Histones d'érythrocytes de poulets

BIOCHIMIE, 1972, 54, 1273-1279.

IV.

Histones d'drythrocytes de poulets. Etude quant i ta t ive des histones au cours de la maturat ion des 6rythrocytes.

Alice ~,~AZEN et Madeleine CHAMPAGNR.

C e n t r e de R e c h e r c h e s s u r les M a c r o m o l d c u l e s d u C N R S , 6, r u e B o u s s i n g a u l t , 6 7 - S t r a s b o u r g - - F r a n c e .

( 1 5 / 5 / 1 9 7 2 ) .

Summary . - - Histones from the erythrocytes of chicken were isolated in two groups : the HRA group of arginine rich histones (F2ax, F~a~, F~) and the HRL group of lysine rich histones (F., Fv, F~b) ; then electrophoresed quantitatively to estimate the distribution of histone components in the blood of normal and anaemic adulte chicken, and the blood of 5 days old chicken.

In the 3 cases the relative values of histone to DNA are very similar and near to 1,1 ; but lhe proportions of each group HBA aaad HR'L, are different. The 2 groups ~re identical in normal adult, but in yoalng chicken the HRL group represents only 40 p. cent of the tota,1 histones. The 3 lysine rich histones increas.e from young to adult chicken, especially F~ and F~, but hi.stone F3 decreases.

These variations are presumably responsible for progressive chromatine condensation during erythrocyte maturation.

INTRODUCTION.

Le sang du poussin h l '6closion pr6sente une image h6matologique vois ine de celle de l 'adulte, en par t ieul ie r , les 6rythrocytes sont de type mfir h noyau ovale fovtement condens6.

An cours des trois p remie r s jours de vie du poussin, des 6rythrocytes jeunes h noyan plus large et h ch romat ine diffuse appara issent clans le s a n g ; une autre vague de ra jeunissement cellulaire se pr6sente apr6s la 2 ° semaine [1], puts, p rogress ivement , l ' ensemhle des 6rythrocytes 6volue vers le type mfir. On peut obteni r @ale- ment chez l 'adul te des formes jeunes dans le sang en p rovoquan t une an6mie qui fait passer des 6rythrocytes non mfirs de la moelle osseuse vers le sang.

En plus des c inq his tones majeures que l 'on re t rouve dans t o u s l e s tissus d ' an imaux sup6rieurs (F1, Fzal, F2a2, Feb , F3) , l ' 6 ry throcyte de poulet cont ient une his tone sp6cifique, F v. Dans une 6tude pr61iminaire [2], nous avions mont r6 que chez Ie poussin de 10 jours, et de mani6re encore plus accentu6e chez le poussin de 3 jours, la propor t ion d 'h is tone F v est plus faible que chez l 'adulte. Nous notions un parall61isme entre l '6tat de condensa t ion nucl6aire et l ' augmenta t ion du taux d 'h is tone sp6cifique. On pouva i t se demander si l 'h is tone F v 6tait la seule dont le pourcen tage var ia i t au cours de la matura t ion des 6rythro- cytes. Nous avons donc en t repr i s une 6tude quan- t i tat ive compar6e de l ' ensemhle des his,tones sur

des 6rythrocytes p rovenan t de sang, soit de poussins de 5 jours, soit de poulets an6mi6s, soit de poulets adultes normaux.

Si l 'on veut suivre les var ia t ions quant i ta t ives des six his tones au cours de la matura t ion cellulaire, il faut d isposer d 'une t echn ique qui per- mette d ' e s t imer de faibles diff6rences dans les p ropor t ions re la t ives des histones. Nous avons dO r enonce r r ap idemen t h extra i re , quan t i t a t ivement et h l '6tat pur les six histones, en ut i l isant l 'une ou l 'aut re des m6thodes de pr6c ip i ta t ion fraq- t ionn6e pr6conis6es par Johns [3J. Une pr6c ip i - tation s6lective ne pe rmet pas d 'ob ten i r une his tone pure. On doit en g6n6ral la faire suivre d 'une chrc~matographie ; celle-ci par contre n 'est j amais quant i ta t ive.

