M ONIT ORI ZA O DA DE GRADA O DO G LIC O G NIO 1. O bjectivo Neste trabalho, ir-se- observar a degradao do glicognio ao longo tempo: i) em meio cido e temperatura de 100C (degradao qumica); ii) em meio neutro, temperatura ambiente e na presena da enzima amilase (degradao enzimtica). O trabalho integra tambm a construo de uma recta de calibrao usando glucose como acar redutor de referncia. 2. Introduo O glicognio um polmero de glucose que actua como reservatrio de unidades glicosdicas no tecido animal. Num ser bem alimentado, a glucose convertida em glicognio no fgado, glicognio esse que hidrolizado a glucose durante o jejum, onde pode ser totalmente consumido em 24 a 48 horas; aps este perodo, os nveis de glucose no sangue so mantidos a partir de fontes no glicdicas. J a quantidade de glicognio do msculo no afectado pela dieta, permanecendo praticamente constante na ausncia de exerccio violento. O glicognio muscular no contribui directamente para o teor de glucose do sangue (a enzima glucose-6-fosfatase no existe no msculo) mas pode fazlo por via indirecta quando se forma lactato durante as contraces musculares em condies anaerbias. O glicognio um polmero ramificado em que a cadeia principal tem ligaes glicosdicas (14) e com ramificaes em (16). Estruturalmente, semelhante amilopectina do amido, o que permite a sua degradao temperatura ambiente na presena enzima amilase (-1,4-D-glucan-4-glucanohydrolase, EC. 3.2.1.1.) por hidrlise aleatria das ligaes glicosdicas internas -1,4, sendo o dissacrido maltose o produto final dominante. Na ausncia de catalisador enzimtico, a degradao s conseguida em condies muito mais agressivas (temperatura elevada e meio fortemente cido). A monitorizao da degradao do glicognio baseia-se no aumento de extremidades glicosdicas redutoras que acompanha necessariamente a reaco. De facto, cada ciso numa molcula de glicognio d origem a duas extremidades redutoras, a do glicognio

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remanescente, e a do sacrido entretanto removido. Assim, espera-se que haja um aumento do n de extremidades redutoras em soluo com o tempo da reaco de degradao, quer por via qumica quer por via enzimtica. O teor em extremidades redutoras pode ser aferido atravs do teste do reagente DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico, DNS, amarelo), que reage com a extremidade redutora do sacrido formando-se cido 3amino-5-nitrosaliclico (vermelho acastanhado) e cido glucnico, de acordo com a reaco:

O produto da reaco absorve no visvel a = 540nm, o que no acontece com o DNS nem com as restantes espcies no meio reaccional. 3. Reagentes e equipamento - Soluo de NaOH 1.25M - Soluo de HCl 1.5M - Soluo de glucose 1mg/ml - Soluo de glicognio 3mg/ml - Soluo de amilase comercial 0.5mg/ml diluda em H2O (1:120; 1:50; 1:100) - SOLUO A: Soluo de cido 3,5-dinitrosaliclico em meio bsico (1 g cido em 200 ml NaOH 2N) - SOLUO B: Soluo de tartarato de sdio e potssio (300g de tartarato em 500 ml H2O) - Espectofotmetro do visvel - Banhos de gua - Vortex - Pipetas automticas e respectivas pontas - Material corrente do laboratrio 2

4. Procedimento experimental

4.1. Evoluo no tempo da hidrlise do glicognio em meio cido a 100C (degradao qumica)Identifique 7 tubos (1-7Q). Junte, a cada um deles: 0.5ml sol. glicognio 3 mg/ml 0.5 ml sol. HCl 1.5M Coloque 6 tubos num banho em ebulio e retire-os de 4 em 4 minutos aproximadamente (use o cronmetro; registe o tempo em min:seg.) como indicado na tabela abaixo. Adicione ao tubo no colocado no banho (tubo 1Q) 1 ml de NaOH 1.25M e depois 1ml DNS. Quando retirar cada tubo, arrefea em gelo , junte rapidamente 1 ml de soluo NaOH 1.25 M. Verifique se a soluo j arrefeceu aprox. at Tamb e junte 1 ml de soluo de DNS. Tubo Tempo (min) no banho em ebulio 1Q 0 2Q 4 3Q 8 4Q 12 5Q 16 6Q 20 7Q 24

Aps completar a experincia, rena os tubos (1Q a 7Q). Coloque-os em simultneo num banho de gua em ebulio durante 5 minutos. Ao fim deste tempo retire todos os tubos e arrefea-os em gelo. Leia a A540 nm utilizando o tubo 1Q como branco.

