Guia Actualizada 2p 2013 (1)

INVESTIGACION DEL GRUPO SANGUÍNEO ABO

1. OBJETIVODeterminar el grupo sanguíneo, con relación al sistema ABH, mediante la identificación de los aglutinógenos y las aglutininas principales que se encuentran en una muestra de sangre y suero, utilizando antisueros y glóbulos rojos conocidos según lo indicado en cada caso.

2. PRE-LABORATORIOLas pruebas utilizadas para establecer la hemoclasificación sanguínea relacionada con los diversos grupos sanguíneos, aprovechan las características inmunológicas que expresa cada individuo, de acuerdo a su particular codificación genética.En dichas pruebas se evidencian los antígenos y/o anticuerpos del grupo sanguíneo, de acuerdo a su comportamiento in-vitro. En cuanto se refiere al sistema ABH se investigan tanto los antígenos o aglutinógenos como los anticuerpos o isoaglutininas naturales.Los glóbulos rojos utilizados en estos procedimientos poseen en la membrana los antígenos que al unirse (in vitro) con los anticuerpos específicos producen reacciones que son fácilmente visibles, actuando como si fuesen los indicadores del punto final de la hemoaglutinación.La hemoaglutinación se considera la reacción de Ag-Ac de mayor utilidad en el laboratorio de Inmunohematología, por lo cual se hace indispensable recordar las características y las condiciones que modifican dicha reacción, para poder determinar con claridad los requerimientos óptimos que permitan obtener la mayor constante de equilibrio en cada prueba específica, y en esta forma se asegure la confiabilidad y contribución exitosa de los procedimientos empleados en el estudio de los grupos sanguíneos. También es necesario conocer las características específicas de comportamiento de los aglutinógenos y aglutininas del sistema ABH.Para la revisión de los aspectos mencionados tenga en cuenta los siguientes parámetros:

1. Analice las fases o etapas de la reacción de hemoaglutinación.2. Efectúe la representación esquemática de la reacción de hemoaglutinación ejemplarizada con lo que ocurre en las pruebas de

tipificación ABH. (Tenga en cuenta que el anticuerpo que interviene es una molécula pentamérica y que la hemoaglutinación se hace evidente cuando se unen muchos eritrocitos.

3. Seleccione las características específicas de los aglutinógenos y las isoaglutininas ABH, que intervienen en la reacción de hemoaglutinación y/o hemólisis, que deben tenerse en cuenta para la realización de cada prueba.

4. Para la tipificación sanguínea ABH, prueba globular se utilizan, reactivos que contienen anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Describa en forma sintética y de manera comparativa las propiedades de los anteriores reactivos teniendo en cuenta: métodos de obtención y usos.

5. Realice la revisión por medio de un mapa conceptual que incluya los principales términos usados en las pruebas de hemoaglutinación como son: afinidad, avidez, sensibilidad, especificidad.

6. Revise en el Manual de Normas Técnicas, Administrativas y de Procedimientos para Bancos de Sangre el control de calidad que se debe realizar en inmunohematología que incluye: aspecto, reactividad, especificidad, potencia y avidez.

7. Elabore una tabla comparativa, de las reacciones esperadas para cada uno de los diferentes fenotipos del sistema ABO, teniendo en cuenta antígenos y anticuerpos expresados y antisueros y células reactivas usadas.

8. Investigue la expresión genotípica y fenotípica, para cada uno de los principales grupos sanguíneos del Sistema ABO.

3. PRACTICA N° 1

IDENTIFICACION DE AGLUTINOGENOS. PRUEBA GLOBULAR, DIRECTA O DE BETH- VINCENTA. Método en tubo3.1 MATERIALES Y REACTIVOSLáminas porta-objeto. Tubos de 10 o 12 x 75 m y tubos de 13 x 10 mm. provistos de tapones de caucho o en su defecto plástico adherente. Pipetas Pasteur (plásticas), palillos, Tubos de sistema al vacío, para recolección de las muestras, tapa roja y tapa lila, con sus respectivas agujas y guías, o sistemas de jeringa hipodérmica, lupa para lectura, fuente de luz blanca.

Solución salina isotónicaSueros anti-A, anti-B, anti-A, B. Dibujos elaborados por Andrea Vallejo.

GUÍA PRACTICA DE BANCO DE SANGRE

3.2 MUESTRAS

Obtener una muestra de sangre del paciente, anticoagulada (EDTA, CPDA-1).

3.3. METODO EN TUBO

1. Marcar cuatro tubos de ensayo de vidrio de 12 x 75 mm (con marcador de vidrio) con el No. de la muestra y el nombre del antisuero correspondiente al antígeno que se va a investigar y un tubo para el control con S.S al 0.85 %.2. Tomar 2 a 3 gotas de los glóbulos rojos en estudio y lavarlos una vez con solución salina fisiológica (SSF); centrifugando a 3.400 r.p.m. x 1 minuto.3. Decantar completamente para eliminar el sobrenadante y preparar una suspensión del 3-al 5% en SSF de los hematíes previamente lavados.4. Seleccionar 4 tubos de, 12 x 75 mm e identificarlos con marcador como A, B, AB, Control, respectivamente.

Nota: Leer y seguir las instrucciones del fabricante. Continuar como sigue:

Anti-A Anti-B Anti A,B S.S 0.85 %

5. Antisuero correspondiente 1 gota (50ul) 1 gota (50ul) 1 gota (50ul) 1 gota (50ul)

6. G.R del paciente lavados y suspendidos del 2 al 5 %

1 gota (50ul) 1 gota (50ul) 1 gota (50ul) 1 gota (50ul)

7. Mezclar suavemente8. Centrifugar a 3.400 r.p.m. x 15” o a 1.000 r.p.m. x 1 minuto.9. Desprender el botón de células del fondo del tubo agitándolo suavemente; inclinarlo hasta la posición horizontal para apreciar completamente la aglutinación y cuantificar las cruces. Se debe usar siempre ayuda visual.10. Anotar inmediatamente, tubo en mano, los resultados obtenidos de la aglutinación o hemólisis.

3.4 INTERPRETACIÓN

POSITIVO: Aglutinados de Glóbulos rojos (GR) de diferentes grados de reacción según tabla.NEGATIVO: Presencia de una suspensión uniforme de los Glóbulos rojos.TABLA 1. GRADOS DE REACCIONES EN HEMAGLUTINACIÓN Y SCORE. (Marsh)


La siguiente tabla debe tenerse en cuenta para graduar todas las reacciones de hemoaglutinación de pruebas realizadas por el método en tubo.

4 ++++

Un agregado sólido compacto. No se detectan glóbulos rojos libres.

3 +++

Varios agregados grandes

2 ++ Agregados grandes en un mar de grumos más pequeños, sin glóbulos rojos libres.1 + Agregados pequeños, sobrenadante rojizo por glóbulos rojos libres.W o débil

Granularidad débil en la suspensión de glóbulos rojos. Pocos aglutinados macroscópicos pero muchos microscópicos.

0 Suspensión de glóbulos rojos uniforme. No se detectan aglutinados. Negativo.H Sobrenadante rojo brillante. Hemólisis

SCOREEs la puntuación que corresponde según el grado de aglutinación. Es de gran importancia en pruebas de titulación de anticuerpos.

4 ++++ 123 +++ 102 ++ 81 + 5W o débil 20 0H Hemolisis

3.5 Método en portaobjetos. REACTIVOS1- Anti-A mono o policlonal2- Anti-B mono o policlonal3- Anti-A,B (opcional)Nota: Todos los reactivos deben utilizarse de acuerdo a las instrucciones del fabricante.4- Solución Salina Fisiológica (0.85 %)

3.6 MUESTRASAntes de realizar pruebas en lámina portaobjetos, es preciso consultar las instrucciones del fabricante de los reactivos, algunos recomiendan efectuarlas con sangre entera y otros con suspensiones de glóbulos rojos poco concentradas, preparadas en solución salina, suero o plasma.

3.7 PROCEDIMIENTO


1. Marcar apropiadamente la lámina con A, B, AB y control.2. Agregar una gota de anti-A, anti-B, anti-AB y solución salina en el sitio correspondiente.3. Colocar las cuatro gotas de sangre con la pipeta de transferencia o Pasteur y mezclar con un palillo limpio y

diferente para cada antisuero, extendiendo la mezcla en un área de aproximadamente dos centímetros por cuatro centímetros.

4. Inclinar el portaobjetos con suavidad por 2 minutos. No colocar en superficie caliente. Rotar constantemente y observar por aglutinación.

5. Leer e interpretar frente a una buena fuente de luz blanca antes de dos minutos, (lámpara lectora)6. Anotar los resultados de acuerdo al siguiente formato.

3.8 INTERPRETACIONPOSITIVO: Aglutinados de GR máximo después de 2 minutos de la mezcla.NEGATIVO: Presencia de una suspensión uniforme de los Glóbulos rojos.

