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GENÔMICA DE INTERAGENÔMICA DE INTERAÇÇÕESÕESPLANTAPLANTA--PATPATÓÓGENOGENO
Departamento de FitopatologiaLaboratório de Genômica/
Núcleo de Biotecnologia Aplicada a AgropecuáriaUniversidade Federal de Viçosa
Sérgio H. Brommonschenkel
TiposTipos dede ResistênciaResistência dede PlantasPlantas a Doena Doenççasas
�� 1. Resistência de planta não1. Resistência de planta não--hospedeirahospedeira
�� 2. Resistência de planta hospedeira2. Resistência de planta hospedeira
2.1 Resistência 2.1 Resistência poligênica (Quantitativa)poligênica (Quantitativa)
2.2 Resistência 2.2 Resistência monogênica (Qualitativa)monogênica (Qualitativa)
-- RaRaçças (as (““quebra da resistênciaquebra da resistência””))
-- DurabilidadeDurabilidade
S0 immune S0HR S1 S2 S3
Junghans et al., 2003
r r R R
A Engenharia GenA Engenharia Genéética do Melhoramento Vegetaltica do Melhoramento Vegetal
SS RR
Genes de Genes de patogenicidadepatogenicidade
Gene de Gene de avirulênciaavirulência
ResistênciaResistência
RR
DoenDoenççaaGenes de Genes de patogenicidadepatogenicidade
Gene de Gene de avirulênciaavirulência
DoenDoenççaa DoenDoenççaaGenes de Genes de
patogenicidadepatogenicidadeGenes de Genes de
patogenicidadepatogenicidadeRR rr
AvrAvr RRxx AvrAvr rrxx
avravr RRxx avravr rrxx
TeoriaTeoria genegene--aa--gene (gene (FlorFlor, 1956), 1956)
PatPatóógenogeno avirulentoavirulento PlantaPlanta hospedeirahospedeira PatPatóógenogeno virulentovirulento PlantaPlanta hospedeirahospedeira
PatPatóógenogeno virulentovirulento PlantaPlanta hospedeirahospedeira PatPatóógenogeno virulentovirulento PlantaPlanta hospedeirahospedeira
rr
PatPatóógenogeno
ElicitoresElicitores
Síntese de proteínas PR
Percepção de sinais
transdução
Morte celular:HR
• Fortalecimento da PC• Metabólitos 2os
• Proteínas PR• thioninas
fluxo de íons,ROS, fosforilação
Sinalização
Defesas Primárias(rápidas)
Defesas Locais(rápidas/intermed.)
Defesas Sistêmicas(intermediária)
Ativação altamente específica, resposta de amplo espectro
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0h 12h 24h 36h 48h 60h
Controle
Inoculado
Genes R
SISTEMA-MODELO
Tomateiro x Tospovírus
Tospovirus
Bunyaviridae
Tomato spotted wilt virus - TSWVChrysanthemum stem necrosis virus - CSNVGroundnut ringspot virus - GRSVTomato chlorotic spot virus- TCSV
Ciclo de Infecção dos Tospovírus
Vira-cabeça do Tomateiro
Vira-cabeça do Tomateiro
Santa Clara
sw-5//sw-5
Suscetível
Sw99-1
Sw-5//Sw-5
Resistente
ContenContençção da infecão da infecçção sistêmica ão sistêmica em plantas com o geneem plantas com o gene SwSw--55
Reação de hipersensibilidade - HR
Apoptose
Credit: Nicolle Rager Fuller, National Science Foundation InIníício, meio e fimcio, meio e fim
OO genegene SwSw--55
• Originário da espécie selvagem de tomateiro Lycopersicon peruvianum
• Confere resistência à diferentes espécies de tospovírus(TSWV, CSNV, GRSV, TCSV)
telômerotelômero
Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9
SwSwSwSwSwSwSwSw--------55555555CT220 CT220
GP39 GP39
TG18 TG18
TG9 TG9
CT143 CT143
