Flow Sitometri – Akan Hücre Ölçer Akım Sitometrisi

Günnur Deniz DETAE

İmmünoloji Anabilim Dalı gdeniz@istanbul.edu.tr

Sitoloji

Mikroskop Gözlemci Morfoloji

İmmünositoloji

Boya işaretli monoklonal antikorlar

(mab) Membran/hücre içi

yapılar

Mikroskop Akan hücre ölçer

Laserbeam (Argon 15 mV)

Fluidics Flow cell

Detectors/Computer

Akan hücre ölçer prensibleri

Süspansiyon halindeki hücreleri bir akış

kanalından, belli bir hızda tek tek geçerken sınıflandıran sistem

Akan hücre ölçer nedir?

•  çok sayıda hücre analizi (106 hücre) •  kısa sürede analiz •  „gating-kapılama“ hücre popülasyonlarının analizi •  rare events ölçümü •  floresan yoğunluğunun objektif ölçümü •  her hücrede 8-10 parametrenin saptanabilmesi

Avantajları

Multiparametrik analizler

Simultane olarak çok sayıda parametrenin analizi

Hücre büyüklüğü Hücre yapıları Boyalar

•  Örnek toplayıcı ve taşıyıcı sistem •  Akış sistemi (sheat fluid) •  Işık kaynağı •  Sferik ve çapraz silindirik filtreler •  Odaklama aynaları •  Sinyal dedektörleri •  Bilgisayarlar •  Ayırma mekanizması

Prensipleri

Amaç: Tek hücre seviyesinde analiz Çözüm: Hydrodynamic focusing

Akan hücre ölçer - prensipleri

Hidrolik sistem Hidrolik sistem partiküllerin sistem sıvısı ile birlikte lazer ile buluştukları nokta flow cell - flow kabin’e taşınması

Optik sistem

Işık sinyallerinin oluşumunu ve toplanmasını sağlar Elektronik sistem

Optik sinyalleri amplifiye ederek elektrik sinyallerine dönüştürür. Elektrik sinyalleri bilgisayar tarafından işlenir ve analiz edilir

Akan hücre ölçer hangi sistemlerinden oluşur?

Hydrodynamic Focusing

Hücre + örnek sıvısı

Cell-free Sheath fluid

Dedeksiyon

düşük flow akımı

yüksek flow akımı Akselerasyon

Laser

Kapiller

Flow kabin

Sheath/Sistem Sıvısı Sheath Sample/Örnek

Laminar Flow

Sheath Sheath/Sistem Sıvısı Sample/Örnek

Laminar Flow

Yüksek örnek basıncı Geçen numune miktarı 60µl/dk

Düşük örnek basıncı Geçen numune miktarı 12µl/dk

Hydrodynamic focusing

FL1

Red Diode Laser ~635 nm

SSC

FL3

FL4

670LP

661/16

585/42

488/10

90/10 Beam Splitter

DM 560SP

Floresans toplama lensi

DM 640LP

Yarım Ayna

488/10 488 nm

Blue Laser

FSC Diode

FL2

530/30

Beam Combiner Flow Cell

Optik sistem (FACSCalibur)

Lazer Dalgaboyu Nominal Yaygın Kullanılan (nm) Güç (mW) Florokromlar

Argon ion 488 (blue) 15.0 FITC, PE, PerCP,

PerCP-Cy 5.5, PI Diode 647 635 (red) 3-5 APC, Alexa Fluor®

Lazer

Multilaser flow sitometri

Dedektör Filtre Renk Florokrom FL1 530/30nm yeşil FITC/Alexaflour 488

(515-545) FL2 585/42nm sarı/turuncu PE

(561-609) FL3 670 koyu kırmızı PerCP, PreCP-Cy5.5

670 ve yukarısı PE-Cy5, PE-Cy7 FL4 661/16nm kırmızı APC, Alexa Flour 647

(653-677)