TABLA DE REGISTRO DE RESULTADOS

Nombre Paciente:_______________________No. Identificación Muestra: _____________

Prueba Directa en Lámina Rechequeó

Anti-A

Anti-B

Anti A,B

Control

Nombre Paciente: _________________________________________

Prueba Directa en Tubo Prueba Inversa Interpretación

Anti-A Anti-B Anti-A,B Control Gr A1 Gr A2 Gr B Gr O Grupo ABO

Grupo: _____________ Fecha: ____________________ Firma: ________________

Lote de Reactivos. Anti-A:___________ Anti-B:____________ Anti-A,B:____________

Fecha de Expiración: ___________ ___________ ____________

Tomado de Dia-MedGUÍA PRACTICA DE BANCO DE SANGRE

PRACTICA N° 2

IDENTIFICACION DE AGLUTININAS. PRUEBA SERICA, INVERSA O DE SIMONIN-MICHON

3.1. REACTIVOSPara esta prueba se debe disponer de hematíes A1, A2, B y O, preferiblemente Rh o D negativo suspendidos en una solución del 3-5% en solución salina fisiológico (las pruebas con hematíes A2 pueden ser opcionales).3.2. MUESTRAS1. Tomar una muestra de sangre total en tubo seco.2. Esperar 10 minutos para que se retraiga el coagulo, centrifugar 7 minutos a 1.500 r.p.m.3. Separar el suero en tubo perfectamente marcado.3.3. PROCEDIMIENTO1. Identificar apropiadamente cuatro tubos de vidrio de 12 x75 mm, por ejemplo: A1, A2, B y O.Continuar como sigue:

GR A 1 GR A2 GR B GR O2. Suero en estudio 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas

3. Hematíes grupo sanguíneo específico 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota4. Mezclar, agitando el tubo. Si desea potenciar la aglutinación los tubos pueden ser incubados durante 5 minutos a temperatura ambiente.5. Centrifugar a 3.400 r.p.m. x 15 “o a 1.000 r.p.m. x 1 minuto

6. Observar el sobrenadante contra un fondo blanco bien iluminado para detectar hemólisis.

7. Desprender el botón de células del fondo del tubo agitándolo suavemente; inclinarlo hasta la posición horizontal y leerlo contra un fondo bien iluminado para apreciar completamente los aglutinados dispersos. Emplear siempre ayuda visual.8. Anotar inmediatamente tubo en mano los resultados de la aglutinación.

3.4. INTERPRETACION

POSITIVA: Aglutinados de GR en grado variable. Graduarla de acuerdo a la Tabla # 1.NEGATIVA: Suspensión homogénea de G.R.

4. ANALISIS DE RESULTADOSDespués de observar aguzadamente como se evidencia la reacción de hemoaglutinación positiva y diferenciarla de la reacción negativa, efectúe la interpretación de las lecturas obtenidas en cada tubo o lámina teniendo en cuenta que usted investiga los aglutinógenos presentes en los glóbulos rojos y las aglutininas presentes en el suero. Haga el análisis correlacionado de lo efectuado en el laboratorio.

Resultado: El grupo sanguíneo ABO corresponderá al resultado tanto de la prueba directa o de detección de antígenos como a la de detección de aglutininas o anticuerpos.

Será el producto del análisis comparativo y correlacionado de las dos pruebas y el cual definirá el fenotipo ABO del paciente.

En caso de existir alguna discrepancia tendrá que resolverse antes de informar el grupo del paciente.


Tomado Imágenes internet5. POST LABORATORIO Analice las dificultades en determinación de la tipificación sanguínea ABH debidas a discrepancias que se

pueden presentar en las pruebas efectuadas realizando un cuadro sinóptico. ¿Cómo complementa las pruebas anteriores para la detección de los subgrupos sanguíneos?. Elabore una tabla. Explique los métodos que se pueden utilizar para detectar antígenos A, B, H, y los antígenos Lewis en

secreciones y tejidos. Investigue la frecuencia en porcentaje de cada uno de los diferentes fenotipos de los hematíes en el sistema A,

B, O en Colombia consígnelo en un cuadro comparativo o en gráficos con la frecuencia en dos países de diferentes continentes.

Investigue fundamento, procedimiento y lectura de las técnicas en microplaca y en Gel para determinación del Sistema ABO.

Tomado de Internet. Grupos sanguíneos Bahía blanca Argentina.

6. INFORME

Consigne los resultados por cada uno de los estudiantes que conforman el grupo de trabajo en el laboratorio y /o el de las muestras asignadas por el docente para estudio.

ANTICUERPOS ABH OBJETIVOSDeterminar el comportamiento serológico de los anticuerpos relacionados al sistema ABH, efectuando pruebas para detectar anticuerpos naturales y anticuerpos inmunes y diferenciar macroscópicamente con ayuda de la lupa, las variaciones cuantitativas de la reacción de la hemoaglutinación calificando los diversos grados de reacción de acuerdo a la escala de valores estandarizadas internacionalmente

2. PRE-LABORATORIOLa clasificación de los anticuerpos de grupo sanguíneo por su comportamiento serológico se basa en los patrones de reacción Ag-Ac frecuentemente observada con los anticuerpos ABH, mediante la reacción de la hemoaglutinación. Los anticuerpos hemolíticos, en presencia de complemento, por lo general aglutinan o sensibilizan las células. La cantidad del complemento del suero fresco de un donante o paciente, suele ser suficiente para que se produzca una hemólisis visible, se puede añadir complemento exógeno (suero humano AB) para aumentar la sensibilidad. Las cantidades relativas de antígeno, anticuerpo y complemento son críticas para producir un nivel adecuado de hemólisis.


Existe cierta correlación entre las propiedades físico-químicas y la actividad serológica de la mayoría de anticuerpos de grupo sanguíneo; por lo tanto es indispensable para analizar la variedad de reacciones tener en cuenta las características de los anticuerpos y en este caso específicamente los relacionados con el sistema ABH, por tanto se deben revisar los siguientes aspectos:1. Condiciones de reacción de acuerdo a las propiedades físico-químicas de los anticuerpos del sistema ABH2. Condiciones de las muestras utilizadas para investigar y cuantificar anticuerpos ABH3. Determine los elementos indispensables para que ocurra el mecanismo de lisis de glóbulos rojos mediado por anticuerpos de grupo sanguíneo4. PRACTICA N° 2

DETECCION SEMICUANTITATIVA DE ANTICUERPOS AGLUTINANTES.TITULACION DE ISOAGLUTININAS NATURALES

3.1 MATERIALES

Tubos de 12 x 75 mm (12), provistos de tapones de caucho o en su defecto de papel adherente. Suero problema fresco (grupo sanguíneo A, B u O), GR A1 y B. Pipeta Pasteur (plásticas). Pipetas automáticas con sus respectivas puntas. Suero AB y/o albúmina bovina. Solución salina fisiológica.3.2 PROCEDIMIENTOColocar en la gradilla 10 tubos de 12 x 75 mm (para cada titulación). Realizar nueve diluciones en base dos a partir de ½ hasta 1/512.1. De izquierda a derecha colocar: Suero fresco del paciente a titular: 0.1 ml en el primer y segundo tubo.2. Solución salina 0.85 % 0.1 ml desde el segundo tubo hasta el tubo 12; mezclar bien el segundo tubo (que corresponde a dilución ½) y pasar 0.1 ml de la mezcla al tercero (cambiar la punta y mezclar), y continuar así sucesivamente hasta el último tubo (cambiando siempre la punta después de dispensar la dilución anterior al siguiente tubo y antes de hacer la mezcla de la dilución). Retirar 0.1 ml de la mezcla del último tubo (en otro tubo aparte debidamente marcado) para posibles diluciones posteriores Cada tubo debe contener 0.1 ml de diluciones dobles de suero, desde suero concentrado hasta dilución 1/512.

Nota: Si se va a titular un suero grupo O para anti A y anti-B, las diluciones deben realizarse al doble, para separar 0.1 ml en un tubo adicional debidamente marcado de cada una de las diluciones para su análisis.Dibujo Elaborado por Andrea vallejo. 2006

3. Agregar GR en suspensión al 5% 0.1 ml (2 gotas) a cada tubo (glóbulos rojos A, si se están titulando anticuerpos anti-A, glóbulos rojos B, si se está titulando anticuerpos anti-B).

4. Incubar 60' a 22 º C.5. Centrifugar todos los tubos a 3.400 r.p.m. x 15”.6. Observe los sobrenadantes para detectar hemólisis.7. Desprenda los botones de células del fondo de los tubos, e incline los tubos en posición horizontal para

observar sobre un fondo bien iluminado, la aglutinación.8. Anote los resultados de cada reacción tubo en mano.


NOTA: Observe con detenimiento las variaciones en la calidad de la aglutinación empezando por las diluciones más débiles (mayor título) y terminando con las más concentradas (título más bajo). Califique la calidad de la reacción de acuerdo a la Tabla #1. (Grados de reacciones de hemoaglutinación).

4. ANALISIS DE RESULTADOS

- Después de calificar las reacciones obtenidas en los tubos establezca el titulo de la isoaglutinina natural A y/o B e informe el resultado de su prueba.- Causas de error: El uso de material sucio o inadecuado induce a error.- Enumere las causas de error inherentes a la muestra, reactivos y procedimientos.

7. POST LABORATORIO Determine la utilidad de la investigación y cuantificación de las aglutininas naturales y los anticuerpos inmunes Cuál es la contribución de estas prueba en la determinación de donantes peligrosos? Cómo se define el título de un anticuerpo?

