Genexpressions- und Metabolismusuntersuchungen der ... · Nasenvorhöfe, Vestibula nasi: Die unmittelbar an die Nasenlöcher,Nares, angrenzenden Teile der Nasenhöhle stellen die

Aus dem Zentrum für Allgemeine Molekularbiologie und Proteindesign der

Tierärztlichen Hochschule Hannover

und dem Zentrum für Pharmaforschung und medizinische Biotechnologie des

Fraunhofer Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin

Genexpressions- und Metabolismusuntersuchungen der menschlichen

respiratorischen Nasenschleimhaut

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

( Dr. med. vet. )

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Daniela Rahmel

aus Berlin

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Bernd Otto

Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Borlak

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Borlak

Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Bernd Otto

2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. Heiner Niemann

Tag der mündlichen Prüfung: 03. Juni 2004

Abkürzungsverzeichnis I

Abkürzungsverzeichnis

Acetyl-CoA Acetyl-CoenzymA

AFB1 Aflatoxin B1

AhR Aryl hydrocarbon-Rezeptor

AK Antikörper

AnH Anilin-Hydroxylase

APD Aminopyrin-N-Demethylase

AR Allergische Rhinitis

BeD Benzaldehyd-Dehydrogenase

bp Basenpaare

BROD Benzyloxyresorufin-O-Deethylase

BSA Bovines Serum Albumin

BzD Benzphetamin-N-Demethylase

bzw. beziehungsweise

CAR Constitutive Androstane Rezeptor

cDNA copy-DNA

CMT Cyclopentadienylmangantricarbonyl

CO Kohlenstoffmonoxid

CPM Counts per Minute

CYP Cytochrom P450-abhängige Monooxygenasen

DCBN 2,6-Dichlorobenzonitril

DCPIP Dichlorophenolindophenol

DEN Diethylnitrosamin

DENd Diethylnitrosamin-N-Deethylase

Abkürzungsverzeichnis II

DEPEC Diethylpyrocarbonat

DMNd Dimethylnitrosamin-N-Demethylase

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleosidtriphosphat

DPM Desintegrations per Minute

ECOD Ethoxycoumarin-O-Deethylase

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EH Epoxid-Hydrolase

ELISA Enzyme-linked immunosorbant assay

EmD Ethylmorphin-N-Demethylase

ErD Erythromycin-N-Demethylase

EROD Ethoxyresorufin-O-Deethylase

FMO Flavinhaltige Monooxygenasen

FS Friederiken-Stift

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

GST Glutathion-S-Transferase

h Stunde

HMPA Hexamethylphosphoramid

HMPAd Hexamethylphosphoramid-N-Demethylase

HNEC human nasal epithelial cells

HPLC High Performance Liquid Chromatography

i.d.R. in der Regel

IgA ImmunglobulinA

IL Interleukin

Abkürzungsverzeichnis III

IR Immunoreaktivität

LE Loteprednol-Etabonat

LK Leberkontrolle

LXR Liver X Rezeptor

M Metabolit

MFO Mischfunktionelle Oxygenase

MHH Medizinische Hochschule Hannover

min Minuten

mRNA Messenger-Ribonukleinsäure

MROD Methoxyresorufin-O-Demethylase

MTBE Methyltertbutylether

NADH Nicotinamidadenindinucletid

NADPH Nicotinamidadenindinucleotidphosphat

NDEA N-Nitrosodiethylamin

NM nasal mucosa

NNK 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon

NO Stickstoffmonoxid

NOS NO-Synthase

OM olfactory mucosa

OMP Odorant marker protein

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PAHs polyzyklische aromatische Hydrocarbone

p. appl. post applicationem

PAS periodic acid Schiff

PCR Polymerase-Kettenreaktion

Abkürzungsverzeichnis IV

pNPH p-Nitrophenol-Hydroxylase

PPAR Peroxisome proliferative activated Rezeptor

PrD Propionaldehyd-Dehydrogenase

PROD Pentoxyresorufin-O-Dealkylase

PVDF Polyvinylidendifluorid

PXR Pregnenolone X Rezeptor

RMDD retrometabolic drug design

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

RT Reverse Transkriptase

s Sekunden

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

sog. Sogenannt

SOP Standard Operating Procedure

SPE solid phase extraction

TAE Tris-Essigsäure-EDTA

TBS Tris buffered saline

TCDD 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-Dioxin

TEMED N,N,N`,N`-Tetramethylendiamin

tgl. täglich

TNF α Tumor-Nekrose-Faktor α

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

u.a. unter anderem

Abkürzungsverzeichnis V

UDP Uridindiphosphat

UDP-GT Uridindiphosphat-Glucuronyl-Transferase

UGT Uridindiphosphat-Glucuronyl-Transferase

Upm Umdrehungen pro Minute

usw. und so weiter

UV Ultraviolett

z.B. zum Beispiel

Zig. Zigaretten

Inhaltsverzeichnis VI

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ................................................................................................ 1 1.1 Anatomie der oberen Atemwege und der Nasenmuschel.............................................2 1.2 Zellulärer Aufbau der Nasenschleimhaut ......................................................................7 1.3 Physiologie und Funktionen der oberen Atemwege....................................................11 1.4 Funktion der Nasenschleimhaut in der Biotransformation.........................................13 1.5 Nasale Applikation von Arzneimitteln - Glucocorticoide – Soft Steroide..................18 1.6 Ziel der Arbeit.............................................................................................................. 21

2. Material und Methoden........................................................................ 22

2.1 Material ........................................................................................................................22 2.1.1 Probenmaterial .........................................................................................................22 2.1.2 Chemiaklien..............................................................................................................22 2.1.3 Geräte und Verbrauchsmaterialien.............................................................................27

2.2 Methoden......................................................................................................................31 2.2.1 Gewinnung und Transport des Probenmaterials..........................................................31 2.2.2 Genexpressionsuntersuchungen.................................................................................31 2.2.3 Proteinexpressionsuntersuchungen.............................................................................35 2.2.4 Metabolismusuntersuchungen....................................................................................40

3. Ergebnisse............................................................................................. 45

3.1 Genexpression..............................................................................................................45 3.1.1 Qualität und Quantität der isolierten RNA..................................................................45 3.1.2 RT-PCR ..................................................................................................................47

3.2 Proteinexpression.........................................................................................................56 3.2.1 Poolgewichte und Bestimmung des mikrosomalen Proteingehaltes..............................56 3.2.2 Western blot.............................................................................................................56

3.3 Metabolismusuntersuchungen.....................................................................................58 3.3.1 Metabolismus von Loteprednol-Etabonat (LE)..........................................................58 3.3.2 Testosteron-Metabolismus........................................................................................69 3.3.3 EROD-Aktivitäten....................................................................................................72

4. Diskussion............................................................................................. 74

4.1 Untersuchtes Gewebe ...................................................................................................74 4.2 Exprimierte Gene .........................................................................................................75 4.3 Nachweisbares Protein.................................................................................................84 4.4 Metabolische Aktivität.................................................................................................86 4.5 Schlussfolgerungen...................................................................................................... 89

5. Zusammenfassung ................................................................................90 6. Summary...............................................................................................92

Inhaltsverzeichnis VII

7. Danksagung ..........................................................................................93 8. Literaturverzeichnis ..............................................................................94 9. Anhang .....................................................................................................I

9.1 Daten der Patienten für die Genexpression.................................................................. I 9.2 Daten der Patienten für die mikrosomalen Pools ........................................................II 9.3 Liste der verwendeten Primer....................................................................................VII 9.4 Liste der verwendeten Primär- und Sekundärantikörper.......................................... IX 9.5 Agarosegele und graphische Darstellung der Genexpression....................................X 9.6 Darstellung der Western blots ..............................................................................XLVII 9.7 HPLC-Chromatogramme von Loteprednol-Etabonat (LE) und seinen Metaboliten nach Inkubation menschlicher Nasenmuschelmikrosomen.........................................L

9.7.1 1. Versuchsabschnitt (Inkubation bei verschiedenen Inkubationszeiten): Serie 1 ...................................................................................................................... L 9.7.2 1. Versuchsabschnitt (Inkubation bei verschiedenen Inkubationszeiten): Serie 2 ....................................................................................................................LII 9.7.3 2. Versuchsabschnitt (Inkubation mit und ohne Glucuronidase-Zusatz) ...................LVII

9.8 HPLC-Chromatogramme von Testosteron und seinen Metaboliten nach Inkubation menschlicher Nasenmuschelmikrosomen..............................................LXI 9.9 Vorkommen von Enzymen in der respiratorischen Nasenschleimhaut (NM) bei verschiedenen Spezies......................................................................................LXIV

1. Einleitung 1

1. Einleitung

Die nasale Arzneistoffapplikation ist aufgrund der leichten Zugänglichkeit und der guten

Durchblutung der Nasenschleimhaut nicht nur für lokal wirksame, sondern auch für

systemisch wirksame Arzneimittel attraktiv. Trotz des wachsenden Interesses der

pharmazeutischen Industrie an der nasalen Applikationsform ist die menschliche

Nasenschleimhaut bislang kaum hinsichtlich ihrer Ausstattung an Arzneistoff-

metabolisierenden Enzymen untersucht worden, was u.a. in der schwierigen Verfügbarkeit

menschlichen Nasenschleimhautgewebes für wissenschaftliche Untersuchungen begründet

sein dürfte. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die menschliche respiratorische

Nasenschleimhaut bezüglich vorhandener Enzymsysteme sowie deren metabolischen

Kompetenz näher zu charakterisieren. Im Fokus stand dabei der Nachweis der verschiedenen

Isoformen des Cytochrom P450 Monooxygenasesystemes (CYPs), der wichtigsten

Arzneistoff-metabolisierenden Enzymfamilie. Da das Cytochrom P450-System durch

epigenetische Faktoren beeinflusst wird, wurde zusätzlich der Einfluss von Geschlecht und

Raucher-Status auf das Genexpressionsmuster mitberücksichtigt. Darüber hinaus wurde die

Verstoffwechselung des Glucocorticoids Loteprednol-Etabonat (LE) untersucht, welches sich

derzeit in der klinischen Phase der Zulassung für die Behandlung allergischer

Atemwegserkrankungen befindet (Szelenyi and Pahl, 2002). Damit sollte geprüft werden, ob

und in welchem Ausmaß eine metabolische Inaktivierung durch die in der menschlichen

Nasenschleimhaut vorhandenen Enzymsysteme erfolgt und ob dieser Arzneistoff somit

potentiell für die nasale Applikation zur lokalen Behandlung in Frage käme.

Im Folgenden werden zunächst die anatomischen Grundlagen der oberen Atemwege und der

Nasenmuscheln, von denen die untersuchte Nasenschleimhaut stammt, beschrieben.

Anschließend wird der zelluläre Aufbau der respiratorischen Nasenschleimhaut dargestellt. Es

folgen Physiologie und Funktionen der oberen Atemwege sowie die Funktion der

Nasenschleimhaut in der Biotransformation. Schließlich wird die nasale Applikation von

Arzneimitteln erläutert, so dass über die medikamentöse Therapie allergischer

Atemwegserkrankungen der Bogen zu den Glucocorticoiden und dem Arzneistoff

Loteprednol-Etabonat geschlossen wird.

1. Einleitung 2

1.1 Anatomie der oberen Atemwege und der Nasenmuschel

Die Nasenschleimhaut ist Teil des Respirationsapparates, der sich in die folgenden drei

funktionalen Abschnitte gliedert (Blue Histology, 2002; Kristic, 1991):

1. luftleitender Abschnitt, der die charakteristische respiratorische Schleimhaut besitzt.

Hierzu zählen die Nasenhöhle mit den Nasenmuscheln und den Nasennebenhöhlen,

Nasopharynx, Larynx, Trachea und der Bronchialbaum mit seinen Bronchi, Bronchioli

und Bronchioli terminales.

2. respiratorischer Abschnitt, der für den Gasaustausch verantwortlich ist und zu dem

die Bronchioli respiratorii und das Alveolarsystem gehören.

3. Ventilationsabschnitt: Dabei handelt es sich um jene Teile des

Muskuloskelettalapparates, welche die Atembewegungen ausführen.

Die knöcherne Grundlage für die Nasenschleimhaut liefert die Nasenhöhle (Cavum nasi oder

Cavitas nasi), die gleichzeitig den Beginn des luftleitenden Abschnitts des

Respirationsapparates darstellt. Die Nasenhöhle beginnt vorne mit den beiden Nasenlöchern,

Nares, und kommuniziert hinten durch die Choanen, Choanae, mit dem nasalen Teil des

Pharynx, der auch als Nasopharynx oder Epipharynx bezeichnet wird.

Durch die Nasenscheidewand, Septum nasi, entstehen zwei getrennte Nasenhöhlen, eine

rechte und eine linke. Bei der Nasenscheidewand handelt es sich um eine mediane

schleimhautüberzogene Trennwand, die in ihrem hinteren Teil aus Knochen, Septum nasi

osseum, und in ihrem vorderen Teil aus Knorpel, Cartilago septi nasi, besteht. Das

Nasenseptum steht meist jedoch nicht genau in der Medianen, sondern ist m.o.w. stark nach

der einen oder anderen Seite verbogen (Septumdeviation). Nach Schiebler et al. (1997) tritt

die Septumdeviation sogar bei über 70% der Menschen auf.

Die Seitenwand jeder Nasenhöhle ist medial zu drei Knochenlamellen aufgeworfen, der

unteren, mittleren und oberen Nasenmuschel (Concha nasalis inferior, media et superior),

wobei die oberen beiden Teile des Ethmoids sind, während es sich bei der unteren um einen

eigenständigen Knochen handelt. Gelegentlich ist oberhalb der Concha nasalis superior noch

eine Concha nasalis suprema ausgebildet, die ebenfalls einen Ethmoidalanteil darstellt. Durch

die drei - gelegentlich vier - Nasenmuscheln ist die laterale Nasenhöhlenwand kompliziert

gestaltet (siehe Abbildung 1). Da die Nasenmuscheln von ihren Anheftungszonen an der

1. Einleitung 3

Nasenhöhlenseitenwand nach medial und unten vorragen, entstehen zwischen den lateralen

Flächen der Nasenmuscheln und der Seitenwand drei oder - bei Vorhandensein einer Concha

nasalis suprema – vier Nasengänge: Meatus nasi inferior, medius, superior und evtl.

supremus. Der Raum oberhalb der oberen Nasenmuschel wird nicht als Nasengang

bezeichnet, da er nicht durchgängig ist, sondern nach hinten durch das Keilbein, Os

sphenoidale, verschlossen wird. Er wird aus diesem Grund als Recessus spheno-ethmoidalis

bezeichnet. Die schleimhautüberzogenen Conchen erreichen i.d.R. das Nasenseptum nicht, so

dass medial von ihnen der gemeinsame Nasengang, Meatus nasi communis, entsteht, der mit

den anderen Nasengängen in Verbindung steht. Eine genauere Beschreibung der

Nasenmuscheln selbst soll am Ende dieses Kapitels erfolgen.

Concha nasalis superior

Concha nasalis media

Concha nasalis inferior

Abbildung 1: Laterale Nasenhöhlenwand mit Concha nasalis superior, media und inferior

[aus: Netter FH, Kopf und Hals. In: Atlas der Anatomie des Menschen, 2. Auflage, Novartis AG, Basel: 38,

2000]

Der Boden der Nasenhöhle, der gleichzeitig auch das Dach der Mundhöhle bildet, wird

jeweils vorne aus dem Processus palatinus maxillae und hinten aus der Lamina horizontalis

ossis palatini gebildet.

Das Dach jeder Nasenhöhle setzt sich zusammen aus Teilen des Os ethmoidale, Os frontale,

Os nasale und Os sphenoidale.

1. Einleitung 4

Grundsätzlich wird die Nasenhöhle in 3 strukturell und funktionell unterschiedliche

Abschnitte unterteilt:

1. Nasenvorhöfe, Vestibula nasi: Die unmittelbar an die Nasenlöcher, Nares,

angrenzenden Teile der Nasenhöhle stellen die ersten Zentimeter des luftleitenden

Abschnitts des Respirationsapparates dar. Sie sind ausgekleidet mit verhorntem

mehrschichtigem Plattenepithel, welches sich von der Gesichtshaut über die

Nasenöffnung bis in die Vorhöfe fortsetzt. Dieser, auch als Regio cutanea bezeichnete

Teil der Nasenhöhle, enthält außerdem besonders dicke Haare, sog. Vibrissen

(Vibrissae), sowie apokrine Knäuelsdrüsen (Glandulae vestibulares nasi) und freie,

d.h. nicht an Haare gebundene Talgdrüsen. Die Vibrissen, die im Gegensatz zu den

Haaren der Haut keinen M. arrector besitzen, verhindern das Eindringen großer

Schutzpartikel und Insekten. Seitlich befindet sich eine Epithelleiste, Limen nasi, die

in etwa dem Übergang in die eigentliche Nasenhöhle mit ihrer Regio respiratoria und

olfactoria entspricht und deshalb auch als „inneres Nasenloch“ (Ostium internum)

bezeichnet und den Nasenlöchern als Ostium externum gegenüber gestellt wird. Im

hinteren Bereich des Vestibulums werden Haare und Drüsen spärlicher. Das Epithel

verliert seine Hornschicht und geht kontinuierlich in das respiratorische Epithel über.

2. Respiratorischer Abschnitt, Regio respiratoria: Der respiratorische Abschnitt

schließt direkt an die Vorhöfe an und macht insgesamt den größten Anteil an der

Nasenhöhle aus. Das verhornte mehrschichtige Plattenepithel der Nasenvorhöfe geht

über ein unverhorntes, zunehmend dünner werdendes Plattenepithel in das

mehrreihige Flimmerepithel der Regio respiratoria über. Dieses ist charakteristisch für

alle Anteile des luftleitenden Abschnitts des Respirationsapparates und wird deshalb

respiratorisches Epithel genannt. Der genaue histologische Aufbau wird in Kapitel

1.2.1 ausführlich erläutert.

3. Olfaktorischer Abschnitt, Regio olfactoria: Dieser Abschnitt ist gekennzeichnet

durch das olfaktorische Epithel (Riechepithel, Riechschleimhaut), welches sich am

Dach der Nasenhöhle, an der oberen Nasenmuschel und am gegenüberliegenden Teil

des Nasenseptums befindet (Boenninghaus, 1996; Kristic, 1991; Speckmann and

Wittkowski, 1998). Das olfaktorische Epithel ist mit 60 µm (Kristic, 1991; Lippert,

1996) deutlich dicker als das respiratorische Epithel und durch die Einlagerung von

Lipofuszin gelbbraun gefärbt. Die Ausdehnung der Regio olfactoria wird beim

Menschen in der Literatur relativ einheitlich mit 5 cm2 angegeben (Kristic, 1991;

1. Einleitung 5

Schiebler et al., 1997; Speckmann and Wittkowski, 1998; Weiss, 1988). Im Gegensatz

zum Mensch erstreckt sich bei den Makrosmatikern die Riechschleimhaut auf eine

wesentlich größere Oberfläche. So wird sie beispielsweise beim Hund mit ca. 100 cm2

(Benninghoff, 1994) angegeben.

Zum Schluss diese Kapitels möchte ich die Anatomie der Nasenmuscheln genauer betrachten,

da von ihnen die Nasenschleimhaut stammt, die im Rahmen meiner Dissertation untersucht

werden soll. Es handelt sich dabei um muschelartige Gebilde, die von der lateralen Wand der

Nasenhöhle in das Lumen hineinragen und auf diese Weise die zuvor beschriebenen

Nasengänge, Meatus nasi, bilden (siehe Abbildung 2). Ihre Form erhält die Nasenmuschel

durch eine Knochenlamelle, die von einer m.o.w. dicken Schleimhaut überzogen ist.

Die untere Nasenmuschel, Concha nasalis inferior, ist die größte und längste. Von Lanz and

Wachsmuth (1985) geben ihre Länge mit 35 – 58 mm, im Durchschnitt 47,7 mm, an. Sie

beginnt direkt hinter dem Vestibulum nasi und hat die Form einer nach medial konvexen,

vorne stumpfen und hinten zugeschärften Platte. Die konvexe, dem Meatus nasi communis

zugewandte Fläche ist durch Anlagerung von Gefäßen und Drüsen fein modelliert, während

die konkave Fläche glatt ist. Ihr Unterrand ist leicht nach lateral eingerollt und nimmt von

hinten nach vorne an Mächtigkeit zu, was als Verstrebung aufgefasst wird.

Concha nasalis superior

Concha nasalis media

Concha nasalis inferior

Abbildung 2: computertomographische Darstellung der Nasenhöhle mit Nasenmuscheln und

Nasenseptum

[aus: Westhofen Prof Dr M, Nase, Nasennebenhöhlen, Mittelgesicht und vordere Schädelbasis. In: Hals-Nasen-

Ohrenheilkunde systematisch, UNI-MED Verlag AG, Bremen: 192, 2001]

1. Einleitung 6

Die mittlere Nasenmuschel, Concha nasalis media, ist die zweitgrößte und beginnt etwa 1,5

cm hinter dem Vorderende der unteren Nasenmuschel. Sie ist wie die untere Muschel von

einer dicken Schleimhaut überzogen und ihre mediale konvexe und ihre konkave laterale

Fläche ähneln in ihrer Oberflächenbeschaffenheit der unteren Nasenmuschel.

Die obere Nasenmuschel, Concha nasalis superior, entspringt ca. 1,5 cm hinter dem

Vorderende der Concha nasalis media und stellt die kleinste der drei Muscheln dar. Die Form

der Flächen ist mit jener der anderen beiden Conchen vergleichbar, während ihre Oberfläche

bedingt durch die marklosen Fila olfactoria durch vertikalen Rinnen gezeichnet ist. Sie besitzt

nur eine vergleichsweise dünne Schleimhaut und weist – im Gegensatz zu den unteren

Nasenmuscheln – olfaktorisches Epithel auf.

Bisweilen existiert oberhalb der Concha nasalis superior noch eine Concha nasalis suprema,

die ebenfalls vom Ethmoid gebildet wird. Von Lanz and Wachsmuth (1985) geben die

Häufigkeit dieser Nebenmuschel mit 17,7% an. In solchen Fällen entsteht noch ein weiterer

Nasengang, der Meatus nasi supremus, der – wie die anderen auch – mit dem Meatus nasi

communis und dem Meatus nasopharyngeus in Verbindung steht.

1. Einleitung 7

1.2 Zellulärer Aufbau der Nasenschleimhaut

Im Anschluss an die makroskopische Betrachtung der Nasenhöhle soll nun der

mikroskopische Aufbau der Nasenschleimhaut dargestellt werden. Die Schleimhaut, Mucosa,

des Respirationstrakts wird - wie in anderen Geweben auch - in die Lamina epithelialis

mucosae und die Lamina propria mucosae unterteilt, die durch eine Basalmembran

voneinander getrennt werden. Bei der Lamina propria mucosae, die der Einfachheit halber oft

als Propria bezeichnet wird, handelt es sich um Bindegewebe, welches als

Verbindungsgewebe zu dem darunter befindlichen Stützgewebe, Knochen bzw. Knorpel,

dient. Die Lamina epithelialis mucosae, auch Epithel genannt, vertritt die oberflächliche

Schicht der Schleimhaut und ist von einem dünnen sero-mucösen Film überzogen. Je nach

den am Aufbau des Epithels beteiligten Zellen unterscheidet man ein respiratorisches und ein

olfaktorisches Epithel und damit eine Regio respiratoria und eine Regio olfactoria, wobei

auch die Propria in beiden Regionen differiert.

Die respiratorische Schleimhaut hat ihren Namen aufgrund der Tatsache, dass sie im

gesamten Bereich des luftleitenden Abschnitts des Respirationsapparates vorkommt.

Innerhalb der Nasenhöhle befindet sie sich am Nasenhöhlenboden, an der Seitenwand im

Gebiet der unteren beiden Nasenmuscheln sowie am gegenüberliegenden Teil des

Nasenseptums. Sie kleidet außerdem die Nasennebenhöhlen aus, ist dort aber nur

vergleichsweise dünn. Am dicksten ist sie über den Conchen.

Es handelt sich hierbei um ein mehrreihiges Flimmerepithel, in dem zahlreich Becherzellen

eingelagert sind. Es werden dabei folgende Zellarten unterschieden: Flimmerepithelzellen,

Becherzellen sowie Intermediär- und Basalzellen (siehe Abbildung 3 und 4). An mechanisch

stärker beanspruchten Stellen jedoch können Inseln von Plattenepithel vorkommen (Weiss,

1988). Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass auch die Vitamin A-Versorgung einen

Einfluss auf Vorkommen und Ausdehnung des Plattenepithels hat (Million et al., 2001).

1. Einleitung 8

Abbildung 3: Schematische Darstellung des respiratorischen Epithels und der Kinozilien

[aus: Rohen JW and Lütjen-Drecoll E, Epithelgewebe. In: Funktionelle Histologie, 4. Auflage, Schattauer

Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart: 72, 1999]

Die hochprismatischen Flimmerepithelzellen besitzen apikal feine, 5 – 10 µm lange (Linß and

Halbhuber, 1991; Rohen and Lütjen-Drecoll, 1995) und 0,2 µm dicke (Linß and Halbhuber,

1991), bewegliche Zilien (Kinozilien, siehe Abbildung 3). Die Kinozilien gehen aus den

Kinetosomen (Basalknötchen) hervor, die sich lichtmikroskopisch als feine, dunkle Linie,

sog. Basalknötchenlinie, darstellen. Diese dient als wichtiges Unterscheidungsmerkmal für

andere epitheliale Oberflächenstrukturen (z.B. Bürstensaum).

Die Kinozilienbewegung setzt sich zusammen aus einem raschen Schlag und einer langsamen

Rückschwingphase. Dabei kann eine Frequenz von bis zu 30 Hz und eine Geschwindigkeit an

der Zilienspitze von bis zu 2,5 m/s erreicht werden (Linß and Halbhuber, 1991). Beim

Vorwärtsschlag ist die Zilie aufgerichtet und schlägt mit ganzer Kraft, während sie bei der

Rückschwingphase stark gekrümmt ist, so dass sie sich praktisch unter dem Sekretfilm

hindurchzieht. Auf diese Weise entsteht ein Flüssigkeitsstrom in Schlagrichtung, wobei die

Kinozilien stets in Richtung Pharynx schlagen. Die peitschenartigen Zilienbewegungen

kommen durch ein Vorbeigleiten der Mikrotubuli innerhalb des Kinoziliums zustande. Für

den Energienachschub sorgen dabei Mitochondrien, die im apikalen Drittel der

Flimmerepithelzellen zu finden sind. Durch inter- und intrazelluläre Koordination erfolgt eine

Vereinheitlichung von Schlagrichtung und –frequenz, so dass ein wellenartiger

Bewegungsablauf (Metachronie) entsteht, der dem Transport von Flüssigkeit, Schleim, Zellen

und Fremdkörpern auf der Epitheloberfläche dient.

Flimmerepithelzelle Becherzelle Basalzelle Basalmembran seromucöse Drüsen

1. Einleitung 9

Die Becherzellen sind vor allem im hinteren Bereich der Nasenhöhle lokalisiert. Es handelt

sich dabei um hochprismatischen Zellen, die stark mit PAS-positiven Schleimgranula gefüllt

sind, so dass ihr abgeplatteter Kern und das Ergastoplasma an der Zellbasis

zusammengedrängt werden. Becherzellen können auch als endoepitheliale mucöse Drüsen

betrachtet werden, die zusammen mit den sero-mucösen Drüsen der Propria für den

Schleimfilm auf der Epitheloberfläche verantwortlich sind. Dieser Schleimfilm ist insgesamt

etwa 5 µm dick (Rohen and Lütjen-Drecoll, 1995) und setzt sich aus einer oberflächlichen

Gel-Phase und einer tieferen Sol-Phase zusammen. Die Gel-Phase ist reich an

Makromolekülen und bildet eine viskoelastische Barriere, welche einen Widerstand für den

aktiven, schnellen Schlag der Zilien gibt, die den Film dadurch verschieben können. Die Sol-

Phase, auch Hypophase genannt, ist für die Zilienbewegung wichtig. In dieser Phase ziehen

die erschlafften Zilien wieder zurück. Der Schleimfilm enthält neben wasserbindenden

Glykoproteinen noch antibakterielle Proteine (Lysozyme, Laktoferrin), Immunglobuline (vor

allem IgA) und Proteinaseinhibitoren, die für die lokale Infektionsabwehr von Bedeutung

sind.

Die undifferenzierten Basalzellen reichen nicht bis zur Epitheloberfläche und haben keine

Zilien. Wegen ihrer Teilungsfähigkeit sind sie als Stratum germinativum zu betrachten. Sie

liefern die Intermediärzellen, die sich dann entweder zu Flimmerepithelzellen oder zu

Becherzellen differenzieren.

Lamina epithelialis mucosae und Lamina propria mucosae werden durch eine auffallend

dicke und glatte Basalmembran getrennt. So können sich die Epithelzellen bei den

regenerativen Zellverschiebungen auf der Membran leicht verschieben (Rohen and Lütjen-

Drecoll, 1995).

Die Lamina propria mucosae besteht aus lockerem Bindegewebe, das mit dem Periost der

knöchernen Nasenwand bzw. dem Perichondrium der knorperligen Wandanteile fest

verbunden ist. Subepithelial befinden sich Lymphozyten und Plasmazellen, einzeln und in

Gruppen, und bilden so die lymphoide Zone. Teilweise sind diese Zellen auch intraepithelial

zu finden. Unterhalb dieser Zone ist die Drüsenzone gelegen, in der zahlreich verzweigte,

tubulo-alveoläre, sero-mucöse Drüsen, die Glandulae nasales, lokalisiert sind. Sie haben

kurze Ausführungsgänge, die auf der Epitheloberfläche münden, sowie mucöse und seröse

Drüsenanteile. In den mittleren und tieferen Schichten der Propria sind ausgedehnte venöse

Schwellkörper gelegen, die besonders an der unteren und mittleren Nasenmuschel ausgeprägt

1. Einleitung 10

sind (Plexus cavernosi concharum). Die Füllung dieser Schwellkörper hat eine erhöhte

Wärmeabstrahlung zur Folge und wird durch Dilatation der zuführenden Arteriolen sowie

durch Konstriktion der abführenden tieferen Venen, die somit als Drosselvenen oder

Sperrvenen dienen, hervorgerufen. Die Regulation erfolgt dabei autonom.

Insgesamt ist die Nasenschleimhaut gut mit Blutgefäßen versorgt. Die dickwandigen Arterien

liegen nahe am Periost in Gestalt eines Gitterwerkes, von dem arkadenartige Gefäße

abzweigen, die auf diese Weise die gesamte Propria senkrecht durchziehen. Kurz vor der

Epitheloberfläche teilen sie sich in Arteriolen, aus denen ein dichtes Netzwerk fenestrierter

Kapillaren entspringt, die teilweise die Oberfläche und teilweise die Drüsen versorgen.

Zwischen den Arterien und Venen befinden sich außerdem zahlreiche gewundene

arteriovenöse Anastomosen.

Abbildung 4: Histologischer Schnitt durch die Schleimhaut der Nase im Bereich der Regio respiratoria

(396x). Man beachte den deutlichen Flimmerbesatz (Kinozilien), die relative dicke, gerade verlaufende

Basalmembran und das lockermaschige, gefäßreiche, subepitheliale Bindegewebe, in dem sich zahlreiche

Lymphozyten und Plasmazellen befinden.

