UNIVERZITET U BEOGRADU TEHNOLOŠKO-METALURŠKI FAKULTET

Karakteristike vrsta roda Leuconostoc

– seminarski rad –

Beograd, septembar 2012

Profesor: Maja VukašinovićStudent: Slađana Davidovićbroj indeksa: 4008/2011

Sadržaj

UVOD...............................................................................................................................................3

FENOTIPSKE KARAKTERISTIKE LEUKONOSTOKA.............................................................4

Morfološke osobine....................................................................................................................4

Fiziološke osobine......................................................................................................................4

EVOLUCIJA I TAKSONOMIJA.....................................................................................................6

STANIŠTA LEUKONOSTOKA.....................................................................................................7

Zastupljenost u različitim nišama..............................................................................................7

Zastupljenost u fermentisanim proizvodima............................................................................8

Zastupljenost u mlečnim proizvodima..................................................................................9

ZDRAVLJE, BOLEST I BEZBEDNOST.......................................................................................9

Infekcija i oportunizam...............................................................................................................9

Otpornost na antibiotike...........................................................................................................10

Metaboličke aktivnosti u vezi sa zdravljem...........................................................................10

RAST LEUKONOSTOKA............................................................................................................11

Uzgajanje, održavanje i čuvanje kultura................................................................................11

Medijumi za izolovanje i prebrojavanje..............................................................................11

Održavanje (čuvanje) kultura..............................................................................................12

Industrijska proizvodnja...........................................................................................................13

Učešće leukonostoka u mikrobnim interakcijama................................................................13

Reakcije ko-agregacije.........................................................................................................13

Rast i metabolizam leukonostoka u kulturama mešanih sojeva.....................................14

Krajnji proizvodi metabolizma i njihov uticaj na bakterijski rast......................................15

Bakteriofagi mlečnih leukonostoka.....................................................................................15

Bakteriocini koje proizvode mlečni leukonostoci..............................................................15

PREŽIVLJAVANJE U STRESNIM USLOVIMA........................................................................16

METABOLIZAM............................................................................................................................17

ULOGE U TEHNOLOGIJI...........................................................................................................20

Uloge u tehnologiji mlečnih proizvoda...................................................................................20

Formiranje rupa u siru..........................................................................................................20

Proizvodnja arome................................................................................................................21

Ciljano dodavanje leukonostoka kao NSLAB....................................................................21

Uloge u funkcionalnoj hrani.....................................................................................................23

1

Leuconostoc kao potencijalni probiotik..............................................................................23

Proizvodnja polisaharida......................................................................................................23

Proizvodnja manitola............................................................................................................24

Hidroliza α-galaktozida.........................................................................................................24

Proizvodnja vitamina............................................................................................................24

ZAKLJUČAK..................................................................................................................................24

Reference......................................................................................................................................26

2

UVOD

Sojevi koji pripadaju rodu Leuconostoc su Gram-pozitivne mlečno kiselinske bakterije (LAB, engl. lactic acid bacteria) od ekonomskog značaja jer su povezane sa brojnim pozitivnim aspektima:

Fermentacija hrane (kiseli kupus, kiseli krastavci, mesni proizvodi, itd.). Proizvodnja gasa (CO2) kod sireva (posebno kod plavih sireva). Proizvodnja jedinjenja koja daju aromu kod raznih mlečnih proizvoda. In situ proizvodnja dekstrana kod mlečnih proizvoda koji sadrže saharozu,

ili proizvodnja dekstrana kao polimera visoke vrednosti za industrijsku ili kliničku upotrebu, ili kao biološki (sporedni) pomoćni proizvod u naftnoj industriji.

Potencijalna uloga u prehrambenoj industriji kao funkcionalna hrana.

Sojevi Leuconostoc takođe su poznati i sa nekoliko negativnih aspekata, među kojima su najznačajniji kvarenje u industriji šećerne trske i kvarenje prehrambenih proizvoda povezano sa formiranjem sluzi. Neki sojevi su takođe bili identifikovani u humanim kliničkim izolatima, gde je utvrđeno da mogu narišiti zdravlje. Međutim, sve u svemu, iz čitave istorije ljudske izloženosti i potrošnje, dolazi se do zaključka da je Leuconostoc. mikroorganizam koji se generalno može smatrati bezbednim.

U tehnologiji mlečnih proizvoda itekako je shvaćen značaj sojeva Leuconostoc, iako su njihova genetika i fiziologija slabije ispitani nego genetika i fiziologija Lactococcus. Sojevi Leuconostoc su često zastupljeni u mlečnim starter kulturama, kao i u mlečnim sredinama i zato se mogu smatrati za ne-startne mlečno kiselinske bakterije (NSLAB, engl. non-starter lactic acid bacteria). Njihova uloga je esencijalna u formiranju arome i strukture (teksture) određenih mlečnih proizvoda.

3

FENOTIPSKE KARAKTERISTIKE LEUKONOSTOKA

Morfološke osobine

Vrste roda Leuconostoc su nepokretne koke koje ne formiraju spore. Ćelije su Gram-pozitivne, elipsoidnog do sfernog oblika, često izdužene (posebno ako se gaje na medijumu sa glukozom); obično rastu u parovima, mada mogu biti i pojedinačne, a takođe formiraju lance kratke do srednje dužine. Većina sojeva obrazuje kokoidne ćelije kad se gaje u mleku. Kada se gaje na čvrstoj podlozi, ćelije su izdužene i mogu se pomešati sa štapićima. Formiraju sitne, ravni kolonije, sive boje. Ne obrazuju prave ćelijske kapsule. Određeni sojevi Leuconostoc mesenteroides produkuju ekstracelularne dekstrane koji obrazuju omotač na površini ćelije.

Fiziološke osobine

Vrste roda Leuconostoc su hemo-organotrofne, fakultativno anaerobne, katalaza-negativne, nemaju citohrome. To su neproteolitički i nehemolitički organizmi, koji ne redukuju nitrate. Ne hidrolizuju arginin i obično ne zakišeljavaju i ne zgrušavaju mleko. Mogu da rastu na pH 4.5, ali nema acidofilnih vrsta i preferiraju početni pH podloge 6.5. Optimalna temperatura za rast je između 20 i 30 oC, ali rast može da se javi i na 5 oC. Rastu u bogatom medijumu sa faktorima rasta i aminokiselinama. Sve vrste za rast zahtevaju nikotinsku kiselinu, tiamin, biotin i pantotensku kiselinu ili njene derivate. Kobalamin i p-aminobenzoeva kiselina nisu neophodni. Rast u bujonu je stimulisan dodatkom 0.05% cistein-HCl.

Leukonostoci su heterofermentativne LAB. Fermentišu glukozu do ekvimolarnih količina D-mlečne kiseline, ugljen-dioksida i etanola ili acetata kombinacijom heksozo-monofosfatnog i fosfoketolaznog metaboličkog puta. Nemaju fruktozo-1,6-difosfat aldolazu. Sve vrste poseduju aktivnu glukozo-6-fosfat dehidrogenazu. Ugljen-dioksid i ribulozo 5-fosfat nastaju od glukoze. Ksilulozo-5-fosfoketolaza konvertuje fermentabilne šećere u etanol i D-mlečnu kiselinu. Neki sojevi mogu da produkuju i acetat umesto etanola kada se gaje u prisustvu kiseonika. U prisustvu fermentabilnih šećera neki sojevi dekarboksiluju L-malat do L+laktata. Polisaharidi i alkoholi, osim manitola, se ne metabolišu. Poseduju NAD-zavisnu glukozo-6-fosfat dehidrogenazu.

Aminokiseline koje ulaze u sastav peptidnog mosta peptidoglikana ćelijskog zida su alanin, serin i lizin.

Fenotipske karakteristike leukonostoka date su u tabeli 1.

