HER2 IQFISH pharmDx™

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 1/61

HER2 IQFISH pharmDx™ Kodas K5731

3-a laida

HER2 IQFISH pharmDx™ yra tiesioginis fluorescencinis in situ hibridizacijos (FISH) tyrimas, kuriuo kiekybiškai nustatomas HER2 genų stiprinimas formalinu fiksuotuose, į parafiną įlietuose (FFPE) krūties v÷žio audinių m÷giniuose bei FFPE m÷giniuose, paimtuose iš pacientų, turinčių pilvo, tame tarpe ir skrandžio-stempl÷s jungties, adenokarcinomą.

Šis tyrimas atliekamas papildomai su HercepTest™ testu tirti pacientus, kuriems numatoma skirti gydymą Herceptin™.

Rinkinyje esančių reagentų pakanka 20 tyrimų atlikti.

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 2/61

Turinys Psl.

Paskirtis................................................................................................................ 4

Santrauka ir paaiškinimas - krūtis......................................................................... 5

Procedūros principas - krūtis ................................................................................ 5

Reagentai - krūtis ................................................................................................. 5

Suteikiamos medžiagos ................................................................................... 5

Reikalingos, tačiau nepateikiamos medžiagos................................................. 7

Atsargumo priemon÷s - krūtis............................................................................... 7

Laikymo sąlygos - krūtis ..................................................................................... 10

M÷ginio paruošimas - krūtis................................................................................ 10

Į parafiną įlieti pjūviai ...................................................................................... 10

NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS - krūtis ............................................................... 12

A. Reagentų paruošimas - krūtis ........................................................................ 12

A.1 Pirminio apdorojimo tirpalas..................................................................... 12

A.2 Stiprus plovimo buferinis tirpalas ............................................................. 12

A.3 Plovimo buferinis tirpalas ......................................................................... 12

A.4 Apdorojimo etanoliu seka......................................................................... 12

A.5 Pepsino tirpalas ....................................................................................... 12

B. Dažymo procedūra - krūtis ............................................................................. 13

B.1 Procedūros pastabos ............................................................................... 13

B.2 Audinių apdorojimas prieš dažymą .......................................................... 13

B.3 Dažymo protokolas .................................................................................. 14

Kokyb÷s kontrol÷ - krūtis .................................................................................... 17

Dažymo rezultatų interpretavimas - krūtis .......................................................... 17

Apribojimai - krūtis .............................................................................................. 19

Veikimo charakteristikos - krūtis ......................................................................... 19

Analitinis jautrumas ........................................................................................ 19

Analitinis specifiškumas ................................................................................. 19

Atsparumo tyrimas ......................................................................................... 19

Kartojimasis.................................................................................................... 21

Atkuriamumas ................................................................................................ 21

Klinikinis naudingumas................................................................................... 21

Trikčių šalinimas - krūtis ..................................................................................... 25

1 priedas - krūtis ................................................................................................. 27

2 priedas - krūtis ................................................................................................. 29

3 priedas - krūtis ................................................................................................. 30

Santrauka ir paaiškinimas - skrandis .................................................................. 31

Procedūros principas - skrandis ......................................................................... 31

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 3/61

Reagentai - skrandis........................................................................................... 31

Suteikiamos medžiagos ................................................................................. 31

Reikalingos, tačiau nepateikiamos medžiagos............................................... 33

Mikroskopo įranga ir priedai ........................................................................... 33

Atsargumo priemon÷s - skrandis ........................................................................ 33

Laikymo sąlygos - skrandis ................................................................................ 36

M÷ginio paruošimas - skrandis........................................................................... 36

Į parafiną įlieti pjūviai ...................................................................................... 37

NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS - skrandis .......................................................... 38

A. Reagentų paruošimas - skrandis.................................................................... 38

A.1 Pirminio apdorojimo tirpalas..................................................................... 38

A.2 Stiprus plovimo buferinis tirpalas ............................................................. 38

A.3 Plovimo buferinis tirpalas ......................................................................... 38

A.4 Apdorojimo etanoliu seka......................................................................... 38

A.5 Pepsino tirpalas ....................................................................................... 38

B. Dažymo procedūra - skrandis ........................................................................ 38

B.1 Procedūros pastabos ............................................................................... 38

B.2 Audinių apdorojimas prieš dažymą .......................................................... 39

B.3 Dažymo protokolas .................................................................................. 40

Kokyb÷s kontrol÷ - skrandis ............................................................................... 43

Dažymo procedūros interpretavimas – skrandis................................................. 43

Apribojimai - skrandis ......................................................................................... 45

Veikimo charakteristika - skrandis ...................................................................... 46

Analitinis jautrumas ........................................................................................ 47

Analitinis specifiškumas ................................................................................. 47

Atsparumo tyrimas ......................................................................................... 48

Kartojimasis.................................................................................................... 49

Atkuriamumas ................................................................................................ 49

Klinikinis naudingumas................................................................................... 50

Trikčių šalinimas - skrandis ................................................................................ 51

4 priedas - skrandis ............................................................................................ 53




Literatūra ............................................................................................................ 59

Simbolių paaiškinimas ........................................................................................ 61

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 4/61

Paskirtis Skirta in vitro diagnostikos tyrimams atlikti.

HER2 IQFISH pharmDx™ yra tiesioginis fluorescencinis in situ hibridizacijos (FISH) tyrimas, kuriuo kiekybiškai nustatomas HER2 genų stiprinimas formalinu fiksuotuose, parafine įlietuose (FFPE) krūties v÷žio audinių m÷giniuose ir FFPE m÷giniuose iš pacientų, turinčių pilvo, tame tarpe ir skrandžio-stempl÷s jungties, adenokarcinomą. HER2 IQFISH pharmDx™ naudojamas papildomai su HercepTest™ testu vertinti pacientus, kuriems numatoma skirti gydymą Herceptin™ (trastuzumabu) (žr. Herceptin™ pakuot÷s lapelį).

Pacientams, sergantiems krūties v÷žiu, rezultatai, gauti iš HER2 IQFISH pharmDx™, yra naudojami kaip papildoma klinikin÷ patologin÷ informacija, reikalinga pacientų, sergančių II stadijos krūties v÷žiu, esant teigiamai limfmazgių reakcijai, prognozei įvertinti. Šiame dokumente skrandžio (įskaitant skrandžio ir stempl÷s jungtį) adenokarcinoma taip pat yra vadinama skrandžio v÷žiu. Apie taikymą krūties v÷žiui žr. 5−30 puslapius. Apie taikymą skrandžio v÷žiui žr. 30−58 puslapius. Svarbu: atkreipkite d ÷mes į į krūties v ÷žio audinio ir skrandžio v ÷žio audinio skirtumus, ypač interpretuojant dažytus pj ūvius.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 5/61

Santrauka ir paaiškinimas - kr ūtis Žmogaus HER2 genas (dar žinomas kaip ERBB2 arba NEU) yra 17 chromosomoje ir koduoja HER2 baltymą arba p185HER2. HER2 baltymas yra membranos receptorin÷ tirozino kinaz÷, homologiška epidermio augimo faktoriaus receptoriui (EGFR arba HER1) (1-2). Kiekvienoje normalioje diploidin÷je ląstel÷je yra 2 HER2 geno kopijos.

Dalies pacientų, sergančių krūties v÷žiu, HER2 genas yra sustipr÷jęs, tai yra piktybinio transformavimosi proceso ir naviko progresavimo dalis (3-8). Sustipr÷jus HER2 genui paprastai padid÷ja HER2 baltymo raiška krūties v÷žio ląstelių paviršiuje (9).

Sustipr÷jęs HER2 genas ir (arba) padid÷jusi jo baltymo raiška pasireišk÷ 25–30 % krūties v÷žio atvejų. Šis padid÷jimas siejamas su prasta prognoze, padid÷jusia pasikartojimo rizika ir mažesniu bendru išgyvenimo lygiu. Kai kurie tyrimai parod÷, kad HER2 būsena koreliuoja su jautrumu arba atsparumu tam tikriems chemoterapijos režimams (10).

Stiprus HER2 baltymo raiškos padid÷jimas arba HER2 geno sustipr÷jimas yra svarbus faktorius pradedant gydymą monokloniniu HER2 baltymo antikūnu Herceptin™. Klinikiniai tyrimai parod÷, kad pacientams, kurių auglių HER2 baltymo raiška ir (arba) HER2 geno stiprinimas labai padid÷jęs, didžiausią teigiamą poveikį turi preparatas Herceptin™ (11).

Proced ūros principas - kr ūtis HER2 IQFISH pharmDx™ turi visus pagrindinius reagentus, reikalingus atlikti FISH procedūrą su formalinu fiksuotais, į parafiną įlietais audinių pjūvio m÷giniais.

Po deparafinizavimo ir rehidratavimo m÷giniai kaitinami pirminio apdorojimo tirpale, v÷liau atliekamas proteolitinis suskaidymas naudojant pepsiną. Po kaitinimo ir proteolitinio pradinio apdorojimo etapų šis rinkinys naudoja nenuodingą, paruoštą naudoti IQISH zondų mišinį, paremtą PNA (peptidų nukleino rūgštis) (12) ir DNR technologijų kombinacija. Šį zondų mišinį sudaro Texas Red pažym÷ti DNR zondai, apimantys 218 kb sritį su HER2 genu 17 chromosomoje, ir fluoresceinu pažym÷ti PNA zondai, skirti centromerinei 17 chromosomos (CEN-17) sričiai. Specifin÷ dviejų taikinių hibridizacija lemia skirtingų raudonų fluorescencinių signalų susiformavimą kiekvieno HER2 geno lokuse ir skirtingų žalių fluorescencinių signalų susiformavimą kiekvienos 17 chromosomos centromeroje. Atlikus plovimą stipriu plovimo tirpalu, m÷giniai užpilami fluorescencin÷ ruošimo terp÷, kurioje yra DAPI, ir uždengiami dengiamaisiais stikleliais. Naudojant fluorescencinį mikroskopą, turintį tinkamus filtrus (žiūr÷kite 3 priedą), aptinkamos auglio ląstel÷s ir registruojami raudoni (HER2) bei žali (CEN-17) signalai. Tada apskaičiuojamas HER2/CEN-17 santykis. Normalios ląstel÷s analizuojamame audinio pjūvyje veikia kaip vidin÷ teigiama pradinio apdorojimo ir hibridizacijos efektyvumo kontrolin÷ medžiaga. Išsamesn÷s informacijos rasite skirsnyje „Dažymo interpretavimas“.

Nor÷dami mokytis interaktyviai nuotoliniu būdu naudokit÷s HER2 IQFISH pharmDx™ elektroninio mokymosi programa, skirta suteikti tikslių ir greitų žinių laboratorijų darbuotojams, patologams ir mokslininkams, kaip pasiekti maksimalių rezultatų naudojant HER2 IQFISH pharmDx™: www.dako.com

Reagentai - kr ūtis

Suteikiamos medžiagos Toliau išvardytų medžiagų pakanka 20-čiai testų (testas yra apibr÷žiamas kaip viena 22 mm x 22 mm tiriama sritis). Testų skaičius pagrįstas 250 µL stikleliui iš 2A buteliuko (5–8 lašai), 10 µL stikleliui iš 3 buteliuko ir 15 µL stikleliui iš 5 buteliuko naudojimu. 3 ir 5 buteliukuose esantys tirpalai yra klampūs, juos gali tekti trumpai centrifuguoti mikrocentrifugoje, kad būtų galima panaudoti visus pateiktus reagentus.

Rinkinyje pateiktų medžiagų pakanka 10-čiai individualių dažymo ciklų (keturiems atskiriems ciklams, jei naudojamas pepsino imersijos metodas).HER2 IQFISH pharmDx™ pristatomas ant sauso ledo. Norint įsitikinti, ar rinkinio komponentai transportuojant nebuvo paveikti aukštos

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 6/61

temperat ūros, b ūtina pasiži ūr÷ti, ar yra lik ę sausojo ledo . Atkreipkite d÷mesį, kad kai kurie rinkinio komponentai gali likti nesušalę, tai netur÷s įtakos HER2 IQFISH pharmDx™ veiksmingumui.

1 buteliukas

Pirminio apdorojimo tirpalas (20x) 150 mL, koncentruotas 20x MES (2-[N-morfolin]etansulfonrūgšties) buferinis tirpalas.

2A buteliukas

2B buteliukas

Pepsinas 4 x 6,0 mL, paruoštas naudoti Pepsino tirpalas, pH 2,0; yra stabilizatoriaus ir antimikrobin÷s medžiagos.

Pepsino skiediklis (10x) 24 mL, koncentruotas 10x Skiedimo buferinis tirpalas, pH 2,0; yra antimikrobin÷s medžiagos.

3 buteliukas HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinys 0,2 mL, paruoštas naudoti Texas Red pažym÷tų HER2 DNR zondų mišinys ir fluoresceinu pažym÷ti CEN-17 PNA zondai; tiekiami IQISH hibridizacijos buferiniame tirpale.

4 buteliukas Stiprus plovimo buferinis tirpalas (20x) 150 mL, koncentruotas 20x SSC (fiziologinis tirpalas-natrio citratas) buferinis tirpalas su detergentu (Tween-20).

5 buteliukas Fluorescencijos ruošimo terp ÷ 0,4 mL, paruoštas naudoti Fluorescencijos ruošimo terp÷ su 500 µg/L DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindolo).

6 buteliukas Plovimo buferinis tirpalas (20x) 500 mL, koncentruotas 20x Tris/HCl buferinis tirpalas.

Dengiam ųjų stikleli ų sandariklis 1 m÷gintuv÷lis, paruoštas naudoti Tirpalas, skirtas nuimti sandariklį nuo dengiamųjų stiklelių.

PASTABA: šie rinkinio reagentai: Išankstinio apdorojimo tirpalas (20x), pepsinas, pepsino skiediklis (10x), stipraus plovimo buferinis tirpalas (20x), fluorescencijos ruošimo terp÷, plovimo buferinis tirpalas (20x) ir dengiamųjų stiklelių sandariklis gali būti sukeičiami su atitinkamais reagentais iš „Dako Histology FISH Accessory Kit“ rinkinio, kodas K5799.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 7/61

Reikalingos, ta čiau nepateikiamos medžiagos Laboratorijos reagentai Distiliuotas arba dejonizuotas vanduo Etanolis, 96 % Ksilenas arba ksileno pakaitalai

Laboratorijos įranga Sugeriančios servet÷l÷s Reguliuojamos pipet÷s Kalibruotas iš dalies įmerkiamas termometras (diapazonas 37–100 °C) Kalibruotas paviršiaus termometras (diapazonas 37–100 °C)

Dengiamieji stikleliai (22 mm x 22 mm) Žnypl÷s Garų gaubtas „Dako Hybridizer“ (Kodas S2450/S2451)* Kaitinimo blokas arba hibridizacijos krosnis* Dr÷gnos hibridizacijos kamera* Mikrocentrifuga Stikleliai, „Dako Silanized Slides“, kodas S3003, arba poli-L-lizinu dengti stikleliai (žiūr÷kite „Bandinių ruošimas“) Dažymo indai ar vonel÷s Laikmatis (veikiantis 2–15 minučių intervalais) Sūkurin÷ maišykl÷ Vandens vonel÷ su pakeliamu dangčiu (galinti palaikyti 37 (±2) °C, 63 (±2) °C ir nuo 95 °C iki 99 °C) Mikrobangų krosnel÷ su jutiklio galimybe, jeigu pradinis apdorojimas atliekamas naudojant mikrobangų krosnelę (žiūr÷kite B3. „Dažymo protokolas“. 1 etapas: pirminis apdorojimas, B metodas)

* Kaitinimo blokas arba hibridizacijos krosnel÷, skirti denatūruoti (66 (±1) °C) ir hibridizuoti (45 (± 2) °C), k artu su dr÷gm÷s kamera gali būti naudojami kaip „Dako Hybridizer“ alternatyva.

Mikroskopo įranga ir priedai Fluorescencinio mikroskopo filtrai: DAPI ir FITC / „Texas Red“ dvigubas filtras arba FITC ir „Texas Red“ viengubi filtrai; išsamiau žiūr÷kite 3 priedą.

Tur÷tų būti naudojamas fluorescencinis mikroskopas su 100 vatų gyvsidabrio lempa kaip šviesos šaltiniu. Kiti šviesos šaltiniai nerekomenduojami, naudojant šiuos filtrus.

Mikroskopo stiklelių aplankas (20 stiklelių kartoninis d÷klas su lankstiniu dangteliu arba panašus)

Atsargumo priemon ÷s - krūtis 1. Skirta in vitro diagnostikos tyrimams. 2. Skirta naudoti profesionalams. 3. 1 buteliuke, Pre-Treatment Solution (20x), nereikia žym÷ti pavojaus etiket÷mis. Pareikalavus

profesionaliems naudotojams bus pateiktas saugos duomenų lapas. 4. 2A buteliuke, Pepsin, yra ≥5-<10% propan-2-ol, ≥0.1-<0.3% pepsin A ir ≥0.011-<0.1% 5-

chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one ir 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. 2A buteliuke yra pažym÷tas etikete:

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 8/61

Pavojinga H314 Smarkiai nudegina odą ir pažeidžia akis. H317 Gali sukelti alerginę odos reakciją. P280 Mūv÷ti apsaugines pirštines / d÷v÷ti apsauginius drabužius /

naudoti akių (veido) apsaugos priemones. P304 + P340 + P310 ĮKVöPUS: Išnešti nukent÷jusįjį į gryną orą; jam būtina

patogi pad÷tis, leidžianti laisvai kv÷puoti. Nedelsiant skambinti į APSINUODIJIMŲ KONTROLöS IR INFORMACIJOS BIURĄ/kreiptis į gydytoją.

P301 + P310 + P331 PRARIJUS: Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico. NESKATINTI v÷mimo.

P303 + P361 + P353 + P310

PATEKUS ANT ODOS (arba plaukų): Nedelsiant nuvilkti visus užterštus drabužius. Odą nuplauti vandeniu/čiurkšle. Nedelsiant skambinti į APSINUODIJIMŲ KONTROLöS IR INFORMACIJOS BIURĄ/kreiptis į gydytoją.

P305 + P310 PATEKUS Į AKIS: Nedelsiant skambinti į APSINUODIJIMŲ KONTROLöS IR INFORMACIJOS BIURĄ/kreiptis į gydytoją.

P405 Laikyti užrakintą. P501 Turinį ir talpyklą išmesti laikantis visų vietos, regioninių,

nacionalinių ir tarptautinių taisyklių.

5. 2B buteliuke, Pepsin Diluent (10x), yra ≥50-<75% propan-2-ol ir ≥5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. 2B buteliuke yra pažym÷tas etikete:

Pavojinga H225 Labai degūs skystis ir garai. H319 Sukelia smarkų akių dirginimą. H336 Gali sukelti mieguistumą arba galvos svaigimą. P280 Mūv÷ti apsaugines pirštines. Naudoti akių ar veido

apsaugos priemones. P210 Laikyti atokiau nuo šilumos šaltinių, karštų paviršių, žiežirbų,

atviros liepsnos arba kitų degimo šaltinių. Nerūkyti. P241 Naudoti sprogimui atsparią elektros, ventiliacijos, apšvietimo

ir visų medžiagų tvarkymo įrangą. P304 + P340 ĮKVöPUS: Išnešti nukent÷jusįjį į gryną orą; jam būtina

patogi pad÷tis, leidžianti laisvai kv÷puoti. P303 + P361 + P353 PATEKUS ANT ODOS (arba plaukų): Nedelsiant nuvilkti

visus užterštus drabužius. Odą nuplauti vandeniu/čiurkšle. P235 Laikyti v÷sioje vietoje. P501 Turinį ir talpyklą išmesti laikantis visų vietos, regioninių,

nacionalinių ir tarptautinių taisyklių. 6. 3 buteliuke, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, yra ≥10-<25% ethylene carbonate ir ≥3-<5%

sodium chloride. 3 yra pažym÷tas etikete:

Atsargiai H319 Sukelia smarkų akių dirginimą. P280 Naudoti akių ar veido apsaugos priemones. P264 Po naudojimo kruopščiai nusiplaukite rankas. P305 + P351 + P338 PATEKUS Į AKIS: Atsargiai plauti vandeniu kelias minutes.

Išimti kontaktinius lęšius, jeigu jie yra ir jeigu lengvai galima tai

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 9/61

padaryti. Toliau plauti akis. 7. 4 buteliuke, Stringent Wash Buffer (20x), yra ≥10-<25% sodium chloride ir ≥10-<20% 2-

amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. 4 buteliuke yra pažym÷tas etikete:

Atsargiai H319 Sukelia smarkų akių dirginimą. H315 Działa draŜniąco na skórę. P280 Mūv÷ti apsaugines pirštines. Naudoti akių ar veido

apsaugos priemones. P264 Po naudojimo kruopščiai nusiplaukite rankas. P305 + P351 + P338 PATEKUS Į AKIS: Atsargiai plauti vandeniu kelias minutes.