PRACTICA N° 3 USO DE LECTINAS PARA DETERMINACIÓN DE SUBGRUPOS

Los extractos salinos de semillas reaccionan con carbohidratos específicos de las membranas celulares y los convierten en reactivos muy útiles para tipificación especialmente para los subgrupos del Sistema ABO. Es muy usada la lectina extraída del Dolichos biflorus, ya que aglutina los glóbulos rojos A1 pero no los A2. La Lectina Dolichus biflorus debe aglutinar los G.R A1 y A1B, pero no debe aglutinar las A2, A2B, B y O.

El extracto del Ulex europaeus reacciona con el determinante H; lo aglutina en forma proporcional a la cantidad de H presente (glóbulos rojos O> A2> B > A2B> A1> A1B)Leer instrucciones del fabricante.

3.1 MATERIALES Y REACTIVOS1. 10 Tubos de 12 x 75 mm.2. Gradilla3. Pipetas Pasteur o de transferencia4. Solución Salina 0.85 %5. Lectina Anti-A16. Lectina Anti-H

3.2 PROCEDIMIENTO

1. Marcar un tubo por cada muestra de glóbulos rojos que se deseen probar, con el # de identificación y la Lectina a realizar.

2. Lavar los glóbulos rojos a analizar durante 3 veces con S.S.F y suspender del 2 al 5 % en S.S.F

Continuar con el siguiente procedimiento:Muestra Control

PositivoControl

Negativo

3. GR lavados y suspendidos del 2 al 5 % del paciente.1 gota ___ ___

4. GR positivos para la Lectina a evaluar. ___ 1 gota

5. GR negativos para la Lectina a evaluar ___ ___ 1 gota

6. Lectina correspondiente 1gota 1 gota 1 gota


Muestra ControlPositivo

Control Negativo

3. GR lavados y suspendidos del 2 al 5 % del paciente.1 gota ___ ___

4. GR positivos para la Lectina a evaluar. ___ 1 gota

7. Centrifugar a 3.400 r.p.m x 15 segundas.

8. Leer y registrar con la lupa la presencia de aglutinación en la fuente de luz y registrar los resultados tubo en mano.

La lectina Dolichus biflorus debe aglutinar los glóbulos rojos A1 y A1 B, no debe aglutinar los A2, A2 B, B y O.La Lectina Ullex europaeus , debe aglutinar los glóbulos rojos de acuerdo al siguiente diagrama (Glóbulos rojos O > A2 > B > A2B > A 1> A1B).

CONTROL DE CALIDAD DE LOS REACTIVOS CELULARES

1. Aspecto: Realizar una inspección visual a los reactivos celulares en busca de hemólisis o turbidez. Frecuencia: Diaria.

2. Reactividad y Especificidad: Reacciones netas con los antisueros seleccionados frente a hematíes conocidos. Frecuencia: Con cada lote el primer y ùltimo dìa del periodo de caducidad.

PEOCEDIMIENTOMarcar nuevos tubos: tres marcados como células A, tres como células B y otros tres como células O.

Adicionar:

Células A Células B Células OTubo 1 Anti- A Anti-A Anti- ATubo 2 Anti-B Anti-B Anti- BTubo 3 Anti- A, B Anti, A,B Anti, A,B

Mezclar cada tubo y centrifugar en serófuga por 15-30 segundos.Re suspender los botones celulares y observar aglutinación.POSITIVO: Aglutinación y/o hemólisisNEGATIVO: Una suspensión uniforme de glóbulos rojos.

Interpretación: Cada antisuero debe reaccionar específicamente solamente con las células que poseen el antígeno correspondiente y no deben reaccionar con células que posean antígenos diferentes.

CONTROL DE CALIDAD DE LOS ANTISUEROS

Células D Positivo Células D NegativoAnti-DAntisuero Control Rh

CONTROL DE CALIDAD DE LOS ANTISUEROS ABO Y Rh

1. Aspecto: Ausencia de hemólisis, precipitado, partículas o formación de Gel a la inspección visual. Frecuencia: Diaria2. Reactividad y Especificidad: Descrito en el segundo punto del control de calidad de reactivos celulares.3. Potencia: El antisuero no diluido debe dar una reacción de tres a cuatro cruces en tubo utilizando una suspensión salina de hematíes a temperatura ambiente. Frecuencia: Cada nuevo lote.


PROCEDIMIENTO1. Marcar Diez tubos así: 1. (1/1) 2. (1/2) 3. (1/4) 5. (1/8) 6. (1/32) 7. (1/164) 8. (1/128) 9. (1/256) 10. (1/512)2. Agregar en todos los tubos excepto en el primero, 50 microlitros de solución salina al 0,85 a 0,9 %.3. Adicionar al primero y segundo tubo 50 microlitros de antisuero al que se le va a determinar la potencia (anti-A, anti, B, anti-D), cambiar la punta y mezclar el segundo tubo. Transferir 50 microlitros del segundo tubo al tercero y así sucesivamente (cambiando la punta de la pipeta antes de mezclar cada dilución) hasta el último tubo el N°104. Adicionar células que contengan el antígeno correspondiente al antisuero que se va a titular (Células A 1, A2, B, Células D positivas)5. Mezclar cada tubo y centrifugar por 15-30 segundos en serófuga.6. Al terminar la centrifugación observar el sobrenadante para detectar la presencia de hemólisis.7. Resuspender los botones celulares y observar aglutinación.8. Observar hasta la dilución en que se observe aglutinación.

POSITIVO: aglutinación y/o hemólisis NEGATIVO: Una suspensión uniforme de glóbulos rojos.Interpretación:Los títulos obtenidos a partir de diluciones seriadas de los antisueros deben ser de : 1/128 para anti-A, anti-B y anti A,B usando células A1 y B y de 64 con células A2 y A2B.Para los antisueros Rh:El suero no diluido debe dar una reacción de 3+ a 4+, en la prueba designada para cada suero y un título de 1/16 para anti-D, anti-C, anti-E, anti- CD, anti- DE y anti-CDE 4. Avidez:Aglutinación macroscópica con una suspensión de Hematíes al 50% en una prueba en portaobjetos, en un tiempo de 5 segundos para anti- A, anti-B y anti-A,B con células A1 y BPara Rh: Usar suspensión al 40% en suero homólogo en portalámina a 40°C, la aglutinación macroscópica debe aparecer a los 30 segundos frente a hematíes del fenotipo adecuado Frecuencia: Cada nuevo lote CONTROL DE CALIDAD DE LOS ANTISUEROS DEL SISTEMA ABO

REQUISITOS MINIMOS PARA EL ANALISIS MUESTRAS DE CONTROL

FRECUENCIAS CONTROL EJECUTADO

PORTipificación ABO

O, A, A1B, B y A2B

Tipificación inversa ABO

Uso de células A y B

Tipificación Rh (D)

Tipificación por duplicado utilizando dos sueros diferentes de anti-D, utilización de la AGH para confirmación del D débil en los donantes Si se utilizan dos anti- D monoclonales debe comprobarse que el sistema reconozca las variantes del D.

Una muestra Rh ( D ) positiva, y una muestra Rh(D) negativa

Cada serie de pruebas o al menos una vez al día siempre que se usen los mismos reactivos

Fenotipo Rh Tipificación por duplicado utilizando dos antisueros por cada factor Rh

Para un fenotipo Rh completo: una muestra de cada uno de los tipos

Reactividad y Especificidad:


Reactivo Células ALoteF. Exp.

Células BLoteF. Exp.

Células OLoteF. Exp.

Anti- AAnti-BAnti-D

Potencia:1/1

1/2

1/4

1/8

1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512

Anti- ACélulas A1Células A2Anti- BCélulas BAnti- DCélulas D

Anti-A, Lote: F exp: Anti-B, Lote: F exp:Anti-D, Lote: F exp:

Avidez:Anti suero Células Tiempo de reacciónAnti- A A1

Anti- B BAnti- A1B A1BAnti- A2B A2BAnti-D D

CONTROL DE CALIDAD EN LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ERITROCITARIOS

TIPO DE PRUEBA REQUISITOS MINIMOS DE LAS PRUEBAS

MUESTRAS DE CONTROL

FRECUENCIAS CONTROL EJECUTADO

PORa) Pruebas para anti-B y anti-B inmunes (en donantes)

Uso de hematíes A y B Muestras de suero con una cantidad de anti-A y anti-B inmunes, respectivamente superior e inferior al título de aglutinación directa en salina para anti A y anti B

Cada serie de pruebas

b) Pruebas para anticuerpos irregulares en donantes

Uso de la prueba mediante la cual se detectan los anticuerpos con importancia clínica y que reaccionan fuertemente

Muestras de suero con aloanticuerpos eritrocitarios conocidos

Ocasional por parte del supervisor del laboratorio y participación en ejercicios externos de comprobación

c) Pruebas de anticuerpos irregulares (en pacientes)

Uso por lo menos de:* Una prueba salina a 37°C.* Un test enzimático.* La prueba AGH indirecta*O una prueba manual o automatizada con sensibilidad equivalente

Lo mismo que para (b) Lo mismo que para (b)

d) Pruebas de compatibilidad

Uso por lo menos de:* Una prueba salina a 37ºC*La prueba antiglobulina indirecta* O una prueba manual o automatizada con

Lo mismo que (c) Lo mismo que (c)


sensibilidad equivalente

PRACTICA N° 4TIPIFICACION SANGUINEA Rh

1. OBJETIVODeterminar la clasificación sanguínea, en relación al sistema Rh, segundo Sistema sanguíneo en importancia después del ABO, efectuando pruebas que identifiquen los principales antígenos del sistema que se encuentran presentes en una muestra de sangre dada.La práctica incluye la Determinación del Antígeno D presente en los Glóbulos rojos por diferentes métodos, la investigación de los cinco principales antígenos del Sistema exceptuando el D, como son: C, c, E, e. Reconocer el interés e importancia clínica de su determinación. Identificar las características de los antígenos del sistema y los diferentes reactivos y métodos existentes para la determinación de los fenotipos relacionados.Identificar los Genotipos más probables de acuerdo a los resultados de la fenotipificación realizada.Analizar las opciones de transfusión para los diferentes componentes sanguíneos de acuerdo al Rh de los receptores.