Nous avons utilis6 ici une m6thode d6riv6e de la m6thode 2 de Johns [3], mats simplifi6e. El le pe rmet l ' ex t rac t ion quant i ta t ive de 2 groupes : le groupe HRA des h is tones r iches en a rg in ine (F2al, F2a2, F 3) et le groupe HRL des his tones r iche en lysine (F1, F2b , Fv), h peu prbs sans contamina- t ion r6ciproque. L 'es t imat ion quant i ta t ive des his tones de chaque groupe est obtenue par 61ec- t rophorbse en ut i l isant une t echn ique d6riv6e de celle de Leboy [4], que nous exposerons plus en d6tail dans la par t ie exp6rimentale .

F ina lement , notre 6tude ind ique que les 3 his tones r iches en lysine (F1, F2b , F v) p rennen t pond6ra lement de l ' impor t ance au cours de la matura t ion des 6rythrocytes au d6pens, essentiel- l ement de l 'h is tone F 3.

1274 A. Mazen et M. Champagne.

MATI~RIEL ET MI~THODES.

Les histories sont pr6par6es h pa r t i r de sang, soit de poulets adultes (de 9 h 18 mois), soit de poussins de 5 jours, soit de poulets an6mi6s.

L 'an6mie est indui te habi tue l lement en in jcc tant du ran t 5 jours cons6cutifs une dose journal ibre de 0,3 ml /kg d 'une solution extemporan6e de chlor- hydra te de ph6ny lhydraz ine ~ 2,5 p. cent dans l 'eau et neutral is6e h la sonde (0,25 g ph6nyl- hydrazine-HC1 mis en solut ion dans 8,3 ml d 'eau distil,16e st6rile, plus 1,7 ml de 1 N NaOH). L 'ani- real est sacrifi6 le 2 ° jour aprbs la derni6re injec- tion. A la suite d 'une forte mortal i t6 observ6e aux cours des dern ie rs essais, ces doses ont 6t6 r6- duites h une in jec t ion de 0,3 ml/kg, et 4 in jec t ions de 0,15 ml/kg, ne p rovoquant que des an6mies 16gbres (P 503).

Des frottis sanguins sont color6s par la tech- n ique de May-Grunwald-Giemsa afin d 'es t imer le p. cent de globules blancs et de thrombocytes dans chacun des cas.

Pr@aration des histories.

Le sang est recueill:i dans un quar t de son vo- lume de C1,Na 0,15 M h6par in6 $ 0,0.8 g/l i tre. Apr6s fi l tration sur gaze, h6molyse ~ la saponine, ,1 lavages des noyaux avec NaCl 0,15 M [5] suivis de 2 lavages NaC1 0,3 M pour 61trainer le m a x i m u m de prot6ines acides [6, 7] et 3 lavages h l 'alcool ti 95 ° pour d61ipider [8], les histones sont extraites par la m6tho.de 2 simplifi6e de Johns [3] : c'est-/~- dire que nous nous bornons h l ' ext ract ion des 2 groupes d 'histones, Fun f iche en a rg in ine (F2a~, F2a 2, Fj) , r au t r e f iche en lysine (F1, F2b et Fv). Afin de contr61er si les his tones on,t 6t6 extraites en totalit6 des noyaux, les culots r6siduels sont trait6s pa r HCI 0,5 N, l ' ext ra i t acide est dialys6 et lyophil is6 pon t contr6~e.

Sur des part ies al iquotes de noyaux lav6s, on proc~de para~U61ement A l 'ext ract ion de l 'h is tone totale par agitat ion darts HC1 0,25 N, 60 rain au froid ; suivie de deux autres extract ions rapides au mixer (Virtis, 30 secondes ~ 5000 RPM) en HC1 0,25 N, et centr i fugat ion de 15 rain 8000 RPM sur centr ifugeuse Spinco modble L1. La solution acide est pr6cipit6e par 9 volmnes d'ac6- tone /~ - -20°C ; le pr6cipi t6 est lay6 3 fois ~ l 'ac6- tone froid et s6ch6 sous vide. D'autre part , nous avons pr6par6 chacun,e des histories (F~, Fuax, F2a2, F2b, Fj, Fv) de sang de poulet, ~ l '6tat put , en pur i f iant pa r chromatographic sur CMC ou biogel les 6 f ract ions obtenues pa r les m6thodes 1 et 2 de Johns [3]. Elles nous servent de r6f6- rence dan,s l '61ectrophorbse quanti tat ive.