Išimti kontaktinius lęšius, jeigu jie yra ir jeigu lengvai galima tai padaryti. Toliau plauti akis.

8. 6 buteliuke, Wash Buffer (20x) yra ≥10-<25% sodium chloride ir ≥10-<20% trometamolio. 6 buteliuke yra pažym÷tas etikete:




9. Coverslip Sealant, yra 100 % šviesiojo hidrogryninto pirminio benzino (naftos) ir jis pažym÷tas etikete:

Pavojinga H225 Labai degūs skystis ir garai. H304 Prarijus ir patekus į kv÷pavimo takus, gali sukelti mirtį. H411 Toksiška vandens organizmams, sukelia ilgalaikius

pakitimus. P280 Mūv÷ti apsaugines pirštines. Naudoti akių ar veido



ir visų medžiagų tvarkymo įrangą. P273 Saugoti, kad nepatektų į aplinką. P301 + P310 + P331 PRARIJUS: Nedelsiant skambinti į APSINUODIJIMŲ

KONTROLöS IR INFORMACIJOS BIURĄ/kreiptis į gydytoją. NESKATINTI v÷mimo.

P303 + P361 + P353 PATEKUS ANT ODOS (arba plaukų): Nedelsiant nuvilkti visus užterštus drabužius. Odą nuplauti vandeniu/čiurkšle.

P235 Laikyti v÷sioje vietoje. P501 Turinį ir talpyklą išmesti laikantis visų vietos, regioninių,

nacionalinių ir tarptautinių taisyklių.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 10/61

10. Prieš ir po fiksavimo elkit÷s su m÷giniais bei su visomis naudojamomis medžiagomis kaip su užkrečiamomis medžiagomis ir utilizuokite laikydamiesi tinkamų atsargumo priemonių (16). Niekada nevarvinkite reagento su burna, venkite oda ir gleivine prisiliesti prie reagentų ir m÷ginių. Jeigu reagentai prisiliečia prie jautrių vietų, nuplaukite gausiu vandens kiekiu.

11. Kiek įmanoma sumažinkite reagentų mikrobinę taršą, kad išvengtum÷te klaidingų rezultatų. 12. Taikant kitas, nei nurodytos, inkubavimo trukmes, temperatūras ar metodus, gali būti gauti

klaidingi rezultatai. 13. Skirtingas, nei nurodyta, audinių fiksavimo metodas ir m÷ginio storis gali tur÷ti įtakos audinio

morfologijai ir (arba) signalo intensyvumui. 14. Saugokite HER2/CEN-17 IQFISH zondų mišinį nuo išgaravimo hibridizacijos metu,

užtikrindami pakankamą dr÷gmę hibridizacijos kameroje. 15. Reagentai yra optimaliai atskiesti. Daugiau atskiedus gali sumaž÷ti efektyvumas. 16. D÷v÷kite atitinkamas asmenines apsaugos priemones, kad išvengtum÷te sąlyčio su akimis ir

oda. Papildomos informacijos žr. medžiagos saugos duomenų lape (SDL). 17. Dirbant pepsino imersijos būdu turi būti naudojami tik švarūs dažymo indai (2 etapas,

C metodas).

Laikymo s ąlygos - kr ūtis Laikykite HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinį (3 buteliukas) -18 °C temperat ūroje tamsioje vietoje. Kitus reagentus galima laikyti 2–8 °C temperat ūroje tamsioje vietoje. Visus reagentus galima laikyti užšaldytus. Reagentų užšaldymas ir atšildymas iki 10 kartų neturi įtakos veiksmingumui.

Pepsiną, HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinį ir fluorescencijos ruošimo terpę (2A, 3 ir 5 buteliukai) gali neigiamai paveikti per didelis karštis. Nepalikite šių komponentų kambario temperatūroje.

HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinį ir fluorescencijos ruošimo terpę (3 ir 5 buteliukai) gali neigiamai paveikti per intensyvi šviesa. Nelaikykite šių komponentų ir neatlikite analiz÷s stiprioje šviesoje, pvz., tiesioginiuose saul÷s spinduliuose.

Nenaudokite rinkinio pasibaigus tinkamumo laikui, kuris nurodytas ant pakuot÷s d÷žut÷s. Jei reagentai laikomi kitokiomis sąlygomis, nei nurodyta informaciniame lapelyje, vartotojas privalo patikrinti reagento efektyvumą (14).

Aiškių šio preparato nestabilumą rodančių požymių n÷ra. Tod÷l svarbu įvertinti normalias ląsteles analizuojamame audinio pjūvyje. Pasteb÷jus netik÷tą fluorescencijos pobūdį, kurio negalima paaiškinti laboratorinių procedūrų pokyčiais, ir įtarus, kad problema susijusi su HER2 IQFISH pharmDx™, kreipkit÷s į Dako technin÷s pagalbos tarnybą.

M÷ginio paruošimas - kr ūtis Biopsijos, ekscizijos arba rezekcijos m÷giniai turi būti apdoroti apsaugant audinius FISH analizei atlikti. Standartinis audinių apdorojimo metodas imunocitocheminiam dažymui turi būti atliekamas visiems m÷giniams (15).

Į parafin ą įlieti pj ūviai Tik neutraliame buferiniame formaline saugomi ir parafine įlieti audiniai yra tinkami naudoti. Pavyzdžiui, m÷giniai turi būti suskirstyti 3 arba 4 mm gabaliukais ir fiksuojami 18–24 valandas neutraliame buferintame formaline. Tada audiniai dehidratuojami laipsniškai skiedžiamo etanolio ir ksileno seka, po to įterpiami į išlydytą parafiną, kuris laikomas ne didesn÷je nei 60 °C temperatūroje. Tinkamai fiksuotus ir įlietus audinius galima laikyti neribotą laiką prieš pjūvio darymą ir tvirtinimą ant objektinio stiklelio, jei jie laikomi v÷sioje vietoje (15–25 °C) (15-16). Kiti fiksatyvai n÷ra tinkami.

Audinio m÷giniai turi būti pjaustomi 4–6 µm pjūviais.

Stikleliai, kurių reikia HER2 geno stiprinimui įvertinti ir patvirtinti naviko buvimą, turi būti paruošiami tuo pačiu metu. Rekomenduojama atlikti mažiausiai 2 serijinius pjūvius, 1 pjūvį naviko buvimui nustatyti, nudažytą hematoksilinu ir eozinu (H&E dažymas), ir pjūvį HER2 geno stiprinimo analizei.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 11/61

Rekomenduojama, kad audinių pjūviai būtų ruošiami ant „Dako Silanized Slides“ (kodas S3003) arba poli-L-lizinu dengtų stiklelių. M÷giniai turi būti analizuojami per 4–6 m÷nesius nuo pjūvio pa÷mimo, kai laikomi kambario temperatūroje (20–25 °C).

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 12/61

NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS - kr ūtis

A. Reagent ų paruošimas - kr ūtis Prieš dažant patogu pasiruošti toliau nurodytus reagentus:

A.1 Pirminio apdorojimo tirpalas 1 buteliuke gali susiformuoti kristalai, bet jie ištirps kambario temperatūroje. Prieš ruošdami reagentą įsitikinkite, kad n÷ra kristalų. Atskieskite pakankamą kiekį iš 1 buteliuko (pirminio apdorojimo tirpalas 20x) skiesdami koncentratą santykiu 1:20 distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu. Nepanaudotas atskiestas tirpalas gali būti laikomas vieną m÷nesį 2–8 °C temperat ūroje. Išmeskite atskiestą tirpalą, jei yra drumzlių.

A.2 Stiprus plovimo buferinis tirpalas Atskieskite pakankamą kiekį iš 4 buteliuko (stiprus plovimo buferinis tirpalas 20x), skiesdami koncentratą santykiu 1:20 distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu. Nepanaudotas atskiestas buferinis tirpalas gali būti laikomas vieną m÷nesį 2–8 °C temperat ūroje. Išmeskite atskiestą buferinį tirpalą, jei yra drumzlių.

A.3 Plovimo buferinis tirpalas Atskieskite pakankamą kiekį iš 6 buteliuko (plovimo buferinis tirpalas 20x), skiesdami koncentratą santykiu 1:20 distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu. Nepanaudotas atskiestas buferinis tirpalas gali būti laikomas vieną m÷nesį 2–8 °C temperat ūroje. Išmeskite atskiestą buferinį tirpalą, jei yra drumzlių.

A.4 Apdorojimo etanoliu seka Iš 96 % etanolio tirpalo paruoškite 3 indelius atitinkamai su 70 %, 85 % ir 96 % etanoliu. Laikykite uždengtus indelius kambario temperatūroje arba 2–8 °C temperat ūroje ir naudokite ne daugiau kaip 200 stiklelių. Jei tirpalai drumzlini, juos išmeskite.

A.5 Pepsino tirpalas

Pepsino tirpalas reikalingas tik naudojant panardinimo į pepsino tirpalą metodą (C metodą).

Paruoškite pepsino tirpalą, kaip nurodyta toliau:

Talpykl÷je, kurioje telpa šeši stikleliai, paruoškite 60 mL pepsino tirpalo:

Įpilkite 48 mL kambario temperatūros (20–25 °C) distiliuoto arba dejonizuoto vandens į talpyklę.

Įpilkite 6 mL šalto (2–8 °C) pepsino skiediklio (10x ) (2B buteliukas) į talpyklę.

Įpilkite 6 mL šalto (2–8 °C) pepsino (2A buteliukas) į talpyklę.

Užd÷kite dangtelį ant talpykl÷s ir nustatykite pepsino tirpalo temperatūrą 37 (± 2) °C vandens vonel ÷je.

Talpykl÷je, kurioje telpa 24 stikleliai, paruoškite 240 mL pepsino tirpalo:

Įpilkite 192 mL kambario temperatūros (20–25 °C) distiliuoto arba dejonizuoto vandens į talpyklę.

Įpilkite 24 mL šalto (2–8 °C) pepsino skiediklio (10 x) (2B buteliukas) į talpyklę.

Įpilkite 24 mL šalto (2–8 °C) pepsino (2A buteliukas ) į talpyklę.

Užd÷kite dangtelį ant talpykl÷s ir nustatykite pepsino tirpalo temperatūrą 37 (± 2) °C vandens vonel ÷je.

Nusistov÷jusį pepsino tirpalą reikia sunaudoti per 5 valandas.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 13/61

B. Dažymo proced ūra - krūtis

B.1 Proced ūros pastabos Prieš naudodamas naudotojas turi atidžiai perskaityti šias instrukcijas ir susipažinti su visais komponentais (žr. „Atsargumo priemon÷s“).

Visų reagentų temperatūra prieš naudojimą turi pasiekti atitinkamą temperatūrą, kaip aprašyta toliau.

1 buteliukas: atskiestas pirminio apdorojimo tirpalas turi būti sušildomas iki 95–99 °C, jeigu pradiniam apdorojimui naudojama vandens vonel÷ (B3. Dažymo protokolas, 1 etapas: pirminis apdorojimas, A metodas). Jei atliekant pirminį apdorojimą naudojama mikrobangų krosnel÷ su jutiklio galimybe (B3. Dažymo protokolas, 1 etapas: pirminis apdorojimas, B metodas), atskiestas pirminio apdorojimo tirpalas turi būti sušildomas iki kambario temperatūros 20–25 °C . 2A buteliukas: pepsinas tur÷tų būti naudojamas 2–8 °C temperatūroje (B3, Dažymo protokolas, 2 etapas: A ir B metodai) ir visą laiką laikomas šaltai. 2B buteliukas: pepsino skiediklis (10x) turi būti naudojamas 2–8 °C temperatūroje (B3, Dažymo protokolas, 2 žingsnis C metodas). 3 buteliukas: HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinys, laikomas -18 °C temperat ūroje, skyla į dvi fazes. Prieš naudodami 3 buteliuką, šildydami zondų mišinį iki kambario temperatūros (20–25 °C ), įsitikinkite, kad yra viena faz÷, po to atliekamas maišymas. Šildykite 3 buteliuką kambario temperatūroje (20–25 °C) daugiausiai 30 minu čių (saugokite nuo stiprios šviesos), po to kruopščiai maišykite indelį 15 sekundžių sūkurin÷je maišykl÷je 2500 aps./min. greičiu. Iš karto po naudojimo laikykite 3 buteliuką -18 °C temperat ūroje. 4 buteliukas: atskiestas stiprus plovimo buferinis tirpalas; prieš naudojimą vienas indas turi būti sušildytas iki kambario temperatūros, kitas indas turi būti sušildytas iki 63 (±2) °C . 5 buteliukas: Fluorescencijos ruošimo terp÷ gali būti naudojama esant 2–25 °C temperat ūrai. 6 buteliukas: atskiestas plovimo buferinis tirpalas turi būti sušildomas iki kambario temperatūros 20–25 °C.

Dengiam ųjų stikleli ų sandariklis gali būti naudojamas 2–25 °C temperatūros diapazone. Visi etapai turi b ūti atliekami laikantis nurodyt ų temperat ūrų. Procedūrą sudaro tam tikras skaičius dehidracijų, po kurių atliekamas audinių pjūvių džiovinimas. Prieš pereidami prie kito etapo įsitikinkite, kad audinių pjūviai yra visiškai sausi. Neleiskite audinių pjūviams išdžiūti kitų procedūrų etapų metu. Jeigu dažymo procedūra turi būti pertraukta, stikleliai atlikus deparafinizavimą gali būti laikomi plovimo buferiniame tirpale iki 1 valandos kambario temperatūroje (20–25 °C) be poveikio rezultatams.

B.2 Audini ų apdorojimas prieš dažym ą

Deparafinizavimas ir rehidratavimas: prieš atliekant analizę, stikleliai su audiniu turi būti deparafinizuoti fiksavimo priemonei pašalinti ir redihidratacijai atlikti. Steb÷kite, kad būtų pašalintas visas parafinas. D÷l įliejimo terp÷s likučių gali sustipr÷ti nespecifinis dažymasis. Šis etapas turi būti atliekamas (20–25 °C) kambario temperat ūroje. 1. Sud÷kite stiklelius į ksileno vonelę ir inkubuokite 5 (±1) minutes. Pakeiskite voneles ir

pakartokite vieną kartą. 2. Pastuksendami pašalinkite skysčio perteklių ir 2 (±1) minut÷ms stikliukus įd÷kite į 96 % etanolį.

Pakeiskite voneles ir pakartokite vieną kartą. 3. Pastuksendami pašalinkite skysčio perteklių ir 2 (±1) minut÷ms stikliukus įd÷kite į 70 % etanolį.

Pakeiskite voneles ir pakartokite vieną kartą. 4. Pastuksendami pašalinkite skysčio perteklių ir įd÷kite stiklelius į atskiestą plovimo buferinį

tirpalą (žiūr÷kite NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, A.3 skyrius) mažiausiai 2 minut÷ms. Prad÷kite dažymo procedūrą, kaip aprašyta B.3 skyriuje, 1 etape: pirminis apdorojimas.

Ksileno ir spirito tirpalai turi būti keičiami po 200 ar mažiau stiklelių.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 14/61

Gali būti naudojami ksileno pakaitalai.

PASTABA: šiame rinkinyje pateikiami reagentai ir instrukcijos buvo sukurti optimaliam veikimui užtikrinti. Toliau skiedžiant reagentus arba keičiant inkubavimo laiką ar temperatūrą, galima gauti klaidingus arba prieštaringus rezultatus. D÷l naudotojo laboratorijoje esančių audinių apdorojimo ir techninių procedūrų skirtumų galima gauti negaliojančius tyrimo rezultatus.

B.3 Dažymo protokolas

1 etapas: Pirminis apdorojimas Pirminis apdorojimas gali būti atliekamas naudojant vandens vonelę, kaip aprašyta A) metode, arba naudojant mikrobangų krosnelę su jutiklio galimybe, kaip aprašyta B) metode.

A metodas: Pirminis apdorojimas naudojant vandens vonelę

Pripildykite dažymo indus, pvz., Coplin indus, atskiestu pirminio apdorojimo tirpalu (žr. NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, A.1 skyrius). Įd÷kite dažymo indus su atskiestu pirminio apdorojimo tirpalu į vandens vonelę. Pašildykite vandenį vandens vonel÷je ir pirminio apdorojimo tirpalą iki 95–99 °C. Pamatuokite temperat ūrą inde naudodami kalibruotą termometrą, kad įsitikintum÷te, jog temperatūra teisinga. Uždenkite indus dangčiais, kad stabilizuotųsi temperatūra ir išvengtum÷te garavimo.

Panardinkite kambario temperatūroje deparafinizuotus pjūvius į iš anksto pakaitintą pirminio apdorojimo tirpalą, esantį dažymo induose. Dar kartą patikrinkite temperatūrą ir inkubuokite 10 (±1) minučių 95–99 °C temperat ūroje.

Išimkite iš vandens vonel÷s visą indą su stikleliais. Nuimkite dangtelį ir leiskite stikleliams ataušti pirminio apdorojimo tirpale 15 minučių kambario temperatūroje.

Perkelkite stiklelius į indą su atskiestu plovimo buferiniu tirpalu (žiūr÷kite NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, A.3 skyrius) ir palikite 3 minut÷ms kambario temperatūroje (20–25 °C).

Pakeiskite plovimo buferinį tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes.

PASTABA: pirminio apdorojimo tirpalas yra skirtas naudoti tik vieną kartą. Nenaudokite pakartotinai.

B metodas: pirminis apdorojimas naudojant mikrobangų krosnelę su jutiklio galimybe

Užpildykite plastikinį indą atskiestu kambario temperatūros (20–25 °C) pirminio apdorojimo tirpalu. Įmerkite deparafinizuotus pjūvius į pirminio apdorojimo tirpalą, uždenkite indą pradurtu dangteliu ir įd÷kite į mikrobangų krosnelę. Pasirinkite virimo jutiklio funkciją ir užprogramuokite, kad krosnel÷ veiktų 10 minučių po to, kai bus pasiekta virimo temperatūra*.

Po 10 minučių inkubacijos išimkite indą su stikleliais iš krosnel÷s, nuimkite dangtelį ir palikite aušti 15 minučių kambario temperatūroje. Perkelkite stiklelius į indą su atskiestu plovimo buferiniu tirpalu ir palikite mirkti 3 minutes kambario temperatūroje (20–25 °C). Pakeiskite plovimo buferin į tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes.

* Naudoti mikrobangų krosnelę su jutiklio galimybe reiškia, kad krosnel÷ turi tur÷ti jutiklį ir programas, kurios leistų iš pradžių įkaitinti pirminio apdorojimo tirpalą iki virimo temperatūros, o po to palaikyti reikalingą pradinio apdorojimo temperatūrą (virš 95 ºC) skaičiuojant numatytą laiką (10 (±1) minučių). Kai kurie mikrobangų krosnelių modeliai su jutiklio galimybe gali netur÷ti galimyb÷s laisvai nustatyti išsijungimo laiko. Jeigu modelis turi tik iš anksto nustatytas programas, įsitikinkite, kad pasirinkote programą, kuri palaiko reikalingą pradinio apdorojimo temperatūrą (virš 95 ºC) mažiausiai 10 (±1) minučių ir rankiniu būdu sustabdykite programą po 10 (±1) minučių.


2 etapas: Pepsinas, paruoštas naudojimui (PRN), arb a pepsino tirpalas Inkubacija pepsine gali būti atlikta tiesiogiai naudojant PRN pepsino lašus ant stiklelių kambario temperatūroje (20–25 °C) (A metodas) arba esant 37 °C (B metodas). Ar ba stiklelius galima įmerkti į pepsino tirpalą ir inkubuoti 37 (± 2) °C temperat ūroje (C metodas).

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 15/61

A metodas ir B metodas:

Stuksendami pašalinkite buferinio tirpalo perteklių. Naudodami šluostę be pūkų (kaip sugeriančią servet÷lę arba marl÷s tamponą), kruopščiai valykite aplink m÷ginį, pašalindami bet kokį išlikusį skystį, bei laikykite reagentus jiems skirtoje vietoje.

Užlašinkite 5–8 lašus (250 µL) šalto (2–8 °C) pepsi no (2A buteliukas), kad uždengtų m÷ginį. Visada laikykite pepsiną 2–8°C temperat ūroje.

A metodas: Pepsinas, PRN – inkubacijai 20–25 °C tem p. Inkubuokite 5–15 minučių kambario temperatūroje (20–25 °C). 5–15 minu čių inkubacija yra pakankama daugeliui m÷ginių, bet optimalus inkubacijos laikas gali priklausyti nuo audinio fiksavimo ir (arba) m÷ginio storio ir jį turi nustatyti naudotojas. Pastuksenkite, kad nulaš÷tų pepsinas, įmerkite pjūvius į atskiestą plovimo buferinį tirpalą (žiūr÷kite NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, A.3 skyrius) ir palikite 3 minut÷ms kambario temperatūroje (20–25 °C). Pakeiskite atskiestą plovimo buferinį tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes. Tęskite dehidratavimą.