[aus: Rohen JW and Lütjen-Drecoll E, Respirationssystem. In: Funktionelle Histologie, 4. Auflage, Schattauer

Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart: 217, 1999]

Die Nasennebenhöhlen werden ebenfalls von Flimmerepithel ausgekleidet, wobei die

Kinozilien hier in Richtung der Ostien schlagen. Im Gegensatz zur Nasenhaupthöhle sind in

den Nebenhöhlen nur wenige Becherzellen vorhanden. Die Lamina propria mucosae ist zu

einem dünnen Bindegewebsblatt umgebildet und auffallend gefäßarm. Sero-mucösen Drüsen

sind nur vereinzelt vorhanden, venöse Schwellkörper fehlen hier vollkommen.

1. Einleitung 11

1.3 Physiologie und Funktionen der oberen Atemwege

Die Nasenhöhlen repräsentieren den ersten Teil des luftleitenden Abschnitts des

Respirationsapparates und dienen somit in erster Linie der Luftleitung. Dabei gelangt der

Hauptluftstrom von den Nasenlöchern über die Nasengänge zu den Choanen. Nur 5 – 10 %

des Inspirationsvolumens erreichen das Riechepithel, die Nasennebenhöhlen sogar nur 1 %

(Westhofen, 2001).

Neben der Luftleitung kommt den Nasenhöhlen noch eine weitere Aufgabe zu, die

Vorbehandlung der Atemluft. Durch die Nasenmuscheln ist die Oberfläche der lateralen

Nasenhöhlenwand in Falten gelegt. Die daraus resultierende Oberflächenvergrößerung

erleichtert – zusammen mit der erzeugten turbulenten Strömung – die Konditionierung der

Atemluft in Form von Erwärmung bzw. Abkühlung, Filterung bzw. Reinigung sowie in Form

des Anfeuchtens der eingeatmeten Luft. Alles zusammen dient dem Schutz der tiefen

Atemwege.

Durch unterschiedliche Blutfüllung der Schleimhaut bzw. der venösen Schwellkörper der

unteren beiden Nasenmuscheln wird die inspirierte Luft auf eine Temperatur von etwa 36°C

gebracht. Um einen effektiveren Wärmeaustausch zu erzielen, strömen Blut und Atemluft

nach dem Gegenstromprinzip.

Eine erste Filterung der eingeatmeten Luft erfolgt durch die Vibrissen der Nasenvorhöfe. Sie

fungieren als Art Reuse, die das Eindringen grober Partikel und Insekten in den

Respirationstrakt verhindert. Kleinere Partikel werden dagegen durch die mucociliäre

Clearance beseitigt. Hierbei transportieren die pharynxwärts schlagenden Kinozilien des

Flimmerepithels den oberflächlichen Schleimfilm mit den darin gelösten Fremdstoffen zum

Pharynx. Der Rachen wiederum ist reich an lymphatischen Einrichtungen, welche der Abwehr

eingedrungener Mikroorganismen dienen. Zusätzlich enthält die oberflächliche, visköse Phase

des Schleimfilmes antibakterielle Proteine, Immunglobuline sowie Proteinaseinhibitoren, die

zusammen mit den Leukozyten des Epithels und der subepithelialen Gewebeschichten für die

lokale Infektionsabwehr verantwortlich sind.

Schließlich erfolgt in den oberen Atemwegen noch das Anfeuchten der Atemluft auf 70 – 80

%. Erzielt wird dies durch Wasserverdunstung und durch Abgabe von Nasensekret, das

gleichzeitig auch die Nasenschleimhaut vor dem Austrocknen schützt.

1. Einleitung 12

Anschwellen und vermehrte Sekretion der Nasenschleimhaut können verschiedene Ursachen

haben. So kann dies reflektorisch über das vegetative Nervensystem, hormonell, durch

Entzündungen, Allergien, Arzneimittel oder aber durch mechanische, thermische oder

chemische Reize ausgelöst werden.

Im oberen hinteren Bereich der Nasenhöhle sind außerdem die Rezeptoren des

Geruchssinnes lokalisiert. Wie bereits erwähnt, erreicht normalerweise nur ein kleiner Teil

der eingeatmeten Luft die Regio olfactoria. Bei bewusster, tiefer Inspiration jedoch erhöht

sich die Geschwindigkeit des eingeatmeten Luftstromes, die turbulente Strömung verwandelt

sich in eine zunehmend laminare Strömung, und ein größerer Teil der Atemluft gelangt bis

zum Riechepithel. Durch die geruchliche Prüfung der Inspirationsluft kommt dem

olfaktorischen System somit auch noch eine Schutzfunktion zu, da viele schädliche Gase als

übelriechend empfunden werden und ihre Einatmung deswegen vermieden wird.

Interessanterweise beruht die vorübergehende Minderung des Riechvermögens (Hyposmie)

bei Schnupfen nicht auf einer Schädigung des olfaktorischen Systems, sondern auf der

Tatsache, dass die Geruchsstoffe infolge der Schleimhautschwellung nicht mehr bis zur

Riechschleimhaut gelangen.

Schließlich dient die Nasenhöhle mit ihren Nebenhöhlen beim Sprechen als Resonanzraum.

Die Konsonanten m, n und ng werden gesprochen, ohne dass der Nasenrachenraum durch das

Gaumensegel abgeschlossen ist. Somit strömt die Luft via Nasenhöhle durch die Nase aus,

weshalb genannte Konsonaten auch als Rhinophone bezeichnet werden.

1. Einleitung 13

1.4 Funktion der Nasenschleimhaut in der Biotransformation

Zusätzlich zu den in Kapitel 1.3 genannten Funktionen nimmt die Schleimhaut der oberen

Atemwege auch in Bezug auf die Xenobiotransformation eine wichtige Rolle ein. Der

Metabolismus von Xenobiotika wird in der Regel in zwei Phasen unterteilt. Die Phase I-

Reaktion, auch Funktionalisierungsreaktion genannt, beinhaltet die Einführung oder

Freisetzung funktioneller Gruppen, wie Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppen.

Die Endprodukte der Phase I-Reaktion enthalten somit chemisch reaktive funktionelle

Gruppen, die von den Phase II-Enzymen benötigt werden.

Während der Phase II-Reaktion erfolgt die Konjugation der Phase I-Metaboliten an

körpereigene Stoffe, weshalb dieser Vorgang auch als Konjugationsreaktion bezeichnet wird.

Hierzu zählen Glucuronidierung, Glycosidierung, Glutathion-Konjugation, Sulfatierung,

Methylierung, Acetylierung, Aminosäuren-Konjugation sowie die Fettsäuren-Konjugation,

deren einzige gemeinsame Eigenschaft ein energiereicher oder aktivierter Zwischenmetabolit

darstellt, sei es ein aktivierter Cofaktor, wie beispielsweise UDP-Glucuronsäure bei der

Glucuronidierung oder Acetyl-CoA bei der Acetylierung, oder sei es ein aktiviertes oder

reaktives Xenobiotikum. Am Ende entstehen generell wasserlösliche und somit leicht

eleminierbare Produkte.

Die Funktionalisierung der Verbindungen im Rahmen des Phase I-Metabolismus kann durch

Oxidation, Reduktion (z.B. Reduktion von Nitrogruppen zu Aminogruppen) oder Hydrolyse

(z.B. Hydrolyse von Estern durch Esterasen) erzielt werden. Phase I-Reaktionen werden von

Monooxygenasen und anderen Oxidasen, Alkoho l- und Aldehyddehydrogenasen sowie

Esterasen und Amidasen vermittelt. Die wichtigste Komponente des oxidativen Phase-I-

Biotransformationssystems besteht aus einer Gruppe von Hämoproteinenzymen, welche

kollektiv als Cytochrom P450-abhängige Monooxygenasen (CYPs) bezeichnet werden.

Bei dem Cytochrom P450-System handelt es sich um eine Enzymsuperfamilie, die sich in

diverse Familien und Subfamilien gliedert. Derzeit sind 18 Familien der humanen Cytochrom

P450-Enzyme bekannt (Chen et al, 2002; Nelson, 2003), wobei die Anzahl sequenzierter

Gene und Pseudogene ständig weiter ansteigt.

1. Einleitung 14

Als Hämoprotein besitzt das Cytochrom P450 ein Häm in Form eines Fe-Protoporphyrins,

welches nicht-kovalent an das Apoprotein gebunden ist. Die Bezeichnung P450 stammt dabei

von der Tatsache, dass das Cytochrom (Cytochrom = Pigment = P) in reduzierter Form in

Anwesenheit von CO ein mit 450 nm spezifisches Absorptionsmaximum aufweist. Im

Gegensatz zu den Bakterien sind genannte Cytochrome bei den Säugetieren stets

membrangebunden und entweder in der inneren Membran der Mitochondrien oder aber – die

Mehrheit der Cytochrome - in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert.

Das Cytochrom P450-System benötigt zusätzlich reduzierende Äquivalente, die vom NADPH

oder manchmal auch vom NADH stammen und via eines zweiten Enzyms auf das Cytochrom

übertragen werden, sowie ein Atom Sauerstoff, welches von molekularem Sauerstoff oder von

oxygenierten Substraten stammt. Da nur eines der beiden Sauerstoffatome von molekularem

Sauerstoff in das Substrat inkorporiert wird, während das andere zu Wasser reduziert wird,

werden diese Enzyme auch als Monooxygenasen bezeichnet und den Dioxygenasen, welche

beide Atome einfügen, gegenüber gestellt. Aufgrund der beschriebenen doppelten Funktion –

Oxidation des Substrates einerseits und Reduktion des Wassers andererseits – werden sie auch

als Mischfunktionelle Oxygenasen (MFO) bezeichnet.

Um die metabolische Aktivität dieser Enzymsuperfamilie untersuchen zu können, bedient

man sich bestimmter Markersubstrate, die entweder nur von einer einzelnen CYP-Isoform

bzw. von einer Subfamilie oder aber von verschiedenen CYPs umgesetzt werden. Eine sehr

häufig verwendete Gruppe sind dabei die 7-Alkoxyresorufine, zu denen 7-Ethoxyresorufin, 7-

Methoxyresorufin, 7-Benzyloxyresorufin und 7-Pentoxyresorufin gehören. Die O-

Dealkylierung des Ethoxyresorufins (EROD) ist mit den Cytochromen P450 1A1 (CYP 1A1)

und 1A2 (CYP 1A2) assoziiert, von denen CYP 1A1 das Ethoxyresorufin in einem bedeutend

größeren Ausmaß umsetzt, wenn beide Cytochrome vorhanden sind (Wardlaw et al., 1998).

Die Verstoffwechselung des Methoxyresorufins (MROD) wird dagegen einzig von CYP 1A2

ausgeführt (Wardlaw et al., 1998), während die O-Dealkylierung des Pentoxyresorufins

(PROD) wiederum den Mitgliedern der CYP 2B-Subfamilie zugeschrieben wird (Gelardi et

al., 2001; Hukkanen, 2000; Seubert et al., 2002; Wardlaw et al., 1998).

Ein weiteres Markersubstrat ist Testosteron, welches stereo- und regioselektiv von

unterschiedlichen CYP-Isoformen hydroxyliert wird und somit die funktionelle Basis für das

gleichzeitige Studium verschiedener Isozyme liefert.

1. Einleitung 15

Das wohl wichtigste Enzym innerhalb des Phase II-Metabolismus ist die UDP-Glucuronyl-

Transferase (UDP-GT oder UGT), was mit der leichten Verfügbarkeit des benötigten Co-

Faktors, der UDP-Glucuronsäure, erklärbar sein dürfte, da die UDP-Glucuronsäure Teil des

intermediären Stoffwechsels ist und eng mit der Glycogensynthese verbunden ist. Auch hier

handelt es sich um eine Enzymsuperfamilie, deren Mitglieder in zwei distinkte Familien

unterteilt werden, UGT 1 und UGT 2 (King et al., 2000, Mackenzie et al., 1997).

Interessanterweise sind diese Enzyme ebenfalls in der Membran des Endoplasmatischen

Retikulums lokalisiert – was eine Ausnahme unter den Phase II-Enzymen darstellt – und

damit in enger Nachbarschaft zum Cytochrom P450-System gelegen, so dass die entstehenden

Phase I-Metaboliten direkt glucuronidiert werden können.

Ein weiteres Phase II-Enzym stellt die zytosolische Glutathion-S-Transferase (GST) dar,

welche die Konjugation mit dem endogenen Tripeptid Glutathion katalysiert und aus zwei

ähnlichen, aber nicht identischen Subunits zusammengesetzt ist. Die Glutathion-Konjugation

unterscheidet sich signifikant von der Gluconat- und der Sulfat-Konjugation, da bei

letztgenannten eine vorherige Aktivierung der Gluconat- bzw. Sulfat-Anteile notwendig ist. In

diesem Fall aber ist die einzige chemische Voraussetzung ein elektrophiles Zentrum innerhalb

des Substrates, das die Reaktion mit dem nukleophilen Glutathion ermöglicht. Somit kann die

Glutathion-Konjugation als Schutzmechanismus aufgefasst werden, bei dem potentiell

toxische, nukleophile Metaboliten einfach „aufgewischt“ werden (Gibson and Skett, 1986).

Die menschliche Nasenschleimhaut enthält alle Komponenten des Cytochrom P450-Systemes

(Gervasi et al, 1991). Der Cytochrom P450-Gehalt der respiratorischen Schleimhaut des

Menschen beträgt 25 pmol/mg Protein (Gervasi et al., 1991; Longo et al., 1989) und ist somit

vergleichbar mit jenem von Hund und Ratte, jedoch geringer als jener beim Kaninchen

(Gervasi et al., 1991). Verglichen mit anderen menschlichen Geweben entspricht diese CYP-

Menge nur etwa 5% des Cytochromgehaltes der Leber, ist dagegen aber etwa doppelt so hoch

wie in der Lunge (Gervasi et al., 1991).

Obwohl im Vergleich zur Leber die Nasenschleimhaut bezüglich ihrer Stoffwechselkapazität

ein relativ unerforschtes Gebiet ist, sind trotzdem eine Anzahl konstitutiv exprimierter CYP-

Isoformen in nasalen Geweben verschiedener Spezies gefunden worden, darunter Mitglieder

der 1A-, 2A-, 2B-, 2C-, 2E-, 3A- und 4B-Subfamilie (Longo et al., 2000; Thornton-Manning

et al., 1997). Das für die Regio olfactoria spezifische CYP 2G1 konnte bei Rind (Longo et al.,

1. Einleitung 16

1997), Schwein (Martini et al., 1998), Kaninchen (Ding and Coon, 1994) sowie bei Ratte und

Maus (Gu et al., 1997; Gu et al., 1998) nachgewiesen werden.

Besonders gut untersucht ist die CYP 2A-Subfamilie, die beim Menschen drei Mitglieder

aufweist: CYP 2A6, CYP 2A7 und CYP 2A13. CYP 2A6 und 2A7 sind reichlich in der Leber

vorhanden in einem Verhältnis von etwa 1:1 (Koskela et al., 1999), während CYP 2A13 am

höchsten in der Nasenschleimhaut exprimiert ist, gefolgt von Lunge und Trachea. Der CYP

2A13-Gehalt der Nasenschleimhaut ist etwa fünf mal höher als der CYP 2A6-Gehalt (Kosekla

et al., 1999). Auch bei anderen Spezies sind in der Nasenschleimhaut CYP 2A-Isoformen

vorhanden, beispielsweise CYP 2A10/11 beim Kaninchen, CYP 2A3 bei der Ratte und CYP

2A4/5 bei der Maus (Ding et al., 1994; Peng et al., 1993).

In der menschlichen Nasenschleimhaut ist aber nicht nur das Monooxygenase-System

vertreten, sondern auch zahlreiche nicht-oxidative Enzyme, darunter die DT-Diaphorase

(Gervasi et al., 1991), die Epoxid-Hydrolase (Gervasi et al., 1991; Green et al., 2001), die

Glutathion-S-Transferase (Aceto et al., 1989; Gervasi et al., 1991; Green et al., 2001; Krishna

et al., 1995) und das Cyanid-metabolisierende Enzyme Rhodanese (Lewis et al., 1991). Eine

Übersicht über die von Gervasi et al. (1991) untersuchten Enzymaktivitäten ve rschiedener

Phase I- und Phase II-Enzyme beim Menschen zeigen die Abbildungen 5 und 6.

Interessanterweise sind die Phase II-Enzyme zwei bis drei mal stoffwechselaktiver als das

Cytochrom P450-System, so dass reaktive Phase I-Metaboliten gar nicht erst akkumulieren

können (Gervasi et al., 1991) – eine Beobachtung, die auch Longo et al. (1991) beim Rind

gemacht haben.

1. Einleitung 17

untersuchte Parameter nasale gepoolte Mikrosomen hepatische Mikrosomen

Protein (mg/g Gewebe) 3,5 11,2

ECOD (pmol/min/mg Protein) 2,9 480

EROD (pmol/min/mg Protein) 0,5 102

AnH (pmol/min/mg Protein) 65 687

HMPAd (pmol/min/mg Protein) 92 240

DMNd (pmol/min/mg Protein) 220 2045

APD (pmol/min/mg Protein) 65 826

Abbildung 5: Monooxygenase-Aktivitäten in menschlichen nasalen und hepatischen Mikrosomen (Gervasi

et al., 1991).

untersuchte Parameter nasale gepoolte Mikrosomen hepatische Mikrosomen

cytosolisches Protein

(mg/g Gewebe)

14,5 24,8

EH (nmol/min/mg Protein) 17,4 35,6

UDP-GT1 (nmol/min/mg Protein) <0,001 2,4

GST (nmol/min/mg Protein) 56,6 476

PrD (nmol/min/mg Protein) 2,08 3,07

BeD (nmol/min/mg Protein) 12,8 1,2

DT-Diaphorase

(nmol/min/mg Protein)

6,25 0,49

Carbonylreductase

(nmol/min/mg Protein)

1,92 1,85

Abbildung 6: Epoxid Hydrolase (EH) und Phase II-Enzymaktivitäten in menschlichen nasalen und

hepatischen Mikrosomen (Gervasi et al., 1991).

1. Einleitung 18

1.5 Nasale Applikation von Arzneimitteln – Glucocorticoide – Soft Steroide

Die nasale Arzneistoffapplikation ist aufgrund der leichten Zugänglichkeit und der guten

Durchblutung der Nasenschleimhaut sowohl für lokal, als auch für systemisch wirksame

Arzneimittel eine attraktive Applikationsform. Bei den lokal wirksamen Arzneistoffen ist die

nasale Applikationstechnik bereits für verschiedene Arzneistoffgruppen etabliert, darunter

Vasokonstriktoren zur Schleimhautabschwellung ( z.B. Xylometazolin [Olynth],

Oxymetazolin [Nasivin]), Mastzellstabilisatoren zur Verhinderung der

Histaminausschüttung bei allergisch bedingten Erkrankungen (z.B. Cromoglicinsäure

[Vividrin]) sowie verschiedene Glucocorticoide. Bei Letztgenannten handelt es sich um die

wichtigste Klasse von Medikamenten zur Behandlung von Entzündungen und Allergien,

gleichzeitig aber auch um Arzneimittel mit einem sehr breiten Nebenwirkungsspektrum.

Obwohl bei nasaler Administration nur ein kleiner Teil in den Blutkreislauf gelangt, sind

systemische Wirkungen nicht ganz auszuschließen. Beispielsweise wird bei nasaler

Verabreichung von Triamcinolonacetat eine Cortisolsuppression von 8 % (Einzeldosis) bzw.

16 % (Steady state-Dosis) beobachtet (Hochhaus et al., 2002).

Glucocorticoide stellen jedoch meistens einen unverzichtbaren Therapiebestandteil bei der

Behandlung von Allergien dar, so auch bei der Behandlung der allergischen Rhinitis

(Histologischer Schnitt durch die Nasenschleimhaut eines Patienten mit allergischer Rhinitis

siehe Abbildung 7). Die allergische Rhinitis – als Allergiekorrelat der Nasenschleimhaut – ist

eine weltweit verbreitete Erkrankung und betrifft etwa 10 – 50 % der Bevölkerung (Pawankar

and Fokkens, 2001). Die steigende Prävalenz in den letzten Jahren, die häufige Kombination

mit Asthma bronchiale (Kumar and Singh, 2002; Pawankar and Fokkens, 2001) und die meist

unerlässliche Glucocorticoidtherapie haben die Suche nach neueren und sicheren

Therapiekonzepten forciert. Durch Arzneistoffkonstruktion nach dem Prinzip des RMDD

(retrometabolic drug design) ist eine neue Klasse von Steroiden entstanden, die sich durch

einen erhöhten therapeutischen Index auszeichnet, da diese Substanzen so konstruiert sind,

dass sie nach ihrer systemischen Verfügbarkeit sofort zu inaktiven Metaboliten

verstoffwechselt werden (Bodor, 1999). Erster Vertreter dieser sog. Soft Steroide ist das

Loteprednol-Etabonat (LE), das für allergische ophthalmologische Indikationen bereits

zugelassen ist und sich derzeit in der klinischen Phase der Zulassung für die Behandlung

1. Einleitung 19

allergischer Atemwegserkrankungen befindet (Szelenyi and Pahl, 2002). In Abbildung 8 sind

Design, Metabolismus und allgemeine Struktur von Soft Steroiden dargestellt.

Abbildung 7: Histologischer Schnitt durch die untere Nasenmuschel eines Patienten mit allergischer

Rhinitis. Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Links: 100-fache Vergrößerung. Man beachte das mehrreihige

Flimmerepithel, die deutliche Basalmembran und das lockere Bindegewebe der Lamina propria, in welches in

den tieferen Schichten zahlreiche Immunzellen eingelagert sind. Rechts: 200-fache Vergrößerung.

Ausschnittsvergrößerung aus den tiefen Schichten der Nasenschleimhaut desselben Patienten. Man beachte

die deutliche Infiltration von eosinophilen Granulozyten, Lymphozyten und Plasmazellen.

[Die Aufnahmen wurden freundlicherweise von Prof. Dr. med. habil. Klaus Richter, Gemeinschaftspraxis für

Pathologie Prof. Dr. K. Richter und Dr. W. Beschow, Hannover zur Verfügung gestellt.]

200 µm 100 µm

1. Einleitung 20

Abbildung 8: Design, Metabolismus und allgemeine Struktur von Soft Steroiden. Das Design beginnt mit

einem inaktiven Metaboliten eines aktiven Steroids, gefolgt von einer Umwandlung dieses inaktiven Metaboliten

in ein isosterisches/isoelektronisches Analog des Leitsteroids, von dem Aktivität angenommen wird. Das Design

dieses Soft Steroids ist so gestaltet, dass jenes Steroid in einem Schritt zurück zu dem inaktiven Metaboliten

verstoffwechselt wird, mit dem das Design begonnen hat, ohne sich dabei anderen metabolischen

Umwandlungen zu unterziehen. Schließlich wird der inaktivierte Metabolit nach erfolgter Konjugation

eleminiert.

[ in Anlehnung an: Bodor N, Recent advances in retrometabolic design approaches. J. Control. Release, 62: 209-

222, 1999.]

Soft Steroid inaktivierter Metabolit

Konjugation und Elemination


retrometabolic drug design(RMDD)

R1 = Alkyl-, halogenierter Alkylrest, usw.R2 = Alkyl-, Carbonyl-, Carboxylrest, usw.R3 = H, α- oder β-CH3X1, X2 = H, F∆1 = Doppelbindung (vorhanden oder fehlend)

inaktivierter Metabolit

Soft Steroid inaktivierter Metabolit



retrometabolic drug design(RMDD)

R1 = Alkyl-, halogenierter Alkylrest, usw.R2 = Alkyl-, Carbonyl-, Carboxylrest, usw.R3 = H, α- oder β-CH3X1, X2 = H, F∆1 = Doppelbindung (vorhanden oder fehlend)

inaktivierter Metabolit

1. Einleitung 21

1.6 Ziel der Arbeit

Trotz des wachsenden Interesses der pharmazeutischen Industrie an der nasalen

Applikationsform ist die menschliche Nasenschleimhaut bislang kaum hinsichtlich ihrer

Arzneistoff-metabolisierenden Kompetenz untersucht. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die

menschliche respiratorische Nasenschleimhaut bezüglich vorhandener Enzymsysteme sowie

metabolischer Kompetenz näher zu charakterisieren. Schwerpunktmäßig wurden dabei die

verschiedenen Isoformen des Cytochrom P450-Systemes (CYPs) untersucht. Da Rauchen

nachweislich einen Einfluss auf die pulmonale CYP-Expression bei Mensch und Ratte besitzt

(Eke and Iscan, 2002; Haussmann et al., 1998; Hukkanen, 2000; Willey et al., 1997) und bei

der Ratte eine CYP-Enzyminduktion durch Zigarettenrauch auch in der nasalen Schleimhaut

beobachtet wurde (Haussmann et al., 1998; Wardlaw et al., 1998), ist davon auszugehen, dass

auch in der menschlichen Nasenschleimhaut Unterschiede im Genexpressionsmuster

abhängig vom Raucherstatus auftreten. Um dieses zu untersuchen, wurden die Spender in eine

Raucher- und eine Nicht-Raucher-Gruppe unterteilt. Die Nasenschleimhaut stammte dabei

von Patienten, die sich aufgrund einer Muschelhyperplasie einer partiellen Turbinektomie der

Concha nasalis inferior unterzogen haben.

Im ersten Versuchsabschnitt wurde die totale RNA der Schleimhaut isoliert, qualitativ und

quantitativ bestimmt und mittels RT-PCR auf die Expression verschiedener Phase I- und

Phase II-Enzyme, regulatorischer Rezeptoren sowie Entzündungsmediatoren untersucht.

Durch Ultrazentrifugation wurden im zweiten Versuchsabschnitt Mikrosomen gewonnen,

wobei aufgrund der geringen Gewebemengen die Nasenmuscheln mehrerer Patienten gepoolt

werden mussten. Auch hierbei wurde die Unterteilung in Raucher und Nicht-Raucher

beibehalten. Die Mikrosomen wurden für die anschließende Proteinbestimmung verwendet, in

deren Rahmen bestimmte Cytochrom P450 Monooxygenasen durch Western blotting weiter

charakterisiert wurden, so dass Gen- und Proteinexpression dieser Isozyme verglichen werden

konnten. Zur Untersuchung der metabolischen Kompetenz wurden die mikrosomalen

Membranen für verschiedene katalytische Assays verwendet. Der Schwerpunkt ruhte hierbei

auf der Verstoffwechselung des Soft Steroids Loteprednol-Etabonat (LE), dessen

Metabolitenprofil mittels Radio-HPLC bestimmt wurde. Abschließend wurden die

Enzymaktivitäten gegenüber den CYP-Markersubstraten Testosteron und Ethoxyresorufin

ermittelt.

