0

Gyűrűs kalkonszármazékok citotoxikus és

daganatellenes hatása molekuláris

mechanizmusának vizsgálata

Egyetemi doktori (Ph.D.) értekezés

Dr. Rozmer Zsuzsanna

Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Pintér Erika

Programvezető: Prof. Dr. Gregus Zoltán

Témavezető: Prof. Dr. Perjési Pál

Konzulens: Prof. Dr. Gregus Zoltán

Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar

Gyógyszerészi Kémiai Intézet

Pécs

2014.

1

Tartalomjegyzék

I. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................ 3

II. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS ......................................................... 5

II.1. TERMÉSZETES KALKONOK ÉS BIOLÓGIAI HATÁSAIK .......................................... 7

II.2. SZINTETIKUS KALKONSZÁRMAZÉKOK ............................................................. 10

II.2.1. Kalkonok szintetikus előállítása ........................................................... 10

II.2.2. Szintetikus kalkonszármazékok biológiai vizsgálatának célja

és háttere ............................................................................................... 11

II.2.3. Gyűrűs kalkonanalógok szintézise és szerkezete .................................. 15

II.2.4. Gyűrűs kalkonszármazékok citotoxikus hatása és szerkezete

közötti kapcsolat ................................................................................... 17

II.2.5. Gyűrűs kalkonszármazékok daganatellenes hatása .............................. 19

III. CÉLKITŰZÉSEK .................................................................................................. 21

IV. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ............................................................................. 24

IV.1. KALKONSZÁRMAZÉKOK LOGP ÉRTÉKEINEK MEGHATÁROZÁSA ...................... 24

IV.1.1. Vizsgált anyagok ................................................................................... 24

IV.1.2. Fordított-fázísú vékonyréteg-kromatográfiás módszer ......................... 25

IV.2. GYŰRŰS KALKONSZÁRMAZÉKOK HATÁSMECHANIZMUSÁNAK VIZSGÁLATA ... 25

IV.2.1. Kísérleti anyagok és sejtkultúra ............................................................ 25

IV.2.2. Sejtkezelési protokoll ............................................................................ 26

IV.2.3. „Túlélés”-vizsgálat ................................................................................ 26

IV.2.4. Áramlási citometriai módszerek ........................................................... 26

IV.2.4.1. Az áramlási citometria ......................................................................................... 26

IV.2.4.2. Sejtszaporodásra gyakorolt hatás vizsgálata ........................................................ 27

IV.2.4.3. Sejtciklus-vizsgálat .............................................................................................. 28

IV.2.5. A vegyületek in vitro antioxidáns hatásának vizsgálata

dezoxiribóz degradációs módszerrel ..................................................... 28

IV.2.6. A kalkonanalógok celluláris redox-homeosztázisra gyakorolt

hatásának vizsgálata .............................................................................. 29

IV.2.6.1. Az intracelluláris ROS-aktivitás meghatározása .................................................. 29

IV.2.6.2. Mitokondriális funkciókra gyakorolt hatás vizsgálata .......................................... 30

2

IV.2.6.3. A celluláris tiolszint meghatározása ..................................................................... 30

IV.2.6.4. A celluláris redukált és oxidált glutationszint vizsgálata ..................................... 31

IV.2.7. A kalkonszármazékok glutationnal való reaktivitásának

vizsgálata .............................................................................................. 33

IV.2.7.1. A kalkon-glutation reakció vizsgálata sejtmentes körülmények között ............... 33

IV.2.7.2. A kalkon-glutation reakció vizsgálata Jurkat T sejtekben HPLC-MS módszerrel 33

V. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK .................................................... 35

V.1. KALKONANALÓGOK LIPOFILITÁSÁNAK JELLEMZÉSE ....................................... 35

V.2. GYŰRŰS KALKONSZÁRMAZÉKOK HATÁS-VIZSGÁLATÁNAK EREDMÉNYEI ....... 41

V.2.1. Az (E)-2-(4-metoxibenzilidén)-1-benzoszuberon és

4-metilanalógjának sejtproliferációra és sejtciklusra gyakorolt

hatása .................................................................................................... 41

V.2.1.1. A kalkonanalógok apoptózist indukálnak Jurkat T sejtekben ................................ 41

V.2.1.2. A vizsgált származékok eltérő módon befolyásolják a sejtciklust ......................... 45

V.2.2. A kalkonszármazékok in vitro antioxidáns hatással bírnak .................. 50

V.2.3. A kalkonszármazékok hatással vannak a Jurkat T sejtek

redox státuszára ..................................................................................... 53

V.2.3.1. A vegyületek befolyásolják a ROS-aktivitást ........................................................ 53

V.2.3.2. A kalkonszármazékok hatással vannak a mitokondriális funkciókra .................... 55

V.2.3.3. A kalkonanalógok befolyásolják a celluláris SH-szintet ....................................... 57

V.2.3.4. A kalkonszármazékok hatása a Jurkat sejtek glutation státuszára ......................... 58

V.2.4. A kalkon-glutation konjugációs reakció vizsgálata .............................. 61

V.2.4.1. A vizsgált kalkonszármazékok intrinsic aktivitást mutatnak glutationnal ............. 61

V.2.4.2. A kalkonanalógok és glutation konjugációs reakciójának vizsgálata Jurkat T

sejtekben ................................................................................................................ 63

VI. ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA, MEGBESZÉLÉS ........................ 67

VII. IRODALOMJEGYZÉK ...................................................................................... 71

VIII. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK .................................................................................... 85

IX. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................... 89

3

I. Rövidítések jegyzéke

ATP adenozin-5’-trifoszfát

ADP adenozin-5’-difoszfát

BCA bicinkoninsav

BSA marha szérum albumin (bovine serum albumin)

CHI kalkon-izomeráz

CHS kalkon-szintáz

CYP citokróm-P450 enzimrendszer

C4H fahéjsav-4-hidroxiláz

DAD diódasoros detektor

DCFH-DA 2’,7’-diklorofluoreszcein-diacetát

DMBA 7,12-dimetil-benz[α]antracén

DMSO dimetil-szulfoxid

DNS dezoxiribonukleinsav

DTNB 5,5'-ditiobisz-(2-nitrobenzoesav)

EDTA etiléndiamin-tetraecetsav

EpRE electrophile response element

ESI elektrospray-ionizáció

FITC fluoreszcein-izotiocianát

FCS fötális borjú savú (fetal calf serum)

FSC besugárzó fény irányával megeegyező irányú fényszóródás

(forward scatter)

GC gázkromatográfia

GCL glutamát-cisztein-ligáz

GGT gamma-glutamil-transzpeptidáz

GSH redukált glutation

GSSG oxidált glutation

GST glutation-S-transzferáz

HPLC nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia

IR infravörös spektroszkópia

KE karboxiláz enzim

Keap1 Kelch-like ECH-associated protein 1

4

logP megoszlási hányados logaritmusa

MALDI mátrix közvetítésével végzett lézer deszorpciós ionizáció

MS tömegspektrometria

NADPH redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát

NEM N-etilmaleimid

NMR mágneses magrezonancia

Nrf2 nuclear factor erythroid 2-related factor 2

OPA orto-ftálaldehid

PAH policiklusos aromás szénhidrogén

PAL fenilalanin-ammónia-liáz

PBS NaCl-tartalmú foszfát-tompítóoldat (phosphate buffered saline)

PGEE prosztaglandin E1-etilészter

PI propidium-jodid

RNS ribonukleinsav

ROS reaktív oxigénszármazék

RP-HPLC fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia

RP-TLC fordított fázisú vékonyréteg-kromatográfia

RPMI Roswell Park Memorial Institute sejttenyésztő médium

SF shake-flaske method

SH tiolcsoport

SDS nátrium-laurilszufát

SSC fény oldalirányú szóródása (side scatter)

TBA tiobarbitursav

TGSH totál glutation

TOF-MS time of flight / repülési idő tömegspektrometria

UDP uridin-5’-difoszfát

VRK vékonyrétegkromatográfia

4CL 4-kumarát-koenzimA-ligáz

γGCS gamma-glutamil-cisztein-szintáz

5

II. Bevezetés, irodalmi áttekintés

A daganatos megbetegedések korunk egyik legaggasztóbb népegészségügyi problémája.

Magyarországon, mint az iparilag fejlett országokban általában, a legtöbb ember a szív

és keringési rendszert érintő betegségekben hal meg, de a daganatos betegségek a

halálokok gyakoriságának sorrendjében a második helyen állnak, az összhalálozás közel

egynegyedét teszik ki. A főbb daganatos halálokok nemenként különbözőek: férfiak

esetén a daganatos halálokok több mint háromnegyedét az emésztőrendszeri és a

légzőszervi daganatok teszik ki, míg a nők között az emésztőszervi, a légzőszervi,

valamint az emlő- és méhdaganatok közel egyenlő százalékban okoznak halált. A

daganatos halálozás abszolút számait tekintve a hazai érték mindkét nem körében

magasabb, mint az európai átlag. (1) Mindezek a jelenségek előtérbe helyezik a

daganatos megbetegedések megelőzésére és kezelésére irányuló lehetőségek és

módszerek az eddigieknél még hatékonyabb kutatását.

A daganatos megbetegedések kialakulása, vagyis a karcinogenezis egy hosszú,

többlépcsős folyamat, melynek során a daganatsejtben mind több mutáció és hiba

halmozódik fel, és egyre jobban elvész a sejszaporodás kontrollja. A folyamat első fő

stádiuma az iniciáció, amikor spontán, vagy mutagén behatások mutációt váltanak ki a

genomban. A promóció során rögzülnek a genetikus hibák, hiszen promóterek hatására

a károsodott DNS expresszálódik, sejt-elfajulásokat okozva. Az invázió a rögzült

genetikus hibáknak az utódsejtek egyre nagyobb számában történő megjelenése,

malignus tumorok kialakulása. A progresszió egy komplex folyamat, amely ahhoz

vezet, hogy az elfajult sejtek elszaporodnak, klinikai daganat alakul ki, metasztázisok

jelennek meg. (2; 3)

(1. ábra)

A karcinogenezis folyamatába több ponton történhet beavatkozás. (1. ábra) A

daganatos megbetegedések elsődleges megelőzését a kockázati tényezők elkerülése,

vagy legalábbis csökkentése, a kemoprevenció és az egészségnevelés jelentik. A

kemoprevenció a DNS állomány károsítására alkalmas karcinogén formák, a DNS

nukleofil centrumaival szemben nagy reakciókészséget mutató elektrofil tulajdonságú

részek képződésének gátlása és/vagy eliminációjuk elősegítése, vagyis a genommal

történő interakciójuk meggátlása.

A tudatos kemoprevenció lényege, hogy természetes eredetű vagy szintetikus

anyagokat hosszú időn keresztül fogyasztunk annak érdekében, hogy a daganat

6

kialakulását megelőzzük, vagy a még reverzibilis folyamatot visszafordítsuk. Számos

epidemiológiai tanulmány döntő bizonyítékot nyújt néhány étrendi összetevő (pl.

vitaminok, fenolos és nem-fenolos antioxidánsok, omega-3-zsírsavak stb.)

kemopreventív hatásáról. Többek között a friss zöldségekben és gyümölcsökben nagy

mennyiségben előforduló polifenolok (főként flavonoidok) is csökkentik a rák

kialakulásának rizikóját. (4; 5)

1. ábra A karcinogenezis többlépcsős folyamata –

beavatkozási lehetőségek, preventív stratégiák (3)

A karcinogenezis folyamatának egy másik stádiumába történő beavatkozási

lehetőséget jelentenek a kemoterápiás gyógyszerek. A citosztatikumok különböző

hatásmechanizmus révén, de végső soron apoptózis indukciója és ezáltal a

daganatnövekedés gátlása útján hatnak. Szelektív toxicitásuk alapja, hogy a daganatos

sejtek osztódása gyorsabb, mint az egészséges sejteké, de alkalmazásuk során jelentős

mellékhatásokkal kell számolni. Bár folyamatosan számos új kemoterápiás szer kerül

7

bevezetésre, a hatékonyságot és a vegyületek szelektív toxicitását növelő kutatások

továbbra is a daganatellenes kutatások intenzív területét képezik.

II.1. Természetes kalkonok és biológiai hatásaik

A természetes növényi hatóanyagok egyik gyógyászati szempontból is széles körben

vizsgált csoportját képezik a flavonoidok. Nagyobbrészt ezek okozzák a virágok és

termések sárga, piros és kék színét. A flavonoidok formailag a difenilpropánból

levezethető (C6-C3-C6 alapszénváz) vegyületek, a két benzolgyűrű általában egy

oxigéntartalmú heterocikluson keresztül kapcsolódik. (6) A flavonoidok csoportján

belül számos alcsoportot (flavonok, flavonolok, flavanonok, flavanonolok,

antocianidinek, proantocianidinek, katechinek, kalkonok, auronok) különböztethetünk

meg, ugyanis az alapszerkezet nagy változatosságot biztosít mind a gyűrűk kapcsolódási

típusa, mind az összekapcsoló gyűrű szerkezete, mind a szubsztituensek tekintetében.

(2. ábra)

2. ábra A flavonoidok kapcsolódási típusai

A flavonoidok főként fenolos hidroxil- és metoxicsoportokat tartalmazó

természetes vegyületek, az alapvázhoz (aglikon) különböző – minőségű, számú és

helyzetű – cukormolekulák kapcsolódhatnak, így glükozidokat hozhatnak létre, amelyek

sokkal gyakrabban fordulnak elő a természetben, mint aglikonjaik.

A növényi flavonoidok szerepéről, kémiai szerkezetéről, élettani hatásairól

rendszeresen jelennek meg összefoglaló tanulmányok. (7; 8; 9; 10; 11) Igen széles körű

biológiai aktivitással rendelkeznek, például a citrusfélékben nagy mennyiségben

megtalálható heszperidin antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatása mellett értonizáló.

(12) A máriatövis hatóanyagai (pl. szilimarin, szilibin) májvédő hatásúak (13), a kerti

ruta (Ruta graveolens L., hatóanyaga a rutin, ami a kvercetin rutinózzal alkotott

glikozidja) gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatása révén szintén régóta használt

reumás megbetegedések, dermatitisz kezelésében, valamint görcsoldóként. (14)

8

A flavonoidok jellegzetes szerkezetű csoportját képezik a kalkonok. A kalkonok

szerkezetüket tekintve 1,3-diaril-2-propén-1-on alapvázzal rendelkező vegyületek.

(3. ábra)

3. ábra A kalkon szerkezete

A növényi kalkonok további átalakulásaik révén a flavonoidok előanyagainak is

tekinthetők. A kalkonok és flavonoidok biogenezisére a legvalószínűbbnek és

általánosan elfogadottnak a 4. ábra vázolt bioszintetikus út tekinthető. (15; 16; 17)

A kalkonok bioszintézisének első lépéseiben fenilalaninból, fenilalanin-ammónia-

liáz (PAL) enzim által katalizált dezaminálással fahéjsav képződik, melynek

hidroxilezését membránhoz kötött P450 monooxigenáz (fahéjsav-4-hidroxiláz, C4H)

végzi. Az így kialakult p-hidroxikumarilsav aktiválását 4-kumaroil-CoA-vá a 4-

kumarát-koenzimA-ligáz (4CL) végzi. A kalkonok B-gyűrűje 4-kumaroil-CoA-ból a

kalkon-szintáz segítségével (CHS) képződik, míg az A-gyűrű három – acetil-CoA-ból

és CO2-ból acetil-CoA-karboxiláz enzim (KE) hatására képződő – malonil-CoA

egységekből épül fel. (18)

A kalkonok sztereospecifikus gyűrűzáródása a kalkon-izomeráz (CHI) enzim

hatására következik be, és flavanonszármazékok keletkeznek, melyek megfelelő

enzimkatalízissel további flavonoidokká és izoflavonoidokká alakulhatnak tovább.

A kalkonszármazékok előfordulása általános a magasabbrendű növényekben. Irodalmi

adatok alapján a Leguminosae család több mint 70 fajtájából izoláltak különböző

szerkezetű kalkonokat, de az Asteraceae és Moraceae családok számos képviselőjében

is megtalálhatóak. (18) Ugyanakkor egyes növényfajták igen nagyszámú, különböző

kalkont tartalmaznak egymás mellett. A Cannabaceae családba tartozó Humulus lupus

gyantájában például 18 fajta kalkonszármazék fordul elő. A Glycyrrhiza inflata

gyökeréből 15 féle, az Angelica keiskei gyökeréből 25 kalkonanalógot különítettek el.

(18)

9

4. ábra A kalkonok bioszintézise

A növényi kalkonok főként hidroxil- és metoxiszubsztituált származékok, de

metil-, prenil-, geranilcsoportokat hordozó analógok, kromén- és benzofurán

heterociklusokat tartalmazó származékok, valamint kalkon-dimerek és dihidrokalkon-

származékok is előfordulnak a természetben.

A vegyületek sokrétű biológiai hatással rendelkeznek. Kalkonban gazdag növényi

drogokat, például az édesgyökeret (Liquorice), évszázadok óta használják Kínában

gyomor- és duodenális fekély kezelésére, különböző bőrproblémák, többek között

ekcéma és urtikária, valamint asztma terápiája során. (19) A távol-keleti országokban

tradícionálisan használják a buteint fájdalomcsillapításra, gasztritisz kezelésére,

különböző paraziták okozta fertőzésekben. (20; 21) A leggyakrabban vizsgált

természetes származékok az izoliquiritigenin, a butein, az izobavakalkon, a

10

xantoangelol, a likokalkon-A és a 4-hidroxi-lonhokarpin. (18) A természetes kalkonok

között megtalálhatóak antibakteriális (22), gombaellenes (23), vírusellenes (24),

protozonellenes (25) és tumorellenes (citotoxikus) hatású (26; 27) származékok,

úgymint kemoprotektív (28), kardioprotektív (29), antidiabetikus (30) hatással bíró

vegyületek. Az irodalmi eredmények alapján a leghatékonyabb tumorellenes hatású

származékoknak az izoliquiritigenin és butein bizonyultak.

II.2. Szintetikus kalkonszármazékok

II.2.1. Kalkonok szintetikus előállítása

A kalkonszármazékok laboratóriumi előállítására több lehetőség is rendelkezésre áll.

Kalkonok szintézise történhet Claisen-Schmidt féle kondenzációs reakció útján.

(5. ábra) (31) A reakció keresztezett aldoldimerizációs reakciónak tekinthető, amelynek

során a megfelelő keton és aldehid között nukleofil addíció játszódik le, és

vízkihasadással a megfelelő kalkonszármazék keletkezik.

5. ábra Claisen-Schmidt féle kondenzációs reakció

A kalkonok szintézisére alkalmas ún. Makaiyama-típusú aldolkondenzációs

reakció a Claisen-Schmidt féle reakcióhoz hasonló mechanizmussal játszódik le. (32)

A Suzuki-reakción alapuló eljárások szintén lehetőséget teremtenek kalkonok

előállítására. (6. ábra) (33) A Suzuki-reakció cinnamoil-klorid és fenil-bórsav, illetve

benzoil-klorid és fenilvinil-bórsav között, palládium katalizátor jelenlétében lejátszódó

keresztkapcsolási reakció.

11

6. ábra A Suzuki-féle kalkonszintézis egyenletei

Dihidrokalkonok szintézise, palládium katalizátor jelenlétében, 1-aril-2-propén-1-

ol és orto-halogénszubsztituált-fenol összekapcsolása révén történhet. (7. ábra) (34)

7. ábra Dihidrokalkonok szintézisének egyenlete

II.2.2. Szintetikus kalkonszármazékok biológiai vizsgálatának célja és

háttere

A növényekből izolált kalkonok vizsgálata mellett nagyszámú szintetikus származék

biológiai vizsgálatáról is beszámoltak, több összefoglaló közlemény is megjelent a

témában. (22; 35; 36; 37)

A szerteágazó biológiai hatások közül kiemelhető a citotoxikus és kemoprotektív

hatás. A szintetikus kalkonszármazékok szintézisének és biológiai vizsgálatainak egyik

előnye, hogy a rokon szerkezetű vegyületek összehasonlító vizsgálata során adatok

nyerhetők a szerkezet-hatás közötti kapcsolatról. Így a szintetikus származékok kiemelt

kutatási célja a természetes vegyületeknél hatékonyabb, főként a daganatterápiában

eredményesen alkalmazható analógok előállítása.

Az erre irányuló kutatások kémiai hátterében az áll, hogy a kalkonok, mint α,β-

telítetlen karbonilvegyületek (3. ábra) lágy elektrofilek, viszonylag könnyen reakcióba

léphetnek celluláris tiolokkal (lágy nukleofilek), ugyanakkor nem reagálnak amino- és

hidroxilcsoportokkal. (38) Mivel kémiailag nem reagálnak nukleinsavakkal, így a

12

kalkonszármazékok nem rendelkeznek genotoxikus hatással, ami a daganatterápiában

alkalmazott alkiláló típusú szerek egyik nemkívánt mellékhatása. (39)

A glutation szerepe

A sejtekben levő tiol (SH)-csoportok nagy többsége glutationból (GSH) származik. A

GSH intracellulárisan viszonylag nagy mennyiségben jelen levő nem-protein típusú tiol,

glicint, ciszteint és glutaminsavat tartalmazó tripeptid. (8. ábra)

8. ábra A glutation (GSH) szerkezete

A sejtek redox homeosztázisában igen fontos az intracelluláris redukált glutation-

szint fenntartása. A GSH kofaktora az oxigéntartalmú szabadgyökök, hidrogén-peroxid,

illetve egyéb organikus peroxidok eliminációjában részt vevő glutation-peroxidáz

enzimnek. A redukált glutation (GSH) oxidációja során két glutationmolekula diszulfid

híddal összekapcsolódhat és oxidált glutation (GSSG) keletkezik. A GSSG redukcióját

glutation-reduktáz enzim katalizálja NADPH felhasználásával. Normál körülmények

között az egyensúly a redukált forma irányába tolódik 500:1 arányban. A redukált

glutation koncentrációja magas a sejtekben, akár 5 mM is lehet. (40)

A glutation továbbá részt vesz a májban történő detoxikációs folyamatokban is, a

szervezetbe kerülő elektrofil vegyületek egy része a májban glutationnal konjugálódik.

A két szakaszban zajló folyamat első lépése a glutationnal való kapcsolódás, amit a

glutation-S-transzferáz enzim katalizál. A konjugáció a cisztein tiolcsoportján keresztül

valósul meg. Ezt követően előbb a γ-glutamil-transzpeptidáz hatására a glutaminsav,

majd a dipeptidáz hatására a glicin is lehasad a molekuláról, és a megmaradt konjugált

cisztein aminocsoportja acetilálódhat. A konjugáció révén az eredetileg toxikus

metabolitok vagy oldhatatlan vegyületek kiválasztásra kerülhetnek. (40)

13

A GSH funkciója tehát igen összetett: többek között detoxikáló folyamatokban

vesz részt, antioxidáns, cisztein-rezervoár és szabályozó szerepe van jelátviteli

folyamatokban. (41)

A kalkonok citotoxikus hatása

A kalkonok citotoxikus hatásának hátterében egyrészt a sejtek glutation-státuszának a

befolyásolása állhat. A kalkonszármazékok glutationnal történő reakcióját több

kutatócsoport is vizsgálta. (42; 43)

A konjugált karbonil-funkcióval rendelkező vegyületek jellegzetes Michael-

reakciós akceptorok, így könnyen reakcióba lépnek glutationnal. (44) A kalkonok -

szerkezetükből adódóan - feltételezhetően szintén reakcióba lépnek GSH-val, főként

konjugációs reakció révén. (42) (9. ábra)

9. ábra A kalkon, mint Michael-reakciós akceptor reakciója nukleofil tiollal (GSH)

Ugyanakkor, főként a hidroxilszubsztituált származékok, és a belőlük képződő

fenoxigyökök, oxidálhatják a GSH-t oxidált glutationná (GSSG), így előidézve a GSH-

szint csökkenését. (43) A GSH-szint megváltozása az intracelluláris redox-státusz

változását vonhatja maga után, ami befolyásolhatja többek között a DNS szintézis

folyamatát, a sejtciklus szabályozását, valamint enzimaktivációt, szelektív gén

expressziót válthat ki. (45)

A kalkonok citotoxikus aktivitásának hátterében még számos más tényező is

állhat. A B-gyűrűn elektronszívó szubsztituenst is hordozó hidroxikalkon-analógok

kiemelkedő tumorellenes hatást mutattak, amihez hozzájárul az angiogenezist gátló

14

hatásuk is. (46) Ugyanakkor, számos vegyület apoptózist indukál (47; 48), befolyásolja

a sejtciklust (48; 49; 50), valamint a mitokondriális membránpotenciál összeomlását

eredményezi (43).

Az antioxidáns hatású flavonoidok – ideértve a kalkonokat is – citotoxikus hatása

összefüggésbe hozható azok esetleges prooxidáns hatásával is. (35; 37; 51) A Fenton-

reakcióban keletkező hidroxilgyökök (HO˙) és aromás vegyületek reakciója során

fenolos-származékok keletkezhetnek. (52) A keletkező metabolitok további

biotranszformációja egy ún. „redox-cycling” reakcióban reaktív oxigén származékok

(ROS) képződését eredményezheti, ami oxidatív stressz kialakulásához vezethet, és így

az eredetileg antioxidáns vegyület prooxidáns hatású metabolittá válhat. (53)

Összeségében elmondható, hogy számos kalkonszármazék mikromólos

tartományban (IC50 < 50 μM) citotoxikus aktivitást mutat különböző tumor sejtvonallal

szemben. (37)

A kalkonok citoprotektív hatása

A daganatsejtekkel szemben mutatott toxicitásuk mellett, a kalkonok citoprotektív

hatása is jól dokumentált. A citoprotektív hatás hátterében egyrészt az állhat, hogy a

kalkonok és rokon szerkezetű Michael-reakciós akceptorok egyes, a fázis 2

biotranszformációkban részt vevő enzimeket indukálnak. (10; 54; 55) Ezen enzimek,

mint például a glutation-S-transzferáz (GST), az UDP-glükuronil-transzferáz, a

NAD(P)H:kinon-oxidoreduktáz (fázis 1 enzim) a celluláris védekező mechanizmus

meghatározó enzimei, és alapvető szerepet töltenek be a sejtek makromolekuláinak

kémiai módosítására irányuló elektrofil vegyületek reaktivitásának eliminálásában. (56)

Az antioxidáns és citoprotektív enzimek, fehérjék megnövekedett expressziójának

hátterében főként az Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2) által aktivált

folyamatok állhatnak. Normál fiziológiás körülmények között az Nrf2 a citoplazmában

a Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), ciszteinben gazdag, homodimer cink

metalloproteinhez kapcsolódik, és inaktív formában van. (57; 58) Oxidatív stressz

hatására az Nrf2-Keap1 komplex felbomlik, és az Nfr2 aktív formába kerül.