Dosage du DNA.

Aprbs extract ion des histones, les culots r6si- duels sont lav6s ~ l 'acide perchlor ique 0,2 N froid pour 61iminer les oligonucl6otides. Puts ils sont trait6s 2 fois h l 'acide perch lor iquc 1 N, 30 mi- nutes h 80 ° ± 2 ° avec agitat ion [9, 10]. Le DNA est dos6 dans l 'extrai t perchlor ique, soit colori- m6t r iquement pa r une modificat ion de la m6thode de Burton [!11], soil par absorpt ion UV en p r e n a n t une valeur de 35 ~t*g de DNA/ml pour une D.O. de 1 h 260 nm (valeur exp6rimentale obtenue avec un 6chanfi l lon purifi6 de DNA d '6rythrocytes de poulet trait6 dans les condi t ions ci-dessus).

Electrophorbse quantitative.

Nous avons choisi la m6thode de Leboy et eotl. [4] qui permet d '6viter la pr661eetrophor~se.

Pour chaque groupe HRA et HRL pr6c~demment d6finis, on obtient 3 pies bien s6par6s.

Le po in t fondamenta l est de passer des in ten- sit6s de colorat ion anx valeurs absolues en poids d 'histones. Nous avons repr i s dans ce but l '6tude de diff6rents parambtres (concent ra t ion des gets, 6elairage et temp6rature de polym6risat ion, colo- rant) et tenant eompte d 'observat ions d6j~ faites par d 'autres auteurs [12, 13, 14, 15}.

Les temps de d6colorat ion des gels doivent 6tre s t r ic tement ident iques pour les 6talons et les 6chanti l lons. C'est pourquoi il est ind i spensab le de ne comparer ' que des gels d 'une m6me 61ectro- phorbse.

F ina lement , nous proc6dons de la manibre sui- vante : apr6s dessiccation de 2 heures sous vide, les his tones sont mises en 'so.lution la veille ~ rai- son de 1 mg de prot6ine pa r ml d 'ur6e 10 M. Une sohltion de r6f6rence con,stitu6e du m61ange de 3 fract ions pures (soit F 1 + F2b d- F v ; s o i t F2a 1 d- F2a 2 A- F a) et une solution de l '6chant i l lon A analyser , HRL ou HRA, sont pr6par~es pour une m6me 6tectrophor~se de 12 tubes. Seules les solu- t ions d 'h is tones r iches en a rg in ine (solution de r6f6rence, et m61ange h anMyser) sont incub6es unc heurc h 37 ° en mil ieu ~-mercapto6thanol 0,1 M avant l '6lectrophor6se. Les gels ~ 17 p. cent d 'acrylamide, pr6par6s selon Leboy [4J, ont 0,6 cm de diambtre sur 7 cm de long. On charge, pour une m6me migrat ion, 5 ~ 6 tubes, avec des concent ra t ions croissantes al lant de 1 h 6 t~g/gel de chacune des 3 fract ions de r6f6rence, et 5 6 tubes avec des concent ra t ions al lant de 5 20 ling/gel de l '6chant i l lon d'hi~stones ~t analyser .

Les 61ectrophor6ses sont effectu6es h temp6ra- lure ambiante du ran t 5 heures dans le mil ieu t ampon ac6tate- ~ a lanine pH 4,5 de Leboy, et un

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Histones d 'dry throcy tes de poulets . 1275

courant de 3 mA par gel. Aprbs une nui t de colora t ion • ~ l ' amido-Sch~arz 10 B, pr6par6 selon P a n i y m [!12] (0,1 p. cent dans 20 p. cent d '6thanol, 7 p. cent d 'acide ac6tique et eau) et d6coloration de 3 heures par 61ectrophor6se en acide acStique 7 ,p. cent clans un courant inverse de 10 mA/tube, les gels sont d i rec tement densitom6tr6s au micro- densi tom6tre Joyce-Loebl 6quip6 d 'un filtre oran- ge. Les surfaces des pics sont ensuite planim6- tr6es.

RI~SULTATS.

