˚G8AB:015;:>2promix.ru/manuf/ge/chrom/sorbent.pdf · 2-ab0489=0o >g8ab:0 2ka>:>;5:c;o@=>3> 15;:0, 3> 38ab848=>< 8a. 1a: ˜5@20o ab048o

GE Healthcare

Очистка белковПриложения, отвечающие Вашим интересам

Вы должны получать качествен-

ные результаты, чистые белки и

публиковать Ваши открытия во-

время, оставаясь при этом в

рамках бюджета . Хоть это и

сложная задача, но очистка

белков никогда не должна

быть проблемой для Вас. Здесь

Вы найдете проверенные ре-

шения для многих современ-

ных задач по очистке белка, а

также обзор хроматографиче-

ских систем, сервисов и обес-

печения качества, которые мы

предоставляем для поддержки

Ваших исследований.

С приблизительно 50-летним

опытом и богатыми знаниями в

области очистки белков спе-

циалисты фирмы GE Healthcare

всегда готовы помочь Вам в

получении наилучших резуль-

татов.

Содержание

Очистка белков, меченых гистидином 3

2-стадийная очистка высокомолекулярного белка, меченного гистидином 4Масштабирование очистки белка, меченного гистидином 5Продукция для очистки белков, меченных гистидином 6

Очистка GST-меченых белков 7

1-стадийная очистка и расщепление на колонке GST-меченого белка 8Масштабирование очистки GST-меченого белка 9Продукция для очистки GST-меченых белков 10

Высокопроизводительная очистка белков 11

Оптимизация протокола для автоматической многостадийнойочистки гистидин- и GST-меченых белков 12Автоматическое удаление метки на системе ÄKTAxpress 13Продукция для высокопроизводительной очистки белков 14

Очистка антител 15

Очистка мышиных IgG1 MAb из культур клеток с помощью Сефарозы Protein G 16Разделение мономер/димер MAb 16Очистка гуманизованных IgG4 из культуры клеток с помощью Protein А 17Сравнительная связывающая способность: protein А и protein G 17Продукция для очистки антител 18

Aналитические разделения 19

Обращеннофазовая хроматография для пептидного картированияпри высоком значении рН 20Анализ чистоты синтетических олигонуклеотидов 20Анализ гликированного и негликированного гемоглобина A1c 21Продукция для аналитических разделений 22

Очистка немеченых белков 23

Быстрая 3-стадийная очистка лабильного фермента 24Двухстадийная очистка нативного белка при оптимизированном рН 25Продукция для очистки немеченых белков 26

Рефолдинг белков из телец включения 27

Одностадийный колоночный рефолдинг и очистка меченогогистидином белка из телец включения E. coli 28Одностадийный колоночный рефолдинг и очистка в двойном градиенте 29Репрезентативный процесс хроматографического рефолдинга 29Продукция для колоночного рефолдинга 30

Пробоподготовка 31

Удаление мажорных белков из плазмы человека 32Удаление трипсиноподобных сывороточных протеаз из плазмы человека 33Малое масштабирование при замене буфера, до 60 мл образца 33Обессоливание 100–300 мл образца методом тангенциальной фильтрации 33Продукция для подготовки образцов 34

Хроматографические системы 35Сервис, техническая поддержка, качество 36Литература 39Контактная информация 40

2

Очистк

3

Очистка белков, меченных гистидином

О белках, меченных гистидиномГистидиновая метка чаще всего используется для реком-бинантных белков. Препаративная очистка рекомбинант-ных белков, меченных гистидином на иммобилизованныхметалл-аффинных сорбентах (IMAC) является самым попу-лярным и эффективным методом выделения. IMAC исполь-зует способность гистидина связываться с хелатным ио-ном переходного металла, таким, как никель (Ni2+). Очисткабелков, меченных гистидином может проводиться как внативных, так и в денатурирующих условиях

Решения

Наши решения предлагают:

• Существенно более высокие выходы целевого белкаблагодаря почти в четыре раза большему связыва-нию сорбентом по сравнению с ранее доступными

• Минимальный риск инактивации целевого белка бла-годаря прекрасной совместимости сорбента с широ-ким диапазоном восстанавливающих реагентов, де-тергентов и других добавок

• Уменьшение ручных операций и большая гиб-кость в работе благодаря удобным предупако-ванным колонкам.Проблемы в очистке белков

Очень важно получить максимально высокий выход ак-тивного целевого белка. Высокая связывающая способ-ность экономит Вам время и уменьшает расход сорбен-та и буферов. Существование Вашего целевого белка вактивной форме может потребовать добавления в рас-твор детергентов или иных веществ. Таким образом, ме-тод очистки и сорбент должны быть совместимы.

В общем, увеличение концентрации имидазола в свя-зывающем и элюирующем буфере уменьшает неспеци-фическое связывание. Наоборот, уменьшение концен-трации дает большее связывание благодаря более болеесильному аффинному взаимодействию. Таким образом,необходимо найти оптимальный баланс. Некоторые бел-ки требуют больше стадий очистки для достижения тре-буемой чистоты.

2-стадийная очистка высокомолекулярного белка, меченного гистидином

Рис. 1A: Первая стадия очистки с IMAC

Образец: 10 ml E. coli экстракта с низким уровнем экспрессии меченнойгистидином маннаназы, Man 26A, из Cellulomonas fimi (Mr ~ 100 000)

Колонка: HisTrap™ HP 1 мл

Связывающийбуфер: 20 мM фосфат натрия, 30 мM имидазол, 500 мM NaCl, pH 7.4

Элюирующийбуфер: 20 мM Фосфат натрия, 500 мM имидазол, 500 мM NaCl, pH 7.4

Градиент: 25 ml линейный градиент 30–300 мM имидазола

Скорость: 1 мл/мин.

Рис. 1B: Вторая стадия очистки гель-фильтрациейОбразец: 0.5 ml концентрированного образца с первой стадии (IMAC)

Колонка: Superdex™ 200 10/300 GL

Буфер: PBS, pH 7.5

Скорость: 0.5 мл/мин

Система: ÄKTAexplorer 100

A 280 nmmAU

400

300

IMAC

mAU80.0

70.0

60.0

50.0

Гель-фильтрация

20040.0

30.0

100

0Eluted pool

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 ml

20.0

10.0

0.0

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 ml

Выводы

• Высокомолекулярный меченый гистидином белок маннана-за Man 26A был очищен и получен в энзиматически актив-ной форме

• Ni Sepharose High Performance (HP) обладаеет прекрасны-ми связывающими свойствами

• получается 60 мг очищенного белка за 1 цикл очистки

• вторая стадия очистки - гель-фильтрация на Superdex 200добавлена для достижения нужной чистоты белка 95 %

Mr

97 000

66 000

45 000

30 000

20 100

14 400

1 2 3 4 5 6

Рис. 1C: SDS-PAGE

Линия 1: LMW

Линия 2: E. coli экстракт

Линия 3: IMAC flow-through

Линия 4: IMAC ранняя фракция

Линия 5: IMAC целевая фракция

Линия 6: после гель-фильтрации

О сорбенте Ni Sepharose High Performance

Использование Ni Sepharose HP позволяет получать узкиепики и высокую концентрацию целевого белка. Она дает:• Выскоэффективную очистку

• высокую концентрацию целевого белка

• Может использоваться в шприце, с насосом или хромато-графической системой

4

Масштабирование очистки белка, меченного гистидином

Рис. 2A: Масштабирование очистки белка, меченного гистидином

Образец: Меченный гистидином связывающий мальтозу белок в экстракте E. coli (образцы содержали 8, 40 и 160 мг соответственно)

Колонки: HisTrap FF 1 мл, HisTrap FF 5 мл, HisPrep™ FF 16/10 20млl. Все колонки упакованы сорбентом Ni Sepharose 6 Fast Flow.

Связывающий буфер: 20 мM фосфат натрия, 25 мM имидазол, 500 мM NaCl, pH 7.4

Элюирующий буфер: 20 мM фосфат натрия, 500 мM имидазол, 500 мM NaCl, pH 7.4

Скорость: HisTrap FF 1 мл: 1 мл/мин; HisTrap FF 5 мл: 5 мл/мин; HisPrep FF 16/10: 5 мл/мин

HisTrap FF 1 мл

mAU

4 000

3 500

3 000

2 500

2 000

1 500

1 000

500

0

выход ≈80 % 6.2 мг

Mr

97 000

66 000

45 000

30 000

20 100

14 400

Рис. 2B: SDS-PAGE

Линия 1: LMW

Линия 2: исходный материал,E. coli экстракт

Линия 3: Собранный элюат, HisTrap FF1 мл

Линия 4: Собранный элюат, HisTrap FF5 мл

Линия 5: Собранный элюат, HisPrep FF16/10 (20 мл)

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 40.0 ml1 2 3 4 5

HisTrap FF 5 мл

mAU

4 000

3 500

3 000

2 500

2 000

1 500

1 000

500

0

выход >80 % 33 мг

Выводы• Масштабирование с HisTrap FF 1 мл через HisTrap FF

5 мл к HisPrep FF 16/10 (20 мл) проводится легко и эф-фективно

• Увеличение размеров колонки при использованииидентичной линейной скорости потока дает пре-красно согласующиеся результаты

• Анализ собранных фракций с помощью SDS-PAGE показал почти идентичные результаты сточки зрения чистоты и выхода

• Стабильно высокие выход и чистота белка могут бытьполучены при различных масштабах очистки, исполь-зуя одинаковые линейные скорости потоков.

0.0 50 100 150 ml

HisPrep FF 16/10, 20 ml

mAU

4 000

3 500О сорбенте Ni Sepharose 6 Fast FlowNi Sepharose 6 FF позволяет легко масштабировать про-цесс очистки белка и использовать большие скоростипотоков.• Скрининг экспрессии в многолуночных планшетах

• Выпускается как в профессионально упакованных удоб-ных в работе колонках HisTrap FF и HisPrep 16/10 FF , таки в виде неупакованного сорбента

• Позволяет работать как в ручном режиме, например, придавлении столба жидкости, так и при больших скоростяхпотока в хроматографических системах

3 000

2 500

2 000

выход >90 % 149 мг

1 500

1 000

500

0

0 100 200 300 400 500 600 700 ml

5

Для высокоэффективной очистки белков и получения узких пиков на хро-матографических системахСорбенты, упакованные колонки, наборы Количество № по каталогу

Ni Sepharose High Performance 25 мл 17-5268-01

Ni Sepharose High Performance 100 мл 17-5268-02

HisTrap HP 5 × 1 мл 17-5247-01

HisTrap HP 100 × 1 мл* 17-5247-05

HisTrap HP 1 × 5 мл 17-5248-01

HisTrap HP 5 × 5 мл 17-5248-02

HisTrap HP 100 × 5 мл* 17-5248-05

HisTrap HP kit 1 17-5249-01

Ni Sepharose 6 Fast Flow

Для больших потоков, масштабирования и ручной очисткиСорбенты и упакованные колонки Количество № по каталогу

Ni Sepharose 6 Fast Flow 25 мл 17-5318-01



HisTrap FF 5 × 1 мл 17-5319-01

HisTrap FF 100 × 1 мл* 17-5319-02

HisTrap FF 100 × 5 мл* 17-5255-02

HisPrep FF 16/10 1 × 20 мл 17-5256-01

HisTrap FF

Гель-фильтрационные колонки для получения высокой чистоты белкаУпакованные колонки Количество № по каталогу

Superdex 200 10/300 GL 1 17-5175-01

Superdex 75 10/300 GL 1 17-5174-01

Superdex Peptide 10/300 GL 1 17-5176-01

HiLoad™ 16/60 Superdex 200 pg 1 17-1069-01

HiLoad 16/60 Superdex 75 pg 1 17-1068-01

HiLoad 16/60 Superdex 30 pg 1 17-1139-01

HisPrep FF 16/10

Системы

ÄKTAFPLC™

ÄKTApurifier™

ЛитератураПостер Code no.

Улучшенная очистка белка, меченного гистидином, на новом сорбенте IMAС 11-0008-47

Информационный бюллетень Code no.

Ni Sepharose 6 Fast Flow 11-0008-86

Ni Sepharose High Performance 18-1174-40

Руководство по выбору продукции Code no.

