Niklas Dahrén

Högupplösande vätskekromatografi (HPLC)

Högupplösande vätskekromatografi (HPLC)

ü HPLC=”high performance liquid chromatography”ellerpåsvenska”högupplösandevätskekromatografi”.

ü HPLCärenavanceradkemiskanalysmetod somanvändsfört.ex.gift-,drog- ochläkemedelsanalyser.Kanävenanvändasföranalyseravdopingpreparat,brandfarligavätskor,miljögifterochmångaandraämnen.

ü HPLCärenavanceradform avvätskekromatografi.Detfinnsävenandraenklareochmerbegränsadeformeravvätskekromatografi,t.ex.papperskromatografi,tunnskiktskromatografi,jonbyteskromatografiochgelfiltrering.

ü Namnet”kromatografi”kommeravdetgrekiskaordet”chroma” sombetyderfärg.Ibörjananvändeskromatografiska metoderendastförfärgadeämnenmennuanvändsdessaäventillofärgadeämnensånamnetärdärförlitemissvisande.

Vilka olika typer av analyser kan utföras med HPLC?

1. Separera(rena)olikaämnensomfinnsiettprov:Vikanskeharettprovsominnehållerettstortantalolikaämnen,menviärenbartintresseradeavettavdessaämnen.VikandåanvändaHPLCförattsepareraämnenafrånvarandraochdärmed”isolera”detämneviäruteefter.

2. Undersökavilkaokändaämnensomfinnsiettprov:Vikanidentifieraokändaämnen(t.ex.gifter,droger,dopingpreparat,miljögifter,brandfarligavätskorellerläkemedel)meddennametod.OmvidessutomkopplarvårHPLCtillenmasspektrometer(enspecielldetektor)fårviettmycketkraftfulltverktygförattidentifieraokändaämnen.

3. Bestämmakoncentrationenavolikaämnensomfinnsiettprov:HPLCkanocksåanvändaskvantitativtförattmätakoncentrationenavdeämnensomfinnsiettprov.

4. Renhetstester:Vikanundersökaomettprovärförorenatmedandraämnensomintebörfinnasdär(t.ex.renhetstesteravläkemedelellerlivsmedel).

En högupplösande vätskekromatograf (HPLC)

3 saker viktiga saker som ingår i en HPLC-analys

ü Prov:IHPLCtillsättsettprovinnehållandeolikaämnensomskaanalyseras.

ü Mobilfas:IHPLCfinnsens.k.mobilfas(rörligfas)sombeståravenvätska(enblandningavolikaämnen).Syftetmeddenmobilafasenäratttransporteraprovetgenomvätskekromatografen,alltsågenomdenmaskinsomskautförasjälvaanalysen.

ü Stationärfas:IHPLCfinnsenkolonn(ettihåligtrör)sompåinsidanärbekläddmedenstationärfas(stillaståendefas)sombeståravolikamolekyler.Denstationärafasenkanvaraifastformellerbeståaventrögflytandevätska.Molekylernasuppgiftidenstationärafasenärattbindatilldeolikaämnenaiprovetsåattdessaämnenbromsasuppinutikolonnen.Vissaämnenkanbindamycketstarkaretillmolekylernaidenstationärafasenochtardärförlängretidpåsiggenomkolonnen.

Principen bakom HPLC

Detektor

Pump

Mobilfas

Ikolonnenseparerasämnenaiprovetfrånvarandraeftersomolikaämnenbinderolikalätttilldenstationärafasenikolonnenochkommerdärförutvidolikatidpunkter.Antingenanvändsenpolärelleropolärstationärfasikolonnen.Polärkolonnomdenmobilafasenäropolär,opolärkolonnomdenmobilafasenärpolär.

Iinjektorntillsättsprovet.

Injektor

Enpumpsompumpardenmobilafasenochprovetgenomhelasystemet.

Detektorngörettkromatogramdärvarjetoppmotsvararettämneiprovet

Detektorn”kännerav”närmolekylernaavettämnepasserarochregistrerarämnetsretentionstidochsignalstyrkan(hurmycketdetfinnsavämnet).

Behållaremeddenmobilafasen(vätska).Denmobilafasenärantingenpolärelleropolär.

Kolonnmedstationärfas

En högupplösande vätskekromatograf (HPLC)

Exempel på ett kromatogram

Bildkälla:"Hplc-perfume-chromatogram"byLukke - Own work.Licensed underCCBY-SA3.0viaCommons -https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Hplc-perfume-chromatogram.png#/media/File:Hplc-perfume-chromatogram.png

Retentionstiden

Intensite

ten(signa

lstyrkan)

ü Retentionstiden:Retentionstidenärspecifikförvarjeämneiettgivetsystemochdärförkanvianvändaretentionstidenförattidentifieraolikaämnen(kvalitativanalys).