4

5

6

Tab

ela

1. F

eno

tipsk

e k

ara

kter

istik

e Le

uco

nost

oc v

rsta

EVOLUCIJA I TAKSONOMIJA

Fenotipske karakteristike su dugo vremena korišćene za izolovanje i karakterisanje leukonostoka i, ponekad, da se napravi razlika među vrstama ili podvrstama. Pošto je teško da se nedvosmisleno identifikuju vrste ili podvrste pomoću ovih klasičnih metoda, nove molekularne tehnike omogućavaju pouzdanu i doslednu identifikaciju, uključujući i vrste roda Leuconostoc. Ove tehnike se koriste pojedinačno ili se međusobno kombinuju za procenjivanje molekulskog diverziteta i/ili identifikaciju vrsta ili podvrsta

Na osnovu filogenetske analize 16S rRNA, rod Leuconostoc pripada porodici Leuconostocaceae, zajedno sa rodovima Oenococcus i Weissella, u okviru reda Lactobacillales.

Grupa Leuconostoc je podeljena u tri zasebne evolutivne linije: Leuconostoc sensu stricto, Leuconostoc paramesenteroides, i Leuconostoc oenos. Leuconostoc paramesenteroides je reklasifikovan kao Weissella paramesenteroides, a Leuconostoc oenos kao Oenococcus oeni.

Leuconostoc sensu stricto vrste Leuconostoc argentinum, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides (subsp. cremoris, subsp. dextranicum i subsp. mesenteroides), i Leuconostoc pseudomesenteroides) pokazuju 97.1–99.5% sličnosti sekvence 16S rRNA. Leuconostoc fallax imaju 94–95% 16S rRNA sličnosti sa nabrojanim vrstama.

Leuconostoc sensu stricto linija je dalje podeljena na tri evolutivne grane uključujući Leuconostoc carnosum, Leuconostoc gasicomitatum i Leuconostoc gelidum u prvoj grani, Leuconostoc citreum i Leuconostoc lactis u drugoj i u trećoj – Leuconostoc mesenteroides i Leuconostoc pseudomesenteroides. Leuconostoc argentinum je pridružen grani Leuconostoc citreum - Leuconostoc lactis.

Iako su molekularne metode korisne za taksonomiju i filogeniju sojeva, fenotipske karakteristike imaju predominantnu ulogu u nauci o hrani. Zanimanje za sojeve od interesa za čoveka često se dovodi u vezu sa bar jednom važnom osobinom i razumevanje odnosa koji postoji između genotipa i fenotipa predstavlja veliki izazov.

Tako su sojevi Leuconostoc fallax okarakterisani pomoću metoda zasnovanih na DNA, ali ovi sojevi se takođe mogu razlikovati od Leuconostoc mesenteroides pomoću malat-laktat reakcije koja ne postoji kod Leuconostoc fallax ali postoji kod

7

ovog drugog. Ovim su naglašeni značaj i jednostavnost fenotipskog razlikovanja, koji bi se mogli koristiti rutinski i pre primene molekularnih tehnika, npr. potrošnja arabinoze, rafinoze i fruktoze, rezistencija na vankomicin, proizvodnja CO2 i dekstrana, ili potrošnja citrata. Na isti način sposobnost koncentrovanih neproliferišućih ćelija leukonostoka da zakisele mleko varira od pH 6.5 do 4.1 i dozvoljava razlikovanje između 107 sojeva testiranih za primenu u mlečnoj industriji. Slično tome, jedna studija predlaže karakterizaciju LAB sojeva na osnovu neutralnih jedinjenja koje proizvode u surutki. Neke alatke koje nisu pogodne za karakterizaciju vrsta mogu, međutim, biti upotrebljene da bi se opisala redukovana grupa sojeva, npr. plazmidni profil i fermentacija ugljenih hidrata da bi se razlikovali fiziološki slični sojevi koji proizvode dekstran ili npr. metabolizam citrata, šema fermentacije ugljenih hidrata i peptidazna aktivnost da bi se odvojili mlečni sojevi za tehnološke primene.

STANIŠTA LEUKONOSTOKA

Zastupljenost u različitim nišama

Leukonostoci su obligatno fermentativni hemo-organotrofni organizmi. Probirljivi su u pogledu nutritivnih zahteva i dele mnoga staništa sa drugim LAB, posebno sa laktobacilima, pediokokama i karnobakterijama, kako prirodna, tako i ona nastala delovanjem ljudskog faktora.

Sojevi leukonostoka prisutni u mnogim okruženjima vode poreklo sa zelene vegetacije i korenja koji predstavljaju njihovu prirodnu ekološku nišu, iako je njihova populacija često mala (manje od 1%) u poređenju sa populacijama aerobnih bakterija i kvasaca. Iz ovog prirodnog staništa lako se šire po raznim nišama kao što su biljni materijal, koga čine povrće i silaža i fermentisani prehrambeni proizvodi poreklom od različitih sirovih materijala. Njihovo prisustvo u mleku i, shodno tome, u mlečnim proizvodima dešava se zbog kontaminacije tokom muže i/ili tokom proizvodnje (prerade), što je još i pojačano njihovom jedinstvenom osobinom da dugo vremena preživljavaju na površinama materijala kao što su drvene posude i kalupi, a preživljavaju i pasterizaciju

Podaci o povezanosti čoveka i životinja sa vrstama roda Leuconostoc su relativno retki. Obično se ne smatraju sastojkom humane flore, iako postoje sojevi koji su izolovani iz ljudskog fecesa, uzoraka vaginalnog sekreta i mleka, kao i iz telesnih tečnosti (krvi, urina i cerebrospinalne tečnosti) pacijenata. U tankom i debelom crevu broj leukonostoka može da dostigne oko 105/g. Iz kliničkih uzoraka izolovane su vrste rezistentne na vankomicin. Leukonostoci su takođe izolovani iz mikroflore stoke, ribe, insekata, kao i iz nekih drugih sredina kao što su ostaci tretirane rude boksita.

8

Leuconostoc su jedna od prvih proučavanih bakterijskih grupa, zbog njihovog udela u komercijalnim gubicima u industriji šećera. Takođe se dovode u vezu sa kvarenjem ribe i mesnih proizvoda. Vrste roda Leuconostoc su povezane sa širokim spektrom mesnih proizvoda, uključujući sveže i vakuum-pakovano meso, živinu, mesne prerađevine i fermentisane mesne proizvode. Poznato je da Leuconostoc carnosum, Leuconostoc gasicomitatum i Leuconostoc gelidum uzrokuju kvarenje određenih mesnih proizvoda. U nekoliko slučajeva Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides i Leuconostoc citreum bili su uzročnici kvarenja hladno dimljenog lososa ili pastrmke. Leuconostoc citreum je izolovan iz fermentisanih ribljih proizvoda sa niskim sadržajem soli.

Zastupljenost u fermentisanim proizvodima

LAB, uključujući Leuconostoc, igraju važnu ulogu u fermentaciji različitih prehrambenih proizvoda. Izvor bakterija može biti ili sirovi materijal, kao npr. za proizvodnju sireva od sirovog mleka, ili za kiseli kupus i neke fermentisane kobasice, ili se kao izvor bakterija mogu koristiti komercijalne starter kulture. Prvi postupak često se primenjuje za kišeljenje u privatnim domaćinstvima, kao i za proizvodnju nekih neindustrijskih, sireva gde se inokulum održava tako što se čuva uzorak prethodnog proizvoda, tzv. tehnika "staro-mlado".

Tokom fermentacije, krajnji proizvodi metabolizma ugljenih hidrata doprinose ne samo očuvanju kvaliteta proizvoda (zahvaljući zakišeljavanju, čime se i sprečava kvarenje proizvoda), već daju i aromu i teksturu proizvodu. Fermentacija takođe može da poveća nutritivnu vrednost hrane na taj način što joj povećava svarljivost, što se dešava u fermentaciji mleka do sira, ili pak tako što smanjuje njenu toksičnost.

Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides igra značajnu ulogu u fermentaciji povrća, kao što su kiseli kupus i krastavci. Iako nije dominantna vrsta, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides inicira fermentaciju kupusa, nakon čega ulogu preuzimaju laktobacili koji su tolerantniji prema kiselom pH. Osim ove vrste, u početnim fazama je uključen i Leuconostoc fallax. Krajnje pH od 3.5 je postignuto tokom fermentacije soka od kupusa, sa mlečnom i sirćetnom kiselinom i manitolom, kao glavnim krajnjim produktima fermentacije. Leuconostoc citreum, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc kimchi, i Leuconostoc mesenteroides dominiraju u početnim stupnjevima fermentacije kimhija, korejskog tradicionalnog jela koje se priprema od kineskog kupusa, rotkvica i krastavca.

Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides i subsp. dextranicum su povezani sa fermentisanim proizvodima na bazi žitarica. Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum ima ulogu u fermentaciji kiselog testa. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides je nađen u kiselim hlebovima

9

sa kvascem i raznim proizvodima nalik na palačinke; prisutan je takođe u velikom broju u proizvodima od povrća i proizvodima na bazi skroba, a učestvuje i u fermentaciju zrna kafe.

Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides je takođe nađen i u šećernoj trsci, gde produkuje polisaharide i uzrokuje zakišeljavanje.

Zastupljenost u mlečnim proizvodima

Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris i Leuconostoc lactis se koriste kao starter kulture u proizvodnji pavlake, maslaca, krem-sira, tvrdih sireva (Gauda i Edam). Takođe, koriste se i u formulisanim starter kulturama za proizvodnju kefira. Leuconostoc argentinum je izolovan iz argentinskog sirovog mleka.

Prisustvo leukonostoka u mnogim vrstama sira i bez dodavanja starter kulture, je često i uobičajeno, naročito kod sireva koji se prave od sirovog mleka. U jednoj studiji, među 4379 uzoraka iz 35 različitih evropskih mlečnih proizvoda uključujući 24 vrste neindustrijskih sireva, 10% sojeva su činili leukonostoci.

Leukonostok je prisutan u raznim oblicima fermentisanih mlečnih proizvoda. Takođe predstavlja komponentu kefirne kulture doprinoseći, ne baš toliko kao kvasci, proizvodnji etanola i acetata, koji su karakteristični za ovaj proizvod.

ZDRAVLJE, BOLEST I BEZBEDNOST

Brojni klinički izveštaji ukazuju na povezanost LAB (uključujući leukonostok) sa infekcijama. Pažnja je takođe posvećena enzimskoj aktivnosti koja se odnosi na proizvodnju potencijalno štetnih supstanci.

Infekcija i oportunizam

Najpre se smatralo da leukonostok nije od kliničkog značaja, jer nije bio specifično detektovan, zatim se polako pojavljuje kao oportunistički patogen, sve dok nije prvi put zabeleženo bakterijsko oboljenje uzrokovano leukonostokom 1985. Od tada je zabeleženo manje od 100 slučajeva i to su uglavnom bili odrasli ljudi sa ugroženim/opalim imunitetom mada je zabeležen i kod jako malog broja zdravih osoba (bez neke druge infekcije). Podložnost ovoj bakteriji veoma pokazuju ljudi koji koriste venske katetere i druge invazivne naprave koje ulaze u telo (kod traheotomije, gastrostomije ili endotrahealne cevi) kao i ljudi koji su uzimali antibiotike. Klinički, leukonostok uzrokuje primarno bakterijska oboljenja, plućne infekcije,

10

infekcije peritonealne tečnosti, endokarditis, meningitis, osteomijelitis, ventrikulitis, apsces i septikemiju. Mnogi sojevi pripadaju vrsti Leuconostoc mesenteroides, izolat Leuconostoc lactis je redak, iako najveći broj vrsta izuzev Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris mogu da žive na 37 stepeni.

Poreklo ovih infekcija ostaje nepoznato, mnoge se "zakače" u bolnici. Detektovane su da žive na koži čoveka kao normalna flora kože i odatle se čovek može i zaraziti, takođe se može zaraziti tako što uđu u krvotok putem gastrointestinalnog trakta. Vredi napomenuti da tretman vankomicinom može dati leukonostoku selektivnu prednost u određenoj ekološkoj niši jer će vankomicin uništiti bakterije koje bi normalno inhibirale njegov rast, što omogućava leukonostoku da se deli i uzrokuje bolest.

Otpornost na antibiotike

Konvergentne studije o osetljivosti na antibiotike mlečnih ili humanih kliničkih izolata sojeva Leuconostoc pokazale su da su oni, pored vankomicina, otporni i na fosfomicin, "stare" hinoline i glikopeptide. Oni su osetljivi ili pokazuju srednju osetljivost na makrolide i tetracikline.

Upotreba komercijalnih starter kultura bakterija u proizvodnji mlečnih proizvoda mogla bi da predstavlja potencijalni rizik za širenje gena koji imaju rezistenciju na antimikrobne agense; korišćenje antibiotika u uzgoju životinja, biljaka ili industrijskim procesima može da doprinese pojavi rezistencije na antibiotike i među humanim izolatima; leukonostok je poznat kao oportunistički patogen i antibiotik-rezistentni sojevi izolovani su sa više mesta infekcija.

Metaboličke aktivnosti u vezi sa zdravljem

Hidroliza soli žučnih kiselina je zavisna od dejstva crevnih bakterija na telesne sekrete. Ova reakcija olakšava ekskreciju, izlučivanje žučnih soli ali takođe može biti uključena u razne bolesti. Hidrolazna aktivnost žučnih soli je odsutna kod sojeva Leuconostoc mesenteroides.

Biogeni amini su organske baze koje ukazuju na trovanje hranom uglavnom usled konzumiranja različite vrste hrane, uključujući sir, meso i proizvode od ribe, kao i crveno vino. Ovi biogeni amini se u najvećoj meri sintetišu dekarboksilacijom aminokiselina i to dejstvom bakterija. Proizvodnja biogenih amina kod leukonostoka nikada nije zabeležena, tako da su sojevi Leuconostoc prvoklasni sastojci starter kultura koje se koriste u mlečnoj industriji.

Leuconostoc proizvodi D-laktat iz metabolizma ugljenih hidrata, baš kao i Lactobacillus delbrueckii. Odrasli ljudi metabolišu D-laktat sporo tako da

11

preporučen dnevni unos ne bi trebalo da premaši 100 mg/kg telesne mase. Ni D- niti D/L laktat ne treba da se nalaze u hrani za decu, osim u terapeutske svrhe. Normalno konzumiranje mlečnih proizvoda neće dovesti do viška D-laktata.

RAST LEUKONOSTOKA

Uzgajanje, održavanje i čuvanje kultura

Medijumi za izolovanje i prebrojavanje

Gajenje leukonostoka se može ostvariti korišćenjem bogatih tečnih podloga i selektivnih ili neselektivnih medijuma, u zavisnosti od toga šta je potrebno – da li treba izolovati pojedinačan rod iz smeše mikroorganizama ili treba održavati izolate u kulturi.

Različite podloge koje zadovoljavaju opšte zahteve u ishrani leukonostoka normalno dozvoljavaju njegovu brzu regeneraciju, bez potpune inhibicije ostalih grupa. Najčešće su APT, Briggs, MRS, La i BHIYE. Zbog njihove niske selektivnosti primena im je ograničena na skupine kojima dominira jedan tip ili grupa organizama. Selektivne podloge, koje sadrže jedan ili više restriktivnih faktora, i koje još uvek omogućavaju rast leukonostoka, ali inhibiraju nepoželjne bakterijske grupe u mešanoj populaciji, se preporučuju za upotrebu. Međutim, još uvek ne postoji potpuno efikasna podloga. Većina selektivnih podloga koje se baziraju na sposobnosti organizma da metaboliše/koristi citrat su se pokazale nezadovoljavajućim jer mnogi organizmi u istom staništu (npr. Lactobacillus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis) takođe metabolišu citrat, a s druge strane postoje i sojevi Leuconostoc koji ne koriste citrat. Takođe je uzeta u obzir njihova sklonost ka kiselom kao i preferiranje mikroaerofilnih do anaerobnih uslova za život. Korišćeni su sledeći inhibitorni faktori, pojedinačno ili u kombinacijama: kalijum-sorbat (MRSS pH 5.7), talijum-acetat (MRST pH 6.5), natrijum-azid (MSE), antibiotici kao što su vankomicin ili tetraciklin.

