IDENTIFIKASI MAGROFAG

DENGAN METODE FLOW

CYTOMETRY

By: Mat Zudi

Mulyadi

Makrofag jaringan berasal dari monosit

Monosit berdiferensiasi menjadi makrofag karena meninggalkan darah dan memasuki jaringan

Dalam jaringan, makrofag dapat merespon rangsangan aktivasi

Respon hospes terhadap infeksi akan mengaktifkan/merespon imunitas humoral(antibodi) dan imunitas seluler (limfosit T) termasuk magrofag

Magrofag

Sel-sel sistem makrofag terdapat pada : jaringan ikat longgar berupa makrofag

atau histiosit didalam darah berupa monosit Didalam hati melapisis sinusoid dikenal

dengan sel kupffer Makrofag perivasculer sinusoid limpa,

limponodus, dan sumsum tulang Pada susunan saraf pusat berupa

mikroglia yang berasal dari mesoderm.

FUNGSI MAKROFAG : Fungsi utama adalah melahap partikel dan

mencernakannya oleh lisosom dan mengalirkan sejumlah substansi yang berperan dalam fungsi pertahanan dan perbaikan

Dalam sistem imun tubuh sel ini berperan serta dalam mempengaruhi aktivitas dari respon imun, merreka menelan, memproses dan menyimpan antigen dan menyampaikan informasi pada sel-sel yang berdekatan secara imunologis kompeten (limfosit dan sel plasma)

Makrofag yang aktif juga merupkan sel sektori yang dapat mengeluarkan beberapa substansi penting, termasuk enzim-enzim lisosim, elastase, kolagenase, 2 protein dari sistem komplemen dan gen antivirus penting (interferon).

MARKER/PENANDA UNTUK MAGROFAG

Makrofag dapat diidentifikasi dengan ekspresi tertentu dari sejumlah protein termasuk CD14, CD11b, F4/80 (tikus) / EMR1 (manusia), CD68 dan MAC-1/MAC-3 dengan sitometri atau pewarnaan imunohistokimia. Salah satu reseptor penting fungsional dalam biologi makrofag adalah PECAM-1 (CD31), yang, melalui adhesi homophilic, menentukan mana sel-sel akan phagocytosed.

FLOW CYTOMETRI

Flow cytometri adalah suatu metode yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi karakteristik permukaan setiap sel dengan kemampuan memisahkan sel-sel yang berada dalam suatu suspensi menurut karakteristik masing-masing secara automatis melalui suatu celah yang ditembus oleh seberkas sinar laser

Metode flow cytometry terus berkembang sejalan dengan perkembangan elektrik komputer dan reagen, termasuk digunakannya monoklonal antibodi.

Sampai saat ini, pengukuran dengan flow cytometry menggunakan label flouresensi, selain mengukur jumlah, ukuran sel, juga dapat mendeteksi petanda dinding sel, granula intraseluler, struktur intra sitoplasmik, dan inti sel.

Prosedur pewarnaan melibatkan membuat suspensi sel tunggal dari kultur sel atau sampel jaringan. Sel-sel tersebut kemudian diinkubasi dalam tabung atau piring mikro dengan antibodi berlabel atau fluorochrome-label. Sel tersebut kemudian dianalisis pada flow cytometer.

IDENTIFIKASI MAGROFAGa. Bahan1. 1,2 × 10 7 sel / ml tes suspensi sel:

makrofag dari setiap kompartemen anatomi2. Dulbecco yang phosphate-buffered saline

tanpa kalsium dan magnesium3. Pharm Lyse melisiskan Buffer 4. Solusi blokir: 5% (v / v) FBS di PBS5. Fc reseptor blocking antibodi: anti-CD16/32 6. Fluoresensi-berlabel antibodi monoklonal

(mAbs)7. Cytofix / Cytoperm Kit8. 2% paraformaldehyde

b. Siapkan sel 

1. Dimasukkan 1,2 × 10 7 sel per sampel ke tabung polypropylene alas bulat 14-ml dan pelet sel dengan sentrifugasi selama 10 menit pada 400 × g , 4 ° C.

2. Resuspend sel dengan 5 ml dingin Dulbecco yang phosphate-buffered saline (tanpa kalsium dan magnesium) per sampel dan centrifuge 10 menit pada 400 × g , 4 ° C. diangakat sel supernatan dan resuspend dalam 2 ml suhu kamar 1 × BD Pharm Lyse penyangga melisiskan. Inkubasi 2 menit pada suhu kamar.