Filtreler

Signal Out LIN

Photon In

   Pre-    Amplifier

Time

FSC

Voltage Pulses LIN

LOG

Fotodiyot parametreleri FSC

Elektronik sistem

Lazer

Lazer

Lazer

Zaman

Volt

aj

Zaman Vo

ltaj

Zaman

Volt

aj

Voltaj değerlerinin oluşması

Alanı

Genişliği

FL2-

H

Yüks

ekliğ

i

40 0

Volt

s

FL2-A

FL2-W

Voltaj değerlerinin hesaplanması

Voltage In

PMT Power Supply

Signal Out LOG

Time

FL4

Time

FL3

Time

FL2

Time

FL1

Time

SSC

Photon In

LIN

LOG

Elektronik sistem

Data Processor

boards

Ora

nge

FSC

Green

SSC

Red

Green

Orange

SSC

FSC

Time

Time

Time

Time

Time

1023 500 0

Hüc

re S

ayıs

ı

510 500 490 Florasan yoğunluğu artar

Histogram plotunda kanallara göre hücrelerin yerleştirilmesi

Aynı florasan yoğunluğuna sahip olan hücreler aynı kanala yerleştirilir

Dijital ortamda görüntüleme/Dot Plot

Parametreler

Laser

Side-Scatter (SSC) = hücre içi yapılar

Forward-Scatter (FSC) = büyüklük

Fluorescence intensity (FL) = antijen ekspiresyonu

Side

Sca

tter

Forward Scatter

0 20

0 40

0 60

0 10

00

0 200 400 600 800 1000

800

Eosinofiller

Monositler

Nötrofiller

Lenfosit

Trombosit ve Eritrositler

Bazofil

Antijen 1

Antijen 2

Antijen 3

Tanıma

Tanıma

Tanıma

epitop antikor

Monoklonal antikorlar

CD = cluster of differentiation

İnsan lökosit antijenlerine karşı tüm antikorların klasifikasyonu (VI. Workshop, Kobe 1997) Bir CD-numarası aynı insan antijenini saptayan tüm antikor klonlarını içerir

Ör: CD34 mab-klonları:Q Bend 10, 581, Immu-133

Fluorokromlar

Floresan boyamada antikorlar aracılığı ile antijeni göstermek için kullanılan

renk maddeleri

ışığı absorbe edebilen molekül

komponentleridir, aromatik halkalardır

dalga boyu uzun enerji düşük dalga boyu kısa enerji yüksek

Fluorokromlar

Lambalar Xenon Xenon/Mercury

Laserler

Argon lon (Ar) Krypton (Kr) Violet 405 Helium Neon (He-Ne) Helium Cadmium (He-Cd) Krypton-Argon (Kr-Ar)

Eksitasyon kaynakları

Işık Farklı dalga boyları arasında seyahet eden elektromanyetik enerji

Dalga boyunun uzunluğu (lenght) RENK

Yüksek enerji

Düşük enerji

UV İnfrared

Görülebilen alan 380-700nm

K P S Y M M

488nm eksitasyonla sık kullanılan boyalar

FITC 520

PE 575

ECD 615

PC5 665

LAZER 488

PI 620

<390 λ 400-450 λ 450-500 500-570 λ 570-590 λ 590-620 λ

620-750 λ >750 λ

ultra- violet blue gr een yellow orange red infra- violet red

λ

FITC = Fluorescein Isothiocyanate PE = Phycoerythrin (RD1)

ECD = Energy Coupled Dye

PI = Propidium Iodide

PC5 = Phycoerythrin Cyanin 5 (PC5)

CD13 PE-RD1 CD19 PC5 CD33

yüksek CD45 FITC HLA-DR

CD3

düşük örnek konjuge

Antijen miktarı

Fluorokrom seçimi

ANTİKORUN TİTRASYONU ÖNEMLİDİR

FARKLI DİLÜSYONLARDA ANTİKOR

KULLANARAK ORTALAMA KANAL FLORESAN DEĞERİ ‘MCF’