2. INTRODUCCIÓNEl sistema del grupo sanguíneo Rhesus es de gran importancia en biología humana. Es el más importante después del Sistema ABO. Su conocimiento permitió lograr transfusiones exitosas después de la segunda guerra mundial. Su descubrimiento permitió comprender el mecanismo de la enfermedad hemolítica del recién nacido por inmunización feto - materna. Dado que la mayor parte de la población es Rh positivo, es indispensable que en el laboratorio de Inmunohematología se utilicen los procedimientos adecuados para establecer la correcta clasificación para el antígeno D, incluyendo las variantes débiles y el fenotipo Rh, para lograr disminuir la sensibilización eritrocitaria por transfusión o embarazo asociada con este sistema.Los antígenos Rhesus fueron identificados por anticuerpos descubiertos en el suero de sujetos transfundidos o mujeres embarazadas. Estos anticuerpos en su mayoría anticuerpos inmunes, que pertenecen a la IgG y son incapaces de aglutinar in-vitro los hematíes portadores del antígeno correspondiente, se les denominó anticuerpos bloqueadores o incompletos.Por esta razón se utilizan corrientemente técnicas de aglutinación “in vitro” para comprobar la fijación del anticuerpo al antígeno específico mediante modificación del medio de suspensión de los hematíes mediante macromoléculas o altas concentraciones de proteínas (albúmina bovina) o utilización de hematíes tratados con enzimas; bromelina, papaina, ficina.El antígeno D es el más importante en transfusión e incompatibilidad feto-materna, dada su gran inmunogenicidad, los restantes antígenos del Sistema pueden también ser causa de inmunización.La rutina en el laboratorio de Inmunohematología incluye la determinación del antígeno D y la detección del antígeno D débil, confirmación del antígeno D negativo en todos aquellos individuos susceptibles de recibir transfusiones repetidas o en posibles futuras embarazadas a quienes también deben identificárseles los 5 antígenos principales del sistema Rhesus.

Para la determinación del antígeno D se utilizan variedades de antisueros cada una de ellas tiene modificaciones o indicaciones específicas para sus uso, para lo pertinente se revisarán algunos aspectos de comportamiento y actividad de dichos antisueros y la utilidad práctica de cada uno de ellos.3. PRE- LABORATORIO

1. Teniendo en cuenta las variedades de antisueros anti-D que existen comercialmente; explique comparativamente las diferencias existentes y sus diversas aplicaciones.

2. En relación a la variante débil del D analice el comportamiento variable frente a los anticuerpos anti-D (Rh).3. Destaque las condiciones de reacción indispensables para detectar antígenos Rh.4. Explique porque se deben emplear en las pruebas de tipificación Rh controles con sueros inertes.5. Qué tipo de antisuero debe de usarse en la determinación del antígeno D en caso de pruebas en tubo con resultado

positivo en el control de prueba.6. Revise y analice a fondo las expresiones D débil y D parcial y explique en un cuadro las diferencias.7. Investigue los diferentes tipos de suero de de Coombs existente y los métodos de obtención.GUÍA PRACTICA DE BANCO DE SANGRE

8. Revise el fundamento de las pruebas de Coombs, su aplicación para la detección de antígenos débiles y la aplicación en la determinación de la variante D débil. Explique el fundamento de la prueba.

4. LABORATORIODETERMINACION DEL FACTOR Rh(D)a. Método en Lámina

4.1. MATERIALES Y REACTIVOSLáminas portaobjetos, palillos, sangre total, suero anti-D y reactivo control Rh, lámpara con visor de aglutinación, lupa, pipetas Pasteur.4.2. PROCEDIMIENTOLeer siempre las instrucciones del fabricante sobre el uso de los reactivos para pruebas en tubo o láminaColocar sobre una lámina de vidrio previamente calentada a 4°C, una gota de suero anti-D, en otra lámina una gota de control Rh o en su defecto albúmina bovina al 22%, agregar a cada lámina una gota de sangre ó una suspensión de hematíes en su propio suero al 50%. Mezclar circularmente y extender sobre una superficie de 22 mm x 40 mm utilizando un palillo de madera, dentro de los 2 minutos siguientes oscilando la lámina observar presencia o ausencia de aglutinaciónNota: Siempre debe usarse un control con el fin de que GR sensibilizados con anticuerpos de tipo IgG(incompletos) o procedentes de pacientes cuyo suero posea globulinas sericas anormales, anticuerpos autoinmunes, aglutininas frías o proteínas que causen rouleaux, y que pueden agregarse espontáneamente sean detectados.4.3 INTERPRETACIONPOSITIVO: Aglutinación de los glóbulos rojos.NEGATIVO: Suspensión uniforme de glóbulos rojos.Observaciones:Si la preparación de glóbulos rojos en el tubo control presenta aglutinación; la prueba no se logra interpretar (Esto puede suceder con antisueros de alta concentración proteica caso en el cual se usa un antisuero salino)Se debe tener cuidado en no leer pasado el tiempo indicado ya que la desecación en los bordes de la preparación se puede confundir con aglutinación.b. Método En Tubo

4.1 MATERIALESTubos de 12 x 75 mm, suspensión de glóbulos rojos 3 - 5%, baño serológico, anti-D, reactivo control Rh, Pipetas Pasteur.

4.2 PROCEDIMIENTO1. Lavar los glóbulos rojos del paciente con solución salina fisiológica (SSF) 0.85 % y preparar una suspensión de

glóbulos rojos a examinar al 3 - 5 % en SSF.2. Identificar apropiadamente dos tubos de 12 x 75 mm (para la prueba y su control) y el número de identificación de

la muestra.

Continuar con el siguiente procedimiento:

Anti-D Control-Rh3. Dispensar 1 gota o 50 ul ____

4. Agregar ____ 1 gota o 50 ul5. GR en estudio lavados y suspendidos del 2 al 5 %

1 gota o 50 ul 1 gota o 50 ul

6. Mezclar y Centrifugar a 3.400 r.p.m. (serófuga) por 15”, o a 1.000 r.p.m. por 1 minuto.7 .Resuspender suavemente el botón de las células del fondo del tubo y leer la aglutinación en cruces8. Si no se observa aglutinación incubar 15 a 30 minutos a 37°C.9 .Centrifugar, leer y registrar.

4.3 INTERPRETACIONPOSITIVO: Aglutinación superior a 2+ antes o después de incubación.


NEGATIVO: Suspensión uniforme de GR o aglutinación débil o dudosa. En este caso continuar con procedimiento para variante débil.

PRACTICA N° 5DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Rh

3.1 MATERIALES Y REACTIVOS-6 Tubos de 12 x 75 mm, Baño de María, Serófuga, Lámpara, Lupa.-Antisueros: Anti- C, anti – E, Anti- c, Anti- e.-Solución salina 0.85 %.3.2 PROCEDIMIENTO1. Lavar los glóbulos rojos 3 o 4 veces y suspender del 2 al 5 %.2. Marcar un tubo por cada antígeno a determinar, con la letra correspondiente al antígeno y el # de identificación

de la muestra.4. INTERPRETACIÓNPOSITIVO: Se observa aglutinación en grado variable.NEGATIVO: Suspensión homogénea de los glóbulos rojos5. POS LABORATORIO1. Para la tipificación Rh se pueden emplear antisueros monovalentes y polivalentes, específicamente determine la importancia de utilizar sueros anti-CD, y anti-CDE.2. ¿Considera usted que en un paciente D negativo que va a recibir una transfusión sanguínea es importante realizar el fenotipo Rh y porque?3. ¿Por qué se debe determinar el fenotipo del sistema Rh en todas las personas Rh D: Negativo?

4. Revise las principales nomenclaturas internacionales para identificar los diferentes fenotipos del sistema Rh

PRACTICA N° 6DETERMINACION DE LA EXPRESIÓN DÉBIL DEL ANTIGENO D

3.1. MATERIALES Y REACTIVOSTubos de 12 x 75 mm, Antisuero anti-D (Rh), suero de Coombs, Albúmina bovina al 30% control de Coombs.3.2. PROCEDIMIENTO

1. Lavar los glóbulos rojos del paciente con SSF al 0.85 % y preparar una suspensión de glóbulos rojos a examinar al 3-5 % en SSF.

2. Identificar apropiadamente dos tubos de 12 x 75 mm (para la prueba y su control) y el número de identificación de la muestra.Continuar con el siguiente procedimiento:

Anti-D Control-Rh3. Dispensar 1 gota ____4. Agregar ____ 1 gota5. GR en estudio lavados y suspendidos del 2 al 5 % 1 gota 1 gota6. Incubar a 37°C por 30 minutos

7. Centrifugar y leer. Si el resultado es positivo no continuar. Si es Negativo o dudoso continuar con el siguiente paso.