TG223A TG223A
CT32 CT32
CP44 CP44 CD32A CD32A
TG568 TG568
CD3, CD3, Tm2aTm2a
TG390 TG390 TG551 TG551 TG404 TG404 TG186 TG186 TG429 TG429 TG348 TG348 TG248 TG248 CT74 CT74 GP129 GP129 CT198 CT198 CT218 CT218
TG421 TG421
TG424 TG424
GP101, (CT96) GP101, (CT96)
TG328 TG328
CT71, CT71,
8.98.9
5.55.5
3.63.6
4.04.0
6.96.9
10.110.1
4.74.7
1.11.1
5.35.3
3.33.3
5.95.9
4.04.0
2.82.8
1.91.92.02.01.01.03.03.0
1.01.0
1.71.72.22.23.93.93.83.8
5.55.5
5.95.9
4.54.5
2.22.21.61.6
2.72.7
TG254TG254
centrômerocentrômerocentrômerocentrômerocentrômerocentrômerocentrômerocentrômero
“Linkage-drag”
SwSwSwSwSwSwSwSw--------55555555CT220 CT220
TC34TC34
TC3TC3
TC87TC87
TC168TC168
TC91TC91
TC1TC1
TC2TC2
TC12TC12
TC16TC16
TC134TC134
TC55TC55
SwSw--55
CT220 CT220
**
“Chromosome walking”
S S+TC55 S+TC134
Fenótipo dos Transformantes
Efeito de dosagem e efeito de posição
2 cópias 1 cópia
1 MAENEIEEML EHLRRIKSGG DLDWLDILRI EELEMVLRVF RTFTKYHDVL LPDSLVELTK
61 RAKLTGEILH RVLGRIPHKC KTNLNLERLE SHLLEFFQGN TASLSHNYEL NDFDLSKYMD
121 CLENFLNDVL MMFLQKDRFF HSREQLAKHR SIKELKIVQK KIRFLKYIYA TEINGYVDYE
181 KQECLENRIQ FMTNTVGQYC LAVLDYVTEG KLNEENDNFS KPPYLLSLIV LVELEMKKIF
241 HGEVKASKFT QSKTFKDKKL PKGFSHHLHN LLMYLRNKKL ENFPNNIAAQ NIDVAIEFLL
301 VFLDADVSNH VINGNWLKKV LLKVGAIAGD ILYVIQKLLP RSINKDETSN ISLCSIQILE
361 KTKDLKAQVE TYYKSLKFTP SQFPTFGGLS FLNSLLRKLN EMSTSKSGLG FLMKPLLGNL
421 EKELSSLTSI LEKELSSIFR DVVHHEHNIP KDLQRRTINL SYEAEVAIDS ILAQYNAFLH
481 IFCSLPTIVK EIKQINAEVT EMWSADIPLN PHYVAAPLKH LPDRHSNLVT DEEVVGFENK
541 AEELIDYLIR GTNELDVVPI VGMGGQGKTT IARKLYNNDI IVSRFDVRAW CIISQTYNRR
601 ELLQDIFSQV TGSDDNGATV DVLADMLRRK LMGKRYLIVL DDMWDCMVWD DLRLSFPDDG
661 IRSRIVVTTR LEEVGKQVKY HTDPYSLPFL TTEESCQLLQ KKVFQKEDCP PELQDVSQAV
721 AEKCKGLPLV VVLVAGIIKK RKMEESWWNE VKDALFDYLD SEFEEYSLAT MQLSFDNLPH
781 CLKPCLLYMG MFSEDARIPA STLISLWIAE GFVENTESGR LMEEEAEGYL MDLISSNLVM
841 LSKRTYKGRV KYCQVHDVVH HFCLEKSREA KFMLAVKGQY IHFQPSDWKG TRVSFSFSEE
901 LSKFASLVSK TQKPFHQHLR SLITTNRAKS INDIFSCQIS ELRLLKVLDL SSYIVEFLSL
961 ATFKPLNQLK YLAVQAFEFY FDPGSHLPHI ETFIVMNLPY YDILLPVSFW EMKKLRHAHF
1021 GKAEFDKQGL SEGSSKLENL RILKNIVGFD RVDVLSRRCP NLQQLQITYF GNNEEPFCPK
1081 LENLTQLQQL QLSFARPRTL SGLQLPSNLN KLVLEGIHIE SVIPFIAGLP SLEYLQLQDV
1141 CFPQSEEWCL GDITFHKLKL LKLVKLNISR WDVSEESFPL LETLVIKKCI DLEEIPLSFA
1201 DIPTLEQIKL IGSWKVSLED SAVRMKEEIK DTEGCDRLHL VKQRSD
NN CCNBSNBS LRRLRRCCCC
TIRTIR NBNB
CCCC NBNB
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KIN
CCCC
N, L
Sw-5, Mi
Xa-21
Pto
Cf-9
CC
NBS
LRR
LRR
CC
NBS
LRRNBSCC
HRHRGuardian ModelVan der Biezen & Jones, 1998
Reconhecimento
Mudança de status da capacidadede ligar a nucleotídeos
Ativação
MR S
EcoRI
R S
DraI
R S
EcoRV
R S
BstNI
R S
HaeIII
O gene estO gene estáá presente em plantas R e presente em plantas R e SS
Brommonschenkel et al., 2000
SwSw--55 Resistance Gene Analogs (RGAs)Resistance Gene Analogs (RGAs)
4,4 Kb
R S
Análise de Expressão
O gene O gene éé expresso emexpresso em plantas R e S. plantas R e S. QualQual aa basebase molecular damolecular da
especificidade da resistência ?especificidade da resistência ?
