yoo YJ (2004) Permeabilization of Ochrobactrum anthropi SY509

cells with organic solvents for whole cell biocatalyst Biotechnol Bioprocess Eng 9 147-150

Cogan T M Jordan K N (1993) Metabolism of Leuconostoc Bacteria J Dairy Sci 77

2704-2717

Colombo D Compostella F Ronchetti F Scala A Toma L Tokuda H Nishino

H(2000) Glycoglycerolipid analogues active as anti-tumor-promoters the influence of the

anomeric configuration Eur J Med Chem 35 1109-1113

Condon S (1983) Aerobic metabolism of lactic acid bacteriaIrish J Food Sci Technol 7

15-25

Literatura

69

De Man J D Rogosa M Sharpe M E (1960) A medium for cultivation of Lactobacilli J

Appl Bact 23 130-135

Doran P M (1995) Bioprocess Engineering Principles 2izd Academic Press San Diego

Felix H (1982) Permeabilized cells Anal Biochem 120 211-234

Ferretti JJ Huang TT Russell RRB (1988) Sequence analysis of the glucosyltransferase

A gene (gtfA) from Streptococcus mutans Ingbritt Infect Immun 56 1585-1588

Flores M V Voget C E Ertola R J J (1994) Permeabilization of yeast-cells

Kluyveromyces with organic-solvents Enzyme Microb Technol 16 340-346

Gaspar P Carvalho A L Vinga S Santos H Neves A R (2013) From physiology to

systems metabolic engineering for the production of biochemicals by lactic acid bacteria

Biotechnol Adv 6 764-788

Goedl C Schwarz A Minani A Nidetzky B (2007) Recombinant sucrose phosphorylase

from Leuconostoc mesenteroides Characterization kinetic studies of transglucosylation and

application of immobilised enzyme for production of -D-glucose 1-phosphate J Biotechnol

129 77-86

Goedl C Sawangwan T Mueller M Schwarz A Nidetzky B (2008) A high-yielding

biocatalytic process for the production of 2-O-(-D-glucopyranosyl)-sn-glycerol a natural

osmolyte and useful moisturizing ingredient Angew Chem Int Ed 47 10086-10089

Goedl C Sawangwan T Wildberger P Nidetzky B (2010a) Sucrose phosphorylase A

powerful transglucosylation catalyst for synthesis of -D-glucosides as industrial fine

chemicals Biocatal Biotransform 28 10-21

Goedl C Sawangwan T Mueller M Schwarz A Nidetzky B (2010b) Biocatalytic

Production of -Glucosylglycerol Food Technol Biotechnol 48 276-283

Havukkala I (1991) Trends in xylitology Trends Glycosci Glycotechnol 3 372-374

Literatura

70

Hayek S A Ibrahim SA (2013) Current limitations and challenges with lactic acid

bacteria a review Food Nutr Sci 4 73-87

Holzapfel W H Bjorkroth J A Dicks L M T (2009) Genus I Leuconostoc U Bergeys

manual of sistematic bacteriology (De Vos P Garrity G M Jones D Krieg N R

Ludwig W Rainey F A Schleifer K H Whitman W B ured) Springer New York str

624-634

Huijbregts R P de Kroon A I P de Kruijff B (2000) Topology and transport of

membrane lipids in bacteria Biochim Biophys Acta 1469 43-61

Jamur M C Oliver C (2009) Permeabilization of Cell Membranes Methods Mol Biol

588 63-66

John R P Nampoothiri K M Pandey A (2007) Fermentative production of lactic acid

from biomass an overview on process developments and future perspectives Appl Microbiol

Biotechnol 74 524-534

Kawasaki H Nakamura N Ohmori M Amari K Sakai T (1996) Screening for bacteria

producing sucrose phosphorylase and characterization of the enzymes Biosci Biotechnol

Biochem 60 319-21

Koga T Nakamura K Shirokane Y Mizusawa K Kitao S Kikuchi M (1991)

Purification and some properties of sucrose phosphorylase from Leuconostoc mesenteroides

Agric Biol Chem 55 1805-1810

Krishnan S Gowda L Karanth NG (2000) Studies on lactate dehydrogenase of

Lactobacillus plantarum spp involved in lactic acid biosynthesis using permeabilized cells

