If you can't read please download the document
Upload
vuonghuong
View
217
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Hisztopatolgiai s ksrletes terpis vizsglatok slyos
koponya-agysrls ksrletes modelljeiben
Doktori (PhD) rtekezs
Kvesdi Erzsbet
Tmavezet: Dr. Bki Andrs
Elmleti Orvostudomnyok, Doktori Iskola vezetje: Dr. Szolcsnyi Jnos
Ksrletes Neurolgia, Programvezet: Dr. Gallyas Ferenc (2006.03.31-ig)
Klinikai Orvostudomnyok, Doktori Iskola vezetje: Dr. Komoly Smuel
Klinikai Idegtudomnyok, Programvezet: Dr. Komoly Smuel
Pcsi Tudomnyegyetem, ltalnos Orvostudomnyi Kar, Idegsebszeti Klinika
2010
1
1. FONTOSABB RVIDTSEK JEGYZKE ............................................................ 4
2. BEVEZETS, IRODALMI HTTR ....................................................................... 5
2.1. A koponyasrls epidemiolgija .......................................................................... 5
2.2. A baleseti agysrlsek osztlyozsa ...................................................................... 6
2.3. Diffz axonlis krosods ....................................................................................... 7
2.3.1. Axon duzzads/axonballon kpzds (AD/B) ...................................................... 8
2.3.2. Az ultrastrukturlis (neurofilament) kompakci (neurofilament compaction, NFC)
........................................................................................................................................ 9
2.4. Diffz idegsejt-krosods (stt idegsejt kpzds) ............................................ 11
2.5. Sejthall mechanizmusok agysrlsben................................................................. 13
2.6. A diffz axonlis krosods terpis befolysolst clz vizsglatok .................. 14
2.6.1. Az agyalapi mirigy adenilt-ciklz aktivl polipeptid ........................................ 14
2.6.2. A poli (ADP-ribz)-polimerz gtlsa ................................................................. 15
3. CLKITZSEK ....................................................................................................... 17
4. AZ AGYALAPI MIRIGY ADENILT-CIKLZ AKTIVL POLIPEPTID
(PACAP) NEUROPRTEKTV HATSNAK IMMUNHISZTOKMIAI
VIZSGLATA A CENTRLIS FOLYADK-PERKUSSZIS (CFP) PATKNY-
MODELLLEL VGZETT AGYSRLS ESETBEN ............................................. 18
4.1. Bevezets ................................................................................................................. 19
4.2. Anyagok s mdszerek ............................................................................................ 19
4.2.1. Ksrleti llatok .................................................................................................... 19
4.2.2. A centrlis folyadk perkusszis modell kivitelezse patknyon ........................ 20
4.2.3. I.c.v. PACAP kezels ........................................................................................... 21
2
4.2.4. Immunhisztokmia ............................................................................................... 21
4.3. Eredmnyek ............................................................................................................. 22
4.4. Megbeszels, kvetkeztetsek ................................................................................. 25
5. AZ L-2286-EGY J POLI (ADP-RIBZ) POLIMERZ INHIBITOR
NEUROPROTEKTV HATSNAK VIZSGLATA MARAMROU-FLE IMPAKT
ACCELERCIS PATKNY MODELLEL VGZETT KOPONYATRAUMA
ESETBEN .................................................................................................................... 28
5.1.Bevezets .................................................................................................................. 29
5.2. Anyagok s mdszerek ............................................................................................ 30
5.2.1. Ksrleti llatok .................................................................................................... 30
5.2.2. Marmarou-fle impakt accelercis modell patknyon........................................ 31
5.3. Immunisztokmia .................................................................................................... 31
5.4. Magatartsvizsglatok ............................................................................................. 32
5.5. Eredmnyek ............................................................................................................. 34
