Universidad Católica Santa MariaFacultad de Ciencias Farmaceúticas, Bioquímicas y Biotecnológicas

Arequipa

Extracción y Purificacion de Flavonoides a partir de pétalos de Rosa

Lenny Orana Sarmiento Sánchez

Resumen

Se realizó una extracción por Soxhlet de los pétalos de rosas rojas, primero se hace un desengrasado con éter que fue desechada, luego la extracción con etanol, la que se concentro y filtro, se hizo un reextracción con Acetato de Etilo por tres veces, se desecha la fase eterea y se conserva la fase acetica. Se agregó cloroformo para formar un precipitado, se filtra y a la fase precipitada se le resuspende en solucion etanolica. Procedemos a hacer las pruebas de identificación y determinación, como lo es la reacción de Shinoda y la reacción con el Tricloruro de Aluminio.

Summary

Extraction by Soxhlet of red rose petals you made, first degreasing with ether which was discarded is, after extraction with ethanol, which was concentrated and filter, made a re-extraction with ethyl acetate three times, discarded the ether phase and the acetic phase is preserved. Chloroform was added to form a precipitate, is filtered and the precipitated phase was resuspended in ethanol solution. We proceed to make identification tests and determination, as is the reaction of Shinoda and reaction with aluminum trichloride.

IntroducciónLos flavonoides lato sensu son pigmentos casi universales en los vegetales. Casi siempre hidrosolubles, son responsables de la coloración de las flores, frutos y a veces de las hojas. Asi ocurre con los flavonoides amarillos (chalconas, auronas, flavonoles amarillos), con los antocianósidos rojos, azules o violetas. Si no son

directamente visibles, contribuyen a la coloración por su papel de copigmentos: asi ocurre con las flavonas y flavonoles incoloros que copigmentan y protegen a los antocianósidos. En algunos casos, la zona de absorción de la molecula se situa en el ultravioleta próximo: la “coloración” se percibe únicamente por los insectos que se sienten asi eficazmente atraídos y guiados hacia el néctar y obligados por lo tanto a asegurar el transporte del polen que condiciona la supervivencia de la especie vegetal. Los flavonoides se encuentran también en la cutícula foliar y en las células epidérmicas de las hojas, asegurando asi la protección de los tejidos contra los efectos nocivos de las radiaciones ultravioletas.

Distribución y localizaciónDistribuciónLa presencia de flavonoides en las Algas no se ha demostrado hasta el momento. Aunque son frecuentes en Bryophytas (Musgos y Hepáticas), se trata de flavonoides stricto sensu, mayoritariamente de O- y C-heterósidos de flavonas y de derivados O-urónicos. En Pteridophytas no es mayor la variedad estructural de flavonoides, las Psylotales y Selaginellales se caracterizan por la presencia de biflavonoides, las Equisetales por la proantocianidoles. Los O-heterosidos de flavonoles dominan en los Helechos que, según algunos autores, elaboran asimismo chalconas o proantocianidoles. En Gymnospermas, los proantocianidoles son bastante constantes y se observa la presencia, en Cycadales y Coniferales (a excepción de Pinaceae) de biflavonides, ausentes en Gnetales; la distribución de estos compuestos y de heterosidos de flavonas y flavonoles que los acompañan varía netamente, en este caso, en función del órgano(leño, corteza, hojas). La diversidad estructural de flavonas es máxima en Angiospermas: así una treitena de tipos de flavonoides se han podido identificar en las Asteraceae. Numerosos autores se han encargado de relacionar la distribución de estas moléculas con los distintos sistemas taxonómicos propuestos por los sistemáticos contemporáneos: en líneas generales no están en desacuerdo con las tendencias evolutivas establecidas para estos sitemas. Esto permite incluso, sobre todo en el caso de las Dicotiledoneas, la construcción de un filograna bastante coherente entre grupos que han conservado gran cantidad de caracteres ancestrales y otros mas evolucionados.