Ugyanakkor lágy elektrofil molekulák, mint az α,β-telítetlen aldehidek és ketonok is,

kovalens kötéssel a Keap1 fehérjék tiolcsoportjaihoz kötődnek, ami az Nrf2-Keap1

komplex bomlásához vezet. A szabad Nrf2 molekulák mennyisége megnő, a sejtmagba

kerülnek, ahol Maf proteinekkel heterodimert képeznek és a promóter szakaszukban

15

EpRE (electrophile response element) részt tartalmazó, a detoxikációs folyamatokban

fontos szerepet betöltő enzimeket kódoló géneket aktiválnak. (59; 60)

A kalkonok kemopreventív hatásában az is szerepet játszhat, ha a vegyület gátolja

azon onkogéneknek, például a c-myc onkogén expresszióját, amelyek megnövekedett

megjelenése hozzájárul a karcinogenezis folyamatához. (61)

Számos xenobiotikum toxikus hatása abból fakad, hogy citokróm P450 1A enzim

aktiválásán keresztül elősegítik promutagének metabolikus aktivációját (10), illetve

megnövelik a reaktív oxigéngyökök mennyiségét, ezzel oxidatív stresszt előidézve.

Főként a hidroxi- és metoxiszubsztituált kalkonszármazékok gátolják a CYP1A

aktivitását, antioxidáns hatással rendelkeznek, valamint pozitív hatással vannak az

intercelluláris kommunikációra (gap junctional intercellular communication, GJIC), így

ígéretes kemoprotektív hatással bíró molekulák. (62)

Az antioxidáns aktivitás hátterében elsősorban a reaktív oxigéngyök-fogó

tulajdonság állhat, ami főként a hidroxiszubsztituált származékok esetén kifejezett. (37)

Az α- és β-szénatom közötti kettőskötés geometriai izomerek jelenlétét feltételezi. Az

(E)-izomer termodinamikai szempontból stabilisabb, szinte minden kalkon ebben a

formában izolálható. A 3-hidroxi-3’-metilkalkon (E)-izomerjének metanolos oldatában

ugyanakkor fény hatására fotoizomerizáció történik, és a (Z)-forma jelenik meg. (63) A

(Z)-izomer antitumor aktivitása nagyobb, mint az eredeti (E)-izomeré, tehát

fotoizomerizáció hatására is megváltozhat a vegyületek biológiai aktivitása.

II.2.3. Gyűrűs kalkonanalógok szintézise és szerkezete

Korábbi kísérleti eredmények szerint a két aromás gyűrű egymáshoz viszonyított térbeli

helyzete alapvetően befolyásolja a kalkonok bioaktivitását. Bár a kalkonok konjugált

molekulák, eléggé flexibilisek ahhoz, hogy oldatban több konformációt is felvegyenek.

A kalkonok vizsgálata így nem teszi lehetővé az optimális térszerkezet és biológiai

hatás közötti kapcsolat vizsgálatát.

Ezen kapcsolat alaposabb megismerése céljából történt a kalkonokkal szerkezeti

rokonságban álló gyűrűs telítetlen karbonilvegyületek szintézise, kémiai

reaktivitásának, elektron- és térszerkezetének, valamint biológiai hatásainak vizsgálata.

(64)

16

A kalkon (1) kevéssé flexibilis analógjainak tekinthetők az (E)-2-benzilidén-1-

indanonok (2), -tetralonok (3) és -benzoszuberonok (4). (10. ábra)

10. ábra A kalkon és gyűrűs származékainak szerkezete

A 2-4 vegyületek és B-gyűrűn szubsztituált származékaik 1-indanon, 1-tetralon és

1-benzoszuberon, valamint a megfelelő aromás aldehid Claisen-Schmidt

kondenzációjával állíthatók elő. (11. ábra)

11. ábra Gyűrűs kalkonszármazékok szintézise Claisen-Schmidt kondenzációval

(1-indanon: n=1; 1-tetralon: n=2; 1-benzoszuberon: n=3)

A vegyületek szerkezetét, térszerkezetét (konfiguráció és konformáció)

elemanalízissel, valamint IR, 1H NMR és

13C NMR módszerekkel igazolták. (64; 65;

66) A gyűrűs kalkonanalógok nukleofil reaktánsokkal szemben mutatott eltérő

reaktivitásának értelmezése céljából Perjési és mtsai megvizsgálták a vegyületek tér- és

elektronszerkezetét. Az infravörös (IR) és 13

C-NMR spektroszkópiai módszerek

segítségével megállapították, hogy az arilidéncsoport elektronküldő, illetve

elektronszívó szubsztituensei hatással vannak a vegyületek telítetlen karbonil (enon)-

17

fragmensének elektroneloszlására, így annak nukelofil reagensekkel szemben mutatott

reaktivitására. (67; 68)

A két aromás gyűrű egymáshoz viszonyított térbeli helyzetén kívül az aromás

gyűrű szubsztituenseinek szterikus, elektronszerkezeti és hidrofób tulajdonságai szintén

fontos szerepet játszanak a biológiai hatás kialakításában.

II.2.4. Gyűrűs kalkonszármazékok citotoxikus hatása és szerkezete

közötti kapcsolat

A különböző szubsztituensekkel bíró gyűrűs kalkonszármazékok in vitro

citotoxicitásának vizsgálata P388, L1210 leukémia sejtekkel, valamint Molt 4/C8 és

CEM T-limfocitákkal szemben történt. (64; 69) A 2-4 sorozat vegyületeinek vizsgált

sejtekkel szemben meghatározott IC50 (a sejtek szaporodásának 50%-os gátlásához

szükséges koncentráció; μM) értékei alapján számított ún. „Átlagos Potenciál” (ÁP,

μM) értékeket az 1. táblázat tartalmazza.

A négy teszt alapján számított ÁP értékek összehasonlítása alapján

megállapították, hogy a 7-tagú gyűrűs (E)-2-(X-benzilidén)-1-benzoszuberon (4)

származékok a leghatékonyabb citotoxikus analógok.

Sorozat P388 sejtek L1210 sejtek Molt 4/C8

limfociták

CEM

limfociták

Indanon (2) 42,9 127 267 155

Tetralon (3) 20,9 135 158 115

Benzoszuberon (4) 11,2 85,2 66 47

1. táblázat A 2-4 sorozat „Átlagos Potenciál” (ÁP; μM) értékei

a vizsgált egér és humán daganatos sejtvonalakkal szemben (64)

Dimmock és mtsai kvantumkémiai számításokkal is meghatározták a

szubsztituálatlan ciklikus kalkonszármazékok energetikailag legkedvezőbb

konformációját az aromás gyűrűk térbeli elhelyezkedésének vizsgálata céljából. (64) Az

öttagú-gyűrűs analóg esetén az arilidéncsoport térbeli elhelyezkedése lényegesen eltér a

másik két vegyületétől, ami alapjául szolgálhat a 2, valamit a 3 és 4 sorozat tagjai eltérő

citotoxikus hatásának.

18

A vegyületek térszerkezete mellett az in vitro citotoxikus hatás nagymértékben

függ a cinnamoil molekulafragmensen található szubsztituens természetétől és

helyzetétől. (2. táblázat) Ezt támasztja alá, hogy minden vizsgált tumorsejtvonallal

szemben a 4-es, vagyis para-helyzetben metoxi-, valamint dimetilamino-szubsztituenst

hordozó 2-(X-benzilidén)-1-benzoszuberonok bizonyultak a sorozat leghatékonyabb

származékainak. (64)

Vegyület (X) P388 sejtek L1210

sejtek

Molt 4/C8

limfociták

CEM

limfociták

H 12,7 106,0 42,7 28,9

4-CH3 11,8 25,0 21,3 11,4

3-Cl 8,2 52,3 23,8 9,44

4-Cl 9,5 51,8 33,0 15,1

4-F 11,1 60,3 53,6 20,0

4-OCH3 1,6 0,34 0,47 0,35

4-N(CH3)2 1,9 1,87 5,25 3,05

melfalán 0,22 2,13 3,24 2,47

2. táblázat Néhány (E)-2-(X-benzilidén)-1-benzoszuberon (4) in vitro IC50 értéke (μM)

(64)

A 4 sorozat szubsztituensei elektronszerkezeti, hidrofób és térbeli

tulajdonságainak vizsgálata során megállapították, hogy a vegyületek P388 és L1210

sejtekkel, valamint humán daganatos sejtekkel szemben mutatott citotoxicitása negatív

korrelációt mutatott az arilidén molekularész szubsztituenseinek Hammett-szigma

értékeivel, ugyanakkor pozitív korrelációt mutatott a szubsztituensek moláris

refraktivitás (MR) értékeivel. (64) A vegyületek citotoxicitása egyetlen vizsgált

sejtvonalon sem mutatott korrelációt a szubsztituensek lipofilitását jellemző Hansch-

féle π-értékkel. Röntgenkrisztallográfiás vizsgálatok támasztották alá, hogy a két

aromás gyűrű által bezárt szög – amit szintén befolyásol a B-gyűrűn levő szubsztituens

jellege – növekedése, vagyis a molekula koplanaritásának csökkenése a citotoxikus

hatás növekedését eredményezi. A legaktívabb 7-tagú gyűrűs származékok (4-OCH3 és

4-N(CH3)2-vegyületek) esetén mért értékek (19° illetve 23°) a hatás szempontjából az

optimális értékeket jelenthetik. Összességében az mondható el, hogy a vizsgált

vegyületek közül a para-helyzetben nagyméretű, elektronban gazdag szubsztituens

hordozó 7-tagú gyűrűs analógok bizonyultak a leghatásosabbnak.

19

Néhány reprezentatív vegyület (4-CH3; 4-OCH3 és 4-N(CH3)2-szubsztituált 2-(X)-

benzilidén-1-benzoszuberon) hatásmechanizmusának előzetes vizsgálati eredményei azt

mutatták, hogy in vitro humán Jurkat-T sejttenyészetben gátolják az RNS- és a

fehérjeszintézist és a sejtek apotózisát váltották ki. A vizsgált koncentrációban (IC80) a

vegyületek RNS- és fehérjeszintézist gátló hatása, valamint azok Jurkat T-sejtekkel

szemben mutatott citotoxicitása között azonban nem állapítható meg korreláció. (64)

II.2.5. Gyűrűs kalkonszármazékok daganatellenes hatása

A kiemelkedő citotoxikus hatást mutató 7-tagú gyűrűs, 4-helyzetben metoxiszubsztituált

kalkonanalóg in vivo daganatellenes hatását vizsgálták Perjési és mtsai. Az

experimentális toxikológiai kísérletek során az egyik gyakran alkalmazott ún.

policiklusos aromás szénhidrogén (PAH) a 7,12-dimetilbenz[α]antracén (DMBA),

amely állatkísérletekben erősen rákkeltőnek bizonyult, és feltételezett humán

karcinogén. A kísérleti állatok DMBA-val történő kezelése emlőtumort, tüdőtumort,

hólyagtumort és leukémiát eredményezhet. (70) Az (E)-2-(4-metoxibenzilidén)-1-

benzoszuberon in vivo daganatellenes hatásának vizsgálata során a vegyület – a rövid

idejű „short-term” (24 és 48 órás) eredmények alapján – hatékonyan csökkentette

onko/szupresszor gének (H-ras, c-myc és p53) DMBA-indukálta expresszióját a kísérleti

állatok (CBA/Ca egér) májában, tüdejében, veséjében és nyirokcsomójában, különösen

akkor, ha azt a DMBA adását megelőzően, vagy azzal egyidőben alkalmazták. (71; 72)

A policiklusos aromás szénhidrogének, így a DMBA is, genotoxikus hatású

karcinogének. A genotoxikus hatás kialakulásának előfeltétele a vegyületek citokróm P-

450 enzimek által katalizált metabolizmusa, melynek eredményeképpen az aromás

szénhidrogének reaktív dihidrodiol-epoxid származékokká alakulnak át, és kémiai

reakcióba lépnek a sejt nukleofil molekuláival, így fehérjékkel és DNS bázisokkal. (73;

74) A DMBA genotoxikus hatásának másik lehetséges mechanizmusa a DMBA

metabolizmusa során keletkező 7-OH-DMBA származék – ami a citoszolban található

szulfotranszferáz enzim szubsztrátja - elektrofil szulfát-észterének keletkezése, ami a

DNS adenin és guanin bázisainak aminocsoportjait támadja meg. (75; 76) Monostory és

mtsai igazolták, hogy az (E)-2-(4-metoxibenzilidén)-1-benzoszuberon DMBA-indukálta

génexpresszióra gyakorolt hatásának kialakulásában szerepet játszhat a vegyületnek a

DMBA-t metabolizáló CYP1A izoenzimre gyakorolt gátló hatása. (77)

20

Ezen kísérleti tapasztalatok alapján a vizsgált metoxiszármazék, valamint

analógjai a policiklusos aromás szénhidrogének okozta karcinogenezissel szemben

alkalmazható kemopreventív szerek lehetnek.

21

III. Célkitűzések

Az irodalmi adatok, valamint a korábbi kísérleti eredmények arra engednek

következtetni, hogy a kalkonok (1) és gyűrűs kalkonszármazékok (2-4) ígéretes

kiindulási anyagok lehetnek a citotoxikus és/vagy citoprotektív hatással rendelkező

vegyületek kutatásában.

A számos, különbözőképpen szubsztituált és eltérő gyűrűtagszámú kalkonanalóg

előzetes, in vitro sejtproliferációt gátló hatásának vizsgálata során nyilvánvalóvá vált,

hogy a vegyületek biológiai hatása nagymértékben függ a gyűrűtagszámtól, valamint a

szubsztituens pozíciójától és jellegétől, ami a vegyület elektron- és térszerkezetét

alapvetően befolyásolja. Munkánk során fő célul a gyűrűs kalkonszármazékok fizikai-

kémiai tulajdonságainak és a citotoxikus/citoprotektív hatás hátterében álló molekuláris

mechanizmusoknak alaposabb megismerését tűztük ki.

Az elektron- és térszerkezeti jellemzők mellett a vegyületek biológiai hatásának, illetve

hasznosíthatóságának fontos paramétere a molekulák lipofilitása, melynek számszerű

jellemzésére leggyakrabban a vegyületek oktanol-víz megoszlási hányadosának

logaritmusát (logP) használják. (78) A logP meghatározásának több kísérleti módszere

is ismeretes az irodalomban. (79) Célunk az 1-4 sorozat különböző szubsztituenseket

hordozó tagjai logP értékének meghatározása egy korábban beállított, ún. „helyettesítő”

módszer, alapvetően fordított fázisú vékonyrétegkromatográfiás technika (RP-TLC)

alkalmazásával. (80) A logP értékek ismeretében a molekulák lipofilitása és szerkezete

közötti esetleges összefüggéseket kívánjuk vizsgálni.

A gyűrűs kalkonszármazékok citotoxikus és daganatellenes hatásának kialakulásában

szerepet játszó mechanizmusok alaposabb megismerése céljából a korábbi in vitro

toxicitásvizsgálatok során kiemelkedő hatást mutató 7-tagú gyűrűs (E)-2-(4-

metoxibenzilidén)-1-benzoszuberont (4a) és kevéssé toxikus 4-metilszubsztituált

analógját (4b) választottuk a tervezett vizsgálatok elvégzéséhez. (12. ábra)

22

12. ábra A vizsgált kalkonszármazékok szerkezete

Munkánk során az alábbi célokat tűztük ki:

1. A vizsgált vegyületek in vitro sejtszaporodást gátló hatásának vizsgálata humán

Jurkat T sejtekkel szemben a vegyületek közel ekvitoxikus dózisával történő

kezelést követően, tripánkékkel történő festési eljárással. Az élő, a korai

apoptotikus fázisban levő és az apoptotikus/nekrotikus sejtek

mennyiségének/arányának meghatározása áramlási citometriai módszerrel.

2. A vegyületek sejtosztódásra, sejtciklusra gyakorolt hatásainak áramlási citometriai

módszerrel történő vizsgálata Jurkat T sejtekben, a vegyületekkel történő 8, 24 és

48 órás kezelést követően.

3. A vizsgált kalkonanalógok in vitro antioxidáns (hidroxilgyök „scavenger”),

illetőleg esetleges prooxidáns hatásának vizsgálata, annak időbeli függése a Fenton-

reakció inicializálta dezoxiribóz degradációs teszt alkalmazásával. A vizsgálatok

során kísérletet kívánunk tenni a vegyületek hidroxilgyökökkel lejátszódó

reakciójában esetlegesen képződő termékek azonosítására is.

4. A vegyületek antioxidáns/prooxidáns jellegének tanulmányozása céljából sejtes

körülmények között, Jurkat T sejtekben is vizsgáljuk az analógok ROS (reaktív

oxigénszármazék)-aktivitásra, vagyis a celluláris redox-státuszra gyakorolt hatását.

A vizsgálatokhoz a diklorofluoreszcein-tesztet kívánjuk alkalmazni.

5. A mitokondriális funkciók alapvetően befolyásolják a sejtek működését.

Xenobiotikumok citotoxikus és antineoplasztikus aktivitásához hozzájárulhat a

mitokondriális funkciók megváltozása. Vizsgálni kívánjuk a kalakonanalógok

mitokondriális respirációra és ATPáz-aktivitásra gyakorolt hatását.

23

6. Az élő sejtek redox-homeosztázisát alapvetően meghatározza a sejt SH-státusza.

Célunk a vegyületek SH-szintre, majd glutation-szintre gyakorolt hatásának

vizsgálata Jurkat T sejtekben. A redox-státusz jellemzésére a sejtek redukált és

oxidált glutation arányának, illetve azok mennyiségének a meghatározása is

szükséges.

7. A vegyületek kémiai szerkezete alapján feltételezhető, hogy tiolcsoportokkal

konjugációs reakcióba is léphetnek, ezért vizsgálni kívánjuk a vegyületek redukált

glutationnal szemben mutatott reaktivitását, mind sejtmentes, mind sejtes

körülmények között. Az esetlegesen képződő konjugátumok jelenlétét

vékonyrétegkromatográfiás módszerrel, ún. „kettős-előhívást” alkalmazva kívánjuk

kimutatni. Az esetleges pozitív reakciót követően RP-HPLC-hez csatolt

tömegspektrometriás eljárással kivánjuk a létrejövő konjugátumok szerkezetét

igazolni.

24

IV. Vizsgálati módszerek

IV.1. Kalkonszármazékok logP értékeinek meghatározása

A 1-4 sorozat különféle szubsztituensekkel bíró tagjai logP értékének meghatározása

egy korábbi, a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézetével kialakult

kooperációs munka során alkalmazott fordított-fázisú vékonyréteg-kromatográfiás

technika alkalmazásával történt. (80)

IV.1.1. Vizsgált anyagok

A vizsgált vegyületek az 1-4 sorozatok tagjai, szintézisük és tisztításuk korábban leírtak

szerint történt. (64) A kalibrációs sorozat tagjainak szerkezete a 3. táblázatban látható.

(81) A módszer validálásához használt progeszteron és diazepam gyógyszerkönyvi

minőségűek, a prosztaglandin E1-etilésztert (PGEE) a Sanofi-Synthelabo-Chinoin Zrt.

(Budapest, Hungary) bocsátotta rendelkezésünkre. A vizsgálatokhoz használt metanol

és n-oktanol HPLC minőségűek, a többi vegyszer analitikai tisztaságú.

R1 R2 R3

CH3 CH2-C6H5 H

CH2- CH2- CH2- CH2- CH2 H

H H CH3

H C6H5 CH3

H C6H5 H

CH3 C2H5 H

3. táblázat A logP meghatározáshoz használt kalibrációs sorozat tagjainak szerkezete

25

IV.1.2. Fordított-fázísú vékonyréteg-kromatográfiás módszer

A korábbi meghatározások (80) folytatásaként 29 kalkonszármazék vizsgálata történt. A

meghatározáshoz szilanizált szilikagél 60F254 (20 cm x 20 cm) rétegeket (Merck,

Germany) használtunk. A vizsgálatok előtt a rétegeket metanollal mostuk, szárítottuk,

majd 1 órán keresztül 160 °C-on aktíváltuk. A vizsgálandó anyagokat, valamint a

kalibrációs és validációs sorozat tagjait metanol-kloroform 1:1 arányú elegyében

oldottuk (2 mg/ml), majd vittük fel a lemezre. Mozgófázisként metanol-víz (60+40)

elegyet használtuk. A rétegek kifejlesztése előtt a szűrőpapírral bélelt futtató kádakat fél

órán át telítettük a mozgófázissal. A kifejlesztést (150 mm) követően a foltok előhívása

UV-fényben (λ = 254 nm), valamint jód-gőzben történt. Minden mérési eredmény

három párhuzamos meghatározásból származik.

A para-szubsztituált vegyületek logPCLOGP értékének számolásához a Chem3D

Ultra 9.0.1. szoftver (CambridgeSoft, Cambridge, MA, USA) CLOGP alkalmazását

használtuk.

IV.2. Gyűrűs kalkonszármazékok hatásmechanizmusának

vizsgálata

IV.2.1. Kísérleti anyagok és sejtkultúra

A vizsgálni kívánt gyűrűs kalkonszármazékok (4a és 4b) szintézise és tisztítása a

korábban leírtak szerint történt. (64) 4a vegyület összegképlete: C19H18O2, moláris

tömege: 278,35 g/mol. 4b vegyület összegképlete: C19H18O, moláris tömege:

262,35 g/mol. Mindkét származék halványsárga, tűkristályos vegyület, amely

metanolban jól oldódik.

A használt vegyszerek mindegyike analitikai tisztaságú volt, és – amennyibben az

külön nincs jelezve – beszerzése a Sigma-Aldrich (Budapest, Hungary) cégtől történt.

A humán Jurkat T limfocita sejtek (ATCC, E6-1 klón) az LGC Promochemtől

(Teddington, UK) származnak. A Jurkat T sejtek tenyésztése 37 °C-on, megfelelő pára-

és 5% CO2-tartalmú környezetben, RPMI 1640 tápoldatban (pH = 7,4) történt, amit

kiegészítettünk 10% FCS-el (magzati borjú szérum, Gibco), penicillinnel (100 U/ml) és

sztreptomicinnel (100 μg/ml).

26

IV.2.2. Sejtkezelési protokoll

A Jurkat T sejtek kezelése (5 x 105 db sejt / 1,0 ml RPMI 1640 tápoldat) a 4a (5,6 μM),

illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a vizsgálati módszereknek megfelelően 1, 4, 8, 24

illetve 48 órán keresztül történt. A koncentrációértékek az előzetesen meghatározott

IC80 dózisértékeknek felelnek meg. (64) A kalkonszármazékokat DMSO-ban oldottuk,

és az elkészült DMSO-oldatból 10 μl-t adtunk 1,0 ml sejteket tartalmazó tápoldathoz,

így mindig 1% DMSO-t tartalmazott a kezelt sejtszuszpenzió. A kontroll

sejtszuszpenzókat nem kezeltük, illetve minden esetben készítettünk egy olyan kontrollt

is, ami csak 1% DMSO-t tartalmazott, kalkon nélkül. (Jelölése: DMSO 1%)

IV.2.3. „Túlélés”-vizsgálat

A Jurkat T sejtek kezelése (5 x 105 db sejt / 1,0 ml RPMI 1640 tápoldat) a 4a (5,6 μM),

illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a protokoll (IV.2.2) szerint történt. A 8, 24 és 48

órás sejtkezelést követően az összes sejt, valamint az életképes sejtek számolása a sejtek

tripánkékkel történő festését követően hemocitométer használatával történt. (82) Az

eredmények négy párhuzamos mérésből származnak.

IV.2.4. Áramlási citometriai módszerek

IV.2.4.1. Az áramlási citometria

Az áramlási citometria egy olyan eljárás, amely alkalmas vegyes sejtpopulációkban az

egyes sejtcsoportok elkülönítésére azok nagysága és a sejtalkotók összetettsége

(granularitás) alapján, valamint egy-sejt szinten, több hullámhosszon mérve, azok

fluoreszcens jelének detektálására. (83)

A vizsgált sejtszuszpenziót a készülékben a köpenyfolyadék egy kapillárisban, az

ún. áramlási cellában áramoltatja. A kapillárisban haladó sejteket a készülék nagyságtól

függetlenül számlálja. Ezzel párhuzamosan hagyományos fényforrással megvilágítva a

sejteket kétféle jelet detektálunk: a besugárzó fény irányával megeegyező irányú

fényszóródás (forward scattered light, FSC) a sejtek nagyságáról ad információt, a fény

oldalirányú szóródása (side scattered light, SSC) pedig a sejtek granularitásával

arányos. A jeleket két detektor érzékeli és alakítja digitális jellé, amit egy számítógépes

program diagrammon jelenít meg.