5.5.1. Immunhisztokmia ............................................................................................... 34
5.5.2. Magatartsvizsglatok .......................................................................................... 37
5.6. Megbeszls, kvetkeztetsek ................................................................................. 42
6. TRANZIENS FOKLIS AGYI ISZKMIA OKOZTA STT IDEGSEJTEK
SORSA NEM-NEKROTIKUS ES NEM EXCITOTOXIKUS SZVETI
KRNYEZETBEN: NEUROBIOLGIAI KVETKEZTETSEK ............................ 44
6.1. Bevezets ................................................................................................................. 45
6.2. Anyagok s mdszerek ............................................................................................ 45
6.2.1. Ksrleti llatok .................................................................................................... 45
3
6.2.2. Patkny tranziens foklis agyi iszkmia modell ................................................... 45
6.2.3. Szvettani feldolgozs .......................................................................................... 46
6.3. Eredmnyek ............................................................................................................. 47
6.3.1. Fnymikroszkpos megfigyelsek ....................................................................... 47
6.3.2. Elektronmikroszkpos megfigyelsek .................................................................. 51
6.4. Megbeszls, kvetkeztetsek ................................................................................. 55
7. J EREDMNYEK SSZEFOGLALSA .............................................................. 57
8. AZ RTEKEZS ALAPJT KPZ PUBLIKCIK ........................................... 59
9. EGYB EREDETI KZLEMNYEK ...................................................................... 60
10. KSZNETNYLVNTS .................................................................................. 63
11. IRODALOMJEGYZK ........................................................................................... 64
4
1. FONTOSABB RVIDTSEK JEGYZKE
AD/B axonduzzads/axonballon-kpzds
AIF apoptzis-indukl faktor (apoptosis-inducing factor)
APP amiloid prekurzor protein (amyloid precursor protein)
CSpT kortikospinlis plya (corticospinal tract)
CT komputer tomogrfia (computed tomography)
DAB diamino-benzidin
DAI diffz axonlis krosods (diffuse axonal injury)
DVI diffz vaszkulris krosods (diffuse vascular injury)
ER endoplazmatikus retikulum
FGF fibroblaszt nvekedsi faktor (fibroblast growth factor)
FP folyadk perkusszi (fluid percussion)
GCS Glasgow kma skla (Glasgow Coma Scale)
i.c.v. intracerebroventrikulris
MLF medilis hosszanti kteg (medial longitudinal fascicle)
MRI mgneses rezonancis kpalkots (magnetic resonance imaging)
NAD nikotinamid adenin-dinukleotid
NFC neurofilament kompakci (neurofilament compaction)
PACAP agyalapi mirigy adenilt-ciklz aktivl polipeptid (pituitary adenilate
cyclase activating polypeptide)
PARP poli (ADP-ribz)-polimerz
PBS foszft puffer (phosafate buffered saline)
TAI traums axonkrosods (traumatic axonal injury)
TBI traums agykrosods (traumatic brain injury)
TNF tumor nekrzis faktor
UC ultrastrukturlis kompakci (ultrastructural compaction)
VIP Vazoaktv intestinlis peptid (vasoactive intestinal peptide)
5
2. BEVEZETS, IRODALMI HTTR
2.1. A koponyasrls epidemiolgija
A fejlett ipari trsadalmakban a 35 v alatti aktv, munkakpes populcit rint
vezet hallok, megelzve a klnbz daganatos valamint szv s rrendszeri
betegsgeket, a koponyasrls okozta agyi krosods. Mg a nyugati trsadalmakban a
koponyasrls kvetkeztben ltrejv hallozs 20-25%-ot tesz ki, addig ez
Magyarorszgon elri a 45%-ot [127]. Az Egyeslt llamokban ksztett felmr
tanulmny szerint vente 100.000 ilyen jelleg srlsbl 180-250 eset vgzdik
halllal [21]. Eurpban 1.600.000 koponyasrlst szenvedett beteg rszesl krhzi
elltsban, ebbl az agysrlt pciensek arnya vente 100.000 emberbl 235 f, s
66.000 koponyasrlt esete halllal vgzdik.
Koponyasrlsek legfkppen autbalesetek, eless, erszakos behatsok s
klnbz sportgakbl fakad srlsek okozataknt jnnek ltre. A leginkbb
veszlyeztetett demogrfiai csoport a frfiak, s a htrnyos terleteken-, illetve egyedl
lk [21]. Sajnlatos mdon nem csak az elbb emltett rtegek veszlyeztetettek,
hanem a gyerekek s a fiatal felnttek is. Kt ves kornl fiatalabb gyermekeknl
leginkbb maga a koponyasrls okoz hallt, gyakran az n. shaken baby szindrma
jn ltre [30, 79].