B metodas: Pepsinas, PRN – inkubacijai 37 °C temp. Įd÷kite m÷ginį su pepsinu į 37 °C kaitinimo blok ą – pvz., „Dako Hybridizer“ – ir inkubuokite 3–5 minutes. 3–5 minučių inkubacija yra pakankama daugeliui m÷ginių, bet optimalus inkubacijos laikas gali priklausyti nuo audinio fiksavimo ir (arba) m÷ginio storio ir jį turi nustatyti naudotojas. Pastuksenkite, kad nulaš÷tų pepsinas, įmerkite pjūvius į atskiestą plovimo buferinį tirpalą ir palikite 3 minut÷ms kambario temperatūroje (20–25 °C). Pakeiskite plovimo buferinį tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes. Tęskite dehidratavimą. Audinių pjūviai dehidratuojami palaipsniui etanoliu: 2 minutes 70 % etanolyje, 2 minutes 85 % etanolyje ir 2 minutes 96 % etanolyje. Leiskite audinių pjūviams visiškai išdžiūti ore.

C metodas: pepsino tirpalas – įmerkiant stiklelius į 37 °C temperat ūros pepsino tirpalą Rinkinyje esančių reagentų pakanka keturiems atskiriems partijų tyrimams (60 mL pepsino tirpalo, maža šešių stiklelių talpykl÷) arba vienam tyrimui (240 mL pepsino tirpalo, didel÷ 24 stiklelių talpykl÷) atlikti. Paruoškite pepsino tirpalą, kaip aprašyta A.5 skyriuje. Užd÷kite dangtelį ant talpykl÷s ir nustatykite pepsino tirpalo temperatūrą 37 (± 2) °C vandens vonel÷je. Įsitikinkite, kad temperatūra stabilizavosi. Kalibruotu termometru išmatuokite temperatūrą talpykl÷s viduje, kad užtikrintum÷te tinkamą temperatūrą. Stuksendami pašalinkite plovimo buferinio tirpalo perteklių. Įmerkite stiklelius į 37 (±2) °C pepsino tirpalą ir inkubuokite 20–30 minučių. 20–30 minučių inkubavimo trukm÷s pakanka daugeliui m÷ginių ištirti, bet optimali inkubavimo trukm÷ gali priklausyti nuo audinio fiksavimo ir (arba) m÷ginio storio ir ją turi nustatyti naudotojas. Pastuksenkite, kad nulaš÷tų pepsinas, įmerkite pjūvius į atskiestą plovimo buferinį tirpalą ir palikite 3 minut÷ms kambario temperatūroje (20–25 °C). Pakeiskite plovimo buferinį tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes. Tęskite dehidratavimą. Audinių pjūviai dehidratuojami palaipsniui etanoliu: 2 minutes 70 % etanolyje, 2 minutes 85 % etanolyje ir 2 minutes 96 % etanolyje. Leiskite audinių pjūviams visiškai išdžiūti ore.

3 etapas: HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinys HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinys, laikomas -18 °C temperat ūroje, skyla į dvi fazes. Prieš naudodami 3 buteliuką, šildydami zondų mišinį iki kambario temperatūros (20–25 °C), įsitikinkite, kad yra viena faz÷, po to atliekamas maišymas. Šildykite 3 buteliuką kambario temperatūroje (20–25 °C) daugiausiai 30 minu čių (saugokite nuo stiprios šviesos), po to kruopščiai maišykite indelį 15 sekundžių sūkurin÷je maišykl÷je 2500 aps./min. greičiu. Iš karto po naudojimo laikykite 3 buteliuką -18 °C temperat ūroje. Užlašinkite 10 µL HER2/CEN-17 zondų mišinio (3 buteliukas) ant audinio pjūvio centro. Nedelsdami užd÷kite 22 mm x 22 mm stiklinį dengiamąjį stiklelį ant zondų mišinio ir leiskite jam tolygiai pasiskirstyti po dengiamuoju stikleliu. Venkite oro burbuliukų. Jeigu pastebite oro burbuliukų, atsargiai išspauskite juos iš audinio žnypl÷mis.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 16/61

Nepamirškite saugoti 3 buteliuko -18 °C temperat ūroje iš karto po naudojimo.

Užsandarinkite dengiamąjį stiklelį dengiamųjų stiklelių sandarikliu, išspausdami sandariklio kraštus aplink visą stiklelį. Leiskite, kad dengiamųjų stiklelių sandariklis persidengtų su dengiamuoju stikleliu ir stikleliu, taip suformuodamas sandarų tarpą aplink dengiamąjį stiklelį. Įsitikinkite, kad dengiamųjų stiklelių sandariklis uždengia visą dengiamojo stiklelio perimetrą.

Paruoškite „Dako Hybridizer“* (kodas S2450 arba S2451) hibridizacijos ciklui. Įsitikinkite, kad „Humidity Control Strips“ (kodas S2452) yra prisotintos ir optimaliai paruoštos naudoti. Paleiskite „Hybridizer“ ir pasirinkite programą, kuri:

Denatūruotų 66 °C temperat ūroje 10 minučių ir po to hibridizuotų 45 °C temperat ūroje 60–120 minučių.

Pad÷kite stiklelius į „Hybridizer“, įsitikinkite, kad dangtelis yra tinkamai uždarytas ir paleiskite programą. Nor÷dami rasti daugiau informacijos, žr. „Dako Hybridizer“ naudojimo instrukcijų vadovą.

* Prietaisai, kurie leidžia sudaryti sąlygas, panašias į aprašytas anksčiau, gali būti naudojami denatūruoti ir hibridizuoti.

Pad÷kite stiklelį ant plokščio metalinio ar akmeninio paviršiaus (kaitinimo bloko arba ant bloko hibridizacijos krosnel÷je), įkaitinto iki 66 (±1) °C. Denat ūruokite lygiai 10 minučių. Pad÷kite stiklelius į pašildytą dr÷gną hibridizacijos kamerą. Uždenkite kamerą dangčiu ir inkubuokite 45 (± 2) °C temperat ūroje 60–120 minučių. Įsid÷m÷kite, kad 37 °C hibridizacijos temperat ūra netinka naudoti zondams, esantiems šiame rinkinyje.

4 etapas: Plovimas stipriu plovimo tirpalu

Pripildykite du dažymo indus, pvz., Coplin indus, atskiestu stipriu plovimo buferiniu tirpalu (žiūr÷kite NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, A.2 skyrius). Rekomenduojamas mažiausias tūris – 100 mL arba 15 mL kiekvienam stikleliui inde.

Įd÷kite vieną dažymo indų su atskiestu stipriu plovimo buferiniu tirpalu į kambario temperatūros traukos spintą, o kitą – į vandens vonelę. Kaitinkite vandens vonelę ir atskiestą stiprų plovimo buferinį tirpalą iki 63 (±2) °C. Įsitikinkite, kad temperatūra stabilizavosi. Uždenkite indą dangčiu, kad stabilizuotųsi temperatūra ir neleistum÷te garuoti. Pamatuokite temperatūrą vandens vonel÷je esančiame inde naudodami kalibruotą termometrą, kad užtikrintum÷te tinkamą temperatūrą. Stiprus plovimo buferinis tirpalas turi detergento ir 63 °C temperat ūroje gali pasidaryti drumstas; tai netur÷s įtakos jo savyb÷ms.

Naudodami žnyples arba pirštines išimkite stiklelius iš hibridizacijos kameros ir atsargiai nuimkite dengiamųjų stiklelių sandariklį bei dengiamąjį stiklelį ir po vieną sud÷kite stiklelius į kambario temperatūros pirminio plovimo indą.

Kai tik visi dengiamieji stikleliai bus nuimti, perkelkite stiklelius iš kambario temperatūros pirminio plovimo indo į 63 (± 2) °C ind ą vandens vonel÷je.

Kai tik stikleliai bus perkelti į 63 (±2) °C temperat ūros atskiestą stiprų plovimo buferinį tirpalą vandens vonel÷je, iš karto prad÷s veikti laikmatis. Atlikite plovimą stipriu tirpalu lygiai 10 minučių. Išimkite stiklelius iš atskiesto stipraus plovimo buferinio tirpalo, įmerkite pjūvius į atskiestą plovimo buferinį tirpalą ir palikite 3 minut÷ms kambario temperatūroje (20–25 °C).

Pakeiskite atskiestą plovimo buferinį tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes.

Audinių pjūviai dehidratuojami palaipsniui etanoliu: 2 minutes 70 % etanolyje, 2 minutes 85 % etanolyje ir 2 minutes 96 % etanolyje.

Leiskite audinių pjūviams visiškai išdžiūti ore.

5 etapas: Tvirtinimas

Užd÷kite 15 µL fluorescencijos ruošimo terp÷s, turinčios DAPI (5 buteliukas), ant stiklelio tiriamosios srities ir užd÷kite dengiantį stiklelį.

PASTABA: stikleliai gali būti analizuojami po 15 minučių arba per 7 dienas po tvirtinimo. Stebimas išblukimas, jeigu stiklelius veikia šviesa arba aukšta temperatūra. Išblukimui sumažinti laikykite stikliukus tamsoje, -18–8 °C temperat ūroje.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 17/61

Kokyb ÷s kontrol ÷ - krūtis 1. Signalai turi būti šviesūs, ryškūs ir lengvai vertinami. 2. Normaliose ląstel÷se galima atlikti vidinę dažymo ciklo kontrolę.

• Normalios ląstel÷s turi tur÷ti 1–2 aiškiai matomus žalius signalus, rodančius, kad CEN-17 PNA zondas buvo s÷kmingai hibridizuotas į centromerinę 17 chromosomos sritį.

• Normalios ląstel÷s turi tur÷ti 1–2 aiškiai matomus raudonus signalus, rodančius, kad HER2 DNR zondas buvo s÷kmingai hibridizuotas į HER2 amplikoną.

• Jei audinys suskirstytas pjūviais, kai kurios normalios ląstel÷s tur÷s mažiau nei lauktus 2 kiekvienos spalvos signalus.

• Jei normaliose ląstel÷se neaptinkama signalų, tyrimas buvo ydingas, o rezultatus reikia laikyti negaliojančiais.

3. Branduolio morfologija turi būti intaktin÷ ir homogeniškai nudažyta, kai tyrimui naudojamas DAPI filtras. Jei yra daug „vaiduokliškų“ ląstelių ir bendrai prasta branduolio morfologija, tai rodo per didelį bandinio suskaidymą, d÷l kurio signalai buvo prarasti arba yra fragmentiški. Tokie m÷giniai laikytini negaliojančiais.

4. D÷l audinio fiksavimo, apdorojimo ir integravimo skirtumų vartotojo laboratorijoje galimi skirtingi rezultatai – d÷l to reik÷s reguliariai vertinti vidines kontrol÷s priemones.

Dažymo rezultat ų interpretavimas - kr ūtis Vertinamas audinys Turi būti vertinami tik invazine karcinoma sergančių pacientų m÷giniai. Karcinomos in situ ir invazin÷s karcinomos tame pačiame m÷ginyje atvejais turi būti vertinamas tik invazinis komponentas. Venkite nekroz÷s sričių ir sričių, kuriose branduolin÷s ribos yra neaiškios. Neįtraukite branduolių, kuriuos reikia subjektyviai vertinti. Neįtraukite branduolių su silpnu signalo intensyvumu ir nespecifiniu arba aukšto lygio fonu.

Signal ų skai čiavimas: Nustatykite naviko vietą remdamiesi H&E nudažytu stikleliu ir vertinkite tą pačią sritį ant FISH nudažyto stiklelio. Nuskenuokite keletą auglio ląstelių sričių, kad gal÷tum÷te nustatyti galimą heterogeniškumą. Pasirinkite sritį, kurioje yra geras branduolių pasiskirstymas. Prad÷kite analizę viršutiniame kairiajame pasirinktos srities kvadrante ir, skenuodami iš kair÷s į dešinę, skaičiuokite kiekvieno įvertinamo branduolio signalus branduolio ribose pagal toliau pateiktus nurodymus (taip pat žiūr÷kite 3 priedą).

- Tolinkite ir artinkite židinį, kol rasite visus signalus atskirame branduolyje. - Du to paties dydžio signalus, kuriuos skiria atstumas, lygus ar mažesnis nei signalo diametras,

skaičiuokite kaip vieną signalą. - Branduoliuose su aukštais HER2 genų stiprinimo lygiais HER2 signalai gali būti išd÷styti labai

arti vienas kito ir sudaryti signalų telkinį. Tokiu atveju HER2 signalų skaičiaus negalima skaičiuoti, jį reikia apytiksliai įvertinti. Ypatingą d÷mesį reikia skirti žaliems signalams, nes HER2 signalų telkiniai gali uždengti žalius signalus, tod÷l juos bus neįmanoma pamatyti. Jei abejojate, patikrinkite žalius signalus specialiu FITC (fluoresceino izotiocianato) filtru.

Nevertinkite branduolių be signalų arba tik su vienos spalvos signalais. Vertinkite tik branduolius, turinčius vieną arba daugiau kiekvienos spalvos FISH signalų.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 18/61

Signal ų skai čiavimo nurodymai

1

Neskaičiuokite. Branduoliai persidengia, ne visos branduolių sritys matomos.

2 Du žali signalai, nevertinkite branduolių tik su vienos spalvos signalais

3 Skaičiuokite 3 žalius ir 12 raudonų signalų (telkinio vertinimas).

4 Skaičiuokite 1 žalią ir 1 raudoną signalą. Du to paties dydžio signalai, kuriuos skiria atstumas, lygus ar mažesnis už vieno signalo diametrą, skaičiuojami kaip vienas.

5 Neskaičiuokite (per daug suskaidyti branduoliai). Trūksta signalų branduolio centre (tuščiaviduris branduolys).

6 Skaičiuokite 2 žalius ir 3 raudonus signalus. Du to paties dydžio signalai, kuriuos skiria atstumas, lygus ar mažesnis už vieno signalo diametrą, skaičiuojami kaip vienas.

7 Skaičiuokite 1 žalią ir 5 raudonus signalus.

8 Skaičiuokite 3 žalius (1 žalias ne židinyje) ir 3 raudonus signalus.

9 Raudonų signalų telkinys slepia žalius signalus, patikrinkite žalius signalus specialiu FITC filtru arba neskaičiuokite.

Įrašai skaičiuojami pagal lentelę, nurodytą 2 priede.

Suskaičiuokite 20 branduolių iš kiekvieno m÷ginio, kai įmanoma, iš skirtingų auglio vietų (17). Apskaičiuokite HER2/CEN-17 santykį padalydami visą raudonų HER2 signalų skaičių iš viso žalių CEN-17 signalų skaičiaus. M÷giniai, kurių HER2/CEN-17 santykis didesnis arba lygus 2, turi būti vertinami kaip turintys sustiprintą HER2 geną (5, 17-19). Rezultatai, artimi ribiniam (1,8–2,2), turi būti interpretuojami atsargiai. Jeigu santykis yra ribinis (1,8–2,2), suskaičiuokite dar 20 branduolių ir perskaičiuokite santykį pagal 40 branduolių rezultatus. Jeigu kyla abejonių, m÷ginio stiklelis turi būti įvertinamas iš naujo. Ribiniais atvejais rekomenduojamos konsultacijos tarp patologo ir gydančio gydytojo.

arba

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 19/61

Apribojimai - kr ūtis 1. FISH tyrimas yra kelių etapų procesas, reikalingas specialaus apmokymo, kaip pasirinkti

tinkamus reagentus, pasirinkti audinius, juos fiksuoti ir apdoroti, paruošti FISH tyrimo stiklelį ir interpretuoti dažymo rezultatus.

2. FISH rezultatai priklauso nuo elgesio su audiniais ir jų apdorojimo prieš dažymą. Netinkamas fiksavimas, plovimas, džiovinimas, šildymas, pjaustymas ar tarša kitais audiniais ar skysčiais gali paveikti zondo hibridizaciją. Netikslūs rezultatai gali būti ir d÷l fiksavimo ir įliejimo metodų pokyčių arba audinyje esančių paveld÷tų netaisyklingumų.

3. Kad būtų gauti optimalūs ir atkuriami rezultatai, audinių stikleliai turi būti visiškai deparafinizuoti. Parafino pašalinimas turi būti atliktas dažymo proceso pradžioje. (žiūr÷kite NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, B.2 skyrius).

4. Galima naudoti tik kalibruotos temperatūros vandens vonelę, kaitinimo bloką ir hibridizacijos krosnelę. Naudojant kitų tipų įrangą hibridizacijos metu gali garuoti HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinys, tai turi įvertinti vartotojas.

Veikimo charakteristikos - kr ūtis

Analitinis jautrumas HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinio jautrumas buvo tiriamas naudojant 18 normalių krūties epitelio ląstelių. HER2 signalų ir CEN-17 signalų skaičiaus santykis buvo apskaičiuotas remiantis 20 branduolių viename m÷ginyje skaičiavimu.

HER2/CEN-17 santykis 18-oje normalių krūties epitelio ląstelių buvo tarp 0,97–1,08.

Analitinis specifiškumas HER2 DNR zondai HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinyje yra išd÷styti ir sužym÷ti, kad būtų apimami visi 218 kb, tarp jų ir HER2 genas.

CEN-17 PNA zondai HER2/CEN-17 zondų mišinyje buvo testuojami atskirai ir kartu, kad būtų patvirtinta jų specifin÷ hibridizacija 17 chromosomos centromerin÷je srityje.

Siekiant pamatuoti tyrimo geb÷jimą savarankiškai identifikuoti ieškomas medžiagas HER2 ir CEN-17 be kitų medžiagų trukdžių, buvo atlikti tyrimai su normalių krūties epitelio audinių m÷giniais naudojant 3 buteliuką, kuriame buvo hibridizacijos buferinio tirpalo, bet be zondų mišinio. Visuose 18 m÷ginių buvo aptikta signalų, nesusijusių su zondų mišiniu. Nei viename iš 18 m÷ginių nebuvo aptikta kitų chromosomų taikinių ar artimai susijusių medžiagų trukdžių.

Atsparumo tyrimas HER2 IQFISH pharmDx™ tyrimo atsparumas buvo tikrinamas keičiant pirminio apdorojimo laiką, temperatūrą ir pradinio apdorojimo buferinio tirpalo šildymo metodus (mikrobangų krosnel÷ arba vandens vonel÷), pepsino inkubacijos laiką ir metodą (PRN pepsinas arba imersija), denatūravimo temperatūrą ir laiką, hibridizacijos laiką bei stipraus plovimo laiką ir temperatūrą.

Esant tokioms eksperimentin÷ms sąlygoms, nebuvo pasteb÷ta žymių rezultatų skirtumų:

• Pradinio apdorojimo A metode 10 minučių vandens vonel÷ derinta su 95 °C, 95–99 °C ir 99 °C temperat ūra, kartu 9, 10 ir 11 minučių su 95–99 °C temperat ūra.

• Pradinio apdorojimo B metode mikrobangų krosnel÷ derinta 9, 10 ir 11 minučių su >95 °C temperat ūra.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 20/61

• Skaidymo pepsinu A metode taikyti inkubacijos laikai 5, 10 ir 15 minučių kambario temperatūroje (20–25 °C).

• Skaidymo pepsinu B metode taikyti inkubacijos laikai 3, 4 ir 5 minut÷s 37 °C temperatūroje.

• Skaidymo pepsinu C metode taikyti inkubacijos laikai 20, 25 ir 30 minučių derinti su 35, 37 ir 39 °C temperat ūromis.

• 10 minučių denatūracija derinta su 65, 66 ir 67 °C temperat ūra kartu su 9, 10 ir 11 minučių 66 °C temperat ūroje. Taikytas hibridizacijos laikas 60, 90 ir 120 minučių 45 °C temperatūroje.

• 10 minučių trukm÷s stiprus plovimas derintas su 61, 63 ir 65 °C temp eratūromis kartu su 9, 10 ir 11 minučių 63 °C temperat ūroje.

Pastaba: tiriant atsparumą vienu metu buvo keičiamas tik vienas dažymo procedūros parametras, o kiti buvo paliekami pastovūs. Rekomenduojama laikytis laikų ir temperatūrų, nurodytu dažymo procedūroje.

60 minučių trukusi hibridizacijos metu buvo gauto signalo intensyvumas buvo aukštas, vis d÷lto šiek tiek mažesnis, palyginti su 90 ir 120 minučių trukm÷s hibridizacija. Kituose laiko arba temperatūros deriniuose nebuvo pasteb÷ta žymesnių rezultatų skirtumų.