Proc Biochem 35 1191-1198

Lee JH Yoon SH Nam SH Moon YH Moon YY Kim D (2006) Molecular

cloning of a gene encoding sucrose phosphorylase from Leuconostoc mesenteroides B-1149

and the expression in Escherichia coli Enzyme Microb Technol 39 612-620

Literatura

71

Lentzen G Schwarz T (2006) Orally used compatible solute containing agents Appl

Microbiol Biotechnol 72 623-34

Mieyal JJ Abeles RH (1972) Disaccharides Phosphorylases U The Enzymes (Boyer

PD ured) Academic Press New York str 515-532

Nitta T Takenaka A Iki M Matsumura E Sakaguchi M (2007) Antitumor agents

containing α-D-glucopyranosylglycerols and food and cosmetics containing them JP patent

2007262023

Nyborg W L (2001) Biological effects of ultrasound development of safety guidelines Part

II General Review Ultrasound Med Biol 27 301-333

Pitt W G Ross S A (2003) Ultrasound increases the rate of bacterial cell growth

Biotechnol Prog 19 1038ndash1044

Polizzi KM Bommarius AS Broering JM Chaparro-Riggers JF (2007) Stability of

biocatalysts Curr Opin Chem Biol 11 220-225

Robeson JP Barletta RG Curtiss RR (1983) Expression of a Streptococcus mutans

glucosyltransferase gene in Escherichia coli J Bacteriol 153 211-221

Russell RR Mukasa H Shimamura A Ferretti JJ (1988) Streptococcus mutans gtfA

gene specifies sucrose phosphorylase Infect Immun 56 2763ndash2765

Santos H Lamosa P Faria T Q Borges N Neves C (2007) Physiology and

biochemistry of extremophiles ASM Press Washington str 86-103

Schrader A Siefken W Kueper T Breitenbach U Gatermann C Sperling G

Biernoth T Scherner C Staumlb F Wenck H Wittern K P Blatt T (2012) Effects of

glyceryl glucoside on AQP3 expression barrier function and hydration of human skin Skin

Pharmacol Physiol 25 192-199

Literatura

72

Silverstein R Voet J Reed D Abeles RH (1967) Purification and mechanism of action

of sucrose phosphorylase J BiolChem 242 1338-1346

Tsai LB Gong GS Tsao GT (1980) Sucrose phosphorylase from Clostridium

pasteurianum Abstracts of the Annual Meeting of the American Society of Microbiology

Miami Beach FL USA

Vandamme E J Loo J V Simkens E De Laporteet A (1987) Optimization of sucrose

phosphorylase production by Leuconostoc mesenteroides J Chem Tech Biofechnol 39 251-

262

van den Broek LA van Boxtel EL Kievit RP Verhoef R Beldman G Voragen AG

(2004) Physico-chemical and transglucosylation properties of recombinant sucrose

phosphorylase from Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 Appl Microbiol Biotechnol

65 219-227

Vučenović I (2018) Permeabilizacija stanica bakterije Leuconostoc mesenteroides i njihova

primjena u proizvodnji α-glukozilglicerola Prehrambeno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u

Zagrebu srpanj 2018

Weimberg R Doudoroff M (1954) Studies with three bacterial sucrose phosphorylases J

Bacteriol 68 381-388

Yoon SH Robyt JF (2003) Study of the inhibition of four α-amylase by acarbose and its

4IV-α-maltohexaosyl and 4IV-α-maltododecaosyl analogues Carbohydr Res 338 1969-

1980

Zhao W R Sheng H U Jun H Mei L (2014) Improve microorganism cell permeability

for whole-cell bioprocess methods and strategies Chin J BiotechnoL 34 125-131

Prilozi

7 PRILOZI

71 PROCJENA VRIJEDNOSTI ZA SPECIFIČNU BRZINU RASTA ()

BAKTERIJSKOG SOJA Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 TIJEKOM UZGOJA U

KEMIJSKI DJELOMIČNO DEFINIRANOJ PODLOZI PRI RAZLIČITIM

KONCENTRACIJAMA OTOPLJENOG KISIKA (MIKROAEROFILNI I AEROBNI

UVJETI UZGOJA ŠARŢNIM POSTUPKOM)

