Glucósidos Cianogénicos en Productos de Yuca

Darwin Ortiz Osorio*

Teresa Sanchez*

Harold Acosta Zuleta***CIAT, Centro internacional de agricultura Tropical, d.a.ortiz@cgiar.org

**Ph.D. Profesor titular, escuela de ingeniería de alimentos. Universidad del Valle

Glucósidos Cianogénicos•Son carbohidratos que producen algunas planta y son productos intermediarios de la biosíntesis de algunos aminoácidos.

Alimentos con cianoglucósidos

Yuca

Sorgo

Almendras amargas

Limón

Cereza

ManzanaRemolacha azucarera

Ciruelas

Melocotón Pera

Enfermedades asociadas al consumo de yuca

Niño enfermo de konzoFotografías cortesía de Konzo.info. Facultad de Medicina de la Universidadde Bergen© Thorkild Tylleskar, 2002.

Konzo o “buka-buka”

Causa parálisis y deformación irreversible de las piernas

Neuropatía atáxica tropical, "TAN"

Causa dificultad progresiva para caminar, se presenta urgencia o retención urinaria,estreñimiento, dolor lumbar e impotencia

Técnica Analítica

• Etapa de Extracción Hidrólisis EnzimáticaDestilación del Cianuro

• Etapa de Cuantificación

O

OH

O

OH

OH

CH2OH

C CH3

CH3

CN

Linamarina,Glucósido Cianogénico

β - glucosidasaC CN

CH3

HO

CH3O

OH

OH

OH

OH

CH2OH

++ H2O

D-Glucosa Cianohidrina

C CN

CH3

HO

CH3

HCN + C CH3

CH3

O

Cianohidrina Acetona

HCN +

Na+

S OO

N-Cl

S OO

NNa H

CNCl +

N

O O

CNCl +

N

O O

CN

+ Cl

N

O O

CN

Cl

+ H2O CH

O CH

C

COO

CH

OCH2

CH

O CH

C

COO

CH

OCH2N

NCH2

CH3

O

N

NH2C

CH3

O

CH

CH

C

COO

CH

CH2N

NC

CH3

O

NN

C

CH3

O

Como aseguramos que la metodología funciona?

LINEALIDADLINEALIDAD

EXACTITUDEXACTITUD

ROBUSTEZROBUSTEZ

Validación de Métodos Analíticos

SENSIBILIDADSENSIBILIDAD

PRECISIÓNPRECISIÓN

Análisis de Muestras

2,042,04t tablas

9,613,39t calculado

18162228Numero de muestras

0,540,650,841,39LC 95%

1,021,211,903,13Desviación estándar

14,67 ± 0,54*18,48 ± 0,65*22,90 ± 0,84*25,54 ± 1,39*Promedio

Método CIATMétodo JapónMétodo CIATMétodo Japón

Bolsa 2Bolsa 1

* Los limites de confianza son calculados al 95 %

•Prueba t por parejas, y comparación de dos medias experimentales

Ho = “Las medias de los resultados dados por ambos métodos son iguales”

Ha = “Las medias de los resultados por ambos métodos son significativamente distintas”

t calculado > t tabla

La diferencia entre los dos resultados es significativa al nivel del 5 %

CONCLUSIONES• La etapa de extracción del cianuro en la muestra es crítica porque

proporciona un nivel de error elevado

• La curva de calibración del método presenta dos intervalos de respuesta lineal, uno entre 0.1 -0.8 ppm y el otro desde 1.2 y 2.4 ppm. La ecuación de la recta para el primer caso es Y = 1.2955 (±0.038) X - 0.0109 (± 0.018)

• El límite de detección para la determinación de cianuro, hallado según la definición de la IUPAC y basado en la curva de calibración a bajas concentraciones de analito fue de 0.003 ppm, el límite de cuantificación establecido con base en el intervalo de respuesta lineal fue de 0.1 ppm

• Los coeficientes de variación para la repetibilidad y precisión intermedia, tanto para el sistema como para el método, se encontraron por debajo de los valores aceptados para los niveles de concentración ensayados; esto permite concluir que tanto el sistema como el método tienen buena precisión intralaboratorio

• El método de adición de estándar en la determinación de cianuro mostró resultados cercanos al 100 %. Estos permite decir que el método es exacto

Gracias

Linealidad

y = 1,3006x + 0,0214R2 = 0,9698

0,000,501,001,502,002,503,00

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Concentración de HCN, (ppm)

Abs

orba

ncia

• 3 curvas de calibración, preparadas en días diferentes, en el intervalo de 0.1 – 3.0 ppm de HCN.