2. Material und Methoden 22

2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Probenmaterial

humane Nasenmuscheln Friederiken-Stift, Hannover;

Medizinische Hochschule Hannover

2.1.2 Chemikalien

2.1.2.1 Reagentien für die Untersuchung der Genexpression

Agarose NEEO Ultra-Qualität, Rotigarose für Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

die Elektrophorese (Code 2267-3; Charge 43151566)

Bromphenolblau Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code B-8026; Charge 18H3630)

Custom Primers, 50nM, entsalzt Invitrogen GmbH, Karlsruhe

(Primerliste einschließlich PCR-Bedingungen siehe Anhang Seite VII bis VIII)

DNA ladder, 100bp Invitrogen GmbH, Karlsruhe

(Code 15628-050; Charge 1131233)

DNA Typing Grade 50X TAE Buffer Life Technologies, Paisley, Schottland

(Code 24710-030; Charge 1101351)

dNTP Mix (5mM für RT) Qiagen, Hilden

(Code 1010355; Charge 10921673)

dNTP Solution 100mM, PCR grade MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

(Code R0181; Charge 0273)

Ethanol 96% Riedel-de Haën Sigma-Aldrich, Seelze

(Code 24105; Charge 13330)


Ethidiumbromidlösung 10 mg/ml Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code E-1510; Charge 117H8509)

Glycerin Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 3783.2; Charge 04252672)

HotStar Taq, 5 units/µl Qiagen, Hilden

(Code 1007837; Charge 11239460)

2-Mercaptoethanol Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code M-7522; Charge 105F-02785)

Omniscript Reverse Transcriptase 4 units/µl Qiagen, Hilden

(Code 1010890; Charge 11229931)

PCR Buffer, 10x Qiagen, Hilden

(Code 1005479; Charge 11239890)

Random Hexamers Promega, Mannheim

(Code C118A; Charge 13232211)

RNA 6000 Nano LabChip Agilent Technologies Deutschland GmbH,

(Code 5065-4476; Charge EC18BK02) Waldbronn

RNA 6000 Nano Reagents & Supplies Agilent Technologies Deutschland GmbH,

(Code 5065-4476; Charge EC21RK02) Waldbronn

RNasin Ribonuclease Inhibitor 10 000 units Promega, Mannheim

(Code N211B; Charge 13000713)

RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden

(Code 74104; Charge 11234541)

10 x RT Buffer Qiagen, Hilden

(Code 1010883; Charge 10922292)

Xylencyanol Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code X-4126; Charge 117H3626)


2.1.2.2 Reagentien für die mikrosomalen Untersuchungen

Acetonitril Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 8825.2; Charge 20281)

30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 3029.1; Charge 18254163)

11-α-Hydroxyprogesteron Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code H-5502; Charge 17H0285)

Ammoniumacetat Merck KG, Darmstadt

(Code 1.01116.0500; Charge A180816 932)

Ammoniumperoxodisulfat Merck KG, Darmstadt

(Code 1.01201.0100; Charge K27070601)

β-Glucuronidase (EC 3.2.1.31) Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code G-0751; Charge 120K1321)

β-NADPH, reduced form Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code N-1630; Charge 81K7067)

Bicinchoninic Acid Solution Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code B-9643; Charge 60K5300)

Bovine Serum Albumin Fraction V PAA Laboratories GmbH, Linz,

(Code K41-001-100; Charge G16112-207) Österreich

Chemicon ECL Chemicon, Temecula, USA

(Code 2230; Charge 20020402)

Dimethylsulfoxid Merck KG, Darmstadt

(Code 1.02952.1000; Charge K30558552 220)

EDTA Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code E-5134; Charge 100K0284)

Essigsäure Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 6755.1; Charge 31150335)


Ethanol 96% Riedel-de Haën Sigma-Aldrich, Seelze

(Code 24105; Charge 13330)

Ethoxyresorufin Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code E-3763; Charge 22K4012)

Ethyl Acetat Mallinckrodt Baker B.V., Holland

(Code 8037; Charge 9930110002)

Glycin Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 3908.2; Charge 49151490)

Heptan Fluka Chemie GmbH, Schweiz

(Code 51745; Charge 423800/1)

Kupfer-(II)-sulfat Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code P023.1; Charge 44046989)

[4-14C] Loteprednol Etabonate Amersham pharmacia biotech,

(Code CFQ13089) Buckinghamshire, England

Loteprednol Etabonate VIATRIS GmbH & Co KG, Frankfurt

(Code X-387; Charge 25)

Methanol Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 4627.1; Charge 15253746)

Natriumchlorid Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 3957.1; Charge 02146852)

Potassium Chloride Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code P-5404; Charge 87H06665)

Precision blue protein standard prestained Bio-Rad Laboratories GmbH, München

(Code 161-0372; Charge 91731)

Primärantikörper für Western blot

(Liste der verwendeten Primärantikörper siehe Anhang Seite IX)

2-Propanol Merck KG, Darmstadt

(Code 1.09634.2500; Charge K29036034 112)


Resorufin Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code R-3257; Charge 18H3639)

Roti-Block 10x Konzentrat Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code A151.1; Charge 06148259)

Roti-Load1 4x Konzentrat Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code K929.1; Charge 27045406)

Rotiszinteco plus Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 0016.2; Charge 40251611)

SDS ultra pure Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 2326.2; Charge 48046682)

Sekundärantikörper für Western blot Chemicon, Temecula, USA

(Liste der verwendeten Sekundärantikörper siehe Anhang Seite IX)

Sodium hydroxide Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code S-5881; Charge 127H01821)

Sucrose Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code S-9378; Charge 100K0121)

TEMED p.a. Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 2367.1; Charge 06141122)

Testosteron Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code T1500; Charge 39H0638)

Tris Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 4855.2; Charge 50152286)

Trizma Base Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code T-1503; Charge 11K5424)

Trizma Hydrochloride Sigma Chemical Company, St.Louis, USA

(Code T-3253; Charge 69H5435)

Tween20 Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code 9127.1; Charge 47046531)


Western Lightning Chemiluminescence PerkinElmer Life Sciences, Boston, USA

Reagent Plus (Code NEL105; Charge 254753)

2.1.3 Geräte und Verbrauchsmaterialien

Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies Deutschland GmbH,

(Serien-Nr. DE01727542) Waldbronn

Analysenwaage Sartorius MC210S Sartorius AG, Göttingen

(Serien-Nr. 11410980)

Biometra Standard Power Pack P25 Biometra, Göttingen

(Serien-Nr. 4111139)

BioRad PowerPac 200 Bio-Rad Laboratories GmbH, München

(Serien-Nr. 285BR04868)

BioRad PowerPac 300 Bio-Rad Laboratories GmbH, München

(Serien-Nr. 283BR09143)

BioRad Sub-CellGT Elektrophoresekammer Bio-Rad Laboratories GmbH, München

(Serien-Nr. 61S01069)

C18-Nucleosil-Säule (250 x 4 mm, Macherey-Nagel, Düren

Partikelgröße 5 µm, Serien-Nr. 1106105)

Chirurgische Pinzette, 14,5 cm Medicalis, Garbsen

Chirurgische Schere, gerade, spitz/spitz, 14,5 cm Medicalis, Garbsen

ELISA Reader Dynatech MR5000 Dynatech, Ohio, USA

(Serien-Nr. G3112)

Emission Filter 620/10 (615-625 nm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München

(Code 1702426)

Excitation Filter 510/10 (505-515 nm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München

(Code 1702423)


Filterpapier Merck KG, Darmstadt

(Code 1001-931)

Flow Scintillation Analyzer 500TR Series Packard BioScience Company, USA

(Serien-Nr. 421035)

Fluorometer VersaFluor Bio-Rad Laboratories GmbH, München

(Serien-Nr. 435 BR 0769)

Gelkammer Biometra Minigel-Twin Typ G42 Biometra, Göttingen


Gewebehomogenisator Dounce 7 ml und 1 ml Wheaton, USA

Glasplatte, ausgeschnitten Whatman Biometra, Göttingen

(Code 010-003)

Glasplatte mit fixierten Spacern 0,6 mm Whatman Biometra, Göttingen

(Code 010-002)

HPLC Series 1100 für Testosteronmetabolismus Hewlett Packard GmbH, Waldbronn

[ Degasser G1322A (Serien-Nr. JP 73014117)

Quat Pump G1311A (Serien-Nr. DE 83104972)

ALS G1313A (Serien-Nr. DE 82206896)

Col Comp G1316A (Serien-Nr. DE 82207725)

DAD G1315A (Serien-Nr. DE 90604736) ]

HPLC Series 1100 für Radio-HPLC Hewlett Packard GmbH, Waldbronn

[ Degasser G1322A (Serien-Nr. JP 73014143)

Quat Pump G1311A (Serien-Nr. DE 83104953)

ALS G1329A (Serien-Nr. DE 91603535)

ALS Therm G1330A (Serien-Nr. DE 82203511)

Col Comp G1316A (Serien-Nr. DE 82207724)

VWD G1314A (Serien-Nr. JP 73797282) ]

Kamm 10-zähnig 0,6 mm für Minigel und Whatman Biometra, Göttingen

Minigel-Twin (Code 010-016)

Klammern für Gelelektrophorese Whatman Biometra, Göttingen

(Code 010-007)


Kodak Digital Science Image Station 440 CF Kodak, USA

(Serien-Nr. 207102)

LS 6500 Multi-Purpos Scintillation Counter Beckmann Coulter, Palo Alto, USA


Magnetrührer Heidolph MR 3000 Heidolph Instruments GmbH & Co.KG,

(Serien-Nr. 030008262) Schwabach

Mahlkugeln Wolframcarbid 5 mm F. Kurt Retsch GmbH & Co KG, Haan

(Code 05.368.0038)

Megafuge 2.0R Heraeus Kendro Laboratory Products, Osterode

(Serien-Nr. 268322)

Mini Trans-Blot Elektrophoretic Transfer Cell Bio-Rad Laboratories GmbH, München

(Serien-Nr. 37S/4382)

MS2 Minishaker IKA IKA Works, INC., Wilmington, USA

(Serien-Nr. 03.059839)

Nunc-Immuno Plates NUNC GmbH & Co KG, Wiesbaden

(Code 442 404)

Polycarbonatröhrchen Beckmann Coulter, Palo Alto, USA

(Code 355618; Charge 010115)

PVDF-Transfer-Membran NEN Life Science Products, Boston,

(Code NEF102; Charge 183321) USA

Rotilabo-Einsätze 100 µl Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

(Code C516.1; Charge 69752226AS7)

Rotor 70Ti Beckmann Coulter, Palo Alto, USA

(Serien-Nr. 01E 933)

Roto-Shake Genie Scientific Industries, Inc.,

(Serien-Nr. 1580) New York, USA

Schwingmühle Retsch MM 200 F. Kurt Retsch GmbH & Co KG, Haan

(Serien-Nr. 200609018G)


Sigma Tischzentrifuge 1-15 Sigma Laborzentrifugen, Osterode

(Serien-Nr. 83054)

Silikonabdichtung 1,0 mm für Minigel und Whatman Biometra, Göttingen

Minigel-Twin (Code 010-005)

Spherisorb ODS-2-Säule (250 x 4 mm, Latek, Eppelheim

Partikelgröße 3 µm, Serien-Nr. 9802010)

Test tube heater SHT 20 Stuart Scientific Co. Ltd., Surrey, England

(Serien-Nr. 5051)

Thermocycler T3 Biometra, Göttingen

(Serien-Nr. 0904125, 0904126, 0904134)

Thermomixer compact Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH,

(Serien-Nr. 5350 02163) Hamburg

Thermomixer comfort Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH,

(Serien-Nr. 5355 03052) Hamburg

Trockeneis Kohlensäurewerk, Laatzen

Ultra Turrax® T8 IKA Labortechnik, Staufen

(Serien-Nr. 00.080400)

Ultrazentrifuge Optima LE-80K Beckmann Coulter, Palo Alto, USA

(Serien-Nr. COL Ø 1C27)

Verschlüsse für Polycarbonatröhrchen Beckmann Coulter, Palo Alto, USA

(Code 338824)

Waage BP 3100P Sartorius AG, Göttingen

(Serien-Nr. 11903531)

Wärmeschrank Typ UE 400 Memmert GmbH + CoKG, Schwabach

(Serien-Nr. c498-0396)

Wasserbad Julabo SW21 Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach

(Serien-Nr. 03904420519)

Waters Oasis HLB 3cc (60mg) Extraction Waters Corporation, USA

Cartridges (Code WAT094226; Charge W2147J4)


White virgin PTFE septa, 8mm Agilent Technologies Deutschland GmbH,

(Code 5183-4434) Waldbronn

Zentrifuge Mikro 22R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen

(Serien-Nr. 0001096-03-00)

Zentrifugenröhrchen 15 ml Sarstedt, Nümbrecht

(Code 62.554.502; Charge 2182 1603)

Zentrifugenröhrchen 50 ml Sarstedt, Nümbrecht

(Code 62.547.254; Charge 2196 7023)

2.2 Methoden

2.2.1 Gewinnung und Transport des Probenmateriales

Respiratorische Nasenschleimhaut wurde von Patienten gewonnen, die sich aufgrund einer

Muschelhyperplasie einer partiellen Turbinektomie der Concha nasalis inferior unterzogen hatten

(Auflistung der Patienten einschließlich der Patientendaten siehe Anhang Seiten I bis VI). Die

Personen wurden vor dem operativen Eingriff über das Projekt aufgeklärt und haben ihre

Einwilligung für die Untersuchung erteilt.

Innerhalb von 10 – 15 Minuten nach ihrer operativen Entfernung wurden die Nasenmuscheln mittels

Trockeneis schockgefroren und bei –80°C gelagert.

2.2.2 Genexpressionsuntersuchungen

Sämtliche Untersuchungen zur Genexpression erfolgten in den Laboren T2.09 und T2.023 des

Fraunhofer Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin.


2.2.2.1 RNA-Isolation

Die RNA-Isolation aus der humanen respiratorischen Nasenschleimhaut wurde nach dem Protokoll

des Herstellers des RNeasy Mini Kits von Qiagen durchgeführt. Abweichend vom Protokoll wurde

die gewonnene RNA jedoch nicht im mitgelieferten RNase-freien Wasser, sondern in 50 µl DEPC-

(Diethylpyrocarbonat) Wasser eluiert. Um hauptsächlich epitheliales Gewebes zu erhalten, wurden

die oberflächlichen Schichten der conchalen Schleimhaut vorsichtig von den darunter liegenden

knorpeligen und knöchernen Trägerstrukturen abgekratzt. Anschließend wurde das im Buffer RLT

(lysis buffer) des RNeasy Mini Kits befindliche Gewebe mit jeweils einer Bleikugel pro Probe in

der Schwingmühle zwei Mal 60 Sekunden bei einer Frequenz von 15 Hz homogenisiert.

Die qualitative und quantitative RNA-Messung erfolgte mit dem Agilent Bioanalyzer der Agilent

Technologies Deutschland GmbH, Waldbronn nach Herstellerprotokoll, wozu 1 µl RNA je Probe

eingesetzt wurde. Zur Beurteilung der RNA-Qualität wurden die beiden ribosomalen Banden

herangezogen, deren Verhältnis (28S rRNA : 18S rRNA) im Idealfall einer reinen und intakten RNA

2:1 ist. Die Schärfe der ribosomalen Banden wurde nicht für Qualitätsbeurteilung herangezogen.

Proben mit einer RNA-Konzentration > 60 ng/µl wurden für die nachfolgende RT-(Reverse

Transkriptase) Reaktion verwendet, bei geringerer RNA-Ausbeute oder bei mangelnder Qualität

wurde die RNA-Isolation wiederholt und die RNA erneut gemessen.

2.2.2.2 RT-Reaktion und RT-PCR

Die Umschreibung der RNA in cDNA wurde mit der Omniscript Reverse Transcriptase von Qiagen

durchgeführt. Für die reverse Transkription wurde jeweils 1 µg RNA eingesetzt und mit der

entsprechenden Menge DEPC-Wasser auf ein Volumen von 12,75 µl eingestellt. Anschließend

wurde die RNA für 5 min bei 65°C denaturiert. Nach Herunterkühlen der Probe auf

Raumtemperatur wurde der Reaktionsmix bestehend aus 2 µl 10 x RT-Puffer, 2 µl dNTP Mix (5

mM), 2 µl Random Hexamers (5 µM), 0,25 µl RNasin (5 µM) und 1 µl Omniscript Reverse

Transcriptase hinzugegeben und die RT-Reaktion bei 37°C gestartet. Da bei Probe M-R 4 aufgrund

der geringen RNA-Konzentration von nur 67 ng/µl bei Einsatz von 1 µg RNA das Volumen von

12,75 µl überschritten wurde, musste bei dieser Probe der 1,5-fache RT-Ansatz gewählt werden,

d.h. die RNA wurde mittels DEPC-Wasser auf ein Volumen von 19,12 µl gebracht, die 1,5-fache

Menge des genannten Reaktionsgemisches hinzugefügt und die Reaktion gestartet. Im Anschluss an

die einstündige Inkubation bei 37°C, während der die RNA in cDNA umgeschrieben wurde, erfolgte


eine erneute Denaturierung bei 95°C für 5 min. Die entstandenen cDNA wurde bei –20°C

aufbewahrt.

Unter Zugabe von 20 µl A. bidest. bzw. von 10 µl A. bidest. im Falle des 1,5-fachen RT-Ansatzes

wurde die in der reversen Transkription gewonnene cDNA auf eine Konzentration von 25 ng/µl

verdünnt und pro PCR-Ansatz jeweils 1 µl cDNA (25 ng) eingesetzt. Die PCR wurde mit der

HotStar Taq DNA Polymerase von Qiagen durchgeführt. Zum PCR-Cocktail, bestehend aus jeweils

14,375 µl A. bidest., 2 µl 10x PCR Buffer, 0,5 µl dNTP Solution (10mM), 0,125 µl HotStar Taq

Polymerase sowie 2 µl der jeweiligen 10 µM Primergebrauchslösung ( je 10 µl 5´ bzw. 3´ Primer auf

80 µl A. bidest.) wurden pro Ansatz 1 µl cDNA hinzugegeben und die Reaktion im Thermocycler für

15 min bei 95°C gestartet. Für die zyklische Amplifizierung wurden folgende Bedingungen gewählt:

Aktivierung der Polymerase 15 min bei 95°C, Denaturierung 45 s bei 95°C, Annealing 60 s mit

primerspezifischen Temperaturen (siehe Anhang Seite VII bis VIII), Elongation 60 s bei 72°C. Je

nach Oligomer wurden unterschiedliche Zyklenzahlen verwendet. Im Anschluss an den letzten Zyklus

erfolgte stets eine Reaktion für 7 min bei 72°C sowie ein Herunterkühlen des Gerätes auf 4°C zur

Konservierung der Proben.

Parallel zu den Proben wurden bei der PCR jeweils eine Leber- und eine Negativkontrolle

mitgeführt. Bei der Leberkontrolle handelte es sich um cDNA, die aus RNA humaner

Leberzellkulturen durch reverse Transkription gewonnen wurde. Leber wurde als Kontrolle

verwendet, da es sich bei der Leber um dasjenige Organ handelt, in dem die meisten Cytochrom

P450 Monooxygenasen exprimiert sind. Nicht in der Leber exprimiert sind dagegen die Cytochrome

2A13 (Koskela et al., 1999; Su et al., 2000), 2F1 (Carr et al., 2003; Chen et al., 2002; Ding and

Kaminsky, 2002, Nishimura et al., 2003), 2S1 (Rylander et al., 2001), 3A5 (Hukkanen et al.,

2003), 4B1 (Nhamburo et al., 1989; Nishimura et al., 2003) sowie die Enzyme FMO2 (Dolphin et

al., 1998) und UGT 2A1 Jedlitschky et al., 1999). Aus methodischer Sicht wurde damit in Kauf

genommen, dass nicht bei allen untersuchten Genen in der Leberkontrolle RT-PCR Amplifikate

nachgewiesen werden konnten. Bei der Negativkontrolle wurde anstelle der cDNA 1 µl A. bidest.

eingesetzt.


2.2.2.3 Linearitätsnachweis

Um den linearen Amplifikationsabschnitt zu gewährleisten, erfolgte vor der eigentlichen PCR für

jeden Primer eine Primereinstellung mit einem cDNA-Mix aller Proben, welcher pro Oligomer bei

30, 33, 36 und 39 Zyklen getestet wurde. Beispielhaft sind nachfolgend die Linearitäten einiger

Primer graphisch dargestellt.

Abbildung 9: Linearitätsnachweis für die Primer CYP 4B1, UGT 2A1, FMO 2, FMO 3, PPAR α und PPAR γ.

Dargestellt sind die an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen Lichtwerte bei

jeweils 30, 33, 36 und 39 Amplifikationszyklen.

CYP 4B1

0

5000

10000

15000

20000

25000

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen

Lichtwerte

y = 7909,9x - 10609R2 = 0,9934

UGT 2A1

0

5000

10000

15000

20000

25000


Lichtwerte

y = 4183,5x + 3351,5R2 = 0,9982

FMO 2

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000


Lichtwerte

y = 34756x - 56596R2 = 0,9935

FMO 3

0

50000

100000

150000

200000

250000


Lichtwerte

y = 55290x - 31575R2 = 0,9976

PPAR a

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000


Lichtwerte

y = 29092x - 44975R2 = 1

PPAG g

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000


Lichtwerte

y = 11013x - 14255R2 = 0,9975

CYP 4B1

0

5000

10000

15000

20000

25000


Lichtwerte

y = 7909,9x - 10609R2 = 0,9934

UGT 2A1

0

5000

10000

15000

20000

25000


Lichtwerte

y = 4183,5x + 3351,5R2 = 0,9982

FMO 2

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000


Lichtwerte

y = 34756x - 56596R2 = 0,9935

FMO 3

0

50000

100000

150000

200000

250000


Lichtwerte

y = 55290x - 31575R2 = 0,9976

PPAR a

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000


Lichtwerte

y = 29092x - 44975R2 = 1

PPAG g

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000


Lichtwerte

y = 11013x - 14255R2 = 0,9975


2.2.2.4 Auswertung der Amplifikate

Zur amplifizierten cDNA wurden 6 µl 6x DNA-loading buffer – bestehend aus 40 mg

Bromphenolblau, 20 mg Xylencyanol, 100,64 g Glycerin ad 200 ml A. bidest. - hinzugegeben und je

Probe 10 µl in eine Kammer auf einem 1,5%igen Agarosegel (in 100 ml 1x TAE-Puffer, versetzt mit

1 µl Ethidiumbromid) aufgetragen. Der Größenkontrolle diente dabei der in die jeweils erste Kammer

gegebene DNA-Molekulargewichtsmarker (nachfolgend Ladder genannt). Nach 45-minütiger

Auftrennung der cDNA bei 120 V in der Elektrophoresekammer erfolgte die Darstellung mittels

UV-Licht an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA). Durch die

Verwendung spezifischer Primer ausreichender Länge und die Überprüfung der erwarteten bp-Länge

konnten die Amplifikate ausreichend verifiziert werden. Eine eigenständige Verifizierung in Form

einer Sequenzierung oder eines Restriktionsenzymverdaus wurde nicht durchgeführt.

Für die Auswertung wurden die Bandenstärken der PCR-Produkte der zu untersuchenden Gene mit

der 1D-Image Analysis Software für Windows Version 3.5.3B geldensitrometrisch ermittelt und die

Mittelwerte sowie Standardabweichungen aller Kandidatengene für die Raucher und die Nicht-

Raucher, sowie die männlichen und weiblichen Patienten berechnet. Die statistische

Signifikanzanalyse wurde mittels Mathematica4.2 der Wolfram Research, Inc. (www.wolfram.com)

durchgeführt, wobei das Programmpaket „Statistics´HypothesisTests´“ mit dem Programm

„MeanDifferenceTest“ und der Option TwoSided->True zur Anwendung kam. Voraussetzung für

die Anwendbarkeit dieses Tests ist das Vorliegen einer Normalverteilung, was vorab mit dem

Shapiro-Wilk-Test gesondert überprüft wurde.

Gemäß SOP wurde pro Patient und Primer eine RT-PCR durchgeführt, weshalb weder ein Intra-,

noch ein Inter-Assay Variationskoeffizient angegeben werden kann.

2.2.3 Proteinexpressionsuntersuchungen

Die Experimente zur Untersuchung der Proteinexpression wurden innerhalb des Fraunhofer Institutes

für Toxikologie und Experimentelle Medizin in den Räumen T2.03, T2.05, T2.09 und T2.033

durchgeführt.


2.2.3.1 Herstellung der Pufferlösungen

KCl-Puffer 0,15 M: 11,18 g KCl

ad 1 l A. bidest.

10x SDS-Laufpuffer 150g Tris

720g Glycin

50g SDS

ad 5 l A. bidest.

1x SDS-Laufpuffer 100 ml 10x SDS-Laufpuffer

900 ml A. bidest.

10x TBS-Puffer 121g Tris

400g NaCl

ad 5 l A. bidest.

mit 1 M HCl auf pH = 7,6 eingestellt

1x TBS-Puffer ohne Tween 100 ml 10x TBS-Puffer

900 ml A. bidest.

1x TBS-T 0,1% 1000 ml 1x TBS-Puffer ohne Tween

1 ml Tween20

10x Transfer-Puffer 151,5g Tris

720g Glycin

ad 5 l A. bidest.

1x Transfer-Puffer 100 ml 10x Transfer-Puffer

900 ml A. bidest.

pH = 8,3

TRIS-Stock 0,1 M: 6,35 g Trizma HCl

1,18 g Trizma Base

ad 500 ml A. bidest.

mit 1 M HCl auf pH = 7,4 eingestellt


TRIS-Sucrose-Puffer: 42,79 g Sucrose

100 ml TRIS-Stock

0,93 g EDTA

ad 500 ml A. bidest.

2.3.3.2 Isolation mikrosomaler Proteine durch Ultrazentrifugation

Aufgrund der geringen Gewebemengen mussten die Nasenmuscheln mehrerer Patienten gepoolt

werden, um für die nachfolgenden proteinanalytischen und metabolischen Untersuchungen

ausreichende Mengen an mikrosomalem Protein zu erhalten. So wurden insgesamt 15 Pools aus den

Nasenmuscheln von drei bis vierzehn Patienten gebildet (Patientendaten zu den einzelnen Pools siehe

Anhang Seite II bis VI). Eine Übersicht über Art und nachfolgende Verwendung der mikrosomalen

Pools gibt Abbildung 10.

Pool Art des Pools

Anzahl der

Patienten

WB LE I LE II Testost. EROD

60 min

120 min

mit Gluc.

ohne Gluc.

1 M-NR 5 X X 1 - - X - 2 M-NR 5 - X 1 X 2 - - - - 4 M-NR 6 X X 2 X 1 - - X - 5 M-NR 6 - X 2 X 1 - - - X 6 W-NR 6 X X 2 - - - X X 7 M-R 6 X X 2 X 1 - - - X 8 W-R 3 X X 2 - - - - - 9 M-NR 14 X X 2 X 2 - - X X 10 M-R 6 X X 2 X 2 - - X X 11 W-NR 5 X X 2 X 2 - - - - 12 M-NR 10 - - - X X - - 13 M-R 7 - - - X X - - 14 W-NR 10 - - - X X - - 15 W-R 5 - - - X X - - 16 W-? 4 - - - X X - -

Abbildung 10: Art und Verwendung der mikrosomalen Pools

Abkürzungen: EROD = Ethoxyresorufin-O-deethylase; LE-I = Loteprednol-Etabonat-Metabolismus Teil I

(verschiedene Inkubationszeiten) mit 1 = 1. Versuchsserie und 2 = 2. Versuchsserie; LE-II = Loteprednol-Etabonat-

Metabolismus Teil II (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz); M = männlich; NR = Nicht-Raucher; R = Raucher;

Testost. = Testosteron-Metabolismus; W = weiblich; WB = Western blot.


Nach Bestimmung der Poolgewichte wurden die jeweiligen Organpools in der dreifachen Menge

0,15 M KCl-Puffer mit einer Schere zerkleinert und anschließend mit dem Ultra Turrax

homogenisiert. Das gewonnene Homogenat wurde in ein Polycarbonatröhrchen gefüllt, mit 0,15 M

KCl-Puffer aufgefüllt und für 30 min bei 15.000 Upm und 4°C in der Ultrazentrifuge Optima LE-

80K (Beckmann Coulter, Palo Alto, USA) zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen und für

60 min bei 55.000 Upm und 4°C erneut zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in einigen

Millilitern 0,15 M KCl-Puffer aufgenommen und im Gewebehomogenisator Dounce (7ml)

homogenisiert. Die erhaltene Suspension wurde nach Auffüllen mit 0,15 M KCl-Puffer nochmals für

60 min bei 55.000 Upm und 4°C zentrifugiert und das gewonnene Pellet in 500 µl TRIS-Sucrose-

Puffer aufgenommen und im Gewebehomogenisator Dounce (1ml) homogenisiert. 10 µl wurden für

die anschließende Proteinbestimmung eingesetzt, der Rest bei –80°C eingefroren.

2.2.3.3 Proteinbestimmung nach Smith et al. (1985)

Die Bestimmung des Gesamtproteingehaltes wurde nach der Methode von Smith et al. (1985)

durchgeführt. Hierzu wurde von jedem Pool eine Verdünnungsreihe (1:100 bis 1:1000) hergestellt.

Zur Quantifizierung des Proteingehaltes wurde vor jeder Probenmessung eine Kalibriergerade aus

bovinem Serumalbumin (BSA) erstellt. Alle Messungen erfolgten als Doppelbestimmungen und

wurden in einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt, wobei pro Kavität 100 µl Probe und 100 µl

frisch angesetzte Färbelösung - bestehend aus 1 Teil 4% CuSO4 und 49 Teilen Bicinchoninic Acid -

eingesetzt wurde. Zur Beschleunigung der Reaktion wurde die Mikrotiterplatte 30 min bei 60°C im

Wärmeschrank inkubiert. Die Messung des Proteingehaltes erfolgte bei 550 nm mittels eines ELISA

Reader Dynatech MR5000 (Dynatech, Ohio, USA).

2.3.3.4 Proteinexpression ausgewählter CYPs

2.3.3.4.1 Auftrennung der Proteine mittels 1D-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde nach der Methode

von Laemmli (1970) durchgeführt. Die mikrosomalen Proteine von acht Pools wurden entsprechend

ihres Molekulargewichtes mittels 1D-SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert

und durch Inkubation mit einem Primär- und Sekundärantikörper die Cytochrome 1A1, 2A, 2B6,

2E1, 3A4 und 3A5 nachgewiesen.


Pro Pool wurden 45 µg mikrosomales Protein auf ein Volumen von 12 µl eingestellt, mit je 4 µl Roti

-Load1 4x-Konz. versetzt und 5 min bei 95°C inkubiert. Auf die erste Spur des 12%igen

Polyacrylamidgeles wurde ein Marker – bestehend aus 5 µl Precision blue protein standard

prestained und 0,5 µl Chemicon ECL – aufgetragen, auf die zweite Spur eine Positivkontrolle

(humane Lebermikrosomen). Zur besseren Auflösung der Proteinbanden wurden die Proben auf ein

Sammelgel aufgetragen, welches sich über dem eigentlichen Trenngel befand. Das Trenngel bestand

aus 3 ml 30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid, 1,875 ml 1,5 M Tris pH 8,8, 2,55 ml A. bidest. und

37,5 µl 20% SDS, das Sammelgel aus 850 µl 30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid, 625 µl 1 M Tris

pH 6,8, 3,47 ml A. bidest. und 25 µl 20% SDS. Zum Start der Polymerisierungsreaktion wurde dem

Trenngel 75 µl 10% Ammoniumperoxodisulfat und 7,5 µl TEMED, dem Sammelgel 50 µl 10%

Ammoniumperoxodisulfat und 5 µl TEMED hinzugegeben. Die Elektrophorese erfolgte bei

Raumtemperatur in einer Minigel-Elektrophoresekammer der Firma Biometra unter Zugabe von 1x

SDS-Laufpuffer. Anfänglich betrug die Stromstärke 20 mA pro Gel, nach Erreichen des Trenngels

wurde sie für etwa 60 bis 90 min auf 25 mA pro Gel erhöht.

2.3.3.4.2 Darstellung der Proteine mittels Western blot

Direkt im Anschluss an die Elektrophorese wurde das Gel aus der Elektrophoresekammer

entnommen und 10 min in 1x Transfer-Puffer getränkt. Parallel dazu wurde die PVDF-Membran 15

s in Methanol aktiviert, 2 min in A. bidest. gewässert und ebenfalls 10 min in 1x Transfer-Puffer

getränkt. Nach Beschicken der Kassette und Einsetzen der Kassette in die Blotkammer erfolgte das

Blotten über Nacht bei 90 mA und 4°C auf einem Magnetrührer Heidolph MR3000 der Firma

Heidolph Instruments GmbH & Co.KG.

Zur Sättigung freier, unspezifischer Bindungsstellen wurde die PVDF-Membran für 1 h bei

Raumtemperatur auf einem Schüttler (Roto-Shake Genie der Firma Scientific Industries, Inc.) mit

Blocking-Reagenz – bestehend aus neun Teilen 1x TBS-Puffer ohne Tween und einem Teil

Rotiblock, 10x Konzentrat – versetzt. Nach drei fünfminütigen Waschschritten mit Waschpuffer (1x

TBS-T 0,1%) wurde die Inkubation mit dem Primärantikörper, welcher in 10 ml Diluent – bestehend

aus 99 Teilen 1x TBS-Puffer ohne Tween und einem Teil Rotiblock, 10x Konzentrat – verdünnt

wurde (Angaben zu den verwendeten Primär- und Sekundärangaben und deren Verdünnungen siehe

Anhang Seite IX), für 1 h bei Raumtemperatur auf dem Schüttler durchgeführt. Nach erneutem

Waschen folgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper in analoger Weise. Anschließend wurde

die PVDF-Membran wieder gewaschen und in frisch angesetztem Entwicklungsreagenz 1 min bei

Raumtemperatur geschwenkt. Nach etwa 5 min erfolgte die Exposition an der Kodak Digital


Science Image Station 440 CF (Kodak, USA). Die Lumineszenz wurde nach 1 und nach 10 min

Expositionsdauer gemessen.

2.2.4 Metabolismusuntersuchungen

Die Inkubationsexperimente wurden in den Laboren T2.06, T2.07, T2.08 sowie T2.09 des Fraunhofer

Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin durchgeführt.

2.2.4.1 Metabolismus von Loteprednol-Etabonat (LE)

Um die Verstoffwechselung von Loteprednol-Etabonat, dem ersten Vertreter der sog. Soft Steroide

(Szelenyi and Pahl, 2002), zu untersuchen, wurde 14C-Loteprednol-Etabonat als Substrat verwendet

und das entstehende Metabolitenprofil mittels Radio-HPLC bestimmt. Die Messung des

Loteprednol-Etabonats und seiner Hauptmetaboliten wurde dabei durch Frau Diplom-Chemikerin

Qiong Luo am Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin durchgeführt.

Abbildung 11: Strukturformel von Loteprednol-Etabonat (LE), dem ersten Vertreter der sog. Soft Steroide.

[aus: Bodor N, Recent advances in retrometabolic design approaches. J. Control. Release, 62: 209-222, 1999.]