SAPTANMALIDIR

HER YENİ ANTİKORDA KONTROL

Örnekler

Hücre süspansiyonu

•  Kan •  Kemik iliği •  BAL •  Eklem sıvısı •  Plevra sıvısı •  Ascites •  Tumor

Boyama Teknik

HEDEF

multiparametrik-analiz

PE

FITC

Fluorokrom işaretli antijen sipesifik mab

(FITC, PE)

Tek bir hücrede farklı antijenlerin saptanması

İŞARETLİ ANTİKOR

Direkt işaretleme

PRİMER ANTİKOR

İŞARETLİ İKİCİ ANTİKOR

İndirekt işaretleme

İndirekt işaretlemenin avantaj ve dezavantajları

Ø  İkinci antikor birden fazla primer antikorun işaretlenmesinde kullanılabilir

Ø  İşaretli olmayan antikorlar, işaretli primer antikorlardan daha ucuzdur

Ø  Her zaman işaretli primer antikor mevcut değildir

Ø  İndirekt işaretleme az sayıda eksprese olan epitoplara sahip hücrelerin saptanmasında faydalıdır

FITC FITC FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

Floresan yoğunluğu

A B

C

Gating-Kapılama

ZweiparameterKorrelation FSC= Zellgröße SSC= Zellstruktur Morphologie

MessungvonSubpopulationenz.B.Lymphozyten

Ziel

FSC = hücre büyüklüğü

SSC = hücre yapısı

Hücre alt gruplarının Analizi

ör. Lenfositler

İki parametrenin korelasyonu

Sinyal analizi

Kapılama Görüntülenmek istenen hücre populasyonunun saptanması

Kadran Negatif ve pozitif populasyonların belirlenmesi

için kullanılır

UL UR

LL LR

Kapılanan Bölge ve Kadran İstatistiği

Kadranlar

Negatif

Çift pozitif

Tek pozitif

Tek pozitif 13.1 59.5

27.1

0.4

0 50 100 150 200 250

0 50

10

0 15

0 20

0 25

0

FSC-Height

CD19

PE

CD3 FITC

10 0

10 0

10 1

10

2

10 3

10

4

10 1 10 2 10 3 104

R1

10 4

CD3 APC

CD4

FITC

10 0 10 1 10 2 10 3

10 0

10 1

10

2

10 3

10

4

CD3 APC CD

8 PE

10

0 10

1

10 2

10

3

10 4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD4 FITC 10 4

CD8

PE

10 0

10 1

10

2

10 3

10

4

10 0 10 1 10 2 10 3

CD4 FITC

Nokta alan Kontur alan

Nükleik asit asit boyası SYTO-9 ile boyanmış E. Coli

SSC

FL1

Sayı

3 Boyutlu Grafik

BOYAMA

n  TEK

n  İKİ

n  ÜÇ

n  DÖRT

n  ON SEKİZ

CD4 CD19 CD8 CD3 CD56

488 nm 575 nm Fluorescein molecule

Fluo

resc

ence

Int

ensity

Wavelength (nm) 450 500 550 600 650

Overlap of FITC fluorescence in PE PMT Overlap of PE fluorescence in FITC PMT

PE molecule

Emisyon sırasında farklı boyaların spektrumlarının birbirine geçmesi durumu

Kompenzasyon

FL1

FL2

Kompenzasyon Yapılmamış

Kompenzasyon Yapılmış

FL1

FL2

FITC - PE

Önce

Sonra

Flurosence Minus One (FMO)

Çok renkli boyamalarda kullanılır

Fazla photon - (hücreler daha cok parlar) ölçümlerde hata riski artar

Dogru kompanzasyon yapıldıgında tüm kanallara yayılma ile sonuclanır fakat parlak populasyonlarda daha fazla oldugu gozlenmis

Örnekte aynı hücre tiplerinin bir fluorokrom eksigi ile boyanması

Deneyin kapılama kontrolü olarak kabul edilebilir. 

