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Juan Luis Castillo N., T.M. MsCLaboratorio de Citometría de Flujo
Hospital del Trabajador Concepción.Departamento de Especialidades Médicas
Facultad de MedicinaUniversidad de Concepción
Miércoles 06 de Septiembre de 2006
www.oncoinmun.co.cl
Inmunofenotipificación Celular:Leucemias y Linfomas por Citometría de Flujo
¿QUE ES LA QUE ES LA CITO / METRIACITO / METRIADE FLUJODE FLUJO??
La Citometría de Flujo es una tecnología que permite la
“medición simultánea de múltiples características físicas y químicas de
células en suspensión”
¿QUE INFORMACION ENTREGA UN CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA CELULA?
1.- Su tamaño.2.- Su granularidad o complejidad
interna.3.- Evaluación de características químicas:
• Fluorocromos
• Anticuerpos conjugados con fluorocromos
FACS: Fluorescence activated cell sorter
Flow Cell
InjectorTip
FluorescenceFluorescencesignalssignals
FocusedFocusedlaserlaserbeambeam
Sheathfluid
FLUOROCROMOSFLUOROCROMOSFluoresceinFluorescein(FITC)(FITC)
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Relat
ive I
nten
sity
Wavelength
ProteinProtein
ExcitationExcitation EmissonEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
ExcitationExcitation EmissonEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
PhycoerytherinPhycoerytherin(PE)(PE)
Protein
PMT
PMT
PMT
PMT
DichroicFilters
BandpassFilters
FlowFlow Cytometry Cytometry OpticsOptics
Láser
1
2
3
4
Flow cell
FORMA DE PRESENTACION DE DATOS
• Histograma
• Gráfico de Puntos (Dot Plot)
• Gráfico de Contorno (Countour Plot)
• Gráfico Isométrico (3D)
• Gráfico de Densidad (Density Plot)
Citometría de flujo: mediciones
L
M
G
SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN
“GATE”
HISTOGRAMA(Un Parámetro)
0
coun
ts
FL1
Autofluorescenciay/o
control isotipo
M1
ESTADISTICA DE CUADRANTES(Dos Parámetros)
Autofluorescenciay/o
control isotipo
0
FL2
FL1
-,+
-,- +,-
+,+
0
FL2
FL1
1 2
3 4
ESTADISTICA DE CUADRANTES(Dos Parámetros)
Procedimiento St.:
• 100 µµµµL de sangre total
• 10 µµµµL del Ac. conjugado
• Incubar por 10-15 minutos RT
• Añade el lisador
• Leer en un citómetro de flujo
PREPARACION DE LA MUESTRAPREPARACION DE LA MUESTRA
PROCESO DE ANALISIS DE UNA MUESTRA
1. CALIBRACION
2. ADQUISICION
3. ANALISIS
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular• HLA-DR en monocitos• Estudio de Función Neutrofílica• Inmunofenotipo de macrófagos intestinales• Cuantificación de moléculas• Estudio de HLA-B27• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares
INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS
“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una
proliferación descontrolada de una o más tipos celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea
como sangre periférica”
Inmunofenotipo de Leucemias y Linfomas Hematopoiesis
PLURIPOTENTSTEM CELL
COMMITTEDPROGENITOR
CELL
RECOGNIZABLE BONE MARROW
PRECURSOR CELL
MATURE BLOOD CELL
myeloblastmonoblast
pronormoblast red cell
neutrophilmonocyte
basophil
platelet
CFU-Baso
CFU-Eos
CFU-GM
BFU-E/CFU-E
eosinophil
pre-T
pre-B
myeloidprogenitor
cell
lymphoidprogenitor
cell
lymphoblast
lymphoblast
T-cell
B-cell
& plasma cell
MIXED PROGENITOR
CELL
CFU-Meg megakaryocyte
pluripotentstem cell
RETENCION DE ANTIGENOS
Células malignas frecuentemente conservan
antígenos asociados con la célula normal a
partir de la cual fueron derivados
CD19 CD19
CELULA PRE-B NORMAL
CELULALEUCEMICA
Transformación
Maligna
CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)
•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg
•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb
•LMA :-LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)
CD34
HLA-DR
CD15
CD34
CD117
TdTCD10(CALLA)
CD1a
CD34
CD117
TdTCD10(CALLA)
Ig cit.
Ig sup.
Definir grado de madurez
CD13
CD33
MPO
CD3c
CD3m
CD7CD2
CD19
CD20
CD79ααααCD22
Definir linaje
LMALLA-TLLA-BPropósito
Leucemias Agudas: Definición de Linaje y Grado de Madurez.
Evaluación de linfocitosis de etiología no determinada.
Aplicaciones
INMUNOFENOTIPO DE LEUCEMIAS
Identificar desordenes linfoproliferativos crónicos de células T y B.
Diferenciar entre leucemia linfoblástica y leucemia mieloblástica.
Aplicaciones
INMUNOFENOTIPO DE LEUCEMIAS
Subtipificar inmunológicamente leucemias agudas.