4.2. Evoluo no tempo da hidrlise do glicognio em meio neutro temperatura ambiente na presena de amilase (degradao enzimtica)Identifique 7 tubos (1-7E). Junte, a cada um deles: 0.5ml sol. glicognio 3mg/ml 0.5 ml H2O destilada 1 ml sol. amilase (ltima a ser adicionada) Prepare tambm uma amostra sem enzima (ASE), juntando num tubo 0.5ml soluo de glicognio e 1.5 ml de H2O. Adicione imediatamente 1 ml da soluo de DNS ao tubo 1E. Retire os restantes tubos da srie (2-7E) de 3 em 3 minutos (use o cronmetro; registe os tempos em min:seg.) como indicado na tabela abaixo e adicione 1 ml de reagente de DNS.

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Tubo Tempo (min) aprox.

1E 0

2E 3

3E 6

4E 9

5E 12

6E 15

7E 18

ASE 18

Aps completar a experincia, rena os tubos (1-7E e ASE). Leve todos os tubos, em simultneo, ebulio durante 5 minutos. Retire em simultneo e arrefea. Leia a A540 nm contra o tubo 1, que funciona como branco . Mea tambm a absorvncia da ASE. Caso tenha curiosidade, repita a experincia anterior substituindo a soluo de amilase comercial por uma soluo de saliva (1 gota) em ca. 10 ml de gua destilada.

4.3. Construo da recta de calibrao para determinao da concentrao em acar redutorIdentifique 6 tubos de ensaio e prepare-os de acordo com o indicado na tabela abaixo: Tubo Sol glucose 1mg/ml(Veml) H2O(Veml) 0 ---2000 1 200 1800 2 500 1500 3 1000 1000 4 1500 500 5 2000 ---

Adicione a cada tubo 1 ml de reagente de DNS. Leve depois todos os tubos, em simultneo, ebulio durante 5 minutos. Retire em simultneo e arrefea. Leia as Absorvncias a 540 nm contra o tubo 0, que funciona como branco.

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5. Bibliografia Plummer DT (1987) An Introduction to practical biochemistry 3rd Ed, McGraw-Hill Book Co (London) pp180-186 Rawn J (1983) Biochemistry, Harper & Row Publishers Inc (NY), pp.668-692 Bohinski RC(1983) Modern Concepts in Biochemistry 4th Ed, Allyn&Bacon Inc (Boston) pp214-216. Protocolo Experimental Monitorizao da degradao do Glicognio DQ, FCT-UNL (2007) 6. Relatrio e clculos 1. Determinao das concentraes das solues-padro de glucose. Construo da recta de calibrao 2. Construo do grfico da concentrao em acar redutor em funo do tempo em segundos para as duas situaes (hidrlise qumica e enzimtica). Expresso do teor em extremidades redutoras em termos de equivalentes de glucose. 3. Discusso dos resultados tendo em conta: a absoro da ASE; a quantidade de produto formado por hidrlise qumica e enzimtica aps um dado perodo de tempo. 7. N O R M AS PA R A A E L A B O R A O D O R E L A T R I O Os relatrios devero ser redigidos correctamente e descrever o trabalho efectuado utilizando linguagem clara e no ambgua. Qualquer figura, grfico, etc. retirado da literatura dever ser devidamente referenciado. O relatrio ter o seguinte formato: Pgina de rosto, que contm: Ttulo do trabalho Data de execuo do trabalho, dia da semana, perodo (manh-tarde) n do grupo e identificao dos membros do grupo (nome e nmero da FCT) Nome do docente responsvel

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Resumo (max. 1 pg) Indica o objectivo ou objectivos do trabalho e os mtodos utilizados. Contm os principais resultados quantitativos e/ou concluses obtidos. Resultados e discusso Apresenta, de forma completa mas concisa, todos os resultados experimentais obtidos, sempre que possvel em tabelas e grficos (construdos utilizando uma folha de clculo como o Excel) numerados e identificados com ttulos explicativos. As tabelas devero especificar as unidades e os valores devero ter o n correcto de algarismos significativos. Os grficos devero ser devidamente dimensionados e expressar as unidades e a graduao dos eixos. Quando existam valores obtidos a partir de regresso linear, deve apresentar-se o valor de R correspondente. Nos casos em que necessrio efectuar uma srie de clculos anlogos, dever exemplificar-se com um caso e tabelar os restantes. A discusso inclui a comparao dos resultados obtidos com os previstos e com os apresentados na literatura e sugestes para as razes dos eventuais desvios verificados. Incluir tambm uma avaliao global do trabalho e sugestes para alteraes que paream pertinentes, devidamente justificadas. Referncias Anexos (facultativo)

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