Slika 26 Grafički prikaz procjene specifične brzine rasta (micro = 0113 h-1

) tijekom

eksponencijalne faze rasta ovog soja (t = 20-50 h) pri mikroaerofilnim uvjetima

ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom

eksponencijalne faze rasta ovog soja (t = 30-60 h) pri aerobnim uvjetima

ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi

72 PROCJENA SPECIFIČNE BRZINA RASTA () BAKTERIJSKOG SOJA

Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 TIJEKOM UZGOJA U (1) KEMIJSKI

DJELOMIČNO DEFINIRANOJ HRANJIVOJ PODLOZI I (2) REAKCIJSKOJ

SMJESI SAHAROZAGLICEROL ndash KONTROLNI UZORAK

Slika 28 Grafički prikaz procjene specifične brzine rasta (micro h-1

) bakterije Leuconostoc

mesenteroides LMG 7954 pri aerobnim uvjetima tijekom eksponencijalne faze rasta u

kemijski djelomično definiranoj podlozi (eksponencijalna faza 1 t = 21-43 h micro = 0246 h-1

diams) te u smjesi saharozaglicerol (eksponencijalna faza 2 t = 53-93 h micro = 0048 h-1

) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


BAKTERIJSKOG SOJA Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 TIJEKOM UZGOJA

U (1) U KEMIJSKI DJELOMIČNO DEFINIRANOJ HRANJIVOJ PODLOZI I (2)

REAKCIJSKOJ SMJESI SAHAROZAGLICEROL TIJEKOM TRETMANA

ULTRAZVUKOM





) te u smjesi saharozaglicerol (eksponencijalna faza 2 t = 41-81 h micro = 0124 h-1

diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


Leuconostoc mesenteroides LMG 7954 TIJEKOM UZGOJA U (1) U KEMIJSKI


SMJESI SAHAROZAGLICEROL TIJEKOM TRETMANA TWEEN-OM-80 (03

VOLVOL)

Slika 30 Grafički prikaz izračuna specifične brzine rasta (micro h-1





) uz

tretman 03 (volvol) Tween-80

ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi

74 PROCJENJENA SPECIFIČNE BRZINA RASTA () BAKTERIJSKOG SOJA




VOLVOL)





) te u smjesi saharozaglicerol uz tretman 05 (volvol) Tween-80 (eksponencijalna faza 2

t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi

75 BAŢDARNI DIJAGRAMI

Slika 32 Baţdarni dijagram ovisnosti površine pika (A mV2) saharoze (tR = 461 min) o

njenoj koncentraciji (saharoza g L-1

) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi

Slika 33 Baţdarni dijagram ovisnosti površine pika (A mV2) glukoze (tR = 529 min) o

njenoj koncentraciji (glukoza g L-1

) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi

Slika 34 Baţdarni dijagram ovisnosti površine pika (A mV2) fruktoze (tR = 569 min) o

njenoj koncentraciji (fruktoza g L-1

) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi

Slika 35 Baţdarni dijagram ovisnosti površine pika (A mV2) laktata (L-enantiomer tR = 569

min diams D-enantiomer tR = 720 min ukupni laktat ) o njegovoj koncentraciji (laktat g L-

1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi

Slika 36 Baţdarni dijagram ovisnosti površine pika (A mV2) glicerola (tR = 737 min) o

njegovoj koncentraciji (glicerol g L-1

) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi

Slika 37 Baţdarni dijagram ovisnosti površine pika (A mV2) acetata (tR = 847 min) o

njegovoj koncentraciji (acetat g L-1

) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi

Slika 38 Baţdarni dijagram ovisnosti površine pika (A mV2) etanola (tR = 1126 min) o

njegovoj koncentraciji (etanol g L-1

) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI

Izjavljujem da je ovaj diplomski rad izvorni rezultat mojeg rada te da se u njegovoj izradi