84SW-5-ORF
84sw-5-ORF
MAENEIEEMLEHLRRIKSGGDLDWLDILRIEELEMVLRVFRTFTKYHDVLLPDSLVELTKRAKLTGEILHRVLGRIPHKCKTNL
MAENEIEEMLEHLRRIKSGGDLDWFDILRIGELEMVLRVFRTFTKYHDVLLPDSLVKLTKMAKLTGEILHRVLGRIPHKCKTNL
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840SW-5-ORF
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924SW-5-ORF
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1008SW-5-ORF
1007sw-5-ORF
TNRAKSINDIFSCQISELRLLKVLDLSSYIVEFLSLATFKPLNQLKYLAVQAFEFYFDPGSHLPHIETFIVMNLPYYDILLPVS
TNRAESIDVILFCQISELRLLKVLDLSSYTVEFLSLATFKPLNQLKYLAVQADKFYFDPGSHLPHIETFIVMNLPYG.IGLPVS
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1092SW-5-ORF
1091sw-5-ORF
FWEMKKLRHAHFGKAEFDKQGLSEGSSKLENLRILKNIVGFDRVDVLSRRCPNLQQLQITYFGNNEEPFCPKLENLTQLQQLQL
FWEMKKLRHAHFGKAEFDKQGLSEGSSKLENLRILKNVIQFDRVDVLSRRCPNLQQLQITYFGNNEEPFCPKLENLTQLQQLQL
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1176SW-5-ORF
1175sw-5-ORF
SFARPRTLSGLQLPSNLNKLVLEGIHIESVIPFIAGLPSLEYLQLQDVCFPQSEEWCLGDITFHKLKLLKLVKLNISRWDVSEE
SFARPRTLSGLQLPSNLNKLVLEGIHIESVIPFIAGLPSLEYLRLQDVCFPQSEEWCLGDITFHKLKLLKLVKLNISRWDVSEE
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1246SW-5-ORF
1245sw-5-ORF
SFPLLETLVIKKCIDLEEIPLSFADIPTLEQIKLIGSWKVSLEDSAVRMKEEIKDTEGCDRLHLVKQRSD
SFPLLETLVIKKCGDLEEIPVSFADIPTLEQIKLVGSWKVSLEDSAVRMKEEIIDIEGCDRLHLVKQHSD
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NN CCNBSNBS LRRLRR
Síntese de proteínas PR
transdução
Morte celular:HR
• Fortalecimento da PC• Metabólitos 2os
• Proteínas PR• thioninas
fluxo de íons,ROS, fosforilação
Sinalização
Defesas Primárias(rápidas)
Defesas Locais(rápidas/intermed.)
Defesas Sistêmicas(intermediária)
swsw--55
Síntese de proteínas PR
transdução
Morte celular:HR
• Fortalecimento da PC• Metabólitos 2os
• Proteínas PR• thioninas
fluxo de íons,ROS, fosforilação
Sinalização
Defesas Primárias(rápidas)
Defesas Locais(rápidas/intermed.)