A nagyban motorizlt trsadalmakban, gy az Egyeslt llamokban a
koponyasrltek elltsnak kzvetett s kzvetlen kltsge jelents, utbbiban az vi
60 millird USA dollrt is elri [50]. A fejlett eurpai orszgokban a slyos
koponyasrltek krhzi elltsnak kltsge pciensenknt elri a 6.000 Eurt [15],
mely a teljes kezelsi kltsgeknek csak egy kis hnyadt teszi ki. Egy koponyasrlt
beteg lete vgig tart kezelsnek sszkltsge az Egyeslt llamokban elrheti a
200.000 USA dollrt is. Felmrsek alapjn 2020-ra a koponyasrls globlisan a
harmadik leggyakoribb vezet hallokk fog vlni [99].
A National Institute of Health felmrse szerint az Amerikai Egyeslt
llamokban (USA) 1,4 milli baleseti agysrls trtnik vente, melybl 50.000
hallos kimenetel, 235.000 ignyel krhzi kezelst, s 5,3 milli ember l
koponyasrlsre visszavezethet tarts egszsgkrosodssal [85].
6
2.2. A baleseti agysrlsek osztlyozsa
A baleseti agysrlseket tbbfle mdon osztlyozhatjuk. A srls
slyossgnak meghatrozsra leggyakrabban hasznlt mdszer a Teasdale s mtsai.
ltal kialaktott Glasgow kma skla (Glasgow Coma Scale, GCS) [149]. A
pontrendszer hrom reakcit rtkel ki: a szem kinyitst, a mozgst s a verblis
megnyilvnulsokat. Az sszestett rtkek alapjn megklnbztetnek: enyhe
(GCS=13-15), kzpslyos (GCS=9-12), valamint slyos (GCS=3-8) srlseket.
A koponyasrlsek klasszikus felosztsa szerint megklnbztetnk nylt (a
dura mater srl) s zrt srlseket (a dura mater intakt marad) [1]. A nylt srlsek
lehetnek penetrl, vagyis a koponyacsontot s az agyburkokat tszakt srlsek,
valamint az agyvz-tr s a klvilg indirekt kzlekedst eredmnyezk.
A srls patomechanizmusa alapjn az irodalom megklnbztet elsdleges s
msodlagos elvltozsokat. Az elsdleges elvltozsok a srls pillanatban a
mechanikai erk hatsra jnnek ltre, amelyek rinthetik az ereket, axonokat, ideg-s
gliasejteket foklis (gcos) vagy p agyszvetben elszrtan (diffz) elfordul mdon.
A kt tpus a srltek nagy rsznl egyidejleg fordul el. A msodlagos elvltozsok a
klnbz tpus elsdleges elvltozsokhoz kapcsoltan, az agy vr-, s oxign
elltsnak kvetkezmnyeknt jnnek ltre (1. bra).
7
Agyi srlst kvet elsdleges elvltozsok
I. Diffz: - axonlis krosods (diffuse axonal injury, DAI)
axonduzzads/axonballon-kpzds
ultrastrukturlis (neurofilament) kompakci
- vaszkulris krosods (diffuse vascular injury, DVI)
II. Foklis: - intrakranilis vrzs
- szubdurlis vrzs
- extradurlis vrzs
- szubarachnoidlis vrzs
- axonlis krosods
- kontzi
- lacerci
Msodlagos elvltozsok
I. Diffz: - hipoxis-iszkmis krosods
- agyduzzads
II. Foklis: - hipoxis-iszkmis krosods
- agyduzzads
1.bra: Elsdleges s msodlagos agyi elvltozsok osztlyozsa
2.3. Diffz axonlis krosods
A disszertci els kt fejezetnek clterlete a DAI vizsglata. DAI a
koponyatrauma hatsra ltrejv axonlis elvltozsok sszessge, amelyek az p
axonok kztt elszrtan, tbbnyire p parenchimlis krnyezetben figyelhetek meg.