2.2.4.1.1 1.Versuchsabschnitt: Inkubation bei verschiedenen Inkubationszeiten

Im ersten Versuchsabschnitt erfolgten die Inkubationen der einzelnen mikrosomalen

Nasenmuschelpools sowie der mitgeführten Negativ- (nur Puffer und Substrat) und Positivkontrollen

bei 60 und/oder 120 min (siehe Abbildung 10). Die Versuche wurden dabei in zwei Versuchsserien

aufgeteilt, wobei in der ersten Serie Rattenlebermikrosomen, in der zweiten humane

Lebermikrosomen als Positivkontrolle verwendet wurden. Die konzentrierte Mikrosomensuspension

wurde mit 0,1 M TRIS-Puffer auf 1 mg mikrosomales Protein / ml eingestellt und mit 1 mM β-

NADPH versetzt. Zum Start der Reaktion wurde je Ansatz Loteprednol-Etabonat (25 µM) mit einer

Aktivität von 1 µCi/ml hinzugegeben und die Reaktionsansätze im Wasserbad bei 37°C 60 bzw. 120

min inkubiert. Im Anschluss wurden die Proben für 5 min bei 8.000 Upm und 4°C zentrifugiert und

bis zur weiteren Aufarbeitung bei –80°C schockgefroren.

Die Metaboliten wurden durch Festphasenextraktion nach folgender Methode gewonnen: Zunächst

wurden die Kartuschen (Waters Oasis HLB 3cc (60 mg) Extraction Cartridges der Firma Waters

Corporation, USA) mit 3 ml Ethanol und 2 ml A. bidest. konditioniert, dann die Proben aufgetragen.

Nach aufeinanderfolgenden Waschschritten mit 1 ml Ethanol (15%), 1 ml A. bidest. und 1 ml

Ethylacetat/Heptan (2:98) sowie Trocknen der Säule erfolgte die Elution mit 3 ml Ethylacetat/Heptan

(35:65) und 1 ml Ethylacetat. Anschließend wurde das Eluat unter Stickstoffstrom bei

Raumtemperatur bis zur vollständigen Trocknung eingedampft und das erhaltene Extrakt in 40 µl

mobiler Phase – bestehend aus Methanol und Essigsäure (0,5%, pH 3) im Verhältnis 62:38 –

aufgenommen.

Bei einem Injektionsvolumen von 10 µl und einer Flussrate von 0,3 ml / min wurden die Metaboliten

auf einer Spherisorb ODS-2-Säule (250 x 4 mm, Partikelgröße 3 µm, Latek, Eppelheim) bei 25°C

chromatographisch aufgetrennt. Die Trennung der Metaboliten erfolgte mit folgendem Gradienten der

mobilen Phase:

I. 0-9 min mit 62% Methanol, 38 % Essigsäure (0,5%, pH 3)

II. 9-16 min mit 74% Methanol, 26 % Essigsäure (0,5%, pH 3)

III. 16-39 min mit 74% Methanol, 26 % Essigsäure (0,5%, pH 3)

IV. 39-43 min mit 62% Methanol, 38 % Essigsäure (0,5%, pH 3)

V. 43-55 min mit 62% Methanol, 38 % Essigsäure (0,5%, pH 3)

Der Detektion diente ein Flow Scintillation Analyzer 500TR Series der Firma Packard BioScience

Company, USA.


2.2.4.1.2 2. Versuchsabschnitt: Inkubation mit und ohne Glucuronidase-Zusatz

Durch zusätzlichen Glucuronidase-Verdau können Glucuronide nachgewiesen werden. Aus diesem

Grund wurden die Proben in doppelter Menge angesetzt, im Anschluss an die LE-Inkubation

gesplittet und die eine Hälfte mit, die andere Hälfte ohne Glucuronidase behandelt. Parallel zu den

Organpools wurden zwei Positiv- (humane Lebermikrosomen) und zwei Negativkontrollen (nur

Puffer und Substrat) mitgeführt (jeweils mit und ohne Glucuronidase-Zusatz).

Auch hier wurde – mit Ausnahme von Pool 15 - der mikrosomale Proteingehalt mit 0,1 M TRIS-

Stock auf 1 mg / ml eingestellt und 1 mM β-NADPH zugesetzt. Bei Pool 15 musste die

Proteinkonzentration aufgrund der geringen Proteinausbeute auf 0,5 mg / ml halbiert werden. Nach

Zugabe von 25 µM Loteprednol-Etabonat mit einer Aktivität von 1 µCi/ml wurden die Proben im

Wasserbad bei 37°C 120 min inkubiert und anschließend 5 min bei 4°C und 8.000 Upm

zentrifugiert. Die Überstände wurden abgenommen, halbiert und eine Hälfte mit, die andere ohne β-

Glucuronidase inkubiert. Die Aliquots erhielten hierzu das gleiche Volumen an

Ammoniumacetatpuffer (200 mM, pH 4,5) unter Zugabe von 5 mg / ml β-Glucuronidase bzw. ohne

β-Glucuronidase-Zusatz (Kontrollen) und wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.

Die Festphasenextraktion der Inkubate sowie die anschließende HPLC-Messung erfolgten wie unter

2.2.4.1.1 beschrieben. Vor dem HPLC-Auftrag wurden jeweils 5% des Probenvolumens

abgenommen, mit je 4 ml Rotiszint versetzt, gemischt und die Radioaktivität des 14C-Isotops jeweils

eine Minute als DPM (Desintegrations per Minute) im LS 6500 Multi-Purpos Scintillation Counter

der Firma Beckmann Coulter, Palo Alto, USA gemessen und für die Berechnung der Wiederfindung

eingesetzt.

2.2.4.2 Testosteron-Metabolismus

Testosteron wird von unterschiedlichen CYP-Isoformen stereo- und regioselektiv hydroxyliert und

liefert auf diese Weise Informationen über die Aktivität einzelner Isozyme. Pro Ansatz wurden 50

µM Testosteron eingesetzt. Zusätzlich wurde eine Negativ- (nur Puffer und Substrat) und eine

Positivkontrolle (humane Lebermikrosomen) mitgeführt. Der mikrosomale Proteingehalt wurde mit

0,1 M TRIS-Stock auf 0,5 mg / ml eingestellt und die Inkubation unter Zusatz von 1 mM β-

NADPH bei 37°C im Wasserbad durchgeführt. Nach 120 min wurden die Proben für 5 min bei

8.000 Upm und 4°C zentrifugiert und die Überstände und Pellets bei –80°C schockgefroren.


Von den Überständen wurden 900 µl abgenommen, mit jeweils 100 µl 2-Propanol, 5 ml Ethylacetat

sowie 1 µg 11-α-Hydroxyprogesteron als internem Standard versetzt und auf dem Rotoshake 20

min bei Raumtemperatur extrahiert. Zur Trennung der Phasen wurden die Proben 20 min bei

Raumtemperatur und 2.200 Upm zentrifugiert und die obere Ethylacetat-Phase mit den darin

gelösten Metaboliten unter Stickstoffstrom eingedampft. Zur HPLC-Messung wurden die Extrakte in

je 100 µl mobiler Phase (Wasser / Methanol / Acetonitril, 60/25/15, v/v/v) aufgenommen, von denen

jeweils 80 µl in das HPLC-System (Hewlett Packard HP Series 1100) injiziert wurden. Die mobile

Phase wurde durch eine HP 1100 Quaternary Pump mit einer Flussrate von 1 ml / min durch das

System gepumpt. Die chromatographische Auftrennung der Testosteronmetaboliten 6α-

Hydroxytestosteron, 7α-Hydroxytestosteron, 6β-Hydroxytestosteron, 16α-Hydroxytestosteron,

2α-Hydroxytestosteron sowie Androstendion erfolgte auf einer C18-Nucleosil-Säule (250 x 4 mm,

Partikelgröße 5 µm, Macherey-Nagel, Düren) bei einer Ofentemperatur von 30°C.

Der Trennung der Metaboliten diente folgender Gradient der mobilen Phase:

I. 0-12 min mit 60% Wasser, 25% Methanol, 15% Acetonitril;

II. 12-15 min mit 45% Wasser, 40% Methanol, 15% Acetonitril;

III. 15-27 min mit 45% Wasser, 45% Methanol, 10% Acetonitril;

IV. 27-32 min mit 40% Wasser, 30% Methanol, 30% Acetonitril;

V. 32-35 min mit 40% Wasser, 25% Methanol, 35% Acetonitril;

VI. 35-40 min mit 30% Wasser, 20% Methanol, 50% Acetonitril;

VII. 40-45 min mit 60% Wasser, 25% Methanol, 15% Acetonitril.

Die Detektion erfolgte bei 238 nm.

2.2.4.3 EROD-Aktivitäten

Ethoxyresorufin ist ein profluoreszierendes Substrat für CYP 1A1, dessen metabolische Umsetzung

zu dem fluoreszierenden Resorufin gemessen werden kann. Hierzu wurde eine Ethoxyresorufin-

Stammlösung in DMSO mit einer Konzentration von 1 mg / ml hergestellt und durch Zugabe zu den

einzelnen Reaktionsansätzen auf die endgültige Konzentration von 10 µM verdünnt. Die konzentrierte

Mikrosomensuspension der Proben und der Positivkontrolle wurde mit 0,1 M TRIS-Stock auf 0,5

mg mikrosomales Protein / ml eingestellt und mit 1 mM β-NADPH versetzt. Mikrosomen humaner

Hepatozyten dienten dabei als Positivkontrolle. Die Inkubation erfolgte im Wasserbad bei 37°C.

Nach 120 min wurde die Reaktion mit 200 µl Acetonitril abgestoppt und die Proben 5 min bei 5.000

Upm zentrifugiert. Zur Bestimmung der Glucuronide wurden die Überstände halbiert und ein Aliquot


mit, das andere ohne Glucuronidase behandelt. Die Proben erhielten hierzu das gleiche Volumen an

Ammoniumacetatpuffer (200 mM, pH 4,5) unter Zusatz von 5 mg / ml β-Glucuronidase bzw. ohne

β-Glucuronidase-Zusatz (Kontrollen) und wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.

Das Dealkylierungsprodukt Resorufin wurde in dem Fluorometer VersaFluor (Bio-Rad

Laboratories GmbH, München) bei einer Excitationswellenlänge von 530 nm und einer

Emissionswellenlänge von 585 nm unter Zusatz von je 500 µl Glycinpuffer und 1000 µl TRIS-Puffer

pro Probe bzw. Kalibrierlösung gemessen. Zur Erstellung der Kalibriergerade wurde Resorufin in

unterschiedlichen Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 nM) in Ethanol gelöst (siehe

Abbildung 12). Lagen die gemessenen Fluoreszenzwerte der Proben oberhalb des höchsten Wertes

der Kalibriergerade, so wurden die Proben in einem Gemisch aus Acetatpuffer, Glycinpuffer und

TRIS-Puffer (im Verhältnis 1:1:2) verdünnt und die Messung wiederholt. Bei der Berechnung der

Konzentration wurde das Ergebnis mit dem jeweiligen Verdünnungsfaktor multipliziert.

Abbildung 12: Resorufin-Kalibriergerade zur Bestimmung des Resorufin-Gehaltes in nmol.

Resorufin-Kalibriergerade

340

95

220

346

473

599y = 6,2509x - 27,578

R2 = 0,9999

0

100

200

300

400

500

600

700

0 20 40 60 80 100 120

Resorufin-Gehalt [nmol]

Fluoreszenz

3. Ergebnisse 45

3. Ergebnisse

Sämtliche Rohdaten meiner Doktorarbeit werden im Archiv des Fraunhofer Institutes für

Toxikologie und Experimentelle Medizin in Hannover gelagert.

3.1 Genexpression

3.1.1 Qualität und Quantität der isolierten RNA

Die qualitative und quantitative RNA-Messung erfolgte durch Kapillarelektrophorese mit dem

Agilent Bioanalyzer der Agilent Technologies Deutschland GmbH, Waldbronn. In Abbildung

13 ist die totale RNA des Molekulargewichtsmarkers (nachfolgend Ladder bezeichnet) sowie

die der einzelnen Proben graphisch dargestellt. Abbildung 14 zeigt die Fluoreszenzwerte in

Abhängigkeit von der Retentionszeit am Beispiel von M-NR 1. In beiden Darstellungsformen

sind die beiden Banden der 18S rRNA sowie der 28S rRNA als Indikator reiner und intakter

RNA deutlich sichtbar.

Abbildung 13: Graphische Darstellung der totalen RNA des Ladders sowie die der einzelnen Proben

gemessen durch Kapillarelektrophorese am Agilent Bioanalyzer der Agilent Technologies GmbH,

Waldbronn. Deutlich sichtbar sind die beiden ribosomalen Banden 18S rRNA und 28S rRNA als Indikator

reiner und intakter RNA.

W-NRW-R M-R M-NR

Ladder 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 7

18S rRNA

28S rRNA

6

W-NRW-R M-R M-NR

Ladder 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 7

18S rRNA

28S rRNA

6

3. Ergebnisse 46

Abbildung 14: Graphische Darstellung der 18S rRNA- und 28S rRNA-assoziierten Fluoreszenz in

Abhängigkeit von der Retentionszeit am Beispiel von M-NR 1. Die Qualität der is olierten RNA lässt sich

anhand des Verhältnisses der beiden ribosomalen Banden ( 28 S rRNA : 18S rRNA ) abschätzen. Die RNA-

Konzentration errechnet sich aus der Gesamt -RNA-Fläche in Relation zur Fläche des Ladders mit bekanntem

RNA-Gehalt.

Die RNA-Konzentration, berechnet aus der jeweiligen RNA-Fläche in Bezug zur RNA-

Fläche des Ladders mit bekanntem RNA-Gehalt, sowie die RNA-Qualität – als Verhältnis der

beiden ribosomalen Banden ( 28S rRNA : 18S rRNA ) – ist für die insgesamt 22 Patienten in

den Abbildungen 15 (Raucher) und 16 (Nicht-Raucher) tabellarisch wiedergegeben.

Probe RNA-Fläche RNA-Konz. ( ng / µl )

rRNA-Verhältnis [ 28S / 18S ]

W-R 1 616,1 357,3 2,9 W-R 2 129,7 102,0 2,1 W-R 3 181,3 105,1 3,2 W-R 4 130,7 102,8 3,0 W-R 5 142,9 112,4 2,6 M-R 1 326,6 257,0 2,5 M-R 2 575,2 452,5 2,6 M-R 3 221,9 174,6 2,4 M-R 4 116,1 67,3 1,2 M-R 5 229,8 180,8 2,3

Abbildung 15: RNA-Fläche und daraus resultierende RNA-Konzentration (in ng / µl) sowie Verhältnis

der beiden ribosomalen Banden (28S rRNA : 18S rRNA) für die Gruppe der Raucher.

19 24 29 34 39 44 49 54 59 64 69Zeit ( Sekunden )

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Fluoreszenz

19 24 29 34 39 44 49 54 59 64 69Zeit ( Sekunden )

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Fluoreszenz

3. Ergebnisse 47

W- NR 1 208,6 96,8 2,6 W-NR 2 674,0 390,8 2,3 W-NR 3 490,8 227,7 2,8 W-NR 4 605,0 280,6 2,0 W-NR 5 637,3 369,5 2,2 M-NR 1 452,9 210,1 2,5 M-NR 2 547,2 253,8 2,5 M-NR 3 1.091,8 633,1 2,4 M-NR 4 687,9 398,9 2,1 M-NR 5 1.165,9 676,1 2,6 M-NR 6 435,2 252,4 1,8 M-NR7 482,0 279,5 2,1

Abbildung 16: RNA-Fläche und daraus resultierende RNA-Konzentration (in ng / µl) sowie Verhältnis

der beiden ribosomalen Banden (28S rRNA : 18S rRNA) für die Gruppe der Nicht-Raucher.

3.1.2 RT-PCR

Sämtliche Agarosegele der exprimierten Gene mit dazugehöriger graphischer Auswertung

sind im Anhang auf den Seiten X bis XLVI dargestellt.

3.1.2.1 Genexpression der Housekeeping-Gene CyclophillinA und GAPDH

Genexpressionsergebnisse werden häufig in Relation zu stabil exprimierten Genen, sog.

Housekeeping-Genen, dargestellt. GAPDH, welches in der Literatur oft als Housekeeping-

Gen ausgewiesene wird (Jung et al., 1997; Mollerup et al., 1999; Jung et al., 2003), zeigte

einen signifikanten Unterschied (p<0,05) zwischen Rauchern und Nicht-Rauchern. So lag der

durchschnittliche geldensitrometrisch ermittelte RNA-Gehalt von GAPDH in der Raucher-

Gruppe signifikant höher als in der Nicht-Raucher-Gruppe (siehe Abbildung 17).

Bei CyclophillinA, einem weiteren Housekeeping-Gen (Elder et al., 2000; Yang et al., 2000),

war der beobachtete Unterschied mit p = 0,076 statistisch zwar nicht signifikant, jedoch

wurde aufgrund der Nähe zum Signifikanzniveau (p<0,05) auf eine Darstellung der Werte

relativ zu CyclophillinA ebenfalls verzichtet.

Die Genexpressionsergebnisse werden daher absolut dargestellt.

3. Ergebnisse 48

Abbildung 17: Genexpression von CyclophillinA (links) und GAPDH (rechts). Mittelwerte und

Standardabweichungen der an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)

gemessenen Lichtwerte für die Nicht-Raucher- (n = 12) und die Raucher-Gruppe (n = 10).

*: p = 0,076; **: p<0,05.

3.1.2.2 CYP-Genexpression

Von den insgesamt 20 untersuchten Cytochrom P450 Monooxygenasen (siehe Liste der

verwendeten Primer im Anhang auf den Seiten VII und VIII) konnten die Cytochrome 1A2,

3A7 und 4A11 auch nach zahlreichen PCR-Amplifikationen von bis zu 39 Zyklen nicht

nachgewiesen werden.

Statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) zwischen der Raucher- und der Nicht-Raucher-

Gruppe konnten für CYP 1A1, 1B1 und 2S1 ermittelt werden. Aus statistischer Sicht war

dieser Unterschied bei CYP 1B1 mit einer Signifikanz von p<0,00006 am stärksten

ausgeprägt, gefolgt von CYP 1A1 mit p<0,002. Alle drei Monooxygenasen waren bei den

Rauchern stärker exprimiert als bei den Nicht-Rauchern. Betrachtet man bei genannten drei

Genen zusätzlich das Geschlecht, so fällt auf, dass CYP 1A1 und 2S1 nur bei den

Raucherinnen signifikant erhöht waren. Hingegen war CYP 1B1 geschlechtsunabhängig bei

männlichen wie weiblichen Rauchern erhöht.

GAPDH

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

Nicht-Raucher Raucher

LichtwerteCyclophillinA

50000550006000065000700007500080000850009000095000

100000


Lichtwerte

* **

GAPDH

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000



50000550006000065000700007500080000850009000095000

100000


LichtwerteGAPDH

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000



50000550006000065000700007500080000850009000095000

100000


Lichtwerte

* **

3. Ergebnisse 49

Abbildung 18: Genexpression von CYP 1B1 (links) und CYP 2S1 (rechts). Mittelwerte und


gemessenen Lichtwerte für die Nicht-Raucher- (n = 12) und die Raucher-Gruppe (n = 10).

*: p<0,00006; **: p<0,03.

Ein statistisch signifikanter Geschlechtsunterschied unabhängig vom Raucherstatus konnte

nur für CYP 2J2 mit p<0,0004 ermittelt werden (siehe Abbildung 19). So exprimieren

Männer CYP 2J2 weitaus stärker als Frauen, wobei bei einer Nichtraucherin (W-NR 5) keine

CYP 2J2-Transkripte nachweisbar waren. Auch CYP 2C9 war bei Männern stärker

exprimiert, wenngleich der Unterschied mit p = 0,063 statistisch nicht signifikant war. Hinzu

kommt, dass CYP 2C9 bei nur 12 (neun Männern und drei Frauen) der 22 Probanden

erfolgreich detektiert wurde, weshalb vor einer Bewertung weitere Untersuchungen mit

größeren Patientenzahlen notwendig erscheinen.

CYP 1B1

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000


LichtwerteCYP 2S1

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000


Lichtwerte

* **

CYP 1B1

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000


LichtwerteCYP 2S1

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000


LichtwerteCYP 1B1

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000


LichtwerteCYP 2S1

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000


Lichtwerte

* **

3. Ergebnisse 50

Abbildung 19: Genexpression von CYP 2J2. Mittelwerte und Standardabweichungen der an der Kodak

Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen Lichtwerte für die Frauen (n = 10) und

die Männer (n = 10).

*: p<0,0004.

Während CYP 1B1, 2A6/7, 2A13, 2B6, 2C8 und 2S1 bei allen Spendern in der

respiratorischen Nasenschleimhaut exprimiert waren, fehlten die übrigen Cytochrome bei

mindestens einer der insgesamt 22 Personen. CYP 2F1, 2J2 und 4B1 fehlten bei je einer

Nicht-Raucherin, wobei es sich jeweils um eine andere Patientin handelte (W-NR 3, W-NR 5

und W-NR 2). CYP 3A4 war bei einer Raucherin (W-R 4) sowie einer Nicht-Raucherin (W-

NR 1) nicht nachweisbar, während die Cytochrome 2E1 und 3A5 bei je drei Nicht-Rauchern

(jeweils bei zwei Männern und einer Frau) fehlten. Die Isozyme CYP 2C18 und 2C19 waren

bei jeweils zwei Rauchern und einer Nicht-Raucherin (CYP 2C18: M-R 3, M-R 4, W-NR 3;

CYP 2C19: W-R 3, M-R 3 und W-NR 4) nicht nachweisbar.

Im Falle des CYP 2D6 war in Höhe des erwarteten Amplifikates von 332 bp keine Bande

detektierbar, dafür jedoch mehrere größere Fragmente (siehe Abbildung 20).

CYP 2J2

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Frauen Männer

Lichtwerte

*

CYP 2J2

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Frauen Männer

LichtwerteCYP 2J2

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Frauen Männer

Lichtwerte

*

3. Ergebnisse 51

Abbildung 20: CYP 2D6-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B). Darstellung des 1,5

%igen Agarosegeles

Die an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen mittleren

Lichtintensitäten der Cytochrome 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2E1 und 3A4 waren deutlich

schwächer als jene der zugehörigen Positivkontrolle, während die mittlere CYP 2J2-Intensität

das 2,3-fache der zugehörigen Positivkontrolle betrug. Nicht in der Positivkontrolle

detektierbar waren Transkripte folgender Isoformen: CYP 2A13, 2F1, 2S1, 3A5 und 4B1.

332 bp

Ladder PK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Ladder

332 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

332 bp

Ladder PK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Ladder

332 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

3. Ergebnisse 52

3.1.2.3 Genexpression Flavinhaltiger Monooxygenasen (FMOs), der Epoxid-Hydrolase

(EH) sowie verschiedener Phase II-Enzyme

Von den sechs bekannten FMOs (Cashman and Zhang, 2002; Furnes et al., 2003) wurden die

Isozyme FMO 2, FMO 3 und FMO 5 auf ihre Expression in der menschlichen

respiratorischen Nasenschleimhaut untersucht. Jedes der drei Gene konnte bei allen 22

Patienten nachgewiesen werden. Die bei den Rauchern beobachtete reprimierte FMO 2-

Genexpression lag mit p=0,055 knapp unterhalb des statistischen Signifikanzniveaus von

p<0,05. Interessanterweise verursachte dabei das Rauchen bei Männer und Frauen ganz

unterschiedliche Effekte. Während die Expression von FMO 2 bei männlichen Spendern mit

p<0,05 statistisch signifikant reduziert war, konnte bei weiblichen Spendern (p<0,98) kein

Einfluss durch das Rauchen beobachtet werden (siehe Abbildung 21).

Vergleicht man die mittleren Lichtwerte der PCR-Amplifikate mit dem entsprechenden

Lichtwert der mitgeführten Positivkontrolle (humane Leber), so war der Wert für FMO 3 mit

dem der Positivkontrolle etwa vergleichbar, während der mittlere Wert für FMO 5

geringfügig darunter lag. FMO 2 dagegen konnte in der Positivkontrolle nicht nachgewiesen

werden.

Abbildung 21: Genexpression von FMO 2 bei Frauen (links) und Männern (rechts). Mittelwerte und


gemessenen Lichtwerte für die Nicht-Raucherinnen (n = 5) und die Raucherinnen (n = 5) sowie für die

Nicht-Raucher (n = 7) und die Raucher (n = 5). Man beachte die unterschiedlichen Effekte durch das Rauchen

bei Männer und Frauen.

*: p<0,98; **: p<0,05.

0100002000030000400005000060000700008000090000

Nicht-Raucherinnen Raucherinnen

Lichtwerte

0100002000030000400005000060000700008000090000


LichtwerteFMO 2 bei Frauen FMO 2 bei Männern

***

0100002000030000400005000060000700008000090000


Lichtwerte

0100002000030000400005000060000700008000090000



0100002000030000400005000060000700008000090000


Lichtwerte

0100002000030000400005000060000700008000090000


Lichtwerte

0100002000030000400005000060000700008000090000


Lichtwerte

0100002000030000400005000060000700008000090000



***

3. Ergebnisse 53

Die Epoxid-Hydrolase (EH) katalysiert die Addition von Wasser an Epoxide, um das

korrespondierende Dihydrodiol zu bilden. Diese Reaktion produziert hauptsächlich

Metaboliten geringerer Reaktivität, die leicht zu konjugieren und auszuscheiden sind

(Seidegard and Ekstrom, 1997). In der untersuchten Nasenschleimhaut konnten EH-

Transkripte bei allen Personen nachgewiesen werden, wobei keine signifikanten Unterschiede

hinsichtlich Raucher-Status oder Geschlecht erkennbar waren.

Von den Phase II-Enzymen Glutathion-S-Transferase (GST) und UDP-Glucuronyl-

Transferase (UDP-GT oder UGT) wurden die Subformen GST α2, GST µ1, GST ρ1 sowie

UGT 1A1 und UGT 2A1 untersucht.

Die hier untersuchten Glutathion-S-Transferasen waren jeweils bei allen Patienten

nachweisbar. Die gemessenen Lichtwerte der PCR-Amplifikate der Spender lagen im Falle

der GST µ1 leicht oberhalb des Lichtwertes der Leberkontrolle, im Falle der GST α2

eindeutig darüber. Mit Ausnahme zweier Raucher (W-R 2 und M-R 1), die nur ein schwaches

Signal lieferten, befanden sich auch die Werte für GST ρ1 deutlich oberhalb des Wertes der

Positivkontrolle. Raucher wiesen insgesamt einen geringeren mRNA-Gehalt an GST α2 auf

(p<0,002), wie in Abbildung 22 zu sehen ist. Bei Betrachtung der Geschlechter zeigte sich

dabei, dass dieser Unterschied nur bei männlichen Spendern (p<0,001) statistisch signifikant

war, nicht jedoch bei weiblichen Spendern (p<0,33).

Abbildung 22: Genexpression von GST α2. Mittelwerte und Standardabweichungen der an der Kodak

Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen Lichtwerte für die Nicht-Raucher- (n =

12) und die Raucher-Gruppe (n = 10) sowie Lichtwert für die Leberkontrolle.

*: p<0,002.

0

50000

100000

150000

200000

250000

Leberkontrolle Nicht-Raucher Raucher

Lichtwerte

*

GST α2 GST α2 GST α2

0

50000

100000

150000

200000

250000

Leberkontrolle Nicht-Raucher Raucher

Lichtwerte

*


*


3. Ergebnisse 54

Die in der Leber stark exprimierte UGT 1A1 ließ sich in der menschlichen respiratorischen

Nasenschleimhaut bei vier Rauchern und zwei Nicht-Rauchern nachweisen, allerdings erst

nach 39 PCR-Amplifikationszyklen (siehe Abbildung XXVI im Anhang Seite XXXV).

Dagegen war die auch als olfaktorische UGT bezeichnete UGT 2A1 (Jedlitschky et al., 1999)

in der Nasenschleimhaut sämtlicher 22 Spender vorhanden (siehe Abbildung XXVII im

Anhang Seite XXXVI), nicht jedoch in der Positivkontrolle (humane Leber). Signifikante

Unterschiede hinsichtlich Raucher-Status oder Geschlecht waren weder bei den drei

Glutathion-S-Transferasen, noch bei den beiden UDP-Glucuronyl-Transferasen erkennbar.

3.1.2.4 Genexpression verschiedener regulatorischer Rezeptoren

Da die transkriptorische Regulation der hier untersuchten Enzyme unter anderem über

verschiedene nukleäre Transkriptionsfaktoren bzw. Rezeptoren erfolgt, wurden ergänzend

folgende Rezeptoren in die Untersuchungen miteinbezogen: Aryl hydrocarbon-Rezeptor

(AhR), Constitutive Androstane Rezeptor β (CAR β), Liver X Rezeptor α (LXR α),

Pregnenolone X Rezeptor (PXR), Peroxisome proliferative activated Rezeptor α (PPAR α)

und Peroxisome proliferative activated Rezeptor γ (PPAR γ).

Die Rezeptoren AhR, LXR α, PXR, PPAR α und PPAR γ waren in der respiratorischen

Nasenschleimhaut aller 22 Personen exprimiert, wobei AhR, PPAR α und PPAR γ

vergleichbare Lichtintensitäten wie die Positivkontrolle (humane Leber) lieferten, während

LXR α und PXR deutlich schwächere Lichtintensitäten aufwiesen. CAR β war

interessanterweise nur bei vier weiblichen Rauchern und sechs männlichen Nicht-Rauchern

nachweisbar (siehe Abbildung XXIX im Anhang Seite XXXVIII), und zwar mit Lichtwerten

deutlich unterhalb der Positivkontrolle.

Ein statistisch signifikanter Unterschied (p<0,015) zwischen der Raucher- und der Nicht-

Raucher-Gruppe war nur bei PPAR γ (siehe Abbildung 23) vorhanden. Interessanterweise war

die beobachtete PPAR γ-Induktion nur bei den Raucherinnen aufzeigbar. PXR wiederum war

mit einer statistischen Signifikanz von p<0,005 bei weiblichen Spendern stärker exprimiert als

bei männlichen (siehe Abbildung 23).

3. Ergebnisse 55

Abbildung 23: Genexpression von PPAR γ (links) und PXR (rechts). Mittelwerte und


gemessenen Lichtwerte für die Nicht-Raucher- (n = 12) und die Raucher-Gruppe (n = 10) im Fall von

PPAR γ bzw. für Frauen (n = 10) und Männer (n = 12) im Fall von PXR.

*: p<0,015; **: p<0,005.

3.1.2.5 Genexpression verschiedener Cytokine

Da Rauchen nachweislich zu entzündlichen Atemwegsveränderungen führt (Dwyer, 2003;

Kasuga et al., 2003; Oudijk et al., 2003), wurden folgende Cytokine als Marker für mögliche

Entzündungsreaktionen (Jones et al., 2003) untersucht: IL-1β , IL-6, IL-8 und TNF α. Auf

diese Weise sollte geprüft werden, ob die zwischen Rauchern und Nicht-Rauchern

beobachteten Unterschiede in der Genexpression in Zusammenhang mit einer möglichen

Nasenschleimhautentzündung gebracht werden könnten. Unterschiede in der Expression

genannter Entzündungsmediatoren zwischen Rauchern und Nicht-Rauchern konnten jedoch

nicht festgestellt werden.

Transkripte von TNF α und IL-8 waren bei allen Patienten nachweisbar, IL-1β-Amplifikate

fehlten bei einer Nicht-Raucherin (W-NR 2). Dagegen war IL-6 nur bei sechs Rauchern (drei

weibliche und drei männliche) und vier Nicht-Rauchern (zwei männliche und zwei weibliche)

exprimiert.