nisam koristila drugim izvorima osim onih koji su u njemu navedeni

Ana-Marija Gruičić

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

PREHRAMBENO-BIOTEHNOLOŠKI FAKULTET

DIPLOMSKI RAD

Zagreb rujan 2019 Ana-Marija Gruičić

1157BPI























Diplomski rad









































Graduate Thesis





Technology
























physiology






Reviewers






Sadrţaj stranica

1 UVOD 1

2 TEORIJSKI DIO 3









31 MATERIJALI 11



313 Kemikalije 12

314 UreĎaji 14


3142 Centrifuga 14





32 METODE 17













(HPLC) 21
















SAHAROZAGLICEROL 35








5 ZAKLJUČCI 66

6 LITERATURA 68

7 PRILOZI 73















80 (03 VOLVOL) 77






Uvod

1

1 UVOD



















i c = 20 mol

L-1













Uvod

2



Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI


























Diplomski rad









































Graduate Thesis





Technology
























physiology






Reviewers






Sadrţaj stranica

1 UVOD 1

2 TEORIJSKI DIO 3









31 MATERIJALI 11



313 Kemikalije 12

314 UreĎaji 14


3142 Centrifuga 14





32 METODE 17













(HPLC) 21
















SAHAROZAGLICEROL 35








5 ZAKLJUČCI 66

6 LITERATURA 68

7 PRILOZI 73















80 (03 VOLVOL) 77






Uvod

1

1 UVOD



















i c = 20 mol

L-1













Uvod

2



Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI





















Diplomski rad









































Graduate Thesis





Technology
























physiology






Reviewers






Sadrţaj stranica

1 UVOD 1

2 TEORIJSKI DIO 3









31 MATERIJALI 11



313 Kemikalije 12

314 UreĎaji 14


3142 Centrifuga 14





32 METODE 17













(HPLC) 21
















SAHAROZAGLICEROL 35








5 ZAKLJUČCI 66

6 LITERATURA 68

7 PRILOZI 73















80 (03 VOLVOL) 77






Uvod

1

1 UVOD



















i c = 20 mol

L-1













Uvod

2



Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI


















Diplomski rad









































Graduate Thesis





Technology
























physiology






Reviewers






Sadrţaj stranica

1 UVOD 1

2 TEORIJSKI DIO 3









31 MATERIJALI 11



313 Kemikalije 12

314 UreĎaji 14


3142 Centrifuga 14





32 METODE 17













(HPLC) 21
















SAHAROZAGLICEROL 35








5 ZAKLJUČCI 66

6 LITERATURA 68

7 PRILOZI 73















80 (03 VOLVOL) 77






Uvod

1

1 UVOD



















i c = 20 mol

L-1













Uvod

2



Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI





Diplomski rad









































Graduate Thesis





Technology
























physiology






Reviewers






Sadrţaj stranica

1 UVOD 1

2 TEORIJSKI DIO 3









31 MATERIJALI 11



313 Kemikalije 12

314 UreĎaji 14


3142 Centrifuga 14





32 METODE 17













(HPLC) 21
















SAHAROZAGLICEROL 35








5 ZAKLJUČCI 66

6 LITERATURA 68

7 PRILOZI 73















80 (03 VOLVOL) 77






Uvod

1

1 UVOD



















i c = 20 mol

L-1













Uvod

2



Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI





Graduate Thesis





Technology
























physiology






Reviewers






Sadrţaj stranica

1 UVOD 1

2 TEORIJSKI DIO 3









31 MATERIJALI 11



313 Kemikalije 12

314 UreĎaji 14


3142 Centrifuga 14





32 METODE 17













(HPLC) 21
















SAHAROZAGLICEROL 35








5 ZAKLJUČCI 66

6 LITERATURA 68

7 PRILOZI 73















80 (03 VOLVOL) 77






Uvod

1

1 UVOD



















i c = 20 mol

L-1













Uvod

2



Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI




Sadrţaj stranica

1 UVOD 1

2 TEORIJSKI DIO 3









31 MATERIJALI 11



313 Kemikalije 12

314 UreĎaji 14


3142 Centrifuga 14





32 METODE 17













(HPLC) 21
















SAHAROZAGLICEROL 35








5 ZAKLJUČCI 66

6 LITERATURA 68

7 PRILOZI 73















80 (03 VOLVOL) 77






Uvod

1

1 UVOD



















i c = 20 mol

L-1













Uvod

2



Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI





(HPLC) 21
















SAHAROZAGLICEROL 35








5 ZAKLJUČCI 66

6 LITERATURA 68

7 PRILOZI 73















80 (03 VOLVOL) 77






Uvod

1

1 UVOD



















i c = 20 mol

L-1













Uvod

2



Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI











80 (03 VOLVOL) 77






Uvod

1

1 UVOD



















i c = 20 mol

L-1













Uvod

2



Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI




Uvod

1

1 UVOD



















i c = 20 mol

L-1













Uvod

2



Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI




Uvod

2



Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI




Teorijski dio

3

2 TEORIJSKI DIO











sur 2007)



















Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI




Teorijski dio

4





iili acetata i CO2


























Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI




Teorijski dio

5



2007)


























Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI




Teorijski dio

6























Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI




Teorijski dio

7














10 mol L-1


(Goedl i sur 2010)

















Teorijski dio

8













otopini















Teorijski dio

9



































Teorijski dio

10

















Eksperimentalni dio

11


31 MATERIJALI








Eksperimentalni dio

12







je u Tablici 6

313 Kemikalije



kemikalija kemijska











Eksperimentalni dio

13










kemikalija kemijska





kemikalija kemijska



Eksperimentalni dio

14

314 UreĎaji






3142 Centrifuga






Eksperimentalni dio

15








Eksperimentalni dio

16








3146 Ostala oprema









Louis SAD)



Eksperimentalni dio

17

32 METODE







sastojak γ (g L-1

) ili (mL L-1

)

pepton 100

mesni ekstrakt 100


D-glukoza 200

Tween 80 10






Eksperimentalni dio

18













sastojak γ (g L-1

)

odjeljak A

saharoza 1000



odjeljak B






Eksperimentalni dio

19























Eksperimentalni dio

20


sastojak γ (g L-1

) c (mol L-1

)

saharoza 27384 08

glicerol 18419 20







i 3252)












Eksperimentalni dio

21





























Eksperimentalni dio

22





01-06 mL min-1






















Eksperimentalni dio

23





























Eksperimentalni dio

24







otopine ( g L-1






R

br


)



octena

kiselina etanol

1 010 013 012 012 012 013 013

2 020 027 060 061 060 033 033

3 050 027 120 123 120 063 063

4 100 200 400 400 400 095 095

5 500 400 571 571 571 667 667



Eksperimentalni dio

25




saharoza 461 A = 543 181 γ + 49 437 09993

glukoza 529 A = 1 000 000 γ ndash 52 735 09997







etanol 1126 A = 379 046 γ + 31 856 09964











Eksperimentalni dio

26









[1]

(

) [2]

gdje je









27












i c = 20 mol L-1














7954









28














29








(Slika 10)








30




desna y-os)








(MRS) podlozi

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


31




desna y-

os)









0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0000

0200

0400

0600

0800

1000

1200

1400

1600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)


32






00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)


33





uvjeti uzgoja


faza rasta t (h)





















34






uvjeti uzgoja


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0113 0141


) 0103 0134



-1)








Eksperimentalni dio






(10-1



mliječne kiseline


35


















42211 i 42221)


36









mol L-1

20 mol L-1















37

















trendom (t = 235-258 h 2C)

0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2

A B C


38










7954

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


39









00

10

20

30

40

50

60

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2

A B C


40




i 29)

Smjesa



saharozaglicerol


uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0281 0124


) 0181 0074


)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


41




( = 0134-0141 h-1



42





radu



















43










(t = 00 h) do 78876 g L-1



20 mol L-1



do 98788 g L-1



do 78876 g L-1

na kraju

uzgoja

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2

A B C


44













do

136865 g L-1





do 0000 g L-1



0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2

A B C


45








vrijednosti

A Uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

07 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

17 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

37 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

41 15374 13770 0107 0135 0242 11715 0000

61 7387 6456 0107 0135 0242 0000 0000

248 11870 12909 0107 0135 0242 9516 1453

258 14600 13107 0107 0135 0242 12078 5583

B Kontrolni uzorak

t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

00 6478 6211 0107 1895 0201 0000 0672

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

242 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000


46
















47












standarda












2C)

tuzgoja (h) A (mV2)

41 1209053

61 410359

248 890013

258 786518


48














49






0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


50





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


51




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


52




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0247 0047


) 0154 0044

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


53





acetata i etanola


54








g L-1

do 73830 g L-1


do 78876 g L-1

) dok je u smjesi


do 99465 g L-1

pri kraju uzgoja (u


do 78876 g L-1

)

