ศดรจระพนธ กรงไกร 1

ศดร จระพนธ กรงไกร (jerapankchulaacth)

Ancient Egypt Fermentation

Fundamentals of Cell and Molecular Biologyเซลลและชววทยาโมเลกลพนฐาน

รหสวชา 3000109 - Academic Year 2014

httpbiochemmdchulaacth

ศดรจระพนธ กรงไกร 2

History of Enzymology

In 1860 L Pasteur identified fermentation of glucose to alcohol is done by yeast

Discovery of Zymase (Diastase) in yeast by E Buchner (NP 1907) and A Harden (NP

1929) sucrose ethanol

In 1926 J Sumner showed the enzyme (urease) is a protein (NP 1946)

In 1930 J Northrop crystallized preteases in gastro-intestinal tract (= proteins) (NP 1946)

In 1934 D Hodgkin did x-ray diffraction of pepsin (for 3-dimensional structure) (NP 1964)

Ancient Egypt Fermentation

In 1878 Willy Kunhe coined the word ldquoenzymerdquo

Enzumersquo = in yeast or ferment (Greek)

ศดรจระพนธ กรงไกร 3

Telomere-Telomerase

H Florey (NP 1945) purified lysozyme hydrolysing cell wall mucopolysaccharides

A Kornberg (NP1959) discovered DNA polymerase in 1957

S Ochoa (NP 1959) discovered RNA polymerase

C Anfinsen S Moore W Stein (NP 1972) discovered catalysis of ribonuclease

D Baltimore R Dulbecco HM Temin (NP 1975) discovered reverse transcriptase (RNA-gtDNA)

W Arber D Nathans H Smith (NP 1978) discovered restriction endonuclease

P Boyer J Walker (NP 1997) discovered ATP synthase

JC Skou (NP 1997) discovered NaK-ATPase

ศดรจระพนธ กรงไกร 4

เอนไซม (Enzyme)Learning objectives The students should be able to

1 Define enzyme

2 Describe structure and function enzyme regarding protein components cofactors

metal ions prosthetic groups and coenzymes

3 Describe enzyme specificity regarding structure of substrate and active site of enzyme

4 Describe effects of an enzyme catalyzed reaction

5 Describe the velocity of an enzyme catalyzed reaction as function of substrate

concentration using Michaelis-Menten equation

6 Discuss factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations

pH temperature

7 Discuss irreversible competitive noncompetive and uncompetitive inhibition

of enzyme

8 Discuss the regulation of enzyme activity regarding allosteric enzyme proenzyme

isozyme and covalent modification

9 Discuss the roles of enzymes in clinical application

ศดรจระพนธ กรงไกร 5

Learning contents 1 Definition of enzyme ribozyme and deoxyribozyme

2Characteristics of enzyme activation energy of an enzyme catalyzed reaction

efficiency specificity cofactors (metal ions prosthetic groups coenzymes)

classification nomenclature

3 Enzyme active site substrate-enzyme binding catalytic mechanisms

4 Kinetics of enzyme Michaelis-Menten equation Lineweaver-Burk plot

5 Factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations pH

temperature

6 Inhibition (irreversible competitive noncompetitive uncompetitive) and activation

of enzyme activity

7 Regulation of enzyme activity allosteric enzyme proenzyme isozyme covalent

modification

8 Clinical application of enzyme laboratory diagnosis therapy drug target and

enzyme defect

ศดรจระพนธ กรงไกร 6

เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)

เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม

ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา

และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ

ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน

1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)

2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)

3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency amp turnover)

Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)

ศดรจระพนธ กรงไกร 7

E

substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P

เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป ( gt108 ) เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E

มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน

เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง

A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได

NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)

thus rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary

ศดรจระพนธ กรงไกร 8

Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at

25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks

polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years

RNA hydrolysis 4 years 9 days

DNA hydrolysis 140000 years 22 years

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme

(the first enzyme of hemechlorophyll synthesis)

OMP decarboxylase is the second one

ศดรจระพนธ กรงไกร 9

ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

(Red = no cofactor)

ศดรจระพนธ กรงไกร 10

ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา

การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo

ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก

โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo

เปน catalyst ทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป

Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme (DNAzyme) = Catalytic nucleic acids

(nucleic acids catalyst efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )

ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy

cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท

ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)

Ribozyme and Deoxyribozyme rRNA

ศดรจระพนธ กรงไกร 11

peptidyl transferase on 23S rRNA

of 50S ribosome as ribozyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 2

History of Enzymology

In 1860 L Pasteur identified fermentation of glucose to alcohol is done by yeast

Discovery of Zymase (Diastase) in yeast by E Buchner (NP 1907) and A Harden (NP

1929) sucrose ethanol

In 1926 J Sumner showed the enzyme (urease) is a protein (NP 1946)

In 1930 J Northrop crystallized preteases in gastro-intestinal tract (= proteins) (NP 1946)

In 1934 D Hodgkin did x-ray diffraction of pepsin (for 3-dimensional structure) (NP 1964)

Ancient Egypt Fermentation

In 1878 Willy Kunhe coined the word ldquoenzymerdquo

Enzumersquo = in yeast or ferment (Greek)