Nous donnons dans le tableau I, pour chacun des 3 cas 6tudi6s, les rendements en histories et en DNA par l i tre de sang. Pour des poulets no rmaux adultes, les r endemen t s f luctuent autour de 5 g d'histt>nes tolales par l i tre et peuvent a t te indre 6 g ; la num6ra t ion cellulaire donne des valeurs comprises entre 3 et 4.106 6rythrocytes par mma. Les HRL e t les HRA se r6part issent en 2 groupes • h peu pr6s 6quivalents en poids. Apr~s an6mie 16g6re (P 503), la quant i l6 d 'his tones totales par l i tre est plus faible, ~t peine plus de 4 g, le nombre d '6rythrocytes pa r mm~ 6rant for tement d iminu6 ; de m6me chez le poussin de 5 jours, on a moins de 4 g d 'his tones totales par l i tre pour des num6- ra t ions de l 'ordre de 2.106 6rythrocytes par ram3. La propor t ion des HRL est progress ivement dimi- nu6e, elle passe h 44 p. cent pou r les poulets an6- mi6s et h 38 p. cent pour les poussins de 5 jours, au b6n6fice du groupe des HRA qui at te ignent 56 et 62 p. cent respectivelnent , et de mani6re repro- ductible.

Pour bien mont re r qu ' i l ne s 'agissait pas d 'arte- facts, nous avons v6rifi6 que les tavages NaG1

0,3 M e t alcool n ' e n t r a l n a i e n t aucune histone, en par t icu l ie r chez le poussin.

D'autre part , nous avons contr616 que l 'extrac- l ion des histones en 2 groupes est bien totale. Un extrai t HC1 0,5 N des culots r6siduels ne donne pas plus de 1 p. cent en poids de mat6riel par rappor t aux his tones totales. De plus, la somme des 2 groupes HRL et HRA est tr~s voisine de la quanti t6 d 'bis tones totales extraites pa r HC1 0,25 N d 'al iquotes de sang, par exemple : 4,96 g e t 4,94 g par l i tre de sang, respect ivement .

Le nombre d '6rythrocytes pa r m m z var ian t d 'un 6tat physiologique h l 'autre, il para l t plus correct pour une 6rude comparat ive, de rappor te r le poids des histories h un 616merit stable de la cellule, le DNA. Nous donnerons donc 6galement darts le tableau I, les rappor ts histones/DNA. Pour les histones totales, ramen6es au DNA, on obtient alors dans les 3 cas des valeurs tr6s rot- sines. Bien entendu, les rappor ts HRL/DNA sor t plus faibles et les rappor ts HRA/DNA plus forts pour le sang an6mi6 et le sang de poussin que pour l 'adulte.

Pour l ' es t imat ion quant i ta t ive de cbaque histone, nous avons 6talonn6 notre m6thode d'61ectropho- r~se en ut i l isant des m61anges artificiels HRL et HRA obtenus "h par t i r des 6 histories pures. Les droites 6talons sont port6es dans la figure 1 ; il faut noter que, si la posi t ion relative des droites ne varie pas, les var ia t ions de pente peuvent a t te indre + 20 p. cent d 'une exp6rience h l 'autre.

Pour les m61anges HRL et HRA inconnus , dont les concent ra t ions par gel var ien t de 5 ~ 20 ~g, le pourcentage de chaque historic dans le m61ange est obtenu h __+ 2 p. cent, sauf pour rh i s tone F~,

TABLEAU I.

Rendements en histories.

P 499 adulte ..

P 503 andmie..

P 500 5 jours..

en g/litre de sang ]Histones (')/lit Histones (')/DNA

HRA HRL

Poids brut corrig

2,41 2,41

1,88 1,82

1,38 1,33

Poids brut corrig

2,57 2,57

2,31 2,25

2,11 2,17

4,98

4,13

3,50

HT DNA

4,45

3,64

3,43

HRL __HRA

0,50 0,50

0,44 0,56

0,38 0,62

HR L HRA IIT

0,56 0,56 1,12

0,50 0,63 1,13

0,39 0,63 1,02

HT = HRL A- HRA. (*) Valeurs corrig~es, compte-tenu de la 16g6re contamination observ~e et chiffr~e

~lectrophor~se quantitative.

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pal"

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tm~jours e n f a i b l e q u a n t i t 6 , o h la p r 6 c i s i o n n ' e s t p l u s que de _+ 10 p. c e n t (fig. 2).