27

Amennyiben a vizsgálandó sejt valamely felszíni vagy citoplazmatikus

markeréhez/markereihez közvetlenül, vagy közvetett módon (monoklonális

ellenanyag(ok)hoz kötve) fluoreszcens festéket kötünk, úgy a készülékben elhelyezett

lézerek (számuktól és a gerjesztő fényük hullámhosszától függően) alkalmasak az adott

fluoreszcens festékmolekulák gerjesztésére. A fluoreszcens festékek fényemisszióját

detektorok mérik adott hullámhosszakon (FL-1, FL-2, FL-3, FL-4 csatornákon). A jelet

átalakítva és ábrázolva lehetőség nyílik egy-sejt szinten egyszerre több molekula

fluoreszcens jelének detektálására.

A módszer nagy előnye, hogy rövid idő alatt nagyszámú (105-10

6 db) sejtről

kapunk többféle információt.

IV.2.4.2. Sejtszaporodásra gyakorolt hatás vizsgálata

A korai apototikus fázisban levő, illetve apoptotikus sejtek mennyiségének

meghatározása a következők szerint történt. A Jurkat T sejteket (5 x 105 db sejt / 1,0 ml

tápoldat) a 4a (5,6 μM), illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a protokoll (IV.2.2) szerinti

8, 24 és 48 órás kezelését és centrifugálását (1000g, 5 perc) követően kétszer mostuk

1,0 ml hideg PBS-pufferben, majd 1,0 ml annexin-kötő pufferben (10 mM

Hepes/NaOH; pH = 7,4; 140 mM NaCl; 2,5 mM CaCl2). A sejteket 100 μl annexin-kötő

pufferben vettük fel és 2 μl fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) jelölt annexin V-oldattal

(Annexin V-FITC) (BD Biosciences) és 10 μl 50 μg/ml koncentrációjú propídium-jodid

(PI)-oldattal inkubáltuk szobahőmérsékleten, fénytől védve, 15 percig. Az inkubációs

idő lejárta után a mintákat 400 μl annexin-kötő pufferrel higítottuk, majd 30 percen

belül vizsgáltuk áramlási citométerrel. A 48 órán keresztül kezelt sejtek jelölése az

előzőkhöz hasonlóan, de csak propídium-jodiddal történt.

Az áramlási citometriás mérést és analízist a FACSCalibur (Becton Dickinson

Biosciences, San Jose, CA) áramlási citométeren a CellQuest (BD Biosciences)

software segítségével végeztük. A vizsgálatkor nem használtunk kapuzást.

Az annexin V-FITC-el jelölt sejteket (zöld fluoreszcencia) az FL-1 csatornán

(525 nm), a propídium-jodiddal jelölt sejteket (piros fluoreszcencia) az FL-2 csatornán

(575 nm) detektáltuk. Mintánként 50 000 eseményt mértünk. A két emissziós spektrum

átfedésének kiküszöbölésére elektronikus kompenzációt használtunk. A kezeletlen

kontroll sejtek esetén beállított kvadráns statisztikai paramétereket használtuk a további

vizsgálatokhoz. Az FL-1/FL-2 csatornákon mérhető fluoreszcencia intenzitás alapján

28

megkülönböztethetünk élő sejteket (annexin V-negatív + PI-negatív), korai apoptotikus

fázisban levő sejteket (annexin V-pozitív + PI-negatív) és apototikus (vagy nekrotikus,

azaz elpusztult) sejteket (annexin V-pozitív + PI-pozitív). (84; 85) Az eredmények négy

párhuzamos mérésből származnak.

IV.2.4.3. Sejtciklus-vizsgálat

A kalkonanalógok sejtciklusra gyakorolt hatásának vizsgálatához a Jurkat T sejteket (5

x 105 db sejt / 1,0 ml tápoldat) a 4a (5,6 μM), illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a

protokoll (IV.2.2) szerinti 8, 24 és 48 órás kezelését és centrifugálását (1000g, 5 perc)

követően kétszer mostuk 1,0 ml hideg PBS-pufferben, majd 300 μl 4% paraformalehid-

oldattal fixáltuk 20 percen keresztül. Ezt követően a sejteket kétszer mostuk 2,0 ml

PBS-pufferben, majd 1,0 ml szaponin-pufferben (PBS/0,1% BSA/0,1% szaponin),

végül 300 μl propídium-jodid-oldatban (50 μg/ml PI; 100 Kunitz units RNase A/ml

szaponin pufferben) vettük fel. 30 perc inkubálási időt követően az áramlási citometriás

mérést és analízist a FACSCalibur (BD Biosciences) áramlási citométeren a CellQuest

(BD Biosciences) software segítségével végeztük.

A jelölt sejtek DNS-mennyiségének meghatározása az FL-2 csatornán (575 nm)

történt, lineáris erősítés mellett. Mintánként 10 000 eseményt mértünk. A kezeletlen

kontroll sejtek esetén beállított kapukat használtuk a további vizsgálatokhoz. Az

eredmények négy párhuzamos mérésből származnak.

IV.2.5. A vegyületek in vitro antioxidáns hatásának vizsgálata

dezoxiribóz degradációs módszerrel

A vizsgált kalkonanalógok in vitro antioxidáns (hidroxilgyök scavenger), esetleges

prooxidáns hatásának vizsgálatához a Fenton-reakció inicializálta dezoxiribóz

degradációs tesztet alkalmaztuk. (86; 87)

30 mM foszfát-puffer (pH=7,4), 9 mM 2-dezoxi-D-ribóz, 40 mM nátrium-klorid,

30 µM vas(II)-szulfát-oldat elegyéhez adtuk a 4a, illetve 4b vegyületet az össztérfogat

1%-nak megfelelő térfogatú DMSO-ban oldva, valamint 50 µM H2O2-ot. A kalkonok

végkoncentrációja 200 µM volt. A vizsgálatokat EDTA hozzáadása nélkül, illetve

EDTA (36 μM) jelenlétében is elvégeztük. Az elegyeket jól záró kémcsövekben 37 oC-

on inkubáltuk, majd a degradációs reakció időbeli követéséhez a 20 percenként (4 órán

29

át) vett mintákban meghatároztuk a tiobarbitursav (TBA)-reaktív anyagok mennyiségét.

A kontroll-oldat a kalkonok DMSO-val készült oldata helyett csak a vizsgált anyagok

oldószereként használt DMSO-t tartalmazta.

A keletkezett TBA-reaktív anyagok meghatározása céljából az inkubátumok 1,0

ml térfogatához 0,5 ml tiobarbitursav-reagenst (1% (w/v) TBA 50 mM NaOH-ban

oldva) és 0,5 ml 5,6%-os (w/v) triklórecetsav-oldatot adtunk, majd az elegyet jól záró

kémcsőben 8 percig 100 oC-os glicerines fürdőben inkubáltuk. A szobahőmérsékletre

hűtött oldat abszorbanciáját 532 nm-en mértük, a megfelelő vak-oldat hasonló

körülmények között derivatizált oldatával szemben. A vak-oldat összetétele minden

esetben megegyezett a vizsgált minta összetételével, de nem tartalmazott vas(II)-

szulfátot és hidrogén-peroxidot. Minden oldat frissen készült, kétszeresen desztillált víz

felhasználásával. Minden mérési eredmény három párhuzamos kísérletből származik.

IV.2.6. A kalkonanalógok celluláris redox-homeosztázisra gyakorolt

hatásának vizsgálata

IV.2.6.1. Az intracelluláris ROS-aktivitás meghatározása

A vizsgált kalkonszármazékok intracelluláris reaktív oxigéngyök (ROS) termelésre

gyakorolt hatását az oxidációra érzékeny 2’,7’-diklórfluoreszcein-diacetátot (DCFH-

DA) felhasználva vizsgáltuk. (88; 89)

A Jurkat T sejteket (5 x 105 db sejt / 1,0 ml tápoldat) a 4a (5,6 μM), illetve 4b

(23,3 μM) vegyületekkel a protokoll (IV.2.2) szerinti 1, illetve és 4 órás kezelését és

centrifugálását (1000g, 5 perc) követően 1,0 ml hideg PBS-pufferben mostuk, majd 1,0

ml PBS-pufferben vettük fel. A sejteket 10 μM DCFH-DA-val, 37 °C-on 20 percig

sötétben inkubáltuk, majd kétszer 1,0 ml PBS pufferrel mostuk és 1,0 ml pufferbe

reszuszpendáltuk. A diklórfluoreszcein fluoreszcencia-intenzitásának meghatározását

FACSCalibur (BD Biosciences) áramlási citométeren a CellQuest (BD Biosciences)

software segítségével végeztük. A mérés az FL-1 csatornán történt, lineáris erősítés

mellett. Mintánként 10 000 eseményt mértünk.

Az eredmények a minták, és a kezeletlen kontroll sejtek fluoreszcencia

intenzitásának összehasonlításából származnak. Minden érték négy párhuzamos

mérésből származó átlag ± szórás. A statisztikai értékelés a Student-t teszt (p < 0,05)

használatával történt.

30

IV.2.6.2. Mitokondriális funkciókra gyakorolt hatás vizsgálata

A kalkonszármazékok mitokondriális funkciókra gyakorolt hatásainak vizsgálatát a

kassai P. J. Šafarik Egyetem Orvosi Kémiai és Biokémiai Intézetével kooperációban

végeztük.

A kísérletekhez hím Wistar patkányok (250-300 g) (Velaz, Praha, Czech

Republic) májából, Johnson és Lardy módszere alapján izolált mitokondriumot

használtunk. (90) A mitokondriális fehérjemennyiség meghatározása Lowry módosított

módszere szerint történt. (91)

Az izolált mitokondrium oxigénfogyasztásának mérése polarográfiás módszerrel,

Clark-típusú oxigénelektróddal (WTW oxi 325 (Germany)), 25°C-on, ún. respirációs

médiumban történt. A respirációs médium összetétele: 80 mM KCl, 300 mM KH2PO4,

300 mM K2HPO4, 15 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2, 0,78 mM EDTA desztillált vízben

oldva; pH = 7,4. A respirációs médiumhoz adtunk 20 mg/ml koncentrációban

mitokondrium-szuszpenziót, respirációs szubsztrátként 50 mM nátrium-szukcinátot, 0,5

mM ADP-t, valamint a vizsgált kalkonszármazékot, melynek mennyisége 70

nmol/mitokondriális fehérje mg. Az oxigénfogyasztás (nmol O2 x min-1

x mg-1

fehérje),

valamint az ATPáz aktivitás meghatározása 1 órás inkubáció után történt. (92) A

respirációs kontroll-hányados (RCR; respiratory control ratio) az „oxigénfogyasztás a 3-

as állapotban (state 3)” (ADP jelenlétében) és az „oxigénfogyasztás a 4-es állapotban

(state 4)” (ADP hozzáadása előtt) hányadosa. A vegyületek ATPáz-aktivitásra gyakorolt

hatásának vizsgálata Meissner szerint történt. (93) Minden érték három párhuzamos

mérésből származó átlag ± szórás. A statisztikai értékelés a Student-t teszt (p < 0,05)

használatával történt.

IV.2.6.3. A celluláris tiolszint meghatározása

A kalkonszármazékok celluláris tiol-szintet befolyásoló hatását vizsgáltuk Jurkat T

sejteken, tápanyag-mentes és tápanyagokat tartalmazó környezetben. A mért SH-szintet

a minták fehérjemennyiségére vonatkoztattuk.

A 4a (5,6 μM), illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel kezelt Jurkat T sejteket (2 x

106 db sejt) egyrészt 1,0 ml PBS-pufferben inkubáltuk (tápanyagmentes környezet) 1

órán át, másrészt 1,0 ml RPMI 1640-tápoldatban (10% FCS) 4 és 8 órán át. A kezelést

és centrifugálását (1000g, 5 perc) követően a sejteket kétszer mostuk 0,9%-os NaCl-

31

oldatban, majd 500 μl TRIS-pufferben (50 mM Trisz-HCl; 0,1% SDS; pH = 7,4) vettük

fel és ultrahangos szonikáció (3 perc) révén lizáltuk. A sejtlizátumokat centrifugáltuk

(13 000g, 5 perc), a tiszta felülúszót használtuk a tiol-szint, illetve a fehérjemennyiség

meghatározásához.

A szabad celluláris SH-szintet a DTNB- (5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoesav))

módszer szerint határoztuk meg, redukált glutation használva standardként. (94) A

fehérjekoncentráció meghatározása a BCA (bicinkoninsav)-módszer alkalmazásával

történt. (95) A fehérjeméréshez BSA (bovine serum albumine) standard oldatsorozatot

használtunk.

Mindkét meghatározás esetén Dynatech MR 7000 microplate (ELISA) reader-t

használtunk abszorbancia mérésre. Minden érték négy párhuzamos mérésből származó

átlag ± szórás. A statisztikai értékelés a Student-t teszt (p < 0,05) szerint, SPSS 12.0 for

Windows szoftver használatával történt.

IV.2.6.4. A celluláris redukált és oxidált glutationszint vizsgálata

A kalkonszármazékok celluláris glutation-szintet befolyásoló hatását vizsgáltuk Jurkat

T sejteken, ami magába foglalja a redukált GSH-szint, valamint az oxidált glutation

(GSSG)-szint meghatározását. A mért glutation-szinteket a minták fehérjemennyiségére

vonatkoztattuk.

A Jurkat T sejteket (2 x 106 db sejt / 5,0 ml RPMI 1640 tápoldat) 4a (5,6 μM),

illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a IV.2.2 protokoll szerint 4 órán át kezeltük. Az

inkubálást és centrifugálását (1000g, 5 perc) követően a sejteket kétszer mostuk 0,9%-

os NaCl-oldatban, majd 400 μl TRIS-pufferben (50 mM Trisz-HCl; 0,1% SDS; pH =

7,4) vettük fel és 3 egymást követő „freeze-and-thaw ciklust” alkalmazva (fagyasztás -

80 °C-on 30 percig, majd lassú olvasztás szobahőmérsékleten) lizáltuk. A

sejtlizátumokat centrifugáltuk (13 000g, 5 perc), a tiszta felülúszót használtuk a

fehérjemennyiség, illetve a glutation-szintek meghatározásához.

A fehérjemennyiség meghatározása a BCA (bicinkoninsav)-módszer szerint, BSA

standard oldatsorozat felhasználásával történt. (95) Abszorbancia mérésre Dynatech MR

7000 microplate (ELISA) reader-t használtunk.

A redukált és oxidált glutation-szint meghatározása Kand’ár és mtsai által

kidolgozott módszer kisebb változtatása szerint történt. (96) A minták

fehérjementesítéséhez a sejtfelülúszókat 6%-os perklórsavval elegyítettük (300 μl

32

felülúszó + 210 μl HClO4-oldat ), majd a kicsapódott fehérjét centrifugálással (10 000g,

4 perc) eltávolítottuk. A mintákat 1 M KOH-oldattal semlegesítettük, a kicsapódott

KClO4 csapadékot centrifugálás révén (3000g, 3 perc) eltávolítottuk. Az itt kapott

felülúszóból történt a redukált és oxidált glutation-szint meghatározása.

A redukált glutation-szint (GSH) meghatározásához 100 μl mintát 1,0 ml 0,1%

EDTA-t tartalmazó 0,1 M foszfát-pufferrel (pH = 8,0) hígítottuk. Ennek 20 μl-éhez 300

μl foszfát-puffert (0,1 M, pH = 8,0, 0,1% EDTA) és 20 μl metanollal készült 0,1%-os

orto-ftálaldehid-oldatot (OPA) adtunk. A mintákat szobahőmérsékleten, 15 percig

sötétben inkubáltuk, majd a vizsgálatig 4 °C-on tároltuk.

Az oxidált glutation-szint meghatározásához (GSSG) 200 μl mintát 200 μl 40 mM

N-etilmaleimid-oldattal (NEM), 25 °C-on, 25 percig sötétben inkubáltuk, majd 750 μl

0,1 M NaOH-oldattal hígítottuk. A hígított minta 20 μl-éhez 300 μl 0,1 M NaOH-

oldatot és 20 μl metanollal készült 0,1%-os OPA-oldatot adtunk. A mintákat

szobahőmérsékleten, 15 percig sötétben inkubáltuk, majd a vizsgálatig 4 °C-on tároltuk.

Referenciaként frissen készült, TRIS-pufferben (50 mM Trisz-HCl; 0,1% SDS;

pH 7,4) oldott, redukált és oxidált glutationt tartalmazó standard sorozatot használtunk.

Az minták GSH és GSSG-tartalmát az OPA-val történő derivatizálást követően

nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerrel határoztuk meg. A vizsgálatokat

Agilent 1100 HPLC-készüléken, fluoreszcens detektálás mellett végeztük. Az

elválasztást Poroshell 120 EC-C18 oszlopon (150 x 4,1 mm; szemcseméret: 2,7 μm)

végeztük (előtétoszlop: TR-C-160-K1, ABLE&Jasco), 0,4 ml/perc áramlási sebesség

mellett. Az injektált térfogat 10 μl volt. Az izokratikus elválasztáshoz használt eluens

összetétele: 15% metanol és 85% 25 mM foszfát-puffer (pH 6,0). A fluoreszcens jel

intenzitásának detektálásakor az excitációs hullámhossz 350 nm, az emissziós

hullámhossz 420 nm volt. Az adatok gyűjtését és a kromatogramok értékelését Agilent

ChemStation (Rev. A. 10. 02) szoftver segítségével végeztük.

A kezeletlen és kalkonokkal kezelt minták glutation-koncentrációjának

meghatározása a standard sorozat mintáinak meghatározása során felvett kalibrációs

egyenesek segítségével történt. (GSH-standard: y(csúcs alattti terület) = 7,298x + 60,69

(μM) (r2 = 0,989); GSSG-standard: y(csúcs alattti terület) = 297,96x + 21,28 (μM) (r

2 =

0,995))

A meghatározott redukált és oxidált glutation-szinteket a minták

fehérjemennyiségére vonatkoztattuk. Minden étrék öt párhuzamos mérésből származó

átlag ± szórás. A statisztikai értékelés a Student-t teszt (p < 0,05) használatával történt.

33

Annak vizsgálatára, hogy a NEM valóban megvédi-e a GSH-t az oxidációtól, a

redukált glutation standard oldatát, a NEM-es reakciót követően, a GSSG-szint

meghatározásához használt módszer szerint derivatizáltuk és vizsgáltuk a

kromatográfiás rendszerben.

IV.2.7. A kalkonszármazékok glutationnal való reaktivitásának

vizsgálata

IV.2.7.1. A kalkon-glutation reakció vizsgálata sejtmentes körülmények

között

A vizsgált kalkonszármazékok és redukált glutation (GSH) között esetlegesen

lejátszódó spontán reakciót vizsgáltuk.

A glutation 0,01M foszfát-pufferrel (pH = 5,5; pH = 7,4 és pH = 9,0) készült

oldatát ugyanakkora mennyiségű 4a és 4b frissen készült metanolos oldatával

elegyítettük. A GSH és kalkonok végkoncentrációja 5 x 10-3

M volt. A reakcióelegyeket

37 °C, illetve 50 °C-os vízfürdőben inkubáltuk és a reakcióelegy összetételét 1 és 3 órát

követően vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) módszerrel vizsgáltuk.

A TLC-futtatáshoz Kieselgel F254 (Merck, Germany) lapokat használtunk

állófázisként. A kifejlesztő elegy összetétele: n-butanol : ecetsav : víz (40 : 10 : 20,

v/v%). A kromatogram előhívása egyrészt UV-fényben (λ = 254 nm) történt, majd

ninhidrin-előhívó oldattal történő bepermetezés révén.

Az kalkon-GSH inkubátumok, valamint a tiszta 4a, 4b és GSH-oldatok VRK

futtatásakor kapott foltok Rf értékei a következők: GSH: Rf = 0 (UV negatív, ninhidrin

pozitív), 4a: Rf = 0,95 (UV pozitív, ninhidrin negatív), „4a-GSH konjugátum”: Rf = 0,42

(UV pozitív, ninhidrin pozitív), 4b: Rf = 0,96 (UV pozitív, ninhidrin negatív), „4b-GSH

konjugátum”: Rf = 0,46 (UV pozitív, ninhidrin pozitív).

IV.2.7.2. A kalkon-glutation reakció vizsgálata Jurkat T sejtekben HPLC-

MS módszerrel

A Jurkat T sejtekben esetlegesen lejátszódó kalkon-glutation konjugációs reakció

vizsgálata céljából a PTE ÁOK Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézetével kooperációban

HPLC-MS módszert dolgoztunk ki.

34

A Jurkat T sejteket (2 x 106 db sejt / 5,0 ml tápoldat) a 4a (5,6 μM), illetve 4b

(23,3 μM) vegyületekkel a protokoll (IV.2.2) szerint 4 órán inkubáltuk. A kezelést és

centrifugálását (1000g, 5 perc) követően a sejteket kétszer mostuk 0,9%-os NaCl-

oldatban, majd 600 μl TRIS-pufferben (50 mM Trisz-HCl; 0,1% SDS; pH 7,4) vettük

fel. A sejtlízist ultrahangos szonikáció (3 perc) mellett végeztük. A sejtlizátumokat

centrifugáltuk (13 000g, 5 perc), a tiszta felülúszót és az üledéket -80 °C-on tároltuk a

további vizsgálatokig.

A sejtes üledék feltárását nagy energiájú ultraszonikátorban (UIS250V) (6 x 10

másodperc) végeztük, jeges hűtést alkalmazva a ciklusok között. A mintákat vortexeltük

és centrifugáltuk (10 000g, 10 perc).

A minták fehérjementesítéséhez a felülúszókat és a feltárt üledékeket centrifugális

szűrőbe (Amicon Ultra with 10K „cut off” membrane, Merck-Millipore, Germany)

tettük, és centrifugáltuk (10 000g, 30 perc). A filtrátumok fehérjetartalmát ellenőriztük,

és amennyiben fehérjét találtunk a mintában, a szűrést új szűrőn ismételtük. A

fehérjementes mintákhoz 0,1% hangyasavat adtunk a HPLC-MS vizsgálatokhoz.

A vizsgálatokat Ultimate 3000 (Dionex, Sunyvale, USA) mikro HPLC-készüléken

és Bruker micro-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) tömegspektrométeren

végeztük. A készülékek ellenőrzése Hystar 3.2 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)

és Bruker micro-TOF control 1.3 szoftverekkel történt. Az adatok gyűjtését és a

spektrumok értékelését Brucker Data analysis 4.1 szoftver segítségével végeztük. Az

elválasztást Kinetex C-18 oszlopon (150 x 2,1 mm; szemcseméret: 2,6 μm)

(Phenomenex, Torrance, USA) végeztük, 0,2 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az

injektált térfogat 1 μl volt.

A grádiens elválasztáshoz „A” eluenst (99,9% metanol + 0,1% trifluorecetsav) és

„B” eluenst (99,9% víz + 0,1% trifluorecetsav) használtunk. A grádiens-profil a

következő volt: 0-5 percig 40% „A” eluens + 60% „B” eluens; 5-15 percig lineáris

grádiens 40% → 90% „A” eluens + 60% → 10% „B” eluens; 15-20 percig 90% „A”

eluens + 10% „B” eluens.

A tömegspektrometrás mérés elektrospray-ionizáció (ESI) mellett történt. ESI

pozitív ionizációs módot, N2 ütközőgázt (áramlás: 8 dm3/perc, 201 °C) használtunk 3,8

kV véglemez potenciál mellett. Porlasztógáz nyomása 20 psi. A spektrumokat 50 –

2.000 tömeg/töltés (m/z) tartományban értékeltük.

35

V. Eredmények és következtetések

V.1. Kalkonanalógok lipofilitásának jellemzése

A lipofilitás a biológiailag aktív molekulák egyik legfontosabb, és igen régóta

használatos fizikai-kémiai paramétere, amely, mint anyagi tulajdonság, a vegyületek

apoláris (lipofil) környezethez való affinitását jellemzi. A lipofilitás az a tulajdonság,

amely nagyban befolyásolja egy vegyület felszívódását, eloszlását, fehérjekötődését,

kiürülését, másrészt a receptorral való kölcsönhatását is, tehát jelentős mértékben

meghatározza egy molekula sorsát a szervezetben. Mindezek alapján a

gyógyszertervezés kiemelt paramétere is, hiszen változtatásával befolyásolhatók az

ADME tulajdonságok. (97; 98) Egy molekula lipofilitását számszerű adatokkal

jellemezhetjük, aminek kialakításában azok a kölcsönhatások játszanak szerepet,

amelyek a szervezetben is létrejönnek a molekula és környezete között.

Egy megoszlási folyamat során a vegyület megoszlik két egymással nem

elegyedő, de bőségesen érintkező oldószer között. Az anyag megoszlási hányadosán a

két egymással nem elegyedő oldószerben mért aktivitásának (híg oldatok esetén a

koncentrációknak) az arányát értjük, mely adott hőmérsékleten és nyomáson az

egyensúlyi állapot elérése után konstans érték.

A lipofilitás általános jellemzésére választott oktanol/víz oldószer-rendszerre

vonatkozó megoszlási hányadost P betűvel jelöljük, leginkább ennek logaritmusát

alkalmazzuk (logP).

A lipofilitás meghatározására jelenleg a leggyakrabban alkalmazott eljárások az

indirekt, másnéven alternatív meghatározási módszerek. (79; 99) Az indirekt eljárások

előnye, hogy az igen nagy és nagyon kis lipofiltású vegyületek is mérhetők, a

módszerek gyorsak és egyszerűek, ami nagyon fontos szempont a gyógyszerkutatás

korai fázisában.

A kromatográfiás vizsgálatoknál alapvető olyan kromatográfiás rendszer

felállítása, ahol a vegyületek retenciója nagy pontossággal megállapítható, ugyanakkor

az adott kromatográfiás állófázissal minél hitelesebben lehessen karakterizálni a

membrán kettősréteget. (100)

A logP meghatározás elvi alapját a folyadék/folyadék megoszláson alapuló

kromatográfiás retenció és a megoszlási hányados között fennálló összefüggés adja

meg. A módszer lényege, hogy az eljárás során a lipofilitástól függő kromatográfiás

36

paramétert (a retenciós faktorral közvetlenül összefüggésben álló ún. RM értéket: RM =

log(1/Rf – 1)) határozzuk meg, majd kalibrációs egyenes felhasználásával logP értéket

számolunk (logP = aRM + b).