ศดรจระพนธ กรงไกร 3

Telomere-Telomerase

H Florey (NP 1945) purified lysozyme hydrolysing cell wall mucopolysaccharides

A Kornberg (NP1959) discovered DNA polymerase in 1957

S Ochoa (NP 1959) discovered RNA polymerase

C Anfinsen S Moore W Stein (NP 1972) discovered catalysis of ribonuclease

D Baltimore R Dulbecco HM Temin (NP 1975) discovered reverse transcriptase (RNA-gtDNA)

W Arber D Nathans H Smith (NP 1978) discovered restriction endonuclease

P Boyer J Walker (NP 1997) discovered ATP synthase

JC Skou (NP 1997) discovered NaK-ATPase

ศดรจระพนธ กรงไกร 4

เอนไซม (Enzyme)Learning objectives The students should be able to

1 Define enzyme

2 Describe structure and function enzyme regarding protein components cofactors

metal ions prosthetic groups and coenzymes

3 Describe enzyme specificity regarding structure of substrate and active site of enzyme

4 Describe effects of an enzyme catalyzed reaction

5 Describe the velocity of an enzyme catalyzed reaction as function of substrate

concentration using Michaelis-Menten equation

6 Discuss factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations

pH temperature

7 Discuss irreversible competitive noncompetive and uncompetitive inhibition

of enzyme

8 Discuss the regulation of enzyme activity regarding allosteric enzyme proenzyme

isozyme and covalent modification

9 Discuss the roles of enzymes in clinical application

ศดรจระพนธ กรงไกร 5

Learning contents 1 Definition of enzyme ribozyme and deoxyribozyme

2Characteristics of enzyme activation energy of an enzyme catalyzed reaction

efficiency specificity cofactors (metal ions prosthetic groups coenzymes)

classification nomenclature

3 Enzyme active site substrate-enzyme binding catalytic mechanisms

4 Kinetics of enzyme Michaelis-Menten equation Lineweaver-Burk plot

5 Factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations pH

temperature

6 Inhibition (irreversible competitive noncompetitive uncompetitive) and activation

of enzyme activity

7 Regulation of enzyme activity allosteric enzyme proenzyme isozyme covalent

modification

8 Clinical application of enzyme laboratory diagnosis therapy drug target and

enzyme defect

ศดรจระพนธ กรงไกร 6

เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)

เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม

ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา

และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ

ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน

1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)

2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)

3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency amp turnover)

Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)

ศดรจระพนธ กรงไกร 7

E

substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P

เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป ( gt108 ) เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E

มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน

เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง

A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได

NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)

thus rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary

ศดรจระพนธ กรงไกร 8

Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at

25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks

polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years

RNA hydrolysis 4 years 9 days

DNA hydrolysis 140000 years 22 years

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme

(the first enzyme of hemechlorophyll synthesis)

OMP decarboxylase is the second one

ศดรจระพนธ กรงไกร 9

ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

(Red = no cofactor)

ศดรจระพนธ กรงไกร 10

ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา

การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo

ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก

โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo

เปน catalyst ทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป

Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme (DNAzyme) = Catalytic nucleic acids

(nucleic acids catalyst efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )

ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy

cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท

ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)

Ribozyme and Deoxyribozyme rRNA

ศดรจระพนธ กรงไกร 11

peptidyl transferase on 23S rRNA

of 50S ribosome as ribozyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 3

Telomere-Telomerase

H Florey (NP 1945) purified lysozyme hydrolysing cell wall mucopolysaccharides

A Kornberg (NP1959) discovered DNA polymerase in 1957

S Ochoa (NP 1959) discovered RNA polymerase

C Anfinsen S Moore W Stein (NP 1972) discovered catalysis of ribonuclease

D Baltimore R Dulbecco HM Temin (NP 1975) discovered reverse transcriptase (RNA-gtDNA)

W Arber D Nathans H Smith (NP 1978) discovered restriction endonuclease

P Boyer J Walker (NP 1997) discovered ATP synthase

JC Skou (NP 1997) discovered NaK-ATPase

ศดรจระพนธ กรงไกร 4

เอนไซม (Enzyme)Learning objectives The students should be able to

1 Define enzyme

2 Describe structure and function enzyme regarding protein components cofactors

metal ions prosthetic groups and coenzymes

3 Describe enzyme specificity regarding structure of substrate and active site of enzyme

4 Describe effects of an enzyme catalyzed reaction

5 Describe the velocity of an enzyme catalyzed reaction as function of substrate

concentration using Michaelis-Menten equation

6 Discuss factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations

pH temperature

7 Discuss irreversible competitive noncompetive and uncompetitive inhibition

of enzyme

8 Discuss the regulation of enzyme activity regarding allosteric enzyme proenzyme

isozyme and covalent modification

9 Discuss the roles of enzymes in clinical application

ศดรจระพนธ กรงไกร 5

Learning contents 1 Definition of enzyme ribozyme and deoxyribozyme

2Characteristics of enzyme activation energy of an enzyme catalyzed reaction

efficiency specificity cofactors (metal ions prosthetic groups coenzymes)

classification nomenclature

3 Enzyme active site substrate-enzyme binding catalytic mechanisms

4 Kinetics of enzyme Michaelis-Menten equation Lineweaver-Burk plot

5 Factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations pH

temperature

6 Inhibition (irreversible competitive noncompetitive uncompetitive) and activation

of enzyme activity

7 Regulation of enzyme activity allosteric enzyme proenzyme isozyme covalent

modification

8 Clinical application of enzyme laboratory diagnosis therapy drug target and

enzyme defect

ศดรจระพนธ กรงไกร 6

เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)

เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม

ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา

และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ

ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน

1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)

2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)

3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency amp turnover)

Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)

ศดรจระพนธ กรงไกร 7

E

substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P

เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป ( gt108 ) เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E

มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน

เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง

A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได

NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)

thus rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary

ศดรจระพนธ กรงไกร 8

Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at

25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks

polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years

RNA hydrolysis 4 years 9 days

DNA hydrolysis 140000 years 22 years

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme

(the first enzyme of hemechlorophyll synthesis)

OMP decarboxylase is the second one

ศดรจระพนธ กรงไกร 9

ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

(Red = no cofactor)

ศดรจระพนธ กรงไกร 10

ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา

การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo

ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก

โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo

เปน catalyst ทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป

Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme (DNAzyme) = Catalytic nucleic acids

(nucleic acids catalyst efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )

ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy

cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท

ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)

Ribozyme and Deoxyribozyme rRNA

ศดรจระพนธ กรงไกร 11

peptidyl transferase on 23S rRNA

of 50S ribosome as ribozyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 4

เอนไซม (Enzyme)Learning objectives The students should be able to

1 Define enzyme

2 Describe structure and function enzyme regarding protein components cofactors

metal ions prosthetic groups and coenzymes

3 Describe enzyme specificity regarding structure of substrate and active site of enzyme

4 Describe effects of an enzyme catalyzed reaction

5 Describe the velocity of an enzyme catalyzed reaction as function of substrate

concentration using Michaelis-Menten equation

6 Discuss factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations

pH temperature

7 Discuss irreversible competitive noncompetive and uncompetitive inhibition

of enzyme

8 Discuss the regulation of enzyme activity regarding allosteric enzyme proenzyme

isozyme and covalent modification

9 Discuss the roles of enzymes in clinical application

ศดรจระพนธ กรงไกร 5

Learning contents 1 Definition of enzyme ribozyme and deoxyribozyme

2Characteristics of enzyme activation energy of an enzyme catalyzed reaction

efficiency specificity cofactors (metal ions prosthetic groups coenzymes)

classification nomenclature

3 Enzyme active site substrate-enzyme binding catalytic mechanisms

4 Kinetics of enzyme Michaelis-Menten equation Lineweaver-Burk plot

5 Factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations pH

temperature

6 Inhibition (irreversible competitive noncompetitive uncompetitive) and activation

of enzyme activity

7 Regulation of enzyme activity allosteric enzyme proenzyme isozyme covalent

modification

8 Clinical application of enzyme laboratory diagnosis therapy drug target and

enzyme defect

ศดรจระพนธ กรงไกร 6

เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)

เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม

ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา

และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ

ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน

1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)

2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)

3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency amp turnover)

Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)

ศดรจระพนธ กรงไกร 7

E

substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P

เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป ( gt108 ) เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E

มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน

เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง

A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได

NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)

thus rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary

ศดรจระพนธ กรงไกร 8

Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at

25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks

polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years

RNA hydrolysis 4 years 9 days

DNA hydrolysis 140000 years 22 years

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme

(the first enzyme of hemechlorophyll synthesis)

OMP decarboxylase is the second one

ศดรจระพนธ กรงไกร 9

ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

(Red = no cofactor)

ศดรจระพนธ กรงไกร 10

ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา

การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo

ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก

โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo

เปน catalyst ทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป

Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme (DNAzyme) = Catalytic nucleic acids

(nucleic acids catalyst efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )

ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy

cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท

ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)

Ribozyme and Deoxyribozyme rRNA

ศดรจระพนธ กรงไกร 11

peptidyl transferase on 23S rRNA

of 50S ribosome as ribozyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 5

Learning contents 1 Definition of enzyme ribozyme and deoxyribozyme

2Characteristics of enzyme activation energy of an enzyme catalyzed reaction

efficiency specificity cofactors (metal ions prosthetic groups coenzymes)

classification nomenclature

3 Enzyme active site substrate-enzyme binding catalytic mechanisms

4 Kinetics of enzyme Michaelis-Menten equation Lineweaver-Burk plot

5 Factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations pH

temperature

6 Inhibition (irreversible competitive noncompetitive uncompetitive) and activation

of enzyme activity

7 Regulation of enzyme activity allosteric enzyme proenzyme isozyme covalent

modification

8 Clinical application of enzyme laboratory diagnosis therapy drug target and

enzyme defect

ศดรจระพนธ กรงไกร 6

เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)

เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม

ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา

และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ

ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน

1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)

2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)

3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency amp turnover)

Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)

ศดรจระพนธ กรงไกร 7

E

substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P

เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป ( gt108 ) เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E

มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน

เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง

A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได

NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)

thus rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary

ศดรจระพนธ กรงไกร 8

Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at

25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks

polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years

RNA hydrolysis 4 years 9 days

DNA hydrolysis 140000 years 22 years

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme

(the first enzyme of hemechlorophyll synthesis)

OMP decarboxylase is the second one

ศดรจระพนธ กรงไกร 9

ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

(Red = no cofactor)