Olyan balesetek esetben jhet ltre, mint pdul motorbicikli, szemlygpkocsi, vagy
gzolsos balesetek, ahol accelerci-decelerci hatsra bred nyrerk jtszanak
fszerepet [127]. A komputer tomogrfin (computer tomography, CT) az elvltozsok
kicsi, petekilis vrzsek formjban, elssorban a szrke- s a fehrllomny hatrn,
valamint a corpus callosum-ban s a hossz plyk agytrzsi szakaszn figyelhetek
8
meg [32]. Annak ellenre, hogy a mgneses rezonancis kpalkots (magnetic
resonance imaging, MRI) megknnyti a kimutatst [14], a DAI teljes bizonyossggal
csak szvettani vizsglattal diagnosztizlhat [64]. Gennarelli munkja alapjn a DAI
50%-ban felels a balesetek utni tarts tudatzavarrt illetve 35%-ban a mortalitsrt a
nem trfoglal jelleg traums agykrosods (traumatic brain injury, TBI) esetekben
[64].
A DAI-nak kt morfolgiailag jl elklnthet megjelensi formja ismert: az
axonduzzads/axonballon-kpzds, valamint az ultrastrukturlis (neurofilament)
kompakci. Korbbi elkpzels szerint mindkt megjelensi forma kivltsban
ugyanazok a tnyezk jtszanak szerepet s ugyanazokat az axonokat rintik. jabb
megfigyelsek szerint a kt elvltozs kt jl elklnthet axon-populciban
figyelhet meg [92, 140].
A DAI vizsglathoz klnbz llatksrletes modelleket alkalmaznak.
Mindazonltal ezek nem kpesek a humn viszonyokat, pldul a humn DAI teljes
kiterjedst s idbeni lefolyst 100%-ban utnozni, ezrt az llatksrletekben
modellezett axonkrosodst traums axonkrosodsnak (traumatic axonal injury, TAI)
nevezzk, a DAI elnevezst pedig a humn esetekre hasznljuk [102].
2.3.1. Axon duzzads/axonballon kpzds (AD/B)
A diffz axonkrosods jelensgt, mint a slyos traums agysrlsek
kvetkezetes velejrjt Strich s munkatrsai rtk le elszr. Megfigyeltk, hogy a
slyos koponya-agysrltek post mortem vizsglata sorn a fehrllomnyban az p
axonok kztt elszrt ballonszer axontgulatok lthatak, amely tgulatoktl disztlis
axon-szakaszon Waller-fle degenerci s mielin-degradci is megfigyelhet [142,
143]. Elmletk szerint a krkp korai szakaszban a trauma ltal ltrejtt mechanikus
erk vezetnek az axon szakadshoz, az rintett proximlis axonvg kvetkezmnyes
retrakcijhoz valamint az axoplazma kiboltosulshoz, ltrehozvn ezzel a retrakcis
axonballont. A retrakcios axonballon utn, a disztlis axon-szakasz Waller-fle
degenercija jn ltre [142]. Mg Strich a megfigyelt elvltozsokat, mint a
fehrllomny diffz degenercijt vagy traums idegrost szakadst definilta,
addig a manapsg hasznlt elnevezs, -a diffz axonlis krosods-, Adams-tl szrazik
[3]. Strich ta Adams s kollgi hangslyoztk elszr -szemben ms kutatkkal-,
hogy a krkp kialakulsban az axonkrosods a koponyasrls elsdleges
kvetkezmnye, s nem pedig a msodlagos krosods (dma, hipotenzi s/vagy
9
hipoxia) kvetkeztben alakul ki [68]. Adams s mtsai. megfigyelsei alapjn a DAI a
fltekei fehrllomnyban, a corpus callosum-ban, az agytrzsi hosszplykban, illetve
kisebb gyakorisggal a kisagyban fordul el foklis krosods nlkl (1-es fokozat).
Foklis lzikkal pedig a corpus callosum-ban (2-es fokozat), illetve a rostralis
agytrzsben (3-as fokozat).
Povlishock s munkatrsai szerint ezen axonlis krosodst a kzpslyos illetve
a slyos koponyatrauma ltal kivltott nyrerk indtjk el. Megllaptottk, hogy a
DAI nem a trauma pillanatban azonnal s vglegesen kialakul axonszakadsknt
alakul ki, hanem a krosodott axonok nagy rszben egy idben fokozatosan
elrehalad folyamat [115]. Azta ez az elmlet szmos llatfajban s
traumamodellben, valamint humn szvetmintkon is is beigazoldott [18, 20, 31, 32,
47, 64, 66].