A kromatográfiás logP meghatározás lényege tehát, hogy egy kiválasztott

standard anyagsorozat esetén, melynek oktanol/víz logP értéke ismert, meg kell

határozni az aktuális kromatográfiás rendszerben érvényes RM értékeket, amely

értékeket felhasználva a fenti egyenlet állandói megismerhetők. Ennek alapján egyéb

vegyületek logP értéke számítható.

Vizsgálatainkhoz, standard sorozatként, az ismert logP értékekkel rendelkező

pirido[1,2-a]pirimidin-származékokat (3. táblázat) használtunk. Bár a vegyületek

kémiai szerkezete különbözik a kalkonok szerkezetétől, fizikai-kémiai tulajdonságaik

nagyon hasonlóak: lipofilek és közel semlegesek (nagyon gyenge bázisok, és

alkalmazott RP-TLC kondíciók mellett deprotonált állapotban vannak (80)). A

kalibrációs sorozat tagjai vékonyréteg-kromatográfiás futtatásának eredményeképpen

kapott kalibrációs egyenes egyenlete:

logP = 4,007 RM + 1,373

(n = 6, r = 0,9935, s = 0,09, F = 304)

Az optimalizált kromatográfiás rendszer validálása három, ismert logP értékkel

rendelkező gyógyszermolekula (diazepám, progeszteron és PGEE) felhasználásával

történt. Az RP-TLC módszer során, a fenti kalibrációs egyenes segítségével

meghatározott logPTLC értékek közel megegyeznek a vegyületek rázótölcséres-

módszerrel meghatározott logPSF értékeivel (80). (4. táblázat)

Minta logPSF logPTLC ∆ logP

Diazepám 2,77 2,80 0,03

Progeszteron 3,54 3,42 0,12

PGEE 4,08 4,02 0,06

4. táblázat A logP meghatározás során használt validációs sorozat tagjainak

rázótölcséres módszerrel (logPSF), illetve RP-TLC módszerrel (logPTLC) történt logP

értékeinek összehasonlítása

37

A validálás során használt három vegyület logPTLC értékeivel kibővítettük a

kalibrációs sorozatot, így a következő kalibrációs egyenes egyenletet kaptuk, amit a

kalkonanalógok logP értékének számolásához használtunk fel.

logP = 4,115 RM + 1,362

(n = 9, r = 0,9973, s = 0,08, F = 1316)

A vizsgált (illetve korábban vizsgált) kalkonszármazékok kísérletes úton

meghatározott logPTLC értékeit az 5. táblázat tartalmazza. (101)

A vegyületek igen lipofilek, logP értékük viszonylag széles tartományba (logP =

2,53 - 5,35) esik, a gyűrű tagszámának valamint a szubsztituens minőségének,

jellegének és helyzetének függvényében. Mivel a lipofilitásbeli különbség minden

bizonnyal a biológiai hatás kialakulásában is szerepet játszik, meghatározása már a

gyógyszertervezés korai szakaszában igen fontos.

A gyűrűtagszám lipofilitást befolyásoló hatását a para-helyzetben szubsztituált

kalkonanalógok kísérletesen meghatározott logP értékeinek összehasonlítása révén

figyelhetjük meg. (6. táblázat) A gyűrű tagszámának növekedése a ciklikus

kalkonanalógok lipofilitásának növekedésével jár. Egy további metiléncsoport

beépülése a gyűrűbe átlagosan 0,4 egységgel növelte meg a logPTLC értéket. Az 1 és 2

sorozat tagjai, valamint a 3 és 4 sorozat tagjai közötti lipofilitásbeli különbség kisebb,

mint a 2 és 3 sorozat tagjai között. Mindezek arra utalnak, hogy az intra- és

intermolekuláris interakciók, valamint a térszerkezet is befolyással vannak a

lipofilitásra.

A 6. táblázat a kísérletes úton meghatározott logPTLC értékeken kívül, számolás

útján prediktált logP értékeket is tartalmaz. A CLOGP szoftver segítségével számolt

logP egy ún. kalkulált partíciós koefficiens. A számítógépes program által használt

módszer a Hansch-Leo fragmens alapú számítás, ahol az alapmolekula és a hozzá

kapcsolódó fragmensek, szubsztituensek száma, pozíciója határozza meg a kalkulált

logP értéket. A mért és számolt értékek viszonylag jól korrelálnak egymással. Az öttagú

gyűrűs és hattagú gyűrűs dimetilamino-származék esetén azonban viszonylag nagy az

eltérés a két adat között, a mért logP értékek jóval magasabbak (4,50, illetve 4,91) mint

a számolt logP értékek (3,76, illetve 4,32). A többi esetben a differencia kisebb, mint

0,45. Míg a 2 sorozat tagjainak kísérleti úton meghatározott logP értéke minden esetben

38

nagyobb a nyílt láncú (1) analógokétól, addig a számolt értékek között gyakorlatilag

nincs különbség.

A szubsztituens minőségének vizsgálatakor megfigyelhető, hogy a para-

helyzetben szubsztituált származékok esetén a lipofilitás a következők szerint változik:

OH < CN < NO2 < H < F < OCH3 < CH3 < Cl < N(CH3)2 ≈ Br

Vegyület logPTLC Vegyület logPTLC Vegyület logPTLC

1 H 3,42 ± 0,05* 2 o-Cl 4,28 ± 0,09 3 m-NO2 3,99 ± 0,02

1 p-N(CH3)2 4,23 ± 0,01* 2 m-Br 5,15 ± 0,04 3 o-NO2 4,06 ± 0,07

1 p-OCH3 3,67 ± 0,05* 2 o-Br 4,36 ± 0,08 3 p-CN 3,48 ± 0,12*

1 m-OCH3 3,80 ± 0,04* 2 o-NO2 4,32 ± 0,05

1 o-OCH3 3,99 ± 0,05* 2 p-CN 3,13 ± 0,07* 4 H 4,48 ± 0,05*

1 p-CH3 4,12 ± 0,04 4 p-N(CH3)2 5,26 ± 0,04*

1 p-F 3,65 ± 0,02 3 H 4,14 ± 0,04* 4 p-OCH3 4,72 ± 0,05*

1 p-Cl 4,11 ± 0,01 3 p-N(CH3)2 4,91 ± 0,03* 4 m-OCH3 4,79 ± 0,09*

1 p-Br 4,23 ± 0,03 3 p-OH 2,96 ± 0,06* 4 o-OCH3 4,69 ± 0,09*

1 p-CN 2,93 ± 0,04* 3 p-OCH3 4,32 ± 0,07* 4 p-CH3 5,10 ± 0,09*

3 m-OCH3 4,42 ± 0,04* 4 m-CH3 4,98 ± 0,01*

2 H 3,63 ± 0,06* 3 o-OCH3 4,43 ± 0,04* 4 o-CH3 4,92 ± 0,11*

2 p-N(CH3)2 4,50 ± 0,07* 3 p-CH3 4,76 ± 0,09 4 p-F 4,45 ± 0,04*

2 p-OH 2,53 ± 0,06* 3 m-CH3 4,70 ± 0,07 4 m-F 4,60 ± 0,02*

2 p-OCH3 3,91 ± 0,04* 3 o-CH3 4,56 ± 0,07 4 o-F 4,55 ± 0,06*

2 m-OCH3 3,97 ± 0,09* 3 p-F 4,14 ± 0,04 4 p-Cl 5,10 ± 0,10*

2 o-OCH3 4,01 ± 0,05* 3 m-F 4,35 ± 0,05 4 m-Cl 5,22 ± 0,02*

2 p-CH3 4,30 ± 0,02 3 o-F 4,42 ± 0,05 4 o-Cl 5,04 ± 0,04*

2 m-CH3 4,34 ± 0,05 3 p-Cl 4,58 ± 0,03 4 p-Br 5,22 ± 0,02*

2 o-CH3 4,12 ± 0,02 3 m-Cl 4,82 ± 0,04 4 m-Br 5,35 ± 0,12*

2 p-F 3,75 ± 0,04 3 o-Cl 4,60 ± 0,08 4 o-Br 5,04 ± 0,02*

2 m-F 4,82 ± 0,03 3 p-Br 4,68 ± 0,04 4 p-NO2 4,15 ± 0,08*

2 o-F 3,90 ± 0,08 3 m-Br 4,88 ± 0,06 4 m-NO2 4,32 ± 0,02*

2 m-Cl 4,38 ± 0,04 3 o-Br 4,61 ± 0,08 4 o-NO2 4,07 ± 0,07*

4 p-CN 3,72 ± 0,03*

5. táblázat Az 1-4 sorozat tagjainak kísérleti úton meghatározott logPTLC értékei. Az

eredmények három párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók.

A *-al jelölt értékek korábbi, nem saját mérések eredményei. (80)

39

p-X logPTLC(logPCLOGP)

1 2 3 4*

H 3,42 (3,62) 3,63 (3,60) 4,14 (4,16) 4,48 (4,72)

N(CH3)2 4,23 (3,79) 4,50 (3,76) 4,91 (4,32) 5,26 (4,88)

OCH3 3,67 (3,54) 3,91 (3,52) 4,32 (4,08) 4,72 (4,64)

CH3 4,12 (4,12) 4,30 (4,10) 4,76 (4,66) 5,10 (5,22)

F 3,65 (3,77) 3,75 (3,74) 4,14 (4,30) 4,45 (4,86)

Cl 4,11 (4,34) N.A. (4,31) 4,58 (4,87) 5,10 (5,43)

Br 4,23 (4,49) N.A. (4,46) 4,68 (5,02) 5,22 (5,58)

CN 2,93 (3,06) 3,13 (3,03) 3,48 (3,59) 3,72 (4,15)

6. táblázat Az 1-4 sorozat para-helyzetben szubsztituált származékainak kísérletes úton

meghatározott (logPTLC), valamint prediktált (logPCLOGP) logP értékeinek

összehasonlítása. A logPCLOGP értékek számolása Chem3D Ultra 9.0.1. szoftver csomag

CLOGP alkalmazásával történt. A *-al jelölt sorozat logP értékeinek meghatározása

korábban történt. (80) (N.A. = nincs adat)

A szubsztituenseknek nemcsak a minősége, hanem a helyzete is befolyásolja a

logP értékeket. (7. táblázat)

A 7-tagú gyűrűs benzoszuberon származékok (4) esetén megállapítható, hogy

adott szubsztituenst orto-, meta-, illetve para-helyzetben taralmazó vegyületek logP

értéke a következők szerint változik: logPTLC(orto) ≤ logPTLC(para) ≤ logPTLC(meta). A

2 és 3 sorozat tagjainál azonban a különböző helyzetben szubsztituált analógok logPTLC

értékeiben nem figyelhető meg hasonló szabályszerűség. Ez a megfigyelés szintén arra

utal, hogy a tér- és elektronszerkezet, amit a szubsztituensek minősége és helyzete is

nagyban befolyásol, jelentős hatással van a molekulák lipofilitására. (80; 101; 67; 68)

A kidolgozott módszer lehetőséget teremt a nagy lipofilitással bíró

kalkonanalógok logP értékeinek pontos meghatározására. A kísérleti eredmények, a

várakozásoknak megfelelően, igazolták a vegyületek lipofilitásának változását a gyűrű

tagszámának, valamint a szubsztituensek minőségének és helyzetének függvényében.

Mindezek segítséget nyújthatnak a kalkon-molekulaelemmel rendelkező, esetleges

gyógyszerjelölt molekula optimális fizikai-kémiai tulajdonságainak megtervezésében.

40

Vegyület logPTLC

orto meta para

2 OCH3 4,01 3,97 3,91

2 CH3 4,12 4,34 4,30

2 F 3,90 4,82 3,75

2 Cl 4,28 4,38 N.A.

2 Br 4,36 5,15 N.A.

3 OCH3 4,43 4,42 4,32

3 CH3 4,56 4,70 4,76

3 F 4,42 4,35 4,14

3 Cl 4,60 4,82 4,58

3 Br 4,61 4,88 4,68

3 NO2 4,06 3,99 N.A.

4 OCH3 4,69 4,79 4,72

4 CH3 4,92 4,98 5,10

4 F 4,55 4,60 4,45

4 Cl 5,04 5,22 5,10

4 Br 5,04 5,35 5,22

4 NO2 4,07 4,32 4,15

7. táblázat A szubsztituensek helyzetének hatása a 2-4 sorozat vegyületeinek kísérletes

úton meghatározott logP értékeire. A 4 sorozat tagjainak logP meghatározása korábban

történt. (80) (N.A. = nincs adat)

41

V.2. Gyűrűs kalkonszármazékok hatás-vizsgálatának eredményei

A korábbi in vitro toxicitásvizsgálatok során kiemelkedő hatást mutató 7-tagú gyűrűs

(E)-2-(4-metoxibenzilidén)-1-benzoszuberont (4a) és kevéssé toxikus 4-

metilszubsztituált analógját (4b) (12. ábra) választottuk a tervezett vizsgálatok

elvégzéséhez, a gyűrűs kalkonszármazékok citotoxikus és daganatellenes hatásának

kialakulásában szerepet játszó mechanizmusok alaposabb megismerése céljából.

V.2.1. Az (E)-2-(4-metoxibenzilidén)-1-benzoszuberon és

4-metilanalógjának sejtproliferációra és sejtciklusra gyakorolt

hatása

V.2.1.1. A kalkonanalógok apoptózist indukálnak Jurkat T sejtekben

Korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a humán Jurkat T sejtek érzékenyebbek egy új

α,β-telítetlen ketonra, mint más tumorsejtvonalak, így munkánkhoz Jurkat T sejteket

használtunk. (102)

A kalkonszármazékok Jurkat T sejtek sejtproliferációjára gyakorolt hatásának

megismeréséhez elsőként a teljes sejtszám, valamint az élő sejtek arányának az

alakulását vizsgáltuk a vegyületekkel történő kezelést követően. A 4a és 4b

vegyületekkel – a Jurkat T sejtekkel szemben korábban meghatározott IC80

koncentrációértékek (4a: 5,6 μM; 4b: 23,3 μM) (64) mellett – történő 8, 24 illetve 48

órás kezelést követően a teljes sejtszámot (8. táblázat), illetve ebből az élő sejtek

arányát (13. ábra) a sejtek tripánkékkel történő festését követően, hemocitométerrel

határoztuk meg. (82)

A tripánkék festék csak az elpusztult sejtek citoplazmájába képes behatolni és

citoplazmás fehérjékhez kötődni, mivel az élő sejtek membránja nem ereszti át a

festéket, így megkülönböztethetők egymástól az élő és elpusztult sejtek.

A 8. táblázatból kiolvasható, hogy a kezeletlen sejtek, valamint az 1% DMSO-t

tartalmazó inkubátumban levő sejtek száma 24 óra alatt megkétszereződik, ami

megfelel a Jurkat T sejtek duplikációs idejének. (103) (A következő 24 óra alatt már

térbeli korlátok miatt nem tud újra osztódni.) A kalkonok oldószereként használt DMSO

tehát ekkora mennyiségben (1%), önmagában nem befolyásolja a sejtszámot. A két

42

vizsgált vegyület egymáshoz hasonló módon csökkenti a sejtek számát a 8, 24 és 48

órás időpontokban, gátló hatásuk a sejtek proliferációjára kifejezett.

Teljes sejtszám (x 105)

8 óra 24 óra 48 óra

Kontroll 5,45 ± 0,66 11,26 ± 1,67 11,07 ± 1,01

DMSO 1% 5,01 ± 0,74 10,53 ± 1,72 11,85 ± 2,44

4a (5,6 μM) 4,88 ± 0,68 8,68 ± 0,98 5,33 ± 0,83

4b (23,3 μM) 4,69 ± 0,52 7,91 ± 0,78 7,00 ± 0,76

8. táblázat 4a és 4b vegyületekkel történő sejtkezeléseket követően a teljes sejtszám

alakulása. A meghatározás tripánkékkel történő festéssel történt. Az eredmények négy

párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók.

Az életképes sejtek aránya a kontroll sejtekhez képest mindkét kalkonanalóg

esetén hasonlóan alakul. (13. ábra) 8 órás inkubációs időt követően az élő sejtek

mennyisége még közel annyi, mint a kezeletlen sejtek esetében, de 24 órás, illetve 48

órás inkubációs idő után már csaknem felére csökken a számuk. Nagy valószínűség

szerint már a 8 órás kezelési időtartam alatt is lejátszódnak olyan folyamatok, amelyek

hatással lesznek a sejtproliferáció további alakulására.

13. ábra A 4a és 4b vegyületek hatása a Jurkat T sejtek életképességére. Az élő sejtek

arányának meghatározása a kezelést követően tripánkékkel történő festési eljárással

történt. Az eredmények négy párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában

láthatók.

43

A 4a és 4b vegyületek citotoxikus hatásának további vizsgálata céljából

meghatároztuk a vegyületekkel történő 8, 24 és 48 órás kezelési időtartamokat követően

az inkubátumokban levő élő, korai apototikus fázisban levő, és apoptózis (és/vagy

nekrózis) során elpusztult sejtek mennyiségét.

A sejteken minden időpontban kettős jelölést hajtottunk végre, fluoreszcein-

izotiocianáttal (FITC)-kötött annexin V-t és propídium-jodidot használva, majd áramlási

citometriai módszerrel mértük a két festék fluoreszcencia-intenzitását.

Az élő, ép sejtek nem jelölődnek. Az apoptózis korai szakaszában azonban

megszűnik a sejtmembrán foszfolipid-aszimmetriája, azáltal, hogy a belső foszfolipid

rétegből a külsőbe kerül a negatív töltésű foszfatidilszerin, amihez nagy affinitással

kötődik az annexin V. Ebben a stádiumban a sejtmembrán még átjárhatatlan PI számára.

Ugyanakkor az elpusztult vagy sérült sejtek membránján keresztül a PI már bejut a

sejtekbe, és a kettős szálú DNS-hez kötődik. Így ez a két anyag együttesen alkalmas az

apoptózis korai, illetve késői fázisában levő sejtek elkülönítésére. (84; 85)

Az áramlási citometriai mérés során a kezeletlen kontroll sejtek esetén beállított

kvadráns statisztikai paramétereket használtuk a kalkonokkal kezelt sejtek

vizsgálatához. (14. ábra)

14. ábra A kontroll, valamint 4a és 4b vegyületekkel kezelt (8 órás kezelés) sejtek

áramlási citometriai vizsgálata a sejtek kettős jelölését (annexin V(FITC) + PI)

követően. Az FL-1/FL-2 csatornákon mérhető fluoreszcencia intenzitás alapján

megkülönböztethetünk élő sejteket (annexin V-negatív + PI-negatív), korai apoptotikus

fázisban levő sejteket (annexin V-pozitív + PI-negatív) és apototikus (vagy nekrotikus,

azaz elpusztult) sejteket (annexin V-pozitív + PI-pozitív).

44

A citotoxicitás vizsgálat eredményeit a 9. táblázat tartalmazza. 8 órás kezelés

alatt sem a 4a, sem a 4b vegyület nem mutat kifejezett toxikus hatást. 24 órás kezelési

időtartam után azonban az élő sejtek száma sokkal kisebb a metoxiszármazék (4a)

esetén (57,7%), mint a 4b vegyülettel történő kezelést követően (71,7%). A sejtek

jelentős része korai apoptotikus fázisban (4a: 22,8%; 4b: 7,8%), illetve késői

apoptotikus/nekrotikus fázisban van (4a: 16,8%; 4b: 17,1%).

Élő sejtek (%)

Korai

apoptotikus

sejtek (%)

Elpusztult

sejtek (%)

8 óra

Kontroll 90,33 ± 3,50 2,15 ± 1,07 3,98 ± 1,53

DMSO 1% 89,53 ± 5,60 2,67 ± 0,17 6,16 ± 2,68

4a (5,6 μM) 84,31 ± 4,24 3,15 ± 0,45 8,66 ± 2,15

4b (23,3 μM) 84,15 ± 0,52 2,81 ± 0,09 8,09 ± 0,11

24 óra

Kontroll 89,37 ± 4,08 4,40 ± 3,07 4,24 ± 0,71

DMSO 1% 88,43 ± 5,72 3,17 ± 2,32 5,71 ± 2,49

4a (5,6 μM) 57,65 ± 5,52 22,80 ± 1,55 16,82 ± 3,39

4b (23,3 μM) 72,71 ± 6,59 7,81 ± 0,98 17,11 ± 6,35

48 óra

Kontroll 90,27 ± 0,37 N.A. 9,70 ± 0,35

DMSO 1% 85,56 ± 1,26 N.A. 14,43 ± 1,24

4a (5,6 μM) 40,15 ± 1,39 N.A. 59,79 ± 1,39

4b (23,3 μM) 48,53 ± 3,18 N.A. 51,44 ± 3,18

9. táblázat 4a és 4b vegyületekkel történő 8, 24 és 48 órás sejtkezeléseket, és

annexinV(-FITC)/propídium jodiddal történő kettős jelölést követő áramlási citometriai

módszer eredményei: az élő, korai apoptotikus fázisban levő, valamint elpusztult sejtek

mennyisége %-ban kifejezve. Az eredmények négy párhuzamos mérésből képezett

átlag ± szórás formában láthatók. (N.A.=nincs adat, 48 órás kezelést követően csak

propídium-jodiddal történt jelölés)

48 órás kezelést követően csak propídium-jodidot használtunk az élő (PI-negatív)

és a késői apoptotikus/nekrotikus fázisban levő (PI-pozitív) sejtek mennyiségének

meghatározására. Ebben az időpontban az élő sejtek száma jelentősen lecsökken, a 4a

vegyület esetén 40,2%-ra, a 4b analóg esetén pedig 48,5%-ra. (9. táblázat)

45

Az eredményekből kiolvasható, hogy a vizsgált kalkonszármazékok, ezen

koncentrációértékek mellett, gátolják a sejtszaporodást, és apoptózist indukálnak. (104)

A fenti módszerekkel kapott 48 órás citotoxicitás vizsgálat eredményei

valamelyest különböznek a 4a és 4b vegyületekkel történt, nigrozin festés mellett

értékelt korábbi vizsgálatok eredményétől. (64) A két különböző festési módszerrel

kapott eltérő eredmény a tripánkék-festés relatív érzéketlenségének lehet a

következménye, ami a festék makromolekuláris szerkezetéből adódik. (105) Másrészt,

az áramlási citometriai módszerrel történt citotoxicitás vizsgálat eltérő eredménye a két

különböző eljárás és értékelési módszer következménye lehet. (106) A 48 órás

eredményeket illetően, az alkalmazott eljárásoktól függetlenül látszódik az, hogy a két

koncentrációérték (4a: 5,6 μM 4b: 23,3 μM) közel ekvitoxikus dózist képvisel.

V.2.1.2. A vizsgált származékok eltérő módon befolyásolják a sejtciklust

A kísérletekbe bevont kalkonanalógok Jurkat T sejtek sejtciklusára gyakorolt hatásának

vizsgálata a vegyületekkel történt kezeléseket (IV.2.2) követően, a DNS mennyiségi

analízise által valósult meg. A Jurkat T sejtek kezelése során különböző: 8, 24 és 48

órás időpontokban vizsgáltuk a sejteket, hogy időben is láthassuk a kalkonok

sejtciklusra gyakorolt hatását.

A DNS mennyiségi analíziséhez a sejtek jelölése minden időpontban propídium-

jodiddal (PI) történt. A PI a sejtekben a kettősszálú DNS-hez kötődik, ezért a megkötött

PI mennyisége, így az áramlási citometriai eljárás során látható fluoreszcens jel

erőssége is arányos a sejtek DNS-mennyiségével. (A kísérletben használt RNAse enzim

a kettős szálú RNS-t bontja, így a PI ahhoz nem tud kötődni, és nem torzítja el az

eredményt.)

A sejtciklus egyes fázisaiban levő sejtek egymástól való megkülönböztetetése a

kezeletlen kontroll sejtek esetén felvett ábra alapján történt, az ott meghatározott

„sávok” kerültek meghatározásra minden vizsgált vegyület és időpont esetén. (107) (15.

ábra)

A 4a és 4b vegyületek sejtciklusra gyakorolt hatásában eltérések mutatkoznak,

különösen drasztikus a változás a metoxiszubsztituált (4a) származék esetén. A

sejtciklus vizsgálat eredményeit, az egyes fázisokban levő sejtek mennyiségét, %-ban

kifejezve az 10. táblázat, valamint a 16. ábra foglalja össze.

46

15. ábra Áramlási citometriai sejtciklus-analízis a kezeletlen kontroll sejteken (8 óra),

valamint a 4a és 4b vegyületekkel történő 8, 24 és 48 órás kezelést követően. A

sejtciklus egyes szakaszainak kijelölése a kontroll sejtek ábráján történt.

A 4a vegyület korai hatása (8 óra) abban nyilvánul meg, hogy megnöveli a G2/M

fázisban levő sejtek arányát (36,9%), ami együtt jár a G0/G1 fázisban levő sejtek

mennyiségének csökkenésével (18,6%). A metilszármazék esetén (4b) a sejtek

legnagyobb hányada, a kontroll sejtekhez hasonlóan, a G0/G1 fázisban található (36,8%).