0

5000

10000

15000

20000

25000


Lichtwerte

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

Frauen Männer

LichtwertePPAR γ PXR

*

**

0

5000

10000

15000

20000

25000


Lichtwerte

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

Frauen Männer


0

5000

10000

15000

20000

25000


Lichtwerte

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

Frauen Männer

Lichtwerte

0

5000

10000

15000

20000

25000


Lichtwerte

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

Frauen Männer


*

**

3. Ergebnisse 56

3.2 Proteinexpression

3.2.1 Poolgewichte und Bestimmung des mikrosomalen Proteingehaltes

In Abbildung 24 sind die zur Mikrosomengewinnung eingesetzten Poolgewichte der

Organpools, der jeweilige mikrosomale Proteingehalt - ermittelt durch die Proteinbestimmung

nach Smith et al. (1985) - sowie die Proteinausbeute (als mikrosomales Protein / g Gewebe)

dargestellt.

Pool-Nr. Art des Pools Poolgewicht ( g )

mikrosomales Protein

( µg / µl )

mikrosomales Protein / g Gewebe ( mg / g )

1 M-NR 1,53 5,77 1,89 2 M-NR 1,49 5,62 1,89 4 M-NR 2,7 7,74 1,43 5 M-NR 2,32 5,11 1,1 6 W-NR 1,58 5,74 1,82 7 M-R 2,6 5,94 1,14 8 W-R 1,16 3,75 1,62 9 M-NR 4,67 10,15 1,09 10 M-R 3,73 9,76 1,31 11 W-NR 2,52 5,01 0,99 12 M-NR 3,74 7,67 1,03 13 M-R 4,39 7,75 0,88 14 W-NR 4,43 6,61 0,75 15 W-R 1,16 3,04 1,31 16 W-? 1,21 4,67 1,93

Abbildung 24: Darstellung der Poolgewichte, des mikrosomalen Proteingehaltes und des mikrosomalen

Proteins / g Gewebe der insgesamt 15 Organpools.

3.2.2 Western blot

Von den mittels Western blot untersuchten Cytochromen 1A1, 2A, 2B6, 2E1, 3A4 und 3A5

konnten bei einem Proteinloading von 45 µg mikrosomalem Protein nur bei CYP 2A eine

schwache Proteinexpression beobachtet werden (siehe Abbildung 25). Die an der Kodak

Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen durchschnittlichen

Lichtwerte der acht Organspools betrugen mit 69.424,51 und einer Standardabweichung von

3. Ergebnisse 57

20.828,68 insgesamt 21,6 % der Positivkontrolle (humane Leber), die einen Lichtwert von

321.244,48 aufwies (siehe Abbildung 26). Die Western blots aller untersuchten Cytochrome

sind im Anhang auf den Seiten XLVII bis XLIX abgebildet.

Abbildung 25: CYP 2A-Proteinexpression mittels Western blot: Messung der Lumineszenz nach 10 min

Expositionsdauer an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA).

Man beachte die deutliche Bande der Positivkontrolle (PK) und die vergleichsweise schwachen Banden der

einzelnen Proben.

Abbildung 26: CYP 2A-Proteinexpression: an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak,

USA) gemessene Lichtwerte: Lichtwert der Positivkontrolle (PK) und durchschnittlicher Lichtwert und

Standardabweichung der acht Organpools

CYP 2A-Proteinexpression

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

PK 8 Organpools

Proben

Lichtwerte

Ladder PKPool 8(W-R)

Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa

unspezifische Bande

CYP 2A


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa

unspezifische Bande

CYP 2A

3. Ergebnisse 58

3.3 Metabolismusuntersuchungen

3.3.1 Metabolismus von Loteprednol-Etabonat (LE)

Die Radio-HPLC-Messung des Arzneistoffs Loteprednol-Etabonats und seiner

Hauptmetaboliten wurde von Frau Diplom-Chemikerin Qiong Luo am Fraunhofer Institut für

Toxikologie und Experimentelle Medizin durchgeführt. Sämtliche Chromatogramme –

getrennt dargestellt für die einzelnen Versuchseinheiten – sind im Anhang auf den Seiten L

bis LX abgebildet.

Abbildung 27 zeigt die detektierten LE-Metaboliten mit der jeweiligen relativen

Retentionszeit in Bezug zu Loteprednol-Etabonat sowie die durch MS-HPLC-Messung

erhaltenen Daten zur Anzahl der Hydroxylgruppen, der Carbonylgruppen und der

Doppelbindungen am Steroidring (Metabolism Studies with Loteprednol etabonate, 2003).

Metabolit Relative Retentionszeit

Anzahl der Hydroxylgruppen

Anzahl der Carbonylgruppen

Anzahl der Doppelbindungen

am Steroidring M 1 0,29 3 1 2 M 2 0,32 2 1 2 M 3 0,49 2 1 1 M 4 0,55 2 1 2 M 5 0,62 2 1 1 M 7 0,71 2 1 1 M 8 0,77 1 2 2 M 13 0,95 1 1 2 LE 1,00 1 1 2

M 12 1,21 2 1 1

Abbildung 27: Nachgewiesene LE-Metaboliten, zugehörige relative Retentionszeiten sowie Anzahl der

Hydroxylgruppen, der Carbonylgruppen und der Doppelbindungen am Steroidring.

[in Anlehnung an: Metabolism Studies with Loteprednol etabonate, 2003]

Abkürzungen: LE = Loteprednol-Etabonat; M = Metabolit.

3. Ergebnisse 59

3.3.1.1 Teil I: Inkubation bei verschiedenen Inkubationszeiten

Die Ergebnisse hausinterner Wiederfindungsversuche durch LE-Inkubation von

Rattenlebermikrosomen belegen, dass die durchschnittliche Wiederfindung nach der

Festphasenextraktion 83,9 % betrug und deshalb als akzeptabel eingestuft wurde (Metabolism

Studies with Loteprednol etabonate, 2003).

Die Inkubation menschlicher Nasenmuschelmikrosomen erfolgte im ersten Versuchsabschnitt

bei unterschiedlichen Inkubationszeiten und wurden in zwei Versuchserien durchgeführt.

Peaks ab 50 CPM (Counts per Minute) wurden integriert und als prozentualer Anteil an der

Gesamtpeakfläche angegeben. Die prozentualen Peakflächen der verschiedenen Metaboliten

und des Loteprednols sind in Abbildung 28 (1. Serie) und 29 bis 30 (2. Serie) dargestellt, die

um die Negativkontrollen korrigierten Werte in den Abbildungen 31 (1. Serie) und 32 bis 33

(2. Serie).

Metabolit Relative Retentions-

zeit

Pool 1 (M-NR, 60 min)




Pool 7 (M-R,

120 min)

PK (60 min)

NK 1 (60 min)

NK 2 (120 min)

M 1 0.25 -- -- -- -- -- 0.25 -- --

M 2 0.31 -- -- -- -- -- 2.60 -- --

? 0.37 -- -- -- -- -- 2.55 -- --

M 3 0.50 -- 0.80 -- -- -- 7.19 0.70 0.69

M 5 0.59 -- 0.75 0.28 -- -- 38.4 0.74 0.43

M 8 0.78 2.36 10.9 2.89 8.05 3.06 11.8 6.24 8.90

M 13 0.93 0.72 1.54 0.63 1.14 0.81 1.21 0.32 0.36 14C-LE 1.00 96.9 86.0 96.2 90.8 96.1 35.6 92.0 89.6

M 12 1.21 -- -- -- -- -- 0.44 -- --

Abbildung 28: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 1.

Versuchsabschnitt (unterschiedliche Inkubationszeiten), 1. Serie: Inkubation bei 60 und 120 min. Radio-

HPLC-Ergebnisse dargestellt als prozentuale Peakfläche bezogen auf die Gesamtpeakfläche jedes

Chromatogramms.

3. Ergebnisse 60


zeit

Pool 4 (M-NR)

Pool 5 (M-NR)

Pool 6 (W-NR)

Pool 7 (M-R)

Pool 8 (W-R)

Pool 9 (M-NR)

Pool 10 (M-R)

Pool 11 (W-NR)

PK 1 NK 1

? 0.37 -- -- -- -- -- -- -- -- 0.29 --

M 3 0.50 -- -- -- -- -- -- -- -- 4.28 --

M 5 0.58 -- -- -- -- -- -- -- -- 27.6 --

M 8 0.77 0.98 1.36 2.62 1.47 1.33 1.82 1.64 1.91 1.67 2.52

M 13 0.95 -- -- -- -- -- -- -- -- 21.2 -- 14C-LE 1.00 99.0 98.6 97.4 98.5 98.7 98.2 98.4 98.1 45.0 97.5


Versuchsabschnitt (unterschiedliche Inkubationszeiten), 2. Serie: Inkubation bei 60 min. Radio-HPLC-

Ergebnisse dargestellt als prozentuale Peakfläche bezogen auf die Gesamtpeakfläche jedes

Chromatogramms.


zeit

Pool 2 (M-NR)

Pool 9 (M-NR)

Pool 10 (M-R)

Pool 11 (W-NR)

PK 2 NK 2

? 0.37 -- -- -- -- 0.26 --

M 3 0.50 -- -- -- -- 1.54 --

M 5 0.59 -- -- -- -- 20.7 --

M 8 0.78 2.74 2.06 2.14 6.77 2.44 6.77

M 13 0.95 -- -- -- -- 10.2 -- 14C-LE 1.00 97.3 97.9 97.9 93.2 64.8 93.2




Chromatogramms.

3. Ergebnisse 61


zeit





Pool 7 (M-R,

120 min)

PK (60 min)

M 1 0.25 -- -- -- -- -- +

M 2 0.31 -- -- -- -- -- +

? 0.37 -- -- -- -- -- +

M 3 0.50 -- (+) -- -- -- +

M 5 0.59 -- (+) Ο -- -- +

M 8 0.78 Ο (+) Ο Ο Ο +

M 13 0.93 + + + + + + 14C-LE 1.00 + + + + + +

M 12 1.21 -- -- -- -- -- +


Versuchsabschnitt (unterschiedliche Inkubationszeiten), 1. Serie: Inkubation bei 60 und 120 min. Radio-

HPLC-Ergebnisse dargestellt als nachgewiesen oder nicht nachgewiesen, korrigiert um die jeweilige

Negativkontrolle.

+ Metabolit nachgewiesen, prozentuale Peakfläche > 25 % höher als die der Negativkontrolle (+) Metabolit nachgewiesen, prozentuale Peakfläche bis zu 25 % höher als die der Negativkontrolle Ο Metaboliten mit einer relativen Peakfläche ≤ Negativkontrolle -- Metaboliten nicht nachgewiesen ? Nicht identifizierte Peaks (Metaboliten).

Metabolit Relative

Retentions-zeit

Pool 4 (M-NR)

Pool 5 (M-NR)

Pool 6 (W-NR)

Pool 7 (M-R)

Pool 8 (W-R)

Pool 9 (M-NR)

Pool 10 (M-R)

Pool 11 (W-NR)

PK 1

? 0.37 -- -- -- -- -- -- -- -- +

M 3 0.50 -- -- -- -- -- -- -- -- +

M 5 0.58 -- -- -- -- -- -- -- -- +

M 8 0.77 Ο Ο (+) Ο Ο Ο Ο Ο Ο

M 13 0.95 -- -- -- -- -- -- -- -- + 14C-LE 1.00 + + + + + + + + +



Ergebnisse dargestellt als nachgewiesen oder nicht nachgewiesen, korrigiert um die Negativkontrolle.

Glossar siehe Abbildung 31.

3. Ergebnisse 62


zeit

Pool 2 (M-NR)

Pool 9 (M-NR)

Pool 10 (M-R)

Pool 11 (W-NR)

PK 2

? 0.37 -- -- -- -- +

M 3 0.50 -- -- -- -- +

M 5 0.59 -- -- -- -- +

M 8 0.78 Ο Ο Ο Ο Ο

M 13 0.95 -- -- -- -- + 14C-LE 1.00 + + + + +





Aufgrund ihrer hohen metabolischen Aktivität wurden Lebermikrosomen als Positivkontrolle

verwendet. In der Positivkontrolle der ersten Serie (Rattenlebermikrosomen) wurden die

Metaboliten M 1, M 2, M 3, M 5, M 8, M 13 und M 12, in denen der zweiten Serie (humane

Lebermikrosomen) die Metaboliten M 3, M 5 und M 13 detektiert. Darüber hinaus wurde in

den Positivkontrollen beider Versuchsserien ein bisher nicht identifizierter Metabolit (M ?)

mit einer relativen Retentionszeit von 0,37 nachgewiesen.

Im Gegensatz zu den Positivkontrollen konnten in den Inkubaten mit nasalen Mikrosomen nur

wenige Metaboliten in nur einigen Proben und in geringen Mengen nachgewiesen werden. So

wurden in Pool 2 (M-NR, 60 min Inkubation) kleine Mengen der Metaboliten M 3, M 5 und

M 8 sowie in Pool 6 (W-NR, 60 min Inkubation) kleine Mengen des Metaboliten M 8

detektiert. In beiden Fällen lag die Ausbeute der gemessenen Metaboliten nur bis zu 25 %

höher als die der Negativkontrolle. In allen Proben der ersten Versuchsserie wurden zudem

geringe Mengen des Metaboliten M 13 gefunden. Aufgrund der geringen Probenanzahl mit

detektierbaren Metaboliten ist jedoch keine Aussage über den Einfluss von Inkubationszeit,

Geschlecht oder Raucherstatus auf die metabolische Aktivität zu treffen.

3. Ergebnisse 63

Betrachtet man schließlich die prozentualen Anteile des verbleibenden Loteprednols an der

Gesamtpeakfläche bei den Proben und den zugehörigen Kontrollen, so zeigt sich, dass die

durchschnittliche Loteprednolfläche der Organpools (Serie 1: 93,2 %; Serie 2: 98,4 % bei 60

min Inkubation und 96,6 % bei 120 min Inkubation) größer als die der jeweiligen

Negativkontrolle (Serie 1: 90,8 %; Serie 2: 97,5 % bei 60 min Inkubation und 93,2 % bei 120

min Inkubation) ist, die Loteprednolfläche der Positivkontrollen (Serie 1: 35 %; Serie 2: 45 %

bei 60 min Inkubation und 64,8 % bei 120 min Inkubation) jedoch deutlich kleiner als die der

Negativkontrollen ist (siehe Abbildung 34).


Versuchsabschnitt (unterschiedliche Inkubationszeiten), 1. und 2. Serie. Loteprednolpeakfläche der

Negativ- und Positivkontrolle sowie der jeweiligen Organpools in % der Gesamtpeakfläche.

1. Versuchsabschnitt: Serie 1

0

20

40

60

80

100

NK PK 5 Organpools

Proben

LE-P

eakf

läch

e (

% )

1. Versuchsabschnitt: Serie 260 min Inkubation

0

20

40

60

80

100

NK PK 8 Organpools

Proben

LE

-Pea

kflä

che

( % )


0

20

40

60

80

100

NK PK 4 Organpools

Proben

LE

-Pea

kflä

che

( % )

1. Versuchsabschnitt: Serie 1

0

20

40

60

80

100

NK PK 5 Organpools

Proben

LE-P

eakf

läch

e (

% )


0

20

40

60

80

100

NK PK 8 Organpools

Proben

LE

-Pea

kflä

che

( % )


0

20

40

60

80

100

NK PK 4 Organpools

Proben

LE

-Pea

kflä

che

( % )

3. Ergebnisse 64

3.3.1.2 Teil II: Inkubation mit und ohne Glucuronidase-Zusatz

Die in diesem Versuchsabschnitt durchgeführten Wiederfindungsversuche durch Messung der

Gesamtradioaktivität vor und nach der Festphasenextraktion (siehe Abbildung 35) ergaben

eine durchschnittliche Wiederfindung nach der Festphasenextraktion von 84,5 % für die

Proben ohne Glucuronidase-Zusatz und von 84,1 % für die Proben mit Glucuronidase-Zusatz.

Damit ist die Wiederfindung mit jener der hausinternen Studie (83,9 % für Proben ohne

Glucuronidase-Zusatz, siehe Abschnitt 3.3.1.1) vergleichbar.

Abbildung 35: Gesamtradioaktivität der Kontrollen und der Organpools, dargestellt als DPM

(Desintegrations per Minute), gemessen am LS 6500 Multi-Purpos Scintillation Counter der Firma

Beckmann Coulter, Palo Alto, USA. Die oberen beiden Grafiken (jeweils ohne und mit Glucuronidase-Zusatz)

zeigen die Gesamtradioaktivität vor der SPE (solid phase extraction), die unteren beiden nach der SPE.

Gesamtradioaktivität vor SPE

0100002000030000400005000060000700008000090000

100000

NK PK Pool 12 Pool 13 Pool 14 Pool 15 Pool 16

Proben ohne Glucuronidase-Zusatz

DPMGesamtradioaktivität vor SPE

0100002000030000400005000060000700008000090000


Proben mit Glucuronidase-Zusatz

DPM

Gesamtradioaktivität nach SPE

0

10000

2000030000

4000050000

60000

70000

80000



DPMGesamtradioaktivität nach SPE

0

10000

2000030000

4000050000

60000

70000

80000



DPM

Gesamtradioaktivität vor SPE

0100002000030000400005000060000700008000090000

100000



DPMGesamtradioaktivität vor SPE

0100002000030000400005000060000700008000090000



DPM

Gesamtradioaktivität nach SPE

0

10000

2000030000

4000050000

60000

70000

80000



DPMGesamtradioaktivität nach SPE

0

10000

2000030000

4000050000

60000

70000

80000



DPM

3. Ergebnisse 65

Im zweiten Versuchsabschnitt erfolgte die LE-Inkubation menschlicher nasaler Mikrosomen

bei 120 min mit und ohne Glucuronidase-Zusatz. Auch hier wurden Peaks ab 50 CPM

(Counts per Minute) integriert und als prozentualer Anteil an der Gesamtpeakfläche

dargestellt (siehe Abbildungen 36 bis 39).

Als Positivkontrolle dienten - wie in der 2. Serie des ersten Versuchsabschnittes - humane

Lebermikrosomen, bei denen in diesem Versuchsabschnitt jedoch zusätzlich zu den

Metaboliten M 3, M 5, M 13 und dem bisher nicht identifizierten Metaboliten (M ?) mit einer

relativen Retentionszeit von 0,37 des ersten Versuchsabschnittes der Metabolit M 7 sowie in

Spuren der Metabolit M 8 nachgewiesen werden konnten.

Bei allen fünf untersuchten Organpools war der Metabolit M 8 unter Zusatz des Enzyms β-

Glucuronidase deutlich gegenüber der Negativkontrolle erhöht. Ohne Glucuronidase-Zusatz

hingegen lag M 8 unterhalb der Negativkontrolle, mit Ausnahme von Pool 15 (W-R), bei dem

M 8 in dem Bereich bis zu 25 % oberhalb der Negativkontrolle zu finden war. M 8 der

Positivkontrolle befand sich ohne Glucuronidase-Zusatz ebenfalls unterhalb der

Negativkontrolle, mit Glucuronidase-Zusatz im Bereich bis zu 25 % oberhalb der

Negativkontrolle. Unter Glucuronidase-Zusatz wurde bei Pool 15 (W-R) ein weiterer

Metabolit detektiert, der mit einer relativen Retentionszeit von 0,19 bislang noch nicht

identifiziert wurde und der bei keiner der anderen Proben zu finden war.

3. Ergebnisse 66


zeit

Pool 12 (M-NR)

Pool 13 (M-R)

Pool 14 (W-NR)

Pool 15 (W-R)

Pool 16 (W-?)

PK NK

? 0.19 -- -- -- -- -- -- --

? 0.37 -- -- -- -- -- 4.9 --

M 3 0.49 -- -- -- -- -- 1.4 --

M 4 0.57 -- -- -- -- -- 22.2 --

M 7 0.74 -- -- -- -- -- 2.3 --

M 8 0.78 31.8 32.0 32.7 35.2 32.9 17.5 32.4

M 13 0.93 1.0 0.9 0.9 1.8 2.1 7.5 5.3

14C-LE 1.00 67.2 67.1 66.4 62.9 65.0 44.1 62.3


Versuchsabschnitt (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz) ohne Glucuronidase-Zusatz. Radio-HPLC-


Chromatogramms.


zeit

Pool 12 (M-NR)

Pool 13 (M-R)

Pool 14 (W-NR)

Pool 15 (W-R)

Pool 16 (W-?)

PK NK

? 0.19 -- -- -- 6.9 -- -- --

? 0.37 -- -- -- -- -- 3.5 --

M 3 0.49 -- -- -- -- -- 0.9 --

M 5 0.57 -- -- -- -- -- 21.5 --

M 7 0.74 -- -- -- -- -- 1.7 --

M 8 0.78 27.6 28.2 34.4 28.5 33.0 18.5 16.6

M 13 0.95 -- -- -- -- -- 7.1 -- 14C-LE 1.00 72.4 71.8 65.6 64.6 67.0 46.9 83.4


Versuchsabschnitt (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz) mit Glucuronidase-Zusatz . Radio-HPLC-


Chromatogramms.

3. Ergebnisse 67


zeit

Pool 12 (M-NR)

Pool 13 (M-R)

Pool 14 (W-NR)

Pool 15 (W-R)

Pool 16 (W-?)

PK

? 0.19 -- -- -- -- -- --

? 0.37 -- -- -- -- -- +

M 3 0.49 -- -- -- -- -- +

M 5 0.57 -- -- -- -- -- +

M 7 0.74 -- -- -- -- -- +

M 8 0.78 Ο Ο Ο (+) Ο Ο

M 13 0.93 Ο Ο Ο Ο Ο + 14C-LE 1.00 + + + + + +


Versuchsabschnitt (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz) ohne Glucuronidase-Zusatz. Radio-HPLC-


+ Metabolit nachgewiesen, prozentuale Peakfläche > 25 % höher als die der Negativkontrolle (+) Metabolit nachgewiesen, prozentuale Peakfläche bis zu 25 % höher als die der Negativkontrolle Ο Metaboliten mit einer relativen Peakfläche ≤ Negativkontrolle -- Metaboliten nicht nachgewiesen ? Nicht identifizierte Peaks (Metaboliten).


zeit

Pool 12 (M-NR)

Pool 13 (M-R)

Pool 14 (W-NR)

Pool 15 (W-R)

Pool 16 (W-?)

PK

? 0.19 -- -- -- + -- --

? 0.37 -- -- -- -- -- +

M 3 0.49 -- -- -- -- -- +

M 5 0.57 -- -- -- -- -- +

M 7 0.74 -- -- -- -- -- +

M 8 0.78 + + + + + (+)

M 13 0.95 -- -- -- -- -- + 14C-LE 1.00 + + + + + +


Versuchsabschnitt (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz) mit Glucuronidase-Zusatz . Radio-HPLC-



3. Ergebnisse 68

Hinsichtlich der prozentualen Anteile des verbleibenden Loteprednols an der

Gesamtpeakfläche fällt auf, dass sowohl die Werte für die Organpools, als auch die Werte für

die beiden Negativkontrollen deutlich unterhalb jener des ersten Versuchsabschnittes liegen.

Dagegen sind die verbleibenden Loteprednolgehalte der beiden Positivkontrollen mit jenen

des ersten Versuchsabschnittes vergleichbar. Während der verbleibende Loteprednolanteil der

Positivkontrollen (44,1 % und 46,9 %) deutlich unter jenem der Negativkontrollen (62,3 %

und 83,4 %, jeweils ohne und mit Glucuronidase-Zusatz) liegt, ist bei den Proben ein

Unterschied hinsichtlich des Glucuronidase-Zusatzes zu beobachten (siehe Abbildung 40). So

ist die durchschnittliche LE-Peakfläche der Organpools ohne Glucuronidase-Zusatz (65,8 %)

größer, mit Glucuronidase-Zusatz (68,3 %) hingegen kleiner als die der Negativkontrollen

(62,3 % bzw. 83,4 %). Auffallend sind jedoch die stark schwankenden Werte der beiden

Negativkontrollen.


Versuchsabschnitt (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz). Loteprednolpeakfläche der Negativ- und

Positivkontrolle sowie der jeweiligen Organpools in % der Gesamtpeakfläche.

2. Versuchsabschnitt: ohne Glucuronidase-Zusatz

0

20

40

60

80

100

NK PK 5 Organpools

Proben

LE

-Pea

kflä

che

( % )

2. Versuchsabschnitt: mit Glucuronidase-Zusatz

0

20

40

60

80

100

NK PK 5 Organpools

Proben

LE

-Pea

kflä

che

( % )

2. Versuchsabschnitt: ohne Glucuronidase-Zusatz

0

20

40

60

80

100

NK PK 5 Organpools

Proben

LE

-Pea

kflä

che

( % )

2. Versuchsabschnitt: mit Glucuronidase-Zusatz

0

20

40

60

80

100

NK PK 5 Organpools

Proben

LE

-Pea

kflä

che

( % )

3. Ergebnisse 69

3.3.2 Testosteron-Metabolismus

Als weiteres CYP-Substrat wurde Testosteron verwendet, dessen Metabolismus durch

Inkubation menschlicher Nasenmuschelmikrosomen mit 50 µM Testosteron und

anschließender Messung mittels HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

untersucht wurde (siehe Kapitel 2.2.4.2). Die Chromatogramme sämtlicher Organpools sowie

die der Kontrollen sind im Anhang auf den Seiten LXI bis LXIII zu finden.

Die chromatographisch ermittelten Peaks der Metaboliten und des Testosterons wurden

integriert und die auf diese Weise erhaltenen Peakflächen um den mitgeführten internen

Standard (11α-Hydroxyprogesteron) korrigiert, um die Extraktionsverluste auszugleichen.

Die Darstellung der Ergebnisse (siehe Abbildungen 41 bis 43) erfolgte sowohl absolut als

Konzentration der Metaboliten (in µmol/l), als auch relativ als Anteil der Metaboliten am

Gesamtmetabolitenprofil (in % von Hundert).

Abbildung 41: absoluter und relativer 6β-Hydroxytestosteron- und Androstendion-Anteil am

Gesamtmetabolitenprofil. In der linken Grafik ist jeweils die absolute Konzentration in µmol/l, in der rechten

der relative Anteil in % von Hundert gezeigt, jeweils getrennt dargestellt für die Negativkontrolle (NK),

Positivkontrolle (PK) sowie den Mittelwert und die Standardabweichung der Proben (Probe 1-5).

05

101520253035404550

NK PK Probe 1-5

Proben

Anteil in %6β-Hydroxytestosteron

0

5

10

15

20

25

30

35

NK PK Probe 1-5

Proben

Konzentration (µmol/l)

6β-Hydroxytestosteron

0

1

2

3

4

5

67

8

NK PK Probe 1-5

Proben

Anteil in %Androstendion

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

NK PK Probe 1-5

Proben


Androstendion

05

101520253035404550

NK PK Probe 1-5

Proben


0

5

10

15

20

25

30

35

NK PK Probe 1-5

Proben



05

101520253035404550

NK PK Probe 1-5

Proben


0

5

10

15

20

25

30

35

NK PK Probe 1-5

Proben



0

1

2

3

4

5

67

8

NK PK Probe 1-5

Proben


00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

NK PK Probe 1-5

Proben


Androstendion

0

1

2

3

4

5

67

8

NK PK Probe 1-5

Proben


00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

NK PK Probe 1-5

Proben


Androstendion

3. Ergebnisse 70

Alle Testosteronmetaboliten lagen jeweils unter 0,5 % des metabolischen Gesamtprofils. Den

höchsten absoluten Wert erreichte mit 0,45 ± 0,04 % (0,38 ± 0,04 µmol/l) 6β-

Hydroxytestosteron, welches sich damit jedoch trotzdem unterhalb der Negativkontrolle mit

0,50 % (0,37 µmol/l) befand. Deutlich über der Negativkontrolle von 0,10 % (0,07 µmol/l)

lag das Androstendion mit 0,37 ± 0,12 % (0,31 ± 0,11 µmol/l).

Unterhalb der Negativkontrollen lagen die beiden Metaboliten 2α-Hydroxytestosteron und

16α-Hydroxytestosteron mit jeweils 0,16 ± 0,03 % (0,14 ± 0,02 µmol/l) und 0,18 ± 0,02 (0,15

± 0,02 µmol/l) gegenüber 0,26 % (0,20 µmol/l) und 0,32 % (0,24 µmol/l).

Abbildung 42: absoluter und relativer 2α- und 16α-Hydroxytestosteron -Anteil am




0

1

23

4

5

6

7

8

NK PK Probe 1-5

Proben

Anteil in %2α-Hydroxytestosteron

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

NK PK Probe 1-5

Proben


2α-Hydroxytestosteron

0

0,5

11,5

2

2,5

3

3,5

4

NK PK Probe 1-5

Proben

Konzentration (µmol/)


0

1

2

3

4

5

6

NK PK Probe 1-5

Proben


0

1

23

4

5

6

7

8

NK PK Probe 1-5

Proben


00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

NK PK Probe 1-5

Proben



0

1

23

4

5

6

7

8

NK PK Probe 1-5

Proben


00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

NK PK Probe 1-5

Proben



0

0,5

11,5

2

2,5

3

3,5

4

NK PK Probe 1-5

Proben



0

1

2

3

4

5

6

NK PK Probe 1-5

Proben


0

0,5

11,5

2

2,5

3

3,5

4

NK PK Probe 1-5

Proben



0

1

2

3

4

5

6

NK PK Probe 1-5

Proben


3. Ergebnisse 71

Nur in Spuren detektierbar waren die Metaboliten 6α- und 7α-Hydroxytestosteron mit 0,022

± 0,003 % (0,019 ± 0,003 µmol/l) und 0,0006 ± 0,0009 % (0,0005 ± 0,0007 µmol/l). Im Falle

des 6α-Hydroxytestosterons betrug die Negativkontrolle 0,018 % (0,013 µmol/l), 7α-

Hydroxytestosteron war dagegen weder in der Negativ-, noch in der Positivkontrolle

nachweisbar (siehe Abbildung 43).

Abbildung 43: absoluter und relativer 6α- und 7α-Hydroxytestosteron -Anteil am




0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

NK PK Probe 1-5

Proben


00,010,020,030,040,050,060,070,080,09

NK PK Probe 1-5

Proben



00,00020,00040,00060,00080,001

0,00120,00140,00160,0018

NK PK Probe 1-5

Proben


0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0,0014

NK PK Probe 1-5

Proben



0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

NK PK Probe 1-5

Proben


00,010,020,030,040,050,060,070,080,09

NK PK Probe 1-5

Proben



0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

NK PK Probe 1-5

Proben


00,010,020,030,040,050,060,070,080,09

NK PK Probe 1-5

Proben



00,00020,00040,00060,00080,001

0,00120,00140,00160,0018

NK PK Probe 1-5

Proben


0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0,0014

NK PK Probe 1-5

Proben



00,00020,00040,00060,00080,001

0,00120,00140,00160,0018

NK PK Probe 1-5

Proben


0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0,0014

NK PK Probe 1-5

Proben



3. Ergebnisse 72

Somit ist das Substrat Testosteron in der Positivkontrolle zu 36,76 % (24,43 µmol/l)

unverstoffwechselt geblieben, während es in der Negativkontrolle (98,80 % bzw. 74,18

µmol/l) und in den Proben (98,82 ± 0,16 % bzw. 83,37 ± 4,59 µmol/l) zu nahezu identischen

Anteilen verblieben ist (siehe Abbildung 44).