Dažymo procedūra HER2 IQFISH pharmDx™ siūlo įvairių protokolo parametrų šiluminiam pradiniam apdorojimui, skaidymui pepsinu ir hibridizacijos laikui. Kiekviena unikali derinimo parinktis buvo įvertinta atsižvelgiant į HER2 geno būklę. Buvo įvertinti 10 FFPE (formalinu fiksuotų, į parafiną įlietų) krūties karcinomos m÷ginių, kiekvienai iš 12 galimų derinimo parinkčių. HER2 FISH pharmDx™ Kit rinkinys (K5331) buvo naudojama kaip pamatin÷ vert÷. HER2/CEN-17 santykis kiekvienam m÷giniui parodytas 1 paveiksl÷lyje. Kryžmin÷ tabuliacija tarp 12 testų ir pamatinio dažymo parod÷ bendrą atitikimą su HER2 geno būkle 100 % (10/10) su atitinkamai 78,3 % ir 100 % apatin÷mis ir viršutin÷mis dvipus÷mis 95 % pasikliauties intervalo ribomis. Kappa vert÷ buvo lygi 1,00, o McNemars testas parod÷, jog paklaidos n÷ra (dvipus÷ p-vert÷ lygi 1,00).

1 pav. Atskiri HER2/CEN-17 santykiai su 10 krūties karcinomos m÷ginių, nudažytų naudojant 12 galimų derinimo protokolo variacijų kaip pamatinę vertę (R) naudojant

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 21/61

HER2 IQFISH pharmDx™ (kodas K5731) (1–12 testai) ir HER2 FISH pharmDx™ rinkinį (kodas K5331). Horizontali linija rodo ribinę 2,0 vertę.

Kartojimasis HER2/CEN-17 santykio kartojimasis buvo tirtas su HER2 IQFISH pharmDx™ tyrimu naudojant iš eil÷s einančius pjūvius iš devynių skirtingų krūties v÷žio m÷ginių su sustiprinto arba nesustiprinto HER2 geno būkle. Kiekvieno ciklo metu kiekvieno m÷ginio pjūviai buvo tiriami tris kartus. Vidutinis nuokrypio koeficientas nesustiprintuose m÷giniuose buvo 5,2 % (nuo 1 % iki 8 %) ir 14 % sustiprintuose m÷giniuose (nuo 7 % iki 20 %).

Iš viso su HER2 IQFISH pharmDx™ buvo patikrinti penki iš eil÷s einantys pjūviai iš keturių skirtingo storio (3, 4, 5, 6 ir 7 µm) krūties karcinomos m÷ginių. Vidutinis HER2/CEN-17 santykio nuokrypio koeficientas buvo 7 % (nuo 6 % iki 9 %).

Atkuriamumas HER2 IQFISH pharmDx™ tyrimas buvo tiriamas tikrinant atkuriamumą skirtingomis partijomis ir dirbant skirtingiems steb÷tojams, naudojant tris partijas HER2 IQFISH pharmDx™ ir dirbant trims steb÷tojams. Atkuriamumas buvo tiriamas devyniuose skirtinguose krūties karcinomos m÷giniuose su sustiprinto arba nesustiprinto HER2 geno būkle.

Vidutinis skirtingų partijų atkuriamumo nuokrypio koeficientas nesustiprintuose m÷giniuose buvo 5 % (nuo 2 % iki 8 %), sustiprintuose m÷giniuose 7,8 % (nuo 5 % iki 11 %).

Vidutinis skirtingų steb÷tojų atkuriamumo nuokrypio koeficientas nesustiprintuose m÷giniuose buvo 3,2 % (nuo 2 % iki 6 %), sustiprintuose m÷giniuose 2,8 % (nuo 0,2 % iki 4 %).

Klinikinis naudingumas Klinikinis Dako HER2 FISH pharmDx™ Kit rinkinio (kodas K5331) naudingumas buvo tiriamas lyginamojo tyrimo metu naudojant „Vysis PathVysion™ HER-2 DNA Probe Kit“. Tyrimas ap÷m÷ 150 archyvinių m÷ginių iš pacientų su teigiama arba neigiama limfmazgių reakcija, sirgusių II-III stadijos krūties v÷žiu.

Pirminis tyrimo tikslas buvo ištirti atitikimo laipsnį tarp HER2/17 chromosomos centromeros santykių 150-yje m÷ginių, tirtų su Dako ir Vysis rinkiniais, kurie abu atrinkti d÷l bendrojo santykių atitikimo ir dichotomizuotų FISH rezultatų atitikimo (+/- grup÷s).

Iš viso buvo s÷kmingai hibridizuoti ir įvertinti 145 m÷giniai, tod÷l jie tiko statistinei analizei atlikti. Rezultatų A 2 x 2 kryžmin÷ tabuliacija vaizduojama 1 lentel÷je.

1 lentel÷. Dichotomizuoti rezultatai, gauti ištyrus 145 krūties v÷žio m÷ginius su „ Dako HER2 FISH pharmDx™ Kit“ ir „Vysis PathVysion™ HER-2 DNA Probe Kit“. 60 kiekvieno m÷ginio branduolių buvo įvertinti su kiekvienu rinkiniu atskirai.

Dako rinkinys (-) sustiprintas

Dako rinkinys (+) sustiprintas

Suma

Vysis rinkinys (-) sustiprintas

95 2 97

Vysis rinkinys (+) sustiprintas

5 43 48

Suma 100 45 145

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 22/61

Atitikimas tarp Dako ir Vysis testų buvo 95 % su 92–99 % pasikliauties intervalu. Kappa vert÷ buvo 0,89.

Sistemingos paklaidos tarp dviejų tyrimų McNemars testas buvo nežymus (p=0,22).

2 paveiksle vaizduojama 145 m÷ginių porinių tyrimų sklaidos kreiv÷.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 23/61

2 pav. 145 krūties v÷žio m÷giniai tirti d÷l HER2 geno sustiprinimo naudojant „Dako HER2 FISH pharmDx™ Kit“ ir „Vysis PathVysion™ HER-2 DNA Probe Kit“ rinkinius. Rezultatai išreikšti kaip HER2/17 chromosomos centromeros santykiai. 60 kiekvieno m÷ginio branduolių buvo įvertinti su kiekvienu rinkiniu atskirai.

Bendrasis atitikimas tarp „Dako HER2 FISH pharmDx™“ ir „Vysis PathVysion™“ HER-2 DNR zondų testų buvo tiriamas analizuojant skirtumą tarp porinių registro (santykio) tyrimų ir abiejų testų registro (santykio) linijin÷s regresijos. Buvo prieita išvados, kad skirtumas tarp porinių registro (santykio) tyrimų sistemiškai did÷ja sumuojant HER2/17 chromosomos centromeros santykius, ir kad matuojamas santykis Dako teste yra didesnis nei Vysis teste.

Aukštesnis HER2/17 chromosomos centromeros santykis, gautas tiriant su „Dako HER2 FISH pharmDx™ Kit“ rinkiniu, gali būti susijęs su skirtumais tarp abiejų testų, pvz., „Dako HER2 FISH pharmDx™ Kit“ aukštesn÷ skiriamoji geba lemia aukštesnius santykius labai sustiprinto HER2 geno atvejais. Tačiau rinkinių tyrimas buvo atliekamas 2 skirtingose vietose, d÷l to galimi skirtumai tarp laboratorijų. Be to, literatūroje aprašomi didesni pokyčiai labai sustiprintais atvejais, tačiau jie laikomi kliniškai nereikšmingais (18). Esamas tyrimas neleidžia atlikti sisteminių skirtumų tarp dviejų testų tyrimų keliose laboratorijose. Der÷tų pamin÷ti, kad nustatyti skirtumai tarp dviejų testų yra panašaus dydžio, kaip vietų skirtumai, nustatyti portatyvumo tyrimo metu. „Dako HER2 IQFISH pharmDx™“ (kodas K5731) buvo palygintas su „Dako HER2 FISH pharmDx™ Kit“ (kodas K5331) rinkiniu atlikus lyginamąjį tyrimą su 78 krūties karcinomos audinio m÷giniais. Kryžmin÷ HER2 būkl÷s tabuliacija, gauta atlikus du tyrimus, pateik÷ 98,7 % bendrą atitikimą su apatin÷mis ir viršutin÷mis 95 % pasikliauties intervalo ribomis,

Scatter plot of paired observations

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00

Vysis PathVysion™ HER-2 DNA Probe Kit

Dak

oCyt

omat

ion

HE

R2

FIS

H p

harm

Dx™

Kit

g

Vysis PathVysion™ HER-2 DNA Probe Kit

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 24/61

kai pasikliauties intervalas buvo 94,2 % ir 99,9 %. Kapa vert÷ buvo 0,96 su apatin÷mis ir viršutin÷mis 95 % pasikliauties intervalo ribomis, intervalui esant tarp 0,89 ir 1,00. McNemars testo p-vert÷ buvo 1,00, tai reiškia, jog tarp dviejų testų paklaidos n÷ra.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 25/61

Trik čių šalinimas - kr ūtis Problema Galima priežastis Si ūlomi veiksmai 1. N÷ra signalų arba

silpni signalai 1a. Rinkinys buvo laikomas

aukštoje temperatūroje transportuojant arba saugant

1a. Patikrinkite laikymo sąlygas. Įsitikinkite, kad buvo sausojo ledo, kai buvo gauta prekių siunta. Įsitikinkite, kad 3 buteliukas buvo laikomas -18 °C temperat ūroje tamsoje. Įsitikinkite, kad 2A ir 5 buteliukai buvo laikomi ne didesn÷je kaip 2–8 °C temperatūroje tamsoje.

1b. Mikroskopas veikia netinkamai.

- Netinkamas filtrų rinkinys. - Netinkama lempa. - Pasenusi gyvsidabrio

lempa. - Nešvarūs ir (arba) įskilę

kolektoriaus lęšiai. - Netinkamas imersin÷

alyva.

1b. Patikrinkite mikroskopą ir įsitikinkite, kad naudojami filtrai yra tinkami naudoti su rinkinio fluorochromais ir kad gyvsidabrio lempa yra gera ir jos galiojimo laikas yra nepasibaigęs. (žr. 3 priedą). Jei abejojate, kreipkit÷s į vietinį jūsų mikroskopo pardav÷ją.

1c. Išblukę signalai 1c. Venkite pernelyg ilgo tyrimo mikroskopu ir sumažinkite tenkantį stiprios šviesos kiekį.

1d. Netinkamos pirminio apdorojimo sąlygos

1d. Užtikrinkite, kad būtų laikomasi rekomenduojamų pirminio apdorojimo temperatūros ir laiko.

1e. Hibridizacijos metu išgaravo zondų mišinys

1e. Užtikrinkite pakankamą dr÷gmę hibridizacijos kameroje

2. N÷ra žalių signalų 2a. Netinkamos plovimo stipriu tirpalu sąlygos

2a. Užtikrinkite, kad būtų naudojama rekomenduojama plovimo stipriu tirpalu temperatūra bei laikas ir kad dengiamieji stikleliai būtų išimti prieš plaunant stipriu tirpalu

3. N÷ra raudonų signalų

3a. Netinkamos pirminio apdorojimo sąlygos

3a. Užtikrinkite, kad būtų laikomasi rekomenduojamų pirminio apdorojimo temperatūros ir laiko.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 26/61

4. Sritys be signalo 4a. Per mažas zondo tūris

4a. Įsitikinkite, kad zondo tūris pakankamas plotui po dengiamuoju stikleliu uždengti

4b. Naudojant arba fiksuojant zondų mišinį pateko oro burbuliukų

4b. Venkite oro burbuliukų. Jeigu juos pastebite, lengvai pastuksenkite žnypl÷mis, kad išsisklaidytų

5. Pernelyg stiprus fono nudažymas

5a. Netinkamas audinio fiksavimas

5a. Užtikrinkite, kad būtų naudojami tik formalinu fiksuoti, į parafiną įlieti audinio pjūviai

5b. Nevisiškai pašalintas parafinas

5b. Vykdykite deparafinizavimo ir rehidratavimo procedūras, aprašytas B.2 skyriuje

5c. Plovimo stipriu tirpalu temperatūra per žema

5c. Užtikrinkite, kad plovimo stipriu tirpalu temperatūra būtų 63 (±2) °C

5d. Hibridizuotas pjūvis per ilgai laikytas stiprioje šviesoje

5d. Venkite pernelyg ilgo tyrimo mikroskopu ir sumažinkite tenkantį stiprios šviesos kiekį

6. Silpna audinio morfologija

6a. Neteisingai naudojamas pepsinas

6a. Laikykit÷s rekomenduojamų pepsino inkubavimo trukmių. Žiūr÷kite B.3 skyrių, 2 etapą.

Užtikrinkite, kad pepsinas būtų laikomas tinkamoje temperatūroje. Žiūr÷kite B.1 skyrių

6b. Neteisingos pirminio apdorojimo sąlygos gali lemti neskaidrumą ir drumstumą

6c. Per ilgas pepsino apdorojimas arba labai plonas pjūvis gali lemti dubliuotų arba tuščiavidurių ląstelių atsiradimą.

6b. Užtikrinkite, kad būtų laikomasi rekomenduojamų pirminio apdorojimo temperatūros ir laiko

6c. Sutrumpinkite pepsino inkubavimo trukmę. Žiūr÷kite B.3 skyrių, 2 etapą. Užtikrinkite, kad pjūvio storis būtų 4–6 µm.

7. Intensyvi žalia autofluorescencija ant stiklelio, apimant vietas be FFPE audinio

7. Nerekomenduojamų arba pasibaigusio galiojimo stiklelių naudojimas

7. Įsitikinkite, kad padengtų stiklelių („Dako Silanized Slides“, Kodas S3003, arba poli-L-lizinu-padengti stikleliai) galiojimo data nepasibaigusi.

PASTABA: jei problemos negalima priskirti n÷ vienai iš išvardytų priežasčių arba jei jos nepašalina siūlomi sprendimo būdai, kreipkit÷s pagalbos į „Dako“ technin÷s pagalbos tarnybą.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 27/61

1 priedas - kr ūtis

HER2 IQFISH pharmDx™, kodas K5731

Protokolo kontrolinis sąrašas Dažymo ciklo žurnalo ID: ______________

Ciklo data: __________________

HER2 IQFISH pharmDx™, K5731, partija: __________________

M÷ginio ID: __________________

Įrangos ID: __________________

1x plovimo buferinio tirpalo skiedimo / galiojimo data (6 buteliukas, atskiestas 1:20): _________ /_________

Audinys fiksuotas neutraliame buferintame formaline Taip Ne

1 etapas: pradinis apdorojimas

Pirminio apdorojimo tirpalo skiedimo / galiojimo data (1 buteliukas, atskiestas 1:20)

/

Pirminio apdorojimo tirpalo pamatuota temperatūra (95–99 °C), jeigu kaitinama naudojant vandens vonel ę

°C

Pradinis apdorojimas (10 minučių) ir aušinimas (15 minučių)

Plaukite plovimo buferiniame tirpale (6 buteliukas, atskiestas 1:20) (2 x 3 minutes)

2 etapas: pepsinas

Pepsino (2 buteliukas) apdorojimo trukm÷ 37 °C temperatūroje arba

minučių

Pepsino (2 buteliukas) apdorojimo trukm÷ kambario temperatūroje (20–25 °C) arba

minučių

Pepsino imersijos trukm÷ 37 (± 2) °C temperat ūroje minučių


Dehidratuokite stiklelius (3 x 2 minutes) laipsniškomis etanolio serijomis ir leiskite išdžiūti ore

3 etapas: HER2/CEN-17 IQFISH zondų mišinys

Užpilkite zondų mišinio (3 buteliukas), uždenkite dengiamuoju stikleliu ir užsandarinkite dengiamųjų stiklelių sandarikliu

Pamatuota denatūracijos temperatūra (66 (±1) °C) °C

Denatūravimas 10 minučių

Pamatuota hibridizacijos temperatūra (45 (± 2) °C) °C

Hibridizacijos laikas (60–120 minučių) minučių

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 28/61

4 etapas: plovimas stipriu plovimo tirpalu

Stipraus plovimo buferinio tirpalo skiedimo / galiojimo data (4 buteliukas, atskiestas 1:20)

/

Pamatuota stipraus plovimo buferinio tirpalo temperatūra (63 (± 2) °C)

°C

Plovimas stipriu tirpalu (10 minučių) nu÷mus dengiamąjį stiklelį


°C


minučių

5 etapas: tvirtinimas

Užd÷kite 15 µl fluorescencijos ruošimo terp÷s (5 buteliukas) ir užd÷kite dengiamąjį stiklelį

Komentarai:

Data ir parašas, technikas:

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 29/61


HER2 IQFISH pharmDx™, kodas K5731 Vertinimo schema

Dažymo ciklo žurnalo ID: _________ Ciklo data: __________________ HER2 IQFISH pharmDx™, K5731, partija: ________ M÷ginio ID: _______________

Skaičiuojami 20 branduoli ų signalai

Branduolio Nr.

HER2 rezultatas (raudonas)

CEN-17 rezultatas

(žalias)

Branduolio Nr.

HER2 rezultatas (raudonas)

CEN-17 rezultatas

(žalias)

1 11

2 12

3 13

4 14

5 15

6 16

7 17

8 18

9 19

10 20

Iš viso (1-10) Iš viso (11–20)

Nor÷dami nustatyti HER2/CEN-17 santykį, suskaičiuokite HER2 signalų kiekį ir CEN-17 signalų kiekį tuose pačiuose 20 branduolių ir padalykite visą HER2 signalų skaičių iš viso CEN-17 signalų skaičiaus. Jeigu HER2/CEN-17 santykis yra artimas ribiniam (1,8–2,2), suskaičiuokite dar 20 branduolių ir perskaičiuokite santykį. Santykiai, lygūs arba artimi ribiniam (1,8–2,2), turi būti interpretuojami atsargiai (žr. skaičiavimo nurodymus).

HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 santykis

Bendras rezultatas (1–20)

� Santykis < 2: HER2 genų stiprinimas nepasteb÷tas

� Santykis ≥ 2: HER2 genų stiprinimas pasteb÷tas


Data ir parašas, patologas:

Vertinimo nurodymai: žr. „Dažymo rezultatų interpretavimas“.

Krūties v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 30/61


HER2 IQFISH pharmDx™, kodas K5731 Fluorescencinio mikroskopo specifikacijos Dako rekomenduoja naudoti toki ą įrang ą su HER2 IQFISH pharmDx™, K5731:

1. Mikroskopo tipas

• Epifluorescencinis mikroskopas.

2. Lempa • 100 vatų gyvsidabrio lempa (fiksuokite degimo laiką).

3. Objektyvai • Tiriant audinius, taikomi fluorescenciją sausai 10x arba fluorescenciją imersiniame aliejuje

16x didinantys objektyvai.

• Padidinti didelį galingumą ir vertinti signalus rekomenduojama naudoti tik fluorescencijai imersiniame aliejuje skirtus objektyvus, pvz., 100x.

4. Filtrai Filtrai yra individualiai sukuriami atsižvelgiant į specifinius fluorochromus ir turi būti pasirenkami atitinkamai. Dako rekomenduoja naudoti specifinius DAPI filtrus kartu su aukštos kokyb÷s „Texas Red“/FITC dvigubu filtru.

• DAPI filtras, pvz., Chroma filter # 31000.

• „Texas Red“/FITC dvigubas filtras, pvz., Chroma filter # 51006.

• „Texas Red“ ir FITC pavienius filtrus galima naudoti patvirtinimui.

Fluorochromas Sužadinimo bangos ilgis Emisijos bangos ilgis

FITC 495 nm 520 nm

„Texas Red“ 596 nm 615 nm

Kiekvieno mikroskopo filtrai yra specifiški ir, norint interpretuoti rezultatus, būtina naudoti tinkamus filtrus. Nor÷dami gauti smulkesn÷s informacijos, kreipkit÷s į Jūsų mikroskopo tiek÷ją arba savo Dako atstovą.

5. Aliejus • Nefluorescuojanti alyva.

Atsargumo priemon ÷s • Nerekomenduojama 50 vatų gyvsidabrio lempa.

• Negalima naudoti rodamino filtrų.

• Nerekomenduojama naudoti trigubų filtrų. Naudojant neoptimizuotą mikroskopą gali kilti problemų nuskaitant fluorescencinius signalus. Svarbu, kad šviesos šaltinis nebūtų pasibaigusios galiojimo datos ir būtų tinkamai nukreiptas bei sufokusuotas. Pirk÷jai turi steb÷ti ir laikytis gyvsidabrio lempų gamintojo rekomendacijų. Mikroskopas turi būti prižiūrimas, o gyvsidabrio lempa turi būti sureguliuota prieš interpretuojant rezultatus. Turi būti stengiamasi m÷ginį kaip įmanoma trumpiau laikyti sužadinimo šviesoje, norint išvengti fluorescencijos išblukimo. Rekomenduojame pasitarti su gamintoju d÷l savo mikroskopo nustatymų prieš pradedant fluorescencinę in situ hibridizaciją arba perskaityti atitinkamą literatūrą.

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 31/61

Santrauka ir paaiškinimas - skrandis Žmogaus HER2 genas (dar žinomas kaip ERBB2 arba NEU) yra 17 chromosomoje ir koduoja HER2 baltymą arba p185HER2. HER2 baltymas yra membranos receptorin÷ tirozino kinaz÷, homologiška epidermio augimo faktoriaus receptoriui (EGFR arba HER1) (1-2). Kiekvienoje normalioje diploidin÷je ląstel÷je yra 2 HER2 geno kopijos.