2C

1C

0 0

UNITE5, DE 5URF'ACE en cm 2

v~

/ / FI- F2 °2

V2b

V ' l I 1 I I I I 1 2 3 4 5 6 7 H9 HISTONE

Fro. 1. - - Re la t ion ent re concen t ra t ion en h i s tone et in tens i t6 de colora t ion exprim~e en uni t~s de surface int~gr~e pa r p lanim~tr ie .

Nous donnons la pente moyenne (11 expdriences) des droi tes co r respondan t aux 6 histories d '6rythroeytes .

D a n s l a f igure 3, n o u s d o n n o n s les e n r e g i s t r e - m e n t s de s 6 1 e c t r o p h o r 6 s e s e f f ee tu6es s u r les 2 e x t r a i t s H R L et H R A p o u r c h a c u n des cas 6 tud i6s . A p r 6 s p l : a n i m 6 t r i e et c o n v e r s i o n de s s u r f a c e s en

UNITE5 DE SURFACE %

5C

4(

30

2O

10

0 5

0'-" 0.,,. 0 0 D

I I 10 15

®

0 " " " ' 0 " . . ,,.0. _ . O _ . . . . 0

[3 13 13 [3

J I 10 15 P9

FIG. 2. - - Pourcentage des h i s tones en fonc t ion de quant i t6s eroissantes de prot6ines eharg~es pa r gel de polyacrylamide. Les va leurs sont exprimdes en uni t6s de surface pour cent de la surface totale int~gr~e.

a) P 485 (F~a+Fa) ; F~ ( n ) __ F~a.~ ( e ) - - F~a~ (O) . b) P 485 (Fad-F:bd-Fv) ; F~ (El) - - F2b ( e ) - -

F~ (0).

m i n u t i o n d u p o u r c e n . t a g e de s h i s t o n e s F 1 et F V en allan,t de l ' a d u l t e v e r s l ' a n 6 m i 6 et le p o u s s i n et u n e a u g m e n t a t i o n de l ' h i s t o n e F2b. D a n s }e g r o u p e

I t , , I "7 '(" ~ I ' ,

©

/ - . / Y - \ \ / ',

Fro. 3. - - Electrophor6ses densi tom6tr6es d 'h is tones d '6rythrocytes .

a) Poule t adul te normaI . b) Poule t an~mi6. e) Pouss in de 5 jours . HRL HRA . . . . . . . . . .

TABLEAU II.

Pourcentage des histories dans chacun des groupes HRL et HRA.

Fl

P 499 a d u l t e - l l , 7 P 503 an~mie] 10,3 P 500 5 jours I 10,2

HRL [ HRA

F~ . . . . F~b F~a~ F~a~

31,5 56,8 32,6 ] 28,7 29,5 60,2 ] 30 / 25,3 27,8 ] 62 [ 26,1 [ 28,7

F3

38,7 4 4 , 8 45,2

de s HRA, l ' h i s t o n e F a es t a u g m e n t 6 e a u d 6 t r i m e n t de E2al, a t o r s q u e la f r a c t i o n F2a 2 p a r a i t p e u v a r i e r .

p o i d s , n o u s d o n n o n s d a n s le t a b t e a u II le p o u r - c e n t a g e de c h a q u e h i s t o n e p a r r a p p o r t au m61ange i n i t i a l . A c e n i v e a u , les d i f f 6 r e n c e s o b s e r v 6 e s e n t r e p o u l e t adu l t e , a n 6 m i 6 et p o u s s i n , s o n t p e u m a r - qu6es . D a n s le g r o u p e des HRL, on n o t e u n e di -

Ma t s r a m e n o n s ces v a l e u r s h la s o m m e des h i s t o n e s . D u fa i r de s i m p o r t a n t e s d i f f 6 r e n c e s d a n s les p r o p o r t i o n s des H R L et des H R A e n t r e les 3 6 ta t s d u s a n g c o n s i d 6 r 6 s , la r 6 p a r t i t i o n r e s p e c - t i ve des 6 h i s t o n e s es t m o d i f i 6 e et p a r t i c u l i b r e - m e n t en ce qu i c o n c e r n e l ' h i s t o n e F~b. Le ta- b l e a u I I I m o n t r e que les 3 h i s t o n e s r i c h e s en

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Histories d 'drgthrocgtes de poulets . 1277

lysine sont en quanti t6s plus faibles chez le poussin. L 'his tone F a est en augmenta t ion conti- nue en al lant du sang normal d 'adulte vers l 'an6- mi6 et le sang de poussin.