LocalizaciónLos heterósidos de flavonoides, hidrosolubles, se acumulan en las vacuolas y, según las especies, se concentran en la epidermis de las hojas o se reparten entre la epidermis y el mesofilo (aunque estos dos tejidos pueden acumular de manera especifica estructuras diferentes, como se ha podido demostrar en algunos cereales). En el caso de las flores, se concentran en las células epidérmicas. Cuando los flavonoides se encuentran en la cuticula foliar, se trata casi siempre de geninas libres cuya lipofilia se incrementa por la metilación, parcial o total, de los grupos hidroxilo. Esto se refiere sobretodo a plantas de regiones aridas o semiáridas, generalmente provistas de estructuras secretoras.

Estructura QuímicaQuimicamente, estas sustancias son de naturaleza fenólica y se caracterizan por poseer dos anillos aromáticos bencénicos unidos por un ouente de tres atomos de carbono, con la

estructura general C6−C3−C6' los cuales pueden formar o no un tercer anillo. Los anillos son denominados A, B y C; los atomos de carbono individuales son referidos por un sistema numérico, el cual utiliza números ordinarios para los anillos A y C y números primos para el anillo B.

Los flavonoides naturales suelen presentar al menos tres hidroxilos fenólicos y se encuentran generalmente combinados con azucares en forma de glucosidos, aunque también se presentan con relativa frecuencia como agliconas libres (1,2). Varios subgrupos de flavonoides son clasificados de acuerdo con la sustitución del anillo C. En esta clasificación son de suma importancia el estado de oxidación del anillo heterocíclico y la posición del anillo B(2,3).

Los tipos de flavonoides están relacionados por una ruta biosintetica común, la que incorpora precursores de las rutas del shiquimato y la acetato-malonato (4,5). Posteriores modificaciones ocurren en varios estados, lo que resulta en la extensión de la hidroxilacion, metilación, isoprenilacion, dimerización y glicosilacion, produciendo O-glicosidos y C-glicosidos.

Flavonas y flavonolesPresentes en vegetales y son los flavonoides mas comunes, distribuidos en todos los pigmentos amarillos de las plantas a pesar de los carotenoides

Flavanonas y flavanonolesSon incoloros o solo ligeramente amarillos, son compuestos que existen en muy pequeñas cantidades por eso son los flavonoides menos conocidos.Sus glicósidos son bien conocidos –hesperidina y naringina- extraidos de la corteza de los frutos cítricos.

AntocianinasSiempre se encuentran como glicósidos; después de la clorofila, son el grupo mas importante de pigmentos en las plantas visibles al ojo humano y proporcionan el color malva, rosa, violeta y azulado a numerosas flores y frutos, como la fresa, la rosa, las manzanas y la uva constituyen hasta aproximadamente 30% de su masa seca.

Propiedades físico-químicas, extracciónSolubilidades y extracciónAunque por regla general, los heterósidos son hidrosolubles y solubles en alcoholes, muchos de ellos poseen una escasa hidrosolubilidad (rutósido, hesperósido). Las geninas son, en su mayoría, solubles en disolventes orgánicos apolares; cuando contienen al menos un grupo fenólico libre, se disuelven en disoluciones de hidróxidos alcalinos.

Los flavonoides lipófilos de los tejidos superficiales de hojas (o de frondes) se pueden extraer directamente con disolventes de polaridad media (diclorometano); seguidamente habrá que separar las ceras y grasas que se extraen simultáneamente (se puede lavar en principio con hexano pero la selectividad de este disolvente no es absoluta).

Los heterosidos pueden extraerse, normalmente en caliente, con acetona o alcohol (etanol, metanol) a los que se adiciona agua(20 a 50% según que la droga sea fresca o seca). Se puede seguidamente realizar una evaporizacicon al vacio y, cuando el medio contenga solo agua, proceder a una serie de extracciones liquido-liquido con disolventes no miscibles con el agua: con éter de petróleo que elimina clorofila y lípidos; con dietileter que extrae las geninas libres; con acetato de etilo que arrastra la mayoría de los heterósidos. Los azucares libres permanecen en la fase acuosa junto con, en caso de fracaso, los heterósidos mas polares.