Padidinta HER2 baltymo raiška ir HER2 geno sustipr÷jimas skrandžio v÷žio atveju buvo stebimas daugelyje tyrimų (apžvalga (20)). HER2 teigiama reakcija aptinkama apytiksliai 20 % pacientų naudojant IHC arba FISH ((20)). Ikiklinikiniuose in vitro ir in vivo tyrimuose buvo atskleista, kad trastuzumabas (Herceptin™) yra veiksmingas naudojant įvairiuose skrandžio v÷žio modeliuose, tod÷l buvo prad÷ti keli klinikiniai tyrimai (20-24). III faz÷s tyrime BO18255 (ToGA klinikiniai tyrimai) HER2 teigiamiems pacientams, turintiems neoperuojamą, pažengusią, recidyvuojančią ir (arba) metastazinę skrandžio arba stempl÷s ir skrandžio adenokarcinomą, atsitiktinių imčių būdu buvo duodama 5-FU arba kapecitabino ir cisplatinos atskirai arba kartu su trastuzumabu. Statistiškai reikšmingas bendro išgyvenamumo (BI) padid÷jimas buvo pasteb÷tas tarp pacientų, kuriems buvo paskirtas kombinuotas gydymas trastuzumabu ir chemoterapija (25). Trastuzumabas yra sužmogintas monokloninis antikūnas, kuris su dideliu afiniškumu jungiasi prie HER2 baltymo ir nustatyta, jog jis slopina žmogaus navikinių ląstelių, kurioms būdinga padid÷jusi HER2 baltymo raiška, veš÷jimą in vitro ir in vivo (21-24).

Proced ūros principas - skrandis HER2 IQFISH pharmDx™ turi visus pagrindinius reagentus, reikalingus atlikti FISH procedūrą su formalinu fiksuotais, į parafiną įlietais audinių pjūvio m÷giniais.

Po deparafinizavimo ir rehidratavimo m÷giniai kaitinami pirminio apdorojimo tirpale, v÷liau atliekamas proteolitinis suskaidymas naudojant pepsiną. Po kaitinimo ir proteolitinio pradinio apdorojimo etapų šis rinkinys naudoja nenuodingą, paruoštą naudoti IQISH zondų mišinį, paremtą PNA (peptidų nukleino rūgštis) (12) ir DNR technologijų kombinacija. Zondų mišinį sudaro Teksaso raudonuoju pažym÷ti DNR zondai, apimantys 218 kb sritį su HER2 genu 17 chromosomoje, ir fluoresceinu pažym÷tų PNA zondų mišinys, skirtas centromerinei 17 chromosomos (CEN-17) sričiai. Specifin÷ dviejų taikinių hibridizacija lemia skirtingų raudonų fluorescencinių signalų susiformavimą kiekvieno HER2 geno lokuse ir skirtingų žalių fluorescencinių signalų susiformavimą kiekvienos 17 chromosomos centromeroje. Atlikus plovimą stipriu plovimo tirpalu, m÷giniai užpilami fluorescencijos ruošimo terpe, kurioje yra DAPI, ir uždengiami dengiamaisiais stikleliais. Naudojant fluorescencinį mikroskopą su atitinkamais filtrais (žr. 3 priedą), nustatoma navikinių ląstelių vieta ir registruojami raudoni (HER2) bei žali (CEN-17) signalai. Tada apskaičiuojamas HER2/CEN-17 santykis. Normalios ląstel÷s analizuojamame audinių pjūvyje veikia kaip vidin÷ teigiama pradinio apdorojimo ir hibridizacijos efektyvumo kontrolin÷ medžiaga. Išsamesn÷s informacijos rasite skirsnyje „Dažymo procedūra“.

Nor÷dami mokytis interaktyviai nuotoliniu būdu naudokit÷s HER2 IQFISH pharmDx™ elektroninio mokymosi programa, skirta suteikti tikslių ir greitų žinių laboratorijų darbuotojams, patologams ir mokslininkams, kaip pasiekti maksimalių rezultatų naudojant HER2 IQFISH pharmDx™: www.dako.com

Reagentai - skrandis

Suteikiamos medžiagos Toliau išvardytų medžiagų pakanka 20 testų (testas yra apibr÷žiamas kaip viena 22 mm x 22 mm tiriama sritis). Testų skaičius pagrįstas 250 µL stikleliui iš 2A buteliuko (5–8 lašai) , 10 µL stikleliui iš 3 buteliuko ir 15 µL stikleliui iš 5 buteliuko naudojimu. 3 ir 5 buteliukuose esantys tirpalai yra klampūs, juos gali tekti trumpai centrifuguoti mikrocentrifugoje, kad būtų galima surinkti visus pateiktus reagentus.

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 32/61

Rinkinyje pateiktų medžiagų pakanka 10-čiai individualių dažymo ciklų (keturiems atskiriems ciklams, jei naudojamas pepsino imersijos metodas). HER2 IQFISH pharmDx™ pristatomas ant sauso ledo. Norint įsitikinti, ar rinkinio komponentai transportuojant nebuvo paveikti aukštos temperat ūros, b ūtina pasiži ūr÷ti, ar yra lik ę sausojo ledo . Atkreipkite d÷mesį, kad kai kurie rinkinio komponentai gali likti nesušalę, tai netur÷s įtakos HER2 IQFISH pharmDx™ veiksmingumui.

1 buteliukas

Pirminio apdorojimo tirpalas (20x) 150 mL, koncentruotas 20x MES (2-[N-morfolin]etansulfonrūgšties) buferinis tirpalas.

2A buteliukas

2B buteliukas

Pepsinas 4 x 6,0 mL, paruoštas naudoti Pepsino tirpalas, pH 2,0; yra stabilizatoriaus ir antimikrobin÷s medžiagos.

Pepsino skiediklis (10x) 24 mL, koncentruotas 10x Skiedimo buferinis tirpalas, pH 2,0; yra antimikrobin÷s medžiagos.

3 buteliukas HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinys 0,2 mL, paruoštas naudoti Texas Red pažym÷tų HER2 DNR zondų mišinys ir fluoresceinu pažym÷ti CEN-17 PNA zondai; tiekiami IQISH hibridizacijos buferiniame tirpale.

4 buteliukas Stiprus plovimo buferinis tirpalas (20x) 150 mL, koncentruotas 20x SSC (fiziologinis tirpalas-natrio citratas) buferinis tirpalas su detergentu (Tween-20).

5 buteliukas Fluorescencin ÷ ruošimo terp ÷ 0,4 mL, paruoštas naudoti Fluorescencijos ruošimo terp÷ su 500 µg/L DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindolo).

6 buteliukas Plovimo buferinis tirpalas (20x) 500 mL, koncentruotas 20x Tris/HCl buferinis tirpalas.

Dengiam ųjų stikleli ų sandariklis 1 m÷gintuv÷lis, paruoštas naudoti Tirpalas, skirtas nuimti sandariklį nuo dengiamųjų stiklelių.

PASTABA: šie rinkinio reagentai: pirminio apdorojimo tirpalas (20x), pepsinas, pepsino skiediklis (10x), stiprus plovimo buferinis tirpalas (20x), fluorescencijos ruošimo terp÷, plovimo buferinis

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 33/61

tirpalas (20x) ir dengiamųjų stiklelių sandariklis yra keičiami su atitinkamais reagentais iš „Dako Histology FISH Accessory Kit“, kodas K5799.

Reikalingos, ta čiau nepateikiamos medžiagos Laboratorijos reagentai Distiliuotas arba dejonizuotas vanduo Etanolis, 96 % Ksilenas arba ksileno pakaitalai

Laboratorijos įranga Sugeriančios servet÷l÷s Reguliuojamos pipet÷s Kalibruotas iš dalies įmerkiamas termometras (diapazonas 37–100 °C) Kalibruotas paviršiaus termometras (diapazonas 37–100 °C)

Dengiamieji stikleliai (22 mm x 22 mm) Žnypl÷s Garų gaubtas „Dako Hybridizer“ (Kodas S2450/S2451)* Kaitinimo blokas arba hibridizacijos krosnis* Dr÷gnos hibridizacijos kamera* Mikrocentrifuga Stikleliai, „Dako Silanized Slides“, kodas S3003, arba poli-L-lizinu dengti stikleliai (žiūr÷kite „M÷ginių ruošimas“) Dažymo indai ar vonel÷s Laikmatis (veikiantis 2–15 minučių intervalais) Sūkurin÷ maišykl÷ Vandens vonel÷ su pakeliamu dangčiu (galinti palaikyti 37 (± 2) °C, 63 (2) °C ir nuo 95 °C iki 99 °C) Mikrobangų krosnel÷ su jutiklio galimybe, jeigu pradinis apdorojimas atliekamas naudojant mikrobangų krosnelę (žiūr÷kite B3. „Dažymo protokolas“. 1 etapas: pirminis apdorojimas, B metodas)

* Kaitinimo blokas arba hibridizacijos krosnel÷, skirti denatūruoti (66 (±1) °C) ir hibridizuoti (45 (± 2) °C), kartu su dr÷gnos hibridizacijos kamera gali būti naudojami kaip „Dako Hybridizer“ alternatyva.

Mikroskopo įranga ir priedai Fluorescencinio mikroskopo filtrai: DAPI ir FITC / „Texas Red“ dvigubas filtras arba FITC ir „Texas Red“ viengubi filtrai; išsamiau žiūr÷kite 3 priedą.

Tur÷tų būti naudojamas fluorescencinis mikroskopas su 100 vatų gyvsidabrio lempa kaip šviesos šaltiniu. Kiti šviesos šaltiniai nerekomenduojami, naudojant šiuos filtrus.

Mikroskopo stiklelių aplankas (20 stiklelių kartoninis d÷klas su lankstiniu dangteliu arba panašus).

Atsargumo priemon ÷s - skrandis 1. Skirta in vitro diagnostikos tyrimams. 2. Skirta naudoti profesionalams. 3. 1 buteliuke, Pre-Treatment Solution (20x), nereikia žym÷ti pavojaus etiket÷mis. Pareikalavus

profesionaliems naudotojams bus pateiktas saugos duomenų lapas. 4. 2A buteliuke, Pepsin, yra ≥5-<10% propan-2-ol, ≥0.1-<0.3% pepsin A ir ≥0.011-<0.1% 5-

chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one ir 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. 2A buteliuke yra pažym÷tas etikete:

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 34/61

Pavojinga H314 Smarkiai nudegina odą ir pažeidžia akis. H317 Gali sukelti alerginę odos reakciją. P280 Mūv÷ti apsaugines pirštines / d÷v÷ti apsauginius drabužius /

naudoti akių (veido) apsaugos priemones. P304 + P340 + P310 ĮKVöPUS: Išnešti nukent÷jusįjį į gryną orą; jam būtina

patogi pad÷tis, leidžianti laisvai kv÷puoti. Nedelsiant skambinti į APSINUODIJIMŲ KONTROLöS IR INFORMACIJOS BIURĄ/kreiptis į gydytoją.

P301 + P310 + P331 PRARIJUS: Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico. NESKATINTI v÷mimo.

P303 + P361 + P353 + P310

PATEKUS ANT ODOS (arba plaukų): Nedelsiant nuvilkti visus užterštus drabužius. Odą nuplauti vandeniu/čiurkšle. Nedelsiant skambinti į APSINUODIJIMŲ KONTROLöS IR INFORMACIJOS BIURĄ/kreiptis į gydytoją.

P305 + P310 PATEKUS Į AKIS: Nedelsiant skambinti į APSINUODIJIMŲ KONTROLöS IR INFORMACIJOS BIURĄ/kreiptis į gydytoją.

P405 Laikyti užrakintą. P501 Turinį ir talpyklą išmesti laikantis visų vietos, regioninių,

nacionalinių ir tarptautinių taisyklių. 5. 2B buteliuke, Pepsin Diluent (10x), yra ≥50-<75% propan-2-ol ir ≥5-<10% 2-amino-2-

(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. 2B buteliuke yra pažym÷tas etikete:

Pavojinga H225 Labai degūs skystis ir garai. H319 Sukelia smarkų akių dirginimą. H336 Gali sukelti mieguistumą arba galvos svaigimą. P280 Mūv÷ti apsaugines pirštines. Naudoti akių ar veido



ir visų medžiagų tvarkymo įrangą. P304 + P340 ĮKVöPUS: Išnešti nukent÷jusįjį į gryną orą; jam būtina

patogi pad÷tis, leidžianti laisvai kv÷puoti. P303 + P361 + P353 PATEKUS ANT ODOS (arba plaukų): Nedelsiant nuvilkti

visus užterštus drabužius. Odą nuplauti vandeniu/čiurkšle. P235 Laikyti v÷sioje vietoje. P501 Turinį ir talpyklą išmesti laikantis visų vietos, regioninių,

nacionalinių ir tarptautinių taisyklių. 6. 3 buteliuke, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, yra ≥10-<25% ethylene carbonate ir ≥3-<5%

sodium chloride. 3 yra pažym÷tas etikete:

Atsargiai H319 Sukelia smarkų akių dirginimą. P280 Naudoti akių ar veido apsaugos priemones.

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 35/61

P264 Po naudojimo kruopščiai nusiplaukite rankas. P305 + P351 + P338 PATEKUS Į AKIS: Atsargiai plauti vandeniu kelias minutes.


7. 4 buteliuke, Stringent Wash Buffer (20x), yra ≥10-<25% sodium chloride ir ≥10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. 4 buteliuke yra pažym÷tas etikete:




8. 6 buteliuke, Wash Buffer (20x) yra ≥10-<25% sodium chloride ir ≥10-<20% trometamolio. 6 buteliuke yra pažym÷tas etikete:




9. Coverslip Sealant, yra 100 % šviesiojo hidrogryninto pirminio benzino (naftos) ir jis pažym÷tas etikete:

Pavojinga H225 Labai degūs skystis ir garai. H304 Prarijus ir patekus į kv÷pavimo takus, gali sukelti mirtį. H411 Toksiška vandens organizmams, sukelia ilgalaikius

pakitimus. P280 Mūv÷ti apsaugines pirštines. Naudoti akių ar veido



ir visų medžiagų tvarkymo įrangą. P273 Saugoti, kad nepatektų į aplinką. P301 + P310 + P331 PRARIJUS: Nedelsiant skambinti į APSINUODIJIMŲ

KONTROLöS IR INFORMACIJOS BIURĄ/kreiptis į gydytoją. NESKATINTI v÷mimo.

P303 + P361 + P353 PATEKUS ANT ODOS (arba plaukų): Nedelsiant nuvilkti visus užterštus drabužius. Odą nuplauti vandeniu/čiurkšle.

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 36/61

P235 Laikyti v÷sioje vietoje. P501 Turinį ir talpyklą išmesti laikantis visų vietos, regioninių,

nacionalinių ir tarptautinių taisyklių. 10. Prieš ir po fiksavimo elkit÷s su kontroliniais stikleliais bei visomis su jais susiliečiančiomis

medžiagomis kaip su užkrečiamomis medžiagomis, ir utilizuokite laikydamiesi tinkamų atsargumo priemonių (16). Niekada nevarvinkite reagento su burna, venkite oda ir gleivine prisiliesti prie reagentų ir m÷ginių. Jeigu reagentai prisiliečia prie jautrių vietų, nuplaukite gausiu vandens kiekiu.

11. Kiek įmanoma sumažinkite reagentų mikrobinę taršą, kad išvengtum÷te klaidingų rezultatų 12. Taikant kitas, nei nurodyta, inkubavimo trukmes, temperatūras ar metodus, gali būti gauti

klaidingi rezultatai. 13. Skirtingas, nei nurodyta, audinių fiksavimo metodas ir m÷ginio storis gali tur÷ti įtakos audinio

morfologijai ir (arba) signalo intensyvumui. 14. Venkite HER2/CEN-17 IQFISH zondų mišinio išgaravimo hibridizacijos metu, užtikrindami

pakankamą dr÷gmę hibridizacijos kameroje. 15. Reagentai yra optimaliai atskiesti. Daugiau atskiedus gali sumaž÷ti efektyvumas. 16. D÷v÷kite atitinkamas asmenines apsaugos priemones, kad išvengtum÷te sąlyčio su akimis

ir oda. Papildomos informacijos žr. medžiagos saugos duomenų lape (SDL). 17. Kadangi skrandžio v÷žio m÷giniai yra heterogeniški, prieš pasirenkant signalų skaičiavimą yra

svarbu atlikti išsamų viso m÷ginio skenavimą, kad būtų galima įvertinti signalų pasiskirstymą. 18. Nerekomenduojama vertinti labai mažus m÷ginius (t .y. m÷ginių morfologija turi būti

nepažeista ir m÷ginyje turi būti pakankamai branduolių, kad būtų galima juos registruoti). 19. Jeigu biopsijos m÷ginys yra tiriamas naudojant HER2 FISH tyrimą, norint patikimai nustatyti

HER2 būklę turi būti tiriami keli (7-8) biopsijos m÷giniai iš skirtingų auglio vietų. 20. Kad būtų nustatytos visos biopsijos m÷ginio audinio šerdys, svarbu patikrinti H&E

nudažytą stiklelį. 21. Dirbant pepsino imersijos būdu turi būti naudojami tik švarūs dažymo indai (2 etapas,

C metodas).

Laikymo s ąlygos - skrandis Laikykite HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinį (3 buteliukas) tamsoje -18 °C temperat ūroje. Visus kitus reagentus galima laikyti 2–8 °C temperat ūroje tamsoje. Visus reagentus galima laikyti užšaldytus. Reagentų užšaldymas ir atšildymas iki 10 kartų neturi įtakos poveikiui.

Pepsiną, HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinį ir fluorescencijos ruošimo terpę (2A, 3 ir 5 buteliukai) gali neigiamai paveikti per didelis karštis. Nepalikite šių komponentų kambario temperatūroje.

HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinį ir fluorescencijos ruošimo terpę (3 ir 5 buteliukai) gali neigiamai paveikti per intensyvi šviesa. Nelaikykite šių komponentų ir neatlikite analiz÷s stiprioje šviesoje, pvz., tiesioginiuose saul÷s spinduliuose.

Nenaudokite rinkinio pasibaigus tinkamumo laikui, kuris nurodytas ant pakuot÷s d÷žut÷s. Jei reagentai laikomi kitokiomis sąlygomis, nei nurodyta informaciniame lapelyje, vartotojas privalo patikrinti reagento efektyvumą (13).

Aiškių šio preparato nestabilumą rodančių požymių n÷ra. Tod÷l svarbu įvertinti normalias ląsteles analizuojamame audinio pjūvyje. Pasteb÷jus netik÷tą dažymosi pobūdį, kurio negalima paaiškinti laboratorinių procedūrų pokyčiais, ir įtarus, kad problema susijusi su HER2 IQFISH pharmDx™, kreipkit÷s į Dako technin÷s pagalbos tarnybą.

M÷ginio paruošimas - skrandis Skrandžio, įskaitant skrandžio ir stempl÷s jungtį, adenokarcinomos m÷giniai, paimti atliekant biopsiją, pašalinant dalį skrandžio ar atliekant rezekciją, turi būti tinkamai tvarkomi, kad audiniai būtų išsaugoti FISH tyrimui. Standartinis audinių apdorojimo

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 37/61

metodas imunocitocheminiam dažymui turi būti taikomas visiems m÷giniams (14). Tiriant mažus biopsijos m÷ginius, nustatykite nepažeisto auglio morfologiją ir įsitikinkite, kad jame yra pakankamas auglio ląstelių kiekis signalų registracijai. Jeigu biopsijos m÷ginys yra tiriamas naudojant HER2 FISH tyrimą, norint patikimai nustatyti HER2 būklę turi būti tiriami keli (7-8) biopsijos m÷giniai iš skirtingų auglio vietų.

Į parafin ą įlieti pj ūviai Tik neutraliame buferiniame formaline saugomi ir parafine įlieti audiniai yra tinkami naudoti. Pavyzdžiui, m÷giniai turi būti suskirstyti 3 arba 4 mm storio gabaliukais ir fiksuojami 18–24 valandas neutraliame buferintame formaline. ToGA tyrime biopsijos m÷giniai buvo fiksuojami 6–8 valandas (daugiau apie tyrimą žr. (25)). Tada audiniai dehidratuojami laipsniškai skiedžiamo etanolio ir ksileno seka, po to įterpiami į išlydytą parafiną, kuris laikomas ne didesn÷je nei 60 °C temperatūroje. Tinkamai fiksuotus ir įlietus audinius galima laikyti neribotą laiką prieš pjūvio darymą ir tvirtinimą ant objektinio stiklelio, jei jie laikomi v÷sioje vietoje (15–25 °C) (14, 15). Kiti fiksatyvai n÷ra tinkami.

Audinio m÷giniai turi būti pjaustomi 3–6 µm pjūviais.

