Genoma Umano e malattie genetiche

lezione 5-6 Martedì 12 Aprile

Mouse Igh cluster Chromosome 12

Human Igh cluster Chromosome 14

12F1

14q32.33

mta1

mta1

JDV

JDV

mta1 crip2 crip1 hole

mta1 crip2 crip1 hole

a b

J D V

J D V

elk 2.1 hs4 hs1.2 hs3 20bp 1

3’1

hole elk 2.2 hs4 hs1.2 hs320bp 2

3’2

hs 4

hs 3

Bhs

1,2

hs 3

A

hs 4

hs 1

,2hs

3

hs 4

hs 1

,2hs

3

3’2 3’1

BAC199M11(AF450245)

86,035,000 86,040,000 86,045,000 86,050,000 86,055,000 86,065,000 86,070,000 86,075,00086,060,000

85,894,500 85,904,500 85,914,500 85,924,500 85,934,500 85,944,500 85,954,500

centromero telomero

trascrizione

IgH3’RR-A

IgH3’RR-B

(rischio riarrangiamenti)

cluster Ig topo-uomo

le regioni regolative delle Ig

centromero

Chromosome 14q32

enhancer 5’ 3 enhancers 3 enhancers

3 1 2 41 a2

geni della regione costante al 3’ delle regioni variabili *

V D J *

regione duplicata regione duplicatareg. variab.*

IgH3’RR-A IgH3’RR-B

trascrizione

quante funzioni per la maturazione delle Ig ?

metodo riduzionistico

metodo olistico globale

che approccio possiamo usare nel topo e

quale nell’uomo ?

metodo riduzionista

la genomica permette studi globali

ma come si possono studiare le regioni cis regolative ?

si possono ottenere topi transgenici, ma uomini no

si possono ottenere linee cellulari transgeniche anche umane

il knock - out ed il knock - in sono molto usati

mutanti umani a disposizione ?

quali sono le mutazioni umane che si possono studiare ?

a = polimorfismi

b = patologie

modello della regolazione delle Ig

non ci sono due genomi uguali

(a parte i gemelli omozigoti)

infatti si trovano polimorfismi dovunque si cercano

prima della conoscenza di tutto il genoma erano più rari perchè si cercavano solo sulle sequenze codificanti

la nuova frontiera sta nelle sequenze regolative

epigenetica

nella oligarchia regolativa

la gerarchia ha le sue eccezioni

il sistema è bidirezionale e deve tener conto dell’ambiente

i semi sono programmati ma senza interazione con l’ambiente non possono germinare

esempio troppo banale

altro esempioil sistema immunitario ha una sua programmazione ma il suo compito è deve proteggere dalle infezioni edeve essere reattivo all’ambiente

quindi si tratta di gerarchia intelligente : modulabile

modello Jacob-Monod

fino da questo modello dellla regolazione del primo operone era chiara la necessità di interazione con l’ambiente

per ambiente non si intende solo lo spazio esterno all’organismo ma anche intercellulare o citoplasmatico

la cascata della regolazione ha a che fare con le modificazioni epigenetiche

non è sempre chiaro chi regola chi

LCR locus control region (nel topo 4 enhancers)

IgH3’RR-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus)

V D J

human chromosome 14 q 32

HS3A HS1,2A HS4A HS3B HS1,2B HS4B

3 1 2 41 a2 centromero

duplicazione 1 duplicazione 2

mouse Ig heavy locus

*HS3A HS1,2 HS3B HS4

L C R a b

LCR*HS = hyper sensitivity to DNase I

3’RR-A 3’RR-B

Chromosome 14

IgH3’RR-B

centromero 3 1 2 41 2

SF AL928742 (40 kb)

CHR77 (35.616 kb)X76785

Y14407AL928767

AL928765 U64453

IgH3’RR-A

contigs del sequenziamento genoma umano e precedenti

elkelk

l contigs delle regioni IgH 3’RR

Chromosome 14

IgH3’RR-BSF AL928742 (40 kb)