ศดรจระพนธ กรงไกร 10

ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา

การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo

ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก

โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo

เปน catalyst ทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป

Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme (DNAzyme) = Catalytic nucleic acids

(nucleic acids catalyst efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )

ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy

cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท

ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)

Ribozyme and Deoxyribozyme rRNA

ศดรจระพนธ กรงไกร 11

peptidyl transferase on 23S rRNA

of 50S ribosome as ribozyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 6

เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)

เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม

ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา

และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ

ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน

1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)

2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)

3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency amp turnover)

Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)

ศดรจระพนธ กรงไกร 7

E

substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P

เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป ( gt108 ) เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E

มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน

เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง

A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได

NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)

thus rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary

ศดรจระพนธ กรงไกร 8

Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at

25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks

polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years

RNA hydrolysis 4 years 9 days

DNA hydrolysis 140000 years 22 years

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme

(the first enzyme of hemechlorophyll synthesis)

OMP decarboxylase is the second one

ศดรจระพนธ กรงไกร 9

ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

(Red = no cofactor)

ศดรจระพนธ กรงไกร 10

ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา

การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo

ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก

โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo

เปน catalyst ทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป

Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme (DNAzyme) = Catalytic nucleic acids

(nucleic acids catalyst efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )

ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy

cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท

ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)

Ribozyme and Deoxyribozyme rRNA

ศดรจระพนธ กรงไกร 11

peptidyl transferase on 23S rRNA

of 50S ribosome as ribozyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 7

E

substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P

เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป ( gt108 ) เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E

มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน

เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง

A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได

NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)

thus rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary

ศดรจระพนธ กรงไกร 8

Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at

25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks

polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years

RNA hydrolysis 4 years 9 days

DNA hydrolysis 140000 years 22 years

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme

(the first enzyme of hemechlorophyll synthesis)

OMP decarboxylase is the second one

ศดรจระพนธ กรงไกร 9

ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

(Red = no cofactor)

ศดรจระพนธ กรงไกร 10

ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา

การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo

ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก

โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo

เปน catalyst ทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป

Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme (DNAzyme) = Catalytic nucleic acids

(nucleic acids catalyst efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )

ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy

cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท

ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)

Ribozyme and Deoxyribozyme rRNA

ศดรจระพนธ กรงไกร 11

peptidyl transferase on 23S rRNA

of 50S ribosome as ribozyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 8

Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at

25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks

polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years

RNA hydrolysis 4 years 9 days

DNA hydrolysis 140000 years 22 years

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme

(the first enzyme of hemechlorophyll synthesis)

OMP decarboxylase is the second one

ศดรจระพนธ กรงไกร 9

ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

(Red = no cofactor)

ศดรจระพนธ กรงไกร 10

ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา

การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo

ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก

โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo

เปน catalyst ทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป

Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme (DNAzyme) = Catalytic nucleic acids

(nucleic acids catalyst efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )

ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy

cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท

ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)

Ribozyme and Deoxyribozyme rRNA

ศดรจระพนธ กรงไกร 11

peptidyl transferase on 23S rRNA

of 50S ribosome as ribozyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 9

ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน

Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33

(Red = no cofactor)

ศดรจระพนธ กรงไกร 10

ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา

การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo

ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก

โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo

เปน catalyst ทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป

Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme (DNAzyme) = Catalytic nucleic acids

(nucleic acids catalyst efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )

ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy

cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท

ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)

Ribozyme and Deoxyribozyme rRNA

ศดรจระพนธ กรงไกร 11

peptidyl transferase on 23S rRNA

of 50S ribosome as ribozyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 10

ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา

การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo

ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก

โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo

เปน catalyst ทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป

Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme (DNAzyme) = Catalytic nucleic acids

(nucleic acids catalyst efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )

ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy

cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท

ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)

Ribozyme and Deoxyribozyme rRNA

ศดรจระพนธ กรงไกร 11

peptidyl transferase on 23S rRNA

of 50S ribosome as ribozyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 11

peptidyl transferase on 23S rRNA

of 50S ribosome as ribozyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 12

Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 13

การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร

ES P

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร14

รป เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P

โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง

1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา

Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26 kcalmol

(ground state)

Linus Pauling

(1946)

with Enzyme

without Enzyme

Sucrose hydrolysis with sucrase 9 kcalmol

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 15

E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆ G Dagger หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)

คา Ea หรอ ∆ G Dagger น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P

โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state

ในภาวะ transition state ดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถก

เปลยนเปน P

E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)

E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน

รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย

ES P

Keq (equilibrium constant = [P][S])

Van Hoff equation NP 1901

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 16

E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement (increase catalysis) by entropy reduction

Less disorder

More order

disorder

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 17

2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)

E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108 -1019 เทา จากปฏกรยาทไมม E (สวนใหญ ~1015 เทา)

[Arginine decarboxylase = 1019 เทา Orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 1017 เทา]

ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน

เพยง 102-106 เทา

3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)

E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย

(chemical specificity)

E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน

จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms

( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)

รวมทง cis- และ trans- forms ดวย

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 18

4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)

41 metal ion (14 metals)-Ref

Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals = 41)

Cu Co Mo Na K Ni V W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)

Se (15-trace element)-gluathione peroxidase (ltlt) Ni V W Cd = non trace elements