TABLEAU III.

Pourcentage de chaque histone ramen~ d la somme des histones.

~ _ _ F v

P499 adulte] 5,7 i 15,3 P 503 an6mie 4,5 i 13 P 500 5 jours 3,9 ! 10,6

F~_b

27,6 26.5 23,6

F '2a i [ F°-a2 . . . . ] . . . . .

16,8 i 14,7 16,8 ~ 14,2 16,2! 17,8

F 3

19,9 25,1 28

Fro. 4. - - Electrophor~ses densitom6tr6es d'histones totales d'drythrocytes.

Poulet adulte. Poussin de 5 jours .................

Les var ia t ions des deux histones F2a paraissent moths significatives. Comme les rapports somme des his tones/DNA soni de l 'ordre de 1,1 pour les 3 types de sang, nons ne donnerons p.as les rappor ts de chaque his tone/DNA, qui sont trbs rot- sins des valeurs du tableau III. Pour i l lustrer le tableau III, nons pr6sentons dans la figure 4 les 61eetrophorbses densitom6trdes de qnanti t6s iden- t iques d 'his tones totales de sang de poulet et de poussin, effectu6es an eours d 'une mSme exp6- rience. On observe ne t tement les p ropor t ions plus faibles des 2 premi6res bandes (F1, Fv) du sang de ponss in ; une troisi6me bande plus impor tan te r6sulte de l a superposi t ion des histones F2b + F3 donl la somme (tableau III) est effectivement sup6- r ieure chez le poussin. F~a 2 a augment6 et F_oa t peu d iminn6 chez le poussin.

DISCUSSION ET CONCLUSION.

La technique que nous avons utilis6e dans ce travail , qui consiste h extraire quant i ta t ivement

les histones d '6rythrocytes en deux groupes de 3 histones, (F 1 + F v + F2b) et (F2a ~ + F2a 2 + F3) , puts "~ d6 te rminer dans chaque groupe le ponrcentage des his tones par 61ectrophor6se, nous a permis de mettre en 6vidence des var ia t ions darts les p ropor t ions relat ives des histones cxtraites du sang de poulet adulte normal ou an6mi6 et du sang de poussin.

Nous avons estim6 n6cessaire d'61aborer notre propre technique d'61ectrophor6se pour passer aux valeurs absolues en histones, car les donn6es de la l i t t6rature sont souvent contradictoires . Avec le protocole exper imenta l adopt6, nous avons obtenu une pente diff6rente pour chacune des 6 histories en por tan t les intensi t6s de colora t ion (exprim6es en unit6s de surface) en fonc- t ion de la concent ra t ion , les pentes var iant d 'une 61ectrophor~se ~ l 'autre.

Nous sommes ici en cont rad ic t ion avec Fam- brough [!1~] qui t rouve une pente un ique pour toutes les fract ions d 'histones, mats en accord avec Johns [161. Par contre, nous n ' avons pas la m6me posi t ion relat ive des droites 6talons qne Johns (ce ne sont pas les m6mes condi t ions d'61ectrophorbse), et nous ne pensons pas pouvoir ut i l iser des droites s tandards 6tablies une lois pour routes, mats des s tandards in ternes ~ cbaque s6rie d'61ectrophorbse. Mohberg et Rusch [17] s ignalent cette m6me variabil i t6 de pente pour l 'h is tone F 1 et comme ces derniers , nous est imons que la m6thode de d6terminat ion de l ' in tens i t6 de colorat ion des pics par densi tom6tr ies est pr6- cise et reproduct ib le pour un gel donn6. En fait, elle 6rite une man ipu la t ion suppl6menta i re qu ' im- pose le proc6dd d 'es t imat ion quant i ta t ive apr6s 61ution de la bande color6e [16].

Rappclons les r6sultats essentiels obtenus.

Le rappor t b is tone/DNA ne varie pas de facon significative quand on passe du poulet adulte au poussin. Par contre, le groupe des histones r iches en lysine (HRL) d iminue et le groupe des histories r iches en a rg in ine (HRA) augmente.