Uobičajena podloga za uzgoj čistih sojeva Leuconostoc jeste klasična MRS podloga, modifikovana ili ne, izostavljanjem citrata i mesnog ekstrakta. Formulisane su podloge za fiziološka ispitivanja šeme fermentacije šećera, proizvodnje gasa, stvaranja dekstrana, degradacije citrata i ostalog. Takođe je razrađena i hemijski definisana podloga koja ispunjava nutricione zahteve velikog broja reprezentativnih sojeva leukonostoka sadrži laktozu, Mn2+, Mg2+, 12 aminokiselina, 8 vitamina, adenin, uracil i Tween 80. Omogućava brz i masivan rast, u poređenju sa rastom na složenoj podlozi i pogodna je za selektivno izolovanje i određivanje broja leukonostoka iz mešanih starter-kultura.

12

Kada su istovremeno prisustne kulture Leuconostoc i Lactococcus, tada postaje još jednostavnije identifikovati Leuconostoc na podlozi MRS koja sadrži vankomicin 30 mg/mL, jer Lactococcus biva inhibiran nižim koncentracijama. M17 podloga koja sadrži 5% glukoze takođe može da se koristi jer će Lactococcus dati kolonije dobre veličine posle 24 h, dok je leukonostoku za formiranje takvih kolonija potrebno 48 h. Nasuprot tome, kada se u M17 doda 5% saharoza, formiranje sluzi omogućava detekciju kolonija leukonostoka znatno pre nego kolonija laktokoka. Čak štaviše, ova podloga obogaćena saharozom omogućava bržu detekciju leukonostoka nego MRS obogaćen vankomicinom ili MSE podloga, koja takođe sadrži saharozu ali usporava rast, verovatno zbog prisustva natrijum-azida (0,075%). β-galaktozidaza (β-gal) pozitivni sojevi Leuconostoc koji rastu kao plave kolonije mogu da se razlikuju od sojeva Lactococcus koji su β-gal negativni na MRS agar podlogama sa 5-bromo-4-hloro-3-indolil-β-d-galaktopiranozidom. Ovo je takođe zgodno i za razlikovanje između β-gal-pozitivnih i β-gal-negativnih Leuconostoc izolata. U prisustvu vankomicin rezistentnih Lactobacillus sojeva treba da se koristi LUSM podloga koja sadrži vankomici, tetraciklin i sok od paradajza.

Većina leukonostokasu relativno neosetljivi na kiseonik, iako se bolji rast često zapaža u redukovanoj atmosferi. Preferiraju mikroaerofilne do anaerobne uslove. Inkubacija u prisustvu N2, H2 ili CO2, ili uz neki komercijalni kit koji generiše anaerobni gas je preporučljivo.

Sojevi Leuconostoc rastu na 30oC, optimalna temperatura je od 20-30 oC. Najveći broj sojeva dobro raste na 10 oC, sa minimalnom temperaturom za većinu vrsta 5oC. Zabeležen je međutim rast i na 1 oC za sojeve Leuconostoc gelidum i Leuconostoc carnosum i na 4 °C kod sojeva Leuconostoc gasicomitatum. Sve tri vrste vode poreklo iz mesnih proizvoda pakovanih u modifikovanoj atmosferi i čuvanih na hladnom. Nasuprot tome neki sojevi su opisani kao termodurni jer preživljavaju pasterizaciju, zadržavaju se na alatu kojim se radi sa mlekom, pa može doći do kontaminacije.

Održavanje (čuvanje) kultura

Za kratkoročno održavanje, sojevi mlečnih leukonostoka se mogu čuvati kao ubodne kulture u MRS medijumu (1% w/v agara) na 4 °C u trajanju od 1 – 2 nedelje. Alternativno, kulture se mogu skladištiti u lakmus mleku obogaćenim sa 5% ekstrakta kvasca i 5% glukoze ili u MRS bujonu koji sadrži 1% laktoze i 10% glicerola kao zaštitnog agensa u trajanju od 6 meseci do godinu dana na -20 °C, ili u dužem periodu na -80°C. Najbolji rezultati se dobijaju kada se sojevi gaje u bogatom medijumu, koji se zatim ukloni centrifugiranjem, a ćelije se isperu fosfatnim puferom, resuspenduju u svežoj podlozi sa 10 – 15% sterilnog glicerola i rasporede u male kriotube pre zamrzavanja. Liofilizacija mlečnih leukonostoka u

13

prisustvu sterilnog obranog mleka obogaćenog sa 4% laktoze rezultuje dugotrajnim preživljavanjem i zadržavanjem metaboličkih karakteristika i do nekoliko godina.

Industrijska proizvodnja

S obzirom da su složene laboratorijske podloge često preskupe, nisu pogodne za industrijsku proizvodnju. Zato se druge podloge koriste u industriji i njihov sastav često nije dostupan (vlasničke procedure). Koriste se podloge zasnovane na papain-hidrolizovanom kazeinu ili mleku ili surutki. Pogodan je takođe i medijum koji se upotrebljava za Lactococcus (1,4% ekstrakt kvasca, 4% tripton, 9% laktoza). Sve ove podloge mogu da se koriste u bač kulturama pod regulisanim pH uslovima (često pH 6.5) i kontrolisanim parametrima. Upotrebom laktoze umesto glukoze izbegava se razvoj laktoza-negativnih mikroorganizama. Međutim, dobijeni su niski prinosi (max 5x109 ćelija/ml) u poređenju sa prinosima kod Lactococcus i Lactobacillus pod istim uslovima.

Vrsta centrifuge koja je korišćena za koncentrovanje ćelija nije uticala na viabilnost, međutim kontinualni proces smrzavanja i sušenja je imao negativne posledice (-33%) u poređenju sa bač laboratorijskim.

Testirana je Proizvodnja mešanih kultura sa sojevima Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris i Lactobacillus rhamnosus, na komercijalnim starter podlogama. Temperatura inkubacije ima uticaj na odnose između populacija, zakišeljavanje i proizvodnju arome (ukusa i mirisa).

Učešće leukonostoka u mikrobnim interakcijama

Mezofilni LAB starteri koji se koriste u mlečnoj industriji predstavljaju mešavine rodova, vrsta, sojeva. Zbog toga njihov sastav nije uvek poznat, naročito u slučajevima prirodnih startera. Pored toga, mikrobne interakcije, bilo da su kooperativnog ili inhibitornog tipa mogu dovesti do nekontrolisanih promena u starteru. Pozitivne interakcije mogu dovesti do boljeg rasta ili bolje proizvodnje metabolita. Interakcije su ili direktne, uključujući fizički kontakt individua, ili indirektne, usled modifikacija supstrata ili promena parametara medijuma. Negativne interakcije mogu biti direktne i uključuju fage ili mogu takođe biti indirektne a tiču se toksičnih metabolita (bakteriocina), kompeticije za potrošnju supstrata, i akumulacije katabolita.

Reakcije ko-agregacije

Ispostavilo se da ekstracelularni materijal izolovan iz Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum 663 fizički interaguje sa ćelijama laktokoka uzrokujući ko-agregaciju. Ovo bi moglo da olakša interakcije između rodova tokom procesa

14

proizvodnje sira.Rast i metabolizam leukonostoka u kulturama mešanih sojeva

Sojevi Leuconostoc rastu asocijativno sa laktokokama koje proizvode kiselinu i taj njihov asocijativni rast je proučavan u odnosu na metabolizam citrata i stvaranje arome. Ovaj asocijativni rast je opisan kao sinergistički funkcionalni odnos (veza). Leukonostok metaboliše citrat u pH opsegu od 6.3 do 4.5, a diacetil i acetoin se proizvode samo pri kiselom pH. Stoga, da bi se inicirao metabolizam citrata i da bi nastala jedinjenja koja daju aromu, neophodno je da Lactococcus lactis proizvede dovoljno kiseline da bi se spustila pH vrednost mleka.