Defesas Sistêmicas(intermediária)
SwSw--55
Qual a Utilidade da InformaQual a Utilidade da Informaçção Gerada?ão Gerada?
• Transferência do gene para outros gêneros deplantas
• Estudos de conservação das vias de transdução de sinais
• Exploração da variabilidade alélica do gene Sw-5
Síntese de proteínas PR
transdução
Morte celular:HR
• Fortalecimento da PC• Metabólitos 2os
• Proteínas PR• thioninas
fluxo de íons,ROS, fosforilação
Sinalização
Defesas Primárias(rápidas)
Defesas Locais(rápidas/intermed.)
Defesas Sistêmicas(intermediária)
SwSw--55
???
Necessidade de conservaNecessidade de conservaçção das vias deão das vias detransdutransduççãoão de sinaisde sinais
Expressão heteróloga do gene Sw-5
Gama de hospedeiros: 82 famílias >800 espécies
X
NicotianaNicotiana
benthamianabenthamiana
SolanumSolanum
melongenamelongena
Lactuca sativaLactuca sativa ((AsteraceaeAsteraceae))
- ausência de resistência- gene transcrito (RT-PCR)
ConservaConservaçção das vias de ão das vias de transdutransduçção ão de sinaisde sinais
Tomateiro>berinjela>Tomateiro>berinjela>NicotianaNicotiana sppspp.>alface, .>alface, arabidopsisarabidopsis
Explorando a biodiversidade.......
L. esculentum L. hirsutum
L. peruvianumL. chilense
Resistência a tospovírus em acessos de Lycopersicon peruvianum e L. chilense
Espécie Acesso Reação
L. chilense LA 2753 ResistenteL. chilense LA 1969 Suscetível L. chilense LA 130 Resistente
L. peruvianum PI 126928 ResistenteL. peruvianum PI 126444 ResistenteL. peruvianum LA 126944 ResistenteL. peruvianum LA 444/1 ResistenteL. peruvianum LA 371 Resistente
L. peruvianum
Fenótipo da Resistência a Tospovírus em Acessos Selvagens
ObtenObtençção de hão de hííbridos interespecbridos interespecííficosficosatravatravéés do cultivo s do cultivo in in vitrovitro de semente imaturade semente imatura
Introgressão de novos genes de resistência a tospovírus no tomateiro cultivado através de cruzamentos interespecíficos
ACESSOSEMENTES
PLAQUEADASPLANTASOBTIDAS
L. chilense LA 130 1915 5 0
L. chilense LA 2753 1990 4 0
L. peruvianum LA 371 1747 4 2L. peruvianum LA 444/1 969 34 11L. peruvianum PI 126944-6 603 1 1L. peruvianum PI 126944-12 142 1 0
L. peruvianum PI 126444 3600 2 0
ESPÉCIE HÍBRIDOSRESISTENTES
L. esculentum Híbrido L. chilense L. esculentum Híbrido L. peruvianum
L. esculentum Híbrido L. peruvianumL. esculentum Híbrido L. peruvianum
Análise de co-segregação da resistência a tospovírusderivada de LA 371 com o loco Sw-5
Marcador CAPs COS134RF localizado a aproximadamente 12 Kb do loco Sw-5
“O gene que confere resistência a tospovírus em LA 371 é alelo do loco Sw-5 ou de
um loco proximamente ligado”
Herança da resistência a tospovírus encontrada no acesso LA 371 de L. peruvianum
“A resistência encontrada em LA 371 é de amplo espectro,
monogênica e dominante”
ISOLADONO DE PLANTAS
R S
VALORP
77 25 3:1 0,013 0,90
54 13 3:1 1,119 0,29
50 17 3:1 0,004 0,94
89 31 3:1 0,044 0,82
AL (GRSV)
V1-3 (TCSV)
CUBIO (GRSV)
BR01 (TSWV)
χχχχ2PROPORÇÃOESPERADA (%)
270 86 3:1 0,13 0,71TOTAL
Amplificação de seqüências homólogas a Sw-5 por meio de PCR
Kb
Acessos de L. peruvianum
resistentes a tospovírus
1958B 19Sma
Homólogos Sw-5
ORFATG5’
Região 3’não traduzida
TGAPromotor
3’
4,1 Kb
LA
371
LA
444
/1
1269
444-
6PCR
Amplificação de duas sequências homólogas
Kb A B B B A B A B B A B B B A B
vetor
Confirmação da clonagem mediante digestão enzimática com EcoRI
LA 371
SW99-1
Moneymaker
LA 444/1
LA 2753
1269444-6
126944
126444
Kb
Pro
du
to d
a PC
R~
1100 pb
Pro
du
to d
a dig
estãoco
m R
saI