Колонки HiTrap™ 18-1129-81

* специальные упаковки по заказу клиента

6

7

Очистка GST-меченных белков

О GST-меченных белкахГлутатион S-трансфераза (GST) – универсальное средство

для экспрессии, очистки и детекции меченных белков.GST-меченные белки очищаются аффинной хроматогра-

фией с использованием иммобилизованного глутатиона,например, Glutathione Sepharose High Performance и Glu-

tathione Sepharose 4 Fast Flow.

Задачи очисткиВысокая чистота белка необходима для большинстваприменений. Для достижения высокой чистоты нужна вы-

сокая специфичность между лигандом и меткой. Целевойбелок связывается со специфичным аффинным сорбен-

том, примеси вымываются из колонки, после чего целевойбелок элюируют. При работе с GST-меченными белками

подбирают мягкие условия элюирования для сохранения

активности белка.

Решения

Наша стратегия очистки GST-меченных белков базирует-ся на применении Glutathione Sepharose. GlutathioneSepharose HP предназначена для высокоэффективной икачественной очистки GST-мечнных белков. GlutathioneSepharose FF применяется для масштабирования про-цесса. Они дают:• Высокий выход и чистоту продукта при использовании

одностадийного протокола очистки• Простоту в очистке GST-меченных белков и других глу-

татион-S-трансфераза- или глутатион-зависимых бел-ков

• Элюирование в мягких неденатурирующих условиях сиспользованием восстановленного глутатиона для со-хранения антигенности и функции белка.

• Удаление метки с помощью PreScission™ про-теазы и очистка при 4°С для повышения ста-бильности.

• GST-метка может увеличивать выход экс-прессии и растворимость Вашего белка, какуказано в некоторых научных публикациях.

Одностадийная очистка и расщепление на колонке GST-меченого белка

Рис. 3A: Очистка SH2 домена с одновременным удалением GST-метки

Образец: 100 мл осветленного E. coli экстракта, экспрессирующего SH2-домен, меченный GST (Mr 37 000)

Колонка: GSTrap™ 5 мл

Связывающий буфер: 20 мM фосфата, 150 mM NaCl, pH 7.3

Элюирующий буфер: 50 мM Tris-HCl, 10 мM восстановленный глутатион, pH 8.0

Расщепление протеазой: 20 U/мл тромбинпротеазы в течение 14 час., 20°С

Скорость: 10 мл/мин (загрузка образца и отмывка) и 2.5 мл/мин (элюция)


Ввод образца Отмывка

A280 A280

4

3

2 Начало инкубирования

14 часов

0.4

0.3

0.2

Элюированиесвязывающим буфером

Чистый целевой белок

Элюирование

GST-метка

1

с протеазой

0.1Отмывка

элюирующим буфером

0

0 50 100 150 Объем (мл)0

0 20 100 120 Объем (мл)

Рис. 3C: MALDI-TOF масс-спектрометрический анализSH2 домена без GST-метки

Mr

94 00067 00043 000

Intensity

90

80

70

Целевой белок с одинарным зарядом

30 000

20 10014 400

1 2 3 4 5 6 7 8


Линия 1: LMW

Линия 2: Исходный материал, экстрактE. coli

Линия 3: проходящий буфер

Линия 4: Последняя фракция отмывки

Линия 5: SH2-домен без GST-метки, элюиро-ванный связывающим буфером, на-чало пика

Линия 6: как линия 5, средняя часть пика

Линия 7: как линия 5, последняя часть пика

Линия 8: отщепленная элюирующим буфе-ром GST-метка

60

50

40

30

Целевой белок с двойным зарядом

20

Выводы

Одностадийная очистка домена SH2 на колонке GSTrap FF 5 мл

Получается высокочистый белок, как показано анализом SDS-PAGE иMALDI-ToF

Расщепление на колонке до элюции

Полное удаление метки

Высокие скорости потока (10 мл/мин) позволяют проводить очисткув 4 раза быстрее

10

06 000 8 000 10 000 12 000 14 000 16 000

mass (m/

О Glutathione Sepharose 4 Fast Flow и GSTrap FF

Сорбент Glutathione Sepharose 4 FF обладает прекрасными характе-ристиками по потоку и идеален для масштабирования

Колонки GSTrap 1 мл и 5 мл columns дают возможность проводитьпростую одностадийную очистку GST-меченных белков, других глута-тион-S-трансфераза- и глутатион-зависимых белков

Мягкие условия элюции сохраняют антигенность и функциональность

Могут использоваться со шприцем, насосом или системой

8

Масштабирование очистки GST-меченого белка

Рис. 4A: GSTrap FF 1 млA280 Элюирующий буфер Рис. 4A: GSTrap FF 1 мл

mAU

1 500

1 000

Отмывка

14 мгGST-Purα

%B100

80

60

Образец: 5 мл экстракта E. coli, экспрессирующего GST-Purα

Колонка: GSTrap FF 1 мл

Связывающий буфер: PBS, pH 7.4

Элюирующий буфер: 50 мM Трис-HCl, pH 8.0 10 мM восстановленный глутатион

Скорость: загрузка: 0.5 мл/мин; отмывка и элюирование: 1 мл/мин

Система: ÄKTAprime™

500

00.0 10.0 20.0 30.0 ml

40

20

0

Рис. 4B: GSTrap FF 5 мл


Колонка: GSTrap FF 5 мл



Скорость: загрузка: 2.5 мл/мин; отмывка и элюирование: 5 мл/мин

Система: ÄKTAprimeРис. 4B: GSTrap FF 5 ml

A280 Элюирующий буферmAU

1 500

1 000

Отмывка

73 мгGST-Purα

%B100

80

60

40

Рис. 4C: GSTPrep FF 16/10


Колонка: GSTPrep™ FF 16/10



Скорость: загрузка: 5 мл/мин; отмывка и элюирование: 10 мл/мин

Система: ÄKTAprime

500

20

0

0.0 50.0 100.0 150.0 ml

0

Выводы

• Стабильно высокая чистота белка при различных масшта-бах очистки

• Чистота~95 % достигается за одну стадию очистки. Мас-штабирование от GSTrap FF 1 мл через GSTrap FF 5 мл кGSTPrep FF 16/10 дает воспроизводимые результаты

• Две или более упакованные колонки GSTrap FF 1 мл или 5 мллегко могут быть соединены последовательно для увеличе-ния связывающей способности

• Примечание: важно проводить загрузку образца на ко-лонку при малых скоростях потока из-за низкой скоростисвязывания GST-метки и лиганда (глутатиона)

Рис. 4C: GSTPrep FF 16/10A280 Элюирующий буфер

mAU

2 000

1 500

1 000

500

Отмывка

346 мгGST-Pur

%B100

80

60

40

20

0

0 100 200 300 400 500 600 ml

0

О GSTPrep FF 16/10

• Упакованные 20 мл HiPrep™ колонки с Glutathione Sepha-rose 4 FF для масштабирования очистки рекомбинантныхGST-меченных белков, других глутатион-S-трансферазаи глутатион-зависимых белков

• Матрица сорбента Sepharose 4 FF в упакованной ко-лонке HiPrep дает высокую воспроизводимость резуль-татов

• Мягкие условия элюции сохраняют антигенность и функ-ции белка

Mr

97 00066 000

45 000

30 000

20 100

14 400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Рис. 4D: SDS-PAGE

Линия 1: LMWЛиния 2: экстракт E. coli, экспресси-

рующего GST-Pur, 1 г клеточ-ной пасты/ 5 мл

Линия 3: проходящий буфер изGSTrap FF 1 мл

Линия 4: GST-pur элюированныйизGSTrap FF 1 ml

Линия 5: как линия 2

Линия 6: проходящимй буфер изGSTrap FF 5 мл

Линия 7: GST-pur элюированный изGSTrap FF 5 ml

Линия 8: как линия 2

Линия 9: проходящий буфер изGSTPrep FF 16/10

Линия 10: GST-pur элюированный изGSTPrep FF 16/10

9

Для высокоэффективной очистки GST-меченых белковСорбенты и упакованные колонки Количество № по каталогу

Glutathione Sepharose High Performance 25 мл 17-5279-01

Glutathione Sepharose High Performance 100 мл 17-5279-02

GSTrap HP 5 × 1мл 17-5281-01

GSTrap HP 100 × 1 мл* 17-5281-05

GSTrap HP 1 × 5 мл 17-5282-01

GSTrap HP 5 × 5 мл 17-5282-02

GSTrap HP 100 × 5 мл* 17-5282-05GSTrap HP

Для масштабирования и быстрой очистки GST-меченых белковСорбенты и упакованные колонки Количество № по каталогу

Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 25 мл 17-5132-01

Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 100 мл 17-5132-02

Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 500 мл* 17-5132-03

GSTrap FF 2 × 1 мл 17-5130-02

GSTrap FF 5 × 1 мл 17-5130-01

GSTrap FF 1 × 5 мл 17-5131-01

GSTrap FF 5 × 5 мл 17-5131-02

GSTPrep FF 16/10 1 × 20 мл 17-5234-01

Glutathione Sepharose 4Fast Flow и GSTrap FF

Автоматические хроматографические системыСистема Количество № по каталогу

ÄKTAprime 1 18-1139-47

ÄKTAexplorer 10 1 18-1300-00 ÄKTAexplorer

ЛитератураПостер

Быстрая очистка GST-связанных белков из больших объемов образца 18-1139-51

Информационный бюллетень № по каталогу

Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 18-1174-85

Glutathione Sepharose High Performance 18-1174-32

GST Gene Fusion System 18-1159-30

Руководство по выбору продукции № по каталогу

Колонки HiTrap 18-1129-81


10

Высокопроизводительная очистка белковО высокопроизводительной очисткеЗа последние годы существенно расширилось использо-вание рекомбинантных белков. Введение метки упрощаетпроцесс очистки и может также увеличить выход целевогопродукта благодаря возрастанию растворимости экс-прессируемого белка. (Histidine)6 и GST, наиболее популяр-ные метки для рекомбинантных белков, позволяют быстроочищать белки и автоматизировать протокол очистки.

Задачи очистки

Для получения высокой чистоты белка протокол его очист-ки должен быть многостадийным. Однако, одновременнаяочистка нескольких образцов с использованием много-стадийного протокола на обычной хроматографическойсистеме является весьма утомительной и времяемкой.Кроме того, многие Downstream процессы требуют уда-ления метки, что дополнительно усложняет протокол. Пол-ная автоматизация такого процесса позволяет высвобо-дить много времени, которое можно посвятить решениюболее важных задач.

РешенияÄKTAxpress™ является первой полностью интегрирован-

ной автоматизированной системой для высокопроизводи-тельной многостадийной очистки меченных белков. ÄK-

TAxpress – модульная система, сочетающая прибор, про-граммное обеспечение UNICORN™ , колонки и сорбенты. В

зависимости от конфигурации системы, ÄKTAxpress позво-ляет:

• Очищать одновременно до 48 образцов

• Получать до 50 мг белка с чистотой >95 % без ручныхманипуляций

• использовать шаблоны методов для создания и исполь-зования оптимизированных протоколов, включающих от-

щепление метки на колонке

11

Оптимизация протокола для автоматической многостадийной очисткигистидин- и GST-меченых белков

Протоколы очистки ÄKTAxpress начинаются с аффиннойхроматографии, далее следует комбинация из обессоли-вания ионного обмена и гель-фильтрации. См таблицу 1 сописанием доступных многоступенчатых протоколов ÄK-TAxpress. На рис. 5А представлен пример автоматическоготрехстадийного протокола очистки.

Проходящая фракция от загрузки образца и невыбранныепики собраны в отдельных сосудах (не показано). Проме-жуточные пики хранятся во внутренних капиллярных пет-лях и автоматически вводятся в следующую колонку. Под-готовка и отмывка колонок производится во время каждойочистки как часть протокола.