INMUNOFENOTIPO DE LEUCEMIAS
Es fundamental para definir línea celular.
Cytometry (CCC)34:39-42 (1998)
Útil en monitorizar Leucemias Linfoblástica Aguda
(LLA) y Leucemia Mielobástica Aguda.
INMUNOFENOTIPO DE LEUCEMIAS
Subclasificación Inmunológica de LLA e Identificación de fenotipos Mieloides (valor pronóstico).
Cytometry (CCC)34:39-42 (1998)
Valor pronóstico
INMUNOFENOTIPO DE LEUCEMIAS
Modalidad Diagnóstica Primaria en síndromes Linfoproliferativos crónicos (Subclasificación
clínica y Pronóstico).
Cytometry (CCC)34:39-42 (1998)
Valor diagnóstico en Gammapatias monoclonales (Enf. Residual).
• Paciente sexo femenino• 45 años• Sangre periférica• Compromiso general severo• Falla hepática
• Inmunofenotipo normal• Paciente fallece Características normales
• Sexo Femenino• 18 años• Médula ósea
LLA-B (BIII: pre B)
• Paciente sexo masculino• 43 años• Dgto. Leucemia Aguda
CD10CD19CD34HLA-DR
CD5CD33CD13CD3CD16+56MPOCD14
CD20
Positivo Negativo Positivo Débil
Leucemia LinfoblásticaDe Línea B (B-II: Común)
• Paciente sexo masculino• 6 años 5 meses• Medula ósea
Leucemia Linfoblástica de tipo B-II (Común), con expresión mieloide aberrante.
CD10CD19CD34CD33CD13HLA-DRTdT
CD20CD5CD3CD8CD16+56MPOCD14
Positivo Negativo Positivo Débil
• Paciente sexo masculino• 5 años 8 meses• Medula ósea
LeucemiaAgudaLínea T (T-IV madura)
CD10CD5CD2CD3CD7CD8CD4
CD19CD20CD33CD13CD16+56MPOCD34HLA-DR
Positivo Negativo Positivo Débil
Leucemia Mieloide Aguda
CD13CD33CD34CD56MPOHLA-DR
CD19CD20CD16TDTCD5CD3CD4CD8CD10
Positivo Negativo Positivo Débil
Leucemia Mieloide Aguda
CD33CD34HLA-DR
CD19CD20CD13TDTCD5CD3CD4CD8CD10
Positivo Negativo Positivo Débil
MPO
• Paciente sexo femenino• 78 años• Sangre periférica • WBC:169.000.
Sugerente de una Leucemia PromielocíticaHipogranular M3 HLA-DR (-)
CD33CD13CD56MPO
CD10CD19CD20CD5CD3CD34
CD14HLA-DR
Positivo Negativo Positivo Débil
• Paciente sexo femenino• 80 años• Diagnóstico: Proceso
linfoproliferativo crónico
Leucemia Linfoblática de Línea B (B-III - pre B)
CD10CD19CD20CD34CD33HLA-DR
CD5CD13CD3CD16+56MPO
Positivo Negativo Positivo Débil• Paciente sexo masculino• 21 años• Sangre periférica
Leucemia Linfoblástica de Línea T (Pre T)
CD5CD4CD8CD2CD7CD3cTdT
CD3CD10CD19CD20CD34CD33CD13CD16+56HLA-DRMPOCD14
Positivo Negativo Positivo Débil• Paciente sexo masculino• 5 años 8 meses• Medula ósea
Leucemia Aguda Línea T (T-IV madura)
CD10CD5CD2CD3CD7CD8CD4
CD19CD20CD33CD13CD16+56MPOCD34HLA-DR
Positivo Negativo Positivo Débil
• 30/12/2004• Sangre Periférica• Sexo femenino• 40 años
36 % 37 %
10 %
37 %
42 %
34 %
36 %
78 %
LLA-B (BIII- pre B)
• Misma Paciente• 08/02/2006• Medula ósea• Sexo femenino• 40 años
Sin evidencia de población patológica
• Misma Paciente• 18/05/2006• Medula ósea• Sexo femenino• 41 años
En el contexto de una muestra de médula ósea hipocelular, la población celular analizada, presenta características inmunofenotípicas sugerentes de una Leucemia Linfática Aguda de línea B (B-III PreB).
Trastorno linfoproliferativo crónico de línea B, con expresión clonal de cadenas livianas de inmunoglobulinas del tipo kappa.
CD19CD20kappaHLA-DR
CD10CD3CD4CD7CD16+56CD34TdTCD13CD33CD14MPOlambda
Positivo Negativo Positivo Débil
• Sexo masculino• 57 años• Sangre periférica• 13 Febrero 2004
Trastorno linfoproliferativo crónico de línea B, con expresión clonal de cadenas livianas de inmunoglobulinas del tipo kappa.