Abbildung 44: absoluter und relativer Testosteron-Anteil am Gesamtmetabolitenprofil. In der linken

Grafik ist die absolute Testosteron-Konzentration in µmol/l, in der rechten der relative Testosteron-Anteil in %

von Hundert gezeigt, jeweils getrennt dargestellt für die Negativkontrolle (NK), Positivkontrolle (PK) sowie den

Mittelwert und die Standardabweichung der Proben (Probe 1-5).

3.3.3 EROD-Aktivitäten

Aufgrund der nur geringen Mengen an mikrosomalem Protein war es nicht möglich,

klassische enzymkinetische Untersuchungen mit variablen Zeiten und variablen

Substratmengen durchzuführen (vergleiche hierzu Michaelis-Menten-Kinetik). Jedoch ließen

sich bei den Organpools auch mit den eingesetzten 500 µg mikrosomalen Proteins keine

EROD-Aktivitäten nachweisen, weshalb nur die Ergebnisse der Positivkontrolle dargestellt

sind. So konnte für die Positivkontrolle (menschliche Lebermikrosomen) eine Aktivität von

199,3 nmol/mg mikrosomales Protein/h ermittelt werden (siehe Abbildung 45). Nach

Inkubation mit β-Glucuronidase war eine Zunahme des Resorufin-Signales um 21,7 % zu

beobachten, was auf eine deutliche Glucuronidierung nach erfolgter Oxidation schließen lässt.

0102030405060708090

100

NK PK Probe 1-5

Proben

Anteil in %Testosteron

0102030405060708090

100

NK PK Probe 1-5

Proben


Testosteron

0102030405060708090

100

NK PK Probe 1-5

Proben

Anteil in %Testosteron

0102030405060708090

100

NK PK Probe 1-5

Proben


Testosteron

3. Ergebnisse 73

Abbildung 45: EROD-Aktivität menschlicher Lebermikrosomen, die im Rahmen des EROD-Assays als

Positivkontrolle verwendet wurden. Dargestellt ist die Bildung des fluorimetrisch gemessenen Resorufins nach

120-minütiger Inkubation mit 10µM Ethoxyresorufin.

0

50

100

150

200

250

300

Positivkontrolle

Bild

ung

von

Res

rufin

[nm

ol/m

g m

ikro

som

ales

Pro

tein

/h]

glucuronidiertesResorufin

nicht-glucuronidiertesResorufin

4. Diskussion 74

4. Diskussion

4.1 Untersuchtes Gewebe

Ausgangsmaterial für die Untersuchungen war hypertrophe Schleimhaut der unteren Nasenmuschel,

welche bei den einzelnen Patienten aufgrund verschiedener Erkrankungen – meist chronischer

Entzündung bzw. allergischer Rhinitis – operativ entfernt werden musste. Es handelt sich dabei zwar

nicht um gesundes und damit unverändertes Gewebe, stellt aber letztendlich genau jenes Gewebe

dar, welches im Rahmen der betreffenden Erkrankung medikamentös behandelt werden soll. Bedingt

durch die Art der Gewinnung des Probenmaterials (chirurgische Entfernung der unteren

Nasenmuschel, Abkratzen der Schleimhaut von den knorpeligen und knöchernen Trägerstrukturen)

ist nicht ganz auszuschließen, dass auch einzelne Zellen adherierenden Gewebes mituntersucht

wurden.

Aufgrund ihrer anatomischen Lage gehört die untersuchte Schleimhaut zur Regio respiratoria der

Nasenschleimhaut. Nicht untersucht wurde dagegen Schleimhaut der Regio olfactoria, die für eine

topische Applikation von Arzneistoffen nicht in Frage kommt. Darüber hinaus unterscheidet sich die

olfaktorische Schleimhaut bei Kaninchen, Ratte, Hund, Schwein, Affe und vermutlich auch beim

Menschen von der respiratorischen Nasenschleimhaut durch eine deutlich höhere metabolische

Aktivität (Gervasi et al., 1991; Hadley and Dahl, 1983; Longo et al., 1989; Marini et al., 1998;

Reed, 1993) sowie durch weitere Funktionen. Hierzu gehört die Beteiligung bei der

Geruchswahrnehmung sowie der Schutz der olfaktorischen Neurone und damit des empfindlichen

Nervengewebes (Bereziat et al., 1995; Dahl and Hadley, 1991; Getchell et al., 1993; Su et al.,

1996), weshalb die olfaktorische Schleimhaut für Vergleiche insgesamt ungeeignet erscheint.

Hingegen ist die Bronchialschleimhaut der menschlichen Lunge nahezu ideal für Vergleichszwecke,

da sich die respiratorische Schleimhaut der oberen Atemwege über die Trachealschleimhaut

kontinuierlich bis in die unteren Atemwege fortsetzt und bereits mehrere Daten zur inhalativen

Arzneistoffapplikation an der menschlichen Lunge vorliegen. Ebenso für Vergleichszwecke geeignet

erscheint die respiratorische Nasenschleimhaut anderer Spezies. Im Vordergrund stehen dabei

Kaninchen, Maus und Ratte, da diese häufig für toxikologische Studien herangezogen werden und

ihre Nasenschleimhäute deshalb vergleichsweise gut charakterisiert sind. Aus den genannten Gründen

werden die Versuchsergebnisse der vorgelegten Doktorarbeit im Folgenden mit der respiratorischen

4. Diskussion 75

Nasenschleimhaut anderer Spezies sowie mit respiratorischem Gewebe der menschlichen Lunge

verglichen.

4.2 Exprimierte Gene

Mit der RT-PCR wird die mRNA verschiedener Targetgene innerhalb eines Gewebes

nachgewiesen, wobei es sich um eine Momentaufnahme des jeweiligen Gewebes handelt. Die

unterschiedlich starke Stabilisierung oder Degradierung der mRNA führt dabei zu spezifischen

Halbwertszeiten der einzelnen mRNAs. Zusätzlich kann eine mögliche Proteinbindung die Translation

behindern, weshalb vom mRNA-Gehalt nicht unmittelbar auf den Proteingehalt geschlossen werden

darf. Aus diesen Gründen wurde die Nasenschleimhaut nicht nur auf der Genexpressionsebene,

sondern auch auf der Protein- und Metabolismusebene untersucht. Die Beobachtung, dass teilweise

mRNA nachgewiesen wurde, aber kein Protein detektierbar war (wie beispielsweise im Fall der

Cytochrome 3A4 und 3A5), zeigt, dass geringe mRNA-Mengen physiologisch möglicherweise ohne

große Bedeutung sind (Koskela et al., 1999). Da die untersuchte Nasenschleimhaut von

unterschiedlichen Spendern stammte, die verschiedene Genotypen besitzen und unterschiedlichen

Umwelteinflüssen unterliegen, war es zu erwarten, dass die einzelnen Gene bei den verschiedenen

Personen unterschiedlich stark exprimiert bzw. teilweise auch gar nicht exprimiert waren. So waren

unter den untersuchten Cytochromen nur CYP 1B1, 2A6/7, 2A13, 2B6, 2C8 und 2S1 bei allen

Spendern exprimiert, während die übrigen Cytochrome bei mindestens einer der insgesamt 22

Patienten nicht exprimiert waren.

Im Anschluss an diese allgemeinen Erläuterungen wird die Expression der einzelnen Gene diskutiert.

Genexpressionsergebnisse werden häufig als Verhältnis zu stabil exprimierten Housekeeping-Genen

dargestellt. Oft werden hierfür GAPDH oder CyclophillinA eingesetzt. Da GAPDH mit einer

statistischen Signifikanz von p<0,05 in der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut bei

Rauchern und Nicht-Rauchern unterschiedlich stark exprimiert war, konnte es als interne

Bezugsgröße nicht verwendet werden. Auch Deindl et al. (2002), Prieto-Alamo et al. (2003) und

4. Diskussion 76

Tricario et al. (2002) haben bereits in vorherigen Studien gezeigt, dass die Expression des häufig

verwendeten Housekeeping-Genes GAPDH innerhalb verschiedener Gewebe des Menschen

teilweise erheblich variiert und somit nicht immer als interner Standard geeignet ist. Auch

CyclophillinA wurde auf die Eignung als Housekeeping-Gen untersucht. Zwar war der beobachtete

Unterschied mit p = 0,076 statistisch nicht signifikant, jedoch wurde aufgrund der Nähe zum

Signifikanzniveau (p<0,05) auf eine Korrektur der Werte durch CyclophillinA ebenfalls verzichtet, so

dass die Genenxpressionsergebnisse absolut dargestellt wurden.

Aus der Enzymfamilie des Cytochrom P450-Systems konnten hier neben den bereits bei anderen

Spezies in der Nasenschleimhaut nachgewiesenen CYP-Isoformen der 1A-, 2A-, 2B-, 2C-, 2E-,

3A- und 4B-Subfamilie (Longo et al., 2000; Thornton-Manning et al., 1997) zusätzlich die

Expression von CYP 1B1, 2F1, 2J2 sowie des erst kürzlich beschriebenen CYP 2S1 mittels RT-

PCR gezeigt werden. Dagegen war das in Leber und Niere vorkommende CYP 4A11 (Baker et al.,

2003; Cummings et al., 2000; Savas et al., 2003) nicht in der menschlichen Nasenschleimhaut

exprimiert. Über das Vorhandensein von CYP 4A11 in anderen respiratorischen Geweben des

Menschen ist bislang auch nichts bekannt. Im Folgenden werden die Ergebnisse im einzelnen

diskutiert.

Das durch AhR-Liganden in nahezu jedem untersuchten Gewebe induzierbare CYP 1A1

(Hukkanen, 2000) ist in der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut offensichtlich nicht

konstitutiv exprimiert, wohl aber durch Zigarettenrauch induzierbar. So war es bei 60 % der Raucher

exprimiert, während es bei keinem der Nicht-Raucher nachweisbar war. Eine CYP 1A1-

Enzyminduktion nach Zigarettenrauchexposition konnten Wardlaw et al. (1998) auch in der

Nasenschleimhaut von Ratten beobachten. Auch in Untersuchungen an respiratorischem Gewebe der

menschlichen Lunge erwies sich Zigarettenrauch als potenter Induktor (Anttila et al., 2000; Mollerup

et al., 1999; Willey et al., 1997), wobei quantitative RT-PCR-Messungen eine höhere Induktion bei

weiblichen als bei männlichen Rauchern belegen (Mollerup et al., 1999). Bei den hier durchgeführten

Versuchen war CYP 1A1 bei insgesamt vier weiblichen im Gegensatz zu nur zwei männlichen

Rauchern induziert, was in Übereinstimmung mit den Beobachtungen von Mollerup et al. (1999) an

der menschlichen Lunge steht. Interessanterweise war der Unterschied zwischen der Raucher- und

der Nicht-Raucher-Gruppe auch nur bei den weiblichen Personen statistisch signifikant.

Im Vergleich zu CYP 1A1 ließ sich das zweite Mitglied der CYP 1A-Subfamilie - CYP 1A2 - bei

keinem der Spender (n=22) nachweisen. Auch in der menschlichen Lunge konnte CYP 1A2 bislang

4. Diskussion 77

noch nicht detektiert werden (Shimada et al., 1996; Thum and Borlak, 2000; Wheeler et al., 1990).

Nach Hukkanen (2000) wird CYP 1A2 strikt leberspezifisch exprimiert, da bisher noch kein CYP

1A2-Protein in extrahepatischen Geweben nachgewiesen wurde. Im Gegensatz zur

Nasenschleimhaut des Menschen ist CYP 1A2 in der Nasenschleimhaut der Ratte konstitutiv

exprimiert (Longo et al., 2000). Daher liegt der Schluss nahe, dass die Ergebnisse von Tierversuchen

nicht unkritisch auf den Menschen übertragen werden können.

Mit einer Signifikanz von p<0,00006 konnte für CYP 1B1 eine statistisch hochsignifikante Induktion

für Raucher ermittelt werden. Auch diese Beobachtung steht in Einklang mit Untersuchungen an der

menschlichen Lunge (Willey et al., 1997).

Die CYP 2A-Subfamilie beinhaltet beim Menschen die Mitglieder CYP 2A6, 2A7 sowie 2A13, von

denen sich bislang nur CYP 2A6 und 2A13 als katalytisch aktiv erwiesen haben (Su et al., 2000).

CYP 2A13, das unter allen untersuchten Geweben am stärksten in der Nasenschleimhaut exprimiert

ist (Su et al., 2000), ließ sich bei allen Patienten, nicht jedoch in der menschlichen Leber nachweisen.

Dies bestätigt die früheren Ergebnisse von Koskela et al. (1999) und Su et al. (2000), die ebenfalls

CYP 2A13 nur in der Nasenschleimhaut nachweisen konnten. Im Gegensatz zu CYP 2A13 war

CYP 2A6/7 zusätzlich auch in der Leber nachweisbar. Auch dies steht in Einklang mit den

Beobachtungen von Koskela et al. (1999) und Su et al. (2000). Die CYP 2A-Isoformen des

Menschen sind hinsichtlich ihrer Nukleotidsequenz zu > 83% mit CYP 2A3 der Ratte, CYP 2A4

und 2A5 der Maus sowie CYP 2A10 und 2A11 des Kaninchens identisch (Ding et al., 1994; Peng

et al., 1993). Sie sind somit homolog zum Cytochrom P450 NMa des Kaninchens, welches zuerst in

nasalen Mikrosomen entdeckt und erst später als CYP 2A10 und 2A11 definiert wurde. Das NMa

ist eines der Hauptcytochrome in der Nasenschleimhaut des Kaninchens. Es metabolisiert mit hoher

Aktivität zahlreiche Substrate (Ding and Coon, 1990; Peng et al., 1993), weshalb sich

Untersuchungen an der Nasenschleimhaut bei verschiedenen Spezies auf die Homologe der CYP

2A-Subfamilie konzentrieren.

Übereinstimmend mit Beobachtungen an respiratorischem Gewebe der menschlichen Lunge (Willey

et al., 1997) konnten bei dem Cytochrom 2B6 auch in der Nasenschleimhaut keine Unterschiede

zwischen Rauchern und Nicht-Rauchern beobachtet werden. Auch die Mitglieder der CYP 2C-

Subfamilie zeigten weder Raucher-, noch Geschlechtsunterschiede, jedoch mussten bei der RT-PCR

von CYP 2C8, 2C9 und 2C19 sehr hohe Zyklenzahlen verwendet werden (jeweils 39 Zyklen), um

4. Diskussion 78

überhaupt Transkripte amplifizieren zu können. Die Frage, ob derart geringe mRNA-Mengen zu

einer nennenswerten Proteintranslation führen und damit physiologisch von Bedeutung sind, haben

bereits Koskela et al. (1999) diskutiert. Im Gegensatz zu den zuvor genannten Isoformen ließ sich

CYP 2C18 bereits mit 33 Zyklen amplifizieren, war aber nur bei 19 der insgesamt 22 Personen

nachweisbar. Bezogen auf die mRNA-Expression scheint CYP 2C18 in der menschlichen Lunge

eine abundante Isoform der CYP 2C-Subfamilie zu sein (Zhu-Ge et al., 2002), was wiederum in

Einklang mit meinen Untersuchungen an der respiratorischen Nasenschleimhaut steht. Obwohl

bislang wenig über spezifische CYP 2C18-Substrate bekannt ist (Zhu-Ge et al., 2002) und CYP

2C18-Protein im Gegensatz zu CYP 2C8, 2C9 und 2C19 in der Leber bisher nicht nachgewiesen

wurde (Gerbal-Chaloin et al., 2001; Hukkanen, 2000; Zhu-Ge et al., 2002), sind mit heterolog

exprimiertem CYP 2C18-Protein einige Substrate identifiziert worden, die CYP 2C18 als Mitglied

der CYP 2C-Subfamilie metabolisiert und die meist auch von den anderen Isoformen

verstoffwechselt werden. Hierzu zählen Tolbutamid (Hukkanen, 2000; Zhu-Ge et al., 2002),

Sulfaphenazolderivate (Ha-Duong et al., 2001), Bisphenol A (Niwa et al., 2001), all-trans-

Retinolsäure (Marill et al., 1999), Diclofenac (Mancy et al., 1996; Bort et al., 1999) und Omeprazol

(Hukkanen, 2000; Karam et al., 1996).

Das ebenfalls zahlreiche Arzneistoffe metabolisierende CYP 2D6-Protein ist durch eine große

interindividuelle Variabilität in der metabolischen Aktivität gekennzeichnet (Charlier et al., 2003;

Endrizzi et al., 2002; Muller et al., 2003). Begründet wird dies durch genetische Polymorphismen,

die zu unterschiedlichen Metabolisierungs-Typen führen. Der Nachweis von CYP 2D6-Transkripten

kann dabei durch Amplifikate der Pseudogene CYP 2D7P und CYP 2D8P behindert werden

(Endrizzi et al., 2002). Das Fehlen einer spezifischen Bande in Höhe der zu erwartenden 332 bp und

das Auftreten mehrerer größerer Fragmente in meinen Untersuchungen könnte auf diese Weise

erklärt werden (siehe Abbildung 20 auf Seite 51).

Mit Ausnahme dreier Nicht-Raucher war das in der Leber durch Alkohole induzierbare CYP 2E1

bei allen Spendern nachweisbar. Da über den Alkoholkonsum der getesteten Personen nichts

bekannt ist, kann somit auch die Frage nach der Induzierbarkeit von CYP 2E1 in der

respiratorischen Nasenschleimhaut nicht beantwortet werden. Während Mace et al. (1998)

berichten, dass CYP 2E1 in nur 50 % der untersuchten Lungenproben exprimiert ist, konnte in der

menschlichen Nasenschleimhaut CYP 2E1 bei 86% der Spender nachgewiesen werden (19 von 22

4. Diskussion 79

Patienten). Unterschiede in der CYP 2E1-Expression zwischen Rauchern und Nicht-Rauchern bzw.

Männern und Frauen konnten nicht festgestellt werden.

Die CYP 2F-Subfamilie ist durch wenige Isoformen charakterisiert und wird selektiv in der Lunge

und nur gering bis gar nicht in der Leber exprimiert (Carr et al., 2003; Chen et al., 2002; Ding and

Kaminsky, 2002, Nishimura et al., 2003). Mit Ausnahme einer Nicht-Raucherin konnte CYP 2F1 in

der respiratorischen Nasenschleimhaut bei allen Probanden nachgewiesen werden, während nach 33

Amplifikationszyklen CYP 2F1-Transkripte in der Leber nicht detektierbar waren. Meine

Untersuchungen belegen somit, dass es sich bei CYP 2F1 tatsächlich um ein überwiegend in

respiratorischen Geweben exprimiertes Cytochrom P450 handelt. Da CYP 2F1 eine ganze Reihe

luftgetragener Verbindungen, besonders jene aus dem Zigarettenrauch (Chen et al., 2002), zu

reaktiven und potentiell pneumotoxischen Metaboliten aktiviert (Chen et al., 2002; Carr et al.,

2003), ist zu vermuten, dass diese reaktiven Metaboliten auch in der menschlichen respiratorischen

Nasenschleimhaut gebildet werden, da die Nasenschleimhaut im Rahmen der In- und Exspiration

ebenfalls mit luftgetragenen Substanzen in Kontakt kommt.

Das abundant in cardiovasculären Geweben exprimierte und am Arachidonsäure- sowie

Linolsäuremetabolismus beteiligte CYP 2J2 (King et al., 2002; Yang et al., 2001) konnte auch in der

untersuchten menschlichen Nasenschleimhaut nachgewiesen werden. Männer waren dabei durch eine

stärkere Expression als Frauen charakterisiert (p<0,004). Auch in der menschlichen Lunge wird

CYP 2J2 exprimiert (Zeldin et al., 1996). Der Einfluss des Geschlechts auf die CYP 2J2-Expression

in der Lunge ist jedoch unbekannt.

Das erst im Jahr 2002 entdeckte CYP 2S1 ist innerhalb der CYP 2-Familie eng mit CYP 2A6,

2A13 und 2B6 verwandt (Rivera et al., 2002) und zeigt hohe Expressionsraten in Trachea, Lunge,

Magen, Dünndarm und Milz (Rylander et al., 2001). In der menschlichen alveolarepithelialen

Lungenzelllinie A549 konnte CYP 2S1 durch 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-Dioxin (TCDD)

induziert werden. Daher vermuten Rivera et al. (2002), dass dieses Enzym eine bedeutende Rolle im

Karzinogenmetabolismus der Lunge spielt. Meine Untersuchungen belegen, dass CYP 2S1 auch in

der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut exprimiert wird. Dabei könnte die beobachtete

Enzyminduktion bei Rauchern (p<0,05) als erwartete Antwort auf die Zigarettenrauchexposition

interpretiert werden und steht damit in Einklang mit den Beobachtungen von Rivera et al. (2002).

Interessanterweise war die CYP 2S1-Induktion nur bei weiblichen Rauchern statistisch signifikant

(p<0,03).

4. Diskussion 80

Aus der CYP 3A-Subfamilie, deren Mitglieder etwa die Hälfte aller gebräuchlichen Arzneistoffe

metabolisieren (De Luca et al., 2001; Hukkanen, 2000), wurden die Isoformen CYP 3A4, 3A5 und

3A7 untersucht. Erwartungsgemäß konnte Amplifikate der fetalen Form, CYP 3A7, weder in der

Leber, noch in der Nasenschleimhaut nachgewiesen werden, was den Untersuchungen von Anttila et

al. (1997) an der menschlichen Lunge entspricht. Dagegen war CYP 3A4, welches zwischen 30 –

40 % (Hukkanen, 2000) und 60 % (De Luca et al., 2001) des Gesamtcytochromgehaltes der Leber

ausmacht, nicht nur in der Leber, sondern auch in 20 der 22 Nasenschleimhautproben exprimiert.

CYP 3A5, die Haupt-CYP 3A-Form der Lunge (Anttila et al., 1997; Hukkanen et al., 2003), war

bei insgesamt 19 Patienten nachweisbar. Allerdings waren für den mRNA-Nachweis 39 (CYP 3A4)

bzw. 38 (CYP 3A5) Amplifikationszyklen notwenig, so dass erneut die Frage nach der

physiologischen Bedeutung derartig geringer mRNA-Mengen aufkommt (Koskela et al., 1997),

zumal auch im ergänzenden Western blot weder CYP 3A4-, noch 3A5-Protein nachgewiesen

wurde. Vergleicht man die benötigte Anzahl an Zyklen, so scheint in nasalem respiratorischen

Gewebe CYP 3A5 die stärker exprimierte Form zu sein. Dies entspricht den Untersuchungen an

pulmonalem respiratorischen Gewebe. Dort konnten Anttila et al. (1997) CYP 3A4- in nur 20 %

der Proben und CYP 3A5-mRNA in allen Proben nachweisen. Die Beobachtung von Hukkanen et

al. (2003), dass Rauchen zu einer verminderten CYP 3A5-Expression in der menschlichen Lunge

führt, konnte für die menschliche Nasenschleimhaut nicht bestätigt werden, steht aber in Einklang mit

Untersuchungen bronchialer Biopsien von Rauchern und Nicht-Rauchern (Borlak et al., 2004).

CYP 4B1, welches u.a. die ω-Hydroxylierung von Laurinsäure katalysiert (Imaoka et al., 2001),

war mit Ausnahme einer Nicht-Raucherin bei allen Patienten nachweisbar, nicht jedoch in der Leber.

Dies steht in Einklang mit den Untersuchungen von Nhamburo et al. (1989) und Nishimura et al.

(2003), die CYP 4B1-Transkripte nur in der menschlichen Lunge amplifizieren konnten.

Von den Flavinhaltigen Monooxygenasen (FMOs), welche bereits in der respiratorischen und

olfaktorischen Nasenschleimhaut von Ratten nachgewiesen wurden (Reed, 1993), ließen sich die

untersuchten Isoformen FMO 2, FMO 3 und FMO 5 bei allen Spendern detektieren. Dabei zeigte

nur FMO 2, bei der es sich um die Hauptform Flavinhaltiger Monooxygenasen in der Säugetierlunge

handelt (Dolphin et al., 1998; Krueger et al., 2002), einen statistisch signifikanten Unterschied

zwischen Rauchern und Nicht-Rauchern in Form einer verminderten Genexpression selektiv bei den

männlichen Rauchern. Dass der beobachtete Unterschied auch tatsächlich einen Einfluss auf den

4. Diskussion 81

Metabolismus von Arzneistoffen und anderen Xenobiotika ausübt, ist dabei aber unwahrscheinlich,

da FMO 2 für ein verkürztes und damit katalytisch inaktives Protein codiert (Dolphin et al., 1998;

Furnes et al, 2003; Whetstine et al., 2000). Das Fehlen von FMO 2-mRNA in der Leber ist zuvor

auch schon von Dolphin et al. (1998) berichtet worden.

Neben den Flavinhaltigen Monooxygenasen war in der menschlichen Nasenschleimhaut auch die

Epoxid-Hydrolase (EH) bei allen 22 Patienten nachweisbar, was die zuvor von Gervasi et al. (1991)

und Green et al. (2001) berichteten EH-Enzymaktivitäten in der menschlichen Nasenschleimhaut

bestätigt. Auch bei der Ratte (Bond, 1983; Faller et al., 2001), bei der Maus (Reed, 1993) und

beim Hund (Bond et al., 1988) konnten EH-Aktivitäten in der Nasenschleimhaut gezeigt werden,

ebenso wie in der menschlichen Lunge (Faller et al., 2001). Im pulmonalen Gewebe wurde dabei

kein Unterschied in der EH-Expression zwischen Rauchern und Nicht-Rauchern festgestellt (Willey

et al., 1997). Dies entspricht wiederum meinen Beobachtungen an nasalem Gewebe des Menschen.

Reaktive Epoxide, die auch aus einigen polyzyklischen aromatischen Hydrocarbonen (PAHs) des

Zigarettenrauchs gebildet werden können und die sich als potente Karzinogene erwiesen haben

(Hecht, 2002; Hukkanen et al., 2000; Rubin, 2001), können durch die Epoxid-Hydrolase in weniger

reaktive und leichter konjugierbare Metaboliten hydrolysiert werden, die somit leichter eleminierbar

sind (Seidegard and Ekstrom, 1997). Über diese detoxifizierende Wirkung der Epoxid-Hydrolase

besitzt die respiratorische Nasenschleimhaut des Menschen zumindest gegenüber einigen im

Zigarettenrauch enthaltenen Prokarzinogenen einen Schutzmechanismus.

Darüber hinaus konnten in der respiratorischen Nasenschleimhaut verschiedene Isoformen der

Glutathion S-Transferase nachgewiesen werden. Bereits zuvor hatten Aceto et al. (1989), Gervasi et

al. (1991), Green et al. (2001) und Krishna et al. (1995) das Vorhandensein dieser Enzymfamilie in

der menschlichen Nasenschleimhaut metabolisch bzw. immunhistochemisch nachgewiesen. Die von

Krishna et al. (1995) gemachte Beobachtung einer geschlechtsabhängigen GST α-Expression in der

Regio olfactoria, nicht jedoch in der Regio respiratoria konnte in meinen Untersuchungen für die

respiratorische Nasenschleimhaut bestätigt werden. Interessanterweise war dabei aber eine

geschlechtsabhängige Reaktion auf das Rauchen zu beobachten. So wies die Gruppe der Raucher

insgesamt geringere GST α2-Transkriptmengen auf. Bei Betrachtung der Geschlechter zeigte sich

jedoch, dass dieser Unterschied nur bei den männlichen Personen statistische Signifikanz erlangte

(p<0,002). Da die GST α2 über die Konjugation reaktiver Phase I-Metaboliten detoxifizierend und

somit zytoprotektiv wirkt (Dreij et al., 2002; Pietsch et al., 2003; Turesky et al., 2003), kann

4. Diskussion 82

vermutet werden, dass – verminderter Proteingehalt und verminderte metabolische Aktivität

vorausgesetzt - Raucher schlechter vor derartigen Substanzen geschützt sind. Da sich die GST α2

darüber hinaus als aktiv gegenüber einigen Kanzerogenen, die aus den Inhaltstoffen des

Zigarettenrauchs gebildet werden, erwiesen hat (Dreij et al., 2002), kann zusätzlich angenommen

werden, dass Raucher ein erhöhtes Risiko nasaler Tumoren besitzen. Hinweise über den

Zusammenhang zwischen Zigarettenkonsum und Tumoren der Nasenschleimhaut sind zumindest

zahlreich gegeben (Benninger, 1999; Ding and Kaminsky, 2002; Feron et al., 2001; Hildesheim et

al., 2001; Talmi et al., 2002).

Die Uridindiphosphat-Glucuronyl-Transferase 1A1 (UGT 1A1) konnte auch bei einer maximalen

Zahl von 39 Amplifikationszyklen nur bei sechs Patienten nachgewiesen werden, wobei die

ermittelten durchschnittlichen Lichtwerte dieser sechs Amplifikate nur 7,3 % vom Lichtwert der

Positivkontrolle (humane Leber) betrugen. Dies erklärt die fehlende UGT-Aktivität in der

menschlichen Nasenschleimhaut bei Gervasi et al. (1991) unter Verwendung von 1-Naphthol, einem

spezifischen UGT 1A1-Substrat (Dean et al., 2002). Die Beobachtung, dass mit 39

Amplifikationszyklen teilweise Transkripte nachgewiesen werden konnten, dies aber zu keiner

messbaren metabolischen Aktivität führt, stützt wiederum die These von Koskela et al. (1999), dass

gering exprimierte Gene physiologisch weniger von Bedeutung sind.

Im Gegensatz zu UGT 1A1 war die auch als olfaktorische UGT bezeichnete UGT 2A1 (Jedlitschky

et al., 1999) bei sämtlichen Spendern in der respiratorischen Nasenschleimhaut exprimiert, nicht

jedoch in der Positivkontrolle (humane Leber). Das Fehlen von UGT 2A1-Transkripten in der

menschlichen Leber hatten zuvor auch schon Jedlitschky et al. (1999) beobachtet. Mit diesen

Untersuchungen konnte zusätzlich zur bekannten UGT 2A1-Expression in der Regio olfactoria

(Jedlitschky et al., 1999) diese Expression nun erstmalig auch in der Regio respiratoria der

menschlichen Nasenschleimhaut gezeigt werden, weshalb die Bezeichnung olfaktorische UGT nicht

mehr korrekt erscheint.

Da die transkriptionelle Regulation der oben genannten Enzyme u.a. über Transkriptionsfaktoren und

nukleäre Rezeptoren erfolgt, wurde die Genexpression von AhR, CAR β , LXR α, PXR, PPAR α

und PPAR γ mituntersucht. Wenngleich zum Verständnis der Regulationsmechanismen

weitergehende Untersuchungen notwendig sind, können die ermittelten Expressionen regulatorischer

Transkriptionsfaktoren einen Beitrag zum verbesserten Verständnis der hier beobachteten

4. Diskussion 83

Genexpressionsprofile liefern. Da für die nasalen Schleimhäute der Ratte gewebsspezifische

Regulationsmechanismen postuliert werden (Bereziat et al., 1995; Longo and Ingelman-Sundberg,

1993; Longo et al., 2000; Wardlaw et al., 1998) und sich dies auch beim Menschen abzeichnet

(Carayol et al., 2002), sollten die für andere Gewebe bekannten Regulationsmechanismen nicht

unkritisch auf die menschliche Nasenschleimhaut übertragen werden.