ü Toppensarea:Detektornmäterintensiteten(signalstyrkan)avvarjeämnesompasserar,vilketmotsvararhurmångamolekyleravämnetsompasserardetektorn.Utifråndetritasentopputikromatogrammet därareanavtoppenmotsvararhurhögkoncentrationviharämnet(kvantitativanalys).

Exempel: Analys av droger i ett urinprov med hjälp av HPLC

Bildkälla:ByJamesHeilman,MD(Own work)[CCBY-SA3.0(http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)],viaWikimediaCommons.http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/29/Pyuria2011.JPG.

ü Dekemiskaforensikerna påNationelltforensisktcentrum(NFC)iLinköpingfårtilluppgiftattanalyseraetturinprovfrånenpersonsommisstänkshaintagitnågonformavdrog.

ü Forensikerna väljerattanalyseraprovetmedhjälpavHPLC.

Kända retentionstider för några utvalda ämnen (obs. påhittade retentionstider)

Utseende: Ämne: Retentionstid(min):

Urinämne 2,5

Kokain 6,0

Anabola steroider 8,2

Amfetamin 8,9

ü Innandeutföranalysentardeframentabellmedkändaretentionstiderfördeämnendemisstänkerkanfinnasiurinprovet(obs.påhittaderetentionstider!).Genomattjämföradeerhållnaretentionstidernameddekändasåkandelistautvilkaokändaämnensomfinnsiurinprovet.

Vilket eller vilka ämnen finns i urinprovet?

Ämnensompasserardetektorn:

Retentionstid(min): Identifiering utifråndekändaretentionstiderna:

6,0

Slutsats:Urinprovetinnehållerurinämneochkokain.

2,5

Kokain

Urinämne

Stationärfas

Stationärfas

Detektorn

Kromatogram av urinprovet

02468

101214

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 Retentionstiden

Intensiteten

Urinämne(urea)

Kokain

HPLC-analyser kan utföras på 2 olika sätt1. Normal-fas-kromatografi(polärkolonn):

§ Denmobilafasenäropolärmedandenstationärafasenärpolär(enpolärkolonnanvänds).§ Polärkolonninnebärattpoläraämnenkommerbromsasuppmestochfålängstretentionstid:

Poläraämnenbindermedstarkavätebindningar(ellervanligadipol-dipolbindningar)tilldenpolärastationärafasenoch”bromsas”därförmestikolonnen.Opoläraämnenbinderintelikastarkttilldenstationärafasen(kaninteskapavätebindningarellervanligadipol-dipolbindningar)ochåkerdärförutförstgenomkolonnen.

2. Omvänd-fas-kromatografi(opolärkolonn):§ Denmobilafasenärpolärmedandenstationärafasenäropolär(enopolärkolonnanvänds).§ Opolärkolonninnebärattopoläraämnenkommerbromsasuppmestochfålängstretentionstid:

OpoläraämnenbeståroftaavlångakolvätekedjorochärdärförbrapåattskapamångavanderWaalsbindningartilldenopolärastationärafasen(somocksåbeståravlångakolvätekedjor).Samtidigt”trivs”depoläraämnenabättreidenmobilafaseneftersomdekanbindatillämnenaidenmedstarkavätebindningar(ellervanligadipol-dipolbindningar).Dettasammantagetledertillattdepoläraämnenaåkerutförstgenomkolonnenochattdeopolärafårlängstretentionstid.

HPLC-analyser kan utföras på 2 olika sätt

ü Förattlättareförståskillnadenmellande2varianternasåtestarviattköraettprovbeståendeavföljande3ämnenienHPLCmedpolärresp.opolärkolonn:

Glycerol Pentanol Heptan

HPLC-analyser kan utföras på 2 olika sätt

Högstpolaritetförst

Polärstationärfas(OH-grupper)

Omvänd-fas-kromatografi(opolärkolonn):

Normal-fas-kromatografi(polärkolonn):Opolärmobilfas (t.ex.enblandningavhexanochkloroform)

Polärmobilfas(t.ex.enblandningavvattenochmetanol)

Lägstpolaritetförst

Opolärstationärfas(kolväten,t.ex.C18)

Obs.Demobilafasernabeståravblandningaravolikaämnenmedolikapolaritet.Vivillnämligenintehaenmobilfassomär100%poläreller100%opoläreftersomallaämnentillslutskakunnatasigigenomkolonnen.Efteretttagkanmanocksåförändrapolaritetenavdenmobilafasenföratt”lockaut”deämnensomsitterväldigthårtbundnatilldenstationärafasen.

