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6° CONGRESSO NAZIONALE AIC3 Novembre 2017 - Genova
Nuove Tecnologie Alimentari del Senza Glutine
Carmen GianfraniIstituto di Biochimica delle Proteine, CNR, Napoli
Laceliachia è unamalattia complessamultifattorialemaconununicoagente responsabile:
leproteine delglutine
glutine
+
-mucosanormale mucosaceliaca
Assoluta, da seguire per la vitaü Sicuraü Qualità della vita compromessa (alimentazione fuori casa)
Terapia attuale:dieta senza glutine
048
121620242832
CD061204 CD171204 CD310504 CD200206
Celiaci con mucosa atrofica
γ-IF
N (n
g/m
l)
controllo
gliadina
0
5
10
15
20
25
30
CD230204 CD280900 CD090401 CD041052
γ-IF
N (n
g/m
l)
Celiaci in remissione, a dieta senza glutine
LadietaacausadellapresenzadilinfocitiTpro-infiammatorireattivialglutineconmemoriaimmunologicanellamucosaceliaca
Camarca,JImmunol,2009Gianfrani,Gastroenterology,2007Gianfrani,JImmunol,2003Vader,Gastroenterology 2002Shan,Science2002
ProteinedelGlutineü Proteinadiriserva (endosperma) delsemedigrano,segale,orzo
ü Piùdicentoproteinediverse
ü Sidivideingliadineeglutenine
ü Altocontenutodiglutamina (40%)andprolina(20%):prolammine
ü Elevataresistenzaalladigestionedelleproteasigastro-intestinali
ü MolteplicisequenzepeptidicheattivesuilinfocitiTdiceliaci
TCRαβ
LinfocitaTCD4
HLA-DQ2/DQ8glutine
1. SipuòPRETRATTARELAFARINAedetossificare ilglutineprimachevenga ingerito?
2. Esistonograniconglutineprivodellesequenze tossiche,equindigranitolleratidaiceliaci?
3. Sipossonoottenere inlaboratoriograninontossici?
NuoveTecnologieAlimentaridelSenzaGlutinedeicerealicontenentiglutine
ü Fermentazione prolungata (24 hours at 30°C.) degli impasti di farina con batterilattici (L. sanfranciscensis L. alimentarius, L brevis, L hilgardii) ottenuti da impastinaturali e con proteasi fungine (Aspergillus oryzae, Aspergillus niger)
ü Totale idrolisi del glutine, dosato con saggio immunoenzimatico R5 (12 mg/kg,ppm) e dei peptidi tossici (analisi proteomiche e spettrometria di massa)
ü Perdita delle proprietà immunostimolanti (test su linfociti T e biopsie di celiaci)
ü Assenza di tossicità in vivo, valutata con challenge orale a breve e a lungotermine
Pretrattamentodellefarinedifrumentoconagentifermentanti
Rizzelloetal.Appl EnvironMicrobiol.2007GrecoetalClin Gastroenterol Hepatol.2011Mandile etal.AlimPhar Ther.2017
Aspetti tecnologici delle farine di grano deglutinateattraverso fermentazione prolungata
ü L’idroslisi spinta, con totale distruzione della rete di glutine, riduce le proprietàtecnologiche (viscoelasticità) dell’impasto che vengono sostituite conl’aggiunta di agenti strutturanti, come amido pre-gelatinizzato, o idrocolloidi
ü Le farine ed i prodotti finiti sono sul mercato per i celiaci
Detossificazione dellefarinedigranomediantemascheramentodelglutine
+mTGasi
K-CH3K-CH3
Trattamento enzimaticodellefarinecontranglutaminasi microbicaemetil lisina(food grade)
tTGasi
F P Q P E L P Y P Q P
F P Q P Q L P Y P Q P
Deamidazione
F P Q P Q L P Y P Q P
K-CH3
F P Q P Q L P Y P Q P
mTGasi +K-CH3
Trans-amidazione
Inflammazione NO Inflammazione
Ilglutinetransamidato (mTGasi +K-CH3)nonattivalecelluleTdiceliaci
Iltrattamentodellefarinetransamidate èinfasedisperimentazioneclinica
Primo studio:Singolo cieco, 47 celiaci adulti consumano 50 g/die di pane controllo (N=12) o trattato (N=35).10/12 dei controlli e 14/35 nei trattati escono dallo studio dopo soli 15 giorni per la presenza disintomi o alterazioni permeabilità intestinale.Normale funzionalità epatica e renaleNei 20 volontari che terminano lo studio (57%), non si osserva danno della mucosa né comparsadi autoanticorpi (Mazzarella et al., Clin Dev Immunol 2012).