Bei weiblichen Spendern war der Pregnenolone X Rezeptor (PXR) signifikant stärker exprimiert als

bei männlichen (p<0,005). Geschlechtsabhängige Unterschiede in der Genexpression wurden mit

Ausnahme von CYP 2J2 jedoch bei keinem der untersuchten Enzyme beobachtet.

Interessanterweise war bei männlichen Patienten CYP 2J2-mRNA signifikant erhöht. Der

geschlechtsspezifische Unterschied zwischen PXR und CYP 2J2 konnte jedoch durch Korrelation

der Genexpressionsbefunde nicht erklärt werden. PXR ist ein wichtiger Faktor für die Regulation der

Cytochrome der 3A-Subfamilie (Hukkanen, 2000; Kliewer et al., 1999; Waxman, 1999) sowie der

Cytochrome 2C8 und 2C9 (Hukkanen, 2000). Auch hier war keine Übereinstimmung im

Expressionsprofil mit genannten Targetgenen feststellbar.

Die PPARs spielen eine wichtige Rolle in der Karzinogenese (Cajaraville et al., 2003; Valles et al.,

2003; Vanden Heuvel et al., 2003). Es ist daher nicht verwunderlich, dass PPAR γ bei Rauchern

induziert war.

Bestandteil der transkriptorischen Regulation der CYP 1-Familienmitglieder ist der Aryl

hydrocarbon-Rezeptor (Hukkanen, 2000; Seubert et al., 2002; Waxman, 1999), dessen

Expression in der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut erstaunlicherweise erheblich von

den Expressionen der Mitglieder der CYP 1-Familie abwich. Während die Genexpression des Ah-

Rezeptors unabhängig von der Zigarettenrauchexposition war, wurde CYP 1A1 bei 60 % der

Raucher exprimiert, CYP 1A2 dagegen überhaupt nicht. CYP 1B1 wiederum war bei Rauchern

hoch signifikant (p<0,00006) induziert. Gewebsspezifische Regulationsmechanismen, wie sie bereits

bei der Ratte beobachtet wurden (Bereziat et al., 1995; Longo and Ingelman-Sundberg, 1993;

Longo et al., 2000; Wardlaw et al., 1998), scheinen somit auch auf die menschliche

Nasenschleimhaut übertragbar zu sein.

Um herauszufinden, ob die beobachteten Unterschiede in der Genexpression zwischen Rauchern und

Nicht-Rauchern bei CYP 1A1, CYP 1B1, CYP 2S1, FMO 2, GST α2 und PPAR γ mit

4. Diskussion 84

entzündlichen Schleimhautveränderungen zusammenhängen, wurden die als Entzündungsmediatoren

bekannten Cytokine IL-1β (Grellner, 2002; Haspolat et al., 2002; Jones et al., 2003; Ruan et al.,

2003), IL-6 (Grellner, 2002; Jones et al., 2003), IL-8 (Beeh et al., 2003; Jones et al., 2003) und

TNF α (Grellner, 2002; Haspolat et al., 2002; Jones et al., 2003) in die Untersuchungen

miteinbezogen. Bei allen Patienten waren die Entzündungsmediatoren in unterschiedlicher

Ausprägung exprimiert, was aufgrund des medizinischen Vorberichts (chronische Entzündung bzw.

allergische Rhinitis) auch zu erwarten war. Signifikante Unterschiede zwischen Rauchern und Nicht-

Rauchern konnten jedoch bei keinem der Cytokine in der menschlichen Nasenschleimhaut

nachgewiesen werden, weshalb auch nicht von entzündungsbedingten Unterschieden in der

Expression genannter Gene auszugehen ist.

4.3 Nachweisbares Protein

In der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut ließ sich mittels Western blot nur Protein der

CYP 2A-Subfamilie nachweisen, jedoch kein CYP 1A1-, 2B6-, 2E1-, 3A4- oder 3A5-Protein.

Dies bestätigt frühere Beobachtungen, wonach die CYP 2A-Enzyme in den Nasenschleimhäuten

verschiedener Spezies stark exprimiert sind, weshalb ihnen eine Schlüsselrolle im Metabolismus

zahlreicher Xenobiotika innerhalb der Nasenschleimhaut zugesprochen wird (Bereziat et al., 1995;

Ding and Coon, 1989; Ding and Coon, 1990; Putt et al., 1995; Su et al., 1996). Bereits 1993

konnten Getchell et al. mittels immunhistochemischer Untersuchungen große Mengen eines CYP 2A-

verwandten Proteins in der menschlichen Nasenschleimhaut der Regio respiratoria sowie der Regio

olfactoria nachweisen. Eine eindeutige Differenzierung der Proteine CYP 2A6 und 2A13 war und

ist jedoch nicht möglich, da aufgrund der hohen Aminosäurehomologie von 95,4 % spezifische

Antikörper nicht verfügbar sind (Ding and Kaminsky, 2002; Su et al., 2000).

Da es keine weiteren publizierten Daten zur CYP-Proteinexpression in der menschlichen

Nasenschleimhaut gibt, werden nachfolgend meine Ergebnisse mit tierexperimentell gewonnenen

Daten verglichen. So konnten Bereziat et al. (1995) ein CYP 2A-immunreaktives Protein in der

Nasenschleimhaut der Ratte detektieren, jedoch kein CYP 2E1- oder CYP 3A4-Protein. Wardlaw

4. Diskussion 85

et al. (1998) konnten nach Zigarettenrauchexposition eine CYP 1A1-Induktion bei exponierten

Ratten nachweisen, jedoch war kein CYP 1A1-Protein in den Kontrollen (nicht exponierte Tiere)

detektierbar. CYP 2B1/2-Protein war bei exponierten wie nicht exponierten Ratten vorhanden.

Auch in ergänzenden immunhistochemischen Untersuchungen konnte kein CYP 3A-Protein

nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu berichteten Longo et al. (2000) neben der Expression

von CYP 2A-, auch die Expression von CYP 2B-, 2C-, 2G1- sowie 3A-Protein in der

Nasenschleimhaut der Ratte, wobei aus dem Versuchsaufbau nicht genau hervorgeht, ob es sich um

respiratorisches oder olfaktorisches Nasenschleimhautgewebe handelte. Die Tatsache, dass auch

CYP 2G1-Protein nachgewiesen wurde, lässt aber darauf schließen, dass Nasenschleimhaut der

Regio olfactoria untersucht wurde, da CYP 2G1 selektiv in olfaktorischem Gewebe exprimiert wird

(Longo et al., 2000).

Die in der vorliegenden Doktorarbeit für die menschliche respiratorische Nasenschleimhaut

gewonnenen Daten sind somit mit den Ergebnissen von Bereziat et al. (1995) für die Ratte

vergleichbar. Übereinstimmend mit den Ergebnissen von Wardlaw et al. (1998) konnte kein CYP

3A-immunreaktives Protein nachgewiesen werden, ebenso kein CYP 1A1-Protein bei den Nicht-

Rauchern. Die Expression von CYP 2B-Protein ebenso wie die Expression von CYP 1A1-Protein

bei den Zigarettenrauch exponierten Tieren in den Versuchen von Wardlaw et al. (1998)

unterscheidet sich von meinen Beobachtungen an der menschlichen Nasenschleimhaut. Bezüglich des

CYP 1A1 bleibt zu bemerken, dass mittels der hoch sensitiven RT-PCR bei keinem der Nicht-

Raucher CYP 1A1-Transkripte nachgewiesen wurden, weshalb CYP 1A1-Protein in den

Nasenmuschelpools der Nicht-Raucher auch nicht zu erwarten war. Dagegen war CYP 1A1 bei

insgesamt 60 % der Raucher exprimiert, wobei die gemessenen Lichtintensitäten deutlich unterhalb

der Positivkontrolle (humane Leber) lagen. Da aufgrund der geringen Gewebemengen und des damit

verbundenen geringen Proteingehaltes der einzelnen Resektate die Nasenmuscheln mehrerer

Patienten gepoolt werden mussten, wäre es durchaus denkbar, dass die auf den Gesamtpool

bezogene nur partielle CYP 1A1-Expression und die daraus resultierende partielle CYP 1A1-

Translation zu gering ist, um im Western blot detektiert werden zu können und somit der verwendete

Western blot für den CYP 1A1-Nachweis in der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut

nicht sensitiv genug ist.

4. Diskussion 86

4.4 Metabolische Aktivität

Neben der Gen- und Proteinexpression wurde auch die Enzymaktivität der menschlichen

respiratorischen Nasenschleimhaut untersucht. Hierzu wurden mikrosomale Membranen mit den

Substraten Loteprednol-Etabonat, Testosteron und Ethoxyresorufin inkubiert. Nach Inkubation

gepoolter Nasenmuschelmikrosomen mit Loteprednol-Etabonat konnte nur eine geringfügige

Loteprednol-Verstoffwechselung ermittelt werden. M 8 stellte dabei den Hauptmetaboliten dar.

Da keine Untersuchungen zur Verstoffwechselung des bislang nur ophthalmologisch zugelassenen

Loteprednol-Etabonates in extraokulären Geweben beim Menschen existieren, sind lediglich

Vergleiche mit den Ergebnissen einer hausinternen Studie möglich (Metabolism Studies with

Loteprednol etabonate, 2003), in deren Rahmen auch Inkubationen mit rekonstituierten

Enzymsystemen durchgeführt wurden. CYP 3A4, eines der Haupt-Cytochrome der Leber (De Luka

et al., 2001; Hukkanen, 2000), war dabei maßgeblich für die Biotransformation des Loteprednols

verantwortlich.

In den vorausgegangen proteinanalytischen Untersuchungen war in der menschlichen

Nasenschleimhaut nur Protein der CYP 2A-Subfamilie nachweisbar, wobei aufgrund der fehlenden

Verfügbarkeit spezifischer Antikörper (Ding and Kaminsky, 2002; Su et al., 2000) eine

Unterscheidung von CYP 2A6 und 2A13 nicht möglich war. In den Experimenten mit

rekonstituiertem und funktionell aktivem CYP 2A6 war keine nennenswerte Metabolisierung des

Loteprednols zu beobachten (Metabolism Studies with Loteprednol etabonate, 2003), wobei das

entstehende Metabolitenprofil dem der Inkubationen mit Nasenmuschelmikrosomen ähnelte.

Insgesamt betrachtet korreliert die deutliche metabolische Umsetzung des Loteprednols in den

verwendeten Positivkontrollen (Lebermikrosomen der Ratte und des Menschen) mit den Daten

durch separate Inkubation mit CYP 3A4, dem Haupt-Cytochrom der Leber. Ebenso stimmt die nur

geringe Loteprednolverstoffwechselung durch menschliche nasale Mikrosomen mit den

Beobachtungen überein, dass in der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut nur Protein der

CYP 2A-Subfamilie detektierbar war und dass dessen Mitglied CYP 2A6 in den Untersuchungen

mit Supersomen gegenüber Loteprednol nur geringe Aktivitäten zeigte.

4. Diskussion 87

Bei der Betrachtung der Ergebnisse des 2. Versuchsabschnittes (mit Zugabe von

Ammoniumacetatpuffer) fällt zunächst auf, dass das Substrat Loteprednol-Etabonat insgesamt sehr

viel stärker zerfällt als im 1. Versuchsabschnitt (ohne Zugabe von Ammoniumacetatpuffer). So liegt

der relative Anteil des verbleibenden Loteprednols in den Negativkontrollen des 2. Abschnittes um

durchschnittlich 21,7 % niedriger als in den Negativkontrollen des 1. Abschnittes. Wenngleich die

Zugabe von Ammoniumacetatpuffer (200 mM, pH 4,5) für den β-Glucuronidase-Verdau notwendig

ist, scheint dessen Zusatz zu einer Instabilität des Loteprednols zu führen. Darüber hinaus sind die

deutlich schwankenden Werte zwischen den beiden Negativkontrollen des 2. Abschnittes auffällig,

weshalb die Daten dieses Abschnittes insgesamt nur qualitativ betrachtet werden.

Im 2. Versuchsabschnitt wurde zum Nachweis möglicher Glucuronide ein zusätzlicher

Glucuronidase-Verdau durchgeführt. Durch Zugabe des Enzyms β-Glucuronidase sollte die

Abspaltung des Glucuronsäure-Restes erzielt werden, womit der Nachweis der Glucuronidierung

erbracht wird. Der einzige Metabolit, der in den Inkubaten ohne Glucuronidase-Zusatz auftrat, war –

wie im 1. Versuchsabschnitt – M 8, der wiederum nur in einem Pool (Pool 15) oberhalb der

Negativkontrolle lag. Somit stellt M 8 bei Pool 15 den einzigen Metaboliten dar, von dem eine

Glucuronidierung hätte nachgewiesen werden können. Interessanterweise wurde nach

Glucuronidase-Verdau auch nur bei Pool 15 (W-R) ein weiterer Metabolit detektiert. Dabei

handelte es sich um einen neuen, bislang unidentifizierten Metaboliten mit einer relativen

Retentionszeit von 0,19. Dies lässt auf eine Glucuronidierung von M 8 schließen.

Darüber hinaus war auffällig, dass M 8 in den Inkubaten mit Glucuronidase-Zusatz gegenüber der

Negativkontrolle erhöht erschien. Betrachtet man dagegen die Metabolitenprofils der einzelnen

Nasenmuschelpools mit und ohne Enzymzusatz unabhängig von der jeweiligen Negativkontrolle, so

ist kaum ein Unterschied erkennbar. Dafür weist die Negativkontrolle mit Glucuronidase-Zusatz

deutlich geringere Mengen an Zerfallsprodukten auf, die nicht erklärbar sind. Korrigiert man nun die

absoluten M 8-Anteile der Organpools um die jeweilige Negativkontrolle, erscheint M 8 in den

Inkubaten mit Enzymzusatz erhöht. Die Überprüfung der Ergebnisse des 2. Versuchsabschnittes war

jedoch nicht möglich, da keine weiteren Mikrosomen menschlicher Nasenschleimhaut zur Verfügung

standen und die Gewinnung des Materials ausgesprochen schwierig und langwierig ist.

Zusätzlich wurden Metabolismusuntersuchungen mit dem endogenen Steroid Testosteron

durchgeführt. Betrachtet man die relativen Anteile des verbleibenden Testosterons in den

4. Diskussion 88

Nasenmuschelpools und in der Negativkontrolle, so scheint so gut wie keine Verstoffwechselung des

Testosterons stattzufinden. Zieht man jedoch die geringe Verschiebung des Metabolitenprofils

gegenüber der Negativkontrolle in Betracht, so dürfte zumindest von einem geringen Testosteron-

Metabolismus auszugehen sein. So lagen nach 120-minütiger Inkubation der mikrosomalen

Organpools mit 50 µM Testosteron alle untersuchten Testosteronmetaboliten jeweils unter 0,5 % des

metabolischen Gesamtprofils. Oberhalb der Negativkontrolle befanden sich dabei Androstendion mit

0,37 % sowie in Spuren 6α-Hydroxytestosteron und 7α-Hydroxytestosteron.

7α-Hydroxytestosteron war dabei der einzige Metabolit, der weder in der Negativ-, noch in der

Positivkontrolle (humane Leber) detektierbar war. Dagegen war er in äußerst geringen Mengen in

allen Nasenmuschelinkubaten nachweisbar. Somit scheint es sich um einen Metaboliten zu handeln,

der durch menschliche nasale Enzyme gebildet wird, welche nicht parallel auch in der Leber

vorhanden sind. Inwieweit der Testosteronmetabolit durch die Cytochrome 2A13 und 2S1 gebildet

wird, muss noch weitergehend untersucht werden.

Für den Menschen ist über den Metabolismus von Testosteron in der respiratorischen

Nasenschleimhaut nichts bekannt. Dagegen wurden beim Rind in der Regio respiratoria insgesamt

acht Testosteronmetaboliten nachgewiesen, wobei die Testosteronoxidationsrate um insgesamt etwa

15 % niedriger als in der Regio olfactoria lag (Longo et al., 1991). Mit heterolog exprimiertem

CYP 2A verschiedener Spezies wurden unterschiedliche Beobachtungen hinsichtlich der

Verstoffwechselung von Testosteron gemacht. So wurden beim Kaninchen sowohl mit gereinigtem

mikrosomalem nasalem NMa (entspricht CYP 2A10/11), als auch mit rekombinantem CYP 2A10

und 2A11 neben Androstendion noch 3 weitere, nicht näher charakterisierte Testosteronmetaboliten

X1, X2 und X3 detektiert (Peng et al., 1993), während bei der Ratte mit heterolog exprimiertem

CYP 2A3 insgesamt 15 verschiedene α-Hydroxytestosteronmetaboliten nachgewiesen wurden (Liu

et al., 1996). Dagegen zeigte heterolog exprimiertes humanes CYP 2A6, welches homolog zu CYP

2A10/11 des Kaninchens und zu CYP 2A3 der Ratte ist (Ding et al., 1994; Peng et al., 1993),

keine Aktivität gegenüber Testosteron (Liu et al., 1996). Dies könnte wiederum die geringe

Testosteronoxidationsrate menschlicher respiratorischer Nasenschleimhaut im Gegensatz zur

vergleichsweise hohen Aktivität bei anderen Spezies (Ding and Coon, 1990; Longo et al., 1991)

erklären, da CYP 2A-Protein in meinen Untersuchungen das einzige Cytochrom war, welches sich

auch auf Proteinebene nachweisen ließ. Wie bereits zuvor erwähnt, war aufgrund der fehlenden

4. Diskussion 89

Verfügbarkeit spezifischer Antikörper (Ding and Kaminsky, 2002; Su et al., 2000) eine

Unterscheidung von CYP 2A6 und 2A13 nicht möglich. Der Nachweis von CYP 2A13-

Transkripten in der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut (Koskela et al., 1999; Su et al.,

2000) in Kombination mit dem Nachweis der Funktionsfähigkeit von CYP 2A13 (Su et al., 2000)

könnte die Beobachtung erklären, dass trotz fehlender Aktivität von CYP 2A6 gegenüber

Testosteron eine – wenn auch nur geringe – Testosteronverstoffwechselung nachgewiesen werden

konnte.

Das CYP 1A1-Markersubstrat Ethoxyresorufin (Burke et al., 1994) wurde von keinem der

insgesamt fünf untersuchten Nasenmuschelpools (zwei Raucher- und drei Nicht-Raucher-Pools)

umgesetzt. Die fehlende EROD-Aktivität bei den Nicht-Rauchern war erwartungsgemäß, da bei den

Nicht-Rauchern in der respiratorischen Nasenschleimhaut weder CYP 1A1-Transkripte, noch CYP

1A1-Protein nachgewiesen werden konnte. Bei Rauchern war CYP 1A1 zwar in 60 % der Fälle

exprimiert, jedoch konnte kein CYP 1A1-Protein detektiert werden, was wiederum mit der

fehlenden Ethoxyresorufin-Verstoffwechselung übereinstimmt.

4.5 Schlussfolgerungen

Insgesamt betrachtet sind somit in der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut verschiedene

Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs) und weitere fremdstoffmetabolisierende Enzyme

exprimiert, wenngleich im Western blot nur CYP 2A-Protein nachgewiesen werden konnte und die

metabolische Aktivität gegenüber den getesteten Substraten Loteprednol-Etabonat (LE) und

Testosteron deutlich geringer als in der Leber war. Bei den durchgeführten in vitro-Versuchen konnte

gezeigt werden, dass der untersuchte Arzneistoff Loteprednol-Etabonat so gut wie keiner

Verstoffwechselung durch menschliche Nasenmuschelmikrosomen unterliegt. Folgerichtig erscheint

eine topische Applikation von Loteprednol-Etabonat mit keinem komplexen und in der menschlichen

respiratorischen Nasenschleimhaut ortsgebundenen Metabolismus verbunden zu sein, was zu

weiteren Untersuchungen ermutigt.

5. Zusammenfassung 90

5. Zusammenfassung

Daniela Rahmel

Genexpressions- und Metabolismusuntersuchungen der menschlichen respiratorischen

Nasenschleimhaut

Ziel dieser Arbeit war es, die menschliche respiratorische Nasenschleimhaut hinsichtlich ihrer

enzymatischen Ausstattung sowie metabolischen Kompetenz näher zu charakterisieren, wobei

schwerpunktmäßig die verschiedenen Isoformen des Cytochrom P450 Monooxygenasesystemes

(CYPs) untersucht wurden. Die respiratorische Nasenschleimhaut stammte dabei von Patienten, die

sich aufgrund einer Schleimhauthyperplasie einer partiellen Turbinektomie der unteren Nasenmuschel

unterzogen haben.

Mittels RT-PCR konnten zahlreiche Cytochrom P450 Monooxygenasen nachgewiesen werden,

darunter CYP 1A1, 1B1, 2A6/7, 2A13, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2E1, 2F1, 2J2, 2S1, 3A4,

3A5 und 4B1. Nicht detektierbar waren hingegen CYP 1A2, 2D6, 3A7 und 4A11. Darüber hinaus

konnte die Expression der Epoxid-Hydrolase (EH), der Flavinhaltigen Monooxygenasen 2, 3 und 5

(FMO 2, FMO 3 und FMO 5), der Glutathion-S-Transferasen α2, µ1 und ρ1 (GST α2, GST µ1

und GST ρ1) sowie der UDP-Glucuronyl-Transferase 2A1 (UGT 2A1) in der menschlichen

respiratorischen Nasenschleimhaut belegt werden. Rauchen führte zu einer verstärkten Expression

von CYP 1A1, 1B1 und 2S1, während GST α2 vermindert exprimiert wurde. Der Einfluss des

Geschlechts konnte nur für CYP 2J2 in Form einer stärkeren Expression bei männlichen Spendern

ermittelt werden. Mittels Western blot konnte immunreaktives CYP 2A-, nicht jedoch CYP 1A1-,

2B6-, 2E1-, 3A4- oder 3A5-Protein nachgewiesen werden. In den mikrosomalen Assays mit

Nasenmuschelpools wurde das CYP 1A-Substrat Ethoxyresorufin nicht umgesetzt, wohingegen

Testosteron und Loteprednol-Etabonat (LE) in geringem Umfang metabolisiert wurden.

Somit konnte für die menschliche respiratorische Nasenschleimhaut die Expression zahlreicher CYP-

Isoformen nachgewiesen werden, wenngleich nur CYP 2A-Protein translatiert erschien und die

metabolische Aktivität gegenüber Loteprednol-Etabonat und Testosteron deutlich geringer als in der

Leber ausfiel. Bei den durchgeführten in vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass der

untersuchte Arzneistoff Loteprednol-Etabonat so gut wie keiner Verstoffwechselung durch die

verwendeten menschlichen Nasenmuschelmikrosomen unterliegt, weshalb nach lokaler Applikation in

5. Zusammenfassung 91

der respiratorischen Nasenschleimhaut beim Menschen mit keinem nennenswerten metabolischen

Abbau zu rechnen ist.

6. Summary 92

6. Summary

Daniela Rahmel

Investigations of gene expression and metabolic activity of the human respiratory nasal

mucosa

The objective of this study was to characterize the expression of xenobiotic metabolizing enzymes as

well as the metabolic capacity of the human respiratory nasal mucosa. In particular, the various

isoforms of the cytochrome P450 monooxygenases (CYPs) were investigated. The respiratory nasal

mucosa samples were taken from patients who had undergone a partial turbinectomy of the lower

nasal concha after mucosal hyperplasia had been diagnosed.

Several cytochrome P450 monooxygenases could be identified using RT-PCR, including CYP 1A1,

1B1, 2A6/7, 2A13, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2E1, 2F1, 2J2, 2S1, 3A4, 3A5 and 4B1, albeit

at different expression levels. The enzymes CYP 1A2, 2D6, 3A7 and 4A11 were below the limit of

quantification. Furthermore, the expression of epoxide hydrolase (EH), the flavin containing

monooxygenases 2, 3 and 5 (FMO 2, FMO 3 and FMO 5), the glutathione-S-transferases α2, µ1

and ρ1 (GST α2, GST µ1 and GST ρ1) as well as the UDP-glucuronyltransferase 2A1 (UGT 2A1)

could be demonstrated in human respiratory nasal mucosa. Abundant expression of CYP 1A1, 1B1

and 2S1 was found in patients that smoked, while GST α2 was expressed at lower levels in these

patients. Male patients showed a higher expression level of CYP 2J2 than female patients, otherwise

no other sex-related differences were observed. Immune reactive CYP 2A protein was confirmed

by Western blot analysis, but not CYP 1A1, 2B6, 2E1, 3A4 or 3A5 protein. In microsomal assays

with pooled nasal concha, the CYP 1A substrate ethoxyresorufin was not metabolized, while

testosterone and loteprednol-etabonate (LE) were metabolized to a limited extent.

Thus, the expression of several CYP isoforms could be demonstrated in human respiratory nasal

mucosa, although only the CYP 2A protein appeared to be translated. The metabolic activities

shown for testosterone and loteprednol-etabonate were markedly lower in nasal mucosa than in the

liver. The drug loteprednol-etabonate was found to undergo only minimal metabolism in the

experiments conducted with human nasal microsomal preparations, and for this reason may be

suitable for therapy using local administration on the nasal mucosa in man.

7. Danksagung 93

7. Danksagung

Mein Dank gilt in erster Linie dem Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin der

Fraunhofer Gesellschaft, das durch die Bereitstellung der Räumlichkeiten, Geräte und Materialien die

Voraussetzung für diese Dissertation geschaffen hat.

Bei Herrn Prof. Dr. Borlak möchte ich mich für die wissenschaftliche Betreuung bedanken, ebenso

bei Herrn Prof. Dr. Otto, der freundlicherweise das Koreferat von Seiten der Tierärztlichen

Hochschule Hannover übernommen hat.

Prof. Dr. Lamm und Dr. Lamm sowie dem gesamten OP-Team des Friederiken-Stifts Hannover

danke ich für die Unterstützung beim Sammeln der Nasenmuscheln, ohne deren Hilfe dieses Projekt

nicht zustande gekommen wäre.

Bei allen technischen Assistenten der Abteilung bedanke ich mich dafür, dass sie mir stets mit Rat

und Tat zur Seite gestanden haben. Dies waren insbesondere Marlies und Antje, die mir beim

Sammeln der Nasenmuscheln geholfen haben, Rong und Kerstin, die mich in die Methodik der RT-

PCR eingewiesen haben, Andrea, die mir die Western blots näher gebracht hat, sowie Gitta, die mir

im Rahmen der metabolischen Assays bei der Durchführung und der anschließenden Auswertung

behilflich war.

Den Post-docs Thomas Thum, Tanja Hansen und Volker Zelinski möchte ich für die Unterstützung

bei der jeweiligen Versuchsplanung, -durchführung und -auswertung danken.

Herrn Dr. Holländer bin ich für die statistische Auswertung und seine ausführlichen Erläuterungen zu

Dank verpflichtet.

Prof. Dr. Richter danke ich für die Bereitstellung der Aufnahmen der histologischen Schnitte eines

Patienten mit allergischer Rhinitis.

Bei Frau Ockert möchte ich mich für die Hilfe bei der englischen Übersetzung bedanken.

Bei meinen Eltern bedanke ich mich für die moralische und finanzielle Unterstützung. Mein

besonderer Dank gilt dabei meinem Vater, der durch seine Sicht als Chemiker und durch die stets

sachlichen Diskussionen zur Klärung vieler Fragen beigetragen hat. Darüber hinaus möchte ich allen

meinen Freunden danken, die stets ein offenes Ohr für mich hatten und mich immer im richtigen

Moment wieder motiviert haben.