Glycerolkanbindamedmångastarkavätebindningartilldenpolärastationärafasen.Fårlängstretentionstid.

Heptankanejbindamedvätebindningar(ellervanligadipol-dipolbindningar)tilldenpolärakolonnen.HeptankandäremotskapamångavanderWaalsbindningarmeddeopoläramolekylernaidenmobilafasen.Fårkortastretentionstid.

Glycerolkanbindamedmångastarkavätebindningartillmolekylernaidenpoläramobilafasen.Fårkortastretentionstid.

Heptankanejbindamedvätebindningar(ellervanligadipol-dipolbindningar)tillmolekylernaidenpoläramobilafasen.DäremotkanheptanskapamångavanderWaalsbindningarmeddelångakolvätenaidenopolärastationärafasen.Fårlängstretentionstid.

Pentanolkanskapavätebindningartilldenstationärafasen,menintelikamångasomglycerol.HarävenenganskalångkolvätekedjaochkanskaparelativtmångavanderWaalsbindningartilldeopoläramolekylernaidenmobilafasen.Fårdärförenmedellångretentionstid.

Pentanolkanskapavätebindningartilldenmobilafasen,menintelikamångasomglycerol.HarävenenganskalångkolvätekedjaochkanskaparelativtstarkamångavanderWaalsbindningartilldeopoläramolekylernaidenstationärafasen.Fårdärförenmedellångretentionstid.

Uppgift 1: Ett prov med okända ämnen analyseras med hjälp av HPLC (opolär kolonn). Tre retentionstider erhålls; 2,5, 7,7 och 12,3. Kemisterna

identifierar nedanstående tre ämnen i provet. Men vilken retentionstid tillhör vilket ämne?

a)Pentan c)Butanolb)2-metylbutan

Pentan:OpolärmolekylmedavlångstrukturvilketmöjliggörflervanderWaalsbindningarmedmolekylernaidenstationärafasen,ijämförelsemed2-metylbutan.Retentionstid:12,3.

2-metylbutan:Opolärmolekylmenmedenmersfärisk/rundformijämförelsemedpentan.AntaletvanderWaalsbindningarmedmolekylernaidenstationärafasenblirdärförfärre.Retentionstid:7,7.

Butanol:Polärmolekyl(OH-grupp)vilketmöjliggörvätebindningarmeddepoläramolekylernaidenmobilafasen.Binderalltsåstarkasttilldenmobilafasenochkommerutförst.Retentionstid:2,5.

Lösning:Kolonneninnehållerenopolärstationärfas.Detinnebärsamtidigtattdenmobilafasenärpolär.Opoläraämnen(oftakolväten)kanbindastarkaretilldenopolärastationärafasenikolonnenäntilldepoläramolekylernaidenmobilafasen(kanskapamångavanderWaalsbindningarmeddelångakolvätenaidenstationärafasen).Samtidigt”trivs”depoläraämnenbättreidenmobilafaseneftersomdekanbindatilldenmedstarkavätebindningar(alt.vanligadipol-dipolbindningar).

Uppgift 2: Ett prov med okända ämnen analyseras med hjälp av HPLC (opolär kolonn). Tre retentionstider erhålls; 3,5, 8,2 och 11,7. Kemisterna

identifierar nedanstående tre ämnen i provet. Men vilken retentionstid tillhör vilket ämne?

a)Heptanol c)Butanolb)Etanol

Heptanol:HarenOH-grupp,menharävenenlångkolvätekedjavilketinnebärattpolaritetenärganskalågtrotsOH-gruppen.DenlångakolvätekedjankanskapamångavanderWaalsbindningarmeddenopolärakolonnen.Bromsasdärföruppmestikolonnenavde3ämnena.Retentionstid:11,7.

Etanol:HarenOH-gruppochenkortkolvätekedja.Hardärförhögstpolaritetochbinderstarkttilldenpoläramobilafasen.KaninteskapasåmångavanderWaalsbindningartilldenopolärakolonnen.Retentionstid:3,5.

Butanol:HarenOH-gruppochenganskalångkolvätekedja.Hardärförmedelhögpolaritet.KanskapaganskamångavanderWaalsbindningarmeddenopolärakolonnen.Retentionstid:8,2.