8. Lavar 3 ó 4 veces en solución salina6. Agregar suero de Coombs poliespecífico 1 a 2 gotas 1 a 2 gotas7. Centrifugar a 3.400 r.p.m. x 15”

8. Leer por aglutinación

9. Si es negativa la prueba añadir solo una gota de control de Coombs. Mezclar, centrifugar, leer por aglutinación.

3. INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO1. La presencia de aglutinación en el tubo con anti- D, pero no en el de Control, constituye un resultado positivo. La

sangre debe clasificarse como D positivo ya que tiene una expresión Débil del Antígeno D.GUÍA PRACTICA DE BANCO DE SANGRE

2. La ausencia de aglutinación en el tubo con anti- D constituye un resultado negativo e indica que las células no expresan D y deben clasificarse como D negativo.

4. ANALISIS DE RESULTADOS7. POST LABORATORIO

¿Cómo se rotulan las bolsas de sangre obtenidas de donantes con prueba de expresión Débil del Ag D: positiva? Revisar los criterios de transfusión en donantes y receptores que presentan una expresión débil del Ag D Positiva. Analice la importancia de determinar la presencia de un antigeno D débil en una materna y explique?.

PRACTICA N° 7DETERMINACIÓN DE FENOTIPO EXTENDIDO

1. OBJETIVOSDeterminar la presencia de los antígenos eritrocitarios más importantes de los Sistemas de Grupos sanguíneos principales.2. PRE LABORATORIO

1. Defina fenotipo eritrocitario.2. Investigue tipo de muestra que se emplea para determinación del fenotipo eritrocitario y condiciones de las

mismas.3. Revise la frecuencia de los fenotipos en raza blanca y raza negra para los siguientes Sistemas:Kell ( K+ k-), (K-k+), (K+k+), (K-k-).Duffy (Fya + Fyb-), (Fya – Fyb+), (Fya + Fyb+), (Fya- Fyb-).Kidd (Fya + Fyb-), (Fya – Fyb+), (Fya + Fyb+), (Fya- Fyb-).MNSsU: Principales combinacionesLewis (Lea+Leb-), (Lea-Leb+), (Lea+Leb+), (Lea-Leb-).Lutheran (Lua+Lub-), (Lua-Leb+), (Lua+Lub+), (Lua-Lub-).4. Revisar el fundamento de la prueba de antiglobulina indirecta aplicada a la determinación de antígenos

eritrocitarios.

3. LABORATORIO

3.1 MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de 12 x 75 mm de fondo redondo. Suero de Coombs poliespecífico (Anti- IgG y anti- complemento) Solución salina. Muestra de sangre anticoagulada del paciente.

3.2 PROCEDIMIENTO PARA DETECCIÓN DE FENOTIPOS EN FASE DE ANTIGLOBULINA


Casa comercial Sanquin .Reactivo para raros grupos sanguíneos. Método AGT(k, Kpa, Kpb, Fya, Fyb, Lua. Lub, s, Wra)

Muestra Controles

1. Agregar reactivo policlonal correspondiente. Leer instrucciones del fabricante.

1 gota 1 gota

2. Preparar una suspensión de G.R del paciente del 3 al 5 % previamente lavados en SSF al 0.85 %

1 gota 1 gota

Mezclar suavemente

Incubar de 15 a 20 minutos a 37o C

3. Lavar las células en solución salina tres o cuatro veces. Centrifugar y decantar muy bien después de cada lavada. Eliminar completamente el sobrenadante final.

4. Suero de Coombs (una o dos gotas, según recomendación del fabricante). Según fabricante

________

5. Mezclar. Centrifugar (30" en serófuga a 3.400 r.p.m)

6. Leer por aglutinación y registrar.

7. Si no se observa aglutinación en los tubos añadir control de Coombs. 1 gota 1 gota

8. Centrifugar. Examinar por aglutinación, si la prueba fue realizada correctamente debe dar 2+ a 3+ de aglutinación.*

4. INTERPRETACIONPOSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.( Se debe reportar la afinidad de la reacción.

(Escala de Cruces)NEGATIVA: Suspensiones homogéneas. Indica la ausencia del antígeno correspondiente.Nota: Probar siempre los resultados negativos con células control de Coombs Para validar la prueba debe existir

aglutinación al agregar las células, centrifugar y leer,5. LIMITACIONES DE LA PRUEBA

Resultados positivos inesperados a causa de: poliaglutinación, autoaglutinación, reacción de aglutinación mixta.Resultados negativos o débiles a causa de antígenos débiles, reacción de aglutinación mixta, actividad reducida del reactivo.Células rojas con PAD Positiva producen un resultado Falso positivo.

3.3 PROCEDIMIENTO PARA DETECCIÓN DE FENOTIPOS POR AGLUTINACIÓN EN PRUEBA DIRECTA

Casa comercial Sanquin (M, N) IgG y (S, P1, Lea, Leb) IgM monoclonales

Muestra Controles

1. Agregar el reactivo monoclonal (IgM) correspondiente. Leer instrucciones del fabricante.

1 gota 1 gota

2. Preparar una suspensión de G.R del paciente del 2 al 5 % previamente lavados en S.S al 0.85 %

1 gota 1 gota

Mezclar suavemente

Incubar de 5 a 15 a temperatura ambiente( 18 a 25 oC)


3. Centrifugar (30" en serófuga a 3.400 r.p.m)


4. INTERPRETACIONPOSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.( Se debe reportar la afinidad de la reacción.

(Escala deCruces)NEGATIVA: Suspensiones homogéneas. Indica la ausencia del antígeno correspondiente.

5. LIMITACIONES DE LA PRUEBA

Resultados positivos inesperados a causa de: pseduiaglutinación, autoaglutinación, reacción de aglutinación mixta, presencia de gelatina de Wharton en las células de cordón umbilical.Resultados negativos o débiles a causa de antígenos débiles, reacción de aglutinación mixta, actividad reducida del reactivo.Células rojas con PAD Positiva pueden producir un resultado Falso positivo. Para estos casos se recomienda usar un control monoclonal inerte.

3.4 DETERMINACIÓN DE FENOTIPOS JKa y JKb (IgM) con antisuero Monoclonal.Casa comercial Sanquin

Muestra Controles


1 gota 1 gota

2. Preparar una suspensión de G.R del paciente del 3 al 5 % previamente lavados en S.S al 0.85 %

50 ul 50 ul

Mezclar suavemente

Incubar de 5 a 15 minutos a temperatura ambiente( 37oC)



4. INTERPRETACION

POSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.( Se debe reportar la afinidad de la reacción. (Escala de Cruces)

NEGATIVA: Suspensiones homogéneas. Indica la ausencia del antígeno correspondiente.5. LIMITACIONES DE LA PRUEBA

Resultados positivos inesperados a causa de: pseudoaglutinación, autoaglutinación, reacción de aglutinación mixta, presencia de gelatina de Wharton en las células de cordón umbilical.Resultados negativos o débiles a causa de antígenos débiles, reacción de aglutinación mixta, actividad reducida del reactivo.Células rojas con PAD Positiva pueden producir un resultado Falso positivo. Para estos casos se recomienda usar un control monoclonal inerte.


3.5 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACIÓN DE FENOTIPOS Cw, Jka, Jkb, M y anti N.Casa Comercial Diagast ( Reactivos con anticuerpos monoclonales de tipo IgM obtenidos a partir de sobrenadantes de cultivos in vitro de hibridomas de origen humano)

Muestra Controles


1 gota 1 gota

2. En tubo plástico preparar una suspensión al 5 % en S.S isotonica de los G.R sin lavar del paciente.

50 ul 50 ul

Mezclar suavemente



4. INTERPRETACION

POSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.NEGATIVA: Suspensiones homogéneas, indican la ausencia del antígeno correspondiente.

3.6 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE FENOTIPO LeaDiagast

Muestra Controles


1 gota 1 gota


50 ul 50 ul

3. Agregar PALERM( PAPAINA) 1 gota 1 gota

Incubar los tubos 5 minutos entre 18 y 25 oC

4. Mezclar por agitación suave y centrifugar (30" en serófuga a 3400 r.p.m)

4. Leer por aglutinación inmediatamente y registrar.

4. INTERPRETACION

POSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.NEGATIVA: Suspensiones homogéneas, indican la ausencia del antígeno correspondiente.

3.7 ROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE FENOTIPO LebDiagast

Muestra Controles


1 gota 1 gota

2. En tubo plástico preparar una suspensión al 5 % en S.S isotonica de los 50 ul 50 ul


G.R sin lavar del paciente.

3. incubar los tubos 15 minutos entre 18 y 25 oC

4. Mezclar por agitación suave y centrifugar (30" en serófuga a 3400 r.p.m)


4. INTERPRETACIONPOSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.NEGATIVA: Suspensiones homogéneas, indican la ausencia del antígeno correspondiente.