Manje pažnje je posvećeno stopi rasta, proizvodnji kiseline i finalnoj biomasi ovih bakterija, koji takođe odražavaju interakcije u kulturama mešanih sojeva Leuconostoc i Lactococcus. Rast leukonostoka je bio ili nepromenjen ili inhibiran tokom eksponencijalne faze i bio je sistematski inhibiran u stacionarnoj fazi. Inhibicija se uglavnom suprimira dodatkom peptida ili aminokiselina, što ukazuje na to da je kompeticija za azotne nutrijente jedna opšta osobina kod kultura mešanih sojeva Leuconostoc i Lactococcus u mleku. Vredi napomenuti da je u ograničavajuće niskim ili preterano visokim koncentracijama azotnih nutrijenata Leuconostoc mesenteroides bio uvek u nepovoljnom položaju u odnosu na Lactococcus lactis. Nasuprot tome, poboljšan maksimalni rast Leuconostoc lactis CNRZ 1091 u kulturama mešanih sojeva sa Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2 u mleku prikazuje bakterijsku kooperaciju između dve vrste. Različiti tipovi interakcija se mogu dešavati u zavisnosti od upotrebljenih sojeva u asocijativnom rastu u mleku, ali takođe i u zavisnosti od temperature na kojoj rastu. Ujednačen rast vrsta dešava se tokom inkubacije između 21 i 25 oC. Na temperaturama preko 25 oC odnos zastupljenosti bakterijskih vrsta je pomeren ka metabolički aktivnijem Lactococcus lactis, koji ima veću stopu rasta na višoj temperaturi (između 25 i 32 oC) u odnosu na Leuconostoc. Razlike u šemi rasta različitih sojeva koji čine strartere sa mešanim sojevima mogu dovesti do neizbežnih i značajnih promena u njegovom sastavu u prilično kratkom periodu kultivacije. Dalje, u komercijalnim koncentratima mešanih kultura koje sadrže bakterije-proizvođače kiseline i Leuconostoc koji proizvodi aromu, zastupljenost leukonostoka kreće se između 5% i 10% ukupne kulture. Tako da se upotrebom koncentrata sa sojem Leuconostoc može izbeći nebalansiranost populacije i brza predominacija Lactococcus lactis nad Leuconostoc.

Iako bi acetaldehid (100 mg/L) mogao da poveća proizvodnju acetoina i diacetila, kao i da poveća rast leukonostoka, normalne koncentracije acetaldehida proizvedene od strane mezofilnih kultura (3-8 mg/L) nisu dovoljne da stimulišu njegov rast u mešanim starter kulturama.

NSLAB mogu takođe da utiču na ponašanje leukonostoka u mlečnoj tehnologiji.

15

Devoyod i Poullain (1988) su zabeležili stimulatorno dejstvo enterokoka i kvasaca na rast leukonostoka i proizvodnju gasa tokom proizvodnje aminokiselina i peptida iz degradacije kazeina.

Krajnji proizvodi metabolizma i njihov uticaj na bakterijski rast

Mehanizam pomoću koga Leuconostoc inhibira bakterijski rast LAB-a, kao i patogenih sojeva, pripisuje se degradacionim proizvodima metabolizma ugljenih hidrata i citrata. Antimikrobni efekti organskih kiselina, uključujući mlečnu i sirćetnu kiselinu, se ispoljavaju dejstvom na ćelisku membranu, menjajući njene osobine kao što su membranski potencijal i ćelijski integritet. Antibakterijske osobine diacetila i etanola takođe su opisane, iako su njihovi efekti blagi kod običnih mlečnih fermentacija. U prisustvu kiseonika Leuconostoc akumulira vodonik peroksid koji može biti inhibitoran za neke mikroorganizme.

Bakteriofagi mlečnih leukonostoka

Spor rast sojeva Leuconostoc u mešovitim starter kulturama možda bi mogao da bude posledica poteškoća u prepoznavanju bakteriofaga u fermentacijama u kojima je proizvodnja kiseline normalna. Međutim, ipak su izolovani fagi koji napadaju Leuconostoc, iz mlečnih proizvoda (uzoraka surutke, sira, itd). Okarakterisani su i ustanovljeno je da pripadaju familiji Siphoviridae.

Bakteriocini koje proizvode mlečni leukonostoci

Bakteriocini su heterogena grupa proteina ili peptida sa antibakterijskim delovanjem na ograničen spektar bakterija, koje su u bliskoj vezi sa sojem koji ih produkuje. Klasičan bakteriocin LAB je nisin A, koga produkuje Lactococcus lactis subsp. lactis.

Nekoliko sojeva Leuconostoc produkuje bakteriocine, uključujući Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, koji, produkuje mezentericin Y105, zatim Leuconostoc gelidum – leukocin A-VAL 187, Leuconostoc camosum – karnozin 44A, Leuconostoc paramesenteroides – leukonocin S. Bakteriocini produkovani od strane leukonostoka mogu, a ne moraju biti aktivni prema drugim LAB, ali svi u svom spektru dejstva uključuju Listeria spp.

Postoje dva moguća načina za eksploataciju antagonističke aktivnosti leukonostoka u prehrambenim proizvodima. Prvi, tradicionalni način je da se proizvedeni bakteriocini dodaju u hranu. Ovo je uspešno iskorišćeno sa nisinom, posebno u mlečnim proizvodima. Problem je što je nisin slabo rastvorljiv i nestabilan na pH > 5; zato ovaj način ima ograničenu primenu. Ovo ograničenje podstaklo je potražnju za drugim bakteriocinima.

16

Alternativni pristup konzerviranju hrane bakteriocinima je dodavanje u hranu organizama koji produkuju ih produkuju. Njegova primena zavisi od kompatibilnosti fermentisanog proizvoda sa tim organizmima. Leukonostoci su heterofermentativne LAB koje produkuju značajne količine CO2 tokom fermentacije ugljenih hidrata, što može predstavljati problem kod proizvoda koji su spakovani u hermetički zatvorenu ambalažu. Međutim, Leuconostoc spp. se koriste kao starteri u mnogim mlečnim proizvodima. Bakteriocini koje produkuju imaju izraženu anti-listerijalnu aktivnost, što bi moglo da bude glavni razlog za korišćenje ovog načina konzervisanja hrane.

Iako su bakteriocini koje proizvodi Leuconostoc mlečnog porekla (konkretno mezentericin Y105) bili ispitivani zarad njihove moguće upotrebe kao konzervanasa u hrani, nema pisanih podataka da su stavljani u hranu bilo producenti bakteriocina, bilo bakteriocini iz Leuconostoc. Zapravo, bakteriocini bi mogli da se koriste u sklopu nekog seta antimikrobnih faktora u cilju efikasnog suzbijanja patogena i uzročnika kvarenja hrane.

PREŽIVLJAVANJE U STRESNIM USLOVIMA

Malo se zna o posledicama stresa na ćelije Leuconostoc. One su sposobne da dugo vremena prežive u raznim nepovoljnim uslovima sredine, kao što su u industriji šećera, ulja kao i u mlečnoj industriji. Zadržavaju vijabilnost tokom dužeg niza godina na površinama drvenog oruđa (u industriji), na glaziranim kamenim površinama, gvozdenim ili plastičnim modlama kao i na ostalom drvenom i glaziranom oruđu, koje se tradicionalno koristi u proizvodnji sira. Neprijateljski uslovi životne sredine dovode do interakcija i takvih fenomena kao što je formiranje sluzi ili glikokaliksa u prisustvu saharoze i tragova minerala, što rezultuje u stvaranju biofilma koji štiti ćelije od štetnih agenasa. Sastav surutke zrelog sira verovatno je takav da dozvoljava opstanak leukonostoka, koji je detektovan u visokim ćelijskim nivoima.