A folyamat sorn a krosodott axonszakaszokban a srlst kveten
gyakorlatilag azonnal (
10
oldalkarok szma. Elkpzelsk szerint az NFC mechanizmusa a kvetkez:
koponyatrauma hatsra az rintett axon egy rvid (tmrjnl alig hosszabb)
szakaszn makromolekulkat (pl. tormagykr-peroxidz) [110, 111] tereszteni kpes
mret prusok nylnak meg (mechanoporci). Ezltal megsznik az axolemmnak az
ionhztartst szablyoz szerepe; az axonba kalcium ionok ramolnak be. A
nagymrtkben megnvekedett kalcium koncentrci kvetkeztben aktivldik a
kalpain-nev cisztein protez, amely a nem-erithroid alfa-II spektrint 145 kD s 150 kD
mret egysgekre bontja (kalpain-medilta spektrin proteolzis, CMSP), amelyek
specilis immunhisztokmiai eljrssal kimutathatak [135]. A spektrin a
szubaxolemmlis citoszkeleton alkotrsze [12, 65, 109], amely az ankyrin fehrjn
keresztl kapcsoldik a klnbz membrnfehrjkhez, valamint az axolemmhoz [38,
159], tovbb megtalhat a mitokondriumok krl is [41, 65]. A spektrin bontsa
eleinte csak a csak a szubaxolemmlis tr s a mitokondriumok krl zajlik (15-30
perc), majd tovatevdik az rintett axon citoszkeletlis hlzatra [26], melynek
emsztdse tovbbi permeabilitsi zavart s tovbbi intraaxonlis proteolitikus kaszkd
aktivldst eredmnyez, amely vgl irreverzibilis axonkrosodst okoz [25, 26]. Az
NFC kimutatsra a kzepes mret neurofilament M-alegysge elleni RMO-14
antitestet talltk hasznlhatnak, amely a neurofilament oldalkarok defoszforilldsa
sorn szabadd vlt neurofilament-M alegysg rod domn-jhez kpes ktdni [87,
117]. Kezdeti elkpzelsek szerint a citoszkeletlis elvltozsok ugyanazokat az
axonokat rintik, mint az axonduzzads/ballonkpzds; mgpedig: a neurofilamen-
kompakci kvetkezmnyeknt ll le az elre-irnyul intra-axonlis transzport, amely
az axon-duzzads/ballonkpzds okozja. Erre abbl kvetkeztettek, hogy az intra-
axonlis transzportzavart mutat APP-pozitv axonok, s a neurofilament-kompakcit
mutat RMO-14-pozitv axonok ugyanazon anatmiai rgikban fordultak el, s
befolysolsuk ugyanazon intervencikkal volt lehetsges [23, 24, 81, 104, 106]. jabb
megfigyelsek szerint az AD/B s a NFC az estek tbbsgben kt klnbz axon-
populcit rint, s csak kis rszben figyelhet meg ugyanazon krosodott axonon bell,
azaz egymstl fggetlen jelensgekrl van sz [92, 140].
A neurofilament-kompakci mechanizmusnak j alapra val helyezst az a
megfigyels tette szksgess, hogy koponya-trauma utn azonnal perfzisan-fixlt
llatok agyban, st post mortem vgzett koponyatraumt szenvedett llatok agyban
is megtallhat volt egy specilis ezstz eljrssal. Elektron-mikroszkpis vizsglat
igazolta, hogy, stt idegsejtek kpzdnek koponyatrauma hatsra az enzimatikus
11
folyamatok szmra szlssgesen kedveztlen krlmnyek kztt is [58]. Ebben az
esetetben a kompaktldott axonokban a mikrotubulusok pnek ltszottak, a
neurofilament oldalkarok sem tntek el, csak megrvidltek. Ez arra utal, hogy a
koponyatrauma utni els rkban ksrletesen tallt kalcium-induklt, kalpain-medilt
spektrin proteolzis nem okozja, hanem kvetkezmnye az ultrastrukturlis
kompakcinak. Minthogy a kompakci nemcsak a neurofilamenteket rinti, hanem az
axon valamennyi ultrastrukturlis elemt, clszer a neurofilament kompakci helyett
az ultrastrukturlis kompakci terminus technikust alkalmazni. Az ezstz eljrssal
kimutathat volt, hogy az ultrastrukturlis kompakci az axon viszonylag hossz (akr 1
mm-nl is hosszabb) szakaszt rinti, de - disztlis irnyban - ltalban nem a teljes
hosszsgt, s - proximlis irnyban - ltalban nem ri el az axon eredsi dombot.