AnAnáálise da lise da cosegregacosegregaççãoão dos homdos homóólogos logos clonadosclonados com a resistência conferida por LA371com a resistência conferida por LA371
Kb371 RR rr rr rr Rr Rr RR RR RrMM
Homólogo 1
Homólogo 2
Homólogo 2PI 125944-6 14344
Homólogo 1LA 444/1 24024
Homólogo 2LA 444/1
02424
Homólogo 1LA 371
808
Homólogo 2LA 371
022
SuscetívelResistenteTotal de
Plantas R0 Inoculadas
Planta Inoculada
Análise funcional em tabaco das seqüências homólogas ao gene Sw-5 clonadas por meio de PCR
Loco 2 Loco 1
Alelo 2 Alelo 1
Loco 2 Loco 1
Alelo 2 Alelo 1
Algumas ConsideraAlgumas Consideraçções....ões....
•• Melhoramento visando resistência a doenMelhoramento visando resistência a doençças=as=melhoramento da capacidade de reconhecimento melhoramento da capacidade de reconhecimento de molde molééculas produzidas pelo patculas produzidas pelo patóógeno durante o geno durante o processo infeccioso;processo infeccioso;
•• Expressão heterExpressão heteróóloga de genes R possloga de genes R possíível, porvel, poréémmde amplitude limitada;de amplitude limitada;
•• Possibiblidade de explorar a diversidade alPossibiblidade de explorar a diversidade aléélica.lica.
Buchanan et al. Biochemistry and Molecular Biology of Plants
DIATCHENKO, L., LAU, Y.F.C., CAMPBELL, A.P., et al.. PNAS, v.93, p.6025-6030, 1996.
Driver
SUPRESSION SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION
abcd
e
Tester adap.1 Tester adap.2R
1ª Hibridização
2ª Hibridização
Adição de driverabcd
Amplificação por PCR Clonagem Seq.
Lesões com anéis concêntricos em folíolos de tomate.
Podridão do fruto na região peduncular e anéis concêntricos na
lesão.
Cancro da haste. Podridão basal.
Pinta preta – Alternaria solani
Tomateiro x Alternaria solani
- resistência do tipo quantitativa
- dificuldade no melhoramento
- resistência afetada pela idade
fisiológica dos tecidos
GRUPO CLONE POSSÍVEL GENE VALOR e
- Proteínas PRs D09-07 Gluthathione S-transferase (PR-1) 6e-53 E06-07 Beta-1,3 glucanase (PR-2) 9e-34
C10-11 Quitinase (PR-3) 2e-52 B04-11 Osmotina (PR-5) 3e-23
F08-06 PR-6 1e-39
B06-06 STH-2 3e-51
F11-07 STH-21 7e-14
- Fatores de A09-07 ERF1 (resposta a etileno) 0.0 Transcrição F10-07 PTI5 (ativação de proteínas PR) 6e-15
G12-09 Proteína de ligação a CREB 5e-07
D03-08 WRKY11 1e-11 E03-09 WRKY38 5e-05
- Sinalização G11-09 Adenilato cinase 2e-23
B09-08 Calmodulina dependente de cálcio 1e-18
B07-11 Diacilglicerol 4e-04
C09-10 Ras-GTP e-177 D06-08 Serina/treonina cinase 0.0
- Metabolismo D10-11 Ascorbato peroxidase 0.0
Oxidativo B03-06 Catalase 2e-28
D11-10 Malato desidrogenase 4e-80
- Tolerância a C11-07 ARG2(choque térmico) 4e-15
Estresses C01-07 NT-SA1 (tolerância a salinidade) e-153
D03-06 Win2(feimento) 3e-31
Alguns genes identificados, NCEBR-2, Biblioteca 36 hai
0
10
20
30
40
50
0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h
Controle
Inoculado
0
2
4
6
8
10
12
0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h
Controle
Inoculado
0
20
40
60
80
100
120
140
0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h
Controle
Inoculado
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h
Controle
Inoculado
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h
Controle
Inoculado
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h
Controle
Inoculado
0
4
8
12
16
20
24
28
32
0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h
Controle
Inoculado
0
2
4
6
8
10
12
0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h
Controle
Inoculado
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h
Controle
Inoculado
Substrato(?)
MAPKKK(S)
Interação gene-a-gene
Elicitores raça não-específicos
Estressesabióticos
Receptores Sensores
Substrato P
WRKYW-Box Genes de Defesa
MEK2
SIPK
Ativação dos genes WRKY
Outros sinais
R
Tomateiro x Meloidogyne incognita
Células gigantes
Classe e-value Similaridade
Ciclo celular 3,E-63 cell cycle control crn (crooked neck) protein-like [Arabidopsis thaliana] 2,E-45 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein [A. thaliana]
Citoesqueleto 3,E-66 MFP1 attachment factor 1 [Lycopersicon esculentum]
Fator de transcrição e-108 D13F(MYBST1) protein - potato
Fisiologia/Água 4,E-74 aquaporin 1 [Nicotiana tabacum]
1,E-61 acid invertase [Citrus unshiu]
Metabolismo geral 3,E-73 peptide transport protein homolog 3,E-45 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase [L. esculentum]
2,E-32 acid phosphatase [A. thaliana]
Nodulina 7,E-45 putative MtN19 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]
Outros 2,E-50 feebly-like protein [A. thaliana]
7,E-24 tuber-induction protein [Solanum tuberosum]
4,E-72 caffeoyl-CoA O-methyltransferase - common tobacco Parece celular 2,E-09 cellulose synthase-2 [Zea mays]
2,E-62 pectin methylesterase isoform alpha [Vigna radiata]
Resposta a ABA 7,E-26 ABA-responsive protein [A. thaliana]
Resposta a auxinas 1,E-26 auxin-resistance protein AXR1 [A. thaliana] ubiquitin-activating enzyme E1
7,E-67 chitinase class II; pathogenesis-related protein, PR-3 type [Sambucus nigra] Resposta de defesa 2,E-63 Peroxidase
1,E-20 phenylalanine ammonia-lyase [A. thaliana]
Stress 5,E-48 potassium transporter HAK3p [Mesembryanthemum crystallinum]
Stress/Metabolismo geral 1,E-49 heat shock protein 90 [L. esculentum] Stress/Transdução de sinais 2,E-95 calcium dependent protein kinase
Tráfico de membranas 2,E-46 27k vesicle-associated membrane protein-associated protein [N. plumbaginifolia] 3,E-45 secretory carrier membrane protein [O. sativa] Transdução de sinais 8,E-58 leucine-rich repeat transmembrane protein kinase [A. thaliana]
4,E-66 receptor protein kinase [A. thaliana]
Opperman et. al. (1994) Science 263:221-223
Elene Yamazaki Lau (DS, CAPES)Klaus K. Scheuermann (DS, FAPEMIG)Cynthia de Melo Rocha (MS, CAPES)Dagoberto B. Oliveira (DS, CNPq)Bruno Lima Soares (ITI, CNPq)Gustavo A. Guimarães (IC, MS, CNPq)Janaína de Oliveira Melo (ITI, CNPq)J. Thadeu R. Castro Silva (SIF)Lúcio Mauro Guimarães (MS, DS, CNPq)
Prof. Eduardo S. Mizubuti (DFP, UFV)Prof. F. Murilo Zerbini Júnior (DFP,UFV)Prof. Leandro G. De Freitas (DFP, UFV)Prof. Ivan Maia (UNESP-Botucatu)Prof. Wagner Campos Otoni (UFV, DBV)
EMBRAPA/PRODETAB (PROJETO DEFESOMA)
AGRADECIMENTOS
OBRIGADO PELA ATENÇÃO!