Homeostaza unutrašnjeg pH je esencijalna za rast i opstanak svih bioloških ćelija, pa tako i leukonostoka, ali bakterijski rast jeste jedan samoograničavajući proces jer vremenom dolazi do zakišeljavanja podloge na kojoj žive i sve veće akumulacije kiseline. Kako pH spoljašnje sredine opada, unutarćelijsko pH Leuconostoc mesenteroides se takođe smanjuje. Rast prestaje kada se dostigne unutrašnja pH vrednost od 5.4 do 5.7, nezavisno od sastava podloge. Nasuprot tome, na spoljašnji ograničavajući pH je u velikoj meri je uticala podloga, tj. priroda i koncentracija organskih kiselina.

Odgovor ćelija Leuconostoc mesenteroides na toplotni šok ogledao se preteranom

17

ekspresijom proteina stresa, čija je N-terminalna sekvenca homologa sa visoko-konzerviranim šaperonima Escherichia coli. Ctsr homolozi su identifikovani kod Oenococcus oeni i drugih Gram-pozitivnih bakterija, pa se pretpostavlja da bi regulacija u uslovima toplotnog šoka putem Ctsr mogla postojati i kod leukonostoka.

Tehnologije koje se koriste u cilju sprečavanja kvarenja hrane, kao što su primena visokog pritiska, kojom se kombinuje efikasno smanjenje broja klica sa maksimalnim zadržavanjem hemijskih i fizičko-hemijskih osobina proizvoda, trenutno se ispituju. Tretman koji podrazumeva homogenizaciju pod visokim pritiskom na 25 stepeni u trajanju od 15 minuta i pritisku u opsegu od 100 i 300 MPa, pokazuje da Gram-pozitivne bakterije uključujući i Leuconostoc mesenteroides su otpornije od Gram-negativnih bakterija, pri čemu struktura peptidoglikana verovatno doprinosi rezistenciji, dok se obe grupe preklapaju pri visokim hidrostatičkim pritiscima. Uništavanje ćelija leukonostoka zavisi i od pritiska i od vremena trajanja primenjenog pritiska, pri čemu je otpornost na visok pritisak manja kod Leuconostoc mesenteroides nego kod Saccharomyces cerevisiae. Posle 5 minuta na 25 stepeni i pritisku od 345 MPa gubitak vijabilnosti ćelija bio je preko 6 logciklusa za jedan sat.

METABOLIZAM

Vrste roda Leuconostoc imaju kompleksne nutritivne zahteve. Generalno, za rast su potrebni nikotinska kiselina, tiamin, biotin i pantotenska kiselina (ili njeni derivati), dok kobalamin i p-aminobenzoeva kiselina nisu neophodni. Leuconostoc lactis ne zahteva folnu kiselinu, dok su za rast Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides potrebne glutaminska kiselina i valin. U skladu sa potrebama za aminokiselinama vrste ovog roda se mogu podeliti u dve grupe:

- prvoj grupi pripadaju sojevi koji obrazuju dekstran, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum i Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, koji zahtevaju do osam aminokiselina za rast;

- drugu grupu čine sojevi koji ne obrazuju dekstran, za čiji rast je potrebno više od osam aminokiselina.

Svi sojevi zahtevaju metionin, valin i glutaminsku kiselinu. Često je neophodno prisustvo riboflavina i folne kiseline u podlozi za gajenje, a neki sojevi ne rastu u odsustvu adenina, guanina, ksantina i uracila. Nijednom soju nije neophodan alanin, ali svi sojevi zahtevaju tiamin, pantotensku kiselinu i biotin.

Rast zavisi od metabolizma fermentabilnih šećera. Pod mikroaerofilnim uslovima glukoza se konvertuje u ekvimolarne količine D-laktata, etanola i CO2, kombinacijom heksozo-monofosfatnog i pentozo-fosfatnog puta, sa glukozo-6-

18

fosfat-dehidrogenazom i ksilulozo-5-fosfoketolazom kao ključnim enzimima. Heterofermentativni put razgradnje glukoze prikazan je na slici 1.

Slika 1: Heterofermentativni put metabolizma glukoze

19

Fruktozo-1,6-difosfat aldolaza je odsutna. Redukovani NAD (NADH) se regeneriše u NAD pomoću laktat dehidrogenaze, acetaldehid-dehidrogenaze i alkohol-dehidrogenaze. Međutim, u prisustvu kiseonika, sojevi Leuconostoc mesenteroides koriste NADH oksidaze i NADH peroksidaze kao alternativne mehanizme za regeneraciju NAD. Umesto etanola nastaje acetat i duplo više ATP.

Fruktozu fermentišu sve vrste roda Leuconostoc, osim Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris i nekih sojeva Leuconostoc argentinum. Ako fruktoza služi kao akceptor vodonika, umesto etanola nastaje manitol.Laktozu fermentišu svi sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Leuconostoc lactis i Leuconostoc argentinum.

Kako je fosfoketolaza jedan od ključnih enzima heterofermentativnog puta razgradnje laktoze, pretpostavlja se da po pravilu sve vrste fermentišu pentoze. Pokazalo se, međutim, da su fermentacioni profili arabinoze, riboze i ksiloze različiti kod različitih vrsta. Moguće je da su geni koji kodiraju fermentaciju pentoza povezani sa plazmidima.

Obrazovanje dekstrana od saharoze zabeleženo je kod sledećih vrsta: Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides i subsp. dextranicum, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc gelidum i Leuconostoc gasicomitatum. Sposobnost obrazovanja dekstrana se gubi nakon nekoliko presejavanja u podloge sa većom koncentracijom soli. Ova osobina se može povratiti zasejavanjem u medijum koji sadrži sok od paradajza ili pomorandže. Od organskih kiselina najčešće fermentišu limunsku i jabučnu. Svi sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris i većina mlečnih leukonostoka (Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum i Leuconostoc lactis) fermentišu citrat u prisustvu fermentabilnih šećera. Sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides konvertuju malat u L-laktat i CO2. Citrat se metaboliše do acetata i laktata. Na nižim pH vrednostima, međutim, od citrata mogu nastati diacetil i acetoin. Svi sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris koriste citrat, dok s druge strane acetat i tartarat ne koriste. Povećana produkcija mirisnih materija zapaža se sa snižavanjem pH i posebno je izražena kod citrat-liaza-pozitivnih sojeva u prisustvu citrata, mada su zabeležene značajne varijacije u količini produkovanog diacetila među sojevima Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris.

Višak piruvata nastalog tokom ko-metabolizma citrata i glukoze koristi se da bi se reoksidovali koenzimi NADH i NADPH. Zbog toga, acetaldehid se ne redukuje do etanola i acetil-fosfat se konvertuje u acetat i ATP, posredstvom aktivne acetat kinaze. Povećan nivo ATP-a doprinosi bržem rastu u poređenju sa ćelijama gajenim na glukozi bez citrata. Osim generisanja veće količine ATP-a, citrat može

20

da služi i kao izvor ugljenika za sintezu lipida i verovatno i drugih ćelijskih komponenata.

Malo se zna o produkciji biogenih amina kod leukonostoka. Nije primećeno obrazovanje tiramina kod sojeva vrsta Leuconostoc izolovanih iz svežeg i vakuum-pakovanog mesa. Neki sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides produkuju tiramin i triptamin.

Određeni sojevi izolovani iz kiselog testa razgrađuju fitinsku kiselinu. U jednoj studiji, Leuconostoc mesenteroides soj 38 poboljšao je rastvorljivost Ca2+ i Mg2+

tokom 9h fermentacije fitatom bogatog integralnog pšeničnog brašna.