47

Sub-G0

fázis (%)

G0 / G1 fázis

(%)

S fázis

(%)

G2 / M fázis

(%)

Poliploid

sejtek (%)

8 óra

Kontroll 3,3 ± 0,7 42,6 ± 0,9 21,2 ± 3,9 27,2 ± 0,9 5,6 ± 1,0

DMSO 1% 3,1 ± 0,3 40,8 ± 1,4 20,7 ± 3,0 26,6 ± 1,7 7,6 ± 1,3

4a (5,6 μM) 6,4 ± 0,9 18,6 ± 2,2 24,7 ± 1,0 36,9 ± 0,9 9,9 ± 2,7

4b (23,3 μM) 3,8 ± 0,4 36,8 ± 2,3 22,8 ± 3,3 25,1 ± 3,2 8,4 ± 1,1

24 óra

Kontroll 5,0 ± 1,5 44,7 ± 3,2 25,8 ± 0,5 22,7 ± 1,8 3,6 ± 0,9

DMSO 1% 5,5 ± 2,2 43,6 ± 2,6 21,1 ± 2,1 20,3 ± 1,1 4,9 ± 0,7

4a (5,6 μM) 22,4 ± 1,1 7,3 ± 0,4 9,6 ± 1,2 44,8 ± 4,9 16,2 ± 2,7

4b (23,3 μM) 14,5 ± 2,5 31,7 ± 2,5 17,3 ± 2,8 27,1 ± 2,2 8,5 ± 1,5

48 óra

Kontroll 6,4 ± 1,9 49,6 ± 2,7 21,0 ± 1,1 17,3 ± 1,5 5,2 ± 2,0

DMSO 1% 8,4 ± 1,8 51,5 ± 2,3 17,2 ± 2,0 19,0 ± 0,7 7,1 ± 2,6

4a (5,6 μM) 40,8 ± 2,2 8,5 ± 0,8 5,9 ± 2,3 8,3 ± 1,5 34,3 ± 6,5

4b (23,3 μM) 36,5 ± 2,4 24,4 ± 1,2 13,0 ± 2,4 13,9 ± 1,3 12,4 ± 2,9

10. táblázat Az áramlási citometriai módszerrel történt sejtciklus-analízis eredményei,

a 4a és 4b vegyületekkel történő 8, 24 és 48 órás kezelést és propídium-jodidos jelölést

követően. Az eredmények négy párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában

láthatók.

Hosszabb, 24 órás inkubációs időt követően a 4a vegyület hatására tovább

csökken a G0/G1 fázisban levő sejtek mennyisége (7,3%), és nő a G2/M fázisban

(44,8%), valamint a Sub-G0 (apoptotikus/nekrotikus sejtek) fázisban (22,4%) levő

sejtek aránya. Ebben az időpontban (24 óra), a 4b származékkal kezelt sejtek esetén

mérsékelt csökkenés következik be a G0/G1 fázisban levő sejtek mennyiségében

(31,7%), ami együtt jár a G2/M fázisban (27,1%), illetve a Sub-G0 fázisban (14,5%)

levő sejtek arányának kismértékű növekedésével. A 4a és 4b vegyületek eltérő hatása a

(G2/M)/(G0/G1) aránnyal is kifejezhető, ami 0,51 a kontroll, 6,1 a metoxi- (4a), és 0,85 a

metilszármazék (4b) esetén.

48 órás kezelést követően mindkét kalkonanalóg esetén további növekedés

tapasztalható a Sub-G0 fázisban, vagyis jelentősen megnő az apoptotikus/nekrotikus

sejtek aránya (4a: 40,8%; 4b: 36,5%), valamint ún. poliploid sejtek kialakulása

figyelhető meg.

48

16. ábra A kontroll, az 1%-ban DMSO-t tartalmazó, valamint a 4a és 4b vegyületekkel

történő 8, 24 és 48 órás kezelést és propídium-jodidos jelölést követő sejtciklus-analízis

eredményei - a sejtciklus egyes fázisaiban levő sejtek százalékos mennyisége szerint

ábrázolva. Az eredmények négy párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában

láthatók.

49

A sejtciklus-vizsgálat eredményeit összefoglalva elmondható, hogy a kalkonok

oldószereként használt DMSO, az alkalmazott 1%-ban nem befolyásolja a sejtciklust, a

két vizsgált vegyület hatása jelentős, de egymástól eltérő. (104) Míg a metilszármazék

(4b) esetén, a 8 órás kezelést követően a sejtek legnagyobb hányada – a kontroll

sejtekhez hasonlóan – a G0/G1 fázisban található, addig a metoxiszubsztituált analóg

(4a) esetén a G2/M fázisban. Ez együtt jár a G0/G1 fázisban levő sejtek mennyiségének

csökkenésével, ugyanakkor a Sub-G0 fázisban levő apoptotikus/nekrotikus sejtek

arányának növekedésével is. (84; 85) Mivel a 8 órás időtartam körülbelül harmada egy

sejtciklus időtartamának Jurkat T sejtekben (103), a kísérleti eredmény arra utal, hogy a

4a vegyület esetén nem működik megfelelően a G1 ellenőrző pont, aminek egyébként

meghatározó szerepe van genetikai problémák kiküszöbölésében. (108) A G1

ellenőrzőpont által „visszatartott” sejtek ugyanis részben, apoptózis vagy nekrózis során

elpusztulnak, aminek fontos szerepe van a genom integritásának biztosításában. (109)

A vegyület tulajdonképpen felfüggeszti a G1 ellenőrzőpont „munkáját”. A 4a vegyület

G2/M fázisú blokkot is okoz. A sejtciklusban bekövetkező ilyen jellegű zavar, mint

egyes flavonoidok és kalkonok lehetséges hatásmechanizmusa, az irodalomban is

dokumentált. (110; 111; 112; 113) Az észlelt változások arra utalnak, hogy a

metoxiszármazék (4a) viszonylag gyorsan DNS károsodást okozhat, aminek gyakori

velejárója a G2/M fázisú blokk. (114; 115)

A metilvegyület (4b) ekvitoxikus dózisával történő sejtkezelés estén nem

figyelhető meg hasonlóan jelentős változás a G1 ellenőrzőpontot illetően, és a G2/M

blokk sem kifejezett.

A 4a származékkal történő hosszútávú (24 és 48 órás) expozíciót követően mind a

G0/G1, az S, valamint a G2/M fázisban levő sejtek mennyisége drasztikusan csökken.

Egyidejűleg nagymértékben megnő a Sub-G0 fázisban levő (apoptotikus/nekrotikus)

sejtek, valamint a poliploid sejtek mennyisége, ami a G2 ellenőrzőpont működési

zavarára utal. Az ilyen jellegű késleltetett sejthalál, amit „mitotikus halál”-nak is

neveznek, jellegzetessége a p53 mutáns tumoroknak. (116)

A poliploid populáció proliferációs potenciálja egyelőre vitatott. Vannak, akik azt

állítják, hogy a poliploid sejtek alacsony proliferatív potenciállal rendelkeznek, mások

szerint azonban – bár késleltetett a metafázis – proliferációra képesek. (116)

A vizsgált kalkonszármazékok csökkentik az élő sejtek számát, apoptózist

indukálnak, ami minden bizonnyal összefüggésbe hozható azzal a kísérleti

eredménnyel, hogy jelentős mértékben befolyásolják a sejtciklust, különösen a 4a

50

vegyület. Az apotózis számos anti-apoptotikus, valamint pro-apototikus modulátor által

irányított folyamat. Későbbi kutatások igazolták, hogy a 4a származék csökkenti a

Bcl-2 fehérje – az anti-apoptotikus proteinek egy típusának – expresszióját, ugyanakkor

megnöveli az apotózist elősegítő Bax protein szintézisét. (117) A Bax/Bcl-2 arány

növekedése nagyban hozzájárulhat az apoptózis indukciójához.

V.2.2. A kalkonszármazékok in vitro antioxidáns hatással bírnak

A 7-tagú gyűrűs 4-metoxi- (4a) és 4-metilszubsztituált (4b) kalkonanalógok in vitro

antioxidáns (hidroxilgyök scavanger), esetleges prooxidáns hatását, illetve annak

időfüggését, a Fenton-reakció inicializálta dezoxiribóz degradációs tesztet alkalmazva

vizsgáltuk. (86; 87)

A hidroxilgyök scavanger hatás in vitro jellemzésére számos módszer ismert az

irodalomban. Ezek egyike a Halliwell és mtsai által kidolgozott módszer, melynek

lényege, hogy a vas(II)-ionok és H2O2 reakciójában keletkező hidroxilgyökök a 2-

dezoxi-D-ribózt eloxidálják. A láncszakadással járó oxidáció eredményeképpen savas

közegben tiobarbitursavval 532 nm körüli abszorpciós maximummal rendelkező

karbonilvegyületek keletkeznek. (87) (17. ábra) Ha a vizsgálatot hidroxilgyök-

scavanger tulajdonságú vegyület jelenlétében végezzük, akkor kompetitív reakció

eredményeként az 532 nm körüli abszorpciós maximummal rendelkező fragmens

vegyületek mennyisége csökken. (87)

17. ábra A Fenton-reakció, illetve a dezoxiribóz degradációs teszt lényege

Kísérleteink során Winterbourn vizsgálatai alapján optimalizált dezoxiribóz teszt

összetételt alkalmaztuk. (118) Bár a reakció pontos mechanizmusa és a reakció során

keletkező vegyületek kémiai szerkezete teljességében nem ismert, az érzékeny és

könnyen kivitelezhető módszer széles körben alkalmazott a hidroxilgyök scavanger

tulajdonságú vegyületek in vitro antioxidáns hatásának vizsgálatára. A módszer, az

alkalmazott kísérleti körülmények között alkalmas az azonnali, illetve hosszútávú

51

antioxidáns, sőt pro-oxidáns aktivitás meghatározására. (119) A hosszútávú (240 perc)

vizsgálat során ugyanis a hidroxilgyökök hatására esetlegesen keletkező redox-aktív

metabolitok további redox-reakciókat indíthatnak el (ami a vas(III)-ionok vas(II)-

ionokká történő redukcióját is magába foglalja), és „újra” hidroxilgyökök

képződhetnek. (53)

A vizsgálatokat etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA) jelenlétében és EDTA

hozzáadása nélkül is elvégeztük. EDTA hozzáadása vas(II)-EDTA-komplex

kialakulását eredményezi (120), aminek Fenton-reakcióban való részvétele az EDTA

degradációjához vezethet. (121) EDTA hiányában a vas(II)-ionok egy része a

dezoxiribózzal képez komplexet. (122) Az ún. „hely-specifikus” Fenton-reakcióban a

hidroxilgyökök képződésük helyén azonnal elreagálnak. Tehát azok a vegyületek,

amelyek ligandként szerepelhetnek (jelen esetben az EDTA), versengenek a

dezoxiribózzal a vas(II)-ionokért, ezáltal csökken a vas(II)-ion katalizálta reakcióban

keletkező hidroxilgyök okozta degradáció.

A dezoxiribóz degradációs teszt eredményeit a 18.-19. ábra foglalja össze. A

kontroll inkubátumok esetén a keletkező TBA-reaktív anyagok mennyisége (a mért

abszorbancia) időben viszonylag állandónak mondható. Ahogy az a 18. ábraról

leolvasható, az EDTA-t nem tartalmazó rendszerben mindkét vizsgált kalkonszármazék

folyamatos antioxidáns, vagyis hidroxilgyök scavanger aktivitást mutat a 240 perces

kísérleti ídőtartam alatt. Bár a 4a vegyület antioxidáns kapacitása az inkubációs idő

120-adik perce körül minimumot mutat, az inkubációt folytatva a két vegyület hasonló

mértékben csökkentette a dezoxiribóz oxidációja során keletkező TBA-reaktív termékek

mennyiségét.

A 19. ábran láthatók az EDTA (36 μM) jelenlétében elvégzett kísérletek

eredményei. EDTA jelenlétében a reakció során keletkező TBA-reaktív termékek

mennyisége jelentősen kisebb (alacsonyabb a mért abszorbancia), mint EDTA nélkül. A

4a vegyület esetén a TBA-reaktív anyagok mennyisége megnő a 80-120 percig tartó

periódius alatt, majd jelentős csökkenésnek indul. Az észlelt prooxidáns hatás könnyebb

értelmezésének céljából a 120. percben vett inkubátum etilacetátos kivonatát GC-MS

mérésnek vetettük alá. A GC-MS analízis során azonban nem sikerült a 4a vegyület

valamely, az inkubáció során keletkező metabolitjának jelenlétét igazolni. Az észlelt

hatás hátterének megismeréséhez további vizsgálatok szükségesek. A metilszármazék

(4b) ezen kísérleti körülmények között is mindvégig antioxidáns aktivitást mutatott.

52

18. ábra A Fenton-reakció inicializálta dezoxiribóz degradációs teszt időbeli

függésének eredményei a kontroll inkubátumban, valamint 4a (200 μM) és 4b (200 μM)

jelenlétében, EDTA hozzáadása nélkül. Az abszorbancia mérése 532 nm-en történt. Az

eredmények három párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók.

19. ábra A Fenton-reakció inicializálta dezoxiribóz degradációs teszt időbeli

függésének eredményei a kontroll inkubátumban, valamint 4a (200 μM) és 4b (200 μM)

jelenlétében, 36 μM EDTA hozzáadása mellett. Az abszorbancia mérése 532 nm-en

történt. Az eredmények három párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában

láthatók.

A rákos sejtek folyamatosan, viszonylag nagy mennyiségben termelnek hidrogén-

peroxidot (H2O2). (123) A hidrogén-peroxid és vas-, illetve réz-ionok reakciója során

(általánosságban a Fenton-reakció során (124)) folyamatosan hidroxilgyökök is

termelődnek. Az aromás vegyületek reakcióba léphetnek a keletkező gyökökkel,

53

miközben hidroxilszubsztituált származékok keletkezhetnek. (52) A fenolos

metabolitok további oxidációja során reaktív oxigéngyökök keletkezhetnek, és az

eredetileg antioxidáns hatású aromás vegyületek – számos, spontán vagy

enzimkatalizált reakció eredményeként – akár oxidatív stresszt is okozhatnak. (53; 125)

Ezek ismeretében vizsgáltuk a két kalkonszármazék in vitro antioxidáns, illetve

esetleges prooxidáns hatását. A Fenton-reakció inicializálta dezoxiribóz degradációs

teszt eredményeként azt láthatjuk, hogy a vizsgált vegyületek rövidtávon antioxidáns

aktivitást mutatnak, de hosszútávú inkubációjuk során kapott eredmények függnek az

alkalmazott kísérleti körölményektől. A metilszármazék (4b) mindkét vizsgálati

protokoll (EDTA nélkül és EDTA mellett) szerint in vitro antioxidáns hatással bír. A

metoxiszubsztituált analóg (4a) az EDTA jelenlétében elvégzett kísérletben átmeneti

prooxidáns aktivitást mutatott, ami arra utal, hogy a vizsgált aktivitás függ a jelen levő

kelátkomplexképző anyagtól, ami befolyásolhatja a vasionok mikrospeciációját és

reaktivitását. (104; 126)

V.2.3. A kalkonszármazékok hatással vannak a Jurkat T sejtek redox

státuszára

V.2.3.1. A vegyületek befolyásolják a ROS-aktivitást

A vizsgált kalkonanalógok reaktív oxigéngyök (ROS) termelésre gyakorolt hatását, a

vegyületekkel történő 1 és 4 órás sejtkezelést követően, 2’,7’-diklórfluoreszcin-

diacetátot (DCFH-DA) használva vizsgáltuk. (88; 89) A DCFH-DA egy nem-

fluoreszkáló molekula, amely képes a sejtek membránján áthatolni, és az intracelluláris

térbe kerülni. A jelen levő észteráz enzimek lehasítják a molekuláról az

acetilcsoportokat és 2’,7’-diklórfluoreszcin (DCFH) keletkezik, amely még nem

fluoreszkál. Reaktív oxigénszármazékok (főként H2O2) jelenlétében azonban

fluoreszcens 2’,7’-diklórfluoreszceinné (DCF) oxidálódik. A fluoreszcens jel intenzitása

– többek között – áramlási citométerrel detektálható. Az FL-1 csatornán mért

jelintenziás tehát végső soron az intracelluláris ROS-koncentrációval arányos.

Az áramlási citometriai analízis alkalmazásával láthatóvá vált, hogy a metil-

analóg (4b) jelentősen csökkenti a kezelt sejtekben a ROS termelést, ugyanakkor a

metoxiszármazék (4a) a kontroll sejtek analízisével hasonló képet mutat, vagyis nem

befolyásolja ezen kísérleti körülmények között a ROS produkciót. (20. ábra)

54

20. ábra A kalkonszármazékok celluláris ROS termelésre gyakorolt hatása. Áramlási

citometriai (FACScan) analízis a Jurkat T sejtek 4a és 4b vegyületekkel történő 4 órás

inkubációját, és DCFH-DA-val (10 μM) történő 20 perces jelölését követően.

A 21. ábra foglalja össze a ROS-mérés eredményeit, a kezeletlen kontroll

sejtekhez viszonyított relatív fluoreszcencia intezitás (%) értékek láthatók.

21. ábra A kalkonszármazékok celluláris ROS termelésre gyakorolt hatása. A kezelt

sejtek (DMSO 1%, 4a és 4b) fluoreszcencia intenzitását a kezeletlen kontroll sejtek

esetén mért fluoreszcenzia intenzitáshoz viszonyítjuk (%). Az eredmények négy

párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók. A kezeletlen kontroll

sejtekhez képest szignifikáns különbség (Student-t teszt, p < 0,05) *-al jelölve.

55

A 4b vegyület szignifikánsan csökkentette a DCF jelének intenzitását, mind az 1

órás, mind a 4 órás kezelést követően (80,20 ± 10,35% és 71,35 ± 16,51% a kontrollhoz

viszonyítva). A 4a származék esetén nem figyelhető meg szignifikáns változás.

A korábbiakban láthattuk, hogy a vizsgált kalkonszármazékok apoptózist

indukálnak. Az apoptózis olyan szigorúan szabályozott morfológiai változások sora,

amelyek a sejtek halálához vezetnek, de az apotózist nemcsak természetes, hanem

mesterséges stimulusok is indukálhatják. Egyre nagyobb az egyetértés arra

vonatkozólag, hogy az oxidatív stressz és a redox-státuszt befolyásoló tényezők döntő

szerepet játszanak az apoptózis irányításában és lefolyásában. (127)

Néhány kalkonszármazék citotoxikus hatásának hátterében az állhat, hogy

oxidatív stresszt okoznak (128), ugyanakkor mások a kalkonok antioxidáns hatásáról

számolnak be (35; 37), de azt is feltételezik, hogy a kalkonok toxikus hatása a pro-

oxidáns tulajdonságnak tudható be (35; 51). A 4a és 4b vegyületek ROS termelésre

gyakorolt hatását azért vizsgáltuk, hogy vajon oxidatív stresszt is okozva indukálnak

apoptózist. A vizsgálati eredmények arra utalnak (21. ábra), hogy a vegyületek nem

növelik meg az intracelluláris ROS aktivitást, sőt a metilszubsztituált analóg (4b)

szignifikánsan csökkenti a ROS-szintet és antioxidáns aktivitást mutat. Ez utóbbi

eredmény összhangban áll az in vitro antioxidáns hatást vizsgáló dezoxiribóz teszt

eredményével (V.2.2), ami szerint a vegyületek in vitro hidroxilgyök-scavanger

aktivitással rendelkeznek. (104; 126)

V.2.3.2. A kalkonszármazékok hatással vannak a mitokondriális funkciókra

A sejtek mitokondriális működése alapvetően három folyamatot határoz meg: az

oxidatív foszforiláció, reaktív oxigénszármazékok képződése, valamint a fiziológiás

sejthalál (apoptózis) iniciációja a legfontosabb mitokondriális funkciók. (129)

Következésképpen, ha egy xenobiotikum befolyásolja a mitokondriális

tevékenységeket, az hozzájárulhat a vegyület citotoxikus vagy antineoplasztikus

hatásához.

Néhány kalkonszármazék és izolált patkány máj mitokondriális külső membrán

interakciójának fluoreszcencia polarizációs módszerrel történő vizsgálatakor a 4a

vegyület más származékoktól eltérő módon viselkedett. A 4a analóg esetén,

mitokondrium jelenlétében, folyamatosan növekedő fluoreszcencia polarizációs jelet

lehetett detektálni. (130) Ez következménye lehet annak, hogy a lipofil kalkonanalóg

56

fokozatosan beépül a mitokondriális membránba, ami csökkenti a molekula

konformációs mobilitását, ez pedig szintén hozzájárulhat a vegyület kiemelkedő

citotoxikus hatásához. (130)

A kalkonanalógok mitokondriális funkcióra gyakorolt hatásának vizsgálatát a

kassai P. J. Šafarik Egyetem Orvosi Kémiai és Biokémiai Intézetével kooperációban

végeztük.

A mitokondriális respirációra, ATPáz enzim aktivitásra, ezáltal a mitokondriális

redox státuszra gyakorolt hatás vizsgálatok izolált patkánymáj mitokondriumokon

történtek. (131)

Az izolált mitokondriumok oxigénfogyasztás sebességének meghatározása 25 °C-

on, polarográfiás módszerrel, oxigénelektróddal történt. Az ún. respirációs médumhoz

adtuk a kalkonanalógokat, ADP-t, respirációs szubsztrátként nátrium-szukcinátot,

valamint a mitokondriumot. Az oxigénfogyasztás nmol O2 x min-1

x fehérje mg-1

formában került kifejezésre, ADP hozzáadásakor (3-as állapot; state 3), illetve ADP

hozzáadása előtt (4-es állapot; state 4). A vizsgált kalkonszármazékok nem

befolyásolják az oxigénfogyasztást a 3-as állapotban, de szignifikánsan megnövelik azt

a 4-es állapotban (a 4a vegyület 50,7 %-al), vagyis ADP-mentes körülmények között.

(11. táblázat)

O2 fogyasztás a

4-es állapotban (nmol O2 x min-1 x

mg-1)

O2 fogyasztás a

3-as állapotban (nmol O2 x min-1 x

mg-1)

RCR ATPáz

(nmol x min-1 x

mg-1)

Kontroll 11,87 ± 0,83 34,57 ± 0,79 2,91 ± 0,14 0,403 ± 0,017

4a 17,89 ± 0,83* 38,44 ± 0,96 2,14 ± 0,10* 0,544 ± 0,021*

4b 15,94 ± 0,66* 40,92 ± 2,78 2,57 ± 0,21 0,457 ± 0,019

11. táblázat A 4a és 4b vegyületek mitokondriális respirációs funkciókra gyakorolt

hatása. RCR = respiratory control ratio, az „oxigénfogyasztás a 3-as állapotban” és az

„oxigénfogyasztás a 4-es állaptban” hányadosa. Az eredmények három párhuzamos

mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók. A kontrollhoz képest szignifikáns

különbség (Student-t teszt, p < 0,05) *-al jelölve látható (131)

A 4a vegyület szignifikánsan csökkenti az RCR-értéket (RCR = respiratory

control ratio, az „oxigénfogyasztás a 3-as állapotban” és az „oxigénfogyasztás a 4-es

állapotban” hányadosa). Mivel a vegyületek autooxidációja nem lehet felelős a

megnövekedett oxigénfogyasztásért, az „elfogyasztott” oxigén a mitokondriális

57

elektron-transzfer reakciók szubsztrátja lehet (132), ami a mitokondriális redox-státusz

megváltozásával járhat.

Annak tisztázása érdekében, hogy az oxigénfogyasztás összefüggésben áll-e az

ATP szintézis esetleges megváltozásával, az ATP szintáz (ATPáz) aktivitását

vizsgáltuk, a Meissner-féle módszer (93) szerint. A kísérlet eredménye szerint a

metoxiszármazék (4a) szignifikánsan megnöveli a mitokondriális ATPáz aktivitást,

anélkül, hogy hatással lenne az oxigénfogyasztásra a 3-as állapotban. (11. táblázat) Az

észlelt szétkapcsoló hatás főként egyes lipofil, gyengén savas karakterű kismolekulára

jellemző, amikor a megnövekedett O2-fogyasztás ellenére nem történik ATP szintézis.

(133) Miután a vizsgált vegyületek lipofil molekulák, de nem bírnak gyenge savi

karakterrel, további vizsgálatok szükségesek a szétkapcsoló hatás mechanizmusának

kiderítésére.

V.2.3.3. A kalkonanalógok befolyásolják a celluláris SH-szintet

Az α,β-telítetlen karbonilvegyületek citotoxikus hatását elsősorban az élő szervezetek

esszenciális, tiolcsoportot tartalmazó molekuláival szemben mutatott reaktivitásuknak

tulajdonítják. (35; 37) Az esetlegesen lejátszódó reakciók befolyásolják az

intracelluláris redox-státuszt, és ezáltal számos más folyamatot is. (45) A 4a és 4b

vegyületek celluláris tiol-csoportokkal kialakuló lehetséges kölcsönhatását első

lépésben a vegyületek celluláris SH-szintre gyakorolt hatása révén vizsgáltuk,

tápanyagmentes és tápanyagokat tartalmazó környezetben.

Az 1 (PBS-pufferben), 4 illetve 8 óráig (RPMI tápoldatban) tartó kezeléseket

követően, Ellmann-reagenssel történő meghatározások (94) eredményeit a sejtek

fehérjemennyiségére vonatkoztattuk. Az eredményeket a 12. táblázat foglalja össze.

A 4a vegyülettel történő 1 órás, tápanyagokat nem tartalmazó PBS-pufferben

történt kezelés alatt a celluláris SH-szint szignifikánsan csökkent az 1% DMSO-val

kezelt kontroll sejtekhez képest. 4b vegyület nem okozott ilyen jellegű változást.

A hosszabb ideig (4, illetve 8 óra) tartó, RPMI-tápoldatban történő inkubáció már

lehetőséget teremt a sejteknek, hogy reagáljanak a GSH-szintet érintő esetleges

változtatásokra. (134) A metoxivegyület (4a) ezen körülmények között is szignifikánsan

csökkentette az SH-szintet, ugyanakkor 4b vegyület nem változtatta meg szignifikáns

mértékben az SH-szintet.