La separación y purificación de los diferentes flavonoides se funda en las técnicas cromatográficas habituales (sobre poliamida, celulosa, gel de Sephadex, etc.). Al igual que para la mayoría de metabolitos secundarios de los vegetales, la CLAR constituye en estos últimos años el método de elección en el arsenal de las técnicas de aislamiento de heterosidos flavonicos (fases reversas C8 o C18 con disolventes se tipo agua -o acetonitrilo, o THF- + metanol + acido acético).

Propiedades biológicasLa principal actividad atribuida a los flavonoides es la de ser “venoactivos”, es decir, ser capaces de disminuir la permeabilidad de los capilares sanguíneos y aumentar su resistencia. En animal, pueden reducir la sintomatología de una hipovitaminosis C esperimental. Esta propiedad le ha valido, durante un tiempo, el nombre de “vitamina P”. Al no ser vitaminas (una carencia en flavonoides no ocasiona ningún síndrome especial), se habla de “factores vitamínicos P” o, mejor aun, de “factores P”. Estos términos, ambiguos, tienden a no utilizarse: en la actualidad, a estod productos naturales y a sus derivados que los diccionarios especializados incluyen bajo la denominación general de “vasculoprotectores y venotonicos” se les denomina “venotropos”. Este interés de los flavonoides en controvertido: así, la FDA (Food & Drug Administration)no les reconoce ninguna actividad; además la lectura de tratados clásicos de farmacología no permite durar sobre la escasa importancia que, por regla general, se atribuye a su valor terapéutico. No

obstante los flavonoides y las preparaciones a base de flavonoides son objeto –en Francia y en muchos países como Alemania, España o Italia- de amplia prescripción, de frecuente recomendación farmacéutica y de una importante automedicación, en el terreno de patologías ciculatorias menores. Ademas algunas moléculas de estos grupos, al menos en posologías elevadas, han podido mostrar una cierta eficacia clínica. Actualmente, interesa sobre todo la interaccion de los flavonoides con radicales y sus posibles consecuencias en términos preventivos. Muchos trabajos experimentales se esfuerzan asimismo en demostrar, in vitro, la actividad celular de estas moléculas y los sitemas implicados en la respuesta inmunitaria y en la inflamación.

Por regla general los flavonoides son in vitro inhibidores enzimáticos:

Inhibición de la histidina descarboxilasa por el quercetol o la naringenina; Inhibición de la elastasa; Inhibición de la hialuronidasa, por las flavonas y sobre todo por los proantocianidoles, lo que permite

conservar la integridad de la sustancia fundamental de la pared vascular; Inhibición no especifica de la catecol-O-metiltranferasa, lo que aumenta la cantidad de

catecolaminas disponibles y provoca por tanto un aumento de la resistencia vascular; Inhibición de la fosfodiesterasa del AMPc que explicaría, entre otras y pro parte, su actividad

antiagregante plaquetaria; Inhibición de la aldosa reductasa- de la que se sabe que se encuentra implicada en la patogenia de la

catarata Inhibición in vitro de la protein-kinasa sobre todo por la luteolina; Numerosos flavonoides –hipolaetina, cirsiriol, etc.- son potentes inhibidores de la 5-lipooxigenasa y

por tanto de la producción de los leucotrienos mediadores de la inflamación y de las manifestaciones alérgicas.

Otras propiedades de los flavonoides, a menudo presentados como antiinflamatorios –lo que es compatible con lo que se conoce como sus interacciones (in vitro) con los polinucleares y los trombocitos o también con el metabolismo del acido araquidónico, los flavonoides pueden ser antialérgicos, hepatoprotectores (isobutrina, hipidulina, flavanolignanos), antiespaspodicos sobre ileon de cobaya estimulado por diversos agonistas (flavonoides de tomillo y de otras Lamiaceae), hipocolesterolemiantes, diuréticos, antibacterianos, antivirales in vitro, etc.