Stikleliai, kurių reikia HER2 geno stiprinimui įvertinti ir patvirtinti naviko buvimą, turi būti paruošiami tuo pačiu metu. Rekomenduojama atlikti mažiausiai 2 serijinius pjūvius, 1 pjūvį naviko buvimui nustatyti, nudažytą hematoksilinu ir eozinu (H&E dažymas), ir pjūvį HER2 geno stiprinimo analizei. Rekomenduojama, kad audinių pjūviai būtų ruošiami ant „Dako Silanized Slides“ (kodas S3003) arba poli-L-lizinu dengtų stiklelių. M÷giniai turi būti analizuojami per 4–6 m÷nesius nuo pjūvio pa÷mimo, kai laikomi kambario temperatūroje (20–25 °C).

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 38/61

NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS - skrandis

A. Reagent ų paruošimas - skrandis Prieš dažant patogu pasiruošti toliau nurodytus reagentus:

A.1 Pirminio apdorojimo tirpalas 1 buteliuke gali susiformuoti kristalai, bet jie ištirps kambario temperatūroje. Prieš ruošdami reagentą įsitikinkite, kad n÷ra kristalų.

Atskieskite pakankamą kiekį iš 1 buteliuko (pirminio apdorojimo tirpalas 20x) skiesdami koncentratą santykiu 1:20 distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu. Nepanaudotas atskiestas tirpalas gali būti laikomas vieną m÷nesį 2–8 °C temperat ūroje. Išmeskite atskiestą tirpalą, jei yra drumzlių.

A.2 Stiprus plovimo buferinis tirpalas Atskieskite pakankamą kiekį iš 4 buteliuko (stiprus plovimo buferinis tirpalas 20x), skiesdami koncentratą santykiu 1:20 distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu. Nepanaudotas atskiestas buferinis tirpalas gali būti laikomas vieną m÷nesį 2–8 °C temperat ūroje. Išmeskite atskiestą buferinį tirpalą, jei yra drumzlių.

A.3 Plovimo buferinis tirpalas Atskieskite pakankamą kiekį iš 6 buteliuko (plovimo buferinis tirpalas 20x), skiesdami koncentratą santykiu 1:20 distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu. Nepanaudotas atskiestas buferinis tirpalas gali būti laikomas vieną m÷nesį 2–8 °C temperat ūroje. Išmeskite atskiestą buferinį tirpalą, jei yra drumzlių.

A.4 Apdorojimo etanoliu seka Iš 96 % etanolio tirpalo paruoškite 3 indelius atitinkamai su 70 %, 85 %, ir 96 % etanoliu. Laikykite uždengtus indelius kambario temperatūroje arba 2–8 °C temperat ūroje ir naudokite ne daugiau kaip 200 stiklelių. Jei tirpalai drumzlini, juos išmeskite.

A.5 Pepsino tirpalas Pepsino tirpalas reikalingas tik naudojant panardinimo į pepsino tirpalą metodą (C metodą). Paruoškite pepsino tirpalą, kaip nurodyta toliau: Talpykl÷je, kurioje telpa šeši stikleliai, paruoškite 60 mL pepsino tirpalo: Įpilkite 48 mL kambario temperatūros (20–25 °C) distiliuoto arba dejonizuoto vandens į talpą. Įpilkite 6 mL šalto (2–8 °C) pepsino skiediklio (10x ) (2B buteliukas) į talpyklę. Įpilkite 6 mL šalto (2–8 °C) pepsino (2A buteliukas) į talpyklę. Užd÷kite dangtelį ant talpykl÷s ir nustatykite pepsino tirpalo temperatūrą 37 (± 2) °C vandens vonel÷je. Talpyklei, kurioje telpa 24 stikleliai, paruoškite 240 mL pepsino tirpalo: Įpilkite 192 mL kambario temperatūros (20–25 °C) distiliuoto arba dejonizuoto vandens į talpyklę. Įpilkite 24 mL šalto (2–8 °C) pepsino skiediklio (10 x) (2B buteliukas) į talpyklę. Įpilkite 24 mL šalto (2–8 °C) pepsino (2A buteliukas ) į talpyklę. Užd÷kite dangtelį ant talpykl÷s ir nustatykite pepsino tirpalo temperatūrą 37 (± 2) °C vandens vonel÷je. Nustatytas pepsino tirpalas turi būti sunaudotas per 5 valandas.

B. Dažymo proced ūra - skrandis

B.1 Proced ūros pastabos Prieš naudodamas, naudotojas turi atidžiai perskaityti šias instrukcijas ir susipažinti su visais komponentais (žr. „Atsargumo priemon÷s“).

Visų reagentų temperatūra prieš naudojimą turi pasiekti atitinkamą temperatūrą, kaip aprašyta toliau.

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 39/61

1 buteliukas: atskiestas pirminio apdorojimo tirpalas turi būti sušildomas iki 95–99 °C , jeigu pirminiam apdorojimui naudojama vandens vonel÷ (B3. Dažymo protokolas, 1 etapas: pirminis apdorojimas, A metodas) Jei atliekant pirminį apdorojimą naudojama mikrobangų krosnel÷ su jutiklio galimybe (B3. Dažymo protokolas, 1 etapas: pirminis apdorojimas, B metodas), atskiestas pirminio apdorojimo tirpalas turi būti sušildomas iki kambario temperatūros 20–25 °C .

2A buteliukas: Pepsiną reikia naudoti 2–8 °C temperatūroje (B3, Dažymo protokolas, 2 etapas, A ir B metodas) ir toliau laikomas šaltai.

2B buteliukas: Pepsino tirpalas (10x) turi būti naudojamas 2–8 °C temperatūroje (B3, Dažymo protokolas, 2 etapas, C metodas).

3 buteliukas: HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinys, laikomas -18 °C temperat ūroje, skyla į dvi fazes. Prieš naudodami 3 indelį, šildydami zondų mišinį iki kambario temperatūros (20–25 °C ), įsitikinkite, kad yra viena faz÷, po to atliekamas maišymas. Šildykite 3 buteliuką kambario temperatūroje (20–25 °C) daugiausiai 30 minu čių (saugokite nuo stiprios šviesos), po to kruopščiai maišykite buteliuką 15 sekundžių sūkurin÷je maišykl÷je 2500 aps./min. greičiu. Iš karto po naudojimo laikykite 3 buteliuką -18 °C temperat ūroje.

4 buteliukas: Atskiestas stiprus plovimo buferinis tirpalas; prieš naudojimą vienas indas turi būti sušildomas iki kambario temperatūros, kitas indas turi būti sušildomas 63 (±2) °C temperatūrai.

5 buteliukas: Fluorescencijos ruošimo terp÷ gali būti naudojama esant 2–25 °C temperatūrai.

6 buteliukas: atskiestas plovimo buferinis tirpalas turi būti sušildomas iki kambario temperatūros 20–25 °C.

Dengiam ųjų stikleli ų sandariklis gali būti naudojamas 2–25 °C temperatūros diapazone. Visi etapai turi b ūti atliekami laikantis nurodyt ų temperat ūrų. Procedūrą sudaro tam tikras skaičius dehidracijų, po kurių atliekamas audinių pjūvių džiovinimas. Prieš pereidami prie kito etapo įsitikinkite, kad audinių pjūviai yra visiškai sausi. Neleiskite audinių pjūviams išdžiūti kitų procedūrų etapų metu.

Jeigu dažymo procedūra turi būti pertraukta, stikleliai atlikus deparafinizavimą gali būti laikomi plovimo buferiniame tirpale iki 1 valandos kambario temperatūroje (20–25 °C) be poveikio rezultatams.

B.2 Audini ų apdorojimas prieš dažym ą

Deparafinizavimas ir rehidratavimas: prieš atliekant analizę, stikleliai su audiniu turi būti deparafinizuoti fiksavimo priemonei pašalinti ir redihidratacijai atlikti. Steb÷kite, kad būtų pašalintas visas parafinas. D÷l įliejimo terp÷s likučių gali sustipr÷ti nespecifinis dažymasis. Šis etapas turi būti atliekamas (20–25 °C) kambario temperat ūroje. 1. Sud÷kite stiklelius į ksileno vonelę ir inkubuokite 5 (±1) minutes. Pakeiskite voneles ir

pakartokite vieną kartą. 2. Pastuksendami pašalinkite skysčio perteklių ir 2 (±1) minut÷ms stikliukus įd÷kite į 96 % etanolį.

Pakeiskite voneles ir pakartokite vieną kartą. 3. Pastuksendami pašalinkite skysčio perteklių ir 2 (±1) minut÷ms stikliukus įd÷kite į 70 % etanolį.

Pakeiskite voneles ir pakartokite vieną kartą. 4. Pastuksendami pašalinkite skysčio perteklių ir įd÷kite stiklelius į atskiestą plovimo buferinį

tirpalą (žiūr÷kite NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, A.3 skyrius) mažiausiai 2 minut÷ms. Prad÷kite dažymo procedūrą, kaip aprašyta B.3 skyriuje, 1 etape: pirminis apdorojimas.

Ksileno ir spirito tirpalai turi būti keičiami po 200 ar mažiau stiklelių.

Gali būti naudojami ksileno pakaitalai.

PASTABA: šiame rinkinyje pateikiami reagentai ir instrukcijos buvo sukurti optimaliam veikimui užtikrinti. Toliau skiedžiant reagentus arba keičiant inkubavimo laiką ar temperatūrą, galima gauti

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 40/61

klaidingus arba prieštaringus rezultatus. D÷l naudotojo laboratorijoje esančių audinių apdorojimo ir techninių procedūrų skirtumų galima gauti negaliojančius tyrimo rezultatus.

B.3 Dažymo protokolas

1 etapas: Pirminis apdorojimas Pirminis apdorojimas gali būti atliekamas naudojant vandens vonelę, kaip aprašyta A) metode, arba naudojant mikrobangų krosnelę su jutiklio galimybe, kaip aprašyta B) metode.

A metodas: Pradinis apdorojimas naudojant vandens vonelę Pripildykite dažymo indus, pvz., Coplin indus, atskiestu pirminio apdorojimo tirpalu (žr. NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, A.1 skyrius). Įd÷kite dažymo indus su atskiestu pirminio apdorojimo tirpalu į vandens vonelę. Pašildykite vandenį vandens vonel÷je ir pirminio apdorojimo tirpalą iki 95–99 °C. Pamatuokite temperat ūrą inde naudodami kalibruotą termometrą, kad įsitikintum÷te, jog temperatūra teisinga. Uždenkite indus dangčiais, kad stabilizuotųsi temperatūra ir išvengtum÷te garavimo.

Panardinkite kambario temperatūroje deparafinizuotus pjūvius į iš anksto pakaitintą pirminio apdorojimo tirpalą, esantį dažymo induose. Dar kartą patikrinkite temperatūrą ir inkubuokite 10 (±1) minučių 95–99 °C temperat ūroje. Išimkite iš vandens vonel÷s visą indą su stikleliais. Nuimkite dangtelį ir leiskite stikleliams ataušti pirminio apdorojimo tirpale 15 minučių kambario temperatūroje.

Perkelkite stiklelius į indą su atskiestu plovimo buferiniu tirpalu (žiūr÷kite NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, A.3 skyrius) ir palikite 3 minut÷ms kambario temperatūroje (20–25 °C).

Pakeiskite plovimo buferinį tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes.

PASTABA: pirminio apdorojimo tirpalas yra skirtas naudoti tik vieną kartą. Nenaudokite pakartotinai. B metodas: pirminis apdorojimas naudojant mikrobangų krosnelę su jutiklio galimybe Užpildykite plastikinį indą atskiestu kambario temperatūros (20–25 °C) pirminio apdorojimo tirpalu. Įmerkite deparafinizuotus pjūvius į pirminio apdorojimo tirpalą, uždenkite indą pradurtu dangteliu ir įd÷kite į mikrobangų krosnelę. Pasirinkite virimo jutiklio funkciją ir užprogramuokite, kad krosnel÷ veiktų 10 minučių po to, kai bus pasiekta virimo temperatūra*.

Po 10 minučių inkubacijos išimkite indą su stikleliais iš krosnel÷s, nuimkite dangtelį ir palikite aušti 15 minučių kambario temperatūroje. Perkelkite stiklelius į indą su atskiestu plovimo buferiniu tirpalu ir palikite mirkti 3 minutes kambario temperatūroje (20–25 °C). Pakeiskite plovimo buferin į tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes.

* Naudoti mikrobangų krosnelę su jutiklio galimybe reiškia, kad krosnel÷ turi tur÷ti jutiklį ir programas, kurios leistų iš pradžių įkaitinti pirminio apdorojimo tirpalą iki virimo temperatūros, o po to palaikyti reikalingą pradinio apdorojimo temperatūrą (virš 95 ºC) skaičiuojant numatytą laiką (10 (±1) minučių). Kai kurie mikrobangų krosnelių modeliai su jutiklio galimybe gali netur÷ti galimyb÷s laisvai nustatyti išsijungimo laiko. Jeigu modelis turi tik iš anksto nustatytas programas, įsitikinkite, kad pasirinkote programą, kuri palaiko reikalingą pradinio apdorojimo temperatūrą (virš 95 ºC) mažiausiai 10 (±1) minučių, ir rankiniu būdu sustabdykite programą po 10 (±1) minučių.


2 etapas: Paruoštas naudoti (PRN) pepsinas arba pep sino tirpalas Inkubacija pepsine gali būti atlikta tiesiogiai naudojant PRN pepsino lašus ant stiklelių kambario temperatūroje (20–25 °C) (A metodas) arba esant 37 °C temper atūrai (B metodas). Arba stiklelius galima įmerkti į pepsino tirpalą ir inkubuoti 37 (± 2) °C temperat ūroje (C metodas).

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 41/61

A metodas ir B metodas:

Stuksendami pašalinkite buferinio tirpalo perteklių. Naudojant šluostę be pūkų (tokią kaip sugeriančią servet÷lę arba marl÷s tamponą), kruopščiai išvalykite aplink m÷ginį, pašalindami bet kokį išlikusį skystį, bei laikykite reagentus jiems skirtoje vietoje.

Užlašinkite 5–8 lašus (250 µL) šalto (2–8 °C) pepsi no (2A indelis), kad uždengtų m÷ginį. Visada laikykite pepsiną 2–8 °C temperat ūroje.

A metodas: Pepsinas, PRN – inkubacijai 20–25 °C temp. Inkubuokite 5–15 minučių kambario temperatūroje (20–25 °C). 5–15 minu čių inkubacija yra pakankama daugeliui m÷ginių, bet optimalus inkubacijos laikas gali priklausyti nuo audinio fiksavimo ir (arba) m÷ginio storio ir turi būti nustatytas naudotojo. Pastuksenkite, kad nulaš÷tų pepsinas, įmerkite pjūvius į atskiestą plovimo buferinį tirpalą (žiūr÷kite NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, A.3 skyrius) ir palikite 3 minut÷ms kambario temperatūroje (20–25 °C). Pakeiskite atskiestą plovimo buferinį tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes. Tęskite dehidratavimą.

B metodas: Pepsinas, PRN – inkubacijai 37 °C temp. Įd÷kite m÷ginį su pepsinu į 37 °C kaitinimo blok ą – pvz., „Dako Hybridizer“ – ir inkubuokite 3–5 minutes. 5–15 minučių inkubacija yra pakankama daugeliui m÷ginių, bet optimalus inkubacijos laikas gali priklausyti nuo audinio fiksavimo ir (arba) m÷ginio storio ir turi būti nustatytas naudotojo. Pastuksenkite, kad nulaš÷tų pepsinas, įmerkite pjūvius į atskiestą plovimo buferinį tirpalą ir palikite 3 minut÷ms kambario temperatūroje (20–25 °C). Pakeiskite plovimo buferinį tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes. Tęskite dehidratavimą. Audinių pjūviai dehidratuojami palaipsniui etanoliu: 2 minutes 70 % etanolyje, 2 minutes 85 % etanolyje ir 2 minutes 96 % etanolyje. Leiskite audinių pjūviams visiškai išdžiūti. C metodas: pepsino tirpalas – įmerkiant stiklelius į 37 °C temperat ūros pepsino tirpalą

Rinkinyje esančių reagentų pakanka keturiems atskiriems partijų tyrimams (60 mL pepsino tirpalas, mažam konteineriui su šešiais stikleliais) arba vienai partijai (240 mL pepsino tirpalo, dideliam konteineriui su 24 stikleliais). Paruoškite pepsino tirpalą, kaip aprašyta A.5 skyriuje.

Užd÷kite dangtelį ant talpykl÷s ir nustatykite pepsino tirpalo temperatūrą 37 (± 2) °C vandens vonel÷je. Įsitikinkite, kad temperatūra stabilizavosi. Kalibruotu termometru išmatuokite temperatūrą talpykl÷s viduje, kad užtikrintum÷te tinkamą temperatūrą.

Stuksendami pašalinkite plovimo buferinio tirpalo perteklių. Įmerkite stiklelius į 37 (±2) °C pepsino tirpalą ir inkubuokite 20–30 minučių. 20–30 minučių inkubavimo trukm÷s pakanka daugeliui m÷ginių ištirti, bet optimali inkubavimo trukm÷ gali priklausyti nuo audinio fiksavimo ir (arba) m÷ginio storio ir ją turi nustatyti naudotojas.

Pastuksenkite, kad nulaš÷tų pepsinas, įmerkite pjūvius į atskiestą plovimo buferinį tirpalą ir palikite 3 minut÷ms kambario temperatūroje (20–25 °C). Pakeiskite plovimo buferinį tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes. Tęskite dehidratavimą.

Audinių pjūviai dehidratuojami palaipsniui etanoliu: 2 minutes 70 % etanolyje, 2 minutes 85 % etanolyje ir 2 minutes 96 % etanolyje. Leiskite audinių pjūviams visiškai išdžiūti ore.

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 42/61

3 etapas: HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinys HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinys, laikomas -18 °C temperat ūroje, skyla į dvi fazes. Prieš naudodami 3 buteliuką, šildydami zondų mišinį iki kambario temperatūros (20–25 °C ), įsitikinkite, kad yra viena faz÷, po to atliekamas maišymas. Šildykite 3 indelį kambario temperatūroje (20–25 °C) daugiausiai 30 minu čių (saugokite nuo stiprios šviesos), po to kruopščiai maišykite indelį 15 sekundžių sūkurin÷je maišykl÷je 2500 aps./min. greičiu. Iš karto po naudojimo laikykite 3 buteliuką -18 °C temperat ūroje. Užlašinkite 10 µL HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinio (3 indelis) ant audinio pjūvio centro. Nedelsdami užd÷kite 22 mm x 22 mm stiklinį dengiamąjį stiklelį ant zondų mišinio ir leiskite jam tolygiai pasiskirstyti po dengiamuoju stikleliu. Venkite oro burbuliukų. Jeigu pastebite oro burbuliukų, atsargiai išspauskite juos iš audinio žnypl÷mis.

Nepamirškite saugoti 3 indelio -18 °C temperat ūroje iš karto po naudojimo.

Užsandarinkite dengiamąjį stiklelį dengiamųjų stiklelių sandarikliu, išspausdami sandariklio kraštus aplink visą stiklelį. Leiskite, kad dengiamųjų stiklelių sandariklis persidengtų su dengiamuoju stikleliu ir stikleliu, taip suformuodamas sandarų tarpą aplink dengiamąjį stiklelį. Įsitikinkite, kad dengiamųjų stiklelių sandariklis uždengia visą dengiamojo stiklelio perimetrą.

Paruoškite „Dako Hybridizer“* (kodas S2450 arba S2451) hibridizacijos ciklui. Įsitikinkite, kad „Humidity Control Strips“ (kodas S2452) yra prisotintos ir optimaliai parinktos naudoti. Paleiskite „Hybridizer“ ir pasirinkite programą, kuri:

Denatūruotų 66 °C temperat ūroje 10 minučių, po kurios atliktų hibridizaciją 45 °C temperat ūroje 60–120 minučių.

Pad÷kite stiklelius į „Hybridizer‘, įsitikinkite, kad dangtelis yra tinkamai uždarytas, ir paleiskite programą. Nor÷dami rasti daugiau informacijos, žr. „Dako Hybridizer“ naudojimo instrukcijų vadovą. * Prietaisai, kurie leidžia sudaryti sąlygas, panašias į aprašytas anksčiau, gali būti naudojami denatūruoti ir hibridizuoti.

Pad÷kite stiklelį ant plokščio metalinio ar akmeninio paviršiaus (kaitinimo bloko arba ant bloko hibridizacijos krosnel÷je), įkaitinto iki 66 (±1) °C. Denat ūruokite lygiai 10 minučių.

Pad÷kite stiklelius į pašildytą dr÷gnos hibridizacijos kamerą. Uždenkite kamerą dangčiu ir inkubuokite 45 (± 2) °C temperat ūroje 60–120 minučių. Įsid÷m÷kite, kad 37 °C hibridizacijos temperatūra netinka naudoti zondams, esantiems šiame rinkinyje. 4 etapas: Plovimas stipriu plovimo tirpalu Pripildykite du dažymo indus, pvz., Coplin indus, atskiestu stipriu plovimo buferiniu tirpalu (žiūr÷kite NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, A.2 skyrius). Rekomenduojamas mažiausias tūris – 100 mL arba 15 mL kiekvienam stikleliui inde.