E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)

โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site

ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 19

Ref Waldron et al Nature 460 823-830 (Aug 2009)

Examples of metalloenzymes

Mg hexokinase phosphofructokinase enolase

Zn carboxyl peptidase alcohol dehydrogenase

Fe cytochrome oxidase catalase

Mn glycosyltransferase

Ca lipase lecithinase

Cu tyrosinase

Co methionine synthase

Mo xanthine oxidase

W formate dehydrogenase

Cu-Zn superoxide dismutase (SOD)

Fe-S enzymes of mitochondrial electron transporting system(complex I II III)

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 20

42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen) [approx 20 of enzyme]

เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions

มทงชนดทไมจบแนน (non-covalent) และชนดทจบแนน (covalent) กบ E ท active site

coenzymes ทเปนวตามน Bเชน thiamine (B-1) riboflavin (B-2) niacin (B-3)

pantothenate (B-5) pyridoxine (B-6) folic acid cobalamine (B-12)

vitamins C and K

(A Todd showed that the coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)

1 ชนดทไมจบแนน เชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด

เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 21OH Warburg NP 1931-structure of NADH

Vitamin niacin (B-3) or nicotinate

Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)

TTP (thiamine pyrophosphate)- eg enzyme pyruvate dehydrogenase

NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide NAD phosphate)

Pyridoxal phosphate

Coenzyme A (CoA has pantothenate component)

Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamine

coenzymes ทไมเปนวตามน เราสรางไดเอง เชน biopterin [nitric oxide (NO)

synthase and aromatic amino acid hydroxylase Phe Tyr]

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 22

2 ชนดทจบแนน (tightly bound-covalent) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic

group เชน

a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of

cytochrome oxidase (complex IV)

Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme

(inactive E) (active E)

b) Biotin (vitamin B-7) prosthetic group of many carboxylases

eg pyruvate or acetyl-CoA carboxylase

Iron porphyrin (heme) complex

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 23

การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 24

Class Catalysis Examples

1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase

2 Transferases transfer functional transaminase kinase methyltransferase

groups(1-C glycosyl)

3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase

4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase

C=O C-N bonds

5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase

6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase

molecules

ตาราง แสดงประเภทการเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม

การแบงประเภทเอนไซม

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 25

ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)

class 1 oxidoreductase

subclass 11 acting on CH-OH group of donor

subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor

serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase

systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase

trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase

เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ

เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase

Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease

การเรยกชอเอนไซม

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 26

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 27

กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)

primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)

secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)

quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)

monomeric enzyme

(very few)

dimer

tetramer

pepsin

subunit

oligomeric enzyme

(majority)

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 28

รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site

มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม

E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site

ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได

active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ

กบโมเลกลของ E

E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 29

ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน

1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)

E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง

(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ

กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)

2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1958)

S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ

active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected

like glove (E) and hand (S) enters to it)

รป Model แสดงการจบ

ระหวาง substrate และ

enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 30

ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม

1 E จบกบ S ท active site (ES complex)

2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)

3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)

ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)

4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)

5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)

6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)

(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second

lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)

E lt----------------------------------- ES ----------gt EShellipgtEP ----------gt P

electrostatic stabilization

Ionic interaction

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 31

รป การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme

CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain

CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 32

รป แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย

พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69

N

C

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 33

รป ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ

Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA

มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145

ม Zn2+ ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69

มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S (electrostatic stabilization themost important energy contribution in energy catalysis)

เกดการเปลยนแปลงโครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย (conformational change)

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 34

รป ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ

active site ของ carboxypeptidase

กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S

มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis

สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product

Base catalysis

Acid catalysis

Covalent intermediate

Proximity effect decrease entropy

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 35

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 36

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 37

Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern

orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 38

3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)

TIM barrel

top view (dimer)side view (monomer)

45 Aring62 Aring

40 Aring

ศดรจระพนธ กรงไกร 39

Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution

Structural Change of OMPDC upon binding of UMP

ศดรจระพนธ กรงไกร 40

Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency

Turnover EfficiencyConclusion Part I

Catalysis

Specificity

Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible

ศดรจระพนธ กรงไกร 41

จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)

Kinetics = Study of reaction rate

ศดรจระพนธ กรงไกร 42รป ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา

จลนศาสตรของเอนไซม

1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)

โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย

Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)

ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม

อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P

v

ศดรจระพนธ กรงไกร 43

รป ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา

2 ความเขมขนของ S

คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป

(saturation)

คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ

คา v จะเรยกวา initial velocity

ศดรจระพนธ กรงไกร 44 รป ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด

3 pH

E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum

การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต

(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด

ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย

ศดรจระพนธ กรงไกร 45

รป ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม

4 อณหภม

ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน

ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน

ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน

ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง

E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล

ศดรจระพนธ กรงไกร 46

5 ความดนบรรยากาศ (pressure)

คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได

6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)

คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา

ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป

ทาใหมผลตอ activity ของ E ได

47

สมการของ Michaelis-Menten

พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกลาง k1 k3

E + S ES E + P

k2

สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา

จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco

ncen

trat

ion

time

EES

PS

steady state

pre-steady state

ศดรจระพนธ กรงไกร 48

รป ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate

([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km

เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]