• Cada punto de la Curva se le midió la absorbancia por triplicado

Curvas promedio para los 3 dias evaluados en el intervalo 0,1 -0,8 ppm

0,0000,2000,4000,6000,8001,0001,200

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1Concentración ppm

Abs

orba

ncia

Dia 1Dia 2Dia 3

•Intervalo de Respuesta Lineal 0.1 – 0.8 ppm de HCN

•Análisis de Varianza para el intervalo 0.1 – 0.8 ppm, se realiza el análisis para las tres curvas en conjunto

•Test de Cochran, homogeneidad de varianzas

Gexp =0,4670; Gtablas (α = 0,05, K=5, n=3)= 0,6161

Gexp < Gtablas, las variancias de las concentraciones son homogéneas, el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados

-0.12

-0.06

0.00

0.06

0.12

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Concentración de HCN, (ppm)

Res

iduo

s

•Normalidad de los residuales. se observa que la distribución de los residuales, es completamente aleatoria, no se observa ninguna tendencia

y = 1,2955x - 0,0109R2 = 0,9864

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Concentración de HCN,(ppm)

Abso

rban

cia

Ecuación de la Recta obtenida

Y = 1.2955 (± 0.038) X - 0.0109 (± 0.018) (r = 0.9932)

•Coeficiente de correlación. Indica que un 99.32 % de la variación de la respuesta es explicada por la recta de regresión.

•ANOVA.

•Prueba F

Ho = “El cuadrado medio de la regresión (CM reg) es igual a el cuadrado medio residual (CM res) (Ho: CM reg = CM res, Ha = CM reg≠ CM res),

F calculado = 1157.73. F crítico (P = 0.05) = 2.36 x 10-16,

Existe correlación muy significativa entre x e y.

• TEST DE LINEALIDAD

• Test de verificación de la pendiente o linealidad

Ho = “La pendiente no es significativamente diferente de cero”.

Ha = La pendiente es significativamente diferente de cero”.

t calculado = 34.00, t teórico (P = 0.05, gl = 16) 2.12,

t calculado> t teórico

Existe diferencia significativa entre la pendiente y cero.

Intervalo de confianza de la pendiente= 1,2955 ± 0,081 (1.376, 1.215) y se observa que este

intervalo no incluye el cero.

bsb

t =exp

• Test de verificación de la variable independiente o de proporcionalidad

• Ho = “No existe diferencia significativa entre el intercepto y cero”.

• Ha = “Existe diferencia significativa entre el intercepto y cero”.

t calculado = 0.6 t teórico (P = 0.05, gl = 16) 2.12,

texp < ttablas

La ordenada en el origen es estadísticamente igual a cero

Intervalo de confianza del intercepto 0,018 ± 0,081 (-0.049, 0,0273).

asa

t =exp

Sensibilidad

nbsyLD blbl 3+

=nb

syLC blbl 10+=

Método de Bajas Concentraciones

Limite de detección = 0,004 ppm

Limite de cuantificación = 0,012 ppm

Método Miller

Limite de detección = 0.0045ppm

Limite de Cuantificación = 0.015

Precisión

))log(5.01(2(%) CCV −=

16,88%0,7

17,28%0,6

17,76%0,5

18,37%0,4

19,18%0,3

20,38%0,2

22,63%0,1

CV(%)Concentración

Se calculan los coeficientes de variación para cada uno de los parámetros evaluados, es decir; Repetibilidad (sistema y método), Precisión Intermedia (sistema y método)

3,736,06,65,23,012,03,00.735 ± 0.006

2,345,98,57,85,54,92,70.630 ± 0.005

2,286,25,94,610,06,04,20.525 ± 0.004

0,964,54,03,95,65,63,70.420 ± 0.003

2,215,65,35,34,49,43,70.315 ± 0.002

1,944,63,84,63,28,03,60.210 ± 0.002

3,016,12,54,35,59,78,70.105 ± 0.001

%%%%%Estándar(P= 0.05)CV,CV,CV,CV,CV,

DesviaciónPromedioDía 5Día 4Día 3Día 2Día 1Concentración*

Repetibilidad del Sistema

Se observan que los coeficientes de variación obtenidos son inferiores al 10%

5,900,050,88310,180,080,7929,570,060,6755,050,030,5554,280,020,4166,620,020,27912,780,020,139

%EstándarPromedio, AbsCV DesviaciónRespuesta

Precisión Intermedia del Sistema

Se observan coeficientes de variación inferiores al 13 %

Repetibilidad y Precisión intermedia del método

11,40223,3226,59112,040CV (%)