Įd÷kite vieną dažymo indų su atskiestu stipriu plovimo buferiniu tirpalu į kambario temperatūros traukos spintą, o kitą – į vandens vonelę. Kaitinkite vandens vonelę ir atskiestą stiprų plovimo buferinį tirpalą iki 63 (±2) °C. Įsitikinkite, kad temperatūra stabilizavosi. Uždenkite indą dangčiu, kad stabilizuotųsi temperatūra ir neleistum÷te garuoti. Pamatuokite temperatūrą vandens vonel÷je esančiame inde naudodami kalibruotą termometrą, kad užtikrintum÷te tinkamą temperatūrą. Stiprus plovimo buferinis tirpalas turi detergento ir 63 °C temperat ūroje gali pasidaryti drumstas; tai netur÷s įtakos jo savyb÷ms.

Naudodami žnyples arba pirštines išimkite stiklelius iš hibridizacijos kameros ir atsargiai nuimkite dengiamųjų stiklelių sandariklį bei dengiamąjį stiklelį ir po vieną sud÷kite stiklelius į kambario temperatūros pirminio plovimo indą.

Kai tik visi dengiamieji stikleliai bus nuimti, perkelkite stiklelius iš kambario temperatūros pirminio plovimo indo į 63 (±2) °C ind ą vandens vonel÷je.

Kai tik stikleliai bus perkelti į 63 (±2) °C temperat ūros indą vandens vonel÷je, iš karto prad÷s veikti laikmatis. Atlikite stiprų plovimą lygiai 10 minučių.

Išimkite stiklelius iš atskiesto stipraus plovimo buferinio tirpalo, įmerkite pjūvius į atskiestą plovimo buferinį tirpalą ir palikite 3 minut÷ms kambario temperatūroje (20–25 °C).

Pakeiskite atskiestą plovimo buferinį tirpalą ir mirkykite pjūvius dar 3 minutes.

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 43/61

Audinių pjūviai dehidratuojami palaipsniui etanoliu: 2 minutes 70 % etanolyje, 2 minutes 85 % etanolyje ir 2 minutes 96 % etanolyje.

Leiskite audinių pjūviams visiškai išdžiūti ore.

5 etapas: Tvirtinimas Užd÷kite 15 µL fluorescencijos ruošimo terp÷s, turinčios DAPI (5 buteliukas), ant stiklelio tiriamosios srities ir užd÷kite dengiantį stiklelį.

PASTABA: stikleliai gali būti analizuojami po 15 minučių arba per 7 dienas po tvirtinimo. Tačiau, jei stiklelius veikia šviesa ar aukštos temperatūros, bus stebimas išblukimas. Išblukimui sumažinti laikykite stikliukus tamsoje -18–8 °C temperat ūroje.

Kokyb ÷s kontrol ÷ - skrandis 1. Signalai turi būti šviesūs, ryškūs ir lengvai vertinami. 2. Normaliose ląstel÷se galima atlikti vidinę dažymo ciklo kontrolę.

• Normalios ląstel÷s turi tur÷ti 1–2 aiškiai matomus žalius signalus, rodančius, kad CEN-17 PNA zondas buvo s÷kmingai hibridizuotas į centromerinę 17 chromosomos sritį.

• Normalios ląstel÷s turi tur÷ti 1–2 aiškiai matomus raudonus signalus, rodančius, kad HER2 DNR zondas buvo s÷kmingai hibridizuotas į HER2 amplikoną.

• Jei audinys suskirstytas pjūviais, kai kurios normalios ląstel÷s tur÷s mažiau nei lauktus 2 kiekvienos spalvos signalus.

• Jei normaliose ląstel÷se neaptinkama signalų, tyrimas buvo ydingas ir rezultatus reikia laikyti negaliojančiais.

3. Branduolio morfologija turi būti intaktin÷ ir homogeniškai nudažyta, kai tyrimui naudojamas DAPI filtras. Jei yra daug „vaiduokliškų“ ląstelių ir bendrai prasta branduolio morfologija, tai rodo per didelį m÷ginio suskaidymą, d÷l kurio signalai buvo prarasti arba yra fragmentiški. Tokie m÷giniai laikytini negaliojančiais.

4. Mažiausias vertinamas naviko ląstelių skaičius yra 20. 5. D÷l audinio fiksavimo, apdorojimo ir įliejimo skirtumų naudotojo laboratorijoje galimi skirtingi

rezultatai – d÷l to būtina reguliariai vertinti vidines kontrol÷s priemones.

Dažymo proced ūros interpretavimas - skrandis Vertinamas audinys Nustatykite naviko vietą remdamiesi H&E nudažytu stikleliu ir vertinkite tą pačią sritį ant FISH nudažyto stiklelio (DAPI filtre). Analizuoti galima tik m÷ginius, gautus iš skrandžio, įskaitant skrandžio ir stempl÷s jungtį, adenokarcinoma sergančių pacientų. Jeigu tame pačiame m÷ginyje yra žarnyno metaplazija ir skrandžio adenokarcinoma, skaičiuoti reikia tik skrandžio adenokarcinomos rezultatus. Venkite didelio uždegimo, nekroz÷s sričių ir sričių, kuriose branduolin÷s ribos yra neaiškios. Neįtraukite branduolių, kuriems reikalingas subjektyvus vertinimas. Praleiskite branduolius su silpnu signalo intensyvumu ir nespecifiniu arba aukšto lygio fonu.

Prad÷kite tyrimą mikroskopu nuo pilnai FISH nudažyto pjūvio ir atitinkamai nuo srities, pažym÷tos H&E nudažytame pjūvyje. Prieš registruodami FISH nudažytą stiklelį, signalų registracijos lape pasižym÷kite bendrą signalų pasiskirstymą (homogeniškas ar heterogeniškas). Jei pasiskirstymas heterogeniškas, pasižym÷kite, ar tai yra židinio sustiprinimas, ar atskirų ląstelių (mozaikinis) sustiprinimas.

1) Homogeniškas signalų pasiskirstymas Jei signalų pasiskirstymas homogeniškas, atitinkamai užregistruokite chromosomų centromerų (žali signalai) skaičių ir HER2 genų (raudoni signalai) skaičių, didesnį nei 20 ląstelių 1-2 tiriamose naviko srityse.

2) Heterogeniškas signalų pasiskirstymas Jei signalų pasiskirstymas yra heterogeniškas, registruokite bendrą 20-ies ląstelių telkinių kiekį pasirinktose srityse, kaip parodyta toliau:

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 44/61

A) Jei yra židinio sustiprinimas, reik÷tų pasirinkti sritis su sustiprintomis ląstel÷mis. B) Jei yra mozaikinis pasiskirstymas arba sustiprintų, polisominių ir disominių ląstelių, skaičiuokite sritis su sustiprintomis ląstel÷mis. Šiose srityse į bendrą 20 ląstelių skaičių įskaičiuokite ne tik sustiprintas, bet ir šalia esančias nesustiprintas ląsteles.

Jei įmanoma, nesirinkite persidengiančių sričių. Nekreipkite d ÷mesio į bakterij ų DNR nusidažym ą Tam tikros specialios ląstel÷s (putliosios ląstel÷s ir makrofagai), išsim÷čiusios skrandžio audinyje, ryškiai nusidažo dažant HER2 zondu d÷l bakterin÷s DNR. Tod÷l atsiranda ryškiai raudonos ląstel÷s, kurios aiškiai skiriasi nuo ląstelių su dideliu HER2 geno amplifikacija. Signal ų registravimas Kai pasirinkote sritį signalams vertinti, prad÷kite analizę viename iš 20 gretimų pasirinktų branduolių ir tada skaičiuokite ląstelę po ląstel÷s, neskaičiuodami branduolių, kurie neatitinka kokybinių kriterijų. Suskaičiuokite signalus kiekvieno įvertinto branduolio ribose pagal toliau pateiktas gaires (taip pat žiūr÷kite 7 priedą).

- Tolinkite ir artinkite židinį, kol rasite visus signalus atskirame branduolyje. - Du to paties dydžio signalus, kuriuos skiria atstumas, (lygus ar) mažesnis nei signalo diametras,

skaičiuokite kaip vieną signalą. Atstumas turi būti bent jau lygus normalaus dydžio signalo diametrui, kad būtų galima suskaičiuoti du atskirus signalus. Jei atstumas tarp dviejų signalų yra mažesnis nei signalo diametras, signalus reikia skaičiuoti kaip vieną.

- Branduoliuose su aukštais HER2 genų stiprinimo lygiais HER2 signalai gali būti išd÷styti labai arti vienas kito ir sudaryti signalų telkinį. Tokiu atveju HER2 signalų skaičiaus negalima skaičiuoti, jį reikia apytiksliai įvertinti. Ypatingą d÷mesį reikia skirti žaliems signalams, nes raudonų HER2 signalų telkiniai gali uždengti žalius signalus, tod÷l juos bus sunku pamatyti. Jei abejojate, patikrinkite žalius signalus specialiu FITC (fluoresceino izotiocianato) filtru.

Nevertinkite branduolių be signalų arba tik su vienos spalvos signalais. Vertinkite tik branduolius, turinčius vieną arba daugiau kiekvienos spalvos FISH signalų.

Signal ų skai čiavimo nurodymai

1

Neskaičiuokite. Branduoliai persidengia, ne visos branduolių sritys matomos.

2 Du žali signalai, nevertinkite branduolių tik su vienos spalvos signalais

3 Skaičiuokite 3 žalius ir 12 raudonų signalų (telkinio vertinimas)

4 Skaičiuokite 1 žalią ir 1 raudoną signalą. Du to paties dydžio signalai, kuriuos skiria atstumas, lygus ar mažesnis už vieno signalo diametrą, skaičiuojami kaip vienas.

5 Neskaičiuokite (per daug arba per mažai suskaidyti branduoliai). Trūksta signalų branduolio centre (tuščiaviduris branduolys).

6 Skaičiuokite 2 žalius ir 3 raudonus signalus. Du to paties dydžio signalai, kuriuos skiria atstumas, lygus ar mažesnis už vieno signalo diametrą, skaičiuojami kaip vienas.

arbaa

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 45/61

7 Skaičiuokite 1 žalią ir 5 raudonus signalus

8 Skaičiuokite 3 žalius (1 žalias ne židinyje) ir 3 raudonus signalus

9 Raudonų signalų telkinys slepia žalius signalus, patikrinkite žalius signalus specialiu FITC filtru arba neskaičiuokite.

Įrašai skaičiuojami pagal lentelę, nurodytą 5 ir 6 prieduose.

Suskaičiuokite 20 branduolių iš kiekvieno m÷ginio, kai įmanoma, iš skirtingų auglio vietų.

Apskaičiuokite HER2/CEN-17 santykį padalydami visą raudonų HER2 signalų skaičių iš viso žalių CEN-17 signalų skaičiaus.

M÷giniai, kurių HER2/CEN-17 santykis didesnis arba lygus 2, turi būti vertinami kaip turintys sustiprintą HER2 geną (26).

Rezultatai, artimi ribiniam (1,8–2,2), turi būti interpretuojami atsargiai.

Jeigu santykis yra ribinis (1,8–2,2), suskaičiuokite dar 40 branduolių ir perskaičiuokite santykį pagal 40 branduolių rezultatus. Jei registracija ir toliau sutampa su riba, antrojo vertinimo rezultatas yra galiojantis. Jei įmanoma, d÷l geresn÷s orientacijos antros registracijos metu reik÷tų atlikti imunohistocheminį HER2 dažymą.

Jeigu kyla abejonių, m÷ginio stiklelis turi būti įvertinamas iš naujo. Ribiniais atvejais rekomenduojamos konsultacijos tarp patologo ir gydančio gydytojo.

Apribojimai - skrandis 1. FISH tyrimas yra kelių etapų procesas, reikalingas specialaus apmokymo, kaip pasirinkti

tinkamus reagentus, pasirinkti audinius, juos fiksuoti ir apdoroti, paruošti FISH tyrimo stiklelį ir interpretuoti dažymo rezultatus.

2. FISH rezultatai priklauso nuo elgesio su audiniais ir jų apdorojimo prieš dažymą. Netinkama fiksacija, džiovinimas, šildymas, pjūvis ar tarša kitais audiniais ar skysčiais gali tur÷ti įtakos zondo hibridizacijai. Netikslūs rezultatai gali būti ir d÷l fiksavimo ir įliejimo metodų variacijų arba audinyje paveld÷tų netaisyklingumų.

3. Kad būtų gauti optimalūs ir atkuriami rezultatai, audinių stikleliai turi būti visiškai deparafinizuoti. Parafino pašalinimas turi būti atliktas dažymo proceso pradžioje. (žiūr÷kite NAUDOJIMO INSTRUKCIJOS, B.2 skyrius).

4. Galima naudoti tik kalibruotos temperatūros vandens vonelę, kaitinimo bloką ir hibridizacijos krosnelę. Naudojant kitų tipų įrangą hibridizacijos metu gali garuoti HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinys, tai turi įvertinti vartotojas.

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 46/61

Veikimo charakteristika - skrandis Faktai Trastuzumabo (Herceptin™) saugumas ir efektyvumas buvo patvirtinti klinikiniais tyrimais (ToGA tyrimas) (25). Tai buvo atvirasis atsitiktinių imčių daugiacentris III faz÷s tyrimas su HER2 teigiamais pacientais, turinčiais neoperuojamą, vietiniai pažengusią, recidyvuojančią ir (arba) metastazavusią skrandžio arba skrandžio ir stempl÷s jungties adenokarcinomą. ToGA tyrime teigiamu HER2 rezultatu buvo laikomas pagal IHC teigiamas (3+) rezultatas (HercepTest™, Dako) ir (arba) pagal HER2 FISH teigiamas rezultatas (HER2/CEN-17≥2,0)(HER2 FISH pharmDx™ Kit, Dako (kodas K5331)). Įtrauktiems į tyrimą atsitiktinai atrinktiems pacientams buvo skirta chemoterapija (5-FU arba kapecitabinas ir cisplatina) arba chemoterapija ir trastuzumabas. Pirminis tyrimo ekvivalentinis taškas buvo bendrasis išgyvenimas (BI, angl. OS).

Tyrimų, kuriuose iš viso dalyvavo 594 pacientai, atsitiktinių imčių būdu buvo atrinkti 584 pacientai, kuriems buvo skiriama tiriamojo vaisto ir su kurių duomenimis buvo atliekamos visos numatytos (VN) analiz÷s. Pagal pirminį tyrimo baigiamąjį rodiklį sud÷tinio gydymo chemoterapija ir trastuzumabu rezultatai buvo statistiškai reikšmingai geresni, palyginti su gydymu vien chemoterapija. Vidutinis BI padid÷jo nuo 11,1 iki 13,8 m÷nesių (p=0,0046) su pavojaus santykiu 0,74 (95 % CI: 0,60–0,91). Kaplano-Mejerio BI kreiv÷s pateiktos 3 pav.

3 pav. Kaplano-Mejerio BI kreiv÷ (n=584).

Jeigu buvo pakankamai duomenų, buvo atliekama mokslin÷ tiriamoji pogrupių analiz÷ pagal iš anksto nustatytus kriterijus ir atsižvelgiant į HER2 būklę. Papildomai remiantis balais pagal IHC, post hoc buvo nustatyti du nauji HER2 pogrupiai: 1 grup ÷ („žemos HER2 išraiškos grup ÷“):

IHC 0/FISH+ ir IHC 1+/FISH+ (n=131)

2 grup ÷ („aukštos HER2 išraiškos IHC 2+/FISH+ ir IHC 3+ (FISH+ arba

11,1

Skaičius kair÷je Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp

Laikas (m÷nesiais)

Gydomoji grup ÷ Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp

„Log-Rank“ bandymas P = 0,0046

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

13,8

Išgyvenimo tikimyb÷

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 47/61

grup ÷“): FISH-, arba FISH be rezultato (n=446)

Kai pirmin÷ BI analiz÷ post hoc buvo pakartota su „aukštos HER2 raiškos grupe“ (n=446), sud÷tinio gydymo nauda buvo dar didesn÷. Vidutinis BI grup÷je, kurioje pacientams buvo taikoma chemoterapija ir skiriamas trastuzumabas, padid÷jo iki 16,0 m÷nesių, palyginti su 11,8 m÷nesio pacientų, kuriems buvo taikoma tik chemoterapija, grup÷je. Pavojaus santykis šiai analizei sumaž÷jo iki 0,65 (95 % CI: 0,51–0,83). „Didel÷s HER2 raiškos grup÷s“ Kaplano-Mejerio BI kreiv÷s pateikiamos 4 pav.

4 pav. „Didel÷s HER2 raiškos grup÷s“ Kaplano-Mejerio BI kreiv÷ (n=446). BO18255 tyrimas parod÷ abiejų testų - HercepTest™ ir HER2 FISH pharmDx™ Kit - klinikinį naudingumą vertinant HER2 būklę pacientams, turintiems neoperuojamą vietiniai pažengusią, recidyvuojančią ir (arba) metastazavusią skrandžio arba skrandžio ir stempl÷s jungties adenokarcinomą. Analitinis jautrumas Analitinis HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinio jautrumas buvo tiriamas su 18 skrandžio adenokarcinomos m÷ginių. HER2 signalų ir CEN-17 signalų skaičiaus santykis buvo apskaičiuotas remiantis 20 branduolių iš normalių ląstelių, supančių naviką, skaičiavimu. HER2/CEN-17 santykis 18 skrandžio adenokarcinomos m÷ginių buvo tarp 0,95 ir 1,06.

Analitinis specifiškumas HER2 DNR zondai HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinyje yra išd÷styti ir sužym÷ti, kad būtų apimami visi 218 kb, tarp jų ir HER2 genas.

CEN-17 PNA zondai HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinyje buvo testuojami atskirai ir kartu, kad būtų patvirtinta jų specifin÷ hibridizacija 17 chromosomos centromerin÷je srityje.

Siekiant pamatuoti tyrimo geb÷jimą savarankiškai identifikuoti ieškomas medžiagas HER2 ir CEN-17 be kitų medžiagų trukdžių, buvo atlikti tyrimai su skrandžio adenokarcinomos m÷giniais naudojant 3 buteliuką, kuriame buvo hibridizacijos buferinio tirpalo, bet be zondų mišinio. Visuose 18 m÷ginių buvo aptikta signalų, nesusijusių su

11,8

Išgyvenimo tikimyb÷

Skaičius kair÷je Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp

Laikas (m÷nesiais)

Gydomoji grup ÷ Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

16,0

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 48/61

zondų mišiniu. Nei viename iš 18 m÷ginių nebuvo aptikta kitų chromosomų taikinių ar artimai susijusių medžiagų trukdžių.

Atsparumo tyrimas HER2 IQFISH pharmDx™ tyrimo atsparumas buvo tikrinamas keičiant pradinio apdorojimo laiką, temperatūrą ir pradinio apdorojimo buferinio tirpalo šildymo metodus (mikrobangų krosnel÷ arba vandens vonel÷), pepsino inkubacijos laiką ir metodą (PRN pepsinas arba imersija), denatūravimo temperatūrą ir laiką, hibridizacijos laiką bei stipraus plovimo laiką ir temperatūrą.

Esant tokioms eksperimentin÷ms sąlygoms, nebuvo pasteb÷ta žymių rezultatų skirtumų: • Pradinio apdorojimo A metode 10 minučių vandens vonel÷ derinta su 95 °C, 95–99 °C

ir 99 °C temperat ūra, kartu su 9, 10 ir 11 minučių su 95–99 °C temperat ūra.

• Pradinio apdorojimo B metode mikrobangų krosnel÷ naudota 9, 10 ir 11 minučių su > 95 °C temperat ūra.

• Skaidymo pepsinu A metode taikyti inkubacijos laikai 5, 10 ir 15 minučių kambario temperatūroje (20–25 °C).

• Skaidymo pepsinu B metode taikyti inkubacijos laikai 3, 4 ir 5 minut÷s 37 °C temperatūroje.

• Skaidymo pepsinu C metode taikyti inkubacijos laikai 20, 25 ir 30 minučių, derinti su 35, 37 ir 39 °C temperat ūromis.

• 10 minučių trukm÷s denatūravimas derintas su 65, 66 ir 67 °C temperat ūromis kartu su 9, 10 ir 11 minučių 66 °C temperat ūroje.

• Hibridizacijos laikai 60, 90 ir 120 minučių 45 °C temperat ūroje.

• 10 minučių trukm÷s stiprus plovimas derintas su 61, 63 ir 65 °C temp eratūromis kartu su 9, 10 ir 11 minučių 63 °C temperat ūroje.