ULOGE U TEHNOLOGIJI

Leukonostok igra važnu ulogu u tehnologiji mlečnih proizvoda, koja se prvenstveno ogleda u produkciji gasa i mirisnih jedinjenja. Uprkos tome što je često u velikoj količini zastupljen u proizvodu sa ustaljenom, dobro poznatom, populacijom, sve uloge leukonostoka još uvek nisu razjašnjene. Njihova uloga može se razmatrati i sa aspekta produžavanja roka trajanja fermentisanoj hrani putem inhibicije neželjenih bakterija, kao i u novim oblastima funkcionalne hrane.

Uloge u tehnologiji mlečnih proizvoda

Formiranje rupa u siru

Svim plavim sirevima, a naročito Rokforu, u toku procesa proizvodnje moraju se u jednom trenutku bušiti rupe od površine ka unutrašnjosti sira, što omogućava kolonizaciju Penicillium roqueforti. Kod mekih zrelih sireva koji su dovoljno čvrsti (da se ne spljošte primenom blagog pritiska) mogu da se mehanički buše rupe, a može da ih pravi leukonostok, koji proizvodeći CO2 stvara šupljine unutar sira. Kod presovanih zrelih nemačkih sireva kao što su Edam i Gauda i ostalih slanih sireva iz salamure postoje sitne i malobrojne rupe unutar sira koje su nastale radom leukonostoka koji stvara CO2, a ne mehaničkim putem. U ovom slučaju selektuju se sojevi koji produkuju umerene količine CO2 da bi se sprečila preterana šupljikavost.

U proizvodnji Rokfor sira, minimalna koncentracija leukonostoka je 106 ćelija/ml mleka. Optimalni rezultati su postignuti sa odabranim sojevima vrste Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, u obliku koncentrovanih ćelijskih suspenzija. U nekoliko slučjeva, populacija leukonostoka prirodno prisutnih u mleku stvara željene rupe. S druge strane, dodatak leukonostoka je obavezan

21

pasterizovanom mleku i sirovom mleku povećanog mikrobiološkog kvaliteta, koje ima mali sadržaj bakterija.

Maksimalna koncentracija nastalog CO2 je 16 mmol/kg sira, što odgovara iskorišćenju 8 mmol/l citrata prisutnog u mleku, pri čemu se razlike u aktivnosti javljaju u zavisnosti od vrste i soja. Sojevi koji razgrađuju citrat moraju da rstu tokom početnih faza pravljenja sira (presovanje), iako su uobičajeni uslovi (30oC) nefavorabilni za leukonostoke. Moraju da prežive i da nastave metabolizam tokom zrenja sira u odsustvu šećera. Međutim, neki sojevi, aktivni na niskim pH grušanca, mogu da postanu neaktivni kada se grušanac ispere vodom pri čemu se poveća pH.

Proizvodnja arome

Glavno jedinjenje povezano sa upotrebom leukonostoka u polju mlekarstva je diacetil, acetat i etanol doprinose takođe obrazovanju arome. Nivo diacetila koji daje željenu aromu je nizak (1.5 do 5 ppm) jer čovek za nju ima nizak prag mirisa. Dovoljan broj ćelija i posebni fizičko-hemijski uslovi su neophodni za optimalno iskorišćenje citrata i produkciju arome. Ukoliko je zakonski dozvoljeno, dodatak citrata u mleko ili u vodu za ispiranje od surutke (npr. kada se primenjuje tehnologija za uklanjanje laktoze tada se deo surutke zamenjuje vodom), jer se na ovaj način ostvaruje intenzivnija aroma proizvoda.

Leukonostok može dalje da transformiše diacetil u acetoin i 2,3-butandiol, koji ne daju aromu. Ova nepoželjna transformacija može biti umanjena ako se proizvodi, kao što je fermentisano mleko, ohlade nakon nastanka arome. Zreli sirevi se obično čuvaju na višim temperaturama (10 – 13 oC) od onih koje su neophodne da bi se proces zaustavio. Inkorporacija kiseonika u fermentisane mlečne proizvode favorizuje produkciju diacetila.

Višak acetaldehida, koji može biti produkovan od strane starter kultura u maslacu i fermentisanom mleku, vodi razvoju defekta „zelenog“ mirisa. U frižideru, leukonostok može da redukuje acetaldehid u etanol, što je u najvećoj meri izraženo kod Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris. U siru, nizak pH, povećan sadržaj soli i mala aktivnost vode, redukuju metabolisanje acetaldehida kod ove vrste.

Ciljano dodavanje leukonostoka kao NSLAB

Naknadno dodavanje leukonostoka u poređenju sa ostalim bakterijama koje spadaju u NSLAB, npr. Lactobacillus, testirano je kod različitih sireva, kod kojih inače nisu normalno prisutni, s obzirom da postoji stvarni interes za ovaj postupak, naročito za floru sirovog, nepasterizovanog mleka.

22

Sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris koji se uobičajeno koriste u proizvodnji maslaca, pavlake ili svežih (mladih) sireva se ne obnavljaju u starijem siru i imaju sasvim mali efekat, ako ga uopšte imaju. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ili Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum su željeni sojevi i broj ćelija u proizvodu mora da bude najmanje 107 ćelija/ml mleka. Najveći broj sojeva se slabo ili baš nikako razmnožava u mleku i prvom siru, grušancu, jer njihov rast suzbija Lactococcus. Mleko se takođe može ostaviti da sazreva sa oko 106 ćelija/ml, u trajanju od 15 sati na 13 oC, da bi se dostigao ovaj nivo koncentracije bakterija.

Kod sira tipa Gauda proizvednog u aseptičnim industrijskim uslovima ovaj efekat je ostao nejasan iako je primećeno samnjenje sadržaja citrata. Na pilot skali, presovani sirevi koji sadrže 108 ćelija/gramu daju veći pH (5.3 nasuprot 5.1), veći sadržaj aminokiselina i dešava im se ubrzano zrenje, u poređenju sa kontrolom. Ovaj veći pH nastaje zbog blage inhibicije proizvodnje L-laktata od strane Lactococcus i delimično bi mogao da pruži objašnjenje za uočeno ubrzano zrenje. Leuconostoc bi zato mogao biti dobar kandidat za suprotstavljanje zakišeljavajućim starterima. Ovi rezultati su potvrđeni eksperimentima u aseptičnim uslovima uz pomoć mikro-modela dizajniranog specijalno za tipove presovanih, ispranih sireva. Aroma je modifikovana kada je koncentracija ćelija bila iznad 5 x 106 ćelija/ml mleka, dok se šupljikavost pojavila tek pri koncentracijama između 5 x 106 i 5 x 107 ćelija/ml, u zavisnosti od upotrebljenog soja a moguće i u zavisnosti od njegovih autolitičkih sposobnosti. Tekstura proizvoda posle samo dve nedelje bila je ista kao i tekstura proizvoda ali u odsustvu leukonostoka posle mesec dana - dakle ovim dodavanjem sojeva proces zrenja je ubrzan.

Ispostavilo se da soj Leuconostoc 5201 takođe inhibira NSLAB, koji su uključeni u proizvodnju neprijatne arome kod Čedar sira. Inhibicija krajnjim proizvodima metabolizma, u kombinaciji sa smanjenim oksido-redukcionim potencijalom koji postoji u siru zajednički dovodi do inhibicije Lactobacillus plantarum

Ras sir proizveden u postrojenju sa dodatkom ćelija tretiranih toplotnim šokom (ili šokom smrzavanja), ili samo sa dodatkom ćelijskog ekstrakta sojeva leukonostoka izolovanih iz prirodne flore francuskog sira, pokazuje smanjenu gorčinu. Mančego sirevi proizvedeni od pasterizovanog mleka i definisanih startera sa Leuconostoc mesenteroides zadržavaju viši kvalitet arome i sveukupno lepše izgledaju nego sirevi pravljeni sa komercijalnim starterima

Veoma veliki broj ćelija u uzorcima sira sa namerno dodatim ćelijama (108 ćelija/ml mleka) dovodi do prevelike proizvodnje rupa u siru a tu pojavu prati i pojava tipične nepoželjne krajnje arome.