3. Langkah ini adalah untuk melisiskan sel darah merah. Dalam beberapa kasus (misalnya, makrofag sumsum tulang), langkah ini tidak diperlukan.

4. Centrifuge sel 10 menit pada 400 × g , 4 ° C. Jika pelet masih merah, ulangi langkah lisis. Jika tidak, buang supernatan dan resuspend sel dalam 1 ml larutan blocking. Menghitung sel dengan hemacytometer.

5. Beberapa kontaminasi RBC tidak masalah karena sel-sel ini mudah gated pergi selama sitometri.

6. Untuk setiap sampel uji sel, tambahkan 100 ml 1 × 10 7 sel / ml suspensi sampai lima sumur dari U-pelat bawah 96-(1 × 10 6 sel total).

7. Sel di sumur tidak ada. 5 adalah kontrol, yang tidak menerima antibodi. Sumur kontrol penting karena mereka digunakan untuk menyesuaikan autofluorescence berasal dari sel itu sendiri. Makrofag biasanya menunjukkan autofluorescence tinggi.

c. Stain sel dengan antibodiDalam tiga dari lima sumur, sel-sel akan diwarnai

dengan mAbs individu, dan dalam sel-sel baik keempat akan diwarnai dengan koktail yang mengandung ketiga mAbs.

8. Tambahkan 1 ml Fc-reseptor antibodi menghalangi satu sama baik dan menetaskan selama 15 menit di atas es.

9. Langkah ini disertakan untuk memblokir pengikatan mAbs berlabel pada reseptor Fc, yang berlimpah disajikan pada makrofag.

10. Tambahkan konsentrasi yang tepat dari anti-F4/80-PE ke sumur no. 1, anti-CD11b-PerCP-Cy5.5 ke sumur no. 2, dan anti-F4/80-PE dan anti-CD11b-PerCP-Cy5.5 ke sumur no. 4.

CONT...

11. Langkah ini akan noda antigen permukaan makrofag. Seringkali kedua antigen yang cukup untuk mengidentifikasi makrofag dalam suatu populasi.

12. Jauhkan piring 96-baik dalam gelap pada suhu 4 ° C selama 30 menit.

13. Centrifuge piring selama 5 sampai 10 menit pada 400 × g , 4 ° C, dalam pembawa piring.

14. Buang supernatan dari sumur dengan cepat "menjentikkan" isi piring ke wastafel atau dengan aspirasi hati. Hati-hati untuk tidak mengganggu pelet.

15. Vortex sebentar untuk melonggarkan pelet.16. Tambahkan 100 ml Cytofix / Cytoperm reagen (dari

BD Cytofix / Cytoperm Kit) untuk masing-masing dengan baik dan menetaskan selama 20 menit dalam gelap pada suhu 4 ° C.

CONT...17. Langkah ini akan permeabilize sel untuk pewarnaan

intraseluler.18. Centrifuge 10 menit pada 400 × g , 4 ° C, dan cuci dua

kali dengan 200 ml dari 1 × Perm / Cuci penyangga dari Cytofix / Cytoperm Kit.

19. Centrifuge selama 5 sampai 10 menit pada 400 × g , 4 ° C, dan membuang supernatan.

20. Vortex hati-hati untuk melonggarkan pelet.21. Tambahkan 50 ml 1 × Perm / Cuci penyangga dari

Cytofix / Cytoperm Kit ke masing-masing dan menambahkan anti-CD68-FITC ke sumur no. 3 dan 4.

22. Perlu gelap pada suhu 4 ° C selama 30 menit.23. Centrifuge selama 5 sampai 10 menit pada 400 × g , 4 °

C, dan menghapus supernatan. Cuci pelet dua kali dengan 200 ml dari 1 × Perm / Cuci penyangga, pemusingan 5 menit pada 400 × g , 4 ° C, dan membuang supernatan setiap kali.

d.Menganalisis sel24. Resuspend sel dalam PBS dan transfer

ke 1,2-ml tabung klaster polypropylene untuk analisis langsung, atau memperbaiki dalam 200 ml 2% paraformaldehyde dan toko pada 2 ° sampai 8 ° C dalam gelap.

25. Sel tetap yang harus dianalisis dalam waktu 18 jam.

26. Dilakukan analisis dengan metode flow cytometry

EKSPRESI DARI MAGROFAG F4/80 DAN CD