FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1.

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Scholtz Beáta

Molekuláris Terápiák – 1. előadás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

1.1 DEFINÍCIÓK

1.2 A BETEGSÉGEKRŐL

1.3 A BETEGSÉGMECHANIZMUSOK FELTÁRÁSÁNAK MÓDSZEREI1.3.1 A génexpresszió szabályozásának alapesetei1.3.2 Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért1.3.3 Genetikai aberrációk és betegségek1.3.4 Genom microarray-k

1.3.4.1. Array összehasonlító genom hibridizáció (aCGH)

A fejezet célja, hogy ismertesse a funkcionális genomika célkitűzéseit és legfontosabb módszereit. Konkrét példákon kereszül bemutatjuk, hogyan járulhat hozzá ez a tudományág az orvostudomány fejlődéséhez.

FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1.

4

Definíciók

Genomika: a genomok, azaz az élőlények DNS állományának vizsgálata, bioinformatikai eszközökkel. Előfeltétele: genomszekvenciák

adatbázisokban. Statikus: a genomszekvenciák elvileg nem (igen lassan) változnak.

Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával.

Funkcionális genomika:

Genotípus és fenotípus korrelációk. Globális, nagy áteresztő-képességű módszerek segítségével vizsgálni a gének és termékeik funkcióit.• Normál és patológiás állapotokban• A környezeti változások hatására• Különböző élőlények összehasonlítása

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

5

Mi a funkcionális genomika?

Funkcionális genomika: Globális (genom-szintű vagy rendszer-szintű) kísérleti módszerek kifejlesztése és alkalmazása, melyek a strukturális genomika reagenseivel és információival együtt alkalmas a gének funkcióinak vizsgálatára. Jellemzően nagy áteresztő-képességű, sok mintát vizsgáló kísérletes megközelítéseket jelent, melyeket az eredmények számítógépes, statisztikai analízise egészít ki (Hieter and Boguski 1997).

A fenotípus vizsgálatra használt funkcionális genomika elsősorban abban különbözik a klasszikus módszerektől, hogy lényegesen több mintát/adatpontot vizsgál, és erősen automatizált. Egy klasszikus génexpressziós kísérlet azt vizsgálhatja, hogy hogyan változik egy gén aktivitása az egyedfejlődés során in vivo. Modern funkcionális genomikai megközelítéssel ezzel szemben azt vizsgáljuk, hogy hogyan változik gének ezreinek-tízezreinek az aktivitása az egyedfejlődés során. (UCDavis Genome Center)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

6

• A genetikai variációk teszik lehetővé az evolúció motorjaként szolgálóadaptív változásokat.

• Bizonyos változások javítják a faj alkalmazkodó-képességét. Mások károshatásúak.

• A faj bizonyos egyedei számára a káros változatok betegséget okozhatnak.

• Molekuláris szemszögből: mutáció és variáció

• Orvosi szemszögből: patológiás állapot

Emberi betegségek: a változatok következményei

J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

7

• A genom sok régióját érintheti

• Sokféle mutációs mechanizmus létezik

• A gének és termékeik kölcsönhatásban vannak a molekuláris környezetükkel

• Az egyén olyan kölcsönhatásba kerülhet környezetével, ami elősegíti a betegség kialakulását

Miért van olyan sokféle betegség?


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

8

• Orvoslás: diagnózis, kezelés, prognózis, megelőzés

• Genetika: megérteni az egyedi fenotípus hátterét és kialakulását

• Genomika/funkcionális genomika: gének azonosítása és karakterizálása. Kromoszomális elrendeződésük, betegségekben betöltött szerepük és funkcióik

• Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával.

Egy betegség különböző perspektívákból


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

9

Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával.