Pastaba: tiriant atsparumą vienu metu buvo keičiamas tik vienas dažymo procedūros parametras, o kiti buvo paliekami pastovūs. Rekomenduojama laikytis laikų ir temperatūrų, nurodytų dažymo procedūroje. Dažymo procedūra HER2 IQFISH pharmDx™ siūlo įvairių protokolo parametrų šiluminiam pradiniam apdorojimui, skaidymui pepsinu ir hibridizacijos laikui. Kiekviena unikali derinimo parinktis buvo įvertinta atsižvelgiant į HER2 geno būklę. Buvo įvertinti 10 FFPE (formalinu fiksuotų, į parafiną įlietų) skrandžio ir skrandžio ir stempl÷s jungties adenokarcinomos m÷ginių, kiekvienai iš 12 galimų derinimo parinkčių. HER2 FISH pharmDx™ rinkinys (K5331) buvo naudojama kaip pamatin÷ vert÷. HER2/CEN-17 santykis kiekvienam m÷giniui parodytas 5 paveiksl÷lyje. Kryžmin÷ tabuliacija tarp 12 testų ir pamatinio dažymo parod÷ bendrą atitikimą su HER2 geno būkle 100 % (10/10) su atitinkamai 78,3 % ir 100 % apatin÷mis ir viršutin÷mis dvipus÷mis 95 % pasikliauties intervalo ribomis. Kappa vert÷ buvo lygi 1,00, o McNemars testas parod÷, jog paklaidos n÷ra (dvipus÷ p-vert÷ lygi 1,00).

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 49/61

5 pav. Atskiri HER2/CEN-17 santykiai su 10 skrandžio adenokarcinomos m÷ginių, nudažytų naudojant 12 galimų derinimo protokolo variacijų, kaip pamatinę vertę (R) naudojant „HER2 IQFISH pharmDx™“ (kodas K5731) (1-12 testai) ir „HER2 FISH pharmDx™ Kit“ rinkinį (kodas K5331). Horizontali linija rodo ribinę 2,0 vertę.

Kartojimasis HER2/CEN-17 santykio kartojimasis buvo tirtas su HER2 IQFISH pharmDx™ tyrimu naudojant iš eil÷s einančius pjūvius iš devynių skirtingų skrandžio adenokarcinomos m÷ginių su sustiprinta arba nesustiprinta HER2 geno būkle. Kiekvieno ciklo metu kiekvieno m÷ginio pjūviai buvo tiriami tris kartus. Vidutinis nuokrypio koeficientas nesustiprintuose m÷giniuose buvo 3,5 % (nuo 1 % iki 5 %) ir 2,8 % sustiprintuose m÷giniuose (nuo 1 % iki 5 %).

Kartojimasis gretimuose skirtingų storių (2, 3, 4, 5, 6, ir 7 µm) skrandžio adenokarcinomos m÷ginių pjūviuose buvo tiriamas su HER2 IQFISH pharmDx™ rinkiniu. Vidutinis HER2/CEN-17 santykio nuokrypio koeficientas buvo 4,5 % (nuo 3 % iki 6 %). T. y. toks pat santykis, kaip vienodo storio audinių ir telpantis į iš anksto nustatytus pripažinimo kriterijus.

Atkuriamumas HER2 IQFISH pharmDx™ tyrimas buvo tiriamas tikrinant atkuriamumą skirtingomis partijomis ir dirbant skirtingiems steb÷tojams, naudojant tris partijas HER2 IQFISH pharmDx™ ir dirbant trims steb÷tojams. Atkuriamumas buvo tiriamas devyniuose skirtinguose skrandžio adenokarcinomos m÷giniuose su sustiprinto arba nesustiprinto HER2 geno būkle.

Vidutinis skirtingų partijų nuokrypio koeficientas nesustiprintuose m÷giniuose buvo 3,8 % (nuo 2 % iki 7 %), o sustiprintuose m÷giniuose 1,8 % (nuo 1 % iki 3 %).

Vidutinis skirtingų steb÷tojų atkuriamumo nuokrypio koeficientas nesustiprintuose m÷giniuose buvo 4,3 % (nuo 3 % iki 5 %), o sustiprintuose m÷giniuose 4,4 % (nuo 2 % iki 7 %). 78,8 % skrandžio andenokarcinomos m÷ginių buvo gauti rezekcijos ir 22,2 % biopsijos būdu. 55,6 % m÷ginių buvo paimti iš skrandžio, o 44,4 % iš skrandžio ir stempl÷s jungties.

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 50/61

Klinikinis naudingumas Klinikinis Dako HER2 IQFISH pharmDx™ (kodas K5731) naudingumas buvo tirtas atlikus lyginamąjį tyrimą su Dako HER2 FISH pharmDx™ Kit rinkiniu (kodas K5331). Tyrimas ap÷m÷ 79 skrandžio v÷žio m÷ginius, susidedančius iš skirtingų skrandžio adenokarcinomos audinių tipų, t. y. skrandžio arba skrandžio ir stempl÷s jungties adenokarcinomos bei rezekcijų ar biopsijų m÷giniai su homogenišku arba heterogenišku (židininiu ar mozaikiniu) signalų pasiskirstymu. Visuose navikuose buvo vertinama HER2 baltymo raiškos būkl÷ naudojant Dako HercepTest™ (kodas K5207). M÷giniai, gauti iš kiekvieno iš keturių IHC vertinimo grupių (0, 1+, 2+, 3+), buvo įtraukti į tyrimą. Kryžmin÷ HER2 būkl÷s tabuliacija, gauta atlikus du tyrimus, pateik÷ 98,7 % bendrą atitikimą su apatin÷mis ir viršutin÷mis 95 % pasikliauties intervalo ribomis, kai pasikliauties intervalas buvo 94,2 % ir 99,9 %. Kappa vert÷ buvo 0,97 su apatin÷mis ir viršutin÷mis 95 % pasikliauties intervalo ribomis, intervalui esant tarp 0,92 ir 1,00. McNemars testo p-vert÷ buvo 1,00, tai reiškia, jog tarp dviejų testų paklaidos n÷ra.

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 51/61

Trik čių šalinimas - skrandis Problema Galima priežastis Si ūlomi veiksmai 1. N÷ra signalų arba

silpni signalai 1a. Rinkinys buvo laikomas

aukštoje temperatūroje transportuojant arba saugant

1a. Patikrinkite laikymo sąlygas. Įsitikinkite, kad buvo sausojo ledo, kai buvo gauta prekių siunta. Įsitikinkite, kad 3 buteliukas buvo laikomas -18 °C temperat ūroje tamsoje. Įsitikinkite, kad 2A ir 5 buteliukai buvo laikomi ne didesn÷je kaip 2–8 °C temperatūroje tamsoje.

1b. Mikroskopas veikia netinkamai.

- Netinkamas filtrų rinkinys. - Netinkama lempa. - Pasenusi gyvsidabrio

lempa. - Nešvarūs ir (arba) įskilę

kolektoriaus lęšiai. - Netinkamas imersin÷ alyva.

1b. Patikrinkite mikroskopą ir įsitikinkite, kad naudojami filtrai yra tinkami naudoti su rinkinio fluorochromais ir kad gyvsidabrio lempa yra gera ir jos galiojimo laikas yra nepasibaigęs. (žiūr÷kite 7 priedą). Jei abejojate, kreipkit÷s į vietinį jūsų mikroskopo pardav÷ją.

1c. Išblukę signalai.

1c. Venkite pernelyg ilgo tyrimo mikroskopu ir sumažinkite tenkantį stiprios šviesos kiekį.

1d. Netinkamos pirminio apdorojimo sąlygos

1d. Užtikrinkite, kad būtų laikomasi rekomenduojamų pirminio apdorojimo temperatūros ir laiko.

1e. Hibridizacijos metu išgaravo zondų mišinys

1e. Užtikrinkite pakankamą dr÷gmę hibridizacijos kameroje

2. N÷ra žalių signalų 2a. Netinkamos plovimo stipriu tirpalu sąlygos

2a. Užtikrinkite, kad būtų naudojama rekomenduojama plovimo stipriu tirpalu temperatūra bei laikas ir kad dengiamieji stikleliai būtų išimti prieš plaunant stipriu tirpalu

3. N÷ra raudonų signalų

3a. Netinkamos pirminio apdorojimo sąlygos

3a. Užtikrinkite, kad būtų laikomasi rekomenduojamų pirminio apdorojimo temperatūros ir laiko.

4. Sritys be signalo 4a. Per mažas zondo tūris

4a. Įsitikinkite, kad zondo kiekis pakankamas plotui po dengiamuoju stikleliu uždengti

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 52/61

Problema Galima priežastis Si ūlomi veiksmai 4b. Naudojant arba fiksuojant

zondų mišinį pateko oro burbuliukų

4b. Venkite oro burbuliukų. Jeigu pastebite, lengvai pastuksenkite žnypl÷mis, kad jie išsisklaidytų

5. Pernelyg stiprus fono nudažymas

5a. Netinkamas audinio fiksavimas

5a. Užtikrinkite, kad būtų naudojami tik formalinu fiksuoti, į parafiną įlieti audinio pjūviai

5b. Nevisiškai pašalintas parafinas

5b. Vykdykite deparafinizavimo ir rehidratavimo procedūras, aprašytas B.2 skyriuje

5c. Plovimo stipriu tirpalu temperatūra per žema

5c. Užtikrinkite, kad plovimo stipriu tirpalu temperatūra būtų 63 (±2) °C

5d. Hibridizuotas pjūvis per ilgai laikytas stiprioje šviesoje

5d. Venkite pernelyg ilgo tyrimo mikroskopu ir sumažinkite tenkantį stiprios šviesos kiekį

6. Silpna audinio morfologija

6a. Neteisingai naudojamas pepsinas

6a. Laikykit÷s rekomenduojamų pepsino inkubavimo trukmių. Žiūr÷kite B.3 skyrių, 2 etapą.

Užtikrinkite, kad pepsinas būtų laikomas tinkamoje temperatūroje. Žiūr÷kite B.1 skyrių

6b. Neteisingos pirminio apdorojimo sąlygos gali lemti neskaidrumą ir drumstumą

6b. Užtikrinkite, kad būtų laikomasi rekomenduojamų pirminio apdorojimo temperatūros ir laiko

6c. Per ilgas pepsino apdorojimas arba labai ponas pjūvis gali lemti dubliuotų arba tuščiavidurių ląstelių atsiradimą.

6c. Sutrumpinkite pepsino inkubavimo trukmę. Žiūr÷kite B.3 skyrių, 2 etapą. Užtikrinkite, kad pjūvio storis būtų 3–6 µm.

7. Intensyvi žalia autofluorescencija ant stiklelio, apimant vietas be FFPE audinio.

7. Nerekomenduojamų arba pasibaigusio galiojimo stiklelių naudojimas

7. Įsitikinkite, kad padengtų stikliukų („Dako Silanized Slides“, kodas S3003, arba poli-L-lizinu-padengti stikliukai) galiojimo data nepasibaigusi.

PASTABA: jei problemos negalima priskirti n÷ vienai iš išvardytų priežasčių arba jei jos nepašalina siūlomi sprendimo būdai, kreipkit÷s pagalbos į „Dako“ technin÷s pagalbos tarnybą.

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 53/61

4 priedas - skrandis

HER2 IQFISH pharmDx™, kodas K5731 Protokolo kontrolinis sąrašas Dažymo ciklo žurnalo ID: ______________ Ciklo data: __________________ HER2 IQFISH pharmDx™, K5731, partija: __________________ M÷ginio ID: __________________ Įrangos ID: __________________ 1x plovimo buferinio tirpalo skiedimo / galiojimo data (6 buteliukas, atskiestas 1:20): _________ /_________

Audinys fiksuotas neutraliame buferintame formaline Taip Ne

1 etapas: pradinis apdorojimas Pirminio apdorojimo tirpalo skiedimo / galiojimo data (1 buteliukas, atskiestas 1:20)

/

Pirminio apdorojimo tirpalo pamatuota temperatūra (95–99 °C), jeigu kaitinama naudojant vandens vonel ę

°C

Pradinis apdorojimas (10 minučių) ir aušinimas (15 minučių)


2 etapas: pepsinas

Pepsino (2 buteliukas) apdorojimo trukm÷ 37 °C temperatūroje arba

minučių

Pepsino (2 buteliukas) apdorojimo trukm÷ kambario temperatūroje arba

minučių

Pepsino imersijos trukm÷ 37 (± 2) °C temperat ūroje minučių



3 etapas: HER2/CEN-17 IQISH zondų mišinys

Užpilkite zondų mišinio (3 buteliukas), uždenkite dengiamuoju stikleliu ir užsandarinkite dengiamųjų stiklelių sandarikliu

Pamatuota denatūracijos temperatūra (66 (±1) °C) °C

Denatūravimas 10 minutes

Pamatuota hibridizacijos temperatūra (45 (± 2) °C) °C

Hibridizacijos laikas (nuo 60 iki 120 minučių) minučių

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 54/61

4 etapas: plovimas stipriu plovimo tirpalu

Stipraus plovimo buferinio tirpalo skiedimo / galiojimo data (4 buteliukas, atskiestas 1:20)

/

Pamatuota stipraus plovimo buferinio tirpalo temperatūra (63 (± 2) °C)

°C

Plovimas stipriu tirpalu (10 minučių) nu÷mus dengiamąjį stiklelį


°C


minučių

5 etapas: tvirtinimas

Užd÷kite 15 µl fluorescencijos ruošimo terp÷s (5 buteliukas) ir užd÷kite dengiamąjį stiklelį

Komentarai:


Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 55/61


HER2 IQFISH pharmDx™, kodas K5731 Vertinimo schema

HER2 IQFISH pharmDx™, K5731, partija: __________ Dažymo ciklo žurnalo ID: __________ Ciklo data: ________________________ M÷ginio ID: _______________

Signal ų pasiskirstymo audinyje apib ūdinimas : Homogeniškas:

Heterogeniškas – židininis: arba Heterogeniškas – mozaikinis:

Skaičiuojami 20 branduolių signalai

Branduoli ų Nr. Raudonas (HER2)

Žalias (CEN-17) Branduoli ų Nr. Raudonas

(HER2) Žalias (CEN-17)

1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 9 19 10 20

Iš viso 1-10 Iš viso 11–20

Nor÷dami nustatyti HER2/CEN-17 santykį, suskaičiuokite HER2 signalų kiekį ir CEN-17 signalų kiekį tuose pačiuose 20 branduolių ir padalykite visą HER2 signalų skaičių iš viso CEN-17 signalų skaičiaus. Jeigu HER2/CEN-17 santykis yra artimas ribiniam (1,8–2,2), suskaičiuokite dar 40 branduolių ir perskaičiuokite santykį (žr. perskaičiavimo vertinimo schemą). Santykiai, lygūs arba artimi ribiniam (1,8–2,2), turi būti interpretuojami atsargiai (žr. skaičiavimo nurodymus).

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 56/61

� Santykis < 2: HER2 genų stiprinimas nepasteb÷tas

� Santykis ≥ 2: HER2 genų stiprinimas pasteb÷tas



Vertinimo nurodymai: žr. „Dažymo rezultatų interpretavimas“

HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 santykis

BENDRAS REZULTATAS (1–20)

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 57/61


HER2 IQFISH pharmDx™, kodas K5731 Perskai čiavimo vertinimo schema

HER2 IQFISH pharmDx™, K5731, partija: _________ Dažymo ciklo žurnalo ID: ___________ Ciklo data: ________________________ M÷ginio ID: ______________

Papildom ų 40 branduoli ų signalai (1-40)

Branduoli ų Nr.

Raudonas HER2

Žalias CEN-17

Branduoli ų Nr.

Raudonas

HER2

Žalias CEN-17

Branduoli ų Nr.

Raudonas

HER2

Žalias CEN-17

Branduoli ų Nr.

Raudonas HER2

Žalias CEN-17

1 11 21 31

2 12 22 32

3 13 23 33

4 14 24 34

5 15 25 35

6 16 26 36

7 17 27 37

8 18 28 38

9 19 29 39

10 20 30 40

Iš viso 1-10

Iš viso

11-20

Iš viso

21-30

Iš viso

31-40

Nor÷dami nustatyti HER2/CEN-17 santykį, suskaičiuokite HER2 signalų kiekį ir CEN-17 signalų kiekį tuose pačiuose 40 branduolių bei padalykite visą HER2 signalų skaičių iš viso CEN-17 signalų skaičiaus. Įrašykite bendr ą rezultat ą, gaut ą iš 1-40 branduoli ų, į pateikt ą lentel ę.

� Santykis < 2: HER2 genų stiprinimas nepasteb÷tas � Santykis ≥ 2: HER2 genų stiprinimas pasteb÷tas



Vertinimo nurodymai: žr. „Dažymo rezultatų interpretavimas“

HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 santykis

BENDRAS REZULTATAS (1-40)

Skrandžio v ÷žys

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 58/61


HER2 IQFISH pharmDx™, kodas K5731 Fluorescencinio mikroskopo specifikacijos Dako rekomenduoja toki ą įrangą naudoti su HER2 IQFISH pharmDx™, K5731:

1. Mikroskopo tipas

• Epifluorescencinis mikroskopas.

2. Lempa • 100 vatų gyvsidabrio lempa (fiksuokite degimo laiką).

3. Objektyvai • Tiriant audinius, taikomi fluorescenciją sausai 10x arba fluorescenciją imersiniame aliejuje

16x didinantys objektyvai.

• Didelio galingumo padidinimui vertinant signalus rekomenduojama naudoti tik fluorescencijai imersiniame aliejuje skirtus objektyvus, pvz. 100x.

4. Filtrai Filtrai yra individualiai sukuriami atsižvelgiant į specifiniams fluorochromus ir turi būti pasirenkami atitinkamai. Dako rekomenduoja naudoti specifinius DAPI filtrus kartu su aukštos kokyb÷s „Texas Red“/FITC dvigubu filtru.

• DAPI filtras, pvz., Chroma filter # 31000.

• „Texas Red“/FITC dvigubas filtras, pvz., Chroma filter # 51006.

• „Texas Red“ ir FITC pavienius filtrus galima naudoti patvirtinimui.

Fluorochromas Sužadinimo bangos ilgis Emisijos bangos ilgis

FITC 495 nm 520 nm

„Texas Red“ 596 nm 615 nm

Kiekvieno mikroskopo filtrai yra specifiški ir, norint interpretuoti rezultatus, būtina naudoti tinkamus filtrus. Nor÷dami gauti smulkesn÷s informacijos, kreipkit÷s į Jūsų mikroskopo tiek÷ją arba savo Dako atstovą.

5. Aliejus • Nefluorescuojanti alyva.

Atsargumo priemon ÷s • Nerekomenduojama 50 vatų gyvsidabrio lempa.

• Negalima naudoti rodamino filtrų.

• Nerekomenduojama naudoti trigubų filtrų. Naudojant neoptimizuotą mikroskopą gali kilti problemų nuskaitant fluorescencinius signalus. Svarbu, kad šviesos šaltinis nebūtų pasibaigusios galiojimo datos ir būtų tinkamai nukreiptas bei sufokusuotas. Pirk÷jai turi steb÷ti ir laikytis gyvsidabrio lempų gamintojo rekomendacijų. Mikroskopas turi būti prižiūrimas, o gyvsidabrio lempa turi būti sureguliuota prieš interpretuojant rezultatus. Turi būti stengiamasi m÷ginį kaip įmanoma trumpiau laikyti sužadinimo šviesoje, norint išvengti fluorescencijos išblukimo. Rekomenduojame pasitarti su gamintoju d÷l savo mikroskopo nustatymų prieš pradedant fluorescencinę in situ hibridizaciją arba žr. atitinkamą literatūrą.

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 59/61

Literat ūra 1. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia

viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1997;76(1-2):34-5.

2. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230(4730):1132-9.

3. King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbB-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229(4717):974-6.

4. Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol 1999;9(4):319-25.

5. Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89(12):5321-5.

6. Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci 2000;30(1):41-8.

7. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235(4785):177-82.

8. Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res 2001;61(3):1214-9.

9. Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res 1990;50(14):4332-7.

10. Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci 2002;32(1):3-11.

11. Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16(2):173-82.

12. Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press 1999.

13. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29-A. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA: NCCLS. 1997.

14. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February 28. 1992.

15. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company. 1980.

16. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press 1981.

17. Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92(12):2965-74.

18. Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2000;53(12):890-2.

19. Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology 2001;61 Suppl 2:22-30.

20. Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78(1):26-33.

21. Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007;59(6):795-805.

22. Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008;32(1):89-95.

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 60/61

23. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-HER2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005;27(3):681-5.

24. Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16(2):273-8.

25. Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010; 376(9742):687-97

26. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology 2008;52(7):797-805.

(128969-001) P04090LT_01_K573111-2/2015.06 p. 61/61

Simboli ų paaiškinimas

Katalogo numeris

Temperatūros ribos Serijos numeris

In vitro medicinos prietaisas

Saugoti nuo šviesos (žr. skyrių “Laikymo sąlygos”)

Tinka iki

Žr. naudojimo nurodymus

Pakanka <n> tyrimų

Gamintojas

GHS piktograma (žr. atsargumo priemonių skiltį)





Gamintojas: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danija Tel. +45 44 85 95 00 Faks. +45 44 85 95 95 www.dako.com

Documents

HER2 IQFISH pharmDx™