GUA DE PROBLEMAS

QUMICA BIOLGICA

Departamento de Qumica Biolgica Facultad deCiencias Exactas y Naturales - UBA Pabelln II

4to Pisohttp://www.qb.fcen.uba.ar

CARRERA

QQumica

BBiologa

2013

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INDICE:

CLULA ............................................................................................................................. ........................2ESPECTROFOTOMETRA Y CURVAS DE CALIBRACIN............................................................5PROBLEMA DE ADN: ESPECTROSCOPA Y GELES DE AGAROSA ...........................................8CINETICA ENZIMATICA .................................................................................................................... .10PURIFICACIN ENZIMTICA .......................................................................................................... .13FILTRACIN MOLECULAR .............................................................................................................. .17INTERCAMBIO INICO...................................................................................................................... .22ELECTROFORESIS................................................................................................ ................................24INTERACCIONES MACROMOLECULA LIGANDOS..................................................................28

Mtodos experimentales para determinaciones in-vitro ....................................................................31PROBLEMAS INTERACCIONES MACROMOLECULA LIGANDOS .......................................32RADIACTIVIDAD ............................................................................................................................. ........3ANEXO: ............................................................................................................................. .........................6

ESTOS PUEDEN CONSULTARLOS EN LAS CLASES DE PROBLEMASCORRESPONDIENTES. ESTRUCTURA PROTEICA.....................................................................6ESTRUCTURA PROTEICA ................................................................................................................ .7CIDOS NUCLEICOS Y BIOSNTESIS DE PROTENAS............................................................25CICLO DE KREBS ............................................................................................................................. .27COMPUESTOS NITROGENADOS...................................................................................................29HORMONAS ............................................................................................................................. ...........31

PARCIAL 1 .............................................................................................................................................. .37PARCIAL 2 ............................................................................................................................. ..................39RADIACTIVIDAD ............................................................................................................................. ......41PARCIAL 3 .............................................................................. .................................................................42PROBLEMA INTEGRATORIO ........................................................................................................... .47

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CLULA(Nota: estos problemas son para alumnos de Qumica solamente y

para repaso del tema terico. No se resolvern en la clase deProblemas. Consultas al Dr. Juan Carlos Calvo)

1. En eucariotas, la cicloheximida inhibe la sntesis proteica en el citoplasma y elcloranfenicol inhibe la sntesis proteica en mitocondrias. Por el contrario, en procariotas,la sntesis proteica es inhibida por cloranfenicol pero no por cicloheximida. Qusugieren estas observaciones acerca del origen de las mitocondrias?

2. El estudio bioqumico de los componentes subcelulares tales como los ribosomas,retculo endoplsmico, microsomas, etc. se facilit enormemente en los aos 40 con ladisponibilidad de un aparato conocido como ultracentrfuga preparativa. Laultracentrfuga preparativa permiti el fraccionamiento de partculas subcelulares apartir de un homogeneizado de tejido centrifugando a diferentes velocidades.Como uno de los investigadores que trabaja con disponibilidad de equipamientomoderno, usted decide llevar a cabo experimentos utilizando una ultracentrfuga.Obtiene un trozo fresco de hgado bovino en un matadero cercano y lo homogeneizausando una licuadora de su madre. Luego filtra el homogeneizado para eliminar todoslos grumos de clulas y tejido conectivo que no se rompieron.

a) Usted toma el homogeneizado y lo somete a una centrifugacin a bajavelocidad (1000 x g durante 10 min). Guarda el sobrenadante en unaheladera y toma el precipitado que se acumul en el fondo del tubo. Usteddisuelve el precipitado en una pequea cantidad de una solucin que contieneun detergente (Tritn X-100) y desoxicolato de sodio que disuelve lasmembranas celulares. Obtiene una solucin densa y viscosa que tiene unaconsistencia gelatinosa. Qu estructura subcelular estaba presente en suprecipitado?

b) Ahora toma el sobrenadante que haba guardado previamente y lo somete auna centrifugacin a media velocidad (15000 x g durante 5 min). Esta vez,usted encuentra que el precipitado contiene enzimas que pueden hidrolizarprotenas eficazmente. Usando tcnicas inmunoqumicas (Western blot)usted demuestra que el precipitado contiene una protena que es utilizada enla sntesis de ATP. Puede haber otras cosas presentes que usted no pudodetectar con estos dos ensayos. Suponiendo que el precipitado contiene unamezcla de estructuras subcelulares, nombre las organelas que esperaencontrar en el mismo. Explique cmo deriv su respuesta de la informacinprovista. Puede pensar en otras formas de detectar ms organelas o probar laexistencia de aquellas que usted piensa que estn en el precipitado?

c) En el prximo paso, usted toma el sobrenadante del paso anterior y lo sometea una centrifugacin a alta velocidad (100000 x g durante 60 min). Separa elprecipitado y el sobrenadante en la manera habitual. Esta vez encuentra quesi agrega los factores traduccionales apropiados, usted puede detectar sntesisproteica. Cules piensa que son los componentes de su precipitado?

d) Cuando usted examina en detalle la protena sintetizada en el paso anterior,encuentra que toda su protena est glicosilada. Qu organela adicional creeque est presente en el precipitado que obtuvo en el paso anterior?

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3. La protena de reconocimiento para acetilcolina es una protena transmembranamayoritaria en neuronas (clulas nerviosas). En su laboratorio usted puede seguir elcamino de la acetilcolina dentro de la clula y ver que primeramente es sintetizada,luego modificada qumicamente, almacenada por un tiempo y, eventualmente,transportada a la membrana plasmtica.

a) Describa el camino que la protena receptora de acetilcolina sigue enneuronas, mostrando qu organelas estn involucradas en cada etapa. Dndese sintetiza? Dnde se la modifica qumicamente? Dnde se almacena?Cmo va de un lugar a otro? Cmo termina en la membrana plasmtica?

b) Describa la sntesis de un lisosoma. Dnde se sintetizan sus protenastransmembrana? Dnde se sintetizan sus protenas internas, digestivas?Dnde son modificadas? Cmo entran al lisosoma? De dnde provienenlos fosfolpidos de la membrana lisosomal?

4. Las cilias son estructuras celulares importantes que poseen exclusivamente las clulaseucariotas. Algunos eucariotas como el Paramecio dependen totalmente de las ciliaspara moverse y para atrapar partculas de alimentos. Cuando se examina el detalleultraestructural, las cilias muestran poseer manojos de microtbulos organizados en unamanera ordenada.Dentro de una clula, la longitud de los microtbulos puede ajustarse de acuerdo con lanecesidad de la clula agregando o removiendo las protenas monomricas a o demicrotbulos existentes. Su supervisor cree que los monmeros proteicos se agregan,preferentemente, a un extremo de un microtbulo existente que llama el extremo + delmicrotbulo. Para probar que esto es as, usted decide llevar a cabo un experimento.Purifica algunos microtbulos y monmeros proteicos de una fuente apropiada. Luegousted marca su protena con un colorante fluorescente rojo. En el prximo paso, ustedincuba sus microtbulos y la protena fluorescente purificada en condiciones quefavorecen el ensamblado de microtbulos. Luego de un perodo de incubacin, examinalos microtbulos con un microscopio fluorescente.

a) Qu esperara observar en trminos de los nuevos monmeros proteicosagregados a ambos extremos de los microtbulos, si la idea de su supervisorfuese verdadera/falsa?

b) En el experimento anterior, usted agrega GTP a su mezcla de incubacinpara conseguir un ensamblado apropiado. Puede explicar por qu?

c) La colchicina que se utiliz como droga anticancergena se une a losmonmeros proteicos libres con alta afinidad e impide el ensamblado ennuevos microtbulos. Aunque la colchicina no posee afinidad para con losmicrotbulos ya formados, se observa que al tratar las clulas con colchicina,todos los microtbulos dentro de la clula se desintegran. Puede pensar enun mecanismo que explique cmo ocurre esto?

d) Como investigador que utiliza colchicina, conoce algunos hechos bsicos: lacolchicina inhibe la formacin de microtbulos y las clulas cancerosascrecen y se replican mucho ms rpidamente que las clulas normales. Qupuede llevarlo a pensar que la colchicina podra curar el cncer y dejar sanoal paciente?

5. Las clulas germinales haploides de un organismo capaz de reproduccin sexual seencuentran conteniendo 50 femtogramos de ADN por cada una (1 fg = 1 x 10-15 g). Un

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ovocito fertilizado contiene 100 fg antes que ocurra la sntesis de ADN. Cunto ADNespera encontrar en?:

a) Una clula somtica en G1b) Una clula somtica en G2c) Una clula germinal en profase I de la meiosisd) Una clula germinal en anafase II de la meiosise) Una clula germinal luego de la telofase II de la meiosis

6. Los humanos poseen 22 pares de cromosomas autosmicos y 2 cromosomas sexuales.Calcule lo siguiente suponiendo que los miembros paternos y maternos de cadacromosoma son distinguibles genticamente.

a) Suponiendo que los cromosomas homlogos se segregan al azar durante lameiosis pero que el crossing over entre pares homlogos no ocurre, cuntasgametas genticamente nicas puede producir un individuo por meiosis?

b) Basado en su respuesta anterior, cuntos individuos genticamentediferentes podra una pareja concebir hipotticamente, una vez msconsiderando segregacin al azar de cromosomas homlogos?

c) Dado el nmero en (b), explique cmo la reproduccin sexual aumenta ladiversidad gentica de una especia cuando se compara con la reproduccinasexual.

7. A usted le entregan una suspensin de clulas creciendo en un medio nutritivo.Existen tantas clulas por ml. Usted agrega un compuesto X al medio y puededeterminar la velocidad a la que el mismo es incorporado por las clulas. Describa,usando diagramas y palabras, cmo determinara si X ingresa a la clula por difusinpasiva, transporte facilitado o transporte activo. Suponga que posee todas las tcnicasexperimentales que necesita.

8. Los iones Ca2+ son eliminados eficazmente de muchas clulas vivientes, an cuandoesto involucra movilizar Ca2+ en contra de gradiente. Proponga un mecanismo paraconseguir esto.

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ESPECTROFOTOMETRA Y CURVAS DE CALIBRACIN

1. Una solucin de concentracin 3 mg/L de una sustancia que absorbe a unadeterminada longitud de onda, transmite el 80% de la luz incidente en una cubeta de 1cm. Calcule la transmitancia de una sustancia que contenga: a) 5 mg/L; b) 6 mg/L; c)calcule la absortividad molar (am) cuando el peso molecular del compuesto es 250.

2. Una solucin de protenas (0,3 mL) se diluye con 0,9 mL de agua. A 0,5 mL de lasolucin diluida se le aaden 4,5 mL del reactivo de Biuret y se deja desarrollar el color.La absorbancia de la mezcla a 540 mm es 0,18. A una solucin estndar (0,5 mL desolucin que contiene 4 mg de protena/mL) se aaden 4,5 mL del reactivo de Biuret yse obtiene una absorbancia de 0,12 en cubeta del mismo tamao. Calcule laconcentracin de protenas en la solucin desconocida antes de la dilucin. Considereque la absorbancia del blanco es despreciable con respecto a la de la muestra.

3. Para la determinacin de un cierto compuesto en orina, se toman 2 mL de orina de 24h., se diluyen a 4 mL con agua destilada, se realiza una extraccin con ter etlico y seevapora el extracto etreo en bao de agua. Para el testigo se pesan 500 mg de drogaslida pura, que se disuelven en 100 mL de alcohol. De esa solucin madre se toma 1mL y se lleva a 50 mL con alcohol; de all se toma una alcuota de 0,5 mL que seevapora en bao de agua. Sobre el residuo seco se hace la determinacin colorimtrica.Para la reaccin colorimtrica se disuelve el residuo seco en 2,5 mL de cido acticoglacial y se agregan 2,5 mL de reactivo de color.El blanco se hace con 2,5 mL de cido actico glacial y 2,5 mL de reactivo de color. Laslecturas obtenidas son las siguientes:

muestra: 0,100 testigo: 0,200 blanco: 0,030Calcule la concentracin del compuesto en la orina y la cantidad excretada en 24 h.,sabiendo que el volumen de orina es de 950 mL.