Secondo studio:Doppio cieco, 21 celiaci adulti consumano 100 g/die di pane controllo (N=10) o trattato (N=11). Il70% completa lo studio a 90 giorni in entrambi i gruppi.14% gruppo trattato e 57% gruppo controllo sviluppano autoanticorpi ed atrofia dei villi(Marino et al., Int Immunopharmacol. 2017).
80.00080
1. SipuòPRETRATTARELAFARINAedetossificare ilglutineprimachevenga ingerito?
2. Esistonograniconglutineprivodellesequenze tossiche,equindigranitolleratidaiceliaci?
3. Sipossonoottenere inlaboratoriograninontossici?
NuoveTecnologieAlimentaridelSenzaGlutine
Ilmonococco (Triticummonococcum)ètraigranicandidati
Ø GranodiploideAA,notoanchecomepiccolofarrooEinkorn
Ø Lasuacoltivazionerisaleacirca10000annifaedèrimastoinalteratogeneticamente
Ø Ottimeproprietàpanificatorie epastificatorie
Ø Lafarinaintegraleèpoveradifibrealimentari,mariccadiproteine,lipidi(ingranparteacidigrassiinsaturi),fructani,ferroedantiossidanti(carotenoidiepolifenoli)
Ø LapresenzadelsologenomaAAcomportaunaridottavarietàdiproteinedelglutine(edipotenzialipeptiditossiciimmunitari),rispettoalgranoduro(tetraploide)etenero(esaploide)
Ø PresenzadisequenzepeptidicheprotettiveQQPQRPQQPF
Ø DiversicentridicoltivazioneinItalia
Hidalgo&Brandolini.J SciFood Agric 2014Lamacchia etal.Nutrients 2014DeVitaetalJ Cerela Sci2012
Ilgrano monococco contieneunglutinepiù digeribile edimmunologicamentemenoattivo
Riproduzione in vitro del processo di digestione gastrointestinale (PTCCE-BBM)
1 Gliadin proteins
2 Pepsin
3 Trypsin
4 Chimotrypsin
5 Carboxypeptidase A
6 Elastase
7 Brush Border Membraneenzymes (BBM)
Gianfrani etal,MolNutr FoodRes. 2015Gianfranietal,AmJClin Nut.2012
Analisi proteomica e della tossicità immunologica su biopsie intestinali e cellule linfocitarie da soggetti celiaci
min20 30 40 50 60 70 80 90
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
DAD1 B, Sig=220,10 Ref =of f (AURICCHI\MOLLIS_0.D)
Gli_Mollis
53.
390
76.
587
77.
445
55.
089
59.
053
50.
015
70.
811
46.
378
72.
891
57.
452
48.
370
69.
827
43.
226
68.
198
74.
225
64.
398
21.
692
28.
846
32.
311
36.
439
25.
706
23.
558
20.
261
min20 30 40 50 60 70 80 90
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
DAD1 B, Sig=220,10 Ref =of f (AURICCHI\ID331_00.D)
Gli_ID331
53.
390
76.
873
77.
768
55.
117
49.
793
59.
235
51.
542
71.
403
46.
446
73.
282
48.
408
57.
610
70.
344
61.
676
43.
310
67.
523
64.
675
36.
287
28.
764
32.
516
30.
848
21.