Un pequeño numero de flavonoides son anticancerígenos e inhibidores del crecimiento de células tumorales in vitro: pueden interaccionar con los enzimas del metabolismo xenobiotico, poseer efectos anti-iniciadores y/o antipromotores o incluso ser citostáticos, es decir, citotóxicos. La mayoría de los flavonoides son, in vitro, antimutagenicos; a contrario, algunos flavonoles son, sobre los mismos modelos, mutagenicos. Las variaciones de actividad en función de las características estructurales no permiten ninguna generalización.

Utilización de Flavonoides en TerapeuticaPese a los resultados parciales proporcionados por test bioquímicos o por estudios de farmacología animal, la realidad de la eficacia clínica de la mayoría de los flavonoides –y, a forfitiori, de la de las drogas que los contienen- casi nunca ha sido correctamente establecida. Los ensayos en el hombre –que no son normalmente mas que meras “observaciones”-, no se realizan siempre de acuerdo con las normas actualmente en vigor para este tipo de pruebas. Unicamente un pequeño numero de moléculas puras o de extractos estandarizados ha podido demostrar una eficacia sintomática moderada a pesar de la subjetividad de los síntomas y de la importancia del efecto placebo en el principal tipo de patología involucrada. Los

flavonoides se utilizan sobre todo en el terreno capilar-venoso: solos o asociados, son constituyentes habituales de vasculoprotectores y venotonicos y de tópicos utilizados en flobologia. En general las especialidades que se disponen en la actualidad en el mercado poseen las indicaciones o propuestas de empleo siguiente:

Tratamiento de síntomas relacionados con la insuficiencia venolinfática (pesadez y dolores de pierna) Tratamiento de los signos funcionales debidos a la crisis hemorroidal. Mejoría de los transtornos de fragilidad capilar a nivel de la piel (petequias); tratamiento de apoyo

de transtornos funcionales de la fragilidad capilar. Tratamiento de metrorragias debidas a la contracepción por microprogestagenos y de metrorragias

debidas a la utilización de dispositivos intrauterinos, después de su exploración clínica o paraclinica. Propuesto en transtornos ligados a la circulación retiniana y/o coroidiana. Tratamiento del linfoedema de miembro superios consecuente al tratamiento radioquirurgico del

cáncer de mama.

Los expertos se ponen de acuerdo para subrayar que los venotropos carecn de interés demostrado en la prevención de transtornos tróficos en pacientes que poseen varices en los miembros inferiores y en la cicatrización de ulceras de las piernas. En la insuficiencia venosa, no poseen indicación en ausencia de sintomatología funcional; no eximen de una terapéutica etiológica y patogénica.

Pigmentos involucrados en la Rosa Roja (Rosa Gallica sp.)Las Antocianinas son los pigmentos mas importantes responsables del color rojo de las rosas. Estos pigmentos pueden causar que los petalos se observen rosados, rojos, violeta o azules, dependiendo de la copigmentacion que se presente. La copigmentacion es la interaccion de antocianinas con flavonoides y otros compuestos como metales, alcaloides, taninnos y polisacáridos. La pigmentación de los tejidos vegetales también se afecta por el pH y la temperatura (Jungmin et al., 2008).

Compuestos como las antocianinas y los fenoles son sintetizados con base a información genética y estadio de desarrollo de la planta, e influenciado por factores ambientales como disponibilidad de nutrientes, temperatura y radicación lumínica. La mayoría de los flavonoides protegen a las células de los daños ocasionados por la luz UV y también están involucradas en la defensa de la planta en otras situaciones de estrés, como heridas o ataque de patógenos (Grotewold, 2006).

Cuando algunas flores inician el proceso de senescencia, sus petalos cambian de color. Este cambio de color puede disminuir el valor estético de la flor y puede ser utilizado como parámetro de senecencia. La modificación del color puede ser causada por cambios bioquímicos de los pigmentos, por el grado de copigmentacion y por cambios en el pH de los petalos. Entre una de las manifestaciones de estos fenómenos bioquímicos se puede mencionar el ennegrecimiento de los petalos de la rosa roja, lo cual ocurre debido a la oxidación ade flavonas, antocianinas y otros fenoles (Halevy y Mayak, 1979).