8. Literaturverzeichnis 94

8. Literaturverzeichnis

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9. Anhang I

9. Anhang

9.1 Daten der Patienten für die Genexpression Patient Geschlecht

( M / W ) Raucher ( R / NR )

Alter (Jahre)

Medikamente Allergien OP-Datum (OP-Ort)

W-R 1 W R ( 15 Zig. tgl. )

34 - Katzen 10.09.2002 (FS)

W-R 2 W R ( 3 Zig. tgl. )

20 - - 25.07.2002 (FS)

W-R 3 W R ( viele ) 39 Pille Nickel 09.07.2002 (FS)

W-R 4 W R ( 15-20 Zig. tgl. )

34 Ibuprofen, Levofloxacin, Pille

Gräser, Hausstaub, Katze

27.06.2002 (FS)

W-R 5 W R ( 20-25 Zig. tgl. )

56 Clirogest N1000, Dolormin extra, Togal, Atrex duo

- 12.06.2002 (MHH)

M-R 1 M R ( 3-4 Zig. tgl. )

36 - - 27.08.2002 (FS)

M-R 2 M R ( 3-4 Zig. tgl. )

30 Eutyrox 200 Nahrungsmittel 20.08.2002 (FS)

M-R 3 M R ( 50 Zig. tgl. )

45 - - 06.08.2002 (FS)

M-R 4 M R ( <15 Zig. tgl. )

28 - Heuschnupfen, Katzenhaare

25.07.2002 (FS)

M-R 5 M R ( 15 Zig. tgl. )

51 - Heuschnupfen 15.05.2002 (MHH)

W-NR 1 W NR 30 - - 05.09.2002 (FS)

W-NR 2 W NR 26 Nasonex, Vividrin, Aerius

Penicillin, Gräser, Pollen

18.07.2002 (FS)

W-NR 3 W NR 62 Augentropfen (Arteoptic)

Gräser 07.05.2002 (MHH)

W-NR 4 W NR 23 Pille Penicillin 07.05.2002 (MHH)

W-NR 5 W NR 19 - - 02.07.2002 (FS)

M-NR 1 M NR 47 Paracetamol - 10.09.2002 (FS)

M-NR 2 M NR 61 Vitamine, Prostata

- 05.09.2002 (FS)

M-NR 3 M NR 33 - - 03.09.2002 (FS)

M-NR 4 M NR 41 für Heuschnupfen Heuschnupfen 03.09.2002 (FS)

9. Anhang II

Patient Geschlecht ( M / W )

Raucher ( R / NR )

Alter (Jahre)


M-NR 5 M NR 20 - Hausstaub 03.09.2002 (FS)

M-NR 6 M NR 27 - Penicillin 17.09.2002 (FS)

M-NR 7 M NR 50 Bluthochdruck - 17.09.2002 (FS)

9.2 Daten der Patienten für die mikrosomalen Pools Pool Geschlecht

( M / W ) Raucher ( R / NR )

Alter (Jahre)


M NR 42 Sortis, Nexium Pollen 23.07.2002 (FS)

M NR 27 - Pollen 19.09.2002 (FS)

M NR 60 Bluthochdruck - 24.09.2002 (FS)

M NR 51 - Pflaster 01.10.2002 (FS)

1

M NR 16 - - 01.10.2002 (FS)

M NR 37 Antidepressivum - 09.07.2002 (FS)

M NR 34 - - 30.07.2002 (FS)

M NR 47 Paracetamol - 10.09.2002 (FS)

M NR 62 - Latex 12.09.2002 (FS)

2

M NR 27 - Penicillin 17.09.2002 (FS)

M NR 14 - - 12.06.2002 (MHH)

M NR 46 - - 18.06.2002 (FS)

M NR 62 - - 20.08.2002 (FS)

M NR 61 - - 27.08.2002 (FS)

M NR 53 - - 29.08.2002 (FS)

4

M NR 61 Vitamine, Prostata

- 05.09.2002 (FS)

9. Anhang III

Pool Geschlecht ( M / W )

Raucher ( R / NR )

Alter (Jahre)


M NR 14 - - 20.06.2002 (FS)

M NR 62 - - 27.06.2002 (FS)

M NR 52 - Jod 09.07.2002 (FS)

M NR 62 - - 25.07.2002 (FS)

M NR 62 - - 30.07.2002 (FS)

5

M NR 57 Sempocort, Oneep

Aspirin 20.08.2002 (FS)

W NR 62 Augentropfen (Arteoptic)

Gräser 07.05.2002 (MHH)

W NR 23 Pille Penicillin 07.05.2002 (MHH)

W NR 19 - - 02.07.2002 (FS)

W NR 30 - - 05.09.2002 (FS)

W NR 16 - Heuschnupfen 08.10.2002 (FS)

6

W NR 58 - Haselnuß 10.10.2002 (FS)

M R ( 15 Zig. tgl. )

51 - Heuschnupfen 15.05.2002 (MHH)

M R ( <15 Zig. tgl. )

28 - Heuschnupfen, Katzenhaare

25.07.2002 (FS)


45 - - 06.08.2002 (FS)

M R ( 3-4 Zig. tgl. )

30 Eutyrox 200 Nahrungsmittel 20.08.2002 (FS)

M R ( 3-4 Zig. tgl. )

36 - - 27.08.2002 (FS)

7

M R 31 - - 10.10.2002 (FS)

W R ( 20-25 Zig. tgl. )

56 Clirogest N1000, Dolormin extra (1-2 Tabl.), Togal (1-2 Tabl.), Atrex duo (1-2 Tabl.)

- 12.06.2002 (MHH)

W R ( 15-20 Zig. tgl. )

34 Ibuprofen, Levofloxacin, Pille

Gräser, Hausstaub, Katze

27.06.2002 (FS)

8

W R ( 3 Zig. tgl. )

20 - - 25.07.2002 (FS)

9. Anhang IV


Raucher ( R / NR )

Alter (Jahre)


M NR 55 Augensalbe - 27.06.2002 (FS)

M NR ( seit Dezember )

33 - - 30.07.2002 (FS)

M NR 44 - - 01.08.2002 (FS)

M NR 33 - - 03.09.2002 (FS)

M NR 53 - Pollen 15.10.2002 (FS)

M NR 63 Bluthochdruck Penicillin 17.10.2002 (FS)

M NR 36 - - 29.10.2002 (FS)

M NR 43 - - 29.10.2002 (FS)

M NR 32 - Pollen 05.11.2002 (FS)

M NR 55 Eupkylong Pflaster 05.11.2002 (FS)

M NR 55 - Penicillin 07.11.2002 (FS)

M NR 62 Bluthochdruck - 12.11.2002 (FS)

M NR 38 - - 19.11.2002 (FS)

9

M NR 59 Antiallergicum Tierhaare 19.11.2002 (FS)

M R ( 3-4 Zig. tgl. )

16 - Penicillin, Pollen

27.06.2002 (FS)

M R 31 - Hausstaub, Katzenhaare

15.10.2002 (FS)


29 - - 29.10.2002 (FS)


59 Asthma - 29.10.2002 (FS)


35 - - 05.11.2002 (FS)

10


52 Bluthochdruck - 05.11.2002 (FS)

W NR 30 Pille Penicillin 17.10.2002 (FS)

W NR 31 Antiallergicum Hausstaub 12.11.2002 (FS)

W NR 55 - - 14.11.2002 (FS)

11

W NR 20 - Penicillin 21.11.2002 (FS)

9. Anhang V


Raucher ( R / NR )

Alter (Jahre)


11 W NR 38 - - 26.11.2002 (FS)

M NR 58 - - 07.01.2003 (FS)

M NR 32 - - 14.01.2003 (FS)

M NR 45 - - 28.01.2003 (FS)

M NR 35 - - 28.01.2003 (FS)

M NR 56 Bluthochdruck Pollen 06.02.2003 (FS)

M NR 29 - Hausstaub, Milben

18.02.2003 (FS)

M NR 32 Allergie alles 20.02.2003 (FS)

M NR 42 - - 20.02.2003 (FS)

M NR 25 - Hausstaub 06.03.2003 (FS)

12

M NR 45 - Pollen, Getreide

06.03.2003 (FS)


29 - Pollen, Asthma

21.01.2003 (FS)

M R ( 1 Schachtel tgl. )

26 - - 28.01.2003 (FS)

M R (gelegentlichHasch )

22 - Pollen, Hausstaub, Tierhaare, Penicillin, Amoxycillin

06.02.2003 (FS)

M R ( 5-10 Zig. tgl. )

22 Pulmicord Pollen 11.02.2003 (FS)

M R ( Pfeife ) 41 - - 20.02.2003 (FS)

M R ( 1 Schachtel tgl. )

20 - - 11.03.2003 (FS)

13


35 - - 11.03.2003 (FS)

W NR 28 Pille Pflaster 14.01.2003 (FS)

W NR 66 Bluthochdruck, Diabetes

- 21.01.2003 (FS)

14

W NR 30 - Neurodermitis, Lokalanästhesie

21.01.2003 (FS)

9. Anhang VI


Raucher ( R / NR )

Alter (Jahre)


W NR 24 - - 23.01.2003 (FS)

W NR 42 - - 06.02.2003 (FS)

W NR 24 - Erdnuss 04.03.2003 (FS)

W NR 19 - - 04.03.2003 (FS)

W NR 72 Schilddrüse Pflaster, Jod

11.03.2003 (FS)

W NR 44 - Pflaster 13.03.2003 (FS)

14

W NR 27 - - 13.03.2003 (FS)

W R 24 Pille - 17.10.2002 (FS)

W R ( 10 – 15 Zig. tgl. )

41 - Wolle 14.11.2002 (FS)

W R ( 15 Zig. tgl. )

40 Schilddrüse Nickel 28.01.2003 (FS)


23 - Hausstaub, Milben

18.02.2003 (FS)

15


22 - - 11.03.2003 (FS)

W ? 24 Pille Penicillin 13.02.2003 (FS)

W ? 26 - - 13.02.2003 (FS)

W ? 32 L-Thyroxin - 13.02.2003 (FS)

16

W ? 62 Schilddrüse Pflaster, Wespen

18.02.2003 (FS)

Abkürzungen: M = männlich; NR = Nicht-Raucher; R = Raucher; tgl. = täglich; W = weiblich; Zig. = Zigaretten; ? = keine Angabe

9. Anhang VII

9.3 Liste der verwendeten Primer

Primer Annealing

Temperatur Zyklen Länge Sequenz Genbank

CyclophillinA 55°C 33 347 5ĆTTGCCATTCCTGGACCCAA 3´TTTCGTGCTCTGAGCACTGG

NM_021130

GAPDH 55°C 33 353 5´GGCCAAGGTCATCCATGA 3´TCAGTGTAGCCCAGGATG

NM_002046

CYP 1A1 58°C 36 432 5´TCACAGACAGCCTGATTGAG 3´GATGGGTTGACCCATAGCTT

NM_000499

CYP 1A2 55°C - 308 5´TGGCTTCTACATCCCCAAGAAAT 3´TTCATGGTCAGCCCGTAGAT

NM_000761

CYP 1B1 55°C 33 301 5´GCAGAATTGGATCAGGTCGT 3´TGGTCAGGTCCTTGTTGATG

NM_000104

CYP 2A6/7 55°C 36 1151 5´GTGTGGACATGATGCCGT 3ÁGGACTTGAGGCGGAAGT

NM_000762 (2A6) NM_000764 (2A7)

CYP 2A13 55°C 36 320 5ÁCAAAGAGTTCCTGTCACTG 3ĆCGCAAAGAAGAGGTTCAGG

NM_000766

CYP 2B6 55°C 33 357 5ĆCATACACAGAGGCAGTCAT 3´GGTGTCAGATCGATGTCTTC

NM_000767

CYP 2C8 58°C 39 311 5´GATCATGTAATTGGCAGACACA 3ĆCTGCTGAGAAAGGCATGAAG

NM_000770

CYP 2C9 58°C 39 437 5ÁGCTTGGAAAACACTGCAGT 3ĆCTGCTGAGAAAGGCATGAAG

NM_000771

CYP 2C18 55°C 33 431 5ĆTGTAACTGATATGTTTGGG 3ĆCTGCTGAGAAAGGCATGAAG

NM_000772

CYP 2C19 58°C 39 431 5´GTAATCACTGCAGCTGACTTAC 3ĆCTGCTGAGAAAGGCATGAAG

NM_000769

CYP 2D6 58°C 38 332 5´TGATGAGAACCTGCGCATAG 3ÁCCGATGACAGGTTGGTGAT

NM_000106

CYP 2E1 55°C 36 365 5ÁGCACAACTCTGAGATATGG 3ÁTAGTCACTGTACTTGAACT

NM_000773

CYP 2F1 55°C 33 283 5ÁTGAACTTGCCGCACCGCGT 3ÁCAGGCTCCACTTACGGTGC

NM_000774

CYP 2J2 55°C 33 389 5ĆCCACCAAACTCTCTTCAGC 3ĆATTCTCTGCACCTCATGGA

NM_000775

CYP 2S1 55°C 33 312 5ÁCCCCAACATCTTCAAGCAC 3´TTCATCTGGTCTGCGTGGT

NM_030622

CYP 3A4 55°C 39 324 5ĆCAAGCTATGCTCTTCACCG 3´TCAGGCTCCACTTACGGTGC

NM_017460

CYP 3A5 55°C 38 472 5´TGTCCAGCAGAAACTGCAAA 3´TTGAAGAAGTCCTTGCGTGTC

NM_000777

CYP 3A7 55°C - 475 5ĆTATGATACTGTGCTACAGT 3´TCAGGCTCCACTTACGGTCT

NM_000765

CYP 4A11 55°C - 280 5ĆAAGTGACCTCCCTGCTCAT 3ĆTGATCTCCCCAGAATCACC

NM_000778

9. Anhang VIII

Primer Annealing Temperatur

Zyklen Länge Sequenz Genbank

CYP 4B1 55°C 36 397 5´TGACCATGTGCATCAAAGGAG 3ÁAAGCCATTCTTGGAGCGCA

NM_000779

EH 55°C 33 227 5´TGATGAGGGAGAGCGGGCTAC 3´TCAGCAGGTCGTCCAGGGAG

NM_000120

FMO 2 55°C 35 250 5ĆTCCTATTAGTATCGCCTGGTGG 3´TACTGGATCCTGACAAGATAATA AAGCCCAAAG

NM_001460

FMO 3 55°C 33 301 5´GGCAGGGCTAGCATTTACAA 3´GATGTCCGGAACAAACCATT

NM_006894

FMO 5 55°C 35 500 5ĆTCTCAGTTTCATATTGCCCAG 3ÁCATTATTTCTCTTATCTCTCAGG

NM_001461

GST α2 55°C 36 354 5´GCCCAAGCTCCACTACTTCA 3´GCAAGCTTGGCATCTTTTTC

NM_000846

GST µ1 55°C 36 347 5´TTCCCAATCTGCCCTACTTG 3´GGGCTCAAATATACGGTGGA

NM_000561

GST ρ1 55°C 36 313 5ÁCCTCCGCTGCAAATACATC 3´GGGAGGTTCACGTACTCAGG

XM_040116

UGT 1A1 55°C 39 350 5´TAAGTGGCTACCCCAAAACG 3´TGTGCCTCATCACAAACTCC

NM_000463

UGT 2A1 55°C 36 297 5´TTGGCCAATGGAAGGTAGTC 3´TCCTGAGACACCATGTGGAA

XM_003547

AhR 55°C 33 284 5ĆAACATCACCTACGCCAGTC 3ÁGTTATCCTGGCCTCCGTTT

XM_165855

CAR β 55°C 39 350 5´GTCATGGCCAGTAGGGAAGA 3´GTCCGGATCAGCTCTTCTTG

NM_005122

LXR α 55°C 36 351 5´TCAACCCCATCTTCGAGTTC 3´GGGGACAGAACAGTCATTCG

U22662

PXR 55°C 36 351 5´TTGTTCGGCATCACAGGTAG 3´GGGATCTGAGGGATTTCTCC

AF061056

PPAR α 55°C 35 357 5ĆTGGAAGCTTTGGCTTTACG 3ĆGACAGAAAGGCACTTGTGA

NM_005036

PPAR γ 55°C 36 302 5´TGAAGGATGCAAGGGTTTCT 3´TCAGCGGGAAGGACTTTATG

L40904

IL-1β 55°C 36 294 5ĆTCCAGGGACAGGATATGGA 3´TTCTGCTTGAGAGGTGCTGA

NM_000576

IL-6 55°C 33 371 5ĆCTTCCAAAGATGGCTGAAA 3ĆATGCTACATTTGCCGAAGA

NM_000600

IL-8 55°C 33 391 5ÁGGGTTGCCAGATGCAATAC 3´GTGGATCCTGGCTAGCAGAC

NM_000584

TNFα 58°C 36 599 5´TCCCCAGGGACCTCTCTC 3ĆTCAGCTTGAGGGTTTGCTG

X02910

9. Anhang IX

9.4 Liste der verwendeten Primär- und Sekundärantikörper Primärantikörper Verdünnung Sekundärantikörper Verdünnung CYP 1A1 (Code MAb 1A3-03, rubitec GmbH, Bochum)

1 : 400 α-mouse (Code AP 160 P; Charge 20040081, Chemicon, Temecula, USA)

1 : 5.000

CYP 2A (Code sc-9896; Charge C280, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA)

1 : 100 α-sheep (Code AP 147 P; Charge 20021225, Chemicon, Temecula, USA)

1 : 10.000

CYP 2B6 (Code AB-1268; Charge 20120789, Chemicon, Temecula, USA)

1 : 4.000 α-sheep (Code AP 147 P; Charge 20021225, Chemicon, Temecula, USA)

1 : 10.000

CYP 2E1 (Code AB-1274; Charge 2210034, Chemicon, Temecula, USA)


1 : 10.000

CYP 3A4 (Code AB-1278; Charge 19101552, Chemicon, Temecula, USA)


1 : 10.000

CYP 3A5 (Code AB-1279; Charge 2103001, Chemicon, Temecula, USA)

1 : 1.000 α-rabbit (Code AP 132 P; Charge 20070556, Chemicon, Temecula, USA)

1 : 10.000

9. Anhang X

9.5 Agarosegele und graphische Darstellung der Genexpression CyclophillinA-Genexpression:

347 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung I: Cyclophillin A-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der Cyclophillin A-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)

Abkürzungen: bp = Basenpaare; LK = Leberkontrolle; M = männlich; NK = Negativ-Kontrolle; NR = Nicht-Raucher; R = Raucher; W = weiblich

LK NKW-R M-R

Ladder

347 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

Cyclophillin A-Genexpression:

Lichtwerte,gemessen an der

Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


Lichtwerte, gemessen an der


347 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung I: Cyclophillin A-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der Cyclophillin A-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

347 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XI

GAPDH-Genexpression:

353 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung II: GAPDH-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der GAPDH-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

353 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







353 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung II: GAPDH-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der GAPDH-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

353 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XII

CYP 1A1-Genexpression:

432 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung III: CYP 1A1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 1A1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

432 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







0

10.000

20.000

30.000

40.000

50.000

60.000

70.000

10.000

0

20.000

30.000

40.000

50.000

60.000

70.000

432 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung III: CYP 1A1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

432 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







0

10.000

20.000

30.000

40.000

50.000

60.000

70.000

10.000

0

20.000

30.000

40.000

50.000

60.000

70.000

9. Anhang XIII

CYP 1B1-Genexpression:

301 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung IV: CYP 1B1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 1B1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

301 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







301 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung IV: CYP 1B1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

301 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XIV

CYP 2A6/7-Genexpression:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

1151 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung V: CYP 2A6/7-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 2A6/7-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

1151 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

1151 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung V: CYP 2A6/7-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 2A6/7-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

1151 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

9. Anhang XV


320 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung VI: CYP 2A13-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

320 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

0

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

320 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung VI: CYP 2A13-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

320 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

0

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

9. Anhang XVI


357 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung VII: CYP 2B6-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

357 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







357 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung VII: CYP 2B6-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

357 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XVII

CYP 2C8-Genexpression:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

311 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung VIII: CYP 2C8-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 2C8-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

311 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

311 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung VIII: CYP 2C8-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

311 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XVIII


437 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung IX: CYP 2C9-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

437 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







437 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung IX: CYP 2C9-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

437 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XIX


1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

431 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung X: CYP 2C18-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

431 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

431 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung X: CYP 2C18-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

431 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XX


431 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XI: CYP 2C19-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

431 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







431 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XI: CYP 2C19-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

431 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XXI

CYP 2E1-Genexpression:

365 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XII: CYP 2E1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 2E1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

365 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







365 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XII: CYP 2E1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 2E1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

365 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XXII

CYP 2F1-Genexpression:

283 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XIII: CYP 2F1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 2F1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

283 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







0

20.000

60.000

40.000

80.000

100.000

120.000

0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

283 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XIII: CYP 2F1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 2F1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

283 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







0

20.000

60.000

40.000

80.000

100.000

120.000

0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

9. Anhang XXIII

CYP 2J2-Genexpression:

389 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XIV: CYP 2J2-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 2J2-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

389 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

40.000

30.000

20.000

10.000

0

40.000

30.000

20.000

10.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

CYP 2J2-Genexpression:L

ichtwerte,gemessen an der





50.000

60.000

70.000

50.000

60.000

70.000

389 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XIV: CYP 2J2-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 2J2-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

389 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

40.000

30.000

20.000

10.000

0

40.000

30.000

20.000

10.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







50.000

60.000

70.000

50.000

60.000

70.000

9. Anhang XXIV

CYP 2S1-Genexpression:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

312 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XV: CYP 2S1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 2S1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

312 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

312 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XV: CYP 2S1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CYP 2S1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

312 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XXV


324 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XVI: CYP 3A4-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

324 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







324 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XVI: CYP 3A4-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

324 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XXVI


1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

472 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XVII: CYP 3A5-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

472 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

80.000

60.000

40.000

20.000

0

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

472 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XVII: CYP 3A5-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

472 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

80.000

60.000

40.000

20.000

0

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XXVII


397 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XVIII: CYP 4B1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

397 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







397 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XVIII: CYP 4B1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

397 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XXVIII

Epoxid-Hydrolase-Genexpression:

227 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XIX: Epoxid-Hydrolase-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der Epoxid-Hydrolase-Genexpression: Lichtwerte gemessen an derKodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

277 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

0

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

227 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XIX: Epoxid-Hydrolase-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der Epoxid-Hydrolase-Genexpression: Lichtwerte gemessen an derKodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

277 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

0

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

9. Anhang XXIX

FMO 2-Genexpression:

250 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XX: FMO2-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der FMO2-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

250 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

100.000

80.000

60.000

20.000

0

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

FMO2-Genexpression:



FMO2-Genexpression:


Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) 40.000

250 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XX: FMO2-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

250 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

100.000

80.000

60.000

20.000

0

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

FMO2-Genexpression:



FMO2-Genexpression:


Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) 40.000

9. Anhang XXX


301 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXI: FMO3-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

301 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

80.000

40.000

0

120.000

80.000

40.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

FMO3-Genexpression:



FMO3-Genexpression:



160.000

160.000

301 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXI: FMO3-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

301 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

80.000

40.000

0

120.000

80.000

40.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

FMO3-Genexpression:



FMO3-Genexpression:



160.000

160.000

9. Anhang XXXI


500 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXII: FMO5-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

500 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

FMO5-Genexpression:



FMO5-Genexpression:



0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

500 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXII: FMO5-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

500 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

FMO5-Genexpression:



FMO5-Genexpression:



0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

9. Anhang XXXII

GST α2-Genexpression:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

354 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXIII: GST αα 2-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der GST αα 2-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

354 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

GST αα 2-Genexpression:



GST αα2-Genexpression:



1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

354 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXIII: GST αα 2-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der GST αα 2-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

354 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

GST αα 2-Genexpression:



GST αα2-Genexpression:



9. Anhang XXXIII

GST µ1-Genexpression:

347 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXIV: GST µ1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der GST µ1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

347 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

0

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

347 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXIV: GST µ1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der GST µ1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

347 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

0

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

9. Anhang XXXIV

GST ρ1-Genexpression:

313 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXV: GST ρ 1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der GST ρ 1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

313 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

GST ρ 1-Genexpression:






50.000

100.000

150.000

200.000

250.000

300.000

350.000

0

50.000

100.000

150.000

200.000

250.000

300.000

350.000

313 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXV: GST ρ 1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der GST ρ 1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

313 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

GST ρ 1-Genexpression:






50.000

100.000

150.000

200.000

250.000

300.000

350.000

0

50.000

100.000

150.000

200.000

250.000

300.000

350.000

9. Anhang XXXV

UGT 1A1-Genexpression:

350 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXVI: UGT 1A1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der UGT 1A1-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

350 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

300.000

250.000

200.000

0

350.000

300.000

250.000

200.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







350.000

50.000

100.000

150.000

50.000

100.000

150.000

350 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXVI: UGT 1A1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

350 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

300.000

250.000

200.000

0

350.000

300.000

250.000

200.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







350.000

50.000

100.000

150.000

50.000

100.000

150.000

9. Anhang XXXVI


1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

297 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXVII: UGT 2A1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

297 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

200.000

150.000

100.000

50.000

0

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

297 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXVII: UGT 2A1-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

297 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

200.000

150.000

100.000

50.000

0

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XXXVII

AhR-Genexpression:

284 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXVIII: AhR-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der AhR-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

284 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

AhR-Genexpression:



AhR-Genexpression:



284 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXVIII: AhR-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der AhR-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

284 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

AhR-Genexpression:



AhR-Genexpression:



9. Anhang XXXVIII

CAR β -Genexpression:

350 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXIX: CAR ß -Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CAR ß-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

350 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

100.000

75.000

50.000

25.000

0

100.000

175.000

50.000

25.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

CAR ß-Genexpression:






125.000

150.000

125.000

150.000

350 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXIX: CAR ß -Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der CAR ß-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

350 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

100.000

75.000

50.000

25.000

0

100.000

175.000

50.000

25.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







125.000

150.000

125.000

150.000

9. Anhang XXXIX

LXR α -Genexpression:

351 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXX: LXR α -Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der LXR α -Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

351 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

70.000

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

70.000

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:




LXR α-Genexpression:



351 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXX: LXR α -Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der LXR α -Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

351 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

70.000

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

70.000

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:




LXR α-Genexpression:



9. Anhang XL

PXR-Genexpression:

351 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXI: PXR-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der PXR-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

351 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

0

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

PXR-Genexpression:



PXR-Genexpression:



20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

351 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXI: PXR-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der PXR-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

351 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

0

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

PXR-Genexpression:



PXR-Genexpression:



20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

9. Anhang XLI

PPAR α -Genexpression:

357 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXII: PPAR α-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der PPAR α-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

357 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

PPAR α-Genexpression:






357 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXII: PPAR α-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der PPAR α-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

357 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:







9. Anhang XLII

PPAR γ-Genexpression:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

302 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXIII: PPAR γ -Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der PPAR γ -Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

302 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

25.000

20.000

15.000

10.000

5.000

0

25.000

20.000

15.000

10.000

5.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

PPAR γ -Genexpression:






1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

302 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXIII: PPAR γ -Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der PPAR γ -Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

302 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

25.000

20.000

15.000

10.000

5.000

0

25.000

20.000

15.000

10.000

5.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

PPAR γ -Genexpression:






9. Anhang XLIII

IL-1β -Genexpression:

294 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXIV: IL-1β -Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der IL-1β -Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

294 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:




IL-1β-Genexpression:



294 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXIV: IL-1β -Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der IL-1β -Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

294 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:




IL-1β-Genexpression:



9. Anhang XLIV

IL-6-Genexpression:

371 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXV: IL-6-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der IL-6-Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

371 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

IL-6-Genexpression:



IL-6-Genexpression:



371 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXV: IL-6-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

371 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

60.000

50.000

40.000

30.000

20.000

10.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

IL-6-Genexpression:



IL-6-Genexpression:



9. Anhang XLV

IL-8-Genexpression:

391 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXVI: IL-8-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

391 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

200.000

150.000

100.000

50.000

0

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

IL-8-Genexpression:



IL-8-Genexpression:



391 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXVI: IL-8-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles



LK NKW-R M-R

Ladder

391 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

200.000

150.000

100.000

50.000

0

200.000

150.000

100.000

50.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

IL-8-Genexpression:



IL-8-Genexpression:



9. Anhang XLVI

TNF α -Genexpression:

599 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXVII: TNFα -Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der TNFα -Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

599 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

TNFα -Genexpression:



TNFα-Genexpression:L



599 bp

Ladder LK NK 1 12 4 53 2 3 4 5

Abbildung XXXVII: TNFα -Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B):jeweils oben: Darstellung des 1,5 %igen Agarosegeles

unten: graphische Darstellung der TNFα -Genexpression: Lichtwerte gemessen an der KodakDigital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA)


LK NKW-R M-R

Ladder

599 bp

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

W-R M-R

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7

W-NR M-NR

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

120.000

100.000

80.000

60.000

40.000

20.000

0

A: Raucher :

B: Nicht-Raucher:

TNFα -Genexpression:



TNFα-Genexpression:L



9. Anhang XLVII

9.6 Darstellung der Western blots CYP 1A1

Abbildung XL: CYP 1A1-Proteinexpression mittels Western blot: Messung der Lumineszenz nach 10 min Expositionsdauer an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA).

Abkürzungen: M = männlich; NR = Nicht-Raucher; PK = Positiv-Kontrolle; R = Raucher; W = weiblich CYP 2A

Abbildung XLI: CYP 2A-Proteinexpression mittels Western blot: Messung der Lumineszenz nach 10 min Expositionsdauer an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA).

Abkürzungen: M = männlich; NR = Nicht-Raucher; PK = Positiv-Kontrolle; R = Raucher; W = weiblich


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa

9. Anhang XLVIII

CYP 2B6

Abbildung XLII: CYP 2B6-Proteinexpression mittels Western blot: Messung der Lumineszenz nach 10 min Expositionsdauer an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA).

Abkürzungen: M = männlich; NR = Nicht-Raucher; PK = Positiv-Kontrolle; R = Raucher; W = weiblich CYP 2E

Abbildung XLIII: CYP 2E-Proteinexpression mittels Western blot: Messung der Lumineszenz nach 10 min Expositionsdauer an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA).



Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa

75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa

75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa

9. Anhang XLIX

CYP 3A4

Abbildung XLIV: CYP 3A4-Proteinexpression mittels Western blot: Messung der Lumineszenz nach 10 min Expositionsdauer an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA).

Abkürzungen: M = männlich; NR = Nicht-Raucher; PK = Positiv-Kontrolle; R = Raucher; W = weiblich CYP 3A5

Abbildung XLV: CYP 3A5-Proteinexpression mittels Western blot: Messung der Lumineszenz nach 10 min Expositionsdauer an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA).



Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa


Pool 7(M-R)

Pool 10(M-R)

Pool 6(W-NR)

Pool 11(W-NR)

Pool 1(M-NR)

Pool 4(M-NR)

Pool 9(M-NR)

100 kDa75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa

9. Anhang L

9.7 HPLC-Chromatogramme von Loteprednol-Etabonat (LE) und seinen Metaboliten nach Inkubation menschlicher Nasenmuschelmikrosomen 9.7.1 1.Versuchsabschnitt ( Inkubation bei verschiedenen Inkubationszeiten ) Serie 1

Negativkontrolle 1 ( Puffer + Substrat ) Inkubation 60 min

Negativkontrolle 2 ( Puffer + Substrat )Inkubation 120 min

Positivkontrolle ( Rattenlebermikrosomen ) Inkubation 60 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 1 ( M-NR ) Inkubation 60 min

Negativkontrolle 1 ( Puffer + Substrat ) Inkubation 60 min

Negativkontrolle 2 ( Puffer + Substrat )Inkubation 120 min

Positivkontrolle ( Rattenlebermikrosomen ) Inkubation 60 min


9. Anhang LI




humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 7 ( M-R ) Inkubation 120 min





9. Anhang LII

9.7.2 1.Versuchsabschnitt ( Inkubation bei verschiedenen Inkubationszeiten ) Serie 2

Negativkontrolle ( Puffer + Substrat ) Inkubation 60 min

Positivkontrolle ( humane Lebermikrosomen )Inkubation 60 min







9. Anhang LIII

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 6 ( W-NR ) Inkubation 60 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 7 ( M-R )Inkubation 60 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 8 ( W-R ) Inkubation 60 min


humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 6 ( W-NR ) Inkubation 60 min


humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 8 ( W-R ) Inkubation 60 min


9. Anhang LIV


humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 11 ( W-NR )Inkubation 60 min



9. Anhang LV









9. Anhang LVI





9. Anhang LVII

9.7.3 2.Versuchsabschnitt ( Inkubation mit und ohne Glucuronidase-Zusatz )

Negativkontrolle ( Puffer + Substrat ) mit Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

Positivkontrolle ( humane Lebermikrosomen ) mit Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 12 ( M-NR ) mit Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 13 ( M-R ) mit Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

Negativkontrolle ( Puffer + Substrat ) mit Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

Positivkontrolle ( humane Lebermikrosomen ) mit Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 12 ( M-NR ) mit Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 13 ( M-R ) mit Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

9. Anhang LVIII

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 14 ( W-NR ) mit Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 15 ( W-R ) mit Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 16 ( W-? ) mit Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

Negativkontrolle ( Puffer + Substrat ) ohne Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 14 ( W-NR ) mit Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 15 ( W-R ) mit Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 16 ( W-? ) mit Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

Negativkontrolle ( Puffer + Substrat ) ohne Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

9. Anhang LIX

Positivkontrolle ( humane Lebermikrosomen ) ohne Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 12 ( M-NR ) ohne Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 13 ( M-R ) ohne Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 14 ( W-NR ) ohne Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

Positivkontrolle ( humane Lebermikrosomen ) ohne Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 12 ( M-NR ) ohne Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 13 ( M-R ) ohne Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 14 ( W-NR ) ohne Glucuronidase-Zusatz Inkubation 120 min

9. Anhang LX

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 15 ( W-R ) ohne Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 16 ( W-? ) ohne Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 15 ( W-R ) ohne Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 16 ( W-? ) ohne Glucuronidase-ZusatzInkubation 120 min

9. Anhang LXI

9.8 HPLC-Chromatogramme von Testosteron und seinen Metaboliten nach Inkubation menschlicher Nasenmuschelmikrosomen

Negativkontrolle ( Puffer + Substrat )Inkubation 120 min


humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 1 ( M-NR )Inkubation 120 min

Negativkontrolle ( Puffer + Substrat )Inkubation 120 min


humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 1 ( M-NR )Inkubation 120 min

9. Anhang LXII

humane Nasenmuschelmikrosomen Pool 4 ( M -NR )Inkubation 120 min






9. Anhang LXIII



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Genexpressions- und Metabolismusuntersuchungen der ... · Nasenvorhöfe, Vestibula nasi: Die unmittelbar an die Nasenlöcher,Nares, angrenzenden Teile der Nasenhöhle stellen die