3.6. ROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE FENOTIPO P1. Diagast

Muestra Controles

1. Agregar el reactivo monoclonal correspondiente. Leer instrucciones del fabricante.

1 gota 1 gota


50 ul 50 ul

3. Mezclar por agitación suave y centrifugar (30" en serófuga ó a 3.400 r.p.m).


5. Si no se observa aglutinación, incubar los tubos de 2 a 8º C por 30´.

6. Mezclar por agitación suave y centrifugar (30" en serófuga ó a 1.500 r.p.m).

4. INTERPRETACIONPOSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.NEGATIVA: Suspensiones homogéneas, indican la ausencia del antígeno correspondiente.8. POST LABORATORIO

1. Cuáles son las aplicaciones en la clínica del fenotipaje extendido.2. De acuerdo a los resultados obtenidos, compare su fenotipo con los conocidos para cada una de las razas.3. Determine cuales son los principales antígenos teniendo en cuenta su naturaleza química y su capacidad

para que los anticuerpos correspondientes se encuentren involucrados en E.H.R.N y R.T inmunes.PRACTICA N° 8

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA (D.A.T.)

1. OBJETIVOS

Demostrar glóbulos rojos sensibilizados in-vivo al poner en evidencia globulinas anticuerpos que se han adherido a los eritrocitos in-vivo mediante el empleo de la antiglobulina humana.Es útil en anemias hemolíticas autoinmunes, enfermedad hemolítica del recién nacido, hemólisis inducida por drogas, reacciones aloinmunes contra eritrocitos recientemente transfundidos.2. PRE LABORATORIO1. Defina un GR sensibilizado2. Analice los diferentes grados de sensibilización de un GR y las concentraciones o proporciones de anticuerpos que pueden evidenciarse con el suero Coombs.


3. Referente al suero de Coombs; detalle el procedimiento de obtención y preparación del suero de Coombs.4. Describa las variedades del suero de Coombs y establezca las diferencias entre dichas variedades.5. Analice las aplicaciones y utilidad del suero de Coombs6. Determine las variedades y condiciones de las muestras que se emplean.7. Fundamentos de la prueba de Coombs directo.8. Función del suero de Coombs y la reacción de hemoaglutinación.3. LABORATORIO

3.1 MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de 12 x 75 mm Suero de Coombs poliespecífico (Anti- IgG y anti- complemento) Solución salina. Muestra de sangre anticoagulada del paciente. Albúmina bovina al 6 % en suspensión que se prepara diluyendo albúmina bovina al 22 % o 30 % en solución salina.

3.2 PROCEDIMIENTOMuestra Control

1. Suspensión de G.R del paciente del 2 al 5 % 1 gota 1 gota

2. Lavar las células en solución salina tres o cuatro veces. Centrifugar y decantar muy bien después de cada lavada. Eliminar completamente el sobrenadante final.

3. Albúmina bovina al 6 % 2 gotas

4.. Suero de Coombs (una o dos gotas, según recomendación del fabricante). Según fabricante

________

5. Mezclar. Centrifugar (30" en serófuga ó en centrifuga a 1.500 r.p.m. por 1-2 minutos)

6. Leer por aglutinación o hemólisis y registrar.

7. Si no se observa aglutinación en el tubo Muestra añadir control de Coombs.

1 gota

8. Centrifugar. Examinar por aglutinación, si la prueba fue realizada correctamente debe dar 2+ a 3+ de aglutinación.*

* Si el Coombs es poliespecifico o C3d incubar 5 minutos a Tº ambiente, centrifugar y leer.4. INTERPRETACION

PAD POSITIVA: Aglutinación. Se debe reportar el grado de aglutinación (Escala deCruces)PAD NEGATIVA: Suspensiones homogéneas

Probar siempre los resultados negativos con células control de Coombs Para validar la prueba debe existir aglutinación al agregar las células, centrifugar y leer,

5. ANALISIS Y RESULTADOSAnalice detalladamente el papel de control de Coombs que se utilizó en la prueba. Describa otras formas de controlar las pruebas. Identifique las causas de error

8. POST LABORATORIO4. Determine las causas de una prueba antiglobulina Directa Positiva.5. ¿Cuál es el resultado de las pruebas De Coombs Directo en las E.H.R.N por ABO y en la E.H.R.N por Rh.6. ¿En qué consiste la prueba de Coombs Fraccionado? y explique cual es su valor diagnóstico.7. Explique si es posible encontrar PAD Negativo en pacientes con AHAI y porqué?

PRACTICA N° 9


PRUEBA DE COOMBS INDIRECTO (I.A.T. o PAI o RAI)

1. OBJETIVOSDetectar en el suero del paciente la presencia de Anticuerpos incompletos de diversos grupos sanguíneos diferentes a los del Sistema ABO, incapaces de aglutinar directamente los hematíes pero capaces de adherirse (sensibilizar) a los GR in- vivo o in-vitro, y posteriormente demostrarse con la adición del suero de Coombs.Está prueba tiene gran utilidad en la detección e identificación de anticuerpos irregulares, agrupación de la sangre y pruebas de compatibilidad.

2. PRE LABORATORIOSENSIBILIZACION IN-VITROEn un primer tiempo se ponen los hematíes lavados que poseen el antígeno correspondiente a los anticuerpos a investigar con el suero del paciente, Si el suero contiene anticuerpos irregulares estos se fijaran sobre los hematíes que poseen el antígeno correspondiente. Los hematíes sensibilizados al adicionar el suero de Coombs se evidenciarán mediante aglutinación.Revise:

1. Clases de anticuerpos que se detectan con la prueba del Coombs Indirecto.2. ¿En qué casos se debe utilizar la prueba de Coombs a diferentes temperaturas?3. ¿Cuál es el valor diagnóstico de la prueba I.A.T3. LABORATORIO

3.1 MATERIALES Y REACTIVOS- Tubos de 12 x 75 mm.- Suero de Coombs de amplio espectro.- Solución salina fisiológica.- Suero del paciente fresco.- Glóbulos rojos reactivos o Glóbulos rojos O Positivo- Albúmina bovina al 6% o Solución de baja fuerza iónica.- Pipetas de transferencia3.2 PROCEDIMIENTOSe emplean glóbulos rojos comerciales, existen en diferentes presentaciones, tres células, dos células o una célula. La presentación en varias células permite tener mayor número de células con antígenos de expresión homocigota lo cual facilita la detección de anticuerpos.Las células deben ser del grupo 0 y expresar los antígenos de grupos sanguíneos principales como son: D, C, E, c, e, f, Cw, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, Xg, Lea, Le, S, s, M, N, P, Lua.Estos dos grupos de glóbulos rojos son provenientes de dos donantes con los siguientes fenotipos de Rh: Rh1 (Dce) y Rh2 (DcE) y vienen suspendidos al 3% en una solución de Alsevers modificada.Únicamente en caso de investigación de anticuerpos Rho D se pueden utilizar en lugar de glóbulos rojos comerciales; glóbulos rojos O Rho D positivos lavados tres veces y suspendidos del 2 al 5 % en S.S. fisiológica.

El suero del paciente a investigar debe ser fresco, nomás de 24 horas después de la recolección. Debe estar libre de hemólisis y separado prontamente después de recolectado. Hasta el momento del análisis congelar para preservar el complemento.En toda investigación de anticuerpos irregulares es importante la Historia del paciente como:

1. Historia de embarazos y abortos.2. Transfusiones anteriores.1- Marcar el número de tubos de acuerdo a las células a usar. Se debe emplear un tubo por célula y un autocontrol.

Continuar el procedimiento de acuerdo al cuadro que sigue:

I II Autocontrol2. Suero del paciente 2 gotas 2 gotas 2 gotas3. G.R reactivos del 2 al 5 % 1 gota 1 gota --------


4. G.R del paciente lavados y suspendidos del 2 al 5 %

-------- ------- 1 gota

5. Centrifugar, leer y registrar.6. albúmina bovina o solución de baja fuerza iónica

2 gotas 2 gotas 2 gotas

7. Incubar a 37C por 30´ en el caso de usar albúmina y 10 a 15 minutos para solución de baja fuerza iónica.).

8. Centrifugar de 15 a 45 segundos.9. Leer*10. Lavar tres a cuatro veces con solución salina fisiológica.11.Decantar perfectamente los tubos.

12. Suero poliespecífico de Coombs 2 gotas 2 gotas 2 gotas13. Centrifugar a 3.400 r.p.m. x 15 “o a 1.000 r.p.m. x 1 minuto

14. Leer desprendiendo el botón de células del fondo del tubo observando la aglutinación por cruces y registrarlo.

Nota: A los tubos con resultado negativo agregar 1 gota de Control de Coombs, centrifugar y leer. Debe producirse una aglutinación de 2 + a 3+ para validar la prueba,

* Observar la presencia de hemólisis en el sobrenadante, resuspender sobre la lámpara y usando la lupa para observar la aglutinación. Registrar los resultados. Si hay aglutinación graduarla según escala.

6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES- Siempre que tengamos un resultado positivo se debe identificar el anticuerpo.- El suero debe ser congelado para investigaciones posteriores.- En caso de que el paciente sea una mujer embarazada se debe realizar la cuantificación del anticuerpo.