Km=

Vmax

(k2+k3)k1

V

Michaelis constant

คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ

จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด

Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 49

จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v กบ [S] ดงน

v = V max [S] _____________________(1)

Km + [S]

คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา

เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S

Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 40

Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency

Turnover EfficiencyConclusion Part I

Catalysis

Specificity

Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible

ศดรจระพนธ กรงไกร 41

จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)

Kinetics = Study of reaction rate

ศดรจระพนธ กรงไกร 42รป ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา

จลนศาสตรของเอนไซม

1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)

โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย

Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)

ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม

อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P

v

ศดรจระพนธ กรงไกร 43

รป ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา

2 ความเขมขนของ S

คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป

(saturation)

คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ

คา v จะเรยกวา initial velocity

ศดรจระพนธ กรงไกร 44 รป ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด

3 pH

E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum

การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต

(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด

ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย

ศดรจระพนธ กรงไกร 45

รป ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม

4 อณหภม

ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน

ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน

ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน

ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง

E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล

ศดรจระพนธ กรงไกร 46

5 ความดนบรรยากาศ (pressure)

คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได

6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)

คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา

ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป

ทาใหมผลตอ activity ของ E ได

47

สมการของ Michaelis-Menten

พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกลาง k1 k3

E + S ES E + P

k2

สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา

จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco

ncen

trat

ion

time

EES

PS

steady state

pre-steady state

ศดรจระพนธ กรงไกร 48

รป ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate

([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km

เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]

Km=

Vmax

(k2+k3)k1

V

Michaelis constant

คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ

จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด

Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 49

จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v กบ [S] ดงน

v = V max [S] _____________________(1)

Km + [S]

คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา

เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S

Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 41

จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)

Kinetics = Study of reaction rate

ศดรจระพนธ กรงไกร 42รป ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา

จลนศาสตรของเอนไซม

1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)

โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย

Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)

ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม

อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P

v

ศดรจระพนธ กรงไกร 43

รป ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา

2 ความเขมขนของ S

คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป

(saturation)

คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ

คา v จะเรยกวา initial velocity

ศดรจระพนธ กรงไกร 44 รป ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด

3 pH

E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum

การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต

(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด

ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย

ศดรจระพนธ กรงไกร 45

รป ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม

4 อณหภม

ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน

ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน

ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน

ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง

E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล

ศดรจระพนธ กรงไกร 46

5 ความดนบรรยากาศ (pressure)

คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได

6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)

คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา

ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป

ทาใหมผลตอ activity ของ E ได

47

สมการของ Michaelis-Menten

พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกลาง k1 k3

E + S ES E + P

k2

สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา

จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco

ncen

trat

ion

time

EES

PS

steady state

pre-steady state

ศดรจระพนธ กรงไกร 48

รป ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate

([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km

เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]

Km=

Vmax

(k2+k3)k1

V

Michaelis constant

คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ

จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด

Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 49

จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v กบ [S] ดงน

v = V max [S] _____________________(1)

Km + [S]

คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา

เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S

Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 42รป ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา

จลนศาสตรของเอนไซม

1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)

โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย

Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)

ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม

อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P

v

ศดรจระพนธ กรงไกร 43

รป ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา

2 ความเขมขนของ S

คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป

(saturation)

คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ

คา v จะเรยกวา initial velocity

ศดรจระพนธ กรงไกร 44 รป ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด

3 pH

E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum

การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต

(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด

ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย

ศดรจระพนธ กรงไกร 45

รป ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม

4 อณหภม

ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน

ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน

ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน

ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง

E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล

ศดรจระพนธ กรงไกร 46

5 ความดนบรรยากาศ (pressure)

คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได

6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)

คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา

ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป

ทาใหมผลตอ activity ของ E ได

47

สมการของ Michaelis-Menten

พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกลาง k1 k3

E + S ES E + P

k2

สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา

จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco

ncen

trat

ion

time

EES

PS

steady state

pre-steady state

ศดรจระพนธ กรงไกร 48

รป ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate

([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km

เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]

Km=

Vmax

(k2+k3)k1

V

Michaelis constant

คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ

จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด

Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 49

จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v กบ [S] ดงน

v = V max [S] _____________________(1)

Km + [S]

คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา

เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S

Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 43

รป ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา

2 ความเขมขนของ S

คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป

(saturation)

คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ

คา v จะเรยกวา initial velocity

ศดรจระพนธ กรงไกร 44 รป ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด

3 pH

E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum

การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต

(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด

ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย

ศดรจระพนธ กรงไกร 45

รป ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม

4 อณหภม

ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน

ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน

ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน

ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง

E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล

ศดรจระพนธ กรงไกร 46

5 ความดนบรรยากาศ (pressure)

คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได

6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)

คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา

ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป

ทาใหมผลตอ activity ของ E ได

47

สมการของ Michaelis-Menten

พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกลาง k1 k3

E + S ES E + P

k2

สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา

จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco

ncen

trat

ion

time

EES

PS

steady state

pre-steady state

ศดรจระพนธ กรงไกร 48

รป ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate

([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km

เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]