Egy specilis koponyatrauma mdszer segtsgvel ultrastrukturlis axon-
kompakcit sikerlt elidzni egybknt p agykreg elre kivlasztott terletn [107].
Ezen mdszer alkalmazsval kiderlt, hogy a kompaktldott axonoknak csupn egy
hnyada degenerldik, msik hnyaduk nhny ra leforgsa alatt visszanyeri eredeti
struktrjt [61]. Az axonokban vgbemen ultrastrukturlis kompakci felttelezett
mechanizmusa megegyezik az idegsejtek szmjban s dendritjeiben vgbemen (s a
kvetkez alfejezetben trgyalt) ultrastrukturlis kompakcijval, ezrt ott trgyaljuk.
2.4. Diffz idegsejt-krosods (stt idegsejt kpzds)
Tbb mint szz ve rtk le [52], hogy klnbz neurolgiai betegsgekben
meghaltak agyban olyan idegsejtek tallhatk, amelyek magja, citoplazmja s a f
dendritjei nagymrtkben zsugorodottak, valamint ersen ktik a neurohisztolgiban
hasznlatos bzikus festkeket (hiperbazofilia). Ezrt ezeket a sejteket tradicionlisan
stt idegsejteknek nevezik [28]. A 80-as ve eleje ta szmos neurolgiai
megbetegeds llatksrletes modellje esetben is lertk a stt idegsejtek jelenltt. A
hipoglikmia s a hiperglikmia hatsra kpzdtt stt idegsejtekrl kimutattk,
hogy mind elpusztulni, mind pedig regenerldni kpesek [4, 10]. Status epilepticus
esetben ugyanez a helyzet [9, 136]. Foklis iszkmia utni reperfzi esetben pedig az
iszkmis gc szli terletein lehet megfigyelni ezen elvltozst [36, 72, 76, 80, 101,
134, 134]. Ngy-r iszkmia esetben a reperfzi utn fleg a hilus s a hippocampus
CA1 rgijban, valamint a cortex terletn figyelhet meg elszrt stt llapoton
keresztli sejtpusztuls [36, 72, 80]. Gallyas s mtsai. a 90-es vek elejn megfigyeltk,
12
hogy mind in vivo, mind pedig post mortem mechanikai trauma hatsra is kpzdnek
stt idegsejtek s axonok [62].
Elektronmikroszkpos vizsglatok [58] szerint a frissen kpzdtt stt
idegsejtek ultrastrukturlis elemei pnek tnnek, de szorosan egyms mell tmrlnek
(ultrastrukturlis kompakci). Az rintett sejtek elektron-denzitsa megemelkedik,
trfogata pedig mintegy felre cskken a plazma-membrn felszakadsa nlkl. Az
endoplazmatikus retikulum (ER) ciszterni sszeszklnek, a Golgi-ciszternk viszont
kitgulnak. Nem vltozik a mitokondriumok s a multivezikulris testek trfogata. Az
rintett idegsejtek egy hnyada nhny ra alatt visszanyeri eredeti morfolgijt
(recovery), egy msik hnyada viszont elpusztul. Azon az alapon, hogy a frissen
ultrastrukturlis kompakcit szenvedett idegsejtek s a frissen ultrastrukturlis
kompakcit szenvedett axonok fny- s elektron-mikroszkpos sajtossgai azonosak,
kpzdsi mechanizmusukat is azonosnak tartjk [58].
A stt idegsejtekre jellemz, hogy ha szmja kompaktldik, akkor
dendritfja is, s fordtva. Az axonoknak mindig viszonylag hossz szakaszai
kompaktldnak. E jelensgek csak gy magyarzhatak, hogy a kompaktlds
minden egyes szma-dendrit domn, vagy axon egyetlen pontjn indul meg, majd
onnan terjed r az egszre. Ezt a folyamatot gy magyarzzk [55, 58] gy
magyarztk, hogy az idegsejtek (s ms sejtek) citoplazmjban egy - az
ultrastrukturlis elemekhez lehorgonyzott - mikro-trabekulris gl-struktra tallhat,
amely nem-kovalens ktsek formjban energit trol, s amely kpes - egy ponton
val inicils utn - sszehzdssal jr, tovaterjed fzistalakulsra (glbl-gl
fzistalakuls) a trolt energia hatsra. A glbl-gl fzistalakuls a polimer-
kmiban ismert jelensg [6, 148]. Az erre kpes gleknek kt, vagy tbb metastabil
llapota van s a klnbz energiaszint metastabil llapotokhoz eltr polimer-
molekula konformci, eltr vztartalom s egymstl eltr trfogat tartozik.