• A DNS adatbázisokban tárolt referencia szekvenciák a normál és betegséggel kapcsolható szekvenciák összehasonlítására is használhatók

• A fizikai és genetikai térkép betegség-gének azonosítására alkalmas

• A proteinek szerkezetét vizsgáló kísérletek értelmezhetik a mutációk hatásait

• A géneket többféle funkcionális genomikai módszerrel tanulmányozzák

• A betegségekkel kapcsolt génekről sok minden megállapítható az ortológ gének és funkcióik összehasonlításával

Egy betegség a bioinformatika szemszögéből


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

10

Négy alapvető betegségtípus:

A betegségek alaptípusai

• Monogénes• komplex • genomikai • környezeti


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

11

Egygénes betegségek ritka többgénes patofiziológiaautoszomális dominánsautoszomális recesszívX-kapcsolt recesszív

Komplex betegségek gyakori többgénesközponti idegrendszerkardiovaszkulárisveleszületett rendellenességek

Kromoszóma elváltozások gyakori többgénes

Fertőző betegségek leggyakoribb többgénes

Környezet okozta betegségek leggyakoribb többgénes

A betegségek alaptípusaiTÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

12

• Korábban szigorúan elválasztották egymástól az egygénes és a többgénes (komplex) betegségeket. Ma már inkább átfedőnek látjuk őket.

• Az egygénes betegségeket definiálhatjuk úgy, hogy a rendellenességet elsősorban egy gén mutációi váltják ki. Ettől függetlenül, a patofiziológia kialakításában több gén is részt fog venni.

Egygénes betegségek


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

13

Betegségek alaptípusai: Komplex betegségek

• Az egygénes betegségek 90%-a serdülőkorra manifesztálódik• 1%-uk 50 éves kor fölött jelentkezik

• A komplex betegségek jellemzően később jelentkeznek• Ha korán jelentkeznek, a tünetek lényegesen súlyosabbak• Példák: fejlődési rendellenességek, korai asztma, magas vérnyomás, rák, cukorbetegség

• A komplex betegségek fenotípusa gradiens mentén változik a populációban


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

14

Komplex betegségek

Több gén felelős a kialakulásukért. A génekben található mutációk vagy szekvencia variánsok együttes kombinációja határozza meg a betegséget.

A komplex betegségek nem mutatnak Mendeli öröklődést: családokban halmozottan fordulhatnak elő, de nem szegregálódnak.Ezért a szokásos genetikai analízisekkel (pl. linkage) nem könnyűazonosítani az érintett géneket még a családok ismeretében sem.

A hajlamosító allélek gyakoriak a populációban.

Komplex betegségek például: asztma, autizmus, magas vérnyomás, elhízás,csontritkulás.


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

15

Genomi - kromoszomális - betegségek

Sok betegség hátterében kromoszomális deléciók, duplikációkvagy átrendeződések állnak. Előfordulhat aneuploidia is, azaza normálistól eltérő kromoszómaszám.

Ezeket a betegségeket bioinformatikai szempontból genomimicroarray kísérletekkel érdemes tanulmányozni.


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

16J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

17

Duchenne izomdisztrófia (1986)

Cisztikus fibrózis (1989)

Huntington betegség (1993)

BRCA1 és 2 - emlőrák (1994)

Fizikai térképezéssel azonosított betegséggének


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

18

Autoszómás dominánsBRCA1, BRCA2 1:1000Huntington chorea 1:2,500Tuberous sclerosis 1:15,000

Autosomal recessiveAlbinizmus 1:10,000Sarlósejtes anémia 1:655 (U.S. fekete)Cisztikus fibrózis 1:2,500 (Európa)Fenilketonuria 1:12,000

X-kapcsoltHemofília A 1:10,000 (férfiak)Rett szindróma 1:10,000 (nők)Törékeny X szindróma 1:1,250 (férfiak)

Egygénes betegségek


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

19

Példa:

Az ólommérgezés környezet okozta betegségnek tekinthető.Elég gyakori - az USA-ban élő gyermekek 9%-ában magas a vérólomszintje.

De ugyanolyan ólomterhelésnek kitett gyermekek fenotípusa egészen különböző lehet.

A különbséget az eltérő genetikai háttér okozza.

Következtetés: a genetikai háttér befolyásolja a környezeti tényezők vagy fertőző ágensek hatására kialakuló betegségek manifesztációját. Még egygénes betegségeknél is több gén megváltozott működése alakítjaki a végső fenotípust.