23

Uloge u funkcionalnoj hrani

Pod funkcionalnom hranom smatra se hrana koja osim uobičajenih hranljivih sastojaka, sadrži komponente koje unapređuju zdravlje i sprečavaju pojavu bolesti. To podrazumeva dodatak probiotika i produkciju metabolita, koji doprinose poboljšanju i očuvanju zdravlja.

Leuconostoc kao potencijalni probiotik

Leuconostoc nema sposobnost kolonizacije intestinalnog trakta. U skladu sa tim, njegov efekat na domaćina će biti mali, osim u slučaju da se uzme u velikim ćelijskim koncentracijama. U jednoj studiji, međutim, pokazano je da konzumiranje indijskog fermentisanog mlečnog proizvoda koji je sadržao 108 g-1 Lactococcus lactis i Leuconostoc mesenteroides skraćuje trajanje diareje kod dece za 0.3 dana.

Proizvodnja polisaharida

Leuconostoc mesenteroides produkuje egzopolisaharide (EPS). EPS Leuconostoc mesenteroides su homopolisaharidi koji se sastoje od α-D-glukana. Dekstrani su uglavnom sastavljeni od α-1,6 ostataka glukoze, sa varijabilnim stepenom grananjima (specifičnim za soj) i alternani sa α-1,3 i α-1,6 grananjem. Biosinteza je eksterna i zahteva prisustvo saharoze. Enzimi uključeni u ovaj proces su specifična glikozil-transferaza i dekstran- ili levan-saharaza. Industrijski dekstrani se koriste kao matriksi za gel filtraciju, a u medicini za povećanje zapremine krvi i poboljšavaju protok krvi.

U tehnologiji mlečnih proizvoda, dekstrani, kao i drugi EPS, se koriste kao aditivi, imaju ulogu u poboljšanju teksture povećavajući viskoznost, a takođe služe i kao stabilizatori na taj način što pojačavaju rigidnost kazeinske mreže vezivanjem vode i interakcijama sa sastojcima mleka. Kao posledica toga, EPS smanjuju sinerezis i povećavaju stabilnost proizvoda.

Osim tehnoloških koristi, određeni EPS imaju i delotvorne fiziološke efekte na konzumente. Pretpostavlja se da povećana viskoznost hrane koja sadrži EPS može da produži vreme zadržavanja fermentisanog mlečnog proizvoda u gastrointestinalnom traktu i samim tim omogući kolonizaciju probiotskim bakterijama.

α-gluko-oligosaharidi koje produkuje Leuconostoc mesenteroides NRRL-B-18242 su visoko rezistentni na dejstvo digestivnih enzima. Smatra se da imaju potencijalni prebiotički efekat kod novorođenčadi, s obzirom da stimulišu rast bakterija crevne flore. Takve oligosaharide bifidobakterije i laktobacili katabolišu, za razliku od Salmonella ili E. coli, koje to ne mogu. pointing toward their effect on intestinal microflora modification

24

Proizvodnja manitola

Manitol je nisko-kalorični šećer koji može da zameni saharozu, laktozu, glukozu ili fruktozu i prehrambenim proizvodima. Metaboliše se nezavisno od insulina, pa se može koristiti u proizvodima koji su namenjeni dijabetičarima. Leuconostoc pseudomesenteroides i Leuconostoc mesenteroides poznati su po proizvodnji manitola tokom fermentacije fruktoze.

Hidroliza α-galaktozida

Ljudi i životinje ne mogu da metabolišu α-galaktozide uobičajeno prisutne u biljkama, kao što su stahioza i rafinoza, usled nedostatka enzima α-galaktozidaze u intestinalnoj mukozi, pa dolazi do naduvenosti. U cilju prevazilaženja ovih nedostataka i povećanja konzumacije inače veoma hranljivih namirnica, učinjeni su pokušaji eliminisanja α-galaktozida fizičkim metodama ili upotrebom α-galaktozidaza. Uprkos činjenici da Leuconostoc ima sposobnost fermentacije α-galaktozida i predloga da se α-galaktozidaza iz Leuconostoc mesenteroides koristi kao biotehnološki pristup za uklanjanje α-galaktozidaza, pokušaji da se ove mogućnosti iskoriste nisu učinjeni.

Proizvodnja vitamina

Sojevi Leuconostoc mesenteroides koji produkuju značajne količine menahinona su okarakterisani i bili bi korisni kao starter kulture mlečnim (i drugim) fermentisanim proizvodima, ili pak kao dijetetski suplementi za prevenciju bolesti uzrokovanih nedostatkom vitamina K. Dokumentovana je takođe proizvodnja folata od strane sojeva Leuconostoc lactis i Leuconostoc paramesenteroides.

ZAKLJUČAK

Poslednjih decenija, nove molekularne alatke, prvenstveno tehnike zasnovane na DNA, značajno su doprinele razjašnjavanju filogenije leukonostoka i identifikovanju novih vrsta. Poznavanje ekologije mikroorganizama u različitim nišama i fermentacije mogu se poboljšati zbog pojave molekularne identifikacije, iako biohemijske karakteristike zadržavaju najveći značaj za tehnološke primene. Paralelno s tim, sekvenciranje genoma i analiza LAB, uključujući i Leuconostoc, će omogućiti jedan složeniji i sveobuhvatniji pristup potencijalu mogućnostima upotrebe lrukonostoka.

Uzevši u obzir široku rasprostranjenost Leuconostoc u okruženju, ogroman broj njih koje dnevno unesemo u organizam sa brojnom i raznovrsnom fermentisanom hranom (kao što su mlečni proizvodi) i relativno mali broj infekcija koje uzrokuju,

25

može se reći da ove bakterije imaju veoma malu (ako je uopšte i imaju) virulentnost za zdrave ljude. Nijedan zabeležen slučaj infekcije nije direktno povezan sa konzumiranjem fermentisane hrane ili viskokom izloženosti LAB. Proizvodi koji sadrže Leuconostoc (kao i Lactobacillus) takođe mogu biti značajni izvori jona mangana.

Tri aspekta metabolizma Leuconostoc treba uzeti u obzir kada je reč o dizajnu funkcionalne hrane ili kada je reč o iskorišćenju metaboličkih osobenosti u cilju industrijske upotrebe. To su:

1) sposobnost leukonostoka da hidrolizuje α-galaktozide kao što je rafinoza iz biljnih proizvoda (povrća);

2) sposobnost leukonostoka da sintetiše akarbozne analoge koji mogu poboljšati glikemični profil i osetljivost na insulin kod pacijenata sa dijabetesom tip2;

3) sposobnost leukonostoka da proizvodi polimere slične inulinu, koji se mogu koristiti kao prebiotici.

26

Reference

Carr F. J., Chill D., Maida N., (2002), The Lactic Acid Bacteria: A Literature Survey. Critical Reviews in Microbiology, 28 (4), 281–370

Cogan T. M., Jordan K. N., (1994), Metabolism of Leuconostoc Bacteria. Journal of Dairy Science 77 (9), 2704-2717

De Vos Paul, George M. Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-Heinz Schleifer and William B. Whitman EDS, Volume three, William B. Whitman director of the editorial office Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition, Volume Three, The Firmicutes, Springer Dordrecht Heidelberg London New York, Library of Congress Control Number: 2009933884, © 2009, 1984–1989 Bergey’s Manual Trust

Hemme D., Foucaud-Scheunemann C., (2004). Leuconostoc, characteristics, use in dairy technology and prospects in functional foods. International Dairy Journal, 14, 467–494Stiles M. E., (1994). Bacterloclns Produced by Leuconostoc Species. Journal of Dairy Science, 77 (9), 2718-2724

Vedamuthu E. R., (1994). The Dairy Leuconostoc: Use in Dairy Products. Journal of Dairy Science, 77 (9), 2725-2737

27