High-Speed Sorter Analyzer

Bench top A / S

İmmün sistem

Hücresel immün yanıt

Hümoral immün yanıt

T B

G M

Membran yapıları antijenler/reseptörler

Hücreiçi yapılar sitokinler enzimler

Akan hücre ölçer - uygulamalar

•  Hücresel immün fenotipleme •  İmmün yetmezlikler •  Bronko alveolar lavaj •  Transplantasyon monitoring •  Tedavi monitoring •  Otoimmün hastalıklar •  HLA-tiplemesi •  Lösemi lenfoma tiplemesi •  Stem ve progenitör hücrelerin belirlenmesi •  Retikülosit sayımı •  Sepsis takibi •  Oxidatif burst •  Fagositoz •  Enzim ve enzim aktivitelerinin saptanması •  Trombosit analizi •  DNA analizi •  Multi-drug resistance •  Hücre proliferasyonu •  Apoptoziz

The Turkish Journal of Pediatrics 2004; 46: 125-130

%CD45=%CD3+%CD19+%NK T=%CD3=%CD4+%CD8

IU, DETAE, 2012

CD45

CD4

CD8

CD3

CD19 CD16+CD56+ HLA-DR

CD3 CD3

Sağlıklı

IU, DETAE, 2012

HIV

IU, DETAE, 2012

Rituximab

İmmunfenotiplemede artefakt nedenleri

Ø  İlaçlara Bağlı

Ø  Zidovudine (AZT): Granülosit frajilitesi artar

Ø  Antibiyotikler (Cephalosporinler): Hücrelerin öz ışımasını (Otofloresans) artırırlar, yanlış pozitifliklere yol açarlar

Ø  Anti kanser ilaçlar (Daunorubicin): Hücrelerin öz ışımasını (Otofloresans) artırırlar, yanlış pozitifliklere yol açarlar

Ø  Nikotin: Lenfosit marjinasyonu nedeni ile lenfosit sayısı azlığına yol açarlar, absolut lenfosit sayısı normalden daha düşük izlenir

Ø  Kortikosteroidler: CD4+ hücre oranını azaltırlar

Ø  Biyolojik Faktörler

Ø  Retikülositoz: Eritrosit lizisinin tam sağlanamaması lökosit popülasyonuna eritrosit bulaşması

Ø  Aşırı eksersiz: Lenfosit marjinasyonunun artışı, absolut lenfosit sayılarında azalma

Ø  Güniçi değişkenlik: NK düzeylerinin sabah daha düşük, akşamüzeri daha yüksek olması vb.

Özellikle granülosit ve trombosit gibi frajil hücrelerin çabuk

bozulması, ölü hücrelerin analiz alanında yanlış sonuçlara yol

açmasına neden olabilir.

Uygun olmayan ısıda, uygun olmayan antikoagülan içinde taşınan

hücrelerin membran yapıları değişirken yüzeydeki antijen

reseptörleri de değişime uğrar.

Örnek alma, taşıma ve saklama koşulları

Geçme/Kalma kriteri

Rapor Oluşturma

Günlük Kalite Kontrol

Lazer Ayarının Kontrolü

Floresan Kalibrasyonu

İşlem/Yöntem Kontrolü

GEÇ

Örneği Geçirme

Hasta Analizi

Sonuçları Elde Etme

Sorun Giderme

KAL

Teknik Servis

Sorunun Çözümü

Renk Kompenzasyon

Klinik

Laboratuvar

Sinyal analizi Antijen yoğunluğu ~ Fluorescence intensity = X Kanal sayısı

0 Kanal sayısı 1024

Hücre sinyali Hücre sayısı

% + A hücreler Antijen yoğunluğu

A

X kanal sayısı

En yüksek maximum sinyalin saptandığı değer o antikor için

uygulanması gereken dilüsyondur