Les var ia t ions les plus fortes sont obtenues pour F t et F v qui passent respect ivement de 6 ~ 4 p. cent et de 15 h 10 p. cent alors que F 3 passe de 20 h 28 p. cent. I1 y a lh une cont rad ic t ion apparente avec nos premiers r6sultats [2], qui mont ra ien t b ien une d iminu t ion du pourcentage de Fv, en passant du poulet adulte au poussin, mats une valeur constante pour F t.

Nous pensons que les var ia t ions de F 1 (dont le pourcentage est toujours faible) qui sont raises en 6vidence dans ce t ravai l sont le fait de notre technique d'61ectrophor6se p lus 61abor6e.

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Le rappor t F v / F 1 est h peu prbs constant darts les 3 cas 6tudi6s et de l 'o rdre de 2,7 h 2,9. Cette valeur est plus 61ev6e que cetle que nous avions trouvde pr6c6demment pour le poulet adulte [2]. E1}e 's 'exphque pa r le fair que nous avons ici la cert i tude d 'avoi r extrait la totalitd de l 'h is tone Fv, alors que nous savons m a i n t e n a n t qu' i l n ' en est pas de m~me pour l ' ext ra i t t r ichloracStique 5 p. cent. On re t rouve en effet une par t ie de F v darts l 'extrai t HCI 0,25 N, qui suit une extract ion h r ac ide t r ichlorac6t ique des noyaux, ce qui n'est pas le cas lorsqu 'on extrai t ~ l 'acide perch lor ique 0,74 N. La quanti t6 d 'h is tone extraite des drythrocytes de poulet adulte par l 'ac ide perch lor ique est d ' a ineurs de 20 h 30 p. cent plus dlev6e que celle extraite h l 'acide trichl:oracdtique.

Nous pensons done que ce t ravnil confirme et prdcise les rdsultats p rdc6demment obtenus.

Nous sommes en co,ntraction avec Dick et Johns [18] qui n 'observen t aucune diffdrence quant i ta t ive entre les his tones de sang de poulet a d o r e no rma l et an6mi~ ; a ins i qu 'avec Stevely [19] qui, sur his tones totales extraites de cellules 6rythro'ides ~ diff6rents stades de matura t ion , t rouve des p ropor t ions d 'h is tone F v identiques.

L'argumen~ de Purkayas tha et Neelin [20] qui no ten t une d iminu t ion de F v darts la moelle osseuse n 'est p e u t 4 t r e pas p roban t du fair de la forte p ropor t ion de ceHules non @ythroides darts la moelle ; pa r contre, Edwards et Hni l ica [8] ne re t rouvent p lus du tout d 'h is tone F v darts la moelle osseuse de poulet andmi6 h la phdnyl- hydraz ine . Dans ce cas, il taut b ien admettre qu'h un stade non encore d6fini de la matura t ion de l 'drythrocyte, il n 'exis te pas d 'h is tone sp6cifique. Ceci expl iquera i t les var ia t ions que nous obtenons sur des s a:ng complets consti tuds d 'une propor t ion var iable d 'drythrocytes non mfirs.

D'apr6s Appels et coll. [21], l ' appar i t ion de l 'h is tone F v dans le noyau de l '6rythrocyte se ferait ~ un stade tr6s prdcoce de l 'drythropoi6se. Ils voient l 'h is tone F v d i m i n u e r de 1/3 en al lan/ de r6 ry th rocy te mfir vers l '6rythroblaste, et F~ augmenter , la so.mme des deux res tant constante, et le rappor t F v / F 1 d iminuant . Pour notre part, nous obtenon,s une var ia t ion de l 'h is tone F v aussi impor tan te en al lant du sang complet de poulet adulte (~ 6rythrocytes mfirs un iquement ) vers celui de pouss in (constitud d 'un mdlange al lant de l ' d r~h rob la s t e h l 'd ry throcyte mfir). La con- t amina t ion en leucocytes et th rombocytes a dr6 contrSlde, elle est de l 'ordre de 2 p. cent darts tous les cas et ne peut done expl iquer les var ia t ions de 50 p. cent de l 'h is tone spdcifique aux drythrocytes.