4. Para determinar la concentracin de glucosa en sangre se extraen 5 mL de sangre, sedesproteiniza y se centrifuga, obtenindose 2 mL de suero. Para realizar la reaccincolorimtrica se toma 0,5 mL de suero y se agregan 3,5 mL de agua. De esta solucin sepipetean 0,5 mL; se completa a 1 mL con agua destilada y se agrega 1 mL de la solucinde Somogyi.Se calienta a bao Mara durante 15 minutos, se enfra, se aade 1 mL de solucin deNelson y se completa a 5 mL con agua destilada. Se lee una absorbancia de 0,25 y de0,02 para el blanco. Se traza la curva de calibracin correspondiente empleando unasolucin testigo de 2 moles/mL (PM glucosa=181).

Tubos 1 2 3 4 5 BlancoGlucosa (mL) 0,025 0,050 0,075 0,100 0,150 ---H2O 0,975 0,950 0,925 0,900 0,850 1Somogyi15 100 C

1 1 1 1 1 1

Enfriar a temperatura ambienteNelson 1 1 1 1 1 1H2O destilada 2 2 2 2 2 2Absorbancia 0,08 0,14 0,21 0,27 0,40 0,02

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a) Cul es la concentracin de glucosa en sangre expresada en mg/mL?b) Si en una muestra de sangre tratada de la misma forma que la anterior se lee unaabsorbancia de 0,80, cmo hara para determinar su concentracin? (La Ley de Beer secumple en el rango de concentraciones entre 0 y 0,30 moles/mL).

5. El cido pirvico puede determinarse colorimtricamente por conversin de su 2,4-dinitrofenilhidrazona seguida de la adicin de lcali. Con el fin de calibrar uncolormetro, la reaccin se llev a cabo en soluciones que contenan diversas cantidadesde cido pirvico, obtenindose los siguientes resultados:

g cidopirvico/3 mL

20 40 60 80 100 125 150 175

lectura 0,130 0,257 0,390 0,515 0,628 0,750 0,855 0,940

Se analizaron por ste mtodo una serie de soluciones desconocidas de cido pirvico yuna solucin patrn de 50 g/3 mL. Las lecturas fueron: a) 0,280; b) 0,555; c) 0,690; yd) 0,910 y para la solucin patrn 0,325. Calcule la concentracin de las solucionesutilizando la curva de calibracin y calcule el error que comete en cada caso si seemplea el patrn de 50 g/3 mL en lugar de usar curva. Considere que la absorbanciadel blanco es despreciable con respecto a la de las muestras.

6. Se saponifican 10 g de manteca y el insaponificable se extrae con 25 mL decloroformo. La solucin clorofrmica diluida al medio da una absorbancia de 0,550 a328 nm, diluda al tercio una absorbancia de 0,140 a 458 nm. Calcule el caroteno y lavitamina A contenido en la manteca.

% en cloroformo328 nm 458 nm

Caroteno 340 2200Vitamina A 1550 0

7. Supngase que a 1,5 mL de una solucin 2x10-4 M de NADPH se aaden 1,5 mL deuna solucin que contiene una concentracin desconocida de glutatin oxidado (GS-SG)que previamente haba sido diluda al medio, y una cierta cantidad de la enzimaglutatin-reductasa. La absorbancia final de la solucin medida a 340 nm es 0,250.Calcular la concentracin de GS-SG en la solucin original.La reaccin catalizada por la glutatin reductasa es:

GS - SG + NADPH+H+ 2GSH + NADP+

y se produce prcticamente transformacin total. M NADPH=6,22x 103

8. El valor normal del colesterol en suero es de 200 mg/100 cm3. Planifique la curva decalibracin (disponiendo de colesterol puro) para cubrir el rango de 80-400 mg/100 cm3,de forma tal que con la tcnica descripta a continuacin se obtenga directamente el valorde colesterol en suero.

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Mtodo: En un tubo de centrfuga se ponen 10 mL de una mezcla de alcohol-ter, seaaden 0,2 mL de suero, se tapa el tubo y se agita vigorosamente. Se centrifuga, elsobrenadante se evapora a sequedad. El residuo se disuelve en 5 mL de cloroformo. Sehace un blanco con 5 mL de cloroformo. A cada tubo se le aaden 2 mL de anhdridoactico y 0,1 mL de cido sulfrico concentrado. Se lee la absorbancia a 411 nm a los 10minutos.

9. Planificar la curva de calibracin para un compuesto X, cubriendo un rango de 5 a 30mg/100mL de suero de manera tal que con la siguiente tcnica se obtenga el valor de Xen suero:2 mL de suero se diluyen con 4 mL de agua y se agregan 0,5 mL de un reductor, se agitay extrae el producto X reducido obtenido con 5 mL de ter etlico (la reduccin de X yposterior extraccin son completas). Se toman 2 mL de extracto, se evapora a sequedady se toma con 3 mL de buffer pH 5. Se aaden 1,2 mL del reactivo de color y se lee laabsorbancia a 390 nm. Para realizar la curva de calibracin dispone de una solucinmadre del compuesto X reducido de 10 mg/mL de Buffer pH 5.

10. La cantidad normal excretada en orina de un compuesto P es de 2 9 mg cada 24 hs.En ciertas patologas la excreta puede sobrepasar los 100 mg/24 hs. no excediendonunca los 200 mg/24 hs. Para cuantificar P se toman 0,2 mL de orina, se diluyen a 1 mLcon agua destilada, se agregan 0,5 mL del reactivo A y 0,5 mL del reactivo B, ambosdisueltos en H2SO4 1N y se deja reaccionar 10 min, se aaden 5 ml de cloruro demetileno, se agita y centrifuga a 2800 rpm durante 10 min. Se toman 3 mL de la faseinferior y se lee la absorbancia a 540 nm. Paralelamente se realizan las mismasoperaciones utilizando un patrn, del cual se dispone en forma slida y se solubiliza conagua destilada.

a) Construir la curva de calibracin para la determinacin de P tal que puedaobtenerse directamente mg P/100 mL de orina para los casos de excretasnormales, donde se cumple la Ley de Beer. Los volmenes de orinanormalmente excretados en 24 hs. caen en el rango de 900-1600 mL Quconcentracin tiene la solucin patrn que prepara?

b) Indique como procedera para obtener el valor en un paciente con elevadaexcreta, si el volumen de orina fue de 1200 mL.

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PROBLEMA DE ADN: ESPECTROSCOPA Y GELES DEAGAROSA

Se realiz un protocolo tpico de mini-prep para extraer ADN pasmdico a partir de uncultivo bacteriano. El mtodo consiste en romper las clulas de dicho cultivo medianteun choque alcalino de modo que slo permee selectivamente su ADN plasmdico.Para ello se sigui el siguiente protocolo:

1-Se centrifugan 1,6 mL de cultivo de E.coli 5 a 4C y 5000 RPM.Se descarta el sobrenadante.

2- Al pellet bacteriano se lo resuspende en 100 uL de solucin I. Se deja incubar15.

5.3- Se le agrega 200 uL de solucin II se mezcla bien y se deja incubar en hielo

4- Se agrega 150 uL de solucin III. Se agita hasta aparicin de un flculoblancuzco, se coloca en hielo y se deja 30.

5- Se centrifuga 15 a 10000 RPM 4C.6- En otro Eppendorf rotulado se coloca 1 mL de EtOH absoluto en frio.7- El sobrenadante de la centrifugacin se mezcla con el alcohol y se deja 2.8- Se lleva a centrifugar 15 a 10000 RPM 4C.9- Se descarta el sobrenadante, y se lava el pellet con alcohol 70%.10- Se deja secar a T. Amb. Se resuspende con 50 uL de agua destilada estril10 bis- Se deja secar a T. Amb. Se resuspende con 50 uL de agua destilada

estril con agregado de RNAsa. Se incub a 37C por 30 min.11- Se agrega 14,4 ul de NaCl 2,5 M + 45 ul de PEG800 al 15 % (en agua

destilada) + 5,6 ul de agua destilada estril12- Incubar en hielo durante 20 min.13- Centrifugar 15 min a 4C y 12000-14000 RPM.14- Lavar con etanol al 70% y secar durante 15 min. Resuspender en 50 uL de

agua destilada estril.

SolucionesSolucion I: 25mM TrisHCl pH:8 + 10mM EDTA pH:8Solucion II: SDS 1 % + NaOH 0,1 M (450 ul de solucin de SDS 10% +450 ul de solucin de NaOH 1 M + 3600 ul de agua destilada).Solucion III: acetato de Potasio pH: 4,8-5,2

Para verificar los resultados y la necesidad o no de realizar los ltimos pasos se trabajopor cuadriplicado y las diferencias en el procedimiento fueron las siguientes:

Muestras 1 y 2: se termin en el paso 10. En el caso de la muestra 1 se us un cultivodel doble de volumen.Muestra 3: se termin en el paso 10 bisMuestra 4: se realiz el paso 10 bis y se continu hasta el paso 14

Se realiz luego un gel de agarosa con las distintas muestras (figura) y se midi laabsorbancia a 260 y a 280 nm en las soluciones (tabla).

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Muestra Abs(260 nm)

Abs(280 nm)

1 0,238 0,1462 0,179 0,1103 0,042 0,0324 0,035 0,017

Figura: gel de agarosa revelado con bromuro de etidio al final de la corrida. Lasmuestras se sembraron en forma consecutiva en el gel

Tabla

Discutir los resultados obtenidos, para ello calcular el cociente de A260/280 para todas lasmuestras, comparar los resultados del gel y espectroscpicos de a pares: muestras 1 y 2; losresultados de las muestras 2y 3 y los de las muestras 3 y 4 (en qu difieren?, a qu puedendeberse las diferencias observadas?)

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CINETICA ENZIMATICA

1. Dada una reaccin enzimtica, dibujar las siguientes curvas:P = f (t) v = f (E) v = f (S)

2. Los siguientes datos, obtenidos en condiciones ptimas de pH y temperatura corresponden ala reaccin:

ES P

S (M) v (mol/min)1 50 x 10-5 32,5

2 40 x 10-5 32,5

3 25 x 10-5 31,5

4 2,5 x 10-5 21,0

5 1 x 10-5 13,5

6 0,25 x 10-5 5,0

a) Estimar los valores de Km y Vmx por observacin de datos.b) Calcularlos matemticamente.c) Extraerlos del grfico.d) Calcular cuntos moles de producto se formarn al cabo de 3 min en los siguientescasos:

S = 4,5 x 10-4M S = 1,5 x 10-5 M

e) Si se hubiese usado una cantidad de la misma preparacin enzimtica 4 veces msconcentrada, qu valores esperara ud para Km, Vmx, el n de unidades enzimticas y laactividad especfica, respecto a las condiciones iniciales?

3. Sea un extracto enzimtico que contiene una enzima E que cataliza la transformacin:E

A RSe sabe que los valores de sus constantes cinticas son Km = 10-3 M y Vmx = 0,25moles/30 min, para una concentracin de protenas de 0,10 mg/ml.1) Cuntos moles de R se formarn en 15 min?a) Si [A] = 10-1 M y [prot] = 0,2 mg/mlb) Si [A] = 3 x 10-1 M y [prot] = 0,1 mg/ml

Considerando que se provee constantemente sustrato al medio, cul ser la v de la reaccinen los siguientes casos?c) [A] = 10-3 M y [prot] = 0,3 mg/ml.d) [A] = 10-5 M y [prot] = 0,4 mg/ml.2) Grafique P = f (t) para los casos a), b), c) y d) en un mismo grfico.

