Upload
homero-planck
View
229
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
UdeC
Citation preview
AbsorciometríaSolución
PoP
Fluorimetría
Po
Detector
PF
Luz emitida
Detector
Solución
ABSORCIOMETRIA vs. FLUORIMETRIA/FOSFORIMETRIA
D. von Baer 2003
Fluorescencia y Fosforescencia Molecular• Son procesos fotoluminiscentes en que molécula emite
radiación que absorbió• Fluorescencia: Si emisión ocurre HASTA 10- 8 seg
después de absorción de luz• Fosforescencia: Si emisión ocurre DESPUES de 10- 8 seg
de Absorción de luz
• Absorción de luz obedece a ecuación: E = h *
Energía (erg)
Cte. de Planck
(erg seg)
Frecuencia(ciclos
seg)
• Niveles energéticos de las moléculas: relacionados con enlaces moleculares
D. von Baer 2003
Estado electrónico fundamental
2° singlete excitado
1er singlete excitadoA
bsor
ciónAbs
orci
ón
So
S2
S1
Fluorescencia y Fosforescencia
Ener
gía
Energía absorbida por la mo-lécula se puede disipar como: • Calor• Reacción Fotoquímica• Calor + Fluoresencia• Calor + Fosforescencia
D. von Baer 2003
Estado electrónico fundamental
2° singlete excitado
1er singlete excitadoCal
or
Fluo
resc
enci
a (<
10-8
seg)
Abs
orci
ónAbs
orci
ón
So
S2
S1
Fluorescencia y Fosforescencia
Ener
gía
D. von Baer 2003
Cruce entresistemas
Estado electrónico fundamental
2° singlete excitado
1er singlete excitado
1er triplete excitadoC
alor
Fluo
resc
enci
a (<
10-8
seg)
Abs
orci
ónAbs
orci
ón
So
S2
S1
T1
Reo
rden
amie
nto
inte
rno
Fluorescencia y Fosforescencia
Ener
gía
D. von Baer 2003
Cruce entresistemas
Estado electrónico fundamental
2° singlete excitado
2° triplete excitado
1er singlete excitado
1er triplete excitadoC
alor
Fluo
rese
ncia
(<10
-8se
g)
Abs
orci
ónAbs
orci
ón
Fosf
ores
cenc
ia
(> 1
0-8se
g)
So
S2
S1
T2
T1
Reo
rden
amie
nto
inte
rno
Fluorescencia y Fosforescencia
Ener
gía
D. von Baer 2003
Ranura
Selecc. excitación
FuenteLumi-nosa
Muestra
Filtro
Lectura Amplificador Detector
Luz transmitidaLuz emitida
Selecc. excitación
Po P
PF
(ESPECTRO) FLUORIMETRO
D. von Baer 2003
Ranura
Selecc. excitación
FuenteLumi-nosa
Muestra
Filtro
Lectura Amplificador Detector
Luz transmitidaLuz emitida
Selecc. emisión
Po P
PF
(ESPECTRO) FLUORIMETRO
D. von Baer 2003
Ranura
Selecc. excitación
FuenteLumi-nosa
Muestra
Filtro
Lectura Amplificador Detector
Luz transmitidaLuz emitida
Selecc. emisión
Po P
PF
(ESPECTRO) FLUORIMETRO
Lámpara de alta intensidad emisión• Xe: espectro continuo • Hg: esp. discreto
De alta sensibilidad (Fotomultiplicador)
Filtro omonocromador
Filtro omonocromador
D. von Baer 2003
CUBETAS DE MEDIDA FLUORIMETROS• Cuatro caras transparentes• Según rango , de vidrio o de cuarzo• Fluorimetría: técnica de muy alta sensiblidad
CUBETAS MUY LIMPIAS SOLVENTES MUY PUROS
Normal Para volúmenes pequeños
D. von Baer 2003
% I
Concentración0
100
Determinaciones Cuantitativas en Fluorimertía
Para soluciones diluídas: % I = k * c
Calibración escala de lectura:
Con blanco
Con Solución más concentrada
D. von Baer 2003
Ejemplos de Aplicaciones de la FluorimetríaEn Bioquímica: Cuantificación de DNA: Microplacas Cuantificación de AMP cíclico Estudios de enlace molecular (Binding)
En Química Ambiental: Detección de Compuestos Aromáticos Policíclicos Cuantificación de iones en aguas mediante reactivos Fluorogénicos
En Biología Celular: Estudios de enlace (binding) celular Determinación de Ca, K, Cl y pH en células mediante distintos
reactivos cromogénicos
En Inmunología: Cuantificación de Reacciones de Inmunoflurescencia
D. von Baer 2003
Absorciometría
Turbidimetría
Nefelometría
Solución
Luz transmitida
Suspensión
PoP
Po
Po
P
Ps
Detector
Luz dispersada
ABSORCIOMETRIA, TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA
D. von Baer 2003
Absorciometría
Turbidimetría
Nefelometría
Solución
Luz transmitida
Suspensión
PoP
Po
Po
P
Ps
Detector
Luz dispersada
ABSORCIOMETRIA, TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA
D. von Baer 2003
Absorciometría: Se mide luz absorbida
Turbidimetría: se mide disminución luz transmitida
Nefelometría: se mide directa-mente la luz dispersada
Solución
Luz transmitida
Suspensión
PoP
Po
Po
P
Ps
Detector
Luz dispersada
ABSORCIOMETRIA, TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA
D. von Baer 2003
DETERMINACIONES CUANTITATIVAS EN TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA
• En suspensiones diluídas, para un haz de rayos paralelos y una dada
log P/ Po = k b c
Dispersión de luz en la suspensión depende de:Número de partículas (concentración)Tamaño y forma de las partículas de la radiación. La luz azul de (< ) es dispersada más que luz roja
INTERFERENCIAS• Cualquier reabsorción de luz afectará medición luz DISPERSADA
Elegir en que muestras tengan mínimo de absorción Dependencia de T°, densidad y muchos otros parámetros
• Aplicaciones prácticas de turbidimetría y nefelometría generalmente se basan en procedimientos empíricos y se debe tomar especial cuidado en reproducir todas las condiciones de trabajo: T°, densidad, pH, agitación, concentración de reactivos y muchos otros parámetros
D. von Baer 2003
DETERMINACIONES CUANTITATIVAS EN TURBIDIMETRIA y NEFELOMETRIA
• En suspensiones diluídas• Para un haz de rayos paralelos• A una dada
log P/ Po = k b c
Dispersión de luz en la suspensión depende de:Número de partículas (concentración)Tamaño y forma de las partículas de la radiación. A Luz azul de (< ) es dispersada más que luz roja
INTERFERENCIAS• Cualquier reabsorción de luz afectará medición luz DISPERSADA
Elegir en que muestras tengan mínimo de absorción Número de partículas (concentración) Dependencia de T°, densidad y muchos otros parámetros
D. von Baer 2003
Ejemplos de Aplicaciones de la Turbidimetría y NefelometríaEn Química Clínica: Cuantificación de Proteínas en Líquidos Biológicos mediante Reactivo de Precipitación – Ac. Sulfosalicílico
En Química Ambiental: Determinación de turbidez de agua Cuantificación de iones en aguas mediante reactivos de precipitación. Ej: sulfato
En Microbiología: Cuantificación del número de células en un medio de cultivo : Curva de Crecimiento
En Inmunología: Cuantificación de Reacciones de Precipitación con Inmunoglobulinas altamente selectivas
D. von Baer 2003