Betegségtípusok: környezet okozta betegségek


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

20

Mitokondriumok:Több mint 100 betegség-okozó mutáció ismert

Peroxiszómák:A mutációk vagy a peroxiszóma funkciót, vagy az organellumbiogenezisét érintik. Élesztőben jól modellezhetők.

Lizoszómák

Egyéb betegségtípusok: az organellumok betegségei


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

21

A humán mitokondriális genom morbiditási térképe

DiMauro and Schon, 2001

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

22

http://www.peroxisome.orgTÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

23

A betegségmechanizmusok feltárásának módszerei

Egygénes betegségek: Genetika és genomikaMódszerek: linkage analízis, genom-szintű asszociációs vizsgálatok,kromoszóma aberrációk azonosítása, genom DNS szekvenálás

Többgének betegségek: genomika, funkcionális genomika, genetika stb.A globális analízisek azonosíthatják a molekuláris terápia célpontjait!1. Betegségokozó gének: (kardiovaszkuláris, diabétesz, Alzheimer-kór)2. Gének és a környezet közötti interakciók, melyek krónikus betegségekhez

vezethetnek3. A rák különböző aspektusai

• terápiás válasz• prognózis• kiújulás

4. Alapvető kérdések a gének szabályozásával kapcsolatban.


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

24

• szervszintű (pl. agyban vagy vesében)

• az egyedfejlődés során (pl. magzati vagy felnőtt szövetek)

• a környezeti hatásokra adott dinamikus válasz (pl. korai válaszadó gének)

• betegség hatására

• génaktivitás

Génexpresszió és betegségek: jó korreláció az RNS expressziós szintek és

a fenotípus között.

A génexpresszió szabályozásának alapesetei


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

25

cDNS

DNS RNS protein

cDNS

DNS RNS protein

UniGene

SAGE

Microarray


A génexpresszió globális analíziseTÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

26

A génexpresszió az a folyamat, melynek során a génben levő információstruktúrákká (protein) és sejtbeli funkciókká fordítódik le.

A microarray alapkoncepciója, hogy egyedileg mérje a mRNS-ek mennyiségét,és ezáltal azonosítsa, mely géneket expresszálja (használja) a sejt.

Microarray

cDNS

DNS RNS protein

cDNS

DNS RNS protein

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

27

Pillanatfelvétel, mely egyszerre többezer gén aktivitását rögzíti.

Szabályos mátrixba rendezett, próbákat tartalmazó mikropöttyök összessége, ahol minden pötty egyféle szekvenciájú nukleinsavat (próbát) tartalmaz, ami egy génnek felel meg.

Génexpressziós microarray-k

A rendszer alkotóelemei:• szilárd hordozófelület• DNS próbák: cDNS vagy oligonukleotida, ismert gének homológjai• Vizsgálandó minták (mRNS-ből jelölt cDNS)• Szkenner (szignál rögzítés)• Számítógépes algoritmus (adatelemzés)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

28

Nyomtatott expressziós array-k

Affymetrix expressziós array-k

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

29

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

30

Kontroll

Teszt

Fluoreszcensen jelöltpróbák készítése

Hibridizálásmosás

szkennelés

Fluoreszcenciamérése, két csatornán

piros zöld

Adatanalízisgénexpressziós

mintázat azonosítása

Nyomtatott expressziós array-kTÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

31

Kontroll

Teszt

Biotinnal jelöltpróbák készítése

Hibridizálásfestésmosás Szkennelés

Analízis

Affymetrix expressziós array-kTÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

32

A microarray minőségi konzorcium (MAQC)

A MAQC Konzorcium cikksorozatot publikált a Nature Biotechnology-ban : 2006 szeptember, 24(9).

20 mikroarray terméket és háromféle technológiát értékeltek, 12000 RNS transzkript expresszióját vizsgálva humán tumorsejtvonalakban vagy agyszövetben. A kísérleteket végző laboratóriumok és a különböző platformok eredményeiben (szabályozott gének) nagyban megegyeztek.


TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

33

MAQC Konzorcium (2006) Nature Biotechnology 24:1151-1161TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

34

MAQC Konzorcium (2006) Nature Biotechnology 24:1151-1161TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

Documents

FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1