0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


55








184000 g L-1

do 143725 g L-1






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


56





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


ukupni

laktat

01 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

11 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

21 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

43 6699 4759 0107 4763 4869 0101 0578

63 8674 9524 0107 0135 0242 0000 0000

83 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606

93 11322 11666 0107 0135 0242 0384 0579

242 22745 19255 0107 0135 0242 0000 0606







57







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 630321

63 16660690

83 564503

93 979095

242 936261


58











0000

0050

0100

0150

0200

0250

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


59





) prikazane su po

istom principu

0000

0020

0040

0060

0080

0100

0120

0140

0160

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

OD

60

8 (

AU

)

OD

60

8 (

AU

)

t (h)

1 2


60




53-242 h)




00

10

20

30

40

50

60

70

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

300

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

pH

(-)

Θ (

degC)

t (h)

1 2


61




Smjesa





uzorak (h-1

)

suspenzija (100) 0237 0046


) 0179 0062

kontrola (h-1

)

suspenzija (100) 0246 0048


) 0222 0047


62












0000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ sah

aroza

(g L

-1)

t (h)

1 2


63






0000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

γ gli

cero

l (g

L-1

)

t (h)

1 2


64





t (h)

(g L-1

)

glukoza fruktoza

laktat


008 2478 2211 0107 0095 0201 0000 0000

108 3459 3334 0107 1265 1372 0000 0000

208 2957 2984 0107 1210 1317 0000 0000

433 6964 6818 0107 6207 6314 0215 0000

633 6436 3697 0107 0135 0242 0000 0000

733 5773 3506 0107 0135 0242 0000 0000

833 10282 6307 0107 0135 0242 0000 0000

2417 11346 10840 0107 0135 0242 0000 0591


65







53-242 h)

tuzgoja (h) A (mV2)

43 723799

63 445707

73 398401

83 809805

242 859478

Zaključci

66

5 ZAKLJUČCI






























Zaključci

67



0124 h-1












Literatura

68

6 LITERATURA












Technol 37 300-308




2704-2717





15-25

Literatura

69















129 77-86










Literatura

70






624-634




588 63-66






Biochem 60 319-21










Literatura

71







2007262023

















Literatura

72





Miami Beach FL USA



262




65 219-227



Zagrebu srpanj 2018





1980



Prilozi

7 PRILOZI







) tijekom


ln OD608 = 01125 middot t - 06532

Rsup2 = 09846

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60 70

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi


) tijekom


ln OD608 = 01408 middot t - 06265

Rsup2 = 09881

-0400

-0350

-0300

-0250

-0200

-0150

-0100

-0050

0000

00 10 20 30 40 50 60

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi










) -

kontrolni uzorak

ln OD608 = 02463 middot t - 17398

Rsup2 = 10000

ln OD608 = 00478 middot t - 17356

Rsup2 = 09558

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





ULTRAZVUKOM






diams) uz

tretman ultrazvukom

ln OD608 = 01244 middot t - 15823

Rsup2 = 09959

ln OD608 = 02814 middot t - 18173

Rsup2 = 09976

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






) uz


ln OD608 = 00474 middot t - 18426

Rsup2 = 09415

ln OD608 = 02472 middot t - 16231

Rsup2 = 09952

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi





VOLVOL)






t = 53-93 h micro = 0046 h-1

diams)

ln OD608 = 00464 middot t - 17078

Rsup2 = 09277

ln OD608 = 02365 middot t - 15967

Rsup2 = 09998

-1600

-1400

-1200

-1000

-0800

-0600

-0400

-0200

0000

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ln O

D6

08

t (h)

Prilozi




) u otopini

A = 543181 middot γ + 49437

Rsup2 = 09993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γsaharoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 52735

Rsup2 = 09997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0000 0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

A (

mV

2)

γglukoza (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 152266

Rsup2 = 09981

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γfruktoza (g L-1)

Prilozi



1) u otopini

A = 157769 middot γ - 16836

Rsup2 = 09984

A = 411185 middot γ - 55517

Rsup2 = 09977

A = 568953 middot γ - 72353

Rsup2 = 09979

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γlaktat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 1000000 middot γ - 119014

Rsup2 = 09985

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000

A (

mV

2)

γglicerol (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A= 499532 middot γ + 105410

Rsup2 = 09968

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γacetat (g L-1)

Prilozi



) u otopini

A = 379046 middot γ + 31856

Rsup2 = 09964

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0000 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

A (

mV

2)

γetanol (g L-1)

IZJAVA O IZVORNOSTI




Documents

Fiziologija heterofermentativnog soja Leuconostoc