58

Teljes celluláris tiol (SH-csoport) mennyiség

(nmol/mg fehérje)

1 óra (PBS) 4 óra (RPMI) 8 óra (RPMI)

Kontroll (DMSO 1%) 33,08 ± 0,35 124,42 ± 3,21 122,01 ± 3,89

4a (5,6 μM) 24,01 ± 0,53* 107,92 ± 2,30* 108,03 ± 2,05*

4b (23,3 μM) 31,84 ± 0,63 129,19 ± 1,52 114,08 ± 1,07

12. táblázat Celluláris SH-szint Jurkat T sejtekben a 4a és 4b vegyületekkel történő

sejtkezeléseket követően. A PBS-pufferben történt meghatározás tápanyagmentes

környezetet, az RPMI-tápoldatban történt mérés tápanyagokat tartalmazó környezetet

jelent. Az eredmények három párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában

láthatók. Az 1% DMSO-val kezelt kontroll sejtekhez képest szignifikáns különbség

(Student-t teszt, p < 0,05) *-al jelölve látható

Sejtes körülmények között a gyűrűs kalkonszármazékok egyrészt enzim-katalizált

konjugációs reakciók révén és/vagy a redukált SH-csoportok diszulfiddá történő

oxidációja révén képesek a tiol-státuszt befolyásolni. (56; 135) A kísérlet eredményei

arra utalnak, hogy a 4a vegyület, glutation-S-transzferáz enzim katalízise mellett,

nagyobb reaktivitást mutat SH-csoportokkal, mint 4b vegyület. (135)

V.2.3.4. A kalkonszármazékok hatása a Jurkat sejtek glutation státuszára

A kalkonanalógok SH-reaktivitásának vizsgálatát tovább folytatva, a Jurkat T sejtek 4a

és 4b vegyületekkel történő kezelését követően, a redukált glutation-szintet (GSH) és az

oxidált glutation-szintet (GSSG) orto-ftálaldehiddel történő derivatizálást követően,

nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerrel határoztuk meg. (96)

A mintaelőkészítés során a sejtlízist három, egymást követő „freeze-and-thaw

ciklus” révén valósítottuk meg (136), nem az egyébként használatos ultrahangos

szonikálás révén, ugyanis az megnövelheti a sejtek GSSG-tartalmát. (137)

Az önmagában nem fluoreszkáló orto-flálaldehid, mint bifunkcionális reagens

egyszerre reagál a GSH molekula tiol- és primer aminocsoportjával, fluoreszkáló

izoindolszármazékot képezve. A keletkező termék 348 nm gerjesztési hullámhossz,

valamint 450 nm emissziós hullámhossz mellett detektálható. (138) A reakció pH-

függő, a redukált glutation OPA-val lejátszódó reakciójának optimális pH-értéke 8,0.

Ezen a pH-értéken az OPA nem reagál oxidált glutationnal, vagyis a GSH szelektíven

59

mérhető. Magas pH-érték mellett (≈ pH 12) azonban a GSSG is reakcióba lép OPA-val.

(133) Így pH 12 mellett a GSSG-tartalom is meghatározható. (138; 139; 140)

Annak érdekében, hogy az oxidált glutationmennyiség is szelektíven mérhető

legyen, a GSSG mérésekor a mintákban levő redukált glutationt N-etilmaleimiddel

(NEM) reagáltatjuk, amely a GSH tiolcsoportjához kapcsolódik. Ezáltal a GSH nem tud

reakcióba lépni OPÁ-val, illetve a konjugáció megvédi az oxidációtól is. (141) Ezt

alátámasztja az a vizsgálat is, amikor csak GSH-t tartalmazó standard oldathoz NEM-et

adtunk, majd azt a GSSG-szint meghatározásához használt módszer (IV.2.6.4) szerint

derivatizáltuk és vizsgáltuk. A kromatogramon nem láttunk csúcsot, igazolva a GSH

teljes „eliminálását” a mintából.

A kezeletlen és kalkonokkal kezelt sejtes minták glutation-koncentrációjának

meghatározása az OPA-val történő derivatizálást követően, a kísérleti részben leírt

fordított fázisú HPLC kromatográfiás kondíciók mellett történt. (IV.2.6.4) A

koncentráció meghatározása a GSH-t és GSSG-t tartalmazó standard sorozat mintáinak

mérése során felvett kalibrációs egyenesek segítségével történt. A meghatározott

redukált és oxidált glutation-szinteket a minták fehérjemennyiségére vonatkoztattuk. Az

eredmények (nmol/mg fehérje) a 22. ábra láthatók.

22. ábra A kalkonszármazékok celluláris glutation-szintre gyakorolt hatása Jurkat T

sejtekben a 4a és 4b vegyületekkel történő 4 órás kezelést követően. A kezeletlen és

kezelt sejtek (DMSO 1%, 4a és 4b) redukált glutation, valamint oxidált glutation

mennyiségének (nmol/mg fehérje) meghatározása OPA-val történő derivatizálást

követően HPLC-módszerrel történt. Az eredmények öt párhuzamos mérésből képezett

átlag ± szórás formában láthatók. A kezeletlen kontroll sejtekhez képest szignifikáns

különbség (Student-t teszt, p < 0,05) *-al jelölve.

60

A kísérleti eredmények alapján a metoxi- (4a), és a metilszubsztituált (4b)

kalkonszármazék eltérő módon befolyásolja a Jurkat sejtekben a glutation-szintet 4 órás

kezelést követően. A 4a vegyület nem befolyásolja jelentősen a szabad glutation-szintet

(GSH), de szignifikáns mértékben megnöveli az oxidált glutation (GSSG) mennyiségét

(0,67 ± 0,26 nmol/mg fehérje a kontroll sejtek esetén, 1,15 ± 0,33 nmol/mg fehérje 4a

esetén). A 4b származék azonban a redukált glutation mennyiségét növeli meg kis

mértékben (35,3 ± 6,6 nmol/mg fehérje mennyiségről 42,4 ± 7,2 nmol/mg fehérje-re),

de nem befolyásolja jelentősen a GSSG szintet a kezeletlen kontroll, illetve 1% DMSO-

val inkubált sejtekhez viszonyítva. (22. ábra)

A glutation-rendszer az egyik legfontosabb celluláris védekező mechanizmus az

élő sejtben. A glutation önmagában ROS scavengerként működik, de az intracelluláris

redox-homeosztázis szabályozásában is kiemelt szereppel bír. (127; 139) A sejt azon

képessége, hogy milyen mértékben képes glutationt termelni (akár a GSSG redukciója

révén, vagy de novo GSH szintézis révén) alapvetően meghatározza a sejt

hatékonyságát az oxidatív stressz kezelésében.

A 4 órás kezelési időtartam elég hosszú ahhoz, hogy a sejt reagáljon a glutation-

szintet érintő változtatásokra. (134) A metilszármazék (4b) az ismert kondíciók mellett

képes a GSH szintet kis mértékben megnövelni. Korábban is beszámoltak már arról,

hogy néhány elektrofil tulajdonsággal rendelkező Mannich bázis megnövelte a celluláris

tiol-szintet Jurkat T sejtekben (134), illetve HeLa sejtvonalakban (142). A

megnövekedett GSH szint nagy valószínűséggel az azt befolyásoló tényezők hatására

fellépő feedback mechanizmus következtében, de novo szintézis eredményeként

képződött GSH-nak tudható be. (134) A GSH-szint növekedése mögött az is állhat,

hogy a kalkon, mint α,β-telítetlen keton, a Keap1 fehérjék inaktiválása révén, aktiválja

az Nrf2 protein által irányított expressziós folyamatokat, többek között a γ-glutamil-

cisztein-szintetáz (γ-GCS), glutation-szintetáz, glutation-reduktáz és glükóz-6-foszfát-

dehidrogenáz enzimek fokozott kifejeződése révén megnöveli a GSH szintézist. (59)

Ezzel ellentétben a metoxianalóg (4a) a sejt oxidált GSSG-tartalmát növelte meg

szignifikáns mértékben, ami utalhat arra, hogy a vegyület valamilyen módon oxidatív

stresszt idéz elő. A GSSG-szint fiziológiás indikátora a ROS elleni intracelluláris

védekező mechanizmus aktivitásának, így alkalmas az oxidatív stressz in vivo

monitorozására is. (143; 144) A GSSG-szint emelkedésével párhuzamosan a GSH-szint

csökkenése nem volt megfigyelhető. Ez adódhat abból, hogy a kettő mennyisége között

nagyságrendbeli különbség van, és a GSH mennyiségben esetlegesen bekövetkező

61

változás nem érzékelhető ilyen módon. Ugyanakkor szerepe lehet annak is, hogy megnő

a glutation-reduktáz enzim aktivitása és/vagy megnő a γ-GCS aktivitása, annak

érdekében, hogy a sejt próbálja fenntartani a megfelelő glutation szintet. (128)

V.2.4. A kalkon-glutation konjugációs reakció vizsgálata

V.2.4.1. A vizsgált kalkonszármazékok intrinsic aktivitást mutatnak

glutationnal

A celluláris glutation-státusz megváltoztatásának a redox reakción kívül egy másik

lehetséges, a gyűrűs kalkonanalógok kémiai szerkezete alapján feltételezhető

mechanizmusa a vegyületek redukált glutationnal lejátszódó spontán és/vagy glutation-

S-transzferáz enzim által katalizált konjugációs reakciója.

Első lépésben a spontán lejátszódó reakciót vizsgáltuk sejtmentes körülmények

között. Ehhez a kalkonanalógokat és redukált glutationt ekvimoláris mennyiségben

tartalmazó, különböző pH-jú (pH = 5,5; 7,4; 9,0) oldatokat inkubáltunk 37 °C-on,

illetve 50°C-on, 1 és 3 órán keresztül. Az inkubátumok összetételét vékonyréteg-

kromatográfiás módszerrel, a kísérleti részben (IV.2.7.1) leírtak szerint vizsgáltuk. A

pH 7,4-es, illetve a pH 9,0-es oldatok esetén az 50 °C-os inkubátum, valamint a pH 9,0-

es, 37 °C-os inkubátum analízise során, a kettős előhívást követően, a kalkon, valamint

a GSH foltján kívül egy harmadik folt is láthatóvá vált. Ez a folt egy addukt jelenlétét

feltételezi, hiszen mind a két előhívási forma szerint látható volt, vagyis az aromás

vegyületekre jellemző UV-aktivitást is mutatja és a peptid (GSH) jelenlétére utaló

színreakciót is adja.

A GSH UV-fénnyel történő előhívás során nem ad jelet, azonban ninhidrinnel

ibolyáskék színreakciót ad, ugyanis a GSH három aminosavból álló tripeptid és az α-

aminosavak zöme semleges közegben ninhidrinnel igen érzékeny, kvantitatív célra is

alkalmas színreakciót nyújt. A kalkonszármazékok csak UV fényben történő előhívás

után adnak jelet. Mivel a konjugátumok GSH-t és a kiindulási kalkon vegyületet is

tartalmazzák, ezért ezek UV fényben, valamint ninhidrinnel történő előhívás során is

pozitív reakciót adnak. (104) Mindkét vizsgált származék (4a és 4b) esetén hasonlóak

voltak a tapasztalatok.

62

Gyengén savas körülmények között (pH = 5,5), ami egyébként jellemző kémhatás

tumoros sejtek környezetében, a vizsgált származékok nem mutatnak intrinsic aktivitást

glutationnal.

A kalkonszármazékok és GSH között lejátszódó nem enzim-katalizált reakció

további vizsgálata céljából egy fordított-fázisú nagyhatékonyságú-

folyadékromatográfiás módszer (RP-HPLC) kifejlesztése is megtörtént. (145) A

reakcióelegyben a GSH végső koncentrációja 5 x 10-2

M, a kalkon koncentrációja 5 x

10-3

M volt. A reakcióelegy pH értékének beállítása pH 8-ra történt, amely pH értéken a

GSH kb. 6%-a a sokkal erősebb nukleofil tiolát-anion formában található. (A GSH tiol-

csoportjának pKa értéke 9,2.) (146) Az inkubációs idő lejárta után (150, illetve 330

perc) a komponensek elválasztása fordított fázisú C-18 oszlopon történt UV-detektálás

mellett (λ = 260 nm). (145) Ezen inkubálási körülmények és kromatográfiás

paraméterek mellett a kromatogramon a kalkonanalógok (4a, illetve 4b) jele mellett,

további két csúcs jelent meg, feltételezhetően a kalkon-glutation konjugátum

diasztereomer párjának jele. (145)

A vékonyréteg-kromatográfiás eljárás, illetve az RP-HPLC vizsgálat (145)

eredményei arra utalnak, hogy a vizsgált vegyületek (4a és 4b) és redukált glutation

között spontán konjugációs reakció játszódik le, aminek során két egymással

diasztereomer viszonyban álló termékek keletkeznek. (23. ábra)

23. ábra A kalkonszármazékok redukált glutationnal (GSH) lejátszódó Michael-típusú

konjugációs reakciója

Az irodalomban is találhatók arra vonatkozó adatok, hogy α,β-telítetlen

karbonilvegyületek és glutation konjugációs reakciójában diasztereomer adduktumok

63

keletkeznek, például a nyílt láncú analóg, (E)-4-fenil-3-butén-2-on és GSH

reakciójában. (147) Hasonlóképpen, néhány ciklikus kalkonszármazék ((E)-2-

benzilidén-1-tetralon és -1-benzoszuberon) és ditiokarbaminsav (szintén kén-nukleofil

reagens) savkatalizálta reakciója során szintén két diasztereomer konjugátum

keletkezett, amit 1H-NMR vizsgálatokkal is alátámasztottak. (148)

A folyadékkromatográfiás vizsgálatok megerősítése céljából, illetve a feltételezett

GSH-adduktok szerkezetének igazolása céljából MALDI-TOF-MS, illetve

elektronspray ionizáció segítségével HPLC-ESI-MS vizsgálatok is történtek. A mérések

megerősítették a DAD-HPLC vizsgálatok eredményeit, miszerint az inkubátumokban

4a-GSH, illetve 4b-GSH adduktok (a protonált molekulatömegek 586,18 és 570,23)

keletkeznek spontán reakció révén. (145)

V.2.4.2. A kalkonanalógok és glutation konjugációs reakciójának vizsgálata

Jurkat T sejtekben

A 4a és 4b vegyületek sejtmentes körülmények között aktivitást mutatnak redukált

glutationnal szemben. A kifejlesztett RP-HPLC és csatolt ESI-MS eljárással (IV.2.7.2)

azt kívántuk vizsgálni, hogy a konjugációs reakció a Jurkat T sejtekben is lejátszódik-e,

hozzájárulva a vegyületek toxikus hatásának kialakításához.

A protokoll szerint (IV.2.2) kezelt sejteket lizáltuk, majd külön vizsgáltuk a

centrifugálás során kapott felülúszót és üledéket is. A megfelelő fehérjementesítés és

előkészítési eljárást követően felvett HPLC kromatogramokat (24. ábra), valamint ESI

tömegspektrumokat (25. ábra) összehasonlítottuk a kalkonanalógokat és glutationt

tartalmazó inkubátumok vizsgálatakor (145) kapott kromatogramokkal, illetve

spektrumokkal.

A vizsgálatok arra utalnak, hogy a 4a származék (279,2 Da protonált

molekulatömeggel) a sejtkezeléseket követően megtalálható mind a sejt felülúszóban,

mind a sejtes üledékben. A vegyület tehát a sejtkezelés során a Jurkat sejtek

membránján átjut és hatását intracellulárisan fejti ki. A 4a származékot és GSH-t

tartalmazó inkubátumban igazoltan keletkező 4a-GSH diasztereomerpár adduktok (145)

jelenléte azonban sem a sejt felülúszóból sem az üledékből nem bizonyítható.

A 4b vegyülettel kapott eredmények teljesen azonosak a 4a vegyület analízisekor

kapott eredményekkel. A 4b analóg jelenléte (m/z = 263,2) igazolható a felülúszóból, és

az üledékből is, de 4b-GSH konjugátumok ebben az esetben sem mutathatók ki.

64

Az előzetes, sejtmentes körülmények között elvégzett mérések eredményi arra

engedtek következtetni, hogy a vizsgált ciklikus kalkonanalógok citotoxikus hatásában

a redukált glutationnal lejátszódó konjugációs reakció is szerepet kap. A HPLC-ESI-MS

mérések azonban arra utalnak, hogy a feltételezett in vivo GST-katalizált reaktivitás 4a

illetve 4b vegyületek és GSH között nem járul hozzá a vegyületek apoptózist indukáló

hatásához.

24. ábra A Jurkat T sejtek 4a (5,6 μM) vegyülettel történő kezelése (4 óra), és

centrifugálása után kapott sejtfelülúszó és sejtes üledék vizsgálata során kapott

szelektált ion-kromatogramok (m/z = 279,2), valamint a 4a vegyületet (5 x 10-3

M) és

GSH-t (5 x 10-2

M) tartalmazó inkubátum (pH = 8,0; 50 °C) analízisekor kapott (145)

egymásra helyezett ion-kromatogramok (m/z = 279,2 és m/z = 586,2)

65

25. ábra A Jurkat T sejtek 4a (5,6 μM)(279,2 Da) vegyülettel történő kezelése (4 óra),

és centrifugálása után kapott sejtfelülúszó és sejtes üledék vizsgálata során kapott ESI

tömegspektrumok, valamint a 4a vegyületet (5 x 10-3

M) és GSH-t (5 x 10-2

M) tartalmazó

inkubátum (pH = 8,0; 50 °C) analízisekor kapott ESI tömegspektrumok (4a vegyület

(279,2 Da), valamint 4a-GSH addukt (586,2 Da)). (m/z = 50 – 2.000)

Ugyanakkor az MS mérések eredményei szerint nem keletkeznek olyan

molekulatömegű adduktumok sem, amelyek a vegyületek ciszteinil-glicin-, cisztein-

vagy esetleg N-acetil-cisztein-konjugátumai lennének, illetve a már előzetesen

66

esetlegesen metabolizálódott vegyület (pl. demetilált-, vagy hidroxilált-származék)

glutationnal képezett adduktumai.

Az eredmények mögött állhat a glutation-S-transzferáz enzim esetleges gátlása is.

Az irodalomban több esetben is beszámoltak róla, hogy α,β-telítetlen

karbonilvegyületek, közöttük kalkonok is, gátolják a GST enzim aktivitását. (149; 150;

151; 152) A GST enzim gátlása Jurkat T sejtekben sejtciklus gátlást és apoptózist

indukál. (153) A glutation-S-transzferáz enzim az egyik legfontosabb képviselője a

detoxikációs folyamatokban kulcsfontosságú szerepet játszó fázis 2 enzimeknek,

ugyanakkor számos humán daganatos sejtben túlexpresszálódik, és hozzájárul a

tumorsejtek kemoterápiás szerekkel szembeni rezisztenciájának kialakulásához. (154)

Az enzim gátlása révén gyógyszer-rezisztens tumorok újra érzékennyé tehetők a terápia

iránt. (149) A vizsgált kalkonszármazékok GST enzimaktivitásra gyakorolt hatása még

további vizsgálatokat igényel.

67

VI. Új eredmények összefoglalása, megbeszélés

Az előtanulmányok során összegyűjtött kísérleti tapasztalatok, valamint irodalmi adatok

alapján a kalkonok (1), valamint gyűrűs analógjaik (2-4) ígéretes kísérleti anyagok

lehetnek egy új szerkezeti típushoz tartozó, antineoplasztikus (citotoxikus és/vagy

citoprotektív) hatással rendelkező anyagok kutatására.

A természetben előforduló kalkonok és szintetikus analógjaik jól dokumentált

antibakteriális, antifungális, antiprotozoális, kemopreventív és citotoxikus aktivitással

rendelkeznek. A vizsgált anyagok és a kapcsolódó publikációk nagy száma ellenére az

irodalomban kevés olyan adat található, amelyek a megfigyelt biológiai hatások

molekuláris hátterének, a hatás szempontjából releváns molekuláris kölcsönhatások

szerkezet-hatás összefüggéseinek vizsgálatával foglalkoznak.

A téma kidolgozásának előzményeként mintegy száz, különbözőképpen

szubsztituált kalkon és ciklikus kalkonszármazék in vitro sejtproliferációt gátló

hatásának (IC50) meghatározása történt egér és humán daganatos sejtvonalakkal

szemben. A vegyületek biológiai hatását nagymértékben befolyásolja azok tér- és

elektronszerkezét meghatározó gyűrűtagszám és a kalkon molekulrész B-gyűrűjén lévő

szubsztituens elektronküldő, illetve elektronvonzó tulajdonsága. A vizsgált vegyületek

szerkezet-hatás összefüggése alapján a leghatékonyabbnak a héttagú gyűrűs (E)-2-(4’-

metoxibenzilidén)-1-benzoszuberon és az (E)-2-(4’-(dimetilaminobenzilidén)-1-

benzoszuberon származékok bizonyultak. (64)

Az e téren folytatandó további kutatómunka fő célkitűzése a gyűrűs

kalkonszármazékok fizikai-kémiai tulajdonságainak, valamint citotoxikus és

citoprotektív hatása molekuláris mechanizmusának alaposabb megismerése volt. A

gyűrűs származékok lipofilitásának jellemzésére számos, a 2-4 sorozatba tartozó

vegyületet vizsgáltunk, a hatásmechanizmus-vizsgálatokhoz a 7-tagú gyűrűs 4-metoxi-

(4a), valamint a 4-metilszubsztituált (4b) analógokat választottuk. (12. ábra)

Munkánk során kapott új eredmények:

1. Fordított fázisú vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel számos, különböző módon

szubsztituált, öt-, illetve hattagú gyűrűs kalkonanalóg logP értékét határoztuk meg,

kiegészítve a korábban vizsgált 7-tagú gyűrűs vegyületek vizsgálata során kapott

eredményeket. Összefüggéseket kerestünk a vegyületek gyűrűtagszáma, a

szubsztituensek minősége és helyzete, valamint a molekulák lipofilitása között.

68

2. In vitro kísérletek során áramlásos citometriai módszerrel vizsgáltuk a vegyületek

sejtszaporodást gátló, valamint sejtciklusra gyakorolt hatását Jurkat T sejtekkel

szemben. A Jurkat T sejteknek a vegyületek közel ekvitoxikus dózisával történő 8

órás kezelést követően a metilszármazék (4b) esetén a sejtek legnagyobb hányada –

a kontroll sejtekhez hasonlóan – a sejtciklus G0/G1 fázisában, míg a

metoxivegyülettel (4a) történt kezelés esetén a G2/M fázisban volt található. A

metoxivegyülettel (4a) történt 24 órás kezelést követően a sejtek közel fele a G2/M

fázisban volt található, míg a metilszármazékkal (4b) kezelt sejtek csak kisebb

hányada volt ebben a fázisban. Hosszabb inkubálás (48 óra) során, mindkét kezelés

estén, jelentősen megnő az apoptotikus sejtek aránya, ugyanakkor poliploid sejtek

képződése is megfigyelhető. A poliploid sejtek aránya a metoxivegyület (4a)

esetében közel háromszor olyan magas volt, mint a metilszármazék esetén.

Ezek alapján megállapíthattuk, hogy az in vitro citotoxicitás azon alapszik, hogy a

vegyületek erős apoptózist indukáló szerek, a hatékonyabb vegyület (4a) esetén

megfigyelhető a G2/M fázisú sejtciklus gátlás, és jellemző a poliploid sejtek

képződése.

A vegyületek sejtciklusra gyakorolt hatása alapján feltételezhető, hogy azok

kölcsönhatást alakítanak ki celluláris makromolekulákkal (tubulinnal, DNS-sel),

valamint redukált glutationnal, és befolyást gyakorolnak a sejtek redox-státuszára.

3. A vizsgálandó vegyületek in vitro antioxidáns hatását úgy jellemeztük, hogy

vizsgáltuk, a vegyületek mennyire képesek gátolni a hidroxilgyök – a biológiai

rendszerekben képződő legreaktívabb oxigénszármazék – toxicitását. Vizsgáltuk a

vegyületek lehetséges pooxidáns aktivitását is, a dezoxiribóz degradációra

gyakorolt hatásuk révén. A 4b vegyület az alkalmazott tesztrendszerben mindvégig

antioxidáns aktivitást mutatott, a 4a vegyület a rövid távú antioxidáns hatás után

(főként az EDTA-t is tartalmazó környezetben) növelte a dezoxiribóz degradációját,

és átmenetileg prooxidáns aktivitást mutatott.

4. A vegyületek celluláris redox-státuszra gyakorolt hatásának vizsgálatakor

megállapítottuk, hogy a vegyületek nem növelik meg az intracelluláris ROS

aktivitást, sőt a metilszubsztituált analóg (4b) szignifikánsan csökkenti a ROS-

szintet és antioxidáns aktivitást mutat. Ez utóbbi eredmény összhangban áll az in

69

vitro antioxidáns hatást vizsgáló dezoxiribóz teszt eredményével, ami szerint a

vegyület in vitro hidroxilgyök-scavanger aktivitással rendelkezik.

A vegyületek apoptózist okozó hatásában az oxidatív stressz indukciója nagy

valószínűséggel nem játszik szerepet.

5. A vegyületek izolált patkánymáj mitokondriumok funkcióira gyakorolt hatásának

vizsgálatakor azt tapasztaltuk, hogy a 4a vegyület megnöveli a mitokondriális

oxigénfogyasztást és emeli az ATPáz aktivitást. A mitokondriális funkciók

megváltozása szerepet játszhat a vegyület citotoxikus hatásának kialakításában.

6. A celluláris redox-homeosztázist alapvetően befolyásolja a celluláris tiol-szint,

illetve a glutation-státusz. A gyűrűs kalkonanalógok celluláris tiolokkal, ezen belül

a sejtekben nagy mennyiségben jelen levő redukált glutationnal szemben mutatott

esetleges kölcsönhatását vizsgáltuk.