7. POST LABORATORIO Identifique los resultados falsos positivos y falsos negativos de las pruebas de Coombs. ¿Cuál es el valor Crítico de las pruebas de Coombs indirecto cuantitativo en la Enfermedad Hemolítica del Recién

Nacido? ¿En que se diferencia una prueba de Coombs Indirecto y un Rastreo de Anticuerpos Irregulares (RAI)

PRACTICA N° 10IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS

1. OBJETIVODeterminar la especificidad y el significado clínico de los anticuerpos irregulares presentes en una muestra de suero.2. PRE- LABORATORIOLa identificación de anticuerpos se realiza utilizando un panel de células obtenidas de 11 donantes envasadas individualmente y organizadas de tal forma que la combinación de reacciones positivas o negativas puedan dar perfectamente clara la identificación del anticuerpo problema. Cada uno de estos donantes ha sido fenotipado para los principales antígenos de los más importantes grupos sanguíneos menores y su fenotipo viene especificado en la tabla anexa al reactivo.

El principio de esta prueba, es el de hacer reaccionar el suero del paciente a investigar, con cada una de las células a T ° ambiente, a 37°C y Coombs, esto dará mayor seguridad de identificación.Está identificación tiene gran valor en pacientes que van a ser transfundidos y tienen un rastreo de anticuerpos

positivo, maternas con rastreo de anticuerpo positivo y pacientes con enfermedad hemolítica autoinmune. 3. LABORATORIO 3.1. MATERIALES12 tubos de 10 x 75 mm, pipetas de Pasteur, serófuga, calentador seco o baño María, albúmina bovina o solución de baja fuerza iónica, solución salina, control de Coombs, suero del paciente en congelación, panel de células,.3.2 TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS

1. Marcar los tubos de 1 a 12 el último es auto control


2. Colocar dos gotas de suero para investigar en cada uno3. Colocar en cada uno una gota de la célula correspondiente, el auto control (tubo No. 12) lleva células del propio

paciente, lavadas y suspendidas al 3%4. Dejar los tubos a T° ambiente 10', antes de centrifugar5. Centrifugar siguiendo las instrucciones dadas en las investigaciones de anticuerpos6. Observar microscópicamente por aglutinación o hemólisis. Anotar los resultados en hojas especiales que vienen con

el panel (Solución Salina a T ambiente)7. Agregar dos gotas de albúmina bovina o LISS en cada tubo. Centrifugar, leer y anotar8. Incubar todos los tubos a 37C x 15 a 30' si se usa albúmina o 10 a 15’ si se usa LISS.9. Centrifugar a 3.400 r.p.m. (serófuga) 30", leer y anotar resultados.

10. Lavar tres o cuatro veces. Agregar 1-2 gotas (depende del fabricante) de suero de Coombs a todos los tubos.11. Centrifugar, leer y anotar. Determinar mediante la exclusión de posibilidades, el anticuerpo presente.12. Confirmar mediante tipificación para el antígeno correspondiente, que el paciente es negativo para el antígeno.NOTA:En algunos casos, no pueden encontrarse la especificidad del anticuerpo usando este panel, pero las casas comerciales están en capacidad de suministrar otro panel (panel raro) para la identificación de estos anticuerpos menos comunesExiste además, la posibilidad de encontrar múltiples anticuerpos en un solo paciente, cuando esto se presenta, hay necesidad a veces de utilizar células adicionales.7. POST LABORATORIO Defina:

Anticuerpo clínicamente significativo. Qué valor tiene esta prueba de identificación de Acs irregulares en estudio prenatales? Explique la importancia de identificar el anticuerpo irregular presente en el suero de un paciente que va a ser

transfundido. Después de realizar la Identificación del o los anticuerpos irregulares por medio del panel de células como podría

corroborar su especificidad.PRACTICA N° 11

TITULACIÓN DE ANTICUERPOS PARA LA DETECCIÓN PRECOZ DE LA E.H.R.N1. INTRODUCCIÓN

La titulación es un método semicuantitativo para la determinación de la concentración de anticuerpos. Se preparan diluciones seriadas de suero y se evalúa la actividad de los anticuerpos. El título es la inversa de la dilución más alta de plasma o suero que exhibe una reacción de 1 +.Ej: Dilución de 1 en 128, título = 128.

Durante el embarazo, la titulación de anticuerpos se realiza para identificar las mujeres con niveles significativos de anticuerpos que podrían llevar a enfermedad hemolítica del recién nacido (E.H.R.N) y, en el caso de los anticuerpos en títulos bajos, establecer un valor basal para compararlos con los de titulaciones posteriores. 2. OBJETIVODeterminar la concentración de anticuerpos de importancia clínica en muestras de suero con el fin de que sirvan para el pronóstico clínico de la posible E.H.R.N, siendo de gran ayuda para el seguimiento y manejo de la misma desde la etapa gestacional. 3. PRE LABORATORIOLos anticuerpos presentes en una muestra de suero fresca, se encuentran en concentraciones desconocidas, por lo cual se requiere de la realización de técnicas que incluyen la dilución del suero y posterior unión con los G. R reactivos y posterior uso de la antiglobulina humana, para encontrar el título máximo en que es capaz de aglutinarlos. De igual manera es importante conocer la potencia (score) del anticuerpo para lo cual está prueba es de gran valor.Responda las siguientes preguntas:

1. Cuales serian los criterios para seleccionar las células que se deben usar para la cuantificación de anticuerpos irregulares?

2. Qué tipo de anticuerpos presentes en una madre gestante tendrían importancia clínica para ser cuantificados?4. LABORATORIOGUÍA PRACTICA DE BANCO DE SANGRE

4.1 REACTIVOS1. Anti- inmunoglobulina humana.

2 Albúmina bovina diluida (al 6 % p/v); opcional albúmina bovina al 22 %(p / v), 1 ml; solución salina isotónica, 3 ml.3 Pipetas: de 0,1- 0,5 ml, con extremos descartables.4 Glóbulos rojos (GR): GR reactivos del grupo O, con doble dosis de los antígenos pertinentes (para titulación de anti-

D, usar GR R2R2); lavar tres veces y suspender al 2 % en solución salina isotónica.5. Solución salina. (Nota: si se desea las diluciones pueden realizarse con albúmina.)4.2 MUESTRASSuero para titulación (con potenciales anticuerpos irregulares significativos, contra antígenos eritrocitarios), 1ml. Si es posible, analizar la muestra actual en paralelo con el suero previo más reciente del embarazo en curso( el cual debe mantenerse en congelación -30ºC).4.3. CONTROL DE CALIDAD

1. Evaluar una muestra previa en paralelo con la actual.2. Preparar las diluciones utilizando una pipeta separada para cada tubo. En caso contrario, podrían registrarse títulos altos falsos.

3. Confirmar las reacciones negativas con GR recubiertos con IgG (véase el paso 9).

4. PROCEDIMIENTO 1. Colocar en la gradilla 12 tubos de 12 x 75 mm. (para cada titulación). Realizar nueve diluciones en base dos a partir de ½ hasta 1/2048.2. De izquierda a derecha colocar: Suero: 0.1 ml en el primer y segundo tubo. El primer tubo corresponde a una dilución 1/1 o suero sin diluir; la dilución ½ significa un volumen de suero en un volumen final de dos o una solución al 50% de suero en el diluyente.3. S.S.F* al 0.85% 0.1 ml desde el segundo tubo hasta el tubo 12; mezclar bien el segundo tubo (que corresponde a dilución ½) y pasar 0.1 ml de la mezcla al tercero (cambiar la punta y mezclar), continuar así sucesivamente hasta el último tubo (cambiando siempre la punta después de dispensar la dilución anterior al siguiente tubo y antes de hacer la mezcla de la dilución). Retirar 0.1 ml de la mezcla del tubo (en otro tubo) para posibles diluciones posteriores Cada tubo debe contener 0.1 ml de diluciones dobles de suero, desde suero concentrado hasta dilución 1/2048. Tomar 0.1 ml de la ultima dilución a un tubo limpio marcado y reservarla.4. Agregar 0.1 ml de GR de expresión homocigota para el antígeno correspondiente al anticuerpo a titular en suspensión del 2 al 5 %. Agitar suavemente.5. Incubar 1 hora a 37°C.

6. Lavar cuatro veces con S.S.F. Decantar completamente el sobrenadante.7. Agregar suero de Coombs de acuerdo a recomendaciones del fabricante.8. Centrifugar a 3.400 r.p.m x 15 “.9. Leer y registrar las reacciones. La lectura debe iniciarse por el tubo con el suero más diluido y continuar con

los más concentrados. 10. A los tubos negativos agregarles control de Coombs para evidenciar la actividad del suero de Coombs.

Nota: Cuando los G.R recubiertos con IgG son negativos; se deben repetir las pruebas.* Se pueden realizar las diluciones en albúmina al 6 %5. INTERPRETACIÓN1. Observar la dilución más alta que produce aglutinación macroscópica de 1+.2. El título es la inversa de la dilución y se informa como, por ejemplo, 32 y no 1 en 32 ni 1:323. Se considera que los títulos > o = a 16 son significativos y podrían señalar la necesidad de monitorear la EHRN por cordocentesis, ecografía o espectofotometría del líquido amniótico para identificar la presencia de bilirrubina.4. Cuando el título es < de 16 y la especificidad de los anticuerpos se asocia con EHRN, es aconsejable repetir la titulación cada 2 a 4 semanas, a partir de la semana 18 de gestación; conservar una alícuota de suero ( congelada a -20 °C o menos ) para realizar estudios comparativos con la próxima muestra.5. Si se advierte aglutinación en el tubo con el suero más diluido, no se alcanzo el punto final y se debe continuar con diluciones adicionales a partir del tubo de dilución que se había reservado.