4. La fosfatasa alcalina es una enzima que hidroliza grupos fosfatos de diversos sustratos enmedio alcalino. Puede determinarse utilizando un sustrato artificial como el p-nitrofenil

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TuboPNFP

25 mM(ml)

H O(ml)

BufferCarbonatopH 10 (ml)

Extracto(ml)

A 405 nm

0 5 10 151 0,1 0,9 3 1 0,02 0,07 0,12 0,172 0,2 0,8 3 1 0,04 0,12 0,20 0,263 0,5 0,5 3 1 0,08 0,20 0,33 0,39

fosfato (PNFP), produciendo fosfato inorgnico y p-nitrofenol (PNF), que puede detectarseespectrofotomtricamente a 405 nm.

PNFPFosfatasa alcalina, pH 10

PNF + Pi

Para estudiar los parmetros cinticos de la enzima de un extracto de placenta, se realizaronlas mezclas de reaccin en la cubeta del espectrofotmetro y se hicieron lecturas a distintostiempos.

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Mediante una curva de calibracin realizada con PNF se obtuvo un factor f = 2,5moles/unidad de absorbancia, en las mismas condiciones de ensayo.

a) Realizar los grficos convenientes y obtener Km y Vmx.

b) Si el extracto posea 2 mg/ml de protena, cul era la actividad especfica?

c) Si se hubiese hecho una dilucin 1:2 del extracto, qu valor de Km, Vmax y AE sehubiera obtenido?

5. La velocidad de la reaccin catalizada por una enzima con un Km de 2,4 x 10-4 M se midia las siguientes concentraciones de sustrato:

i) 2 x 10-7 Mii) 6,3 x 10-5 Miii) 10-4 Miv) 2 x 10-3 Mv) 0,05 M

La velocidad observada cuando la [S] es 0,05 M fue de 128 mmoles/litro x min.

a) Especificar para cada concentracin de sustrato el orden de reaccin y estimar lavelocidad inicial en cada caso.

b) Cul ser la velocidad observada a [S] = 0,05 M cuando se agrega al sistema el triplede la concentracin de protenas?

c) Si esta enzima tiene un Km para otro sustrato de 2,4 x 10-5 M, qu concentracionesde sustrato utilizara para realizar el estudio de velocidades iniciales?

6. Se conoce que el Km de una determinada enzima Michaeliana en diferentes tejidosanimales es de alrededor de 2 mM. Ud quiere determinar el Km de la misma enzima en otrotejido, nunca analizado y dispone del homogeneizado y reactivos del sistema de incubacin ycuantificacin del producto formado.

i) Describa en detalle como procede en el laboratorio para determinar la [E] y los rangosde tiempos utilizados para determinar los parmetros cinticos.

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ii) Arme el protocolo de trabajo indicando las [S] empleadas y las finales alcanzadas,suponiendo que el volumen de incubacin final es de 1 ml, el volumen de E es 0,2 ml, elvolumen de S es 0,5 ml y el resto se completa con buffer.

iii) Cmo verifica que las [S] ensayadas fueron las correctas?

iv) Si no tiene idea previa del orden del Km, qu determinaciones tendra que efectuarantes de comenzar los ensayos?

7. Para reacciones enzimticas que obedecen a la ecuacin de Michaelis-Menten, enumerar losdistintos tipos de inhibicin, indicando en cada uno de ellos:

a) Formas enzimticas a las que se unen sustrato S e inhibidor I

b) Grficos de inversas correspondientes

c) Qu ocurre con los parmetros cinticos Km y Vm?

d) Cmo determina Ki? Describa brevemente.

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PURIFICACIN ENZIMTICA

1. a) Con preparaciones crudas de enzimas suele haber considerable formacin de producto sinque se haya agregado sustrato (Blancos muy altos). Cmo subsanara esta dificultad?Justificar.

a1) Usando una solucin de enzima ms concentrada.a2) Usando una solucin de enzima ms diluida.a3) Midiendo a tiempos ms cortos.a4) Midiendo a tiempos ms largos.

b) Por qu la extraccin de la enzima debe ser un proceso rpido y debe controlarseestrictamente la temperatura?

2. a) A qu atribuira un rendimiento mayor que el 100% despus de un paso depurificacin?

b) Con qu objeto define unidad enzimtica? Cmo se expresa?c) Una vez que se ha purificado, aislado y caracterizado una enzima, puede afirmarse

que el mecanismo hallado es fiel reflejo de su mecanismo fisiolgico in vivo?

3. Un extracto crudo, libre de clulas, de Neurospora crassa contiene 36 mg de protena/mL.20 L del extracto catalizan una reaccin a una velocidad de 0,15 moles/min. en condicionesptimas del ensayo. 100mL del extracto fueron fraccionados por precipitacin con (NH4)2SO4.La fraccin que precipita entre 25% y 45% de saturacin fue redisuelta en 10 mL. Estasolucin contiene 50 mg de protena/mL. 20 L de esta fraccin purificada catalizan lareaccin a una velocidad de 0,8 moles/min.a) Calcular el % de recuperacin de la enzima en la fraccin purificada.b) Calcular el grado de purificacin obtenido.c) Analizar si el fraccionamiento salino es satisfactorio.

4. Se quiere purificar una enzima de la saliva para luego determinar sus parmetros cinticos.Se probaron dos esquemas de purificacin y se obtuvieron los siguientes resultados:

A a) Saliva B a) Saliva

Dilisis durante 48 hs. Precipitacin con(NH4)2SO4 al 45%

b) de saturacin

Precipitacin con b) ppdo. sobrenad.(NH4 )2SO4 al 45%de saturacin Pasaje x Sephadex G100

c) ppdo. sobrenad. c) Vo de la columna

Pasaje x Sephadex G100

d) Vo de la columna

1414

Esquema A:

Fraccin Vol. total (prot.) mg/mL unidades/0,5 mLa) 20 ml 5 0,125b) 20 ml 5 8,75c) 5 ml 6,5 20d) 2 ml 4 45

Esquema B:

Fraccin Vol. total (prot.) mg/mL unidades/0,25 mLa) 20 ml 5 0,063b) 5 ml 6,5 0,1c) 2 ml 4 22

Construya ambas tablas de purificacin y, en base a los resultados, decida qu esquemautilizara, explicando qu ocurre en cada paso de cada uno de los esquemas de purificacinpropuestos. Justifique todas sus respuestas.

5. Se homogeneizaron 5 g. de hgado de rata con 50 mL de sacarosa 0,25 M. Un pequeovolumen del homogeneizado se separ para determinar actividad enzimtica. Porcentrifugacin diferencial del homogeneizado se prepararon las fracciones subcelulares ydespus de la purificacin se ajust el volumen de cada fraccin a un valor dado.Se determin en contenido de protenas en cada una de las fracciones. La actividad de laenzima glucosa 6-fosfatasa (Glu6P- Glu +Pl) se determin incubando un volumen medido dela fraccin con glucosa 6-P 10mM y buffer en un volumen final de 5 mL a 37C. A intervalosde tiempo de 5 minutos se retiraron muestras de 0,5 mL y se determin la cantidad de fsforoinorgnico presente en estas muestras por un mtodo colorimtrico.Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

Homogeneizado

Ncleos Mitocondrias Microsomas FraccinSoluble

Volumen total (mL) 50 10 10 5 75Protena (mg/mL) 24 35 49 31 2,2Volumen usado

para el ensayo (mL) 0,5 0,5 0,5 0,05 1,0

Fosforopresente

(g)

0 min.5 min.

10 min.15 min.20 min.

124477192

17,513,521,028,0

2,521405678

018304664

23

3,54,54,5

Qu conclusiones puede extraer de estos resultados con respecto a la localizacin de estaenzima en hgado de rata? Justificar la respuesta mediante el cuadro de purificacincorrespondiente.La actividad enzimtica se expresa como: mol P liberadoPeso atmico del P = 32 mL. min.

6. Se ha comprobado que un extracto libre de clulas (homogeneizado) de pncreas poseeactividad enzimtica sobre dos sustratos A y B. Se ignora sin embargo, si esa actividadenzimtica reside en una o varias protenas y cules son sus caractersticas. Con el objeto dedilucidar esta cuestin se someti al homogeneizado a una serie de pasos de purificacin. Las

1515

fracciones resultantes de cada una de ellos fueron utilizadas para determinar la actividadenzimtica con ambos sustratos. Los procedimientos utilizados y los resultados obtenidos seexponen en la tabla.

1. Homogeneizado2. Calentamiento del homogeneizado a 50C, 10 minutos.3. Sobrenadante (2) se pasa por columna DEAE-celulosa, obtenindose una sola fraccinactiva.4. La fraccin activa se pas por una Sephadex G-50 (rango: 70.000-5.000), obtenindosedos picos proteicos: Vo y P.5. La fraccin Vo se pasa por una columna Sephadex G-100 (150.000-5.000), obtenindoseun pico proteico con actividad enzimtica que no coincide con el Vo.

Nro. fraccin Volumen(mL)

Protenas(mg)

Actividad enzimtica(U/mL)Sustrato A Sustrato B

123

4: Vo4: P

4: Vo+eluidos

1616

Fraccin Vol.Total(mL)

nmolesmedidos

UE en volde

incubacin

UE/mL UETotales

Prot.(mg/mL)

Prot.Totales

(mg)

AE R% Gr.P

Homogeneizado 94 0,25 0,94

Sobrenadantede (NH4)2SO4

30-50%90 325 2,64

Precipitado30-50%

1,4 9800 1987

Eluido DEAE 0,21 14,9 8,03Eluido

Heparina-Sepharosa

11 1766 1,3

8. Sea una enzima E presente en hgado de rata, capaz de catalizar la conversin A P.Nuestro objetivo es extraerla y purificarla. A continuacin se resumen los resultados obtenidosal aplicar los siguientes tratamientos:

1) Extracto crudo: se resuspende el tejido en buffer de extraccin y se homogeneiza enlicuadora.

2) Sobrenadante de 5000 g, 10 minutos3) Precipitado de 15.000 g, 20 minutos, se resuspende en buffer y se sonica.4) Calentamiento a 55C durante 5 minutos5) Pasaje por DEAE-celulosa equilibrada a pH 7,0. La protena queda retenida en la

columna y eluye en un pico de actividad bien definido al aplicar un gradiente de fuerzainica.

Fraccin UE Totales mg protenas totales Volumen (mL)

1 8400 200 1202 8200 175 1153 7700 55 254 6400 44 245 5800 8 10

Datos: se define unidad enzimtica como la cantidad de enzima capaz de catalizar laformacin de un mol de producto por hora en las condiciones estndar de incubacin.El sistema de incubacin para la determinacin de actividad consta de 0,1 mL de buffer, 0,1mL de sustrato, extracto enzimtico y agua hasta un volumen final de 1 mL. Se incuba 1 horaen condiciones estndar de incubacin. Con el sistema descrito se pueden cuantificar entre 5 y40 moles de P por tubo.

a) Completar el cuadro de purificacin calculando grado de purificacin y rendimiento.b) Armar el protocolo para la medicin de actividad de todas las fracciones. Especificar

claramente los volmenes a utilizar.c) Suprimira alguna etapa del esquema de purificacin? Justifique brevemente.d) Qu propiedades de la protena puede inferir con estos resultados? Justifique

brevemente.e) Si al cromatografiar E por tamices moleculares, eluye con un Kav = 0 por Sephadex G-

75 y con Kav = 0,4 por Sephadex G-100, acotar el PM de la protena. (Sephadex G-75resuelve entre 3000-70000 y Sephadex G-100 entre 4000-150000).

