核酸杂交技术徐艺文 16307130289

一、技术原理核酸杂交技术原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化

因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。

把经酶切的、电泳分离的、经碱变性后生成单链分子的待检测核酸片段转印到特定的膜上，用已知特定序列的标记探针与之杂交，以检验该核酸片段是否与已知的探针有同源序列。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为 DNA 印迹杂交（Southern blot

hybridization ）和 RNA 印迹杂交（Northern blot hybridization）。核酸分子杂交的操作程序如下图所示：

制备待测核酸样品

分离、变性、转移、固化 DNA 片段

预杂交

制备核酸探针

标记核酸探针

加入标记核酸探针

核酸探针是指带有标记的某一特定 DNA 或 RNA 片段，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。

最常用的探针是 DNA 探针，DNA 探针又分为寡核苷酸探针、基因组 DNA 探针和 cDNA 探针其优点在于，这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖制备方法简便，且 DNA 探针相对不易被降解，一般 DNA 酶活性能有效的被抑制，它的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR

标记法等，能用于放射性核素和非放射性物质标记。另一类探针是 RNA 探针，优点在于杂交效率高稳定性高，非特异性杂交较

少，未杂交探针可以用 RNase 降解，减少本底的干扰，但它易降解，而且标记方法较为复杂。

标记探针与为标记探针

缺口平移法的制作原理大致如上图所示，而下图是随机引物法的大致原理图，随机引物是含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，在下图过程中，可见其保留了 5’->3’DNA 聚合酶活性，弱 3’->5’外切酶活性，无 5’->3’外切酶活性

而要分离杂交探针，则需先提取某一病原微生物株系的染色体 DNA，后用限制性内切酶进行酶解，得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库，文库中重组质粒的插入片段可用以分别同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA 进行杂交、筛选。

二、技术应用：目前，已有很多病毒基因探针可用于病毒病原学的研究，如乙型肝炎病毒、

单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒和轮状病毒等等。人们用这些病毒基因探针检查血清、体液及相应组织中病毒基因，探讨病

缺口平移法原理图

随机引物法原理图

毒基因与肿瘤和其它一些疾病的关系。我们曾应用 HFRSV 探针检测 HFRS尸检组织中广泛分布有 HFRSV。并与组织免疫复合物沉积、病毒抗原分布和病理变化结合分析，以探讨 HFRS 的发病机理。

核酸分子杂交在肿瘤学中主要用于探讨病毒基因与肿瘤发生的关系、检测肿瘤组织中癌基因并探讨病毒致癌基因用于肿瘤病理诊断的可能性。

病毒基因与肿瘤的关系的研究较多，如鼻咽癌与 HBV，传染性单核细胞增多症、Burkitt’s淋巴瘤与 EBV，宫颈癌与 HSV、HPV-16，肝癌与 HBV 等肿瘤性疾病与病毒感染的关系。其方法主要是通过癌组织中病毒基因的检测来分析二者之间的相关关系。

用核酸杂交检测癌组织及癌旁组织、癌前病变的癌基因的报道也很多。这些研究的目的主要是探讨癌基因在其肿瘤发生学中的意义。研究曾从微量石蜡包埋的胃癌组织中制备 DNA，采用聚合酶链反应（PCR）和寡脱氧核苷酸（ODN）探针杂交方法，检测我国胃癌患者组织中是否存在 H-ras癌基因第 12

位密码子的 G->T突变，结果在 17例胃癌中有 5例存在这种点突变。而 7例胃溃疡无 1例发生突变，提示 H-ras癌基因第 12位密码子的 G->T突变可能导致胃癌中癌基因的激活。

病毒致癌基因是被逆转录病毒所转导的，细胞致癌基因存在正常细胞内，它可被特异的点突变、启动因子诱导，基因扩增和染色体的重排等激活，应用病毒癌基因探针可检测细胞癌基因序列，一旦致癌机理被了解后，探针即可用于肿瘤的＂基因诊断＂。人类遗传病的诊断核酸杂交可用于人类遗传病的产前诊断。其方法是从羊

水中分离胚胎纤维母细胞或取绒毛膜细胞的 DNA，经酶切以吸印法将 DNA 转移

至硝酸纤维滤膜上，与特异的基因探针杂交，从酶切图谱的变化可对某些遗传病做出诊断。目前已能对 60 种生化遗传病做出产前诊断。经典的核酸杂交法为Southern 杂交，常用于疾病的产前诊断，如镰形细胞贫血、苯丙酮酸尿症、血友病、假肥大性肌营养不良等等。

除以上三方面外，目前核酸杂交已广泛用于细菌、病毒和寄生虫病的诊断和流行病学调查，以及某些疾病发病机理的探讨等。三、技术优缺点：

检测某一疾病的病因是否由病毒引起的主要手段是采用体外敏感细胞感染和组织培养分离病毒，电镜观察组织寻找病毒颗粒，血清学方法和免疫细胞化学方法检测组织病毒抗原等等。核酸杂交方法与这些传统方法比较，具有高特异性及快速的优点，灵敏度和可靠性极高，而且不依赖于病毒的复制，可检查细胞中已存在的病毒基因，而在对寄生虫感染的诊断方法中，杂交方法可以分辨不同种的寄生虫，不需要以前有寄生虫感染病史，从理论上说，用此方法来诊断疾病可用于对所有的致病微生物的检测；但其缺点也很明显，花费高、步骤多，有时会有假阳性和假阴性。

Southern 杂交