Glutation és a kapcsolódó mechanizmusok

Fitokelatinok, metallotioneinek

A nehézfémfelesleg hatásai

• Más elemek gyökér általi felvételének befolyásolása (Cd, Cu, Zn)

• Szabad oxigéngyökök generálása

Cu+ + O2 → Cu2+ + O2.-

Cu+ +H2O2 → Cu2+ + OH- + OH.

lipidperoxidáció iniciálása

Cu+ + LOOH → Cu2+ + OH- + LO.

Cu2+ + LOOH → Cu+ + H+ + LOO.

• Enzimek működésének gátlása (pl. NR-t az Pb)• Klorofill bioszintézis gátlása

(δ-aminolevulinsav DH, protoklorofillid reduktáz)

A nehézfémfelesleg hatásai

A nehézfém-toxicitás általános tünetei• gyökér- (hajtás-) növekedésének gátlása• vízfelvétel- és belső vízmozgás gátlása

Különösen magasabb koncentrációban a legtöbb nehézfém:

• gátolja sztómák nyitódását és a transzspirációt

• CO2-fixáció, a fotoszintézis egyes folyamatainak gátlása

• károsítja a plazmamembránt

A nehézfémrezisztencia lehetséges mechanizmusai

• Elkerülés (baktériumban P-típusú ATPázok kipumpálják)

• Detoxifikálás a sejten belül (kelatálás, transzport) - fehérjék indukciója

hősokk (Heat-shock) proteinek, metallotioneinek, fitokelatinok, ferritin, transzferrin- antioxidáns enzimek indukciója és aktiválása

szuperoxid dizmutáz, kataláz, glutation peroxidáz- szerves savak magasabb „turnover”-e

malát, citrát, oxalát, fitát, szukcinát stb.

A nehézfémtolerancia fontos a nehézfém hiperakkumuláláshoz !

A Cd kelatálásában és vakuólumba juttatásában központi szerepe van a

glutationnak

Antioxidáns védő mechanizmusok

Az aszkorbinsav-glutation ciklus szerepe a H2O2 eltávolítása

A glutation

A glutation szerepe a növényekben

Előfordulása: kloroplasztiszban,citoszólban, mitokondriumban

mM-os nagyságrendben (500 µM - 5 mM)

Redukált/oxidált glutation aránya:

normál körülmények között: 90-99 %

stresszhatásra: 30-80%

Redukált glutation – oxidált glutation

2 GSH → GSSG

Oxidált glutation = glutation diszulfid

A glutation szerepe a növényekben

- Oxidatív stressz elleni védelem (GR, GSPX) - Szubsztrátja a glutation S-transzferáznak - Redox puffer, redox szabályozás (fehérjék -SH

csoportja, sejtciklus)- Génexpresszió szabályozása - Fitokelatinok prekurzora- Fő raktározott formája a redukált kénnek- A szervek közötti kénmegoszlás szabályozása

A glutation bioszintézise

A glutation szintetáz, GS (GSase)

Transzgénikus nyárfaCitoszolban, 100-szoros GS-növekedés, GSH tartalom nem nőtt

Transzgénikus Brassica j. : 2-3-szoros növekedés a Cd-toleranciában

-glutamil cisztein szintetáz, -ECS

Szerepe bizonyított a GSH szint emelkedésben stresszhatásra

Transzgénikus nyárfa: citoszolban: enzim mennyiségben 5-10-szeres növekedés,

2-3-szoros GSH- és GSSG- szint növekedés (a redox állapot nem különbözött a kontrolltól !)

Kloroplasztiszban: hasonló eredmény

Transzgénikus Brassica j. : 2-3-szoros növekedés a Cd-toleranciában

Transzgénikus dohány: nekrózis, csökkent növekedés

A bioszintézis génjének túltermeltetésével a glutation mennyisége megemelhető

növényekben

Glutation reduktáz, GR

• Transzgénikus nyárfakloroplasztiszban: 1000-szeres GR-növekedés

2-szeres növekedés a glutationban (aszkorbát mennyisége is nőtt stresszhatásra)

citoszolban:5-10- szeres GR növekedésglutation mennyisége nem nőtt

GR overexpresszió a kloroplasztiszban növeli aGSH/GSSG arányt és a totál glutation mennyiséget is

• Transzgénikus dohány: 1-3,5-szörös GR növekedés

Glutation bioszintézis és homeosztázis összetett szabályozása

A glutation szintézise, felhasználása és lebontása a növényi sejtben

GSH: redukált glutation,

Glu: glutaminsav

-ECS:-glutamil cisztein

szintetáz,

GSase: glutation szintetáz,

GSSG: glutation diszulfid,

GRase: glutation reduktáz,

GST: glutation S-transzferáz,

PCS: fitokelatin szintetáz,

CPase: karboxipeptidáz,

-GTase-glutamil transzpeptidáz,

DPase: dipeptidáz

A glutation S-transferáz (GST) szerepe• Különböző elektrofil komponensek konjugálása GSH-val