Megállapítottuk, hogy míg a 4a vegyület az oxidált glutation mennyiségét növelte

meg, és a redukált glutation-szintet nem befolyásolta, addig a 4b származék a

redukált glutation szintet (és a totál SH-szintet is) növelte. A redukált glutation-

szint növelése magyarázatot adhat a korábbi vizsgálatok során tapasztalt

antioxidáns aktivitás (ROS csökkentés) hátterére.

A 4a vegyület GSSG-szintet növelő hatása szerepet játszhat az apoptózis-

indukcióban.

7. A vegyületek glutationnal történő konjugációs reakciójának vizsgálatakor

megállapítottuk, hogy a vegyületek közel semleges és gyengén lúgos kémhatás

mellett, magasabb hőmérsékleten intrinsic aktivitást mutatnak redukált glutationnal

szemben. A reakció során keletkező kalkon-GSH adduktok jelenlétének igazolása

vékonyréteg-kromatográfiás, illetve RP-HPLC eljárásokkal, szerkezetük igazolása

HPLC-MS technika segítségével történt.

A kifejleszett módszerek lehetőséget nyújtottak a konjugációs reakció sejtes

körülmények közötti vizsgálatára is. A Jurkat T sejtekben a kalkonokkal való

kezeléseket követően, azonban csak a vizsgált származékot sikerült kimutatni,

konjugátumok jelenlétét nem. Az eredmény arra enged következtetni, hogy a

citotoxicitásban minden bizonnyal szerepet játszó, GSH-szintet befolyásoló hatás

nem a konjugációs-reakció következménye.

70

Összességében azt láthattuk, hogy bár a két vizsgált kalkonszármazék szerkezetét

tekintve csak egy oxigénatomban tér el egymástól, hatásmechanizmusuk igen

különböző.

A kevésbé toxikus 4-metilanalóg (4b) apoptózist indukál Jurkat T sejtekben, de

hatása elmarad a 4a vegyület sejtciklust befolyásoló hatásától. Mind az in vitro tesztben,

mind sejtes körülmények között antioxidáns aktivitást mutat, ami összefüggésben állhat

a redukált glutation-szintet emelő hatásával.

A kiemelkedő citotoxicitást mutató 4-metoxiszármazék (4a) drasztikusan

befolyásolja a sejtciklust, apoptózist indukál, poliploid sejtek képződését váltja ki. Nem

rendelkezik kifejezett antioxidáns hatással, sőt citotoxikus hatásának hátterében a

vegyület prooxidáns hatása is valószínűsíthető. Befolyásolja a mitokondriális

funkciókat, a celluláris SH-szintet, megnöveli a sejtek oxidált glutation tartalmát, ezáltal

befolyásolja a redox homeosztázist.

A sejtciklus G2/M fázisú, a vegyületek általi gátlásának egyik biokémiai háttere a

tubulin polimerizációs-depolimerizációs folyamatára gyakorolt hatás lehet. A

citotoxikus hatás, a fent említett hatások mellett, részben a vegyületek celluláris

makromolekulákkal (tubulin, DNS) történő nem-kovalens kölcsönhatásának

eredményeképpen alakulhat ki.

A kutatási programunk eredményeképpen tovább bővültek ismereteink a gyűrűs

kalkonszármazékok kettős – citotoxikus és citoprotektív (kemopreventív) – hatásának

mechanizmusát illetően. A kísérletek eredményei alapjául szolgálnak a további

munkának: a természetes és/vagy szintetikus kalkonszármazékok daganatellenes hatás

szempontjából történő komplex vizsgálatának.

71

VII. Irodalomjegyzék

1. Döbrössy, L.: A daganatos betegségek helyzete és várható alakulása. Kopper L.,

Jeney A. (Eds.): Onkológia - a géntől a betegágyig. Medicina Kiadó, Budapest.

2003.

2. Szeberényi, J.: Molekuláris sejtbiológia. Dialóg-Campus Kiadó, Budapest-Pécs.

1999

3. Ember, I.: Népegészségügyi orvostan. Dialog-Campus Kiadó, Budapest-Pécs. 2007.

4. Hoensch, H.P., Kirch, W., 2005. Potential role of flavonoids in the prevention of

intestinal neoplasia. International Journal of Gastrointestinal Cancer 35, 187-196.

5. Cutler, G.J., Nettleton, J.A., Ross, J.A., Harnack, L.J., Jacobs, D.R., Scrafford,

C.G., Barraj, L.M., Mink, P.J., Robien, K., 2008. Dietary flavonoid intake and risk

of cancer in postmenopausal women: The Iowa Women's Health Study.

International Journal of Cancer 123, 664-671.

6. Petri, G.: Gyógynövény és drogismeret. Medicina, Budapest. 1991.

7. Carlo, G.D., Mascolo, N., Izzo, A.A., Capasso, F., 1999. Flavonoids: Old and new

aspects of a class of natural therapeutic drugs. Life Sciences 65, 337-353.

8. Crozier, A., Burns, J., Aziz, A.A., Stewart, A.J., Rabiasz, H.S., Jenkins, G.I.,

Edwards, C.A., Lean, M.E., 2000. Antioxidant flavonols from fruits, vegetables and

beverages: measurments and bioavailability. Biological Research 33, 79-88.

9. Havsteen, B.H., 2002. The biochemistry and medical significance of the flavonoids.

Pharmacology and Therapeutics 96, 67-202.

10. Moon, Y.J., Wang, X., és Morris, M.E., 2006. Dietary flavonoids: Effects on

xenobiotic and carcinogen metabolism. Toxicology in Vitro 20, 187-210.

11. Cushnie, T.P.T. és Lamb, A.J., 2005. Antimicrobal activity of flavonoids.

International Journal of Antimicrobial Agents 26, 343-356.

12. Garg, A., Garg, S., Zaneveld, L.J.D., Singla, A.K., 2001. Chemistry and

pharmacology of the citrus bioflavonoid hesperidin. Phytotherapy Research 15,

655-669.

13. Jacobs, B.P., Dennehy, C., Ramirez, G., Sapp, J., Lawrence, V.A., 2002. Milk

thistle for the treatment of liver disease: a systematic review and meta-analysis. The

American Journal of Medicine 113, 506-515.

72

14. Ratheesh, M., Shyni, G.L., Sindhu, G., Helen, A., 2011. Inhibitory effect of Ruta

graveolens L. on oxidative damage, inflammation and aortic pathology in

hypercholesteremic rats. Experimental and Toxicologic Pathology 63, 285-290.

15. Seigler, D.S.: Plant secondary metabolism. Kluwer Academic Publishers, 1998.

16. Dixon, R.A., Steele, C.L., 1999. Flavonoids and isoflavonoids - a gold mine for

metabolic engineering. Trend in plant science (reviews) 4, 394-400.

17. Winkel-Shirley, B., 2001. Flavnoid biosynthesis. A colorful model for genetics,

biochemistry, cell biology and biotechnology. Plant Physiology 126, 485-493.

18. Rozmer, Zs. és Perjési, P. Naturally occuring chalcones and their biological

activity. Phytochemistry Reviews Közlésre beküldve.

19. Fenwick, G.R., Lutomski, J., Nieman, C., 1990. Liquorice, Glycyrrhiza glabra -

Composition, usues and analysis. Food Chemistry 38, 119-143.

20. Kang, D.G., Lee, A.S., Mun, Y.J., Woo, W.H., Kim, J.C., Sohn, E.J., Moon, M.K.,

Lee, H.S., 2004. Butein ameliorates renal concentrating ability in cisplatin-induced

acutes renal failure in rats. Biological and Pharmaceutical Bulletin 27, 366-370.

21. Lee, J.C., Lee, K.Y., Kim, J., Na, C.S., Jung, N.C., Chung, G.H., Jang, Y.S., 2004.

Extract from Rhus verniciflua Stokes is capable of inhibiting the growth of human

lymphoma cells. Food Chemistry and Toxicology 42, 1383-1388.

22. Nowakowska, Z., 2007. A review of anti-infective and anti-inflammatory

chalcones. European Journal of Medicinal Chemistry 42, 125-137.

23. ElSohly, H.N., Joshi, A.S., Nimrod, A.C., Walker, L.A., Clark, A.M., 2001.

Antifungal chalcones from Maclura tinctoria. Planta Medica 67, 87-89.

24. Buckwold, V.E., Wilson, R.J.H., Nalca, A., Beer, B.B., Voss, T.G., Turpin, J.A.,

Buckheit, R.W., Wei, J., Wenzel-Mathers, M., Walton, E.M., Smith, R.J., Pallansh,

M., Ward, P., Wells, J., Chuvala, L., Sloane, S., Paulman, R., Russell, J., Hartman,

T., Ptak, R., 2004. Antiviral activity of hop constituents against a series of DNA

and RNA viruses. Antiviral Research 61, 57-62.

25. Sen, R., Chatterjee, M., 2011. Plant derived therapeutics for the treatment of

Leishmaniasis. Phytomedicine 18, 1056-1069.

26. Zhang, X., Yeung, E.D., Wang, J., Panzhinskiy, E.E., Tong, C., Li, W., Li, J., 2010.

Isoliquiritigenin, a natural anti-oxidant, selectively inhibits the proliferation of

prostate cancer cells. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 37,

841-847.

73

27. Szliszka, E., Czuba, Z.P., Mazur, B., Sedek, L., Paradysz, A., Krol, W., 2010.

Chalcones enhance TRAIL-induced apoptosis in prostate cancer cells. International

Journal of Molecular Sciences 11, 1-13.

28. Haraguchi, H., Ishikawa, H., Mizutani, K., Tamura, Y., Kinoshita, T., 1998.

Antioxidative and superoxide scavenging activities of retrochalcones in

Glycyrrhiza inflata. Bioorganic and Medicinal Chemistry 6, 339-347.

29. An, W., Yang, Y., Ao, Y., 2006. Metallothionein mediates cardioprotection of

isoliquiritigenin against ischemia-reperfusion through JAK2/STAT3 activation.

Acta Pharmacologica Sinica 27, 1431-1437.

30. Enoki, T., Ohnogi, H., Nagamine, K., Kudo, Y., Sugiyama, K., Tanabe, M.,

Kobayashi, E., Sagawa, H., Kato, I., 2007. Antidiabetic activities of chalcones

isolated from a Japanese herb, Angelica keiskei. Journal of Agricultural and Food

Chemistry 55, 6013-6017.

31. Dong, F., Jian, C., Zhenghao, F., Kai, G., Zuliang, L., 2008. Synthesis of chalcones

via Claisen-Schmidt condensation reaction catalyzed by acyclic acidic ionic liquids.

Catalysis Communications 9, 1924-1927.

32. Fan, X.S., Zhang, Y.M., 2002. A simple access to chalcones via modified

Mukaiyama aldol condensation promoted by SmI3/TMSCl. Chinese Journal of

Chemistry 20, 198-201.

33. Eddarir, S., Cotelle, N., Bakkour, Y., Rolando, C., 2003. An efficient synthesis of

chalcones based on the Suzuki reaction. Tetrahedron Letters 44, 5359-5363.

34. Briot, A., Baehr, C., Brouillard, R., Wagner, A., Mioskowski, C., 2004. Concise

synthesis of dihydrochalcones via palladium-catalyzed coupling of aryl halides and

1-aryl-2-propen-1-ols. Journal of Organic Chemistry 69, 1374-1377.

35. Dimmock, J.R., Elias, D.W., Beazely, M.A., Kandepu, N.M., 1999. Bioactivities of

chalcones. Current Medicinal Chemistry 6, 1125-1149.

36. Ni, L., Meng, C.Q., Sikorski, J.A., 2004. Recent advances in therapeutic chalcones.

Expert Oponion on Therapeutic Patents 14, 1669-1691.

37. Go, M.L., Wu, X., Liu, X.L., 2005. Chalcones: an update on cytotoxic and

chemoprotective properties. Current medicinal chemistry 12, 483-499.

38. Dimmock, J.R., Raghavan, S.K., Logan, B.M., Bigam, G.E., 1983. Antileukemic

evaluation of some Mannich bases derived from 2-arylidene-1,3-deiketones.

European Journal of Medicinal Chemistry 18, 248-254.

74

39. Benvenuto, J.A., Connor, T.H., Monteith, D.K., Laidlaw, J.L., Adams, S.C.,

Matney, T.S., Theiss, J.C., 1993. Degradation and inactivation of antitumor drugs.

Journal of Pharmaceutical Science 82, 988-991.

40. Ádám, V.: Orvosi biokémia. Medicina Könykiadó, Budapest, 2001.

41. Sen, C.K., 1997. Nutritional biochemistry of cellular glutathione. (Review).

Nutritional Biochemistry 8, 660-672.

42. Dimmock, J.R., Kandepu, N.M., Hetherington, M., Quail, J.W., Pugazhenthi, U.,

Sudom, A.M., Chamankhah, M., Rose, P., Pass, E., Allen, T.M., Halleran, S.,

Szydlowski, J., Mutus, B., Tannous, M., Manavathu, E.K., Myers, T.G., De Clercq,

E., Balzarini, J., 1998. Cytotoxic activities of Mannich bases of chalcones and

related compounds. Journal of Medicinal Chemistry 41, 1014-1026.

43. Sabzevari, O., Galati, G., Moridani, M.Y., Siraki, A., O'Brien, P.J., 2004.

Molecular cytotoxic mechanisms of anticancer hydroxychalcones. Chemico-

Biological Interactions 148, 57-67.

44. Esterbauer, H., Zollner, H., Scholz, N., 1975. Reaction of glutathione with

conjugated carbonyls. Zeitschrift für Naturforschung C 30, 466-473.

45. Powis, G., Gasdaska, J.R., Baker, J.R.: Redox signaling and the controll of cell

growth and death. In: Sies, H. (Ed.), Antioxidants in Disease Mechanism and

Therapy. In:Advances in Pharmacology, vol. 38. Academic Press, San Diego, pp

329-359. 1997.

46. Nam, N.H., Kim, Y., You, Y.J., Hong, D.H., Kim, H.M., Ahn, B.Z., 2003.

Cytotoxic 2',5'-dihydroxychalcones with unexpected antiangiogenic activity.

European Journal of Medicinal Chemistry 38, 179-187.

47. Navarini, A.L.F., Chiaradia, L.D., Mascarello, A., Fritzen, M., Nunes, R.J., Yunes,

R.A., Creczynski-Pasa, T.B., 2009. Hydroxychalcones induce apopotosis in B16-

F10 melanoma cells via GSH and ATP depletion. European Journal of Medicinal

Chemsitry 44, 1630-1637.

48. Hsu, Y.L., Kuo, P.L., Tzeng, W.S., Lin, C.C., 2006. Chalcone inhibits the

proliferation of human breast cancer cell by blocking cell cycle progression and

inducing apoptosis. Food and Chemical Toxicology 44, 704-713.

49. Rao, Y.K., Fang, S.H., Tzeng, Y.M., 2004. Differential effects of synthesized 2'-

oxygenated chalcone derivatves: modulation of human cell cycle phase distribution.

Bioorganic and Medicinal Chemistry 12, 2679-2686.

75

50. Satomi, Y., 1993. Inhibitory effects of 3'-methyl-3-hydroxy-chalcone on

proliferation of human malignant tumor cells and on skin carcinogenesis.

International Journal of Cancer 55, 506-517.

51. Middleton, E., Kandaswami , C., Theoharides, T.C., 2000. The effect of plant

flavonoids on mammalian cells: Implications for inflammation, heart disease and

cancer. Pharmacological Reviews 52, 673-751.

52. Gutteridge, J.M.C., 1987. Ferrous-salt-promoted damage to deoxyribose and

benzoate. The increased effectiveness of hydroxyl-radical scavengers in the

presence of EDTA. Biochemical Journal 243, 709-714.

53. Gregus, Z., Klaasen, C.D.: Mechanism of toxicity. In: Klaasen, C.D. (Ed.), Casarett

and Dull's Toxicology. The Basic Science of Poisons. Sixth ed. McGraw-Hill, New

York, (Chapter 3.) pp. 35-81. 2001.

54. Prochaska, H.J., Fernandes, C.L., 1993. Elevation of serum Phase II enzymes ba

anticarcinogenic enzym inducers: markers for a chemoprotrcted state?

Carcinogenesis 14, 2441-2449.

55. Dinkova-Kostova, A.T., Abeygunawardana, C., Talalay, P., 1998. Chemoprotective

properties of phenylpropenoids, bis(benzylidene)cycloalkanones, and related

Michael reaction acceptors: correlation of potencies as Phase 2 enzyme inducers

and radical scavengers. Journal of Medicinal Chemistry 41, 5287-5296.

56. Dinkova-Kostova, A.T., Massiah, M.A., Bozak, R.E., Hicks, R.J., Talalay, P.,

2001. Potency of Michael reaction acceptors as inducers of enzymes that protect

against carcinogenesis depends on their reactivity with sulfhydryl groups.

Proceedings of the National Academy of Sciences 98, 3404-3409.

57. Dinkova-Kostova, A.T., Holtzclaw, W.D., Kensler, T.W., 2005. The role of Keap1

in cellular protective responses. Chemical Research in Toxicology 18, 1779-1791.

58. Dinkova-Kostova, A.T., Holtzclaw, W.D., Wakabayashi, N., 2005. Keap1, the

sensor for electrophiles and oxidants that regulates the Phase 2 response, is a zinc

metalloprotein. Biochemistry 44, 6889-6899.

59. Motohashi, H., Yamamoto, M., 2004. Nrf2-Keap1 defines a physiologically

important stress response mechanism. Trends in Molecular Medicine 10, 549-557.

60. Izumi, Y., Matsumura, A., Wakita, S., Akagi, K., Fukuda, H., Kume, T., Irie, K.,

Takada-Takatori, Y., Sugimoto, H., Hashimoto, T., Akaike, A. 2012. Isolation,

identification and biological evaluation of Nfr2-ARE activator from the leaves of

76

green perilla (Perilla frutescens var. crispa f. viridis). Free Radical Biology and

Medicine 53, 669-679.

61. Hashimoto, Y., Kagechika, H., Kawachi, E., Shudo, K., 1987. New-type inducers

of differentation of HL-60 leukemia cells suppress c-myc expression. Chemical and

Pharmaceutical Bulletin 35, 3190-3194.

62. Forejtníková, H., Lunerová, K., Kubinová, R., Jankovská, D., Marek, R., Kares, R.,

Suchy, V., Vondrácek, J., Machala, M., 2005. Chemoprotective and toxic potentials

of synthetic and naural chalcones and dihydrochalcones in vitro. Toxicology 208,

81-93.

63. Iwata, S., Nishino, T., Inoue, H., Nagata, N., Satomi, Y., Nishino, H., Shibata, S.,

1997. Antitumorigenic activities of chalcones. (II) Photo-isomerization of

chalcones and the correlation with their biological activities. Biological and

Pharmaceutical Bulletin 20, 1266-1270.

64. Dimmock, J.R., Kandepu, N.M., Nazarali, A.J., Kowalchuk, T.P., Motaganahalli,

N., Quail, J.W., Mykiytiuk, P.A., Audette, G.F., Prasad, L., Perjési, P., Allen, T.M.,

Santos, C.L., Szydlowski, J., De Clercq, E., Balzarini, J., 1999. Conformational and

quantitative structure-activity relationship study of cytotoxic 2-

arylidenebenzocycloalkanones. Journal of Medicinal Chemistry 42, 1358-1366.

65. Perjési, P., Nusser, T., Tarczay, Gy., Sohár, P., 1999. E-2-Bezylidene-

benzocycloalkanones. Stereostructure and NMR spectroscopic investigations.

Journal of Molecular Structure 479, 13-19.

66. Tarczay, Gy., Vékey, K., Ludányi, K., Perjési, P., Sohár, P., 2000. E-2-

benzylidenebenzocyclanones. II. IR and mass spectrometric investigations. Journal

of Molecular Structure 520, 97-102.

67. Perjési, P., Perjéssy, A., Kolehmainen, E., Ősz, E., Samalikova, M., Linnato, J.,

Virtanen, E., 2004. E-2-Benzylidenebenzocycloalkanones III. Studies on

transmission of substituent effects on IR carbonyl stretching frequencies and 13C

NMR chemical shifts of E-2-(X-benzylidene)-1-indanones. Comparison with the IR

data of E-2-(X-benzylidene)-1-indanones. Journal of Molecular Structure 697, 41-

47.

68. Perjési, P., Linnanto, J., Kolehmainen, E., Ősz, E., Virtanen, E., 2005. E-2-

Benzylidenebenzocycloalkanones IV. Studies on transmission of substituent effects

on 13C NMR chemical shifts of E-2-(X-benzylidene)-1-tetralones and

77

benzosuberones. Comparison with the 13C NMR data of chalcones and E-2-(X-

benzylidene)-1-indanones. Journal of Molecular Structure 740, 81-89.

69. Dimmock, J.R., Zello, G.A., Oloo, E.O., Quail, J.W., Kraatz, H.B., Perjési, P.,

Aradi, F., Takács-Novák, K., Allen, T.M., Santos, C.L., Balzarini, J., De Clercq, E.,

Stables, J.P., 2002. Correlations between citotoxicity and topography of some 2-

arylidenebenzocycloalkanones determined by X-ray crystallography. Journal of

Medicinal Chemistry 45, 3103-3111.

70. Miyata, M., Furukawa, M., Takahashi, K., Gonzalez, F.J., Yamazoe, Y., 2001.

Mechanism of 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene-induced immunotoxicity: Role of

metabolic activation at the target organ. Japanese Journal of Pharmacology 86,

302-309.

71. Perjési, P., Bayer, Z., Ember, I., 2000. Effect of E-2-(4'-methoxybenzylidene)-1-

benzosuberone on the 7,12-dimethylbenz[alpha]anthracene-induced onco/supressor

gene action in vivo.I: A 24-hour experiment. Anticancer Research 20, 475-481.

72. Perjési, P., Gyöngyi, Z., Bayer, Z., 2000. Effect of E-2-(4'-methoxybenzylidene)-1-

benzosuberone on the 7,12-dimethylbenz[alpha]anthracene-induced onco/supressor

gene action in vivo II: A 48-hour experiment. Anticancer Research 20, 1839-1848.

73. Pitot, H.C., Dragon, Y.P.: Chemical carcinogenesis. In: Klaassen, C.D. (Ed.),

Casarett and Dull's Toxicology. McGraw-Hill, New York, pp. 241-320. 2001.

74. Larsen, M.C., Angus, W.G.R., Brake, P.B., Eltom, S.E., Sukow, K.A., Jefcoate,

C.R., 1998. Characterization of CYP1B1 and CYP1A1 expression in human

mammary epithelial cells: Role of the aryl hydrocarbon receptor in polycyclic

aromatic hydrocarbon metabolism. Cancer Research 58, 2366-2374.

75. Michejda, C.J., Kroeger Koepke, M.B., 1994. Carcinogen activation by sulfate

conjugate formation. Advances in Pharmacology 27, 331-363.

76. Surh, Y.J., Miller, J.A., 1994. Roles of electrophilic sulfuric acid ester metabolites

in mutagenesis and carcinogenesis by some polynuclear aromatic hydrocarbons.

Chemico-Biological Interactions 92, 351-362.

77. Monostory, K., Tamási, V., Vereczkey, L., Perjési, P., 2003. A study on CYP1A

inhibitory action of E-2-(4'-methoxybenzylidene)-1-benzosuberone and some

related chalcones and cyclic chalcone analogues. Toxicology 184, 203-210.

78. Tute, M.S.: Lipophilicity: A History. In: Mannhold, R., Kubinyi, H. and

Timmerman, H. (Eds), Methods and principles in medicinal chemistry, Vol. 4,

78

Lipophilicity in Drug Action and Toxicology (Pliska, V., Testa, B. and van de

Waterbeemd, H., Eds.) VHC, Weinheim, FRG. Chap. 2., pp. 7-26. 1996.

79. Takács-Novák, K., 1997. A megoszlási hányados GLP szerinti meghatározásának

praktikus szempontjai. Acta Pharmaceutica Hungarica 67, 179-191.

80. Takács-Novák, K., Perjési, P., Vámos, J., 2001. Determination of logP for

biologically active chalcones and cyclic chalcone analogs by RPTLC. Journal of

Planar Chromatogrphy 14, 42-46.

81. Almási, J., Takács-Novák, K., Kökösi, J., Vámos, J., 1999. Characterization of

potential NMDA and cholecystokinin antagonists: II. Lipophilicity studies on 2-

methyl-4-oxo-3H-quinazoline-3-alkyl-carboxylic acid derivatives. International

Journal of Pharmaceutics 180, 13-22.

82. Tennant, J.R., 1964. Evaluation of the trypan blue technique for determination of

cell viability. Transplantation 12, 685-694.

83. Givan, A.L.: Flow Cytometry: First Principles. New York, NY-Wiley-Liss., 1992.

84. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelinsperger, C., 1995. A novel

assay for apoptosis. Flow-cytometric detection of phosphatidylserin expression on

early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. Journal of

Immunological Methods 184, 39-51.

85. Del Bino, G., Darzynkiewicz, Z., Degraef, C., Mosselmans, R., Fokan, D., Galand,

P., 1999. Comparison of methods based on annexin V binding, DNA content or

TUNEL for evaluating cell death in HL-60 and adherent MCF-7 cells. Cell

Proliferation 32, 27-37.

86. Cheng, Z., Li, Y., Chang, W., 2003. Kinetic deoxyribose degradation assay and its

application in asessing the antioxidant activities of phenolic compounds in a

Fenton-type system. Analytica Chimica Acta 478, 129-137.

87. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., Auroma, O.I., 1987. The deoxyribose method: A

simple "test-tube" assay for determination of rate constants for reactions of

hydroxyl radicals. Analytical Biochemistry 165, 215-219.