1717

FILTRACIN MOLECULAR

1. Se siembra una muestra que contiene KCl, tres oligopptidos de PM: 1500, 3000 y 6000 ydos protenas de 5000, en una columna de Sephadex G-25, obtenindose el siguiente grficode elucin.

A (280nm) -( ) (Cl ) ( )

Ve (mL)

a) Indicar los componentes de cada pico.b) Con esta columna, se podran aislar los tres oligopptidos? Si su respuesta fue

negativa, indique entonces cmo podra lograrlo.c) Podra usar este Sephadex para desalar totalmente la muestra? Cmo lo lograra?

2. Se dispone de Sephadex G-25, G-50, G-75 y G-100. Se desea separar los componentes deuna muestra que contiene tres protenas de PM 15.000, 30.000 y 70.000 y dos oligopptidos de2.000 y 3.000.Qu gel o conjunto de geles utilizara (el mnimo posible)? Dibujar los perfiles de elucin

Sephadex Rango fraccinG-10 0-700G-25 1000-5000G-50 1500-30000G-75 3000-70000G-100 4000-150000G-200 5000-250000

3. Se tiene una mezcla de protenas cuya composicin se desconoce. Con el objeto de conocerel nmero de protenas que la componen y el rango en cual se encuentran sus pesosmoleculares, se ensayan las siguientes operaciones:

Picos proteicos Rango de separacinG-25 3 1000-5000G-75 4 3000-70000G-200 5 5000-250000

En esta ltima columna ningn pico proteico eluye con Ve=Vo.Determinar el nmero mnimo de protenas que a su juicio contiene la muestra y en base a estojustificar los resultados obtenidos en cada una de las columnas. Estimar el peso molecular orango dentro del cual se encuentra cada una de las protenas de la muestra.

1818

4. Se tiene un extracto proteico el cual presenta actividad enzimtica para dos sustratos: A y B.Por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida se determina la presencia de 2 protenasen el extracto, estimndose sus pesos moleculares en 40.000 y 100.000.Para lograr la separacin se emplea una columna de Sephadex de 30 cm de alto y 2 cm dedimetro, emplendose 6,5 g. de Sephadex G-100 (WR: 10mL/g gel seco).Una muestra de blue dextrano (PM: 2 x 106) es eludo a 25 mL. A partir de una calibracin sedetermin que las protenas de PM 40.000 tienen un Kav de 0,29 y la de 100.000 un Kav de0,18.- a) Calcular el volumen mximo de extractos que se pueden sembrar en esta columna y losvolmenes de elucin de ambas protenas.- b) Al ensayar la actividad enzimtica para sustratos A y B en cada una de las protenasaisladas se obtuvieron los siguientes resultados:PM 100.000: activa con A pero no con BPM 40.000: inactiva para ambos sustratosDar una explicacin congruente con estos resultados y de que forma se comprobara.

5. La villina es una protena de PM = 95.000. Estudios de inmunomicroscopa sugieren queest involucrada en el citoesqueleto celular. Para estudiar esto se us villina purificada,incubndola con actina, importante componente del citoesqueleto, en diferentes condiciones.- I) Villina- II) Villina + actina- III) Villina + actina + Ca2+

Se corrieron las fracciones incubadas en Bio Gel P-100 (rango: 5000-100000)

A (280nm)( )

Vo Ve1 Vo Ve1 Ve2 Vo Ve1 Ve2Ve (mL)

Anticuerpo anti-villina

a) Justificar los resultados obtenidos.b) Qu rango de PM puede indicarse para la actina?

6. Se sabe que la conversin de A a B est catalizada por 2 enzimas presentes en un extracto.Con el fin de caracterizar estas enzimas, el extracto se pasa por columnas Sephadex G-75 y G-100. Midindose la actividad en las distintas fracciones colectadas, se observa un nico picode Kav = 0 en la G-75 y 2 picos con Kav = 0 y Kav = 0,1 en G-100.Por la misma columna de Sephadex G-100 se hacen pasar 3 soluciones con protenas de PMconocido con el fin de calibrarla, obtenindose los datos de la tabla.

Protena PM KavCitocromo C 12.400 0,543Peroxidasa 40.000 0,289BSA 66.000 0,177

1919

Fosforilasa b 97.000 0,095

Rango de fraccionamiento:Sephadex G-75 3.000-70.000Sephadex G-100 4.000-150.000

- a) Hacer el grfico de los perfiles de elucin obtenidos luego de pasar el extracto por lacolumna de G-75 y G-100, indicando el Vo de la columna.- b) Calcular el PM de las 2 protenas.- c) Qu consideraciones deben hacerse para asumir que el PM de la protena sea igual alcalculado?.

7. Se obtiene una mezcla de protena y polisacridos y se los analiza por cromatografa entamiz molecular, detectndose por absorbancia a 280 nm y antrona sulfrico (exclusivo paraazcares).Se usaron diferentes combinaciones de geles:

1.500-20.000 20.000-200.000 5.000- 500.000

A (280 nm)( )

Vo Vt Vo Vt Vo VtAntrona sulfrico

Indicar y justificar cuntos pptidos y polisacridos hay como mnimo, dando rangos de PM.

8. Se tiene una solucin de una protena pura, con actividad de fosforilasa, cuyo pesomolecular es 240.000. Con el objeto de estudiar la estructura de dicha protena se realizaronexperimentos con columnas de filtracin molecular. Para ello alcuotas de la solucin deprotenas fueron sometidas a distintos tratamientos y sembradas y eludas de distintascolumnas. Los resultados se describen a continuacin:

a) condiciones nativas. Sephadex G-150

2020

+++ - + - + - +

A (280nm)( )

+

Vo Ve (mL)

b) Dos alcuotas se tratan con urea 7M. Una de ellas se siembra en una columna de SephadexG-100 y otra en una de Sephadex G-80. Ambas se eluyen con urea 7M.

A (280nm)( )

A (280nm)( )

- -

Vo Vt Ve (mL) Vo Ve (mL)

Sephadex G-100 Sephadex G-80

c) cuatro alcuotas se tratan con beta-mercaptoetanol. Cada una de ellas se siembra en una delas columnas indicadas y se eluyen con la misma solucin de beta- mercaptoetanol.

A(280nm)G-150 G-100 G-70 G-50

( )

Ve (mL)Vo Vt Vo Vt Vo Vt Vo

Proponga una hiptesis sobre la estructura y actividad enzimtica de la protena en cuestinque sea congruente con los resultados obtenidos.

2121

Datos: Las flechas en los grficos indican Rangos de separacin:los volmenes de elucin del azul Sephadex G-150: 200.000-5.000dextrano y del cloruro de cobalto. El signo Sephadex G-100: 150.000-5.000(+) indica que el pico proteico presenta Sephadex G-80: 100.000-5.000actividad enzimtica, el signo (-) indica Sephadex G-70: 50.000-5.000ausencia de actividad enzimtica. Sephadex G-50: 30.000-5.000

9. Se tiene un extracto enzimtico a pH 7,5 que contiene 3 protenas A, B, y C, sales ysacarosa, sabiendo que:

A PM = 37.000 pI = 3,2B PM = 90.000 pI = 3,2C PM = 160.000 pI = 5,5Sacarosa PM = 340

Disponiendo de:

Sephadex G-10 rango 0 - 700Sephadex G-75 rango 3000-70000

Resina aninica: DEAE-celulosaResina catinica: CM-celulosaAmbas resinas estn equilibradas con un buffer a pH 7,5

- a) Indique que tamiz molecular usara para separar las protenas del resto de loscomponentes.- b) Si quisiera separar cada uno de los componentes proteicos, describa que operacionesrealizara y bajo qu condiciones. Justifique y dibuje los diagramas de elucin.- c) Podra determinar los Vo de las columnas de Sephadex G-10 y G- 75 sin utilizar Blue-dextrano? Cmo hara?- d) Cul es la utilidad de desalar una protena? Justifique.

2222

B

INTERCAMBIO INICO

1. Una mezcla de 4 protenas se intent separar por intercambio inico en DEAE-Celulosa. Enel panel A se us un gradiente de NaCl de 0,1 a 1,5 M y en el caso B de 0,1 a 0,8 M.- a) Cul de los dos gradientes usara para separar la mezcla proteica? Justificar.- b) Podra aumentar la resolucin de separacin entre las 4 protenas empleando un gradientean ms suave que el usado en el panel B?- c) Cmo procedera si quisiera obtener en forma pura slo la protena ms bsica?

A(280nm) (NaCl)( ) (---)

A B

Ve (mL) Ve (mL)

2. Al pasar una mezcla proteica por una columna de intercambio inico de CMC se obtiene elsiguiente perfil cuando se aplica un gradiente de pH creciente. El pico A eluye con el buffer desiembra cuyo pH es 6.a) Puede afirmar que cada pico corresponde a un solo componente de mezcla? Por qu?b) Cul de los tres eludos: B, C o D corresponde a la protena ms cida?b) Qu hubiera ocurrido si la columna se hubiera equilibrado y sembrado con el buffer pH 8?

A(280nm) ( ) pH (--)A -9

C D -8

-7

-6

Ve (mL)

3. Para purificar la enzima piruvato quinasa del hongo Mucor rouxii se parti de micelio delhongo, homogeneizndolo en un mortero con N2 lquido, en presencia de arena.Luego de realizar 2 centrifugaciones para eliminar los restos celulares y la arena se realiz uncorte con (NH4)2SO4 30-70%. Se sabe que el paso ms conveniente para continuar lapurificacin es un pasaje por DEAE-celulosa.a) Cmo procedera si tuviera el precipitado de 70% de (NH4)2SO4 resuspendido en buffer?Luego de realizar la DEAE se obtiene el siguiente perfil:

2323

A(280nm) ( ) (KCl) (---)-0,2 M

A B

-0,08 M

( ) Actividad de piruvato quinasaVe (mL)

Por cromatografa de tamiz molecular se obtendra un slo pico con actividad y electroforesisen condiciones desnaturalizantes, se vio que los picos A y B daban una sola banda del mismopeso molecular.b) Qu puede decir acerca de los pIs de las especies de los picos A y B?

4. Se tiene una muestra compuesta por diversas protenas. Se analiza por cromatografa deintercambio inico. Indicar cuntas protenas hay como mnimo, dando el orden de pIs.Justificar.

A(280 nm) ( ) (KCl) (--)

-0,2M -0,2M

-0,1M -0,1M

20 mL 150 mL 20 mL 150 mLDEAE-celulosa, pH 8,0 CM-celulosa, pH 6,0

A(280 nm) ( ) (KCl) (--)-0,2M

-0,1M

20 mL 300 mL Ve (mL)DEAE-celulosa, pH 8,0

2424

ELECTROFORESIS

1. Se tiene una mezcla de cuatro protenas de distinto peso molecular disueltas en un buffer depH 8,3:

A) 65.000B) 63.000C) 38.000D) 19.000

Si se siembra esta mezcla de protenas en una columna de intercambio aninico, a pH 8,3, elorden en que son eludas las protenas con un buffer de fuerza inica creciente es el siguiente:

1 B2 A3 C4 D

Cmo esperara que corrieran estas protenas en un gel de poliacrilamida al 7,5 %? Dibuje lasbandas y justifique.