Linfoma del Manto
Leucemizadoetapa IV-B
• Mismo paciente• 59 años• Sangre periférica• 08 de junio 2005
Dgto. y TTO
CD19CD20kappaHLA-DR
CD10CD3CD4CD7CD16+56CD34TdTCD13CD33CD14MPOlambda
Positivo Negativo Positivo Débil
Linfoma de células linfociticas pequeñas de bajo grado de malignidad (línea B con expresión clonal de cadenas livianas del tipo kappa)
• Sexo femenino• 42 años• Julio 2001• Medula ósea
37 % células
CD19CD20kappa
lambdaCD10CD3CD4CD7CD33CD34CD13CD14HLA-DR
Positivo Negativo Positivo Débil
Linfoma de células linfociticas pequeñas de bajo grado de malignidad (línea B con expresión clonal de cadenas livianas del tipo kappa)
CD19CD20kappa
lambdaCD10CD3CD4CD7CD33CD34CD13CD14HLA-DR
Positivo Negativo Positivo Débil
• Misma paciente• 44 años• Octubre 2002• Medula ósea
9.6 % células
• Misma paciente• 45 años• Agosto 2003• Medula ósea
Medula ósea normal
• Misma paciente• 46 años• Abril 2004• Medula ósea
Medula ósea normal
• 30/12/2004• Sangre Periférica
• 18/05/2006• Medula ósea
LLA-B (BIII- pre B)LLA-B (BIII- pre B)
Esta población de blastos, presenta características de expresión de CD45 y CD13, diferentes a las encontradas en el estudio realizado el 30 de diciembre de 2004, lo que podría indicar que NO se trata de
la misma población celular, detectada en esa ocasión.
• 19/05/2006• Medula ósea• Sexo Masculino• 56 años• Diagnóstico ?????
82 % 17 %
4 % 95 % 36 % 12 %
37 %
60 %
81 %56 %
84 %
82 %
85 %
36 %
11 %
CD19CD13, CD33CD34MPOHLA-DRCD14
CD10, TDTCD4, CD8CD3CD16+56CD20
Positivo Negativo
CD13, CD33CD34MPOHLA-DR
CD19, CD20CD10, TDTCD4, CD8CD3CD16+56CD14
Positivo Negativo
R1 15.53 %R2 6.31 %
CD19CD13, CD33CD34MPOHLA-DRCD14
CD10, TDTCD4, CD8CD3CD16+56CD20
Positivo Negativo
CD13, CD33CD34MPOHLA-DR
CD19, CD20CD10, TDTCD4, CD8CD3CD16+56CD14
Positivo Negativo
R1 15.53 %R2 6.31 %
1. Leucemia MielomonocíticaAguda
2. Leucemia Mieloblástica Aguda3. Síndrome Mielodisplásico
Leucemizado
CD19CD13, CD33CD34MPOHLA-DRCD14
CD10, TDTCD4, CD8CD3CD16+56CD20
Positivo Negativo
CD13, CD33CD34MPOHLA-DR
CD19, CD20CD10, TDTCD4, CD8CD3CD16+56CD14
Positivo Negativo
R1 15.53 %R2 6.31 %
1. Leucemia MielomonocíticaAguda
2. Leucemia Mieloblástica Aguda3. Síndrome Mielodisplásico
Leucemizado
1. Blastos regenerativos de tipo mieloide, con poca granularidad
2. Blastos regenerativos del tipo basófilos
3. Leucemia Mieloblástica Aguda sin Maduración
4. Leucemia Mieloblástica Aguda con maduración
5. Leucemia Basófila Aguda
CD19CD13, CD33CD34MPOHLA-DRCD14
CD10, TDTCD4, CD8CD3CD16+56CD20
Positivo Negativo
CD13, CD33CD34MPOHLA-DR
CD19, CD20CD10, TDTCD4, CD8CD3CD16+56CD14
Positivo Negativo
R1 15.53 %R2 6.31 %
1. Leucemia MielomonocíticaAguda
2. Leucemia Mieloblástica Aguda3. Síndrome Mielodisplásico
Leucemizado
1. Blastos regenerativos de tipo mieloide, con poca granularidad
2. Blastos regenerativos del tipo basófilos
3. Leucemia Mieloblástica Aguda sin Maduración
4. Leucemia Mieloblástica Aguda con maduración
5. Leucemia Basófila Aguda
• En su conjunto la muestra analizada PODRÍAcorresponder a un trastorno mieloproliferativobifenotípico
• No se puede descartar la presencia de otro inmunofenotipo celular no identificado, ni de un sustrato de base del tipo mielodisplásico
• Citometría de flujo:
• Principios básicos.
• Presentación de datos.
• Inmunofenotipificación de leucemias y linfomas:
• Utilidad y clasificación.
• Inmunofenotipo normal.
• Casos clínicos reales.
Tópicos Revisados
Juan Luis Castillo N., T.M. MsCLaboratorio de Citometría de Flujo
Hospital del Trabajador Concepción.Departamento de Especialidades Médicas
Facultad de MedicinaUniversidad de Concepción
Miércoles 06 de Septiembre de 2006
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Inmunofenotipificación Celular:Leucemias y Linfomas por Citometría de Flujo