Megfelel aktivcis energia kzlsvel a magasabb energij metastabil struktra egy
pontja tbillen az alacsonyabb energiartk, m ugyanakkor energetikailag stabilabb
llapotba. Az itt felszabadul energia a szomszdos pontokon aktivcis energiaknt
szolglva lncreakcit indt el (domin-elv). A stt idegsejtek esetben a
fzistalakuls inicildhat patometabolikus folyamat (iszkmia, hipoglikmia,
epilepszis roham vagy mechanikai behats) ltal. A gl-struktra sszehzdsa
magval vonja a hozz horgonyzott ultrastrukturlis elemeket, s folyadkot prsel ki a
szma-dendrit domnbl illetve az rintett axon-szakaszokbl [58].
13
2.5. Sejthall mechanizmusok agysrlsben
Koponyasrls sorn az elsdleges krosods mellett msodlagos folyamatok is
elindulnak. A klnbz llatksrletes modellekben az erbehats nagysgtl, nemtl,
letkortl, sejttpustl s agyi rgitl fggen klnbz sejthall-mechanizmusok
aktivldnak. Az elmlt vtizedben egyre tbb, a sztrk, a neurodegeneratv betegsgek,
valamint a neurotrauma terletn szletett kutatsi eredmny krdjelezi meg a jelenleg
is rvnyben lv nekrzis- apoptzis paradigma helyessgt [67].
A klasszikus lers alapjn a nekrzis a sejthrtya integritsnak megsznsvel,
duzzadssal, vgl a sejtorganellumok sztessvel jr folyamat.
Az apoptzis a klasszikus definci szerint a filogenezis sorn konzervlt,
fiziolgis folyamat, amelynek szerepe a szveti homeosztzis fenntartsa.
Jellegzetessge a kromatin-kondenzci, mag-fragmentci, a sejtzsugorods, vgl az
apoptotikus testek kpzdse, amelyeket makrofgok takartanak el. Mivel az apoptzis,
szemben a nekrzissal energia ignyes folyamat, ezrt az apoptozis elssorban az
iszkmis vagy traums srls nekrotikus kzpontja krl elhelyezked szli
(penumbra) terleten fordul el. Kulcsenzime a kaszpz, amely mitokondrilis
krosods valamint hallreceptorok segtsgvel aktivldhat. Az apoptzisnak ismert
kaszpztl fggetlen formja is, amelyben klnbz faktorok mint az az AIF vagy
endonuklez G (mitochondrialis nuklez) mediljk a tpusos programozott sejthall
fenotpus megjelenst [151, 157].
Egyes kutatsi eredmnyek alapjn a sejtet rt behats erssgtl (mechanikai
energia), a kalcium-felszabaduls mrtktl, illetve az intracellulris ATP-szinttl fgg
[44], hogy a sejt melyik sejthall utat vlasztja. Felttelezik, hogy az egyik t gtlsa a
msik irnyba tereli a sejtpusztulst [19, 51, 112]. Mind a nekrzis, mind az apoptzis
csak abbl a genetikailag elre meghatrozott eszkzkszletbl vlogathat, amelybl a
fiziolgis mkdsek is, gy az lettani s a klnbz noxk ltal elindtott patolgis
folyamatok a genotpusukban s ez ltal a fenotpusukban is hasonlthatnak egymshoz.
Egyes szerzk szerint a nekrzis s az apoptzis egy kpzeletbeli spektrum kt
szln helyezkedik el, amely kztt brmilyen hibrid elfordulhat [157]. Ms kutatk
nekrzis, nekrzis-szer, apoptzis-szer, s apoptzis kategrikat hasznlnak
[88]. Mindezek alapjn ugyan klnbz sejthall-tpusokrl beszlnk, de ezek viszont
gyakran ugyanazokat a jeltviteli utakat hasznljk [54].