(endogén metabolitok, gyomirtószerek detoxifikálása )• GSH-PX funkció→ lipid peroxidok detoxifikálása

GST/GS-PX gént túltermelő transzgénikus dohány növények megemelkedett stressz toleranciával rendelkeznek

• izomerizációs reakciók katalizátora (pl. aromás aminosavak lebontásában)

• nem-enzimatikus szállító (ligandin-funkció): endogén molekulák kötése nem-katalitikus helyen (kötés és transzport)

- auxin- és citokinin-kötő fehérjék

- cianidin-3-glukozid vakuolumba történő transzportja

- intracelluláris hormon transzport?• Apoptózis szabályozása - véd a letális hatástól

(„Bax-inhibitor GST”)

A fitokelatinok

• Fémkötő polipeptidek

(-Glu-Cys)2-11-Gly

a felesleges, toxikus fémionok megkötése, kizárása,

elkülönítése

A fitokelatinok

A fitokelatin szintáz (PCS)

• Nehézfémek és tiolátjaik aktiválják

(Cd2+, Zn2+ ,Cd.GS2, Zn.GS2) C-terminális részen Cys-csoportok fontosak az aktiválásban

• cad1 mutánsok (Arabidopsis, S. pombe) mutáció a PC szintázban

- Cd2+ -ra, Cu2+-ra hiperszenzitívek- fitokelatin-deficiensek

• PCS-expresszáló transzgénikus sejtek Cd2+-toleranciája és -akkumulációja, nagyobb, mint a kontrollé (S. pombe, S. cerevisiae, dohány, Arabidopsis)

A fitokelatinok

Cd2+ kapcsolódása két fitokelatin molekulával

A fitokelatinok

A fitokelatinok

• A Cd2+-ot jól toleráló sejtekben a Cd2+ min. 90%-a Cd-fitokelatin komplex formájában található

• A Cd-fitokelatin komplexek általában a növényi sejtek vakuólumában találhatóak

• Transzporterük: ABC-transzporter

(HMT1: heavy metal tolerance factor 1)

A vakuólum a növényi sejtek 90%-át is kitöltheti

Fitokelatin-közvetített Cd-transzport és Cd-S komplexek kialakulásának modellje

A kén csökkenti a Cd toxicitását

A metallotioneinek

Kis molekulasúlyú, ciszteinben gazdag fémkötő proteinek

(8-14 kDa, 50-70 aminosav, >30% Cys)

„fitokelatin aggregátumok” ?

Fitokelatinokhoz hasonló szerep a fémek komplexálásában

(nagyobb affinitás a Cu-hez)

Antioxidáns funkciójuk is lehet (membránok védelme)

Génexpressziójukat befolyásolják pl. nehézfémek (Cu, Zn, Cd), sebzés, öregedés, patogén fertőzés.

S. cerevisie metallotionein

A metallotionein molekula szerkezete, kiemelve a

Cys csoportok S atomjait (világosabb gömbök )

és a kötött Cu atomokat (sötétebb gömbök)

A metallotioneinek csoportosításaaminosav sorrend és összetétel alapján

I. típus: 20 Cys-t tartalmaznak (6 Cys-X-Cys két fő doménban, köztük kb. 40 aminosav)

II. típus: N- és C-terminális részen más, konzervált elrendezésben vannak az aminosavak (pl. Cys-Cys, Cys-Glu-Glu-Cys, MSCCGGNCGCS) tipikusan növényi MT

III. típus: N-terminális részen csak 4 Cys, C-terminálison 6 enzimatikusan, nem transzlációsan szintetizálódnak!

IV. típus: 3 Cys-gazdag domént tartalmaznak (5-6 Cys), köztük 10-15 aminosav)

Az N- ás C-terminális részen lévő Cd- (kék gömbök) kötő fém-centrumokat hosszabb fehérjelánc köti össze.

Egy metallotionein feltételezett szerkezete

A metallotioneinek

Génexpressziójuk különbözhet szövettől függően is:

I. típus gyökérben jobban expresszálódik, mint hajtásban, II. típus ellenkezőleg

III. típus expressziója magas levelekben és éretlen termésekben

IV. típus fejlődő magvakban expresszálódik.

Nyárfában 6 MT expresszióját vizsgálták, eltérő mintázat

A nehézfémrezisztencia lehetséges mechanizmusai

• Fémionok immobilizálása a sejtfalban (pektinek)

• PM permeabilitás változása, kompartmentizáció a vakuólumban

• Aktív kijuttatás• Kelátképzés a

citoplazmában, vakuoláris transzport

Lehetőségek a növények nehézfém rezisztenciájának, akkumulációjának,

transzportjának növelésére