6. Se debe obtener el Score o puntaje a la afinidad de las reacciones.Nota: Está prueba es semicuantitativa y muchos factores intervienen en sus resultados.6. POS LABORATORIO¿Cuál es el valor clínico de los estudios de titulación de anticuerpos en mujeres embarazadas?¿Cuáles son las variables que afectan los resultados en las pruebas de Titulación de anticuerpos?¿Cuáles son los títulos que podrían considerarse con significado clínico y podrían señalar la necesidad de monitorear la E.H.R.N?

PRACTICA No. 12PRUEBAS CRUZADAS

1. OBJETIVOEstablecer la compatibilidad entre el donador y el receptor, mediante la utilización de procedimientos que permitan detectar los anticuerpos presentes en el receptor, que puedan lesionar GR del donador en el momento de ser transfundidos; y detectar los anticuerpos que se encuentren en el donador y puedan ser perjudiciales al receptor.

2. PRE LABORATORIO1. Explique en que consiste la prueba cruzada mayor2. Explique en que consiste la prueba cruzada menor3. Determine la importancia y la utilidad de estas pruebas4. Precise las limitaciones de las pruebas para detectar todos los errores relacionados a la clasificación sanguínea5. Relacione los requerimientos de los diferentes anticuerpos con la ejecución de las pruebas en diferentes condiciones

de reacción3. LABORATORIO 3.1 MATERIALES Y REACTIVOS

Tubo de 12 x 75 mm, gradilla, pipetas, solución salina, albúmina bovina al 30%, suero de Coombs, sangre del donador con anticoagulante y coagulada, sangre del receptor anticoagulante y coagulada. 3.2 PROCEDIMIENTO

Mayor MenorSuero del receptor 2 gotas ____Suero del donador ____ 2 gotasGR del donador lavados y suspendidos de 2 al 5 % 1 gota ____GR del receptor lavados y suspendidos del 2 al 5 % ____ 1 gotaMezclar. Centrifugar a 3.400 r.p.m x 15” *Leer. Registrar. Si no observa aglutinación agregar:Albúmina bovina al 22 % 0 30 % o LISS 1 gota 1 gotaIncubar 10 a 15’ en caso de usarse LISS y 15 a 30 ‘ si se usa albúmina.Centrifugar 30’’ a 3.400 r.p.m y leer. Registrar.Si no hay aglutinación lavar tres veces con S.S. al 0.85 %.Suero de Coombs 2 gotas 2 gotasCentrifugar, leer y registrar.Si no observa aglutinación adicione una gota de células control de Coombs al tubo muestra y valide la prueba.

* Si se observa aglutinación en este paso se demuestra incompatibilidad ABO por centrifugación inmediata o presencia de anticuerpos irregulares contra los antígenos eritrocitarios. 4. ANÁLISIS DE RESULTADOSDespués de determinar la lectura de las pruebas, determine los resultados que indiquen compatibilidad y los que indiquen incompatibilidad5. AUTO EVALUACION.

Describa las debilidades y fortalezas que encontró en la práctica Qué aportó usted para el desarrollo de la práctica6. POST LABORATORIO

1. Aplique un método de SELECCIÓN EFECTIVA de las PRUEBAS MINIMAS que deben efectuarse en el laboratorio de Inmunohematología justificando la necesidad de efectuar dichas pruebas. (Tenga en cuenta que pueden existir reacciones dependiendo del componente que se transfunde)


2. Realice un cuadro que defina los criterios de transfusión teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la prueba cruzada entre donante y receptor y el rastreo de anticuerpos de los receptores, en cada caso en particular.3. Realice los algoritmos correspondientes a las pruebas de compatibilidad obligatorias a realizar en caso de : a. Emergencia. b. Urgencia c. Reserva de sangre

PROCEDIMIENTOS EN GEL CENTRIFUGACIÓN Dia-medLos procedimientos en Gel Centrifugación de la casa comercial Dia-Med utilizan dos diluyentes el Diluyente 1 que es Bromelina y el Diluyente 2 Liss. Según el procedimiento a realizar se utilizan el diluyente 1 o el 2.Clasificación ABO y DPrueba directaSe realiza una dilución como sigue:

500 micolitros de Diluyente 2 5 microlitros de GR1. Se agregan 10 microlitros de la dilución anterior a cada columna según corresponda.2. Centrifugar3. Leer4. Registrar

Prueba inversa1. Se agregan 50 microlitros de las células A1 y B al pozo correspondiente.2. 50 microlitros del suero del paciente o donante.3. Centrifugar4. Leer5. Registrar

Prueba Cruzada Se realiza dilución de las células del donante:

1000 micolitros de diluyente 2 10 Microlitros de paquete globular

Dispensar en una columna de reacción1. 50 microlitros de la dilución de los G.R del donante2. 25 microlitros de suero del receptor3. Incubar 15min a 37oC4. Centrifugar5. Leer6. Registrar

D ConfirmatorioRealizar la siguiente dilución de la muestra a confirmar1. 500 microlitros Diluyente 1 Bromelina2. 25 micolitros paquete globular

3. Incubar 10 minutos a Temperatura ambiente.Dispensar en una columna de reacción

4. 10 microlitros en la tarjeta correspondiente5. Centrifugar 10 minutos6. Leer7. Registrar

Rastreo de anticuerposDispensar en una columna de reacción

1. 50 microlitros de células pantalla.2. 25 micro de suero3. 25 microlitros de bromelina. Diluyente 14. Incubar 15 minutos a 37 oCGUÍA PRACTICA DE BANCO DE SANGRE

5. Centrifugar6. Leer7. Registrar8. Analizar con el inserto correspondiente.

Identificación de anticuerpos1. Dispensar 50 microlitros de las células pantalla en una columna de reacción.2. Agregar 25 microlitros del suero del paciente o donante.3. Incubar 15 minutos a 37°C4. Centrifugar5. Leer6. Registrar7. Analizar de acuerdo al inserto de las células del lote correspondiente.

ANEXO N° 1PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN SALINA 0.85 %

REACTIVOS1. Cloruro de Sodio (NaCl)2. Agua destilada

PREPARACIÓNLa Solución salina se prepara P/V en agua destilada de acuerdo a la concentración y volumen requeridos.Para preparar 1000 ml de solución salina al 0.85 %: se pesan 8.5 gr de cloruro de sodioY se disuelven en 1000 ml de agua destilada.

ANEXO N° 2PREPARACIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS LAVADOS DEL 2 – 5 %

REACTIVOS1. Solución salina 0.85 %.2. Glóbulos rojos tomados con E.D.T.A

PREPARACIÓN1. Dispensar 2 a 3 gotas de glóbulos rojos en un tubo de 12 x 75 mm.2. Agregar solución salina hasta máximo tres cuartas parte del mismo.3. Colocar los tubos en la serófuga y equilibrarlos con un tubo correspondiente.4. Tapar perfectamente la serófuga.5. Centrifugar durante 45’’ o 1 ‘ a 3.200 r.p.m.6. Esperar que se detenga completamente la serófuga.7. Sacar los tubos.8. Decantar completamente la solución salina.9. Agitar suavemente los tubos para resuspender el contenido.10. Agregar nuevamente salina como en el paso 2 y continuar de acuerdo al número de lavados que se

deseen.11. Tomar 1 gota (50 ul) de hematíes lavados y concentrados + 1ml (1000 ul) de S.S al 0.85 %.La

suspensión de G.R obtenida, será color rojo salmón. %.ANEXO N° 3

PREPARACION DEL CONTROL DE COOMBS

El control de Coombs se obtiene tomando células del grupo "O" Rho D positivo y añadiéndole antisuero anti-D con el fin de recubrirlas de Inmunoglobulina para que puedan reaccionar a su vez con la Inmunoglobulina presente en el suero de Coombs y de esta manera servir de control de calidad de las pruebas de Coombs con resultado negativo.REACTIVOS1. Anti- D2. Solución salina 0.85 %


3. Glóbulos rojos O positivos lavados y concentrados.PREPARACIOnLas cantidades pueden doblarse de acuerdo a las necesidades del banco de sangre. La siguiente fórmula produce aproximadamente 10 ml de control de Coombs.1. Colocar en un tubo de 12 x 75 mm o 13 x 75 mm 2 gotas de anti-D2. 4 gotas de solución salina3. 4 gotas de células de grupo "O" Rh D positivos.4. Mezclar. Incubar por 30' a 37 ºC.5. Lavar 4-5 veces en solución salina.6. Hacer dilución al 5%

ANEXO N° 4PREPARACIÓN DE LA ALBÚMINA BOVINA AL 6 %

REACTIVOS1. Albúmina bovina al 22 %2. Solución salina 0.85 %

PREPARACIÓN1. De acuerdo al volumen de albúmina al 6 % requerido, realizar los cálculos correspondientes, empleando la siguiente fórmula V1x C1 = V2 x C2.

Para preparar 2 c.c de albúmina al 6 % a partir de albúmina al 30 %, tomar 0,4 c.c de albúmina al 30 % y diluir con 1,6 c.c de solución salina al 0,85 %


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Guia Actualizada 2p 2013 (1)