14
Az elpusztult stt idegsejtek vagy az apoptotikushoz hasonlan (a
kompaktldott struktra homogenizldik, majd membrnnal krlvett
fragmentumokra bomlik, amelyeket fagocitl sejtek kebeleznek be), vagy pedig a
nekrotikushoz hasonlan (a kompaktldott ultrastruktra fellazul, majd elemei
sztzilldnak, vgezetl elbb a plazma-membrn, majd a mag-membrn eltnik)
takartdik el a szvetbl [56]. Ismeretes, hogy az apoptotikus sejtek citoplazmja a
biokmiai folyamatok lejtszdsa s a mag-kromatin kondenzldsa utn
ultrastrukturlis kompakcit szenved. Azon az alapon, hogy a kompakcit szenvedett
apoptotikus sejtek fny- s elektron-mikroszkpos sajtossgai megegyeznek a stt
idegsejtekvel felttelezik [55], hogy az ultrastrukturlis kompakci mechanizmusa
mindkettben ugyanaz. gy a stt idegsejt kpzds nem ms, mint a fiziolgis
apoptzis szmra genetikailag kdolt ultrastrukturlis kompakci nem-apoptotikus
(nem-kdol, tves) indtsa.
Az ultratrukturlis kompakcit szenvedett apoptotikus sejtek is eltakarthatdnak a
nekrotikushoz hasonl ton [55]. Ezrt el kell vlasztani a sejt-hall folyamatt a
meghalt sejtek eltakartsnak folyamattl. Az elbbi lehet nekrotikus, apoptotikus,
egyb [67], vagy a stt-idegsejt llapoton keresztli; az utbbi pedig apoptotikushoz-
hasonl, vagy nekrotikushoz-hasonl [55].
2.6. A diffz axonlis krosods terpis befolysolst clz vizsglatok
Az elz fejezetekbl kitnik, hogy az axon-duzzads/ballonkpzds egy rk
alatt kialakul folyamat eredmnye, az ultrastrukturlis kompakcit szenvedett axonok
pedig regenercira kpesek, a DAI mindkt formjban lehetsg nylik a krosods
mrsklsre.
Mivel a dolgozat az agyalapi mirigy adenilt-ciklz aktivl polypeptid
(PACAP) s egy poli (ADP-ribz)-polimerz (PARP) inhibitor, az L-2286 terpis
hatsval foglalkozik, gy e bevezet rszletesen csak a PACAP s a PARP inhibitorok
hatsmechanizmust trgyalja.
2.6.1. Az agyalapi mirigy adenilt-ciklz aktivl polipeptid
A PACAP szerkezetileg a vazoaktv intesztinlis peptid (VIP)/szekretin/glkagon
csaldba tartozik, melyet elsknt a hipotalamusz-bl izolltak [98]. A fehrje a
hipofzis-ben nveli az adenilt-ciklz aktivitst, neuromodulcis funkcija mellett a
kzponti-, illetve a perifris idegrendszer terletn neurotrfikus s neuroprotektiv
hatst fejt ki [7]. Antiapoptotikus hatst igazolta, hogy a gerincvel srls extradural
15
static weight compression modelljben a szignifiknsan cskkentette a gerincveli
apoptzist [77], tovbb gerincvel tmetszs modelljben kivdte a tumor nekrozis
faktor (TNF) felszabadulst [78]. In vitro mind antiapoptotikus, mind
gyulladscskkent hatsait lertk. A kisagy granulris sejtjeiben szignifiknsan gtolta
a kaszpz-3 aktivldst [153], mikroglilis pro-inflammatorikus citokin s nitrogn-oxid
felszabadulst [40, 78, 84], illetve serkentette az anti-inflammatorikus IL-10 citokin
termeldst [63]. A PACAP tbb olyan gn mkodst indtja be, amelyek a
neurotoxicits elleni vdekezsben szerepet jtszanak, ilyen pldul a citokrm P450 s
az fibroblaszt nvekedsi faktor (fibroblast growth factor, FGF) [152].
A PACAP ksrletes krlmnyek kztt gtolta a mitokondrilis kalcium
felvtel hatsra ltrejv akonitz enzim inaktivldst, ezzel megtartva ennek a
neuronok mkdkpessghez nlklzhetetlen enzimnek a funkcijