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Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Fundamentos doDiagnóstico Laboratorial
deDoenças Transmissíveis
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
EPIDEMIOLOGIA
DiagnósticoLaboratorial
Epid. Analítica
Epid. Descritiva
GeoreferenciamentoSensoriamento
Remoto
Modelagem Matemática
Vacinologia
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
CONTROLE OU ERRADICAÇÃO DE DOENÇAS
ObjetividadeDiagnósticoLaboratorial
Medidas de DSA•Sacrifício•Interdição•Restrições Importação / Exportação•Indenizações•etc
$ $Sensível
EspecíficoSubjetividadeDiagnóstico Clínico
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
•Rede de Laboratórios de Diagnóstico de Referência
•Recomenda Técnicas
•Estabelece “Padrões Ouro”
World Organizationfor Animal Health
Comércio Internacionalde Animais e Produtos de Origem
Animal
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Ectoparasitas
Endoparasitas
Fungos
Protozoários
Bactérias
Rickettsias
Vírus
Prions
Diversidade de Agentes
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Abrangênciade
diagnósticodos
Laboratórios
D. Parasitárias
D. Fúngicas
D. Protozoários
D. Bacterianas
D. Virais
D. Priônicas
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
INFECÇÃO DOENÇA?
(Infectividade) (Patogenicidade)
D. Grave
D. Branda
(Virulência)
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
INFECÇÃO
EXUBERÂNCIA CLÍNICAQUEDA PRODUÇÃO
QUEDA PRODUÇÃO
DOENÇA
SUB-CLÍNICA
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Robert KochLouis Pasteur
•Carbunculo hemático
•Tuberculose
•Cólera
•Cólera Aviária
•Carbúnculo hemático
FinalSéculo
XIX
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
X
Binômio Infecção x Doença
TuberculoseRobert Koch
M. bovis
Postulados de Koch, 1877
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
POSTULADOS DE KOCH, 1877
1. A presença do agente deve ser sempre comprovada em todos os indivíduos que sofram da doença em questão e, a partir daí, isolada em cultura pura.
2. O agente não poderá ser encontrado em casos de outras doenças.
3. Uma vez isolado, o agente deve ser capaz de reproduzir a doença em questão, após a sua inoculação em animais experimentais.
4. O mesmo agente deve poder ser recuperado desses animais experimentalmente infectados e de novo isolado em cultura pura.
Agente X Doença Y
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
POSTULADOS DE EVANS
1976
ALFRED S. EVANS M.D., M.P.H.YALE UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
1- a prevalência da doença deve ser significativamente mais alta entre os expostos à causa suspeita do que entre os controles não expostos.
2- a exposição à causa suspeita deve ser mais frequente entre os atingidos pela doença do queo grupo de controle que não a apresenta, mantendo constante os demais fatores de risco.
3- a incidência da doença deve ser significantemente mais elevada entre os expostos à causa suspeita do que entre aqueles não expostos.
4- a exposição ao agente causal suspeito deve ser seguida de doença, enquanto que a distribuição do período de incubação deve apresentar uma curva normal.
5- um espectro da resposta do hospedeiro deve seguir a exposição ao provável agente, num gradiente biológico que vai do benigno ao grave.
6- uma resposta mensurável do hospedeiro, até então inexistente, tem alta probabilidade de aparecer após a exposição ao provável agente, ou aumentar em magnitude se presente anteriormente.
7- a reprodução experimental da doença deve ocorrer mais frequentemente em animais ou humanos adequadamenteexpostos à provável causa do que naqueles não expostos.
8- a eliminação ou modificação da causa provável deve diminuir a incidência da doença.
9- a prevenção ou modificação da resposta do hospedeiro face a exposição à causa provável deve diminuir a incidência ou eliminar a doença.
10- todas as associações ou achados devem apresentar consistência com os conhecimentos no campo da biologiae da epidemiologia.
POSTULADOS DE EVANS, 1976
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Doenças Multifatoriais
Doenças Associadas ao Manejo
Doenças Geneticamente Transmitidas
Compreensão Atual daMaior Complexidade do Binômio
Infecção x Doença
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Fenotípicas•Morfologia•Efeito biológico•Atividade enzimática
•Estrutura antigênica
Genotípicas•Estrutura Ácido Nucléico
S. Imune
Imunodiagnóstico
Sorodiagnóstico
R. Humoral
R. Celular
Alergodiagnóstico
Padrão
Padrão
+
+
MÉTODOS DIRETOS
MÉTODOS INDIRETOS
+
Padrão
Ident. Sorológica
Ident. Genotípica
Padrão
Fenotípicas•Estrutura antigênica
do Agente
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Fenotípicas (proteínas)
•Morfologia •Atividade biológica•Atividade enzimática•Estrutura antigênica (Identific. Sorológica)
Genotípicas (ácido nucléico)
•PCR•PCR+RFLP•Seqüenciamento
MÉTODOS DIRETOS
E
ERegiões
Codificadorasou não
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Fenotípicas (proteínas)Estrutura antigênica •Identificação Sorológica
Genotípicas (ácido nucléico)Estrutura Ácido Nucléico•PCR•PCR+RFLP•Seqüenciamento
BASES DA ESPECIFICIDADE ANTIGÊNICA E GENOTÍPICA
DOS MÉTODOS DIRETOS
Proteína x Proteína
DNA x Proteína
Complementariedade
Complementariedade
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
•Concentração
•Distribuição
Tempo da infecção
Amostra do agente
Grau de imunidade do Hospedeiro
Tropismo
População
VARIÁVEL
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Fenotípicas (proteínas)
Estrutura antigênica
SI
Y
Linf. T
Proteína x Proteína
Complementariedade
Proteína x Proteína
BASES DA ESPECIFICIDADE ANTIGÊNICA
DOS MÉTODOS INDIRETOS
Sorodiagnóstico
Imunodiagnóstico
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
•Concentração
•Distribuição
Tempo da infecção
Amostra do agente
Grau de imunidade do Hospedeiro
Tropismo
População
VARIÁVEL
SI
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
FILOGENIA
E
REATIVIDADE CRUZADA
Fenotípica e Genotípica
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Charles Darwin
•Conservação de Estruturas Fenotípicas (Antigênicas)
•Conservação de Estrutura Genotípica
AgentesPróximos
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Recursos para aumentar
da Especificidade da
Identificação Genotípica
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
A B
RFLP genômicoPCRPCR + RFLPSequenciamento
Regiões•Codificadoras•Não Codificadoras
Escolhade Regiões
Alvo
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Recursos para aumentar
da Especificidade da
Resposta Imune Humoral
•Identificação Sorológica (produção de soros padrão)Diagnóstico Direto
•Sorodiagnóstico (pesquisa de anticorpos no soro de animais)Diagnóstico Indireto
SI
+Anticorpo Monoclonal
Resposta Policlonal
Aumento da Especificidade de soros para Identificação Sorológica de Agentes
?
Antígeno usado na imunizaçãoA B
A e B
A e B
A e B
B
SIPurificação
Ag Recombinante ?
Anticorpo obtido
CromatografiaAfinidade
+Anticorpo Monoclonal
Resposta Policlonal
?
Antígeno usado no TesteA B
A e B
A e B
A e B
B
Purificação
Ag Recombinante?
Anticorpos produzidos na infecção natural
SI
Infecção NaturalSI
Competição com Anticorpos Monoclonais
Y
Y Y Y YY Y Y
Aumento da Especificidade no Sorodiagnóstico de Agentes
X
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
OS CONTEXTOS
ANALÍTICOE
DIAGNÓSTICO DE
TESTES DIAGNÓSTICOS
DE DOENÇAS TRANSMISSÍVEIS
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Teste CONTEXTO
ANALÍTICO
Teste CONTEXTO
DIAGNÓSTICO
GeraçãoDo
Analito
DetecçãoQuantificação
doAnalito Conservação
do Analito
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
O CONTEXTO
ANALÍTICODE
TESTES DIAGNÓSTICOS
DE DOENÇAS
TRANSMISSÍVEIS
Detecção do Analito
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Procedimento realizado para adetecção e / ou quantificação
de um
Analito
Conceito de Teste no contexto analítico:
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Natureza bilógica do Analito:
•Substâncias ex: colesterol , glicose, anticorpos etc.
•Microorganismosex: prions, vírus, bactérias, fungos etc
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Exemplos de ANALITOSNo Diagnóstico de Doenças Transmissíveis
•Vírus •Rickettsias•Bactérias•Protozoários•Fungos•Parasitas
•Resposta Celular•Anticorpos
Diag. Direto
Diag. Indireto
Fenotípicas•Morfologia•Efeito biológico•Atividade enzimática
•Estrutura antigênica
Genotípicas•Estrutura Ácido Nucléico
Fenotípicas•Estrutura antigênica
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
TESTEAnalítico
Geração de SINAL
NATUREZA VARIÁVEL EMENSURÁVEL
SINALCLÍNICO
ISOLAMENTO VIRAL
QUALITATIVO QUANTITATIVO
+ ou -
CONTÍNUOS DESCONTÍNUOS
•Absorb. ELISA•Radiação RIA
•Títulos de anticorpos•2 , 4, 8, 16 etc
Prenhêz
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Sensibilidade Analítica = Quanto do Analito?
Especificidade Analítica = Quais Analitos?
Características Analíticasdo Teste
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Avaliação da Sensibilidade Analítica de Testes
[Analito]
+ + + + + + --SINAL
Mensuração Objetiva
Unidades:•UFC/mL•DICT50%•µg Ag/mL•µg Ac/mL•µg DNA/mL
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
+ + --SINAL
Mensuração Subjetiva
A B C D
Arbitrariedade da escolha agentescom estrutura antigênica ou genotípica
presumivelmente semelhantes
Avaliação da Especificidade Analítica de Testes
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
SENSIBILIDADE ANALÍTICA
•Menor quantidade de elemento em análise que o teste écapaz de detectar (capaz de gerar um sinal).
Exemplo: ELISA 0,005 µg/ µL de anticorpos.IDGA = 30 µg/ µL de anticorpos
ESPECIFICIDADE ANALÍTICA
•Capacidade do teste tem de detectar só o elemento de análisee não detectar elementos de análise semelhantes.
Difícil mensuração. Exemplo:
RFC diferencia tipos A O e C VFA (+ esp. analítica)IDGA c/ VIA não diferencia A O e C (- esp. analítica)
Definições
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
O CONTEXTO
DIAGNÓSTICODE
TESTES DIAGNÓSTICOS
DE DOENÇAS
TRANSMISSÍVEISGeração do Analito
Resultado do
Teste
Qualitativo + ou -•Presença ou não do Analito
Quantitativo •[Analito]
Diagnostica condiçãodo Hospedeiro
•Infectado x Não infectado
•Doente x SadioGeração
do Analito
Conservação do Analito
Detecção do Analito
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA
•Capacidade do teste fornecer um resultado + quando oindivíduo realmente tem o parâmetro em diagnóstico (%).
ESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA
•Capacidade do teste fornecer um resultado - quando oindivíduo realmente não tem o parâmetro em diagnóstico (%).
Definições
+ -
Condição do Hospedeiro
Resultadodo
Teste
+
-
VP FP
FN VN
VP+FN VN+FP
VP+FP
VN+FN
SENS.diagn.= VP+FN
VP x 100 VN+FPVN x 100ESPEC.
diagn.=
+ -+ +
- + - -
Infectado/Doente Não Infect./ Sadio
Avaliação da Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica de Testes
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Formas de Avaliação da
Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica de Testes
Infecção Experimental Referência (Gold Standard )
Infectado Controle
TesteTeste Referência
x Teste Avaliado
População
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Formas de Avaliação da
Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica de Testes
Infecção Experimental
Infectado Controle
Teste
Críticas:
•Qual amostra do agente?
•Qual a dose?
•Qual a via?
•Quanto tempo para testar?
•Como estabelecer o controle?
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Formas de Avaliação da
Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica
Referência (Gold Standard )
Teste Referênciax
Teste Avaliado
Crítica:
•O teste em avaliação pode termaiores Sensibilidade e Especificidade
Diagnósticas que o de Referência
Ex: IBR em sêmenIsolamento x PCR
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
CONTEXTOANALÍTICO
CONTEXTODIAGNÓSTICO
Diagnostica Parâmetro:Infectado, Doente
•Sen.Diag.= Infectado / Doente e o teste foi + (%)
•Esp.Diag = N.Infectado/Sadio e o teste foi - (%)
•Sen.Anal.= Quanto de Analito detecta?
•Esp.Anal.= Detecta Analitos semelhantes?
ReagentesImunoreagentesAnimaisCélulas
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
CONTEXTOANALÍTICO
CONTEXTODIAGNÓSTICO
Diversos FatoresInterferem naGeração da
[Analito]
Diversos FatoresInterferem naDetecção da
[Analito]
SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICAESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA
FP
FN •Sensibilidade analítica insuficiente
• Especificidade analítica insuficiente(reações cruzadas)
ANALÍTICO (detecção) DIAGNÓSTICO (geração)
•Reagentes e equipam. c/ problemas
•Conservação inadequada do analito
•Tempo da infec.(antígeno / resposta imune)
•Imunodepressão / Imunotolerância
•Gama de agentes com Reação Cruzadana região
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Testes de Alta Especificidade Analítica
Tendem a apresentar
Alta Especificidade Diagnóstica
Testes de Baixa Especificidade Analítica
Tendem a apresentar
Baixa Especificidade Diagnóstica
Testes de Alta Sensibilidade Analítica
Tendem a apresentar
Alta Sensibilidade Diagnóstica
Maior risco de amplificar reações cruzadas e ruídos
Testes de Baixa Sensibilidade Analítica
Tendem a apresentar
Baixa Sensibilidade Diagnóstica
Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP
Reflexos da
Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica
dos Testes
nos diferentes momentos do
Controle de Doenças
SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICAESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA
+ -
Resultadodo
Teste
+
-
VP FP
FN VN
VP+FN VN+FP
VP+FP
VN+FN
SENS.diagn.= VP+FN
VP x 100 VN+FPVN x 100ESPEC.
diagn.=
Sem título mínCom título mín
Condição do Hospedeiro
SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICAESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA
+ -
+
-
VP FP
FN VN
VP+FN VN+FP
VP+FP
VN+FN
Valor Preditivo + =VP + FP
VPx 100
Sem título mínCom título mín
Melhora-se o VP+Diminuindo FP
Com o aumento da Espeficidade.
Resultadodo
Teste
Condição do Hospedeiro
VP + = 47/142 x 100= 33,1% VP+ = 190/270 x 100= 70,37%
INFLUÊNCIA DA PREVALÊNCIA NO VALOR PREDITIVO +
100050 950
473
95855
142858
Condição
++
--
RES.TESTE
TOTAL
TOTAL
P= 5% S= 95% E= 90%
1000
++
--
TOTAL
TOTAL
P= 20% S= 95% E= 90%
190 2708010 720 730200 800
RES.TESTE
Condição
+ -Situação real
Resultadodo
Teste
+-
VP FP
FN VN
VP+FN VN+FP
VP+FP
VN+FN
FN
VP
VP VN
FN
FP
FP
VP+ =
AltaPrevalência
BaixaPrevalência
VP
VP + FP
Saída Menor Prevalência =Teste mais Específico
Mesmo TesteSens.Diag.Esp. Diag.
VN