0,3070,3010,3820,423

0,3390,3740,3680,451

0,3990,4210,4180,3550,309

0,3290,3310,3620,473

6,19921,39112,2035,988CV (%)

0,2370,2360,3220,281

0,2480,2680,2570,309

0,2140,2530,2490,2690,206

0,2350,2270,2630,293

21,88610,3698,11012,994CV (%)

0,1250,1480,1290,106

0,1450,1430,1080,145

0,0910,1270,1260,1330,103

0,0970,1180,1270,123

Teórica

Día 4Día 3Día 2Día 1Concentración

Exactitud

0,0

0,2

0,5

0,7

0,08 0,16 0,24 0,32Concentración de HCN, (ppm)

Abs

orba

ncia

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 4

Curva Promedio

1.539 ± 0,091.032 ± 0.011.265 ± 0.111.699 ± 0.021.2955 ± 0.04(P= 0.05)

Pendiente

Muestra 4Muestra 3Muestra 2Muestra 1Curva Patrón

• Prueba t student Ho = “No hay diferencias

significativas entre las pendientes de las curvas de las muestras con adición de patrón y la pendiente de la curva patrón promedio”.

t calculado = 0.597; t crítico fue 3.18,

t calculado < t critico

Estadísticamente las pendientes obtenidas de las curvas de adición estándar son iguales a la de la curva de adición patrón.

No hay efectos de matriz en las muestras analizadas.

• Test de Cochran.

Prueba de igualdad de variancias de varios grupos muéstrales del mismo tamaño

Ho = “El factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados”

G calculado = 0.624; G crítico 0.7977,

G calculado < G crítico

El factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados.

89,55107,90103,8381,21Porcentaje de recuperación

35,0438,8539,1638,21Concentración por lectura directa

31,3841,9240,6631,03Concentración con adición de estándar

Muestra 4Muestra 3Muestra 2Muestra 1

Se observa que los porcentaje de recuperación son cercanos al 100%, indicando que:

La variación entre las dos formas de determinar las concentraciones es mínima y no es necesaria la adición de patrón para determinar cianuro en muestras de croqueta de yuca.

•Comparación de los dos métodos de cuantificación

12,0CV%

11,93DS

99,60R(n = 12)

108,6585,0094,60121,500,3087

109,8988,77100,37114,710,2058

86,6096,6787,96100,480,1029

Muestra 4Muestra 3Muestra 2Muestra 1% Recuperación Concentración

• Test de t, (α = 0.05)

Ho = “no existe diferencia significativa entre la recuperación media y el 100.

t calculado = 0.116, t critico 2.20,

t calculado < t crítico

No existe diferencia significativa entre la recuperación media y el 100%

La exactitud del método analítico es correcta.

Robustez

7 min.3 min.Factor C: Tiempo de reacción cloramina T

50 min.30 min.Factor B: Tiempo de Reacción Colorimétrica

45ºC35ºCFactor A: Temperatura del Baño

+-Factores

Nivel

Se construyó una matriz de diseño, la cual se define como el valor que deben tomar cada uno de los factores a evaluar en cada uno de los experimentos a realizar.

+++++++8

-+--++-7

--+-+-+6

+--++--5

---+-++4

+-+--+-3

++----+2

-+++---1

ABCBCACABCBANº Ensayo

InteraccionesFactores

0.045-0.105-0.03ABC

Interacción de tres factores

0.055-0.095-0.02BC

0.025-0.125-0.05AC

0.04-0.11-0.04AB

Interacción de dos factores

0.07-0.08-0.05C

0.01-0.14-0.07B

0.220.070.145A

Intervalo de confianzaEfectoEfecto único (efecto principal)

“El factor que no incluya el cero dentro del intervalo de confianza significa que el análisis se encuentra influenciado por la variación del factor en cuestión, el factor que incluya el cero se considera que su efecto es negligible”

Recomendaciones• La hidrólisis enzimática emplea gran parte del tiempo de la técnica

analítica, es indispensable realizar un estudio con el objetivo de reducir en lo mínimo el tiempo empleado

• Adaptar la técnica analítica a un equipo de destilación por arrastre de vapor que sea mas eficiente y el tiempo de destilación se reduzca, ya que por el momento la técnica analítica no permite realizar análisis de rutina

• Realizar estudios de eficiencia de la enzima con el objetivo de reducir la cantidad de enzima utilizada

• Realizar ensayos a micro escala con el fin de reducir en lo mas mínimo la cantidad de reactivos utilizado

• Realizar un estudio de robustez de la técnica completa, es decir; incluyendo la etapa de la hidrólisis enzimática