Km=

Vmax

(k2+k3)k1

V

Michaelis constant

คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ

จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด

Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 49

จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v กบ [S] ดงน

v = V max [S] _____________________(1)

Km + [S]

คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา

เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S

Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 44 รป ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด

3 pH

E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum

การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต

(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด

ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย

ศดรจระพนธ กรงไกร 45

รป ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม

4 อณหภม

ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน

ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน

ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน

ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง

E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล

ศดรจระพนธ กรงไกร 46

5 ความดนบรรยากาศ (pressure)

คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได

6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)

คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา

ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป

ทาใหมผลตอ activity ของ E ได

47

สมการของ Michaelis-Menten

พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกลาง k1 k3

E + S ES E + P

k2

สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา

จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco

ncen

trat

ion

time

EES

PS

steady state

pre-steady state

ศดรจระพนธ กรงไกร 48

รป ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate

([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km

เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]

Km=

Vmax

(k2+k3)k1

V

Michaelis constant

คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ

จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด

Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 49

จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v กบ [S] ดงน

v = V max [S] _____________________(1)

Km + [S]

คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา

เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S

Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 45

รป ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม

4 อณหภม

ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน

ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน

ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน

ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง

E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล

ศดรจระพนธ กรงไกร 46

5 ความดนบรรยากาศ (pressure)

คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได

6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)

คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา

ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป

ทาใหมผลตอ activity ของ E ได

47

สมการของ Michaelis-Menten

พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกลาง k1 k3

E + S ES E + P

k2

สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา

จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco

ncen

trat

ion

time

EES

PS

steady state

pre-steady state

ศดรจระพนธ กรงไกร 48

รป ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate

([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km

เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]

Km=

Vmax

(k2+k3)k1

V

Michaelis constant

คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ

จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด

Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 49

จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v กบ [S] ดงน

v = V max [S] _____________________(1)

Km + [S]

คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา

เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S

Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 46

5 ความดนบรรยากาศ (pressure)

คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได

6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)

คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา

ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป

ทาใหมผลตอ activity ของ E ได

47

สมการของ Michaelis-Menten

พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกลาง k1 k3

E + S ES E + P

k2

สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา

จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco

ncen

trat

ion

time

EES

PS

steady state

pre-steady state

ศดรจระพนธ กรงไกร 48

รป ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate

([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km

เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]

Km=

Vmax

(k2+k3)k1

V

Michaelis constant

คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ

จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด

Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 49

จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v กบ [S] ดงน

v = V max [S] _____________________(1)

Km + [S]

คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา

เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S

Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

47

สมการของ Michaelis-Menten

พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกลาง k1 k3

E + S ES E + P

k2

สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา

จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco

ncen

trat

ion

time

EES

PS

steady state

pre-steady state

ศดรจระพนธ กรงไกร 48

รป ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate

([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km

เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]

Km=

Vmax

(k2+k3)k1

V

Michaelis constant

คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ

จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด

Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 49

จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v กบ [S] ดงน

v = V max [S] _____________________(1)

Km + [S]

คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา

เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S

Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 48

รป ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate

([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km

เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]

Km=

Vmax

(k2+k3)k1

V

Michaelis constant

คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ

จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด

Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 49

จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v กบ [S] ดงน

v = V max [S] _____________________(1)

Km + [S]

คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา

เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S

Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 49

จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v กบ [S] ดงน

v = V max [S] _____________________(1)

Km + [S]

คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา

เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S

Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 50

bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)

bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)

bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย

bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological

concentration ของ S ในเซลลนน- E is operating at its full capacity)

เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M

Km ของ glucokinase = 5x10-5 M

bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E

Km is the signature of the enzyme

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 51

คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา

ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท

(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)

kcat = Vmax [E] ______________________(3)

ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme

มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ

kcat = k3 = turnover number of enzyme

kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1

Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 1x106- 5x108 M-1 s-1

Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 52

จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน

Km+ [S]

1 = Km 1 + 1 _____________________(4)

v Vmax [S] Vmax

นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา

Lineweaver-Burk plotrsquorsquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม

คาทเสนตดแกน X เปน -1Km

คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax

คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax

Y = a X + b

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 53

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 54

การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม

(Enzyme inhibition and activation)

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 55

การยบยงการทางานของเอนไซม

สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)

ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน

1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo

irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site

และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups

ตวอยาง Irreversible inhibitor

สาร organophosphates

Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)

Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)

เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors

ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase

ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E

เชนเดยวกบ DIPF

Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 56

รป สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม

H H

Sarin (methylisopropylphosphofluoridate)

CH3

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 57

2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)

เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได

เรยก I นวา reversible inhibitors

แบงเปน 3 กลมดงน

21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)

I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ

ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity

ตวอยาง

1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ

ม โครงสรางคลาย succinate)

2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)

analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)

ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 58

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor

คา Km เพมขน แต Vmax คงท

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 59

Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive

inhibitor complex) Antibiotic pepstatin is pentapeptide

( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 60

HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 61

Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)

Crystal of NA-Tamiflu complex

Tamiflu

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 62

Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo

เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state

intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S

ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง

โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม

aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 63

รป การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง

ของ transition-state ในปฎกรยา

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 64

22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)

ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ

iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ

แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได

I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ

- Km คงท

- Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 65

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site

Km คงท Vmax ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 66

23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)

พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E

ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 67

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย

คา Vmax และ Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 68

การกระตนการทางานของเอนไซม

สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน

ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)

ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน

ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย

อาจเรยกวา metal ion catalysis กได

Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +

compounds 1-6 (activator)

histamine

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 69

รป Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย

Km ลดลง

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 70

การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)

Allosteric enzymeM-M enzyme

[S]

v

Allosteric enzyme

Proenzyme = zymogen Enzyme complex

Isoenzyme = isozyme

Enzyme covalent modificatiom

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 71

การควบคมการทางานของเอนไซม

1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)

เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ

(เรยกวา Cooperativity = co-op)

กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)

การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ

โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ

E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z

End product+

Feedback inhibition

Feedforward activation

21

34

S1 S2

S3S4

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 72

ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม

carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห

พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site

ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )

HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

allosteric site

allosteric site

R = relax form

T = tense (taut)

form

R = active T = inactive

active site

allosteric site

pink

active site purple

CPS II

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 73

รป แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme

Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector

มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ

เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย

ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท

allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)

Effector = ATP or CTP

Sigmoidal curve (S-shape)

ATP Km

CTP Km

C subunit

R subunit

C 6+ R 6

(allosteric site)

(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 74

2 Isozymes (Isoenzymes)

เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ

เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน

คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย

Tetramer

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 75

ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits

ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E

ถง 5 forms คอ

M4 M3H M2H2 MH3 H4

(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)

- ve ---- electrophoresis------gt + ve

M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ

isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง

ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate

เพอเขา anaerobic metabolism

ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate

เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป

M4

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 76

creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)

ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)

E มได 3 isozymes

- CK-BB พบมากทสดในสมอง

- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ

- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ

โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 77

3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)

ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ

สรางเปน inactive form กอน

เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ

ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)

ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade

proenzyme active

protease (trypsin)

chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin

pepsinogen ------------gt pepsin

(self activation H+)

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 78

protease (trypsin then chymotrypsin)

chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)

trypsin

chymotrypsin

Example of proenzyme and how does it activate I

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 79

Example of proenzyme and how does it activate II

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 80

4 Multienzyme complex (Metabolons)

PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)

Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32

E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง

ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution

ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)

fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)

glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)

purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex

as purinosome (2008-2010) Krebs cycle (10 enzymes 1987)

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 81

5 Covalent modification of enzyme at active site

E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน

ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)

เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได

กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)

Example Activity state

Low High

Glycogen synthase E-P E

Glycogen phosphorylase E E-P

6 Gene regulation

E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย

(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 82

Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)

Protein phosphorylation alters enzyme activity

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 83

Covalent modification by other modifiers

adenylylation uridylylation ADP-ribosylation

methylation cysteinylation

nitrosylation (NO) sulfhydration (H2S)

lipids (eg palmitoylationisoprenylation

farnesylation geranylgeranylation)

glutathionylation (eg enzymes of mitochondrial

electron transport system complex I II and FoF1 ATP synthase

complex- at alpha subunit) [glutathione = GluCysGly]

NB Some enzymes have several regulatory mechanisms

Eg glycogen phospholylase

- allosteric enzyme (activator = AMP inhibitor = ATP)

- covalent modification (active-E-P inactive-E)

- isozymes (a b) etc

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84

ศดรจระพนธ กรงไกร 84

End

Examination MCQs10 questions with 5 choices

• Slide Number 1
• Slide Number 2
• Slide Number 3
• Slide Number 4
• Slide Number 5
• Slide Number 6
• Slide Number 7
• Slide Number 8
• Slide Number 9
• Slide Number 10
• Slide Number 11
• Slide Number 12
• Slide Number 13
• Slide Number 14
• Slide Number 15
• Slide Number 16
• Slide Number 17
• Slide Number 18
• Slide Number 19
• Slide Number 20
• Slide Number 21
• Slide Number 22
• Slide Number 23
• Slide Number 24
• Slide Number 25
• Slide Number 26
• Slide Number 27
• Slide Number 28
• Slide Number 29
• Slide Number 30
• Slide Number 31
• Slide Number 32
• Slide Number 33
• Slide Number 34
• Slide Number 35
• Slide Number 36
• Slide Number 37
• 3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
• Slide Number 39
• Slide Number 40
• Slide Number 41
• Slide Number 42
• Slide Number 43
• Slide Number 44
• Slide Number 45
• Slide Number 46
• Slide Number 47
• Slide Number 48
• Slide Number 49
• Slide Number 50
• Slide Number 51
• Slide Number 52
• Slide Number 53
• Slide Number 54
• Slide Number 55
• Slide Number 56
• Slide Number 57
• Slide Number 58
• Slide Number 59
• Slide Number 60
• Slide Number 61
• Slide Number 62
• Slide Number 63
• Slide Number 64
• Slide Number 65
• Slide Number 66
• Slide Number 67
• Slide Number 68
• Slide Number 69
• Slide Number 70
• Slide Number 71
• Slide Number 72
• Slide Number 73
• Slide Number 74
• Slide Number 75
• Slide Number 76
• Slide Number 77
• Slide Number 78
• Slide Number 79
• Slide Number 80
• Slide Number 81
• Slide Number 82
• Slide Number 83
• Slide Number 84