Certains auteurs [22, 23] o,nt montr6 sur cellules Hela et sur lymphocytes qu 'on pouvait passer de l '6tat condens6 h l '6tat diffus de la chromat ine en enlevant l 'h is tone F 1. Le ph6nom6ne est d 'a i l leurs r6versible.

I1 semb~e que nous observons au niveau des 6rythrocytes un phdnom6ne in t race l lu la i re analo- gue, puisque les 2 histories r iches en lysine F~ et F v augmentent de 50 p. cent en passant du sang de poussin, dont de nombreuses cellules ont une chromat ine lache, vers le sang de poulet adulte dont ~es 6rythrocytes ont le noyau c o n d e n s £ Pa- rall61ement, les biosynth6ses de ]a chaine pro- t6ique sont for tement inhib6es puisque nos rapports RNA/DNA passent de 15 h 3 p. cent, la d ispar i t ion des r ibosomes 6rant un crit6re de viei l t issement [24, 25].

Les histories F~ et F v pour ra ien t done jouer le rSle de r6presseur pe r ma ne n t comme le sugg6rent Edwards et Hni l ica [8], en agr6geant les com- plexes DNA-hislones riches en arginine , de telle sorte qu'i l y ait blocage int6gral du DNA.

ttemerciements.

Nous remercions Madame D. Buhr et Mademoiselle J. Dunand de leur excellente collaboration technique.

R~SUM~.

L 'ext rac t ion quan t i t a t ive des h i s tones d 'drythrocytes , en deux groupes : le groupe HRA des h i s tones r iches en a rg in ine (F~a~, F2as, Fa) et le groupe HRL des h i s tones r iches en lys ine (F~, Fv, F~b), suivie d 'une ~lectrophor~se quan t i t a t ive de chaque groupe, a pe rmis d ' e s t imer avec precis ion la propor t ion de chaque h i s tone prdsente dans le sang de poulet adu l te no rma l et android, et le sang de pouss ins de 5 jours .

Dans les t rois eas, le r appor t h i s tone /DNA reste vois in de 1,1; ma t s les propor t ions re la t ives des groupes HRA et HRL varient . Les 2 groupes sont sensi - b t emen t dgaux chez le poulet adul te , a lors que chez le pouss in , le groupe des t tRL ne repr~sente que 40 % des h i s tones totales . Les t rois h i s tones r iches en lys ine a u g m e n t e n t en p a s s a n t du pouss in au poulet adul te par t icu l i~rement F1 et Fv, alors que l 'h i s tone F.~ d iminue .

Ces va r ia t ions sont sans doute responsah les du phdnom~ne de condensa t ion progress ive de la ch romat ine de l 'drythrocyte au cours de sa ma t u r a t i o n .

ZUSAMMENFASSUNG.

Hii'hner Erythrozyten Histone vcerden in 2 Gruppen quantitativ extrahiert : die HRA Gruppe der Arg:inin reichen Histonen (F2a~, F:a~, F~) und die HRL Gruppe der Lysin reichen Histone. Danach ~verden sie durch quantitative Elektrophorese analysiert. So hat man die Histonen Komponenten im Blur yon erwachsenen Normalen und bllttarmen Hikhnerr und im Blur von 5 Tage alten :Kiiken genau bestimmt.

BIOCHIMIE, 1~972, 54, n ° 1~0.

H i s t o n e s d ' d r y t h r o c y t e s d e p o n l e t s . 1 2 7 9

In den drei Fal len ble ibt die Bezi.ehung His tone / DNA u m 1,1 ; aber die re la t iven Propor t ionen der HRA und HRL Gruppen ver~indern sich. Die zwei Gruppen sind ungef / ihr gleichm~issig bei den e rwachsenen Hiihnen, aber bei den Kiiken ist die HRL Gruppe n u r mi t 40 p cent yon den gesamten His tonen dargestell t . Die drei a n Lys in re ichen His tonen, steigen vo~n Kiiken zu e rwaehsenen Hiihn~er, hesonder s F1 und Fv, w~ihrend das F3 His ton a b n i m m t .

Diese Veri inderungen s ind wahrsehe in l i eh verant - wort.lie'h ffir das progress ive Kondensa l i ' onsphenomen des G h r o m a t i n s w~ihrend der Matura t ion der Ery thro- zyten.

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Documents

Histones d'érythrocytes de poulets