958
T.monococcum (Monlis) T.monococcum (ID331)T.aestivum (grano tenero)min10 20 30 40 50 60 70 80 90
mAU
0
200
400
600
800
DAD1 B, Sig=220,10 Ref =of f (LUIGIA\SAGIT.D)
65.
278
64.
276
52.
439
57.
940
53.
476
55.
447
51.
697
57.
471
74.
264
60.
630
66.
933
33.
213
49.
618
82.
541
68.
375
44.
485
47.
632
46.
069
54.
394
61.
740
70.
460
72.
034
34.
146
15.
941
19.
859
43.
698
80.
520
39.
193
85.
563
90.
346
31.
187
4.7
45
28.
735
13.
725
26.
841
3.1
80
37.
126
18.
694
21.
421
7.0
90
25.
409
23.
865
11.
264
Peptidi 76α-gliadin 50
ω-gliadin 9
γ-gliadin 17
Peptidi 68
α-gliadin 51
γ-gliadin 17
Peptidi 241
α-gliadin 108
ω-gliadin 22
γ-gliadin 111
α-γ-
α−γ-ω-
γ- α-
Ridotto rilascio dipeptidi dopo idrolisi gastrointestinale
Gianfrani etal,MolNutr FoodRes. 2015
ü E’notalaquantità minina diglutine perscatenare lapatologia,soglia di20ppm(20mg/kg)nelle linee guida
ü Qual è lasoglia diglutine perindurre lapatologia?
ü Qualeè il ruolo dei diversi aplotipi HLAdirischio nella risposta immuneavversa?
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0,001 0,01 0,1 1 10
Infla
mm
ator
yre
spon
se
Gluten stimulatory peptides
DR3/3 DR3/5
DR1/3
Threshold
Catassi, AmJClin Nutr 2007Gibert,AmJClin Nutr 2013Pisapia,J Autoimmun,2016
É possibile prevenire laceliachia nei soggetti arischio conunaalimentazione abasedigrani meno tossici?
1. SipuòPRETRATTARELAFARINAedetossificare ilglutineprimachevenga ingerito?
2. Esistonograniconglutineprivodellesequenze tossiche,equindigranitolleratidaiceliaci?
3. Sipossonoottenere inlaboratoriograninontossici?
NuoveTecnologieAlimentaridelSenzaGlutine
Ø SelezionedigenotipidigranoteneroegranoduroprivideilociGli-A2eGli-D2attraversol’analisidellesequenzediglutine inbanchedatiridottocontenutodeipeptidi immunotossici (vandeBroeck etal.Mol BioSyst 2010;Theor Appl Genet 2010).
Ø Regolazionedell’espressione deigenidellegliadineconlatecnicadelsilenziamentogenico(conRNAi)RidottaattivazionedeilinfocitiTinfiammatori (Gil-Humanes etal.PNAS2010).
Ø Selezionedinuovicerealimediante ibridizzazionedivarietànaturali.ConcettodiLowCDToxic:Tritordeum,unanuovaspeciedaincrociogranoduroeorzoconridottaimmunotossicità (VaqueroetalJ SciFoodAgric 2017).
Ø Silenziamento digeniprolaminici mediantemutagenesie nuovetecnologie digeneeditingCRISPR/Cas9(Jouanin etalICDSNewDelhi2017).
Sipossonoottenereinlaboratoriograninontossici?
Conclusioni
ü La complessità genetica del grano si traduce in una molteplicità di peptidi tossici(repertorio molto ampio)
ü Diverse strategie per rendere deglutinate le farine dei cereali tossici:1)fermentazione naturale con batteri lattici/funghi, 2)enzimatica permascherare i peptidi tossici, utilizzandola transglutaminasi e metil lisina
ü Esistono piante ancestrali diploidi (monococco) che hanno meno copie dei geniche codificano per le proteine del glutine
ü Possibilità di incrocio di queste piante per la selezione di grani meno tossici
ü La ridondanza del genoma (poliploidia) rende molto difficile manipolazionigenetiche che silenzino tutti i geni codificanti i peptidi immunotossici