Métodos Experimentales de extracciónLos flavonoides en general se extraen de muestras secas y molidas. La muestra se desengrasa inicialmente con éter de petróleo ó n-hexano, y el marco se extrae con etanol puro o del 70%. Este último es recomendado para garantizar la extracción de los más polares. El extracto obtenido se evapora con calentamiento no superior a los 50°C y se le hacen particiones sucesivas con éter etílico, acetato de etilo y n-butanol. Los flavonoides apolares quedan en la fase etérea, los medianamente polares en la fase acetato de etilo y los más polares en el nbutanol. Cada una de estas tres fracciones se puede analizar por cromatografía en capa fina (CCF) y HPLC en fase reversa.

Se pesaron 5g de pétalos de rosas, se somete a una extracción con éter por Soxhlet, por 3 ciclos para el desengrasado y luego continuamos la extracción con Etanol por 5 ciclos.

El extracto etanolico es evaporado a sequedad y suspendido en agua destilada hirviendo a 100ml con agitación.

La suspensión acuosa es filtrada por papel y el filtrado se lleva a una re extracción con Acetato de Etilo, por tres veces cada una con 20ml.

La fase Acética contiene los flavonoides los cuales precipitan al agregarle Cloroformo. Filtrar el precipitado, y el residuo re disolverlo en Etanol para las pruebas de identificación.

Reacción de Shinoda o CianidinaCaracteriza compuestos de estructura benzopirona. Si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol –como es el caso- se diluye con 1ml de HCl concentrado y un pedacito de cinta de Magnesio°. Despues de la reacción se espera 5minutos, se añade 1ml de alcohol amílico, se mezclan fases y se deja reposar hasta que se separen.

Si la alícuota del extracto se encuentra en agua, se procede de la misma manera, a partir de la adicion del HCl concentrado.

El ensayo se considera positivo, cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo. Intensos en todos los casos.

Reaccion con el FeCl3 5%Utilizar una solución acuosa de rutina, añadirle gotas del reactivo de FeCl3 5%. Observar a la luz UV con y sin vapores de amoniaco en un cromatograma.

Resultados y discusionesDiscusión de resultadosLas antocianinas son mas estables en un medio acido que en un medio neutron o alcalino. En medio acido a pH 1, la forma predominante es la del ion flavilio, el cual da el color rojo, cuando esta es sometida a pH basico o alcalino, el ion flavilio es susceptible al ataque nucleofilio por parte del agua, produciendose la pseudobase carbinol, esto es a pH 4.5 y seguido se forma la chalcona, las dos formas son incoloras. A un pH 7 se produce la base quinoidal, el cual da una coloracion azul debido a cambios conformacionales y a la estabilizacion de los electrons de Valencia del cation flavilio y la resonancia del anillo aromatico B3.

En el caso de la reaccion de Shinoda, el extracto de Rosas en contacto con el acido clorhidrico con las Cintas de Magnesio metalico se genera hidrogeno, este ultimo reduce al flavonoide lo cual se reconoce por la coloracion rosada.

En la reaccion de coloracion con FeCl3, la muestra de extracto de Rosas cambio a una coloracion roja rosada. Esto se debe a que la naturaleza polifenólica de los flavonoides, especificamente compuestos con orto-difenoles, lleva a la formacion de coloraciones variadas en presencia de FeCl3, que en este caso por presentar antocianinas produce una coloracion roja rosada.

Conclusiones1. Las diferentes especies vegetales estudiadas, en especial las drogas de estas, como: los petalos de

rosas; presentan diferentes tipos de flavonoids, utilizados hoy en las industrias con fines terapeuticos, alimentarios, etc.

2. Mediante los metodos de extraccion y las reaccion de identificacion, las rosas presentan heterosido flanonico antocianina.

3. La muestra problema de flavonoides, presenta una relacion de flujo determinado, cercano a los estandares empleado en UV.

Bibliografía BRUNETON JEAN, Farmacognosia, Editorial Acribia S.A. 2da Edicion ZARAGOZA, España CLAUDIA KUKLISKI, Farmacognosia, Ediciones Omega, S.A, 2000, primera impresión 2003 DOMINGUEZ XORGE, Métodos de investigación de fitoquimica

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