2. Una mezcla de tres protenas disueltas en un buffer al cual se sabe que las 3 estn cargadasnegativamente se siembran en una columna de Sephadex G-100. El perfil de Absorbancia a280 nm en funcin del Ve es el siguiente:

A (280nm) 1 2( )

Ve (mL)

Posteriormente se hace una corrida electrofortica en geles de poliacrilamida de tresmuestras distintas (I, II y III) y se obtienen las siguientes bandas:

I) la mezcla de protenas

II) la fraccin (1) eluda de la columna de Sephadex

III) la fraccin (2) eluda de la columna de Sephadex

(+) SIEMBRA (+) SIEMBRA (+) SIEMBRAX XY YZ Z

(-) (-) (-)mezcla fraccin 1 fraccin 2

Comente sobre las propiedades con respecto a carga y peso molecular de las protenas X, Y yZ. Justifique.3. Se realizan las curvas de calibracin para determinar pesos moleculares en electroforesis engeles de poliacrilamida en buffer de pH 8. Se utilizan para ello 3 protenas estndar cuyos

2525

_

_

_

_

Protena Peso Molecular Distancia (mm)tranferrina 78.000 13albmina de suero bovino 66.000 21ovalbmina 45.000 35anhidrasa carbnica 30.000 56tripsingeno 24.000 64mioglobina 17.800 80citocomo c 12.400 95aspartato aminotransferasa (AAT) ? 42

pesos moleculares son A: 200.000, B: 150.000 y C: 100.000. Se obtuvieron los resultados delgrfico.

a) Identificar cada recta con elestndar correspondiente y estimar

log Rf

el peso molecular de la protena X X(lnea punteada).

b) Ordenar A, B, C y X segn sus pI.%T

4. La tabla muestra la distancia de corrida de un grupo de protenas de peso molecularconocido en SDS-PAGE al 10%. En el mismo gel, se corri una enzima purificada, aspartatoaminotranferasa (AAT), de PM desconocido. Disee un grfico apropiado y determine el PMde AAT.

5. Con el objeto de estudiar la sntesis de la catepsina D, se marcaron hepatocitos en cultivocon Met35S por 15 minutos (pulso. Luego de este tiempo se lavaron las clulas, se agregexceso de Met fra y se analiz el procesamiento de las protenas marcadas a lo largo deltiempo (chase). Para ello, se lisaron las clulas y se inmunoprecipitaron con un anticuerpoespecfico. Se realiz autorradiografa o revelado por actividad.

Activ. Autor. Activ. Autor. Activ. Autor.Geles nativos15%

(-) (-) (-)

Chase 0 min. Chase 15 min. Chase 90 min.

PM*103 PM*103

Autorradiografa de 50 50_

geles desnaturalizantes 30 30_

(SDS, -mercaptoetanol) 20 20_

15 15_

Chase 15 min. Chase 90 min.Justificar los perfiles electroforticos observados y proponer un modelo para la biosntesis dela catepsina D.

6. Una enzima purificada hasta homogeneidad se someti a electroforesis en distintascondiciones y dio los resultados que se muestran en la figura 1. Por otro lado, se corrieron

alcuotas del preparado en una columna de Sephadex G-100 (5000-150000) con lostratamientos indicados en la figura 2.

Figura 1: en cada caso se muestra la tincin de protenas y de actividad.Prot. Activ. Prot. Activ. Prot. Activ.

(-) (-) (-)

(+) (+) (+)PAGE nativo 7,5% PAGE-SDS 7,5% PAGE-SDS 7,5%

pH 8,9 con -mercaptoetanol

Figura 2:

A(280nm)( )

A(280nm)( )

5,5 Ve (mL) 6,5 7,5 8,3 Ve (mL)i) Buffer Tris pH: 7,4 ii) Buffer Tris pH: 7,4 + urea 4M

A(280nm)( )

Actividad(- - - - - )

7,5 8,3 Ve (mL)

iii) Buffer Tris pH 7,4 + urea 4M + -mercaptoetanol

a) Justificar los resultados obtenidos en cada figura.

b) Proponer una estructura posible para la enzima.

c) Si se obtuvieran los siguientes resultados, explique a qu podra deberse.

(-)

(+)

A(280nm)( ) Actividad

( )

27

PAGE nativo Buffer Tris 100mM pH: 7,47,5% pH:8 Sephadex G-100

7. La unin de la insulina a su receptor de membrana estimula la actividad quinasadel receptor, lo que hace que se fosforile una protena llamada IRS-1 (insulin receptorsubstrate). Proponer experimentos electroforticos para mostrar:

a) Fosforilacin del IRS-1 en respuesta al tratamiento con

insulina. b) que se fosforila en mltiples sitios.

c) que IRS-1 se fosforila en Tyr y no en Ser o Thr.

* Si desean profundizar en el tema, consultar paper de Myers et al. (1994), TIBS 19, 289-293.

28

INTERACCIONES MACROMOLECULA LIGANDOS

Muchas funciones biolgicas involucran la interaccin de pequeas molculas (metabolitos,reguladores, cationes, etc.) con superficies especficas de macromolculas como las protenas o lainteraccin entre dos o ms macromolculas. Esta interaccin implica la formacin de enlaces nocovalentes entre la molcula o in que consideraremos el ligando con una regin especfica de lamacromolcula que consideraremos el receptor. Ejemplos importantes en los sistemas biolgicosinvolucran la interaccin entre protena-ADN, protena-ARN, protena- ATP (o GTP), protena-metal,protena-cofactor, antgeno-anticuerpo, hormona-receptor, protena-protena, protena-gas,protena-inhibidor, etc.

La unin de un ligando a una protena puede ser en algunos casos tan fuerte que parezca irreversible,pero si no se forman enlaces covalentes, lo podemos considerar como cualquier proceso deequilibrio.

Dados un receptor, R y un ligando, L en equilibrio:

Kd: constante de equilibrio de disociacin = 1/Ka

Ka: constante de equilibrio de asociacin

[LR]: concentracin del complejo.

[R]: concentracin de protena o receptor libre

[L]: concentracin de ligando libre

1- En el caso de un receptor con un solo sitio de unin para el ligando

R+ L LR LR

LRKd

Balances de masa:

Para el ligando: [LT]= [L] + [LR]

Para el receptor: [RT]= [R] + [LR]

Reordenando puede calcularse [LR] en funcin del ligando total y del receptor total:

TTdTTdTT RLKRLKRLLR 45,0

2

29

Si se tiene el mtodo adecuado para medir la concentracin de complejo formada, se puede realizaruna titulacin, agregando concentraciones crecientes de ligando a una concentracin de receptor fijao viceversa. Graficando [LR] en funcin de [LT], ajustando la ecuacin anterior se puede determinarKd.

Otra forma de hacerlo es definiendo:

: moles de ligando unido por mol de receptor o fraccin de receptor complejado (nmero promediode sitios ocupados)

d

d

T KL

KL

LRR

LR

R

LR

/][1

/][

][][

][

][

][

][

][

LK

L

d

En este caso se grafica en funcin de la concentracin de ligando libre, [L] y se calcula Kd.

[L]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Kd

Notar que en este caso a diferencia del anterior es necesario conocer la concentracin de ligando librey no alcanza con conocer la concentracin total.

2- En el caso de un receptor con mltiples sitios de unin para el ligando (n)

R+ n L LnR][

][][

RL

RLK

n

n

nd

En forma anloga al caso anterior se puede definir el parmetro (moles de ligando unido por mol dereceptor total)

n

i i

n

i i

T

n

i i

RLiR

RLi

R

RLi

].[][

].[

][

].[

30

2-i Si los sitios de unin son idnticos e independientes (no existe cooperatividad):

Kd1= Kd2= Kd3= Kdn=Kd

Entonces

][

].[

LK

Ln

d

Graficando de en funcin de la concentracin de ligando libre, [L] y ajustando la ecuacin anteriorse calculan n y Kd .

[L]

Kd

n/2

n

Para linealizar el grfico anterior se puede

i- hacer un grfico doble recproco y graficar 1/ en funcin de 1/[ [L]

][

1.

11

Ln

K

nd

ii- un grfico de Scatchard y graficar /[L] en funcin de :

31

...1

][ aaddKKn

KK

n

L

2-ii- Los sitios de unin no son equivalentes

En el caso de que los sitios no sean equivalentes se observan desviaciones con los tratamientosanteriores

[L] [L] -1

/[L]

-1

[L]

[L] -1[L]

-1

[L] -1[L]

/[L]

[L] -1

/[L]

-1

[L] -1

/[L]

[L]

-1

[L] -1

/[L]

[L]

-1

[L] -1

/[L]

[L]

-1

[L] -1

/[L]

[L]

-1

[L] -1

/[L]

1) sitios equivalentes e independientes

2) cooperatividad positiva

3) cooperatividad negativa

En el caso de sitios equivalentes a partir de][

].[

LK

Ln

d puede re-escribirse

32

dKLnlog]log[log

. Si se grafica

nlog en funcin de log [L] es una recta de

pendiente 1.

Si los sitios no son equivalentes este grfico permite visualizar mejor las desviaciones:

pendiente >1, para algn valor de [L]: cooperatividad positiva

pendiente

33

PROBLEMAS INTERACCIONES MACROMOLECULA LIGANDOS

Problema 1- La afinidad de la mioglobina por oxgeno varia entre distintas especies. En la siguientefigura se muestra curvas de saturacin en funcin de la presin de oxigeno para mioglobina decaballo, goldfish y trucha. Cul de las tres especies presenta mayor afinidad por oxgeno?Determinar grficamente las constantes de afinidad.

Pedersen C L et al. J Exp Biol 2010;213:2755-2762

Problema 2. Para disear compuestos que compitan con la interaccin protena-ADN de una protenaviral encargada de la replicacin del virus se disearon compuestos 2 peptdicos (pptidos 1 y pptido2) que contienen el sitio de unin a ADN y se ensayo la afinidad de los mismos con un oligonucletidode doble cadena que corresponde al sitio de unin en el genoma viral. En la siguiente figura seilustran los resultados obtenidos.

[peptido]total/[ADN]total

0 10 20 30 40 50

Frac

cin

com

plej

ada

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

peptido1peptido salvajepeptido 2

Decidir que pptido diseado podra usar para prevenir la infeccin viral. Justificar.

Problema 3. Para determinar si el tripptido del hipotlamo l-prolil-1-leucil-1-glicinamida (PLG)aumenta la afinidad de distintos receptores de dopamina por su agonista propilnorapomorfina (NPA).Para ello se empleo [3H] NPA. Las figuras muestran las curvas de saturacin y los grficos deScatchard para dos subtipos de receptores, D2S (arriba) y D2L (abajo), en ausencia (control) y enpresencia de de PLG.

34

JPET 315:12281236, 2005

Discutir los resultados. Qu efectos tienen el PLG en la afinidad de NPA por los receptores?Afecta el nmero de sitios de unin?

Problema 4. La Isocitrato deshidrogenasa mitocondrial (IDH2) consume NADP+ en lugar deNAD+ para oxidar isocitrato . Para determinar el nmero de sitios de unin de NADP+ de laIDH2 (Mr= 90 kDa), se aprovecho que la fluorescencia del NADP+ aumenta al pasar de unentorno polar a uno menos polar, siguiendo entonces el aumento de la fluorescencia delNADP+ al estar unido a la enzima. A continuacin se muestran los datos obtenidos al titular13,5 mg/L de enzima con cantidades crecientes de NADP+:

NADP+/ M 0,07 0,14 0,21 0,28 0,35 0,50 0,75

Aumento de intensidad de fluorescencia 2,3 4,7 7,0 9,3 9,9 10,0 10,0

35

Determinar la estequiometra del complejo formado entre NADP+ y la enzima. Indicar sirealiz alguna aproximacin.