Рис. 5A: Автоматическая многостадийная очистка меченной гистидиномкиназы

Образец: Меченная гистидином киназа (Mr 42 200, pI 5.75) экспрессиро-ванная в E. coli

Колонки

Аффинная (АС): HisTrap HP, 1мл

Обессоливание (DS): HiPrep 26/10 DesaltingИонообменная (IEX): Mono Q 5/50 GL, 1 млБуферыAC связывающий: 50 мM Трис-HCl, 500 мM NaCl, 5 мM имидазол 1 mM DTT,

10 % глицерин, pH 8

AC элюирующий: 50 мM Трис-HCl, 500 мM NaCl, 500 мM имидазол, 1 мM DTT,10 % глицерин , pH 8

DS и IEX связывающий: 50 мM Tris-HCl, 25 мM NaCl, 1 мM DTT, 10 % глицерин, pH 7.5IEX элюирующий: 50 мM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 мM DTT, 10 % глицерин, pH 7.5

Рис. 5B: последняя стадия очистки на Mono QA280

IEX

4 5 6 7 8 9A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B12 B11 B10 B9 B8

160.0 165.0 170.0 175.0 ml

Mr

97 00066 00045 00030 00020 10014 400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Рис. 5C: SDS-PAGE

Линия 1: LMW

Линия 2: Исходный образец

Линия 3: Проходящий буфер

Линия 4–9: См. фракции на хро-матограмме

Линия 10: LMW

AC DS IEX Таблица 1: Доступные в ÄKTAxpress многостадийные протоколы очистки

AC: Аффинная хроматография, DS: обессоливание, IEX: Ионообменная хромато-графия* Загрузка образца и отмывка не показаны

Выводы• Автоматическая многостадийная очистка меченной

гистидином протеинкиназы

• Финишная очистка на Mono Q™ показывает наличие

разных фосфоформ очищенной киназы и ее очень вы-сокую чистоту (Рис. 5B)

• Шаблон методов позволяет легко создавать протоколыочистки

• Эффективное автоматическое детектирование и

сбор пиков на промежуточных стадиях

Протоколы Эффект от дополнительных хроматографических шагов

AC–DS Замена буфера

AC–GF Отделение нежелательных агрегатов и примесей

AC–DS–IEX Отделение от других изоформ (например, гетерогенно фософри-лированных или гликозилированных белков)

AC–DS–IEX–DS Отделение от других изоформ на IEX и замена буфера на DS

AC-DS-IEX-GF Отделение от других изоформ на IEX и Отделение нежелательныхагрегатов и примесей на GF

AC: Аффинная хроматография

DS: Обессоливание

GF: Гель-фильтрацияIEX: Ионообменная хроматография

12

Автоматическое удаление метки на системе ÄKTAxpress

Колонки:AC: HisTrap HP 5 мл [для (histidine)6-меченных белков]

AC: GSTrap HP 5 мл [для GST-меченных белков]

Рис. 6A: Автоматическое расщеплени и очистка с использованиемAcTEV протеазы

Четырехстадийный протокол: AC–DS–IEX–GF

Sample: 0. 5 mg, M 38 900 (cleaved product M 36 400) APC1040; (histidine) -taggedDS: HiPrep 26/10 Desalting, 53 мл

IEX: RESOURCE™ Q, 6 мл

GF: HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade, 120 мл

Буферы:AC (histidine) связывающий: 50 мM Трис-HCl, 500 мM NaCl, 20 мM имидазол, pH 7.5

AC (histidine) расщепляющий: 50 мM Трис -HCl, 500 мM NaCl, 50 мM имидазол, pH 7.5

AC (histidine) элюирующий: 50 мM Трис -HCl, 500 мM NaCl, 500 мM имидазол, pH 7.5

AC (GST) связывающий ирасщепляющий: 50 мM Трис s-HCl, 150 мM NaCl, 1 мM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.5

AC (GST) элюирующий: 50 мM Трис -HCl, 10 мM восстановленный глутатион, pH 8.0

DS и IEX связывающий: 50 мM Трис -HCl, pH 8.0

IEX элюирующий: 50 мM Трис -HCl, 1 M NaCl, pH 8.0

GF: 50 мM Трис -HCl, 150 мM NaCl, pH 7.5

A 280mAU

1 500

1 000

500

r

Расщепленный белок

Регенерация

r 6

11 мг

Рис. 6B: Автоматическое расщепление и очистка с использованием PreScissionпротеазы

01 100 1 200 1 300 1 400 1 500

B10

мл

Образец: GST-pur

Двухстадийный протокол: AC–GF

AC DS IEX GF

AC: Аффинная хроматография, DS: Обессоливание, IEX: Ионообменная хроматография;GF: Гель-фильтрация

A 280

mAU

2 000 Расщепленный белокРегенерация

1 500

1 000

500

46 мг

Mr

97 000

66 000

45 000

30 000

20 100

Рис. 6C: SDS-PAGE

Линия 1: LMW

Линия 2: исходный образей


Линия 4: Очищенный расщепленный APC1040

(Mr 36.4 x 10 ) после AC–DS–IEX–GF

Линия 5: Сравнение: нерасщепленный APC1040 (M

38.9 x 103)

0

200 250 300AC GF

A2 A4 A6 A8

мл

14 400

1 2 3 4 5

AC: Аффинная хроматография, GF: Гель-фильтрация

Mr97 000

66 000

45 000

30 000

20 100

Рис. 6D: SDS-PAGE

Линия 1: LMW

Линия 2: Исходный образец


Линия 4: Очищенный расщепленный

GST-pur (Mr 35.2 x 10 ) по-

сле AC–GF

Линия 5: Сравнение: нерасщеплен-

ный GST-pur (M 61.6 x 103)

Выводы

• Полностью автоматическоеудаление метки с помощьюPreScission и AcTEV протеазы

• Выход белков с удаленной меткой составляет десятки мг• Все обработанные белки получены высокоочищенными

14 400

1 2 3 4 5

О системе ÄKTAxpress• Двух-четырехстадийный протокол очистки позво-

ляет получать высоко чистый белок (>95 %)• Возможность автоматического удаления метки во всех

протоколах

• Высокая производительность: 16 образцов за ночь(двухстадийный протокол), 8 образцов в день (4х-

стадийный протокол)на четырехмодульной системе• Автоматизация позволяет избежать ручных операций

• В модуле можно очищать до 4 образцов одновременно• Один компьютер может контролировать до 12 модулей

13

Высокопроизводительные системы для автоматической многостадийной очисткиСистема Количество № по каталогу

ÄKTAxpress, 4х-модульная система с компьютером 1 18-6645-05

ÄKTAxpress TWIN, 2х-модульная система с компьютером 1 11-0012-85

Продукция для аффинной хроматографии в высокопроизводительнойочистке белковУпакованные колонки Количество № по каталогуHisTrap HP 5 × 1 мл 17-5247-01

HisTrap HP 100 × 1 мл* 17-5247-05

HisTrap HP 5 × 5 мл 17-5248-02

HisTrap HP 100 × 5 мл* 17-5248-05

GSTrap HP 5 × 1 ml 17-5281-01

GSTrap HP 100 × 1 мл* 17-5281-05

GSTrap HP 5 × 5 мл 17-5282-02

GSTrap HP 100 × 5 мл* 17-5282-05

Колонки HisTrap и Mono Q всистеме ÄKTAxpress

Продукция для обессоливания в высокопроизводительной очистке белковУпакованные колонки Количество № по каталогу

HiPrep 26/10 Desalting 1 × 53 мл 17-5087-01

HiPrep 26/10 Desalting 4 × 53 мл 17-5087-02

HiTrap Desalting 5 × 5 мл 17-1408-01

HiTrap Desalting 100 × 5 мл* 11-0003-29

Четырехмодульнаясистема ÄKTAxpress

Ионообменная продукция в высокопроизводительной очистке белковУпакованные колонки Количество № по каталогуMono Q 5/50 GL 1 × 1 мл 17-5166-01

Mono S™ 5/50 GL 1 × 1 мл 17-5168-01

RESOURCE Q 1 × 1 мл 17-1177-01

RESOURCE S 1 × 1 мл 17-1178-01

RESOURCE Q 1 × 6 мл 17-1179-01

RESOURCE S 1 × 6 мл 17-1180-01

Программа UNICORN

Гель-фильтрационная продукция в высокопроизводительной очистке белковУпакованные колонки Количество № по каталогу

HiLoad 16/60 Superdex 75 pg 1 × 120 мл 17-1068-01

HiLoad 16/60 Superdex 200 pg 1 × 120 мл 17-1069-01

ЛитератураИнформационный бюллетень № по каталогуÄKTAxpress 18-1177-69 AB

Информация по применению № по каталогу

Automated on-column tag cleavage and multi-step purificationof histidine-and GST-tagged proteins 11-0011-26

Optimizing protocols for automated multi-step purificationof histidine and GST-tagged proteins using ÄKTAxpress 11-0011-25


14

Очистка антител

Об очистке антителПрименение моноклональных антител (MAbs) и их фраг-ментов в научных исследованиях, терапии и диагностикепостоянно растет. Высокая специфичность MAbs являетсяих существенным преимуществом, особенно в терапии ииммуноблотинге. Поликлональные антитела обычно ис-пользуются в качестве реагентов в иммунохимическихприложениях, используя сырую сыворотку из различныхисточников.

Решения

Сорбенты Protein G и Protein A Sepharose созданы дляочистки моноклональных и поликлональных IgG из ас-цитной жидкости, сыворотки и супенатанта культур кле-ток. Они дают:• Получать высоко чистый продукт (>95 %) в одну стадию

• Благодаря большой емкости получать высокие выходы

• Высокая селективность исключает связывание боль-шинства других белков

• Удобные в работе уже упакованные колонки и собст-венно сорбенты для упаковки колонок

Задачи очистки

MAbs можно получать как in vivo так и in vitro. Получениеin vivo включает их очистку из асцитной жидкости, содер-жащей много других белков, включая хост-белки, липидыи остатки клеток. Отделение хост-белков обычно сложнаязадача. Из-за наличия большого количества альбуминахост-белки имеют сходство с иммуноглобулином как позаряду, так и по свойствам. Липиды в асцитной жидкостимогут также забивать колонку, если они предварительноне удалены. Mabs, получаемые в культурах клеток, суще-ственно разбавлены, так что очистка белка также должнасопровождаться концентрированием образца.

Несмотря на высокую чистоту продукта, получаемого по-сле аффинной хроматографии, для его окончательнойочистки от агрегатов и/или димеров обычно применяютгель-фильтрацию. Наш сорбент Superdex идеально подхо-дит для этих целей.

15

Очистка мышиных IgG1 MAb из культур клеток с помощью СефарозыProtein G

Рис. 7A: Стадия извлечения мышиных IgG1

Образец: Супернатант культуры клеток мышиных IgG1

Колонка: HiTrap Protein G HP 1 мл

Связывающий буфер: 20 mM фосфат натрия, pH 7.0

Элюирующий буфер (B): 0.1 M глицин-HCl, pH 2.7


AU 280 nm

UV 280 nm

pH

1.0

0.8

MышиныйIgG1

0.4

вводобразца

pH

7

6

5

4

3

Выводы

• Автоматическая двухстадийная очистка с использо-ванием аффинной хроматографии и гель-фильтра-ции применима для широкого спектра задач поочистке белков.

• Сорбенты Protein G и Protein A Sepharose HP созданыдля очистки моноклональных и поликлональных IgG изасцитной жидкости, сыворотки и супернатанта культу-ры клеток

• Сорбенты Protein G и protein A имеют различную специ-фичность связывания IgG в зависимости от природы по-следнего (см. таблицу на стр. 17)

О сорбенте Protein G Sepharose HP

Для удобной и быстрой рутинной очистки моно-клональных IgG антител:• Связывание до 25 мг человеческого IgG/мл сорбента• Высокая емкость и быстрая кинетика связывания• Устойчив при pH 3–9 (в работе) и рН2–9 (при отмывке)• Простота операций с помощью шприца, насоса или

высокопроизводительной хроматографической систе-мы семейства ÄKTAdesign™

0 2

7.5 15. 0 мин

Разделение мономер/димер MAb

Рис. 7B: Финишная очистка гель-фильтрацией IgG1,предварительноочищенного на Protein G

Колонка: Superdex 200 10/300 GL

Буфер: PBS, pH 7.2

Скорость: 0.7 ml/min

Система: ÄKTAFPLC

mAUA280

ВыводыВ большинстве случаев при очистке антител в образцемогут присутствовать димеры и агрегаты IgG. В связи с

этим в цикл очистки необходимо включать финишнуюстадию гель-фильтрации для получения чистых гомоген-

ных MAbs. Сорбент Superdex 200 идеально подходит дляэтих целей, как показано на фиг. 7B.