88. Aronis, A., Melendez, J.A., Golan, O., Shilo, S., Dicter, N., Tirosh, O., 2003.

Potentiation of FAS-mediated apoptosis by attenuated production of mitochondria-

derived reactive oxygen species. Cell Death and Differentiation 10, 335-344.

89. Frei, G.M., Lebenthal, I., Albeck, M., Albeck, A., Sredni, B., 2007. Neutral and

positively charged thiols synergize the effect on the immunomodulator AS101 as a

79

growth inhibitor of Jurkat cells, by increasing its uptake. Biochemical

Pharmacology 74, 712-722.

90. Johnson, D., Lardy, H., 1967. Isolation of liver or kidney mitochondria. Methods in

Enzymology 10, 94-96.

91. Hartree, R.F., 1972. Determination of protein: A modification of Lowry method

that gives a linear photometric response. Analytical Biochemistry 48, 422-427.

92. Estabrook, R.E., 1967. Mitochondrial respiratory control and the polarographic

measurment of ADP/O ratios. Methods in Enzymology 10, 41-47.

93. Meissner, G., 1974. Isolation of sarcoplasmic reticulum from skeletal muscle.

Methods in Enzymology 31, 238-246.

94. Ellmann, G.L., 1958. A colorimetring method for determining low concentrations

of mercaptans. Archives of Biochemistry and Biophysics 74, 443-450.

95. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H.,

Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., Klenk, D.C., 1985.

Measurment of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry 150, 76-

85.

96. Kand'ár, R., Záková, P., Lotková, H., Kucera, O., Cervinková, Z., 2007.

Determination of reduced and oxidized glutathione in biological samples using

liquid chromatography with fluorimetric detection. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis. 43, 1382-1387.

97. Testa, B., Crivori, P., Reist, M., Carrupt, P.A., 2000. The influence of lipophilicity

on the pharmacokinetic behavior of drugs: concepts and examples. Perspectives in

Drug Discovery and Design 19, 179-211.

98. Zhou, L., Wang, J., 2009. Physico-chemical characterization in drug discovery.

Trends in bio/pharmaceutical industry. Preclinical formulation 2009, 12-18.

99. Takács-Novák, K., Völgyi, G., 2005. A fizikai-kémiai jellemzés helye és módszerei

a gyógyszerkutatásban. Magyar Kémiai Folyóirat 111, 169-176.

100.Lambert, W.J., 1993. Modeling oil-water partitioning and membrane permeation

using reversed-phase chromatography. Journal of Chromatography A 656, 469-

484.

101.Rozmer, Zs., Perjési, P., Takács-Novák, K., 2006. Use of RP-TLC for

determination of logP of isomeric chalcones and cyclic chalcone analogues.

Journal of Planar Chromatography 19, 124-128.

80

102.Vashishtha, S.C., Nazarali, A.J., Dimmock, J.R., 1998. Application of fluorescence

microscopy to measure apoptosis in Jurkat T cells after treatment with new

investigational anticancer agent. Cellular and Molecular Neurobiology 18, 437-

445.

103.Schoene, N.W., Kamara, K.S., 1999. Population doubling time, phosphatase

activity, and hydrogen peroxide generation in Jurkat cells. Free Radical Biology

and Medicine 27, 364-369.

104.Rozmer, Zs., Berki, T., Perjési, P., 2006. Different effects of two cyclic chalcone

analogues on cell cycle of Jurkat T cells. Toxicology in Vitro 20, 1354-1362.

105.Cook, J.A., Mitchell, J.B., 1989. Viability measurments of mammalian cell

systems. Analytical Biochemistry 179, 1-7.

106.Mesner, P.W., Kaufman, S.H.: Methods utilized in the study of apoptosis. In:

Kaufman S.H. (ed.), Apoptosis. Pharmacological Implications and Therapeutic

Oppurtunities. In: Advances in Pharmacology, Vol. 41. Academic Press, San

Diego, pp. 57-87.

107.Dean, P.N.: Data analysis in cell kinetics research. In: Gray, J.W., Darzynkiewicz,

Z.( Eds.) Techniques In Cell Cycle Research. Humana Press, Clifton, New Jersey,

pp. 207-253. 1987.

108.Murray, A., 1994. Cell cycle checkpoints. Current Opinion in Cell Biology 6, 872-

876.

109.Diffey, J.F.X., Evan, G., 2000. Oncogenes and cell proliferation. Cell cycle,

genome integrity and cancer - a millennial view. Current Opinion in Genetics and

Development 10, 13-16.

110.Lepley, D.M., Li, B., Birt, D.F., Pelling, J.C., 1996. The chemopreventive

flavonoid apigenin induces G2/M arrest in keratinocytes. Carcinogenesis 17, 2367-

2375.

111.Rao, Y.K., Fang, S.H., Tzeng, Y.M., 2004. Differential effects of synthesized 2'-

oxygenated chalcone derivatives: modulation of human cell cycle phase

distribution. Bioorganic and Medicinal Chemistry 12, 2679-2686.

112.Rao, Y.K., Fang, S.H., Tzeng, Y.M., 2005. Synthesis, growth inhibition, and cell

cycle evaluations of novel flavonoid derivatives. Bioorganic and Medicinal

Chemistry 13, 6850-6855.

81

113.Hsu, Y.L., Kuo, P.L., Tzeng, W.S., Lin, C.C., 2006. Chalcone inhibits the

proliferation of human breast cancer cell by blocking cell cycle progression and

inducing apoptosis. Food and Chemical Toxicology 44, 704-713.

114.Kimler, B.F., Schneiderman, M.H., Leeper, D.B., 1978. Induction of concentration-

dependent blockade in the G2 phase of the cell cycle by cancer chemotherapeutic

agents. Cancer Research 38, 809-814.

115.Konopa, J., 1988. G2 block induced by DNA crosslinking agents and its possible

consequences. Biochemical Pharamcology 37, 2303-2309.

116.Erenpreisa, J., Cragg, M.S., 2001. Mitotic death: a mechanism of survival? A

review. Cancer Cell International 1, 1-7.

117.Pilatova, M., Varinska, L., Perjési, P., Sarissky, M., Mirossay, L., Solar, P., Ostro,

A., Mojzis, J., 2010. In vitro antiproliferative and antiangiogenic effects of

synthetic chalcone analogues. Toxicology in Vitro 24, 1347-1355.

118.Winterbourn, C.C., 1991. Factors that influence the deoxyribose oxidation assay for

Fenton reaction products. Free Radical Biology and Medicine 11, 353-360.

119.Rozmer, Zs., Perjési, P., 2005. Néhány nem-szteroid gyulladáscsökkentő hatásának

vizsgálata a 2-deoxi-D-ribóz Fenton-reakció inicializálta degradációjára. Acta

Pharmaceutica Hungarica 75, 69-75.

120.Galey, J.B.: Antioxidants in Disease Mechanism and Therapy. Sies H. (Ed.)

Academic Press, San Diego, pp. 167-203. 1997.

121.Halliwell, B.: Antioxidants in Disease Mechanism and Therapy. Sies H. (Ed.)

Academic Press, San Diego, pp. 3-20. 1997.

122.Chobot, V., 2010. Simultaneous detection of pro- and antioxidative effects in the

variants of the deoxyribose degradation assay. Journal of Agricultural and Food

Chemistry 58, 2088-94.

123.Loo, G., 2003. Redox-sensitive mechanism of phytochemical-mediated inhibition

of cancer cell proliferation. Journal of Nutritional Biochemistry 14, 64-73.

124.Croft, S., Gilbert, B.C., Lidsay Smith, J.R., Whithwood, A.C., 1992. An ESR

investigation of the reactive intermediate generated in the reaction between iron and

hydrogen peroxide in aqueous solution. Direct evidence for formation of the

hydroxyl radicals. Free Radical Research Communication 17, 21-39.

125.Prokai, L., Prokai-Tátrai, K., Perjési, P., Zharikova, A.D., Perez, E.J., Liu, R.;

Simpkins, J.W., 2003. Quinol-based cyclic antioxidant mechanism in estrogen

82

neuroprotection. Proceedings of the National Academy of Sciences 100, 11741-

11746.

126.Perjési, P., Rozmer, Zs., 2011. Kinetic analysis of some chalcones and synthetic

chalcone analogues on the Fenton-reaction initiated deoxyribose degradation assay.

The Open Medicinal Chemistry Journa. 5, 61-67.

127.Curtin, J.F., Donovan, M., Cotter, T.G., 2002. Regulation and measurment of

oxidative stress in apoptosis. Journal of Immunological Methods 265, 49-72.

128.Winter, E., Chiaradia, L.D., Cordova, C.A.S., Nunes, R.J., Yunes, R.A.;

Creczynski-Pasa, T.B., 2010. Naphthylchalcones induce apoptosis and caspase

activation in a leukemia cell line: The relationship between mitochondrial damage,

oxidative stress, and cell death. Bioorganic and Medicinal Chemistry 18, 8026-

8034.

129.Wallace, D.C., 1999. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science 283, 1148-

1482.

130.Tomeckova, V., Perjési, P., Guzy, J., Kusnir, J., Chovakova, Z., Chavkova, Z.,

Marekova, M., 2004. Comparison of effect of selected synthetic chalcone

analogues on mitochondrial outer membrane determined by fluorescence

spectroscopy. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 61, 135-141.

131.Perjési , P., Kubalkova, J., Chovanova, Z., Marekova, M., Rozmer, Zs., Fodor, K.,

Chavkova, Z., Tomeckova, V., Guzy, J., 2008. Comparison of effects of some

cyclic chalcone analogues on selected mitochondrial functions. Pharmazie 63, 899-

903.

132.Hodnick, W.F., Milosavljevic, E.B., Nelson, J.H., Pardini, R.S., 1988.

Electrochemistry of flavonoids. Relationships between redox potentials, inhibition

of mitochondrial respiration and production of oxygen radicals of flavonoids.

Biochemical Pharmacology 37, 2601-2611.

133.Trumbeckaite, S., Bernatoniene, J., Majiene, D., Jakstas, V., Savickas, A., Toleikis,

A., 2006. The effects of flavonoids on rat heart mitochondrial function.

Biomedicine and Pharmacotherapy 60, 245-248.

134.Gul, M., Gul, H.I., Hanninen, O., 2002. Effects of Mannich bases on cellular

glutathione and related enzymes on Jurkat cells in culture conditions. Toxicology in

Vitro 16, 107-112.

83

135.Galati, G., Sabzevari, O., Wilson, J.X., O'Brien, P.J., 2002. Prooxidant activity and

cellular effects of the phenoxyl radicals of dietary flavonoids and other

polyphenolics. Toxicology 177, 91-104.

136. Michaelsen, J.T., Dehnert, S., Giustarini, D., Beckmann, B., Tsikas, D., 2009.

HPLC analysis of human erythrocytic glutathione forms using OPA and N-acetyl-

cysteine ethyl ester: Evidence for nitrite-induced GSH oxidation to GSSG. Journal

of Chromatography B. 877, 3405-3417.

137. Ridnour, L.A., Winters, R.A., Ercal, N., Spitz, D.R., 1999. Measurement of

glutathione, glutathione disulfide, and other thiols in mammalian cell and tissue

homogenates using high-performance liquid chromatography separation of N-(1-

pyrenyl)maleimide derivatives. Methods in Enzymology. 299, 258-264.

138. Hissin, P.J., Hilf, R., 1976. A fluorometric method for determination of oxidized

and reduced glutathione in tissues. Analytical Biochemistry. 74, 214-226.

139.Camera, E., Picardo, M., 2002. Analytical methods to investigate glutathione and

related compounds in biological and pathological processes. Journal of

Chromatography B 781, 181-206.

140. Lenton, K.J., Therriault, H., Wagner, J.R., 1999. Analysis of glutathione and

glutathione disulfide in whole cells and mitochondria by postcolumn derivatization

high-performance liquid chromatography with ortho-phthalaldehyde. Analytical

Biochemistry. 274, 125-130.

141. Pastore, A.; Federici, G.; Bertini, E.; Piemonte, F., 2003. Analysis of glutathione:

implication in redox and detoxification. Clinica Chimica Acta. 333, 19-33.

142. Lóránd, T., Kocsis, B., Sohár, P., Nagy, G., Kispál, G., Krane, H.G., Schmitt, H.,

Weckert, E., 2001. Synthesis and antibacterial study of unsaturated Mannich

ketones. European Journal of Medicinal Chemistry 36, 705-717.

143.Gitler, C., Mogyoros, M., Kalef, E., 1994. Labeling of protein vicinal dithiols: Role

of protein-S2 to protein-(SH)2 conversion in metabolic regulation and oxidative

stress. Methods in Enzymology 233, 403-415.

144.Hughes, H., Taeschke, H., Mitchell, J.R., 1990. Measurment of oxidant stress in

vivo. Methods in Enzymology 186, 681-685.

145.Perjési, P., Maász, G., Reisch, R., Benkő, A., 2012. (E)-2-Benzylidene-

benzocyclanones: Part VII. Investigation of the conjugation reaction of two

cytotoxic cyclic chalcone analogues with glutathione: an HPLC-MS study.

Monatshefte für Chemie 143, 1107-1114.

84

146. Tang, S.S., Chang, G.G., 1996. Kinetic characterization of the endogenous

glutathione transferase activity of Octopus lens S-Crystallin. The Journal of

Biochemistry 119, 1182-1188.

147.Kubo, Y., Armstrong, R.N., 1989. Observation of a substituent effect on the

stereoselectivity of glutathione S-transferase toward para-substituted 4-phenyl-3-

buten-2-ones. Chemical Research in Toxicology 2, 144-145.

148. Perjési, P., Batta, G., Földesi, A., 1994. Reaction of benzylidenebenzocyclanones

with dithiocarbamic acid and thiourea. Monatshefte für Chemie 125, 433-439.

149.Wang, J., Wang, S., Song, D., Zhao, D., Sha, Y., Jiang, Y., Jing, Y., Cheng, M.,

2009. Chalcone derivatives inhibit glutathione S-transferase P1-1 activity: Insights

into the interaction mode of α,β-unsaturated carbonyal compounds. Chemical

Biology and Drug Design 73, 511-514.

150.Miyamoto, T, Silva, M., Hammock, B.D., 1987. Inhibition of epoxide hydrolases

and glutathione S-transferases by 2-, 3-, and 4-substituted derivatives of 4'-

phenylchalcone and its oxide. Archives of Biochemistry and Biophysics 254, 203-

213.

151.Huang, H., Niu, J., Zhao, L., Lu, Y., 2011. Reversal effect of 2',4'-dihydroxy-6'-

methoxy-3',5'-dimethylchalcone on multi-drug resistance in resistant human

hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402/5-FU. Phytomedicine 18, 1086-1092.

152.Zhang, K., Das, N.P., 1994. Inhibitory effects of plant polyphenols on rat liver

glutathione S-transferase. Biochemical Pharmacology 47, 2063-2068.

153.Mccaughan, F.M., Brown, A.L., Harrison, D.J., 1994. The effect of inhibition of

glutathione S-transferase P on the growth of the Jurkat human T cell line. Journal

of Pathology 172, 357-362.

154.Townsend, D.M., Tew, K.D., 2003. The role of glutathione S-transferase in anti-

cancer drug resistance. Oncogene 22, 7369-7375.

85

VIII. Saját publikációk

A tézis alapját képező közlemények

1. Zs. Rozmer, T. Berki, G. Maász, P. Perjési: Different effects of two cyclic

chalcone analogues on redox status of Jurkat cells. Toxicology in Vitro. Közlésre

elfogadva.

2. Zs. Rozmer, P. Perjési: Naturally occurring chalcones and their biological activity.

Review. Phytochemistry Reviews. Közlésre beküldve.

3. P. Perjési, Zs. Rozmer: Kinetic analysis of some chalcones and synthetic chalcone

analogues on the Fenton-reaction initiated deoxyribose degradation assay.

Open Med. Chem. J. (2011) 142, 463-468

IF: - (2010)

4. P. Perjesi, J. Kubalkova, Z. Chovanova, M. Marekova, Zs. Rozmer, K. Fodor, Z.

Chavkova, V. Tomecková, J. Guzy: Comparison of effects of some cyclic chalcone

analogues on selected mitochondrial functions.

Pharmazie (2008) 63, 899-903

IF: 0.858 (2008)

5. Zs. Rozmer, P. Perjési, K. Takács-Novák: Use of RP-TLC for Determination of

logP of Isomeric Chalcones and Cyclic Chalcone Analogues.

J. Planar Chrom. – Modern TLC (2006) 19, 124-128.

IF: 1,153 (2006)

6. Zs. Rozmer, T. Berki, P. Perjési: Different effects of two cyclic chalcone

analogues on cell cycle of Jurkat T cells.

Toxicol. in Vitro (2006) 20, 1354-1362.

IF: 2,045 (2006)

Egyéb közlemények

1. Rozmer Zs., Perjési P.: (E)-2-benzylidenebenzocyclanones: Part X. Determination

of logP of (E)-3-benzylidene-2,3-dihydro-1-benzopyran-4-ones by RP-TLC. Effect

on logP of incorporation of oxygen atom into carbocyclic chalcone analogues.

J. Planar Chrom. - Modern TLC (2013) 26, 284-288.

IF: 0,955

86

2. P. Perjési, K. Takács-Novák, Zs. Rozmer, P. Sohár, R. E. Bozak, T. M. Allen:

Comparison of structure, logP and P388 cytotoxicity of some phenyl and ferrocenyl

cyclic chalcone analogues. Application of RP-TLC for logP determination of the

ferrocenyl analogues.

Cent. Eur. J. Chem. (2012) 10, 1500-1505.

IF: 1,073 (2011)

3. J. Guzy, J. Vasková-Kubálková, Zs. Rozmer, K. Fodor, M. Marekova, M.

Poskrobová, P. Perjési: Activation of oxidative stress response by hydroxyl

substituted chalcones and cyclic chalcone analogues in mitochondria.

FEBS Lett. (2010) 584, 567-70.

IF: 3.601 (2010)

4. P. Perjési, U. Das, E. De Clerq, J. Balzarini, M. Kawase, H. Sakagami, J. P.

Stables, T. Loránd, Zs. Rozmer, J. R. Dimmock: Design, synthesis and

antiproliferative activity of some 3-benzylidene-2,3-dihydro-1-benzopyran-4-ones

which display selective toxicity for malignant cells

Eur. J. Med. Chem. (2008) 43, 839-845-

IF: 2,882 (2008)

5. P. Perjési, I. Ember, R. E. Bozak, E. Nádasi, Zs. Rozmer, T. Varjas, R. J. Hicks:

Effect of the Chalcone Analogue E,E-bis(2-Hydroxybenzylidene)acetone on the

7,12-Dimethylbenz[a]anthracene-Induced Ha-ras Gene Action in Vivo.

In Vivo (2006) 20, 141-146.

IF: 1,273 (2006)

6. Rozmer Zs., Perjési P.: Néhány nem-szteroid gyulladáscsökkentő hatásának

vizsgálata a 2-deoxi-D-ribóz Fenton-reakció iniciálta degradációjára

Acta Pharm. Hung. (2005) 75, 87-93.

IF: - (2005)

Idézhető absztraktok

1. Rozmer Zs., Marton E., Perjési P.: Gyűrűs kalkonanalógok celluláris

makromolekulákkal kialakuló kölcsönhatásának vizsgálata spektroszkópiai és

kromatográfiás módszerekkel.

Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XV., Budapest, 2014.

Gyógyszerészet Suppl. 2014/14. P-18

87

2. Rozmer Zs., Berki T., Maász G., Perjési P.: Gyűrűs kalkonszármazékok celluláris

redox státuszra gyakorolt hatásának vizsgálata Jurkat T sejtekben.

Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XV., Budapest, 2014.

Gyógyszerészet Suppl. 2014/14. P-94

3. P. Perjési, M. Kuzma, K. Fodor, Zs. Rozmer: Application of crocin bleaching and

deoxyribose degradation tests to assess antioxidant capacity of capsaicinoids and

some selected flavonoids.

2nd BBBB Conference on Pharmaceutical Sciences, Tartu, 2007.

Eur. J. Pharm. Sci. 32 (S1), 39, 2007.

4. Csékei J., Szitter I., Rozmer Zs., Perjési P.: Flavonoid tartalmú teakeverékek

flavonoidtartalmának meghatározása és hidroxilgyök scavenger hatásának in vitro

jellemzése a dezoxiribóz degradációs teszt alkalmazásával.

Magyar Molekuláris és Prediktív Epidemiológiai Társaság III. Nemzetközi

Kongresszusa, Pécs, 2006.

Magyar Epidemiológia 3 (S), S33, 2006.

5. Rozmer Zs., Perjési P.: Kalkonszármazékok és fenolos nem-szteroid

gyulladáscsökkentők hidroxilgyök scavenger hatásának in vitro jellemzése a

dezoxi-ribóz degradációs teszt alkalmazásával.

Magyar Molekuláris és Prediktív Epidemiológiai Társaság II. Nemzetközi

Kongresszusa, Pécs, 2005.

Magyar Epidemiológia 2 (S), S76. 2005.

6. Nádasi E., Rozmer Zs., Bozak R. E., Hicks R. J., Perjési P.: A synthetic curcumin

analogue: chemopreventive or genotoxic effect?

Magyar Molekuláris és Prediktív Epidemiológiai Társaság II. Nemzetközi

Kongresszusa, Pécs, 2005.

Magyar Epidemiológia 2 (S), S63. 2005.

Poszterek

1. Rozmer Zs., Berki T., Maász G., Perjési P.: Different effects of two cyclic

chalcone analogues on redox status of Jurkat T cells.

2nd International Doctoral Workshop on Natural Sciences, Pécs, 2013.

88

2. Perjési P., Kuzma M., Fodor K., Rozmer Zs.: Studies on in vitro antioxidant effect

of salicylic acid and its hydroxylated metabolites.

9th International Symposium on Instrumental Analysis, Pécs, 2008.

3. Kuzma M., Fodor K., Rozmer Zs., Perjési P.: Néhány kapszaicinoid és flavonoid

antioxidáns hatásának vizsgálata krocin oxidációs teszt és deoxiribóz degradációs

teszt alkalmazásával.

Magyar Szabadgyök Kutató Társaság IV. Kongresszusa, Pécs, 2007.

4. Rozmer Zs., Berki T., Perjési P.: Gyűrűs kalkonanalógok citotoxicitásának

vizsgálata.

Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIII, Budapest, 2006.

5. J. Guzy, M. Mareková, Z. Chavková, J. Kubálková, V. Tomečková, Zs. Rozmer, P.

Perjési: Comparison of effect of some cyclic chalcone analogues on selected

mitochondrial functions.

8th Symposium on Instrumental Analysis, Graz, 2005.

6. Rozmer Zs., T. Novák K., Perjési P.: Kalkonok és gyűrűs kalkonszármazékok logP

értékeinek meghatározása fordított fázisú vékonyréteg kromatográfiás módszerrel.

Az MGYT Gyógyszerkutatási Szakosztály tudományos ülése, Pécs, 2005.

7. Zs. Rozmer, P. Perjési: Application of deoxyribose degradation to assess hydroxyl

radical scavanger activity of chalcones and cyclic chalcone analogues.

8th

Symposium on Instrumental Analysis, Graz, 2005.

8. Zs. Rozmer, T. Berki, P. Perjési: Cytotoxic effect of chalcone analogues in human

T-cell leukemia.

1st BBBB Conference on Pharmaceutical Sciences, Siófok, 2005.

Előadások

1. Rozmer Zs., Perjési P.: Flavonoidok sejtciklusra gyakorolt hatása,

Magyar Biológiai Társaság Pécsi Csoportja szakülése, Pécs, 2006

2. Rozmer Zs., Berki T., Perjési P.: Gyűrűs kalkonanalógok daganatsejt-toxikus

hatásának vizsgálata, MTA Gyógyszerésztudományi Osztályközi Komplex

Bizottságának ülése, Pécs, 2005

3. Rozmer Zs.: Gyűrűs kalkonanalógok citotoxicitásának és citoprotektív hatásának

vizsgálata. VII. Clauder Otto Emlékverseny, Visegrád, 2004

89

IX. Köszönetnyilvánítás

Ezúton szeretném köszönetemet kifejezni mindazoknak, akik az elmúlt évek során

segítették a munkámat.

Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Perjési Pál Professzor Úrnak, hogy

szakmai tevékenységemet mindvégig figyelemmel kísérte, kutató munkámat irányította

és segítette. Köszönöm Dr. Gregus Zoltán Professzor Úrnak szakmai tanácsait,

disszertációm gondos átolvasását, és hogy kutatómunkámat az általa vezetett Ph.D.

program keretein belül végezhettem.

Szeretnék köszönetet mondani Dr. Berki Tímea Professzor Asszonynak, hogy

lehetőséget biztosított a sejtkezelések és áramlásos citometriai kísérletek elvégzésére az

Immunológiai és Biotechnológiai Intézetben, valamint köszönöm segítségét a kísérletek

megtervezésében és elvégzésében, szakmai és személyes tanácsait. Az intézetben

dolgozó asszisztenseknek külön köszönöm a sejtek előkészítésében nyújtott

segítségüket.

Köszönöm Dr. Maász Gábornak a tömegspektrometriás mérésekben nyújtott

segítségét.

Köszönöm Takácsné Dr. Novák Krisztina Professzor Asszonynak a logP

meghatározás módszerének elsajátításában nyújtott segítségét, valamint személyes

példamutatását. A kooperációban végzett munkáért köszönetemet szeretném kifejezni a

a kassai P. J. Šafarik Egyetem Orvosi Kémiai és Biokémiai Intézet munkatársainak.

Köszönettel tartozom kollégáimnak szakmai tanácsaikért, valamint baráti

támogatásukért. Köszönöm a Gyógyszerészi Kémiai Intézet minden munkatársának az

évek során nyújtott segítségét.

Végül köszönöm barátaim biztatását, családom támogatását, megértő türelmét és

mindazt a szeretetet, amit tőlük kaptam.