Lösning:Kolonneninnehållerenopolärstationärfas.Detinnebärsamtidigtattdenmobilafasenärpolär.AllaovanståendeämnenharenOH-grupp.Dekanalltsåskapavätebindningar.Skillnadenmellanämnenaärhurlångkolvätekedjanär.EnlångkolvätekedjainnebärattmolekyleninteblirsåpolärtrotsförekomstenavenOH-grupp.Depoläramolekylernasomfinnsidenpoläramobilafasen”störs”avdenlångakolvätekedjanochvilldärförintesågärnaskapavätebindningarmeddentypenavmolekylerutanbinderdåhellremedvätebindningartillandramolekyler.SamtidigtsåkommerdenlångakolvätekedjankunnaskapamångavanderWaalsbindningarmeddenopolärakolonnen.Dettatillsammansledertillattmolekylermedlångakolvätekedjorbinderhellretilldenopolärastationärafasenjämförtmeddenpoläramobilafasen,trotsförekomstenavenOH-grupp.

Vi kan förbättra separationen i kolonnen genom att ändra olika faktorer

1. Användaenkolonnmedenannanstorlek:Ienlängreoch/ellersmalarekolonnkommerdeolikaämnenaiprovetbindaflergångertilldenstationärafasenochdärmedseparerasfrånvarandra ihögreutsträckning.

2. Sänkahastighetenavdenmobilafasen: Omvisänkerdenmobilafasenshastighetsåkommerämnenaiprovethalängretidpåsiginutikolonnenochdekommerhinnabindaistörreutsträckningtilldenstationärafasen.Detledertillenbättreseparation.

3. Ändrakolonnenspolaritet:Omvifårendåligseparationpåenopolärkolonnsåkanvitestamedattbytautdenmotenpolärkolonn(ellertvärtom).

4. Ändradenmobilafasenspolaritet:Vikanökaellerminskapolaritetenavdenmobilafasengenomattpåverkasammansättningenavdeämnensomingår.

ü Iblandkandetvarasåatttopparnafrånfleraolikaämnensammanfallerikromatogrammet(dåligupplösning).Detkrånglarisåfalltillvåranalyseftersomdetblirsvårareattidentifieraolikaämnenochattbestämmakoncentrationenavdessa.

ü Åtgärderförattförbättraseparationenochfåenbättreupplösningikromatogrammet:

En annan liknande metod är gaskromatografi (GC)

Vad är de viktigaste skillnaderna mellan HPLC och GC?

ü Olikamobilafaser:Igaskromatografianvändsengassommobilfas(helium,kvävgasellervätgas)medanenvätska(enblandningavolikaämnen)användsvidHPLC.

ü HPLCkananvändasförflerämnen:GCkanenbartsepareraochanalyseraämnensomärflyktiga(kanövergåigasformrelativtlätt)ochsomärvärmetåliga.GaserochlättflyktigavätskorkananalyserasmedGCmedandeflestavanligavätskorejkananalyseras.Detärenbartämnensomharenlägrekokpunktän350gradersomkananalyserasmedGC,vilketmotsvararca15-20%avallakändaämnen.HPLCkandäremotanvändasävenförickeflyktigaämnenochförämnensomärvärmekänsliga ochhardärförettstörreanvändningsområde (t.ex.användsHPLCförkolhydrater,fetterochproteinerochhardärförstorbetydelseinombiokemi,medicinetc.).

ü FördelenmedGCframförHPLCärframföralltattdetärensnabbareochliteenklaremetodattgenomföra.

För den bästa kvalitativa analysen krävs dock en masspektrometer som detektor

ü Mångaproverärkomplexaochinnehållerettstortantalämnenmedlikartaderetentionstider.DessaärdärförsvåraattidentifieramedenbartHPLCellerGCkoppladtillen”vanlig”detektor.OmvidäremotkopplarvårHPLCellerGCtillendetektorsomheter”masspektrometer”(MS)såkommervifåettmycketkraftfulltverktyg.DessaanalysmetoderkallasförHPLC-MSresp.GC-MS.

ü Medhjälpavenmasspektrometerkanmassanavdeolikaämnenaiprovetbestämmas.Masspektrometernkanäven”lista”utvilkadelarsomfinnsideolikaämnenasmolekylereftersommolekylerna”slåssönder”imindrebeståndsdelarochsedanvägsvarjebeståndsdel.Varjebeståndsdelimolekylenkandåidentifierasochvikangöraenstrukturbestämningavhelamolekylen.Masspektrometernskaparpådettasättettkemisktfingeravtryckförvarjeämne.Därmedkanviidentifieraheltnyaämnen(t.ex.heltnyadroger).

SegärnaflerfilmeravNiklasDahrén:http://www.youtube.com/Kemilektionerhttp://www.youtube.com/Medicinlektioner