25.0

20.0

15.0

10.0

5.0

mAUA280

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

Димер/агрегаты

Mономеры

О сорбенте Superdex 200

Сорбент Superdex 200 идеально подходит для финиш-ной очистки и удаления агрегатов и димеров из МAb:• Разделяет белки в диапазоне Mr от10 000 до 600 000

(глобулярные белки)• Легкое и предсказуемое масштабирование• Прекрасная воспроизводимость и срок службы• Поставляется в виде качественно упакованных коло-

нок и расфасованным в емкости0.0

0.44 0.48 0.52 0.56 cv

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2объемы колонки (CV)

16

Очистка гуманизованных IgG4 из культуры клеток с помощью Protein A

Рис. 8A: очистка с использованием HiTrap rProtein A FF 1 мл

Образец: 30 мл содержащего 12 мг IgG4

Колонка: HiTrap rProtein A FF, 1 мл

Связывающий буфер: 200 мM фосфат натрия, pH 7.0

Элюирующий буфер: 100 мM цитрат натрия, pH 3.0

Скорость: 1 мл/мин (156 см/час)

Элюировано IgG4: 11.2 мг

Выход: 93 %

Чистота: >95 % в соответствии с SDS-PAGE

A280 mm Элюирующийбуфер

Выводы

• Высокочистые гуманизованные IgG4 получены непо-средственно из культур клеток миеломы с выходом 93 %• За одну стадию достигается чистота > 95 %

О сорбенте HiTrap rProtein A FF

• Колонки, упакованные сорбентом rProtein A Sepharose4 FF для производительной и селективной очистки ифракционирования субклассов IgG

• Очищается около 50 мг человеческих поликлональныхIgG за 1 цикл

• Стабилен при pH 3–9 в работе, при рН 2–10 для отмывки

• Простота операций при использовании шприца, насосаили высокоэффективной хроматографической системы,например, ÄKTAdesign

1.5

1.0

0.5

Элюированный lgG4 Сравнительная связывающаяспособность:protein A и protein G

0.0Проходящий буфер

0 10 20 30 40 Объем (мл)Время (мин)

Ниже приводятся данные по сравнительной связываю-щей способности поликлональных иммуноглобулинов изразличных источников к protein A и protein G (по ре-зультатам измерений конкурентных ELISA тестов.

Mr

Вид Субкласс Protein A Protein G

Человеческий IgA переменная –

97 000

66 000

43 000

30 000

20 10014 400

1 2 3 4


Линия 1: LMW маркеры

Линия 2: Исходный материал


Линия 4: Элюированный IgG4

IgD – –IgEIgG1 ++++ ++++IgG2 ++++ ++++IgG3 – ++++IgG4 ++++ ++++IgM* переменная –

Желток птичьего яйца IgY† – –

Корова – ++ ++++

Собака – ++ +

Коза – – ++

Морская свинка IgG1 ++++ ++IgG2 ++++ ++

Хомяк – + ++

Лошадь – ++ ++++

Коала – – +

Лама – – +

Обезьяна (резус) – ++++ ++++

Мышь IgG1 + ++++IgG2a ++++ ++++IgG2b +++ +++IgG3 ++ +++IgM* переменная –

Свинья IgM* +++ +++

Кролик нет различий ++++ +++

Крыса IgG1 – +IgG2a – ++++IgG2b – ++IgG3 + ++

Овца IgG3 +/– ++* Очищено на колонках HiTrap IgM HP ++ среднее связывание† Очищено на колонках HiTrap IgY HP ++++ сильное связывание– слабое или отсутствие связывания

17

Для получения узких пиков и высокой концентрации продуктаУпакованные колонки Количество № по каталогу

HiTrap Protein A HP 5 × 1 мл 17-0402-01




HiTrap Protein G HP 5 × 1 мл 17-0404-01




MAbTrap™ Kit 1 17-1128-01

HiTrap Protein A HP

Для получения высоких выходов и масштабированияСорбенты и упакованные колонки Количество № по каталогу

rProtein A Sepharose 4 Fast Flow 5 мл 17-1279-01

rProtein A Sepharose 4 Fast Flow 25 мл 17-1279-02

rmp Protein A Sepharose Fast Flow 5 мл 17-5138-01

rmp Protein A Sepharose Fast Flow 25 мл 17-5138-02

Protein G Sepharose 4 Fast Flow 5 мл 17-0618-01

Protein G Sepharose 4 Fast Flow 25 мл 17-0618-02

HiTrap rProtein A FF 5 × 1 мл 17-5079-01




HiTrap Protein G HP

Для удаления агрегатов и финишной очисткиПродукция Количество № по каталогу

HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade 1 17-1069-01


Superdex 200 10/300 GL 1 17-5175-01

Superdex 200 prep grade 25 мл 17-1043-10

Superdex 200 prep grade 150 мл 17-1043-01

HiLoad Superdex


ÄKTAFPLC 1 18-1118-67


ЛитератураИнформационный бюллетень № по каталогу

HiTrap rProtein A FF & HiTrap Protein A HP & HiTrap Protein G HP 11-0035-58

rProtein A Sepharose FF 18-1113-94

Protein G Sepharose FF 18-1012-91

Руководство по выбору продукции № по каталогу

HiTrap Columns 18-1129-81

18

Аналитические разделения

19

Решения• Хроматография высокого разрешения дает вы-

сокую селективность, скорость, простоту и на-дежность результатов

• При необходимости анализировать много об-разцов может быть создать автоматический

процесс, включающий ввод образца и анализполученных результатов

• Колонки SOURCE™ RPC идеально подходят дляработы в широком диапазоне рН

Об аналитических разделенияхПосле того, как белок очищен, принципиально необходимо найти

точные методы для идентификации и характеризации примесей ицелевого продука. Стандартная аналитическая задача включает:

• определение мономер/димер

• энзиматическая активность• определение чистоты и выхода

• характеризация пептидных карт после триптозного расщепления

для идентификации посттрансляционных модификаций

Обращеннофазовая хроматография для пептидного картированияпри высоком значении pHРис. 9A: Пептидное картирование при pH 9.5 на колонкеSOURCE 5RPC ST 4.6/150

Образец: (RVP-BSA-mT), ~750 pmol

Колонка SOURCE 5RPC ST 4.6/150

Элюэнт A: 10 mM NH4OH/HCOOH, pH 9.5

Элюэнт B: 60 % ацетонитрил в элюэнте A

Градиент: 0–67 % B over 115 ml i.e. 46 column volume

Cкорость: 0.5 мл/мин.

Система: ÄKTApurifier 10

A(mAU)

%B100

Выводы• Колонки SOURCE 5RPC ST 4.6/150 очень удобны для очистки

пептидов в щелочной среде, в особенности, плохо раствори-мых в кислых растворах

• Полимерная матрица сорбента SOURCE дает возможность про-водить обращеннофазовую хроматографию при высоких значе-ниях рН, позволяя получать высокое разрешение и исключитель-ную чувствительность в масс-спектрометрическом анализе

150

100

50

0

— 215 nm— 254 nm— 280 nm

a)SOURCE 5RPC ST 4.6/150pH 9.5

50

О колонке SOURCE 5RPC ST 4.6/150Колонки SOURCE 5RPC ST 4.6/150 из нержавеющей стали предна-значены для аналитической обращеннофазовой хроматографиипептидов, фрагментов белков и олигонуклеотидов. Они дают:• Исключительное разрешение в широком диапазоне рН (1–12)• Отличное функционирование при высоком рН• Длительный срок службы благодаря высокой химической и физи-ческой стабильности• Высокую воспроизводимость от колонки к колонке

–30 00 50 100 ml

Анализ чистоты синтетических олигонуклеотидов

Рис. 9B: Проверка чистоты синтетического олигонуклеотида

Образец: 5’-биотинилированный синтетический 20-мер

Колонка: Mini Q™ 4.6/50 PE

Стартовый буфер: 10 mM NaOH

Элюирующий буфер: 10 mM NaOH, 2 M NaCl

Скорость: 1.0 мл/мин.


mS/cm

Выводы• Анионообменная колонка Tricorn Mini Q™ является

мощным инструментом для контроля чистоты синтети-ческих олигонуклеотидов

mAU

40.0

20.0

0.0

Исходнаяреакционнаясмесь

Биотинилированный20-мер

50.0

0

О колонках Tricorn MiniBeads• Высокоэффективные колонки Tricorn™, качественно упако-

ванные ионообменным сорбентом MiniBeads™:

• Исключительно гомогенные 3 μm непористые частицы,дающие прекрасное разрешение, скорость, воспроизво-

димость результатов и долговечность

• Применяют для разделения белков, пептидов, олигонукле-отидов, углеводов и других биомолекул в соответствии с

их зарядом (Mini Q и Mini S™)

• Используют как для аналитических, так и для микропрепа-

ративных целей

0 20.0 30.0

mAU

40.0

40.0 ml

mS/cm

50.0

20.0 После очистки

0.0

0 20.0 30.0 40.0 ml0

20

Анализ гликированного и негликированного гемоглобина A1c

Рис. 10A: Анализ гемоглобина A1c

Образец: 10 мл гемолизованной ЭДТА крови

Колонка: Mono S 5/50 GL

Буфер A: 20 мM малонат натрия, 0.2 г/л азид натрия, pH 5.7

Буфер B: Буфер A + 0.3 M LiCl

Градиент: 20–50 % B за 3 мин; 50–75 % B за 1.1 мин, 75–100 % B за 0.3 мин,100 % B в течение 2.6 мин, 20 % B за 1 мин

Скорость: 2 мл/мин

mAU % B

Рис 10B: Сравнение HbA1c

, измереного в соответствии с националь-ными методами калибровки и в соответствии с методом IFCC (4).

14

12

10

8

0.05HbA0 100 6

0.04

0.03

HbA1c75

4

22 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0.02

50

HbA

1C (%

)

HbA1C (%), IFCC-NRL

0.01

HbFHbA3

25

00 1 2 3 4 5 6 7 8

Время (минуты)

0

Выводы• Гемоглобин-A1c (HbA1c) измеряли для оценки долгосрочного кон-

троля больных диабетом• Колонка Tricorn Mono S полностью разделяет все формы глико-

зилированного и негликозилированного гемоглобина (Рис. 10A)• Метод анализа на Mono S использовался в Швеции в течение

двух десятилетий для калибровки приборов, измеряющих HbA1c

(1, 2). Рис. 10B показывает, что метод калибровки, принятый вШвеции, имеет самое высокое разрешение для HbA1c и, таким

образом, находится максимально близко к стандарту, установ-ленному IFCC (3), по сравнению с двумя другими национальными

методами калибровки.

• Методика с использованием Mono S – надежный и хорошо про-

веренный метод измерения и калибровки приборов для HbA1c .

О колонках Tricorn MonoBeadsМонодисперсные пористые частицы, профессионально упакованные в высокоэффек-

тивные колонки Tricorn для микропрепаративных (от пг до мкг) и аналитических разде-лений пептидов, фрагментов белков и олигонуклеотидов. Они дают:

• Высокое разрешение, воспроизводимость и долговечность• Высокую чистоту для анализа и финишной очистки

• Быстрые и простые операции с использованием высокоэффективных хроматографи-

ческих систем, таких как ÄKTAdesign

21

Для обращеннофазовой хроматографии в широком диапазоне рНУпакованные колонки Количество № по каталогу

SOURCE 5RPC ST 4.6/150 1 17-5116-01

SOURCE 15RPC ST 4.6/100 1 17-5068-01

Для аналитических задач, требующих высокого разрешения и связыванияУпакованные колонки Tricorn Количество № по каталогу

Mono Q 5/50 GL 1 17-5166-01

Mono Q 10/100 GL 1 17-5167-01

Mono Q 4.6/100 PE 1 17-5179-01

Mono S 5/50 GL 1 17-5168-01

Mono S 10/100 GL 1 17-5169-01

Mono S 4.6/100 PE 1 17-5180-01

SOURCE 5RPC

Для получения очень высокого разрешения в аналитических разделениях

Упакованные колонки Tricorn Количество № по каталогу

Mini Q 4.6/50 PE 1 17-5177-01

Mini S 4.6/50 PE 1 17-5178-01

Mini Q PC 3.2/3 1 17-0686-01

Mini S PC 3.2/3 1 17-0687-01

Tricorn MiniBeads

Для аналитических задач, требующих высокого разрешения и выхода

Упакованные колонки Tricorn Количество № по каталогу

Superdex Peptide 10/300 GL 1 17-5176-01

Superdex 75 10/300 GL 1 17-5174-01

Superdex 200 10/300 GL 1 17-5175-01

ÄKTApurifier

Для аналитических задач, требующихширокого диапазона разделенийУпакованные колонки Tricorn Количество № по каталогу

Superose™ 6 10/300 GL 1 17-5172-01

Superose 12 10/300 GL 1 17-5173-01

Автоматические хроматографические системыСистема Количество № по каталогу.

ÄKTApurifier 10 1 18-1400-00

ЛитератураИнформационный бюллетень № по каталогу

SOURCE 5RPC ST 4.6/150 and ST 2.1/150 18-1132-36

Tricorn MonoBeads™ 18-1165-92

Tricorn MiniBeads 18-1165-93

Tricorn Superdex 18-1163-79

Tricorn Superose 18-1163-80

Информация по применению № по каталогу

Hemoglobin A1c measurement with Mono S method 18-1167-92

22

23

Очистка немеченых белков

Очистка немеченых белковОчистка немеченых белков может варьироваться от про-

стых одностадийных осаждений до крупномасштабныхвалидированных процессов для биофармацевтического

производства. Очищать белок до нужной чистоты и полу-чать его в достаточном количестве простым, надежным,

быстрым и дешевым способом является основной задачейлюбой очистки. Для разработки стратегии очистки можно

использовать систематический подход.

Задачи очисткиДля успешной очистки белка необходимо следовать мно-

гостадийному подходу для проведения извлечения, про-межуточной и финишной очистки (CiPP). Каждая из этих

стадий решает свои задачи:• Извлечение: отделяет, концентрирует и стабилизирует

целевой белок• Первичная очистка: удаляет основные примеси, такие

как другие белки и нуклеиновые кислоты, эндотоксиныи вирусы

• Финишная очистка: достигается высокая чистота продук-та путем удаления оставшихся примесей или близких по

строению веществ

РешенияGE Healthcare предлагает широкую номенклатуру лабора-

торных сорбентов и упакованных колонок для очисткинемеченых белков. Она покрывает все хроматографиче-

ские методы и стадии.Это позволяет:

• Выбрать логичную комбинацию методов очистки, осно-ванную на основных преимуществах метода и состояния

образца в начале и в конце каждой стадии• Минимизировать обработку образца между стадиями

очистки, комбинируя наилучшие методы• Увеличить выход, экономя время и деньги путем исполь-

зования наименьшего количества стаадий очистки

Быстрая 3х-стадийная очистка лабильного фермента

Рис. 11A: Извлечение: ионообменная хроматография

Образец: 40 мл осветленного E. coli экстракта DAOCS,на льду

Колонка: HiPrep 16/10 Q XL

Стартовыйбуфер (A): 50 мM Tris-HCl, 1 мM EDTA, 2 мM DTT,

0.2 M бензамидин-HCl, 0.2 мM PMSF, pH 7.5;

Элюирующийбуфер (B): A + 1.0 M NaCl

Градиент: 0 % B в 5 CV, 30 % B в 5 CV, 100 % B в 5 CV(ступенчатый градиент)



Рис. 11B: Первичная очистка: гидрофобнаяхроматография

Образец: 40 мл DAOCS фракции после HiPrep 16/10 Q XL,на льду

Колонка: SOURCE 15ISO в колонке HR 16/10

Стартовыйбуфер (A): 1.6 M (NH4)2SO4, 10 % глицерин, 50 мM Tris-HCl,

1 мM EDTA, 2 мM DTT, 0.2 мM бензамидин-HCl,0.2 мM PMSF, pH 7.5

Элюирующийбуфер (B): 50 мM Tris-HCl, 10 % глицерин, 1 мM EDTA, 2 мM

DTT, 0.2 мM бензамидин-HCl, 0.2 мM PMSF, pH 7.5

Градиент: 0–16 % B в 4 CV, 16–24 % B в 8 CV, 24–35 % B в4 CV, 100 % B в 4 CV



Рис. 11C: Финишная очистка: гель-фильтрация

Образец 3 мл DAOCS фракции после SOURCE 15ISO,на льду

Колонка: HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade

Буфер: 100 мM Tris-HCl, 1 мM EDTA, 2 мM DTT,0.2 мM бензамидин-HCl, 0.2 мM PMSF, pH 7.5



mAU mS/cm

3 00080

mAU

400

mAU

1 000

2 000

1 000

00 100 200 ml

60

40

20

0

300

200

100

00 100 200 ml

800

600

400

200

00 20 40 60 80 100 ml

Mr

97 000

66 000

45 000

30 000

20 10014 400

1 2 3 4 5 6

Рис. 11D: SDS-PAGE, окрашен серебром

Линия 1: LMW

Линия 2: Исходный экстракт E. coli

Линия 3: DAOCS фракция после Q Sepharose XL

Линия 4: DAOCS фракция после SOURCE 15ISO

Линия 5: DAOCS фракция после Superdex 75 pg

Линия 6: LMW

Рис. 11E: Карта плотности высо-кого разрешения очищенногоDAOCS

Выводы• Быстрый метод очистки с использованием современного

препаративного сорбента• Выделение 10 мг активного высоко лабильного фермента

с чистотой, достаточной для кристаллизации• Экономия времени: с трех дней до 6 часов

• Удобная оптимизация условий разделения с использова-

нием запрограммированных шаблонов и функций поиска

О колонке RESOURCE 15ISO• Одна из серии колонок, упакованных сорбентом SOURCE

для быстрого и высокоэффективного разделения

• Колонки RESOURCE имеют простой эфирный (SOURCE15ETH), изопропильный (SOURCE 15ISO) и фенильный

(SOURCE 15PHE) гидрофобные лиганды на сорбенте

• Высокая эффективность при низком противодавлении,даже при больших загрузках до 25 мг белка

О колонке HiPrep 16/10 Q XL• Упакована сорбентом Sepharose Q XL или SP XL

• 20 мл препаративные катионо- и анионообменные ко-лонки позволяют загружать большое количество образ-

ца и проводить быструю элюцию• Оптимизирована для надежных, воспроизводимых разде-

лений

О колонке HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade• Колонка HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade - упакован-

ная ХK колонка для препаративной гель-фильтрации

• Крутые кривые селективности дают отличное разрешение

для пептидов и белков в диапазоне Mr 3 000–70 000

• Высокая механическая прочность и гидрофильность сор-бента позволяют работать при высоких скоростях потока и

при минимальных неспецифических взаимодействиях

24

Двухстадийная очистка нативного белка при оптимизированном pH†

Рис. 12A: Извлечение и первичная очистка:колонка HiTrap Q для анионообменной хрома-тографииОбразец: 250 мкл осветленного обработан-

ного эстрадиолом (E2) вителлоге-нина (Vtg), образец из плазмы рыб

Колонка: HiTrap Q, 1 мл

Связывающий 0.1 M Tris–HCl, 1 мM PMSF, pH 7.0–8.5

буфер:

Элюирующий 0.1 M Tris-HCl, 1 мM PMSF, 0.5 Mбуфер: NACl, pH 7.0–8.5

Скорость: 5 мл /мин


Рис. 12B: Профили элюции оптимизированнойпо рН анионообменной хоматографии

Образец: 10 мл осветленной E2-обрабо-танной плазмы рыб

Колонка: RESOURCE Q, 1 мл

Связывающий буфер: 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5

Элюирующий буфер: 0.1 M Tris–HCl, 0.5 M NaCl, pH8.5

Скорость: 4 мл /мин

Система ÄKTApurifier 10

Рис. 12C: Финишная очистка на Superdex 200

Образец: Фракции Vtg после анионообменнойхроматографии на колонке RESOURCE Qиз трех E2- обработанных рыб

Колонка: Superdex 200 10/300 GL

Буфер: 0.05 M карбонат–бикарбонат, pH 9.6



mAU (280nm)800

700

600

500pH 7.0

400

mAU (280nm)

3 500

3 000

2 500

2 000

RT-Vtg

mS/cm

90

80

70

60

50

mAU (280nm)3 000

2 500

2 000

1 500

CH-VTG

RT-VTG

G-VTG

300

200

100

0

pH 7.5

pH 8.0

pH 8.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Время(мин)

1 500

1 000

500

00 1 2 3 4 5

40

30

20

10

0 Time(min)

1 000

200

0

0 2 4 6 8 10 12 14Volume(ml)

Теоретический градиентt Измеренный градиентRT-Vtg: Вителлогенин радужной форели

RT-Vtg: Вителлогенин радужной форелиCH-Vtg: Вителлогенин голавляG-Vtg: Вителлогенин пескаря

Stacking gel

Vtg➞

SDS-PAGE8μg 4μg 2μg

Western blotting8μg 4μg 2μg

Выводы• Вителлогенин (Vtg) был очищен из трех обработанных

эстрадиолом рыб: радужной форели, пескаря и голавля (5)

• Анионообменная хроматография на колонке HiTrap Q ис-пользована при оптимизации рН для извлечения и первич-

ной очистки; наилучшее разрешение получено при pH 8.5• После оптимизации pH колонка RESOURCE Q использова-

лась для извлечения и первичной очистки во время рутин-

ной процедуры очистки• Сорбент Superdex 200 использовался на стадии финишной

очистки для дальнейшего отделения продуктов распада отнативного Vtg и хранения продукта в требуемом буфере.

• Сочетание колонок RESOURCE Q и Superdex улучшило вос-производимость и сократило время проведения процесса.

Рис. 12D: Нативный PAGE очищенного вителло-генина радужной форели и соответствующийВестерн блот после гель-фильтрации

Электрофорез проводился в 4%-ном концентрирующеми 7.5 % разделяющем ПААГ и окрашивался серебром.Иммуноблотинг проводили с использованием BN-5анти-лососевых Vtg антител; иммунодетектированиепроводилось по усовершенствованному хемилюминес-центному методу после переноса белков на нитроцел-люлозную мембрану.

О колонках RESOURCE Q и SКолонки RESOURCE Q и S заполнены сорбентом SOURCE 15 Q

или 15 S для быстрого и простого разделения методом ионно-го обмена. Они дают:

• Высокоэффективные разделения в широком диапазоне ра-бочих давлений

• Монодисперсные 15 мкм частицы сорбента обладают пре-красными гидродинамическими характеристиками

• Минимальное неспецифическое связывание и высокий вы-ход очищенного продукта

• Сравнительно низкое противодавление на высоких скоро-

стях потока, позволяя проводить эффективное разделениедаже при использовании насосов низкого давления

† Перепечатано с любезного разрешения Elsevier

25

Продукция для очистки немеченых белковGE Healthcare производит широчайшую номенклатурулабораторных упакованных колонок и сорбентов для

очистки немеченых белков. Это покрывает все основныехроматографические методы и стадии. Логические ком-

бинации хроматографических стадий показаны на рис.13A. Руководство по применимости каждого метода для

стадий извлечения, первичной и финишной очистки при-ведены в таблице 13B.

Если ничего не известно о целевом белке, то наиболееэффективный подход к очистке следующий: ионный обмен

(извлечение), гидрофобная хроматография (первичнаяочистка) и гель-фильтрация (финишная очистка). Для полу-

чения общей информации см. «Protein Purification Hand-book» или обратитесь к представителю GE Healthcare. Что-

бы подобрать продукцию, наиболее подходящую для Ва-ших задач, смотрите наши руководства на сайте:

www.chromatography.amershambiosciences.com

Рис. 13A: руководство по комбинированию стадий Таблица 13B: применимость методов для стадий очистки

Исходный образец или образец с высоким содержанием солей Метод Основные черты Извлечение Первичная Финишная Стартовые Финишныеочистка очистка условия условия

IEX высокое разрешение★★★ ★★★ ★★★ низкая ионная сила высокая ионнаяОсветлениеобразца* GF GF GF

обессоливание обессоливание обессоливание

высокая емкость объем образца сила или сильноевысокая скорость не ограничен изменение pH,

концентрированный

HIC хорошее разрешение ★★ ★★★ ★ высокая ионная сила низкая ионнаяхорошая емкость объем образца силавысокая скорость не ограничен концентрированный

Извлечение AC IEX HIC IEXМожет требовать-ся разбавление

AC высокое разрешение★★★ ★★★ ★★ особые условия особые условиявысокая емкость связывания элюции,высокая скорость объем образца концентрированный

не ограничен

GF высокое разрешение ★ ★★★ объем образца буфер замененПервичнаяочистка

IEX HIC при использовании Superdex ограничен (<5% CVl (если требуется),скорость потока разбавленныйограничена

Финишнаяочистка GF GF GF GF RPC высокое разрешение ★ ★★★ требуется органи- риск потери биологи-

ческий растворитель ческой активности в* Альтернативно, образцы могут быть отфильтрованы методомтангенциальной фильтрации, см. раздел ”Пробоподготовка” и, еслинеобходимо, ионную силу можно уменьшить разведением

органическом раство-рителе,концентрированный

AC: аффинная хроматография; DS: обессоливание; IEX: ионообменная хроматография; GF: гель-фильтрация; HIC: гидрофобная хроматография; RPC: обращеннофазовая хроматография


ÄKTApurifier 10 1 18-1400-00

ÄKTAFPLC 1 18-1900-26

ЛитератураРуководство по выбору продукции № по каталогу

Ion exchange columns and media 18-1127-31

Gel filtration columns and media 18-1124-19

Affinity Chromatography columns and media 18-1121-86

Fast desalting and buffer exchange of proteins and peptides 18-1128-62

HiTrap column guide 18-1129-81

Prepacked chromatography columns with ÄKTAdesign systems 18-1173-49

26

Рефолдинг белков из телец включения

О рефолдинге рекомбинантных белковДля экспрессии рекомбинантных белков E. coli является

наиболее часто используемым объектом. Белки экспрес-сируются в цитоплазму или секретируются. Суперэкспрес-

сия белков в некоторых случаях приводит к накоплению ихв нерастворимых полипептидных агрегатах, называемых

тельцами включения.

Задачи очисткиПревратить нерастворимый белок в тельцах включенияв полезный растворимый биологически активный бе-

лок.

РешенияХроматографический колоночный рефолдинг позволяет:

• Автоматизировать процесс

• Надежно и просто масштабировать

• Проводить одновременно рефолдинг и очистку• Высокую совместимость и химическую стабильность

к различным добавкам, восстанавливающим реаген-

там, денатурирующим агентам и детергентам• Удобную оптимизацию условий разделения с использо-

ванием запрограммированных шаблонов и функций по-иска.

27

Одностадийный колоночный рефолдинг и очистка меченого гистидиномбелка из телец включенияE. coliРис. 14A: Колоночный рефолдинг и очистка

Образец Меченый гистидином солюбилизованный одноцепочечный Fvфрагмент антитела Fab 57P, 10 мл (конц. 0.67 мг/мл) из телецвключения E. coli

Колонка: HisTrap HP 1 мл

Солюбилизирующий 20 мM Tris-HCl, 6 M Gua-HCl, 1 мM DTE, 1 мM Na2-EDTA,буфер: 0.1 мM Pefabloc™, pH 7.5

Денатурирующий свя- 20 мM Tris-HCl, 5 мM имидазол, 0.5 M NaCl, 8 M мочевина,зывающий буфер: 1 мM DTE, 0.1 мM Pefabloc, pH 7.5

Буфер для 20 мM Tris-HCl, 5 мM имидазол, 0.5 M NaCl, 0.5 M аргинин-HCl,рефолдинга: 1 мM восстановленный глутатион (GSH), 1 мM окисленный

глутатион (GSSG), pH 7.5

Нативный связывающий 20 мM Tris-HCl, 10 мM имидазол, 0.5 M NaCl, pH 7.5буфер:

Нативный элюирующий 20 мM Tris-HCl, 500 мM имидазол, 0.5 M NaCl, pH 7.5буфер:



Рис. 14B: Сенсограмма взаимодействия между иммобилизованнымпептидом и ренатурированным белком

Система: Biacore™ system 2000

Серсорная Иммобилизованный пептид C16V”37” (вирус табачнойповерхность: мозаики) со сродством к scFv57P

Чистая поверхность: иммобилизованная с пептидом без сродства к scFv57P

Выход: 14 % активного белка из собранной фракции

RU20000

15000

10000

5000

0

mAU3 5

Элюирующийбуфер %

100-5000

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600Sec

500

40080

Ячейка сравненияЯчейка образцаРезультат вычитания образец-сравнение

300

200

100

0

1

2

4

60

40

20

0

Выводы• Выход в рефолдинге составил 14% от очищенного белка

• Параметры рефолдинга для белков, меченных гистиди-ном, могут быть легко оптимизированы, и конечный ме-

тод автоматизирован как для рефолдинга, так и для очи-

стки на колонках HisTrap HP

0 20 40 60 80 100 мл

1 Ввод пробы

2 Промывка системы сначала нативным элюирующим буфером, за-тем нативным связывающим буфером (клапан колонки находитсяв положении bypass). После этого начинается уравновешиваниеколонки нативным связывающим буфером.

3 Старт рефолдинга буфером рефолдинга4 Переуравновешивание системы в исходное состоя ние5 Старт элюирования нативным элюирующим буфером

Рис. 14C: Фракция после очисткифрагмерта антитела scFv 57Pпосле рефолдинга

О колонках HisTrap HPСорбент Ni Sepharose HP, упакованный в удобные колонки

HisTrap для очистки меченых гистидином белков:• Высокая связывающая способность, не менее 40 мг/мл

сорбента

• Совместимы с различными добавками, восстанавли-вающими реагентами, денатурирующими агентами и

детергентами• Незначительная потеря Ni

• Простота использования со шприцем, насосом или высо-коэффективной хроматографической системой, например,

ÄKTAdesign

500

400

Элюирующий буфер %100

80

300 60

200 40

100 20

0

91.5 92 92.5 93 93.5 94 94.5 95 мл

0

28

Одностадийный колоночный рефолдинг и очистка в двойном градиенте

Рис. 15: Использование двойного градиента при ионообменном рефол-динге.

Образец: 8 мг лизоцима, растворенного в денатурирующем буфере

Колонка: HiTrap SP HP 5 мл

Денатурирующий буфер: 50 мM Tris-HCl, 6 M мочевина, 3 мM GSH и 3 мM GSSG(редокс соотношение 1:1), pH 6.2

Буфер для рефолдинга: 100 мM Tris-HCl, 1 M мочевина, 0.3 M NaCl, 3 мM GSH и3 мM GSSG (редокс соотношение 1:1), pH 10.0

Двойной градиент: линейный от денатурирующих до условий рефолдинга в15 мл объема градиента. Одновременно изменение pH от6.2 до 10 в течение градиента рефолдинга


Выводы• Сочетание градиента уменьшения концентрации моче-

вины и увеличения рН на колонке HiTrap SP HP дает

более высокие выходы лизоцима с большей биологи-ческой активностью (8)

• Для рефолдинга денатурированного лизоцима актив-ность и количество белка после рефолдинга выше, чем

в процессах без градиента или только с одним гради-ентом (данные не показаны)A280 (mAU)

700

6Лизоцим после рефолдинга

pH NaCl (M)0.4

О колонках HiTrap SP HP

Колонки HiTrap, профессионально упакованные ионооб-

менным сорбентом SP Sepharose High Performance, дляэффективной очистки белков:

• Малые размеры частиц сорбента (34 мкм) позволяют

проводить быструю адсорбцию и десорбцию даже привысоких загрузках образца и больших скоростях потока

• Высокая емкость в широком диапазоне рН• Удобная конфигурация для простых и быстрых разделе-

ний в одной колонке или нескольких, соединенных по-

следовательно

600

500

300

200

100

5

4

3

2

1

10

9

8

7

6

0.3

0.2

0.1

0.0

00 10 20 30

Объем, мл

A280 NaCl мочевина pH

Репрезентативный процесс хроматографического рефолдинга†

Не существует единого метода рефолдинга, который удовлетворял бы всем требова-

ниям по рефолдингу различных белков. Химические условия также меняются в зави-симости от белка. Нахождение оптимальных условий рефолдинга следует проводить

экспериментально. Процессы хроматографического рефолдинга (см. таблицу внизу)показывают свое преимущество для различных белков, денатурированных нативных

белков или полипептидов, экспрессированных в виде телец включения (8).

Метод рефолдинга Хроматографический метод Метод элюции Белок Выход ( %) Ссылка

Замена растворителя нормальная GF Нормальная GF RETS-1 изоформа PDGF 75 [6]гель-фильтрацией 75 [7]

Градиентная GF Нет градиента ScFv 14.5 [8]Градиент мочевины 17.3Градиент мочевины и рН 25

Замена растворителя во время IEX Трехбуферная система Некоторые тельца включения ND [9–11]обратимой адсорбции Двойной градиент Лизоцим человека SOD 50 [12]

40 [13]IMAC Трехбуферная система Гистидин-TNF 90 [14]HIC Нормальная HIC α-Интерферон человека ND [15]RPC Нормальная RPC Интерлейкин-2 человека ND [16]

Использование иммобили- GroEL, GroES Смесь денатурированного Лизоцим 85 [17, 18]зованного катализатора белка и сорбентафолдинга Липосомы Нормальная хроматографическая элюция Лизоцим 90 [19, 20]

PEG Нормальная хроматографическая элюция Лизоцим 90 [21]

ND: не определено; IEX: ионообменная хроматография; GF: гель-фильтрация; IMAC: иммобилизованная металл-аффинная хроматографияHIC: гидрофобная хроматография; RPC: обращеннофазовая хроматография; PEG: полиэтиленгликоль

† Перепечатано с любезного разрешения Elsevier

29

Примеры продукции для колоночного рефолдингаУпакованные колонки Количество № по каталогу

HisTrap HP 5 × 1 мл 17-5247-01

HisTrap HP 100 × 1 мл* 17-5247-05

HisTrap HP 1 × 5 мл 17-5248-01

HisTrap HP 5 × 5 мл 17-5248-02

HisTrap HP 100 × 5 мл* 17-5248-05

HiTrap SP HP 5 × 1 мл 17-1151-01

HiTrap SP HP 5 × 5 мл 17-1152-01

HiTrap Q HP 5 × 1 мл 17-1153-01

HiTrap Q HP 5 × 5 мл 17-1154-01

HiTrap Phenyl HP 5 × 1 мл 17-1351-01

HiTrap Phenyl HP 5 × 5 мл 17-5195-01

RESOURCE ETH 1 × 1 мл 17-1184-01

RESOURCE ISO 1 × 1 мл 17-1185-01

RESOURCE PHE 1 × 1 мл 17-1186-01

RESOURCE RPC 1 мл 17-1182-01

HisTrap HP kit 1 17-5249-01

HiTrap SP HP

HisTrap HP kit

Гель-фильтрационная продукция для колоночного рефолдингаУпакованные колонки Количество № по каталогу

Superdex 75 10/300 GL 1 17-1047-01

Superdex 200 HR 10/300 GL 1 17-1088-01







ÄKTAexplorer


ÄKTAexplorer 10 1 18-1300-00

* специальная упаковка по заказу

30

ПробоподготовкаО пробоподготовкеПробоподготовка присутствует в огромном количестве

приложений. Для протеомного анализа плазмы человекамногие исследователи изучают минорные белки. Одной из

их первоначальных задач является нахождение полезныхбиомаркеров для различных заболеваний и условий.

Масс-спектрометрический анализ (MS) является очнь важ-ным инструментом в анализе белков. Некоторые молекулы

разрушают белки в супернатантах культур клеток, бакте-риальных лизатах или плазме.

ЗадачиМажорные белки, такие как альбумин и иммуноглобулины ,создают сложности при детектировании минорных белков.

Протеазы, находящиеся в плазме, могут разрушить образец,

если их не удалить.. MS анализ нельзя проводить, если врастворе присутствуют некоторые буферные соли.

Решения• Удаление мажорных белков можно проводить на колонках

HiTrap Blue HP

• Колонки HiTrap Benzamidine FF (high sub) можно применятьдля удаления трипсиноподобных сывороточных протеаз из

плазмы человека• Обессоливание на сорбенте Sephadex™ очень полезно

для удаления буферных солей перед очисткой и MSанализом

• Очистка на мембране методом тангенциальной фильтрацииявляется идеальным сособом замены буфера при работе с

большими объемами растворов

31

Удаление мажорных белков из плазмы человека

Рис. 16A: Обессоливание на колонке HiTrapОбразец: 1 мл ISTH/SSC плазмы человека, Secondary Coagulation Standard

(SCS)

Колонка: HiTrap Desalting 5 мл

Буфер: 20 мM Tris-HCl, 100 мM NaCl, pH 7.4

Скорость: 5 мл/минСистема: ÄKTAFPLC

Выводы

• Концентрация белков в плазме варьируется от нескольких

фемтомолей/л и менее до миллимолярной, делая, таким об-разом, анализ минорных белков крайне сложной задачей

• Предварительная хроматографическая очистка плазмыулучшает детектирование и идентификацию минорных бел-

ков в 2-D электрофорезе и/или жидкостной хроматографиис последующим MS анализом

• Быстрый, простой и полуавтоматический хроматографиче-

ский метод для фракционирования белков плазмы• Показана идентификация ряда белков, демонстрирующая

простоту и надежность метода

Замена

mAU3000

2500

mS/cm14.0

12.0

10.0буфера 2000

1500

1000

500

0

8.0

6.0

4.0

2.0

0.00.0 2.0 4.0 6.0 8.0 мл

Рис. 16B: HiTrap Blue HP (2 колонки по 5 мл последовательно)Образец 3 мл ISTH/SSC плазмы человека, SCS, обессоленный

Колонка: HiTrap Blue HP (2 x 5 mмл последовательно)

Связывающий буфер: 20 мM Tris-HCl, 100 мM NaCl, pH 7.4

Элюирующий буфер: 20 мM Tris-HCl, 1.0 M NaCl, pH 7.4

Скорость: 3 мл/минСистема: ÄKTAFPLC

О колонках HiTrap Blue HP• Колонки HiTrap Blue HP упакованы сорбентом Blue

Sepharose HP, имеющим лиганд Cibacron™ Blue F3G-A• Этот лиганд ковалентно связан с высоко сшитой агарозной

матрицей и стабилен в широком диапазоне рН• Для очистки альбумина, ферментов, факторов свертывае-

мости крови, интерферонов и аналогичных белков

Удалениеальбумина

mAU300

250

200

150

100

mS/cm160

140

120

100

80

60

complement component 1 inhibitor

transferrin50

0

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 мл

40

20

0

gelsolin (2 spots)

kininogen (4 spots)

profilaggrin

hemopexin (8 spots)

HiTrap Protein G HP

УдалениеиммуноглобулинаДанные не показаны

antithrombin III (4 spots)

IgG

fibrinogen beta (3 spots) fibrinogen beta (5 spots)

Рис. 16C: RESOURCE QОбразец: 3 мл ISTH/SSC плазмы человека, SCS, альбумин и имму-

ноглобулин удалены (рис. 13A и 13B)

Колонка: RESOURCE Q 5 мл

Стартовый буфер: 20 мM Tris-HCl, 100 мM NaCl, pH 7.4

Элюирующий буфер: 20 мM Tris-HCl, 1.0 M NaCl, pH 7.4


Градиент: ступенчатый


macroglobulin alpha-2 (5 spots) helicase -like protein NHL isoform b

alpha-1B glycoprotein (4 spots) serum albumin (8 spots)macroglobulin alpha-2 (3 spots)

angiotensinogen (7 spots)

Anionexchange

mAU160

140

mS/cm

80

alpha 1 antitrypsin (5 spots)IgA (3 spots)

fractionation 120

100 60no id (3 spots)

haptoglobin (3 spots)

apolipo protein A-IVIg kappa (3 spots)

80

60 40

apolipo protein A-I (4 spots)

40

20

0

20

00 20 40 60 80 100 мл

haptoglobin (4 spots)

32

Удаление трипсиноподобных сыворо-точных протеаз из плазмы человека

A280A405

Активность10-3 IU/мг

3.01.00

A280

Рис. 17: Удаление трипсиноподобных сывороточных протеазОбразец: 1 мл плазмы человека, отфильтрованной через 0.45 мкм фильтр

Колонка: HiTrap бензамидин FF (high sub), 1 мл

Связывающий буфер: 20 мM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 7.4

Элюирующий буфер: 50 мM глицин, pH 3.0

Градиент: 0–100 % элюирующий буфер в один шаг

Скорость: 1.0 мл/минСистема: ÄKTAexplorer 10

0.80

0.60

0.40

0.20

0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 5.0 10.0 15.0 мл

Выводы• Протеазы, находящиеся в плазме человека, могут разру-

шать образец, если их не удалить

• Почти все трипсиноподобные сывороточные протеазыбыли удалены из плазмы человека и связаны на колонке

О колонках HiTrap бензамидин FF (high sub)• Для удаления и/или очистки сывороточных протеаз

в одну стадию

• Высокая связывающая способность

• Эффективное удаление тромбина и фактора Xa послеудаления метки из рекомбинантных белков

Малое масштабирование при замене буфера, до 60 мл образцаРис. 18: Пять обессоливающих колонок HiTrap Desalting, соединенных последовательно

Образец: 2 мг/мл BSA в 50 мM фосфате натрия, 0.5 M NaCl, pH 7.0 Колонка: HiTrap обессоливающая, 1 × 5 мл, 3 × 5 мл, 5 × 5 млОбъем образца: 28 % объема колонки (1.4, 4.3 и 7.1 мл соответственно) Буфер: 50 мM фосфат натрия, 0.15 M NaCl, pH 7.0Скорость: 5 мл/мин Система: ÄKTAFPLC

Рис. 18A: Одна колонка HiTrap Desalting 5 мл Рис. 18B: Две колонки HiTrap Desalting по 5 мл Рис. 18C: Три колонки HiTrap Desalting по 5 мл

0.40

AU280nm

ABSA

NaCl

Электропровод-ность, mS/см

50 0.40

AU 280nm

B

BSANaCl

0.40

AU 280nm

C

BSANaCl

0.30

0.20

400.30

0.20

400.30

0.20

40

0.1030

0.1030

0.1030

0.000 2.0 4.0 6.0 ml

20 0.00

0 5.0 10.0 15.0 20.0 ml

20 0.00

0 10.0 20.0 30.0 ml

20

ВыводыРис. 18А–С показывает результаты использования колонокHiTrap Desalting для обессоливания образцов объемом 1.4,4.3 и 7.1 мл. Последовательное соединение колонок HiTrap

Desalting позволяет быстро и просто масштабировать про-

цесс без увеличения противодавления.

О колонках HiTrap Desalting и HiPrep DesaltingКолонки HiTrap Desalting и HiPrep Desalting упакованы сор-бентом Sephadex G-25 для быстрого простого обессолива-

ния и замены буфера. Использование четырех последова-тельно соединенных колонок HiPrep 26/10 Desalting позво-

ляет обессолить 60 мл образца за короткое время.

Обессоливание 100-300 мл образцаметодом тангенциальной фильтрацииРис. 19: Обессоливание 100 мл методом тангенциальной фильтрацииОбразец: 100 мл раствора белка (1 мг/мл) в 2 M NaCl

Буфер для диафильтрации: водаМодуль фильтрации: MidGee™ UFP-3-C-MM06A (площадь фильтрации 26 cм2)Скорость: 30 мл/мин


600

400

200

0

mAU bar

8008.0

UVConductivityPressure

Start Diafiltration mS/cm800

600

6.0

4.0

2.0

0.0

Concentration Diafiltration

600

400

400

200

00 20 40 60 80 100 120 140 minВыводы

• Обессоливание 100 мл раствора белка методом танген-циальной фильтрации уменьшило концентрацию солейс 125 mS/cм до 2 mS/cм, концентрация белка увеличенав 10 раз

• Тангенциальная фильтрация – простая технология очи-стки для замены буфера и обессоливания

Обессоливание на ультрафильтрационныхкартриджахТангенциальную фильтрацию проводили на картриджахMidGee UFP-3-C-MM06A, подключенных к системе ÄKTAprime.• Идеально для обработки 100–300 мл образца• Многократно используемые фильтры дают во с-

производимые результаты

33


50


50

Удаление мажорных белковУпакованные колонки Количество № по каталогу

HiTrap Blue HP 1 × 5 мл 17-0413-01

HiTrap Blue HP 5 × 1 мл 17-0412-01

RESOURCE Q 1 × 6 мл 17-1179-01

RESOURCE Q 1 × 1 мл 17-1177-01


HiTrap Protein G HP 5 × 1мл 17-0404-01


HiTrap Protein G HP 5 × 5 мл 17-0405-03Колонки HiTrap Blue HP

Удаление трипсиноподобных протеазУпакованные колонки и сорбенты Количество № по каталогу

HiTrap Benzamidine FF (high sub) 2 × 1 мл 17-5143-02



Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow 25 мл 17-5123-10

Обессоливание и масштабирование замены буфераУпакованные колонки Количество № по каталогу

HiTrap Desalting 5 × 5 мл 17-1408-01

HiPrep 26/10 Desalting 1 (53 мл) 17-5087-01

HiPrep 26/10 Desalting 4 (53 мл) 17-5087-02

Колонки HiTrap BenzamidineFF (high sub)

Обессоливание с помощью тангенциальной фильтрацииПоловолоконные фильтры Предел отсечения № по каталогу

MidGee UFP-3-C-MM06A 3 kD 56-4100-05





Картридж MidGee

Автоматические хроматографические системыСистемы Количество № по каталогу

ÄKTAFPLC 1 18-1118-67


ЛитератураРуководство по выбору продукции

Affinity chromatography columns and media 18-1121-86

Gel filtration column and media 18-1124-19

HiTrap columns 18-1129-81

Hollow fiber cartridges and systems 18-1165-29

34

Хроматографические системы

ÄKTAprime plus:простая хромато-графическая очистка

ÄKTAFPLC:высокоэффективнаяочистка белков идругих биомолекул

ÄKTApurifier:высокоэффективнаяочистка и характери-зация

ÄKTAexplorer:для быстрой разработки ме-тода и масштабирования

ÄKTApilot:быстрая разработка процессаи пилотное производство

ÄKTAxpress:для высокопроизводительнойочистки меченых белков и антител

Задачи ÄKTAprime plus ÄKTAFPLC ÄKTApurifier ÄKTAexplorer ÄKTApilot ÄKTAxpress

Простая одностадийная очистка • • • • •

Воспроизводимые результаты для рутинной очистки • • • • • •

Оптимизация одностадийной очистки для повыщения чистоты • • • • •

Контроль системы и обработка данных в соответствии с требованиями GLP • • • •

Автоматическая разработка и оптимизация метода • • •

Автоматическое приготовление буферов • •

Автоматический выбор рН • •

Автоматический подбор сорбентов или колонок • •

Автоматическая многостадийная очистка • • •

Разработка метода и масштабирование • •

Санитарный дизайн по cGMP •

Масштабирование, разработка процесса и переход в производство •

Полностью автоматизированные, высокопроизводительные, unattended operations •

Система контроля UNICORN: одна программа обеспечивает контроль вреальном времени за всеми нашими хроматографическими системами.Она дает простые в использовании редактируемые шаблоны методов длявсех основных применений и технологий. UNICORN enables direct methodtransfer while providing powerful data reporting and evaluation.

35

Очистка быстрее, проще и надежнее.За более, чем 50 лет.

Подразделение по выделению белков фирмы GE Health-care насчитывает более 230 разработчиков, значительную

часть которых составляют химики, биохимики и инженеры.Совместно со специалистами по продаже продукции они

тесно сотрудничают с нашими пользователями и другимиключевыми специалистами в области естественных наук,

биотехнологии и биофармацевтической промышленности.За 50 лет признанного лидерства в разработке и совер-

шенствовании технологий очистки белков нашей задачейостается делать Ваши операции быстрее, проще, надеж-

нее и производительнее. Вот два последних примера:• Система ÄKTAxpress, котрая автоматизирует многоста-

дийную очистку до 48 образцов и позволяет получатьза ночь до 50 мг меченого белка с чистотой более 95%.

• Сорбенты Ni Sepharose High Performance и Fast Flow,доступные как в виде собственно сорбентов, так и упа-

кованные в колонки HisTrap и HisPrep. Последняя ком-

бинация позволяет проводить простую одностадийнуюочистку меченых гистидином белков при увеличении

связывающей емкости сорбента до 4 раз.

Высокая воспроизводимость и контролькачестваМы имеем самую большую в мире производственную базу

для изготовления хроматографических сорбентов с годо-вой мощностью 450 000 литров и/или килограммов. Наши

сорбенты и колонки производятся в соответствии с вали-дированными методами и их качество строго контролиру-

ется. Это гарантирует воспроизводимость характеристикнаших сорбентов и колонок от партии к партии, что помо-

гает достигать воспроизводимых результатов в очистке.