Problema 5. La protena hE2 del papilomavirus humano cumple funciones de replicacin yregulacin transcripcional del virus, el dominio C-terminal es el dominio de unin a ADN (hE2c)y posee 4 posiciones de unin en el genoma viral. Para determinar la estequiometra de unincon uno de los sitios de unin del genoma se realiz un experimento de desplazamiento demovilidad electrofortica en gel (gel shift assay). Se emple un oligonucletido de doblecadena de 18 pares de base que contiene el sitio consenso de unin marcado con fluorescena(concentracin 1 M) y se le agregaron cantidades crecientes de protena hE2c recombinante.Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente figura:

Biochemistry 2000, 39, 14692-14701

Explicar los resultados observados en el gel, a qu corresponden las bandas observadas?Cul es la estequiometra de unin observada?

Cmo determinara la constante de afinidad correspondiente al complejo 1:1? Quconsideracin necesita hacer con respecto al segundo equilibrio?

Problema 6. La enzima fosfohidrolasa necesita unir Manganeso para ser activa. Empleandouna tcnica adecuada se determino la cantidad de Manganeso unido en funcin delManganeso total usando una concentracin 100 M de enzima:

[Mn2+] total /M 110 190 290 500 750

[Mn2+] unido /M 75 125 175 250 300

36

Determinar el nmero de sitios de unin a Mn2+ y la constante de afinidad.

Problema 7. Al igual que la mioglobina, la hemoglobina une oxgeno. La siguiente figurapresenta un grfico de saturacin para ambas protenas

Discutir las diferencias observadas. Cmo esperara que sea un grfico de

nlog en

funcin de log [L] en cada caso?

Problema 8. El TNP-ATP es un anlogo fluorescente de ATP, muy usado para caracterizar lainteraccin de protenas que unen ATP. Su fluorescencia depende del entorno, aumentando alpasar de un entorno polar a uno no polar.

Se quiere estudiar si mutaciones puntuales en una protena que funciona como ATP-asamodifica sus propiedades de unin a ATP. Se cuenta con la ATP-asa salvaje (wt ) y dos variantescon una mutacin puntual en un aminocido cada una (MUT1 y MUT2).

Para ello se realiza en primera instancia un experimento en el que se titula la ATP-asa salvaje(wt) con concentraciones crecientes de TNP-ATP siguiendo los cambios de fluorescencia. En lasiguiente figura se muestran los resultados obtenidos comparndolos con los resultadosobtenidos empleando ATP radiactivo () en lugar de TNP-ATP () (el grfico de la derecha esuna ampliacin del de la izquierda).

2727

[ligando] (M)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

[ligando libre] (M)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

a- Realizar un grfico de Scatchard (/[L] en funcin de ) para los resultados mostrados en lafigura.

b- Indicar qu parmetros que caracterizan la interaccin protena-ATP pueden obtenerse quvalores toman?Es el TNP-ATP un buen anlogo de ATP para caracterizar la interaccin?(justificar brevemente)

c- Graficar en el mismo grfico de Scatchard realizado en (a) los resultados que se obtendran, elcaso de la mutante puntual (MUT1), si la mutacin introducida disminuye a la mitad el nmerode sitios para ATP sin modificar la afinidad de los mismos (el experimento se realiz empleandoTNP-ATP).

d- Al medirse la interaccin de la otra mutante (MUT2), el grfico de en funcin de ligando librepresenta una forma sigmodea. Qu puede concluir acerca de esta modificacin puntual en laprotena?

Problema 9. En la siguiente figura se muestran los grficos de Scatchard para 4 protenas (A, B, C, D) queunen magnesio. Todos los experimentos estn hechos a la misma concentracin de protena.

2828

grficos de Scatchard

0 1 2 3 4 5

/[L

] ( M

-1)

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0

1234

Se sabe que B tiene el doble de sitios para Mg++, pero igual afinidad que D, se sabe adems que A es laque tiene mayor afinidad que todas por el ligando.

a- Asignar cada una de las curvas a los distintos receptores.b- Cuntos sitios para magnesio tiene cada una de las protenas? Cul es la constante de

afinidad para cada una de las protenasc- Esquematice en un mismo grfico las curvas en funcin de ligando libre para las 4 protenas.d- En el mismo grfico realizado en (c) agregue una curva para una protena con 4 sitios y

cooperatividad positiva para la unin de Mg++.

29

RADIACTIVIDAD

1. Se disuelve una muestra de 10 mg de bicarbonato de sodio 14C en 10 ml de agua destilada.Una alcuota de 0,1 ml se seca sobre una plancheta de 2 cm de dimetro. Se coloca laplancheta en un contador Geiger-Muller y se mide la radiactividad: 7.125 cuentas en 5minutos. Una plancheta que se usa como blanco contada durante 50 minutos di 1.250cuentas.a) Cul es la lectura de fondo del aparato (background)?b) Cul es la radiactividad total de la muestra y cul su actividad especfica?

2. Una alcuota de 0,5 ml de un estndar de 14C cuya radiactividad es de 10 Ci/ml se diluye a100 ml. Una alcuota de 0,1 ml de esta solucin se seca sobre una plancheta de 2 cm dedimetro y se cuenta en el instrumento usado en el problema anterior durante 5 minutos. Seobtienen 5.675 cuentas. Cul es la eficiencia del contador?

3. Usando la informacin obtenida en los problemas 1 y 2, calcule la actividad especfica delbicarbonato de sodio14C en trminos de a) dpm/mg, b) Ci/g, c) mCi/mol.

4. El 45Ca tiene un perodo de semidesintegracin (T) de 163 das. Calcular:a) La constante de desintegracin () en das-1 y seg-1.b) El porcentaje de la radiactividad inicial que queda en la muestra despus de 90 das.

5. Cuntos moles y cunta radiactividad (en cpm) hay en 100 l de una solucin de 32P-dCTP 0,25 mCi/0,025 ml (actividad especfica 3.000 Ci/mmol)?

6. Describir la preparacin de 75 ml de una solucin 10 mM de clorhidrato de L-cistena 35Sen la que el aminocido tiene una actividad especfica de 3,92x104 dpm/mol. Suponer que sedispone de clorhidrato de cistena slido no marcado (121,15 g/mol) y una solucin madre deL-cistena35S: 14 mCi/mmol y 1,2 mCi/ml.

7. Para valorar la cantidad de glicina presente en un hidrolizado de protenas se tomaron 152,6mg de ste y se mezclaron con 6 mg de glicina 14C con una actividad especfica de 120dpm/mg. Despus de aislar parte de la glicina y purificarla totalmente, se encontr que suactividad especfica era de 59 dpm/mg. Determinar la proporcin de glicina que haba en elhidrolizado inicial.

8. Se aaden 20 mg de glucgeno marcado con 14C (6,7x104 cpm/mg) a una solucin quecontiene una cantidad desconocida de glucgeno sin marcar. Se asla de la mezcla unapequea cantidad de glucgeno y se precipita con etanol hasta lograr una actividad especfica(2,8x104 cpm/mg). Calcular la cantidad de glucgeno no marcado que haba en la solucin.

30

9. Se trat una mezcla de cido esterico con diazometano 14C (actividad especfica1,93x105 cpm/mol) para esterificar todos los cidos presentes. A la mezcla se agregaronluego 2 nmoles de estearato de metilo. Una vez homogeneizado, se aisl, mediante unprocedimiento adecuado, una pequea cantidad de estearato de metilo en el cual se contaron4,87x103 cpm/mol. Calcular la cantidad de cido esterico en la mezcla.

10. Exactamente 1,7 mg de una enzima purificada (PM 55.000) se incubaron con un exceso deiodoacetamida-14C (actividad especfica 2 Ci/mmol). Luego se precipit la protenacarboximetilada y se lav hasta dejarla libre de iodoacetamida sin reaccionar; se disolvi enuna cantidad de buffer y la muestra ntegra se cont en un contador de centelleo con unaeficiencia del 80%. En una hora la muestra di 13.190 cuentas (corregidas por el blanco).Calcule el nmero de grupos SH reactivos por la molcula de protena.

11. Se incubaron 2,4x105 cpm de corticosterona-3H con adrenales de rata durante 1 hora.Finalizada la incubacin se extrajeron los esteroides y se agregaron 40.000 dpm dealdosterona-14C. Se analizaron separaciones y purificaciones de la aldosterona biosintetizada yse obtuvieron las medidas de radiactividad que se detallan:

Extracto de incubacin 3H 14C 3H/14C

1 purificacin2 purificacin3 purificacin

2.400.000180.00054.48040.225

40.00032.00024.00017.720

a) Calcular la relacin 3H/14C para cada etapa.

b) Cul es el criterio de pureza adoptado para la aldosterona aislada?

c) Calcular el % real de aldosterona obtenida durante la incubacin.

12. El ensayo de medicin de quinasa de protenas se realiza en las siguientes condicionesfinales:

20 mM MOPS pH 7,410 mM Mg2Cl3 mg/ml histona10 mM NaF50 M ATP200.000 cpm ATP-- 32P

Teniendo presente que de esta mezcla de reaccin se pipetean 50 l y el volumen final dereaccin es 100 l, se pide: calcular las cantidades a utilizar de las siguientes solucionesmadres a fin de preparar mezcla de reaccin para 30 ensayos y analizar si la masa de ATPaportada por el radiactivo es significativa con respecto a la masa fra.

1 M MOPS pH 7,41 M MgCL2100 mg/ml histona200 mMNaF1 mM ATPATP-- 32P 1,6 Ci/mmol 0,5 Ci/ml

31

13. Se desea estudiar la sntesis de protenas en un cultivo de hepatocitos de rata, midiendo laincorporacin de metionina-35S en las protenas totales de dichas clulas. se utiliza metionina-35S de actividad especfica 100 Ci/mmol en una solucin 1 mCi/ml (estos valores sedeterminaron 28 das antes del experimento). Perodo de semidesintegracin 35S T: 87,7 das.

Experimento: se suspenden las clulas en 5 ml de un medio que contiene todos losaminocidos en una concentracin 0,1 mM y se le agregan 5 l de metionina-35S. Se incuba lasuspensin a 37C durante 90 minutos. Transcurrido ese tiempo, se toman dos alcuotas de 1ml cada una. En una de ellas se determina la cantidad de protenas por el mtodo de Lowry, loque da 5 mg. En la otra se determina la radiactividad incorporada: 1 ml del medio + BSAcomo carrier y 1 ml de TCA 10%. Se filtra a travs de papel Whatman GF-A y se lava elprecipitado para eliminar toda absorcin inespecfica de metionina-35S. Se obtienen 60.000cpm (eficiencia 30%).

a) Calcular los moles de metionina-35S incorporada por hora por mg de protena (lasunidades que crea convenientes).

b) Se saba de experiencias anteriores que 3,5 mg de protena contienen 1 mol demetionina. Calcular la masa de protena que se ha sintetizado en 1 hora en los 5 ml decultivo.

32

ANEXO:

LOS SIGUIENTES PROBLEMAS/PREGUNTAS CORRESPONDEN ALA PARTE TERICA Y SON UNA GUA PARA QUE REPASEN.

EN LAS CLASES CORRESPONDIENTES, CADA PROFESORDESARROLLAR LOS PROBLEMAS TIPO QUE SERN TOMADOS

EN LOS PARCIALES.

TAMBIN ENCONTRARN PARCIALES PRCTICOS QUE SETOMARON EN AOS ANTERIORES PARA QUE PRACTIQUEN.

ESTOS PUEDEN CONSULTARLOS EN LAS CLASES DE PROBLEMASCORRESPONDIENTES.

33

ESTRUCTURA PROTEICA

1. Indique el patrn de corte de los siguientes polipptidos con los agentes indicados

a) Ser-Ala-Phe-Lys-Pro por tripsinab) Leu-Arg-Ile-Phe-Trp-Met-Arg-Glu por bromuro de ciangenoc) Trp-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Glu-Ser por quimiotripsinad) Arg-Leu-Tyr-Glu-Asp-Glu-Thr-Asp por proteasa Asp-N

2. Se desea averiguar la secuencia de un determinado polipptido. Para ello se realiza unahidrlisis cida parcial. Luego los oligopptidos obtenidos a partir de la misma son separadosy analizada su composicin aminoacdica. La composicin del polipptido entero es (Ala2,Asp, Cys, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser2, Trp2). El tratamiento con carboxipeptidasa A da comoresultado Leu.Se obtuvieron los oligopptidos con la siguiente composicin:

(Ala, Lys) ; (Ala, Lys, Trp) ; (Ala, Pro) ; (Ala, Pro, Ser) ; (Ser2, Trp) ; (Ala, Ser2) ; (Ala, Trp) ;(Asp, Lys, Phe) ; (Phe, Asp) ; (Cys, Leu) ; (Cys, Leu, Pro) ; (Phe, Ser, Trp) : (Ser, Trp).

Nota: La carboxipeptidasa A libera el aminocido ubicado en el exptremo COOH. Excepto Arg, Lys o Pro.

3. Usted posee un pptido que es un potente inhibidor de la conduccin nerviosa y deseaobtener la estructura primaria. El anlisis de aminocidos revela la siguiente composicin:Ala(5), Lys, Phe. La reaccin del pptido intacto con FDNB, libera DNP-alanina, luego dehidrlisis cida y -DNP-lisina (pero no -DNP-lisina) tambin se encuentra. La digestin contripsina deja un tripptido (Lys, Ala(2)) y un tetrapptido (Ala(3),Phe). La digestin conquimotripsina del pptido intacto libera un hexapptido y alanina libre. Escriba la secuenciadel pptido e indique los puntos de corte. Datos: la tripsina corta hacia el extremo COOH delos aminocidos bsicos y la quimotripsina corta hacia el COOH de Phe, Trp, Tyr.

4. A partir de un hongo raro, usted ha aislado un octapptido que combate la calvicie y deseadeterminar la estructura primaria del mismo. La composicin en aminocidos es Lys(2), Asp,Tyr, Phe, Gly, Ser, Ala. La reaccin del pptido intacto con FDNB da DNP-alanina y 2 molesde -DNP-lisina, luego de hidrlisis cida. Corte con tripsina da pptidos con unacomposicin (Lys, Ala, Ser) y (Gly, Phe, Lys) ms un dipptido. La reaccin conquimotripsina libera cido asprtico, un tetrapptido con composicin (Lys, Ser, Phe, Ala) yun tripptido (Gly, Lys, Tyr). Escriba la secuencia del pptido e indique los puntos de corte.Datos: la tripsina corta hacia el extremo COOH de los aminocidos bsicos y laquimotripsina corta hacia el COOH de Phe, Trp, Tyr.

5. Indique, brevemente, qu pasos seguira para analizar por completo una protenadeterminando, secuencialmente, la estructura primaria, la composicin en estructurassecundarias y la conformacin terciaria.

6. Describa, brevemente, cmo procedera para secuenciar una protena formada por 4subunidades idnticas.

7. Qu ventajas tiene el uso del MALDI comparado con mtodos de secuenciacin clsica.Describa brevemente cada uno de los mtodos.

34

8. Qu informacin puede obtenerse a partir del dicrosmo circular?

9. Cules son los pasos a seguir para obtener la estructura de una protena utilizando?:a) Cristalografa de rayos-Xb) RMN

10. Indique los posibles efectos de las siguientes mutaciones en la estructura de una protena:

a) Leu a Pheb) Lys a Gluc) Val a Thrd) Gly a Alae) Met a Pro

11. Dibuje los puentes de hidrgeno presentes en las siguientes estructuras secundarias:

12. Dibuje las estructuras de resonancia que justifican que el enlace peptdico es plano.

13. Por qu se dice que las hlices alfa son estructuras locales y las hojas beta no? Quopina de los loops?

14. Indique el tipo de interaccin presente en las siguientes estructuras, ordnelas por sumagnitud en vaco y diga de que aminocidos se trata.

15. Relacione los dominios de plegamiento con los grficos de Ramachandran, justifique laasignacin. Nombre si puede los dominios de plegamiento

35

16. Para las siguientes secuencias indique si la probabilidad de formar hlices hojas o loops esalta, media o baja. Justifiquea) EALMQRLMRAALb) VICYFWYFc) AAGPGSAA

17. Sabiendo que la protena que usted esta estudiando posee un dominio de plegamiento detipo Manojo de 4 hlices (o 4-helix bundle), usted ha olvidado la secuencia que posee latercera hlice (residuos 40 a 50), indique cul de las siguientes es la ms probable decorresponder a este segmento. Justifiquea) KEDAKAKSEEE b) LSIAAAMNILA c) INELFDLLRSGSabiendo que de las restantes secuencias una pertenece a una hlice transmembrana, puedesugerir cul es? Justifique

18. Indique para cada uno de los siguientes casos que metodologa utilizar para determinar laestructura, justifquelo en trminos de posibilidad de xito, esfuerzo, costo y garanta de xito.

a) Protena de membranab) Hormona protica de 25 resduosc) Estructura cuaternaria de la hemoglobina de un pez del rticod) Protena nativamente desestructuradae) Triple Mutante del sitio activo, de una protena de estructura conocida

19. Calcule el G de desplegamiento en agua (o sea para el proceso N => U) a partir de lossiguientes datos experimentales:

Protena A Protena BGu (kcal/mol) [Urea] Molar Gu (kcal/mol) [Urea] Molar

0 1 -5 1-3 2 -11 2-5 3 -14 3

1010

a) Cul protena es ms estable en agua?b) Qu protena es ms estable en urea 2M?c) Qu protena es ms sensible a la desnaturalizacin por alta Temperatura?

20. En relacin con la ley del embudo responda brevemente (3 renglones)a) Qu es un contacto nativo?b) Cmo se interpretan los grficos tridimensionales de Energa vs. conformacin,

dnde se encuentra la entropa en el mismo?c) Cul es la diferencia entre un embudo ideal y uno casi real?d) Puede un embudo ideal presentar intermediario de plegamiento? y una estructura de

tipo glbulo fundido?e) En esta teora, cmo se origina la barrera en el perfil de energa libre para el proceso

de plegado?f) Comparando dos embudos de igual dimetro inicial, pero siendo el primero

significativamente ms profundo que el segundo, qu diferencias espera en cuanto ala termodinmica y cintica de plegamiento?

g) De una interpretacin estructural para el caso anteriorh) Dibuje en una hoja cuadriculada un embudo ideal en dos dimensiones (cmo si fuera

un corte transversal de un embudo 3D con simetra rotacional), ahora asuma que unacuadrado en el eje vertical equivale a un 1kcal/mol de energa, y que un cuadradito enel eje horizontal equivale a una perdida de entropa conformacional de 1 kcal/mol a300K. Dibuje entonces el perfil de energa libre para el proceso de plegado.

21. En base al anlisis de los valores de elija uno de los mecanismos de plegamientopropuesto y racionalice los resultados

Nt 10 20 30 40 50

Mut E5G F15A Y25A A35G P30G F45A F55A 0.8 0.1 0 1 -1 0.1 0.1

Mecanismo 1. Se forman primero las hojas 1 y 2 y en el estado de transicin se asocian conlas hojas 3 y 4, lo que luego colapsa a la estructura final.Mecanismo 2. Se forman primero las hlices 1 y 2 x separado y en el ET se asocian. Luego laestructura colapsa al estado final al formarse las hojas beta.

21. Sean las siguientes hlices, ordnelas de acuerdo a la magnitud de su dipoloa) DAEEIIALAIKRb) LILAFVMAIc) KIKLVALVDE

22. Indique dos maneras en cmo las cristalografa de rayos-X muestra la dinmica proteica

1111

ACLARACIONES PARA LOS PROXIMOS PROBLEMAS: La N-glicosilacin es una de las modificaciones postraduccionales ms comunes. Ocurresobre las protenas que son sintetizadas en la va secretoria (en el retculo endoplsmico). Estamodificacin puede tener consecuencias muy marcadas sobre las propiedades de las protenas.Los oligosacridos pueden tener varios kilodalton de peso molecular y su naturalezahidroflica puede aumenta dramticamente la solubilidad y estabilidad de las glicoprotenas.Los N-glicanos se clasifican en tres familias: alta manosa, complejos y mixtos. La agregacin proteica puede medirse mediante dispersin de luz. Tpicamente se usaradiacin de 360 nm.

23. La protena Xhil-P est glicosilada en dos sitios. Uno del los N-glicanos es de alta manosa,mientras el otro es una azucar complejo biantenario. Para estudiar el efecto de la N-glicosilacin en la estabilidad conformacional de Xhil-P se decidi desglicosilarla mediantetratamiento con ENDO-H (corta N-glicanos de alta manosa) con PNGase F. En paralelo setrat la protena con un procedimiento qumico que elimina TODOS los N-glicanos. Lasmuestras se analizaron por un gel de SDS PAGE:

MWM Xhil-P ENDO-H PNGase F Trat. Quimico

66

55

40

A continuacin se midi la estabilidad trmica de Xhil-P y de sus variantes desglicosiladasenzimticamente siguiendo la seal de dicrosmo circular a 280 nm (reporta estructuraterciaria):

1

Fraccinnativa

0

Xhil-P

ENDO-H

PNGase F

Temperatura

a) En base al primer gel, Qu puede decir de la especificidad del corte por PNGase F?b) Cul es el efecto de los N-glicanos en la estabilidad de Xhil-P? A qu se debe la

diferencia de estabilidad entre la protena tratada con ENDO-H y la tratada conPNGase F?

1212

24. La protena Luc-G se encuentra modificada con un N-glicano de alta manosa. Paraestudiar el efecto de la N-glicosilacin en el comportamiento biofsico de Luc-P, la protenafue desglicosilada con ENDO-H y se estudi desnaturalizacin trmica de ambas formasmediante dicroismo circular en el UV cercano (reporta estructura terciaria) y lejano (reportaestructura secundaria):

UV cercanoUV lejano

Luc-P

65CTemperatura

UV cercano UV lejano

Luc-P +ENDO-H

45 C 55CTemperatura

Para medir la tendencia a formar agregados de ambas protenas se las incub a 70C y semidi la dispersin de luz a 360 nm a lo largo del tiempo:

1OD 360 nm

2

Tiempo

a) En base a los experimentos de dicrosmo circular Cul fue el efecto de lasdesglicosilacin en el camino de desplegamiento trmico de la protena?

b) Las curvas 1 y 2 corresponden a Luc-G y a su variante tratada con ENDO-HPodra asignar cada curva a la protena correspondiente? En base a qu decidi sueleccin?

1313

25. La protena Kal2 est glicosilada por un N-glicano de alta manosa. Para estudiar el efectode la N-glicosilacin en la estabilidad conformacional de Kal2 se purificaron sus variantesglicosiladas y no glicosiladas, denominadas Kal2 y Kal2-NG, respectivamente. La varianteKal2 fue expresada en levaduras, mientras que la variante Kal2-NG en Escherichia coli (estabacteria no N-glicosila protenas). Para verificar el estado de glicosilacin las protenas seanalizaron por un gel de SDS PAGE luego de ser tratadas o no con ENDO-H (enzima quecliva N-glicanos de alta manosa):

ENDO H - + - +MWM Kal2 Kal2 Kal2-NG Kal2-NG

55

30

15

A continuacin se midi la estabilidad trmica de Kal2 y Kal2-NG siguiendo la seal dedicrosmo circular a 280 nm (reporta estructura terciaria) y a 220 nm (reporta estructurasecundaria):

1

Seal CDnormalizada

0

Kal2 (220 y 280 nm)

Kal2-NG (220)

Kal2-NG (280 nm)

Temperatura

a) Explique las diferencias de tamao observadas en la electroforesis.b) Cul es el efecto de los N-glicanos en la estabilidad de Kal2?c) Qu indica que las seales a 220 y 280 nm para Kal2 cambien en paralelo? Cual

podra ser el motivo del corrimiento observado entre 280 y 220 nm para Kal2-NG?