H

2

B

HS3

B

U2 U4

U5

B

R3

H

HS1,2

E

R3r U5rU1

R1

U3 U6

U7

U8r

B

U6r

HS4

Ub1 U4-5

R3 U7r

Ub2

B H

R4U9

R5

Ub3

U10

R5

U11

U12

R6

SA2.5 A2R A2F

Alu

U15 U16

H

LTR

END OF HOMOLOGY WITH ALFA1

U14U13

Ub4

H

1

B

HS3

B

U2U4

U5

B

R3

H*

HS1,2

E

R3r U5r

U1R1

Ua1

R2

U3

U6 U7 U8

B

U6r

HS4

B H

Ua2

R4

Ua3

U9 Ua4

R5U10

U11

R5

U12

R6

U13

SA2.5 A2R

Alu

U15 U16

H

LTR

END OF HOMOLOGY WITH ALFA2

K10 retrovirus

ELK2

H

U14

Ua5

A

B

centromero 3 1 2 41 2

CHR77 (35.616 kb)X76785

Y14407AL928767

AL928765 U64453

Poly A site

Poly A site

IgH3’RR-A

HS fragments are able to synergize with Vk,VH,IgH germline promoters (2b, 3, ,) and non Ig-prmoters (c-myc) so as to enhance the transcription activity in a tissue

and stage specific manner. (Ong et al, 1998)

Symergic effects

TOR VERGATAsynergism of HS3A-B-HS1,2-HS4

Immunology 2001, 103: 35-40

Polymorphism of the human a1 immunoglobulin gene 3’ enhancer HS1,2 and its relation to gene expression

se nell’uomo ci sono due 3’RR ci sarà un motivo ?

3 domande:

è cambiato il sistema di regolazione rispetto al topo ?

nell’uomo si possono studiare i polimorfismi (i topi di campagna si studiano male)

- dalle diverse forme alleliche si può capire il funzionamento delle due 3’RR ?

- hanno tempi di attivazione diversi?

le due 3’RR sono ridondanti

TOR VERGATA

- si attivano e disattivano nelle fasi diverse della vita del linfocita B?

come si possono studiare nell’uomo le 3’RRs

in vitro

in epidemiologia genetica

in patologia

perchè nell’uomo? il modello murino è parziale: una sola 3’RR

QuickTime™ and aTIFF (LZW) decompressor

are needed to see this picture.

Studio di correlazione dei polimorfismi

Che cosa possiamo andare a studiare nella struttura

La struttura regolatrice ha dei polimorfismi che coinvolgono la funzione in quanto variano i siti di legame dei fattori di trascrizione

Ad ogni forma allelica può corrispondere una diversa funzione

Studio della distribuzione degli alleli nelle diverse popolazioni

Esistono frequenze alleliche diverse nelle popolazioni umane

Internal spacers

Conserved sequence Unit

Selective amplification of HS1,2-B downstream C2 (IgH3’EC-2)

H

2m

HS 3

B B H

HS 1,2

E B

SA2.5

A2R A2F

HS1,24420 bp

ALLELE 3BP3Frw

HS1,2

D3Rev

EcoRI

ALLELE 4B

Poly A site

HPoly A site

1m

B

HS 3

B B H* B

5402 bp

SA2.5 A2R

HS1,2HS 3

Selective amplification of HS1,2-A downstream C1 (IgH3’EC-1)

ALLELE 1AHS1,2

P3Frw D3Rev

EcoRI

ALLELE 2A

ALLELE 3A

ALLELE 4A

HS 1,2

A B

BE

Core of enhancer HS1,2 External element - 31 bp

Repeated element - 38 bpExternal element -17 bp

EcoRI

EcoRI EcoRI

EcoRI

Ua1

R1 R2

U1 U5

U4U2

U3 R3 rR3

U6 U7

U8 U1 R1

U2

Ub1

UU3 4

U5

U6

R3 R3U8 r

U4-5

U7r R3r

U6r U5r

Ub2

R4

14bp 16bp 20bp

i polimorfismi

Sites for :IK2; MZF1; NF-kB (P50)

Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-)

ALLELE 1A17bp El. END HS1,2

CORE enhancer

17bp El. 38bp Rp

14bp Sp.

ALLELE 2A16bp Sp.

ALLELE 3A

ALLELE 4A

20bp Sp.

ALLELE 3B

31bp El

ALLELE 4B

Sites for : AP4; E47; MYOD; E5

Sites for : NF-kB (Q6)

Sites for : CMYB

M2M1

ALLELE 1

ALLELE 4ALLELE 3ALLELE 2

G A B G A B

CM11 CM 4 CM 5

G A B

100 bp

400 bp

200 bp

300 bp

A

B 72

114

178

198

250

250

gli alleli