Обеспечение качестваВся наша продукция производится и поставляется в соот-ветствии с требованиями ISO 9001 и сопровождается тех-

нической документацией. Критичные материалы, приме-

няемые при создании оборудования (например, колонн,систем и т.д.) проверяются на биологическую безопасность

в соответствии с действующими стандартами. Мы обеспе-чиваем полное отслеживание всех источников используе-

мых материалов. Кроме того, мы инвестируем средства втехнологии контроля характеристик сорбентов, которые

доказывают, что наши сорбенты соответствуют заявлен-ным спецификациям и, таким обзаром, гарантируют поль-

зователю полную уверенность в качестве продукции.

36

37

38

Готовы помочь в Ваших исследованияхyour researchНаши специалисты по очистке белков готовы предоста-

вить Вам в помощь мощные ресурсы. Фактически, каж-

дую минуту каждого рабочего дня они помогают пользо-вателям нашей продукции в решении задач по очистке.

Наши профессиональные специалисты по продажам

также всегда готовы Вам помочь. Вы можете обратитьсяк специалистам технической поддержки в режиме он-

лайн, или по телефону. Наши профессионалы по логисти-

ке, а также системы складского менеджмента и проце-дуры гарантируют своевременные поставки. Наша про-

фессиональная сервисная служба предложит стандарт-

ный или персональный договор на обслуживание обо-рудования и процесса.

Научные форумыМы создаем профессионалам условия для обмена опы-

том и знаниями. В режиме он-лайн мы предлагаем обра-зовательные центры и клубы пользователей. Мы прово-

дим или же активно участвуем в тысячах живых форумовкаждый год.

Курсы и тренингиПовышение уровня знаний и эффективности работы Ва-ших сотрудников предоставляет Вам длительное конку-рентное преимущество. Мы предлагаем как общие, так и

специализированные тренинги для удовлетворения Ва-

ших конкретных нужд. В среднем более 450 инженеров иученых ежегодно обучаются на наших курсах Fast Trak™.

Tехническая литератураМногие университеты во всем мире используют наши ме-

тодические руководства в качестве учебных материалов.Мы предоставляем Вам техническую литературу, включая

каталоги продукции, научные постеры, информацию поприменению и другое. Эта информация регулярно обнов-

ляется в соответствии с новейшими данными и доступнапо адресу в Интернете:

www.chromatography.amershambiosciences.com

Литература1. Jeppsson, J-O. et al. Measurement of hemoglobin A1c by a new liquidchromatographic assay: methodology, clinical utility and relation toglucose tolerance evaluated. Clin. Chem.; 32, 1867–72 (1986)

2. Eckerbom, S.et al. Improved method for analysis of glycated he-moglobin by ion exchange chromatography. Ann. Clin. Biochem.31, 355–360 (1994).

3. Jeppsson, J-O. et al. Approved IFCC Reference Method forMeasurement of HbA1c in Human Blood. Clin. Chem. Lab. Med. 40,78–89 (2002)

4. Hoelzel, W. et al. IFCC Reference system for Measurement ofHemoglobin A1c in Human Blood and the National StandardizationSchemes in the United States, Japan and Sweden: A Method- Com-parison Study. Clin.Chem. 50, 166–174 (2004)

5. Brion, Francois. et al. Two-step purification method of vitellogeninfrom three teleost fish species: rainbow trout, gudgeon and chub.Jour. Chrom. B Biomed. Sc.i appl., 737 (1–2), 3–12 (2000)

6. Amons, R. and Schrier, P.I. Removal of sodium dodecyl sulfatefrom proteins and peptides by gel filtration, Anal. Biochem. 116,439–443 (1981)

7. Hamaker, K.H., Liu, J., Seely, R.J., Ladisch, C.M., and Ladisch, M.R.Chromatography for rapid buffer exchange and refolding of secretoryleukocyte protease inhibitor, Biotechnol. Prog. 12, 184–189, (1996)

13. Li, M. and Su, Z. Refolding of superoxide dismutase by ion-exchange chromatography, Biotechnol. Lett . 24 919–923 (2002)

14. Xu, J., Zhou, Q., Ma, Z., Yu, J., Hua, M. and Ding, R. Study onconstruction of His6-human TNFb fusion expression plasmid andsingle-step purification of its product, Pharm. Biotechnol. 7, 1–5, (2000)

15. Guo, L. Simultaneous purification and renaturation of recombinanthuman interferon alpha expressed by E. coli by highperformance hy-drophobic interaction chromatography, Chin. J. Chromatogr. 19,301–303 (2001)

16. Ling, M., Xu, X., Shi, F., Zhu, Y., and Long, N. Refolding ofrecombinant human interleukin-2 by reverse phase highperformance liquid chromatography, Chin. J. Biotechnol. 13, 180–183(1997)

17. Dong, X.-Y., Yang, H., Gan, Y.-R., Bai, S. and Sun, Y. Reactivation ofdenatured lysozyme with immobilized molecular chaperones GroE,Chin. J. Biotechnol. 16, 169–173 (2000)

18. Altamirano, M.M., Garcia, C. Possani, L.D., and Fersht, A. Oxidativerefolding chromatography: folding of the scorpion toxin Cn5, NatureBiotechnol. 17,187–191 (1999)

19. Yoshimoto, M. and Kuboi, R. Oxidative refolding of denatured/reduced lysozyme utilizing the chaperone-like function of liposomesand immobilized liposome chromatography, Biotechnol. Progr. 15,480–487, (1999)

20. Yoshimoto, M., Shimanouchi, T., Umakoshi, H., and Kuboi, R.Immobilized liposome chromatography for refolding and purificationof protein, J. Chromatogr. B 743, 93–99 (2000)

21. Geng, X.D. and Chang, X.Q. High performance hydrophobicinteraction chromatography as a tool for protein refolding,J. Chromatogr. A 599, 185–194, (1992)

8. Gu, Z., Weidenhaupt, M., Ivanova, N., Pavlov, M., Xu, B., Su, Z., Janson,J.-C. Chromatographic methods for the isolation and refolding of proteinsfrom E. coli inclusion bodies, Protein Expr. Purif. 25, 174–179, (2002)

9. Mozhaev, V.V., Martinek, K., Berezin, I.V. Effect of immobilization onprotein (trypsin) folding,Mol. Biol. (Moscow) 13, 73–80 (1979)

10. Creighton, T.E., Folding of proteins adsorbed reversibly to ion ex-change resins, D.L. Oxender (Ed.), UCLA Symposia on Molecular andCellular Biology, New Series, 39, 249–257 (1986)

11. T.E. Creighton, A process for production of a protein, 1986, WorldPatent, WO 86/05809.

12. M. Li, Z. Su, Refolding human lysozyme produced as an inclusionbody by urea concentration and pH gradient ion exchange chroma-tography, Chromatographia, 56 33–38, (2002)

БлагодарностиХотим выразить благодарность многим исследовательским ин-ститутам, лабораториям и профессорам, а также другим нашимпартнерам, которые посвятили нам свое время, поделились зна-ниями и информацией, позволившими нам создать эту брошюру.Хотим также поблагодарить издательство Elsevier за любезноесогласие на перепечатку статей, опубликованных в журналахJournal of Chromatography B и Protein Expression and Purification.

Дополнительная литератураРуководства Code No.

Affinity chromatography 18-1022-29

Recombinant protein purification 18-1142-75

GST gene fusion system 18-1157-58

Antibody purification 18-1037-46

Affinity chromatography 18-1022-29

Ion exchange chromatography and chromatofocusing 18-1114-21

Protein purification 18-1132-29

Hydrophobic interaction chromatography and reversed phase chromatography 11-0012-69

Gel filtration 18-1022-18

39

www.chromatography.amershambiosciences.comwww.gehealthcare.com

GE HealthcareAmersham Biosciences ABBjörkgatan 30SE-751 84 UppsalaSweden

ÄKTAdesign, ÄKTAexplorer, ÄKTAFPLC, ÄKTAprime, ÄKTApurifier,ÄKTAxpress, Fast Trak, FPLC, GSTPrep, GSTrap, HiLoad, HiPrep,HisPrep, HiTrap, HisTrap, MAbTrap, MidGee, MiniBeads, Mini Q,Mini S, MonoBeads, Mono Q, Mono S, PreScission, RESOURCE,Sephadex, Sepharose, SOURCE, Superdex, Superose, Tricorn, andUNICORN are trademarks of GE Healthcare Limited, a GeneralElectric company.

Biacore is a registered trademark of Biacore AB. Cibacron is aregistered trademark of Ciba Speciality Chemicals Corporation.Pefabloc is a registered trademark of Pentafam AG.

All goods and services are sold subject to the terms and conditionsof sale of the company within GE Healthcare that supplies them.General Electric Company reserves the right, subject to any regula-tory and contractual approval, if required, to make changes inspecifications and features shown herein, or discontinue theproduct described at any time without notice or obligation. Contactyour local GE Healthcare representative for the most currentinformation.

Licensing informationAll materials for research use only. Not for diagnosticor therapeutic purposes. A license for commercial useof GST gene fusion vectors must be obtained fromChemicon International Incorporated, 28820 SingleOak Drive, Temecula, California 92590, USA.

Purification and preparation of fusion proteins and affinity peptidescomprising at least two adjacent histidine residues may require alicense under US pat 5,284,933 and US pat 5,310,663, includingcorresponding foreign patents (assigne: Hoffman La Roche, Inc).

© 2005 General Electric Company – All rights reserved.

Amersham Biosciences AB, a General Electric company going tomarket as GE Healthcare.

GE Healthcare Amersham Biosciences ABBjörkgatan 30, 751 84 Uppsala, Sweden

GE Healthcare Amersham Biosciences Europe GmbHMunzinger Strasse 9, D-79111 Freiburg, Germany

GE Healthcare Amersham Biosciences UK LtdAmersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA, UK

GE Healthcare Amersham Biosciences Corp800 Centennial Avenue, P.O. Box 1327, Piscataway,NJ 08855-1327, USA

GE Healthcare Amersham Biosciences KKSanken Bldg. 3-25-1, Hyakunincho, Shinjuku-ku,Tokyo 169-0073, Japan

Asia Pacific Tel: +852 2811 8693 Fax: +852 2811 5251 • Australasia Tel: + 61 2 9899 0999 Fax: +61 2 9899 7511 • Austria Tel: 01/57606-1619 Fax: 01/57606-1627 • Belgium Tel: 0800 73 888 Fax: 03 272 1637 • Canada Tel: 800 463 5800 Fax: 800 5671008 • Central, East, & South East Europe Tel: +43 1 982 3826 Fax: +43 1 985 8327 • Denmark Tel: 45 16 2400 Fax: 45 16 2424 • Finland & Baltics Tel: +358-(0)9-512 39 40 Fax: +358 (0)9 512 39 439 • France Tel: 01 69 35 67 00 Fax: 01 69 41 96 77• Germany Tel: 0761/4903-490 Fax: 0761/4903-405 • Italy Tel: 02 27322 1 Fax: 02 27302 212 • Japan Tel: +81 3 5331 9336 Fax: +81 3 5331 9370 • Latin America Tel: +55 11 3933 7300 Fax: +55 11 3933 7304 • Middle East & Africa Tel: +30 210 9600687 Fax: +30 210 9600 693 • Netherlands Tel: 0165 580 410 Fax: 0165 580 401 • Norway Tel: 815 65 555 Fax: 815 65 666 • Portugal Tel: 21 417 7035 Fax: 21 417 3184 • Russia & other C.I.S. & N.I.S Tel: +7 (095) 232 0250, 956 1137 Fax: +7 (095) 2306377 • South East Asia Tel: 60 3 8024 2080 Fax: 60 3 8024 2090 • Spain Tel: 93 594 49 50 Fax: 93 594 49 55 • Sweden Tel: 018 612 1900 Fax: 018 612 1910 • Switzerland Tel: 0848 8028 12 Fax: 0848 8028 13 • UK Tel: 0800 616928 Fax: 0800 616927• USA Tel: 800 526 3593 Fax: 877 295 8102

GE imagination at work

11-0027-81 AB

ЗАО ДжиИ Хэлскеа117198 Москва, Ленинский просп., 113/1тел. (495) 956-51-77 факс (495) 956-51-76E-mail: [email protected]

Documents

˚G8AB:015;:>2promix.ru/manuf/ge/chrom/sorbent.pdf · 2-ab0489=0o >g8ab:0 2ka>:>;5:c;o@=>3> 15;:0, 3> 38ab848=>< 8a. 1a: ˜5@20o ab048o