El grado de oligomerizacin de Kal2 y Kal2-NG fue estudiado mediante dispersin de luzdinmica. Segn su secuencia primaria Kal2 presenta un PM de 32 kDa. El PM de lasprotenas en solucin medido fue:

Kal2: 68 kDaKal2-NG: 32 kDa

1414

A continuacin se determin la unin de ANS (cido anilinonaftalen sulfnico) a ambasprotenas. El ANS es un compuesto cuya fluorescencia se incrementa unas 100 veces cuandose une a un parche hidrofbico expuesto de una protena:

Kal2-NG

Fluorescencia

Kal2Long. onda

Para medir la tendencia a formar agregados de ambas protenas se las incub a 70C y semidi la dispersin de luz a 360 nm a lo largo del tiempo:

1

OD 360 nm

2

Tiempo

d) Cul es el efecto de la N-glicosilacin de Kal2 sobre su estado de oligomerizacin?Cul podra ser la causa del incremento en la unin de ANS a Kal2-NG?

e) En el experimento de agregacin a 360 nm, a cul de las protenas corresponderanlas curvas 1 y 2? Justifique.

26. Usted est tratando de expresar en E. coli el inhibidor de tripsina 2 silvestre (CT2) y unaversin mutante en la cual introdujo por mutagnesis dirigida un puente disulfurointracatenario (CT2-mut). La masa molecular de ambas protenas es de 8.5 kDa y seencuentran clonadas en el vector pBAD, inducible por arabinosa. Luego de inducir dos cepascada uno expresando una de las protenas, cosecha las clulas, las lisa con lisozima y tritn X-100 (un detergente no inico) y centrifuga el lisado, separando el sobrenedante (sn) delprecipitado (pp). Al analizar ambas fracciones mediante un gel de SDS-Page observ losiguiente:

1515

1 2 3 4 5 6 7 8Arabinosa - + + + - + + +

T T PP SN T T PP SN

180 kDa

100

66 kDa

29 kDa

10 kDa

T: total (SN + PP)PP: precipitado.SN: sobrenadante

CT2 CT2-mut

Luego de purificar las protenas de la fraccin soluble estudi su estabilidad conformacionalante la urea, midiendo en paralelo la fluorescencia de TRP (sensible a la estructura terciaria,lnea continua) y la seal de dicrosmo circular a 222 nm (sensible a la estructura secundaria,lnea punteada):

Max. Fluor.

320 nm

340 nm

CT2

CD 222 nm

0 mdeg

-5 mdeg

2 M 3.5 M [Urea]

Max. Fluor.

320 nmCT2-mut

CD 222 nm

0 mdeg

340 nm -5 mdeg

5 M [Urea]

1616

Preguntas:

a) Cul fue el efecto de la mutacin en la estabilidad de la protena? Explique de quforma la introduccin del puente disulfuro afect la estabilidad y cual podra ser suefecto a nivel molecular.

b) Existe algn intermediario durante el desplegamiento de alguna de las protenas? Encaso afirmativo, qu caractersticas estructurales presenta?

c) A qu podra deberse la diferencia en la distribucin entre sobrenadante y precipitadoentre ambas protenas? Proponga algn mtodo que le permita recuperar a CT2 delprecipitado en forma cuantitativa y con actividad biolgica.

27. La protena HAL2 est formada por dos subunidades idnticas de 24 kDa cada una. Lasuperficie de contacto entre las subunidades est formada por una hlice alfa (llamada hlice"C") que presenta la secuencia:

Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala

Por otra parte, HAL2 presenta una segunda hlice alfa (helice "B"), de la cual NO se sabe siparticipa en la superficie de contacto entre las subunidades.

A continuacin se realizan las siguientes mutaciones:

Mutante 1: (llamada MUT1) sobre la hlice C que forma la superficie de contacto se cambiandos residuos de Leu por Ala, la nueva hlice presenta la secuencia:

Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala

Mutante 2: (llamada MUT2) se cambia una Tyr de la hlice "B" por Gly

Para ver el efecto de las mutaciones sobre la estructura y estabilidad de HAL2 se realizaroncurvas de desnaturalizacin inducidas por UREA seguidas mediante las siguientes tcnicas:

a) Dispersin de luz: permite medir el tamao de las molculas en solucin(DATO: si una protena tiene estructura cuaternaria por dispersin de luz se obtiene eltamao del oligmeros. Los cambios de estructura terciaria no se detectan)

Tamao

48 kDa Curvas para HAL2 yMUT2

MUT1

2 2.5 M UREA (M)

24 kDa

1717

b) Dicrosmo circular en el UV cercano (estructura terciaria)

1

Fraccindesplegada

MUT2Curvas para HAL2 yMUT1

0

2.5 M 3.5 M UREA (M)

c) Dicrosmo circular en el UV lejano (estructura secundaria)

1

Fraccindesplegada

MUT2

Curvas paraHAL2 y MUT1

0

2.5 M 5 M UREA (M)

Preguntas:a) Cmo es el camino de desplegado de HAL2? Describa como es la prdida de los

diferentes niveles de estructura en base a las curvas.b) Cul fue el efecto de las mutaciones introducidas en MUT1 sobre el camino de

desplegado? Describa como es la prdida de los diferentes niveles de estructura enbase a las curvas.

c) Qu tipo de motivo estructural mantiene a HAL2 en forma dimrica?d) Cul fue el efecto de la mutacin introducida en MUT2 sobre el camino de

desplegado? Describa como es la prdida de los diferentes niveles de estructura enbase a las curvas.

e) Cmo es la dependencia mutua de los diversos niveles de estructura para MUT2?(dicho de otra forma: Como depende la estructura terciaria y secundaria de laestructura cuaternaria?)

f) Cual podra ser el motivo molecular de cambiar TYR por GLY en la estabilidad deMUT2?

1818

Gen de Sma - + + +fraccin total total SN PP

Plsmido con A - + + +fraccin total total SN PP

28. El gen que codifica para la protena Sma fue aislado de hgado de rata y clonado en unvector de expresin en la bacteria Escherichia coli. Sma est formada por dos dominios: eldominio A tiene un PM de 11 kDa y el B un PM de 15 kDa. Cada una de los dominiospresenta un triptofano en el core hidrofbico, el cual sirve para medir la estabilidad de laprotena mediante fluorescencia.Para determinar si la protena Sma expresada en E. coli es soluble o se fue a cuerpos deinclusin, luego de crecer las bacterias a 37 C, se rompieron mediante sonicacin ydetergente, se centrifug el material resultante y se separ el sobrenadante (SN) delprecipitado (PP). Las fracciones aisladas se analizaron por SDS-Page:

Marcadores PM180 kDa

100 kDa

50 kDa

27 kDa

10 kDa

A continuacin se expresaron los dominios por separado y se realiz un anlisis similar:

Expresin del dominio A

Marcadores PM180 kDa

100 kDa

50 kDa

27 kDa

10 kDa

1919

Plsmido con B - + + +fraccin total total SN PP

Expresin del dominio B

Marcadores PM180 kDa

100 kDa

50 kDa

27 kDa

10 kDa

Luego de purificar las protenas (Sma completa, y los dominios por separado) se les midi laestabilidad trmica siguiendo la intensidad de fluorescencia del triptofano en funcin de latemperatura:

Fluorescencia 350 nm

Fluorescencia 350 nm

Fluorescencia 350 nm

Sma

A

B

28C

28C

65C

65C

Temperatura

Preguntas:a) Explique la curva de desplegado de Sma (Porqu presenta dos transiciones?)b) Cul es el grado de cooperacin del plegamiento de los dominios de Sma en la

protena completa? (Se ve afectada la estabilidad de un dominio por la presencia delotro?)

c) Explique la distribucin intracelular de cada una de las protenas (SN o PP) en base asu estabilidad trmica

2020

29. La protena RepM cuando se une a secuencias especficas de DNA reprime latranscripcin de las enzimas involucradas en la biosntesis de metionina. La unin al DNA esprecedida por la unin a RepM de una molcula pequea llamada S-adenosil metionina(SAM). Si SAM no est unida a la protena, sta no se une al DNA. Segn su estructuraprimaria RepM tiene una masa molecular de 32 kDa. La estructura terciaria de RepM puedeesquematizarse de la siguiente forma:

Sitio de unin a SAM

KHlice A D

Superficie de unin alADN

K: lisina (residuo positivo)D: cido asprticoLos residuos de K y D marcados en la figura estn a tres aminocidos de distancia en lasecuencia de RepM.

RepM posee varios residuos de triptofano que permiten estudiar cambios conformacionalesmediante fluorescencia.

Se estudi el efecto de la urea sobre RepM mediante dicrosmo circular en el UV lejano (far-UV, sigue cambios de estructura secundaria) y por fluorescencia de triptofano (sigue cambiosen la estructura terciaria, y si la hubiere, de estructura cuaternaria). Las curvas se realizaron enausencia y en presencia de SAM:

Sin SAM:

MAX

339nm

Fluorescencia

350

-5000

CD far UV

0

4.5 M 4.5 M

[UREA] [UREA]

2121

Con SAM:

MAX

339nm

330nm

Fluorescencia

2 M

4.5 M

[UREA]

350nm

-5000

CD far UV

4.5 M

0

[UREA]

A continuacin se determin el tamao de la protena por cromatografa de exclusinmolecular (cuanto ms grande es una protena su volumen de elusin es menor). El tamao delas protenas fue medido a la salida de la columna mediante un detector de dispersin de luz:

Abs 280 nm

+SAM64.2 kDa

-SAM32 kDa

Volumen

Finalmente se estudi el efecto del la hlice A sobre la estructura de RepM. Para ello se mutel residuo de lisina que est marcado en la figura por un cido asprtico y se midi el efecto dela urea en presencia de SAM:

RepM mutada en presencia de SAM:

MAX

Fluorescencia

2 M

350nm

CD far UV

0

339nm

-5000

330nm

3 M3 M

[UREA] [UREA]

2222

PREGUNTAS:

a) En base a los experimentos dibuje un modelo que describa el camino de desplegado deRepM en presencia y en ausencia de SAM.

b) Cul es la estructura cuaternaria de RepM cuando se encuentra unido al DNA?c) Cul fue el efecto de la mutacin de K por D sobre la estabilidad de RepM? Cul

podra ser la causa de dicho efecto?d) Por qu podra ser que la primera transicin (la de urea 2 M) de la protena mutada

sucede en la misma concentracin de urea que con la protena silvestre?

Nota: si bien este es un ejemplo inventado, en la realidad el comportamiento de RepM es bastante cercano.SAM es un metabolito secundario de la metionina, la necesidad de RepM por SAM para unirse al DNAconstituye un elegante mecanismo de autorregulacin en la biosntesis de este aminocido. Medtelo por unossegundos.

30. La protena IivA presenta un peso molecular predicho a partir de su secuencia de 12 kDa.En su secuencia presenta un nico residuo de cistena.

Cuando se realiza un gel de SDS-page en condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR) deIivA se observa:

Marcadores de pesomolecular

50 kDa

30 kDa

15 kDa

6 kDa

R NR

La estabilidad de la protena fue medida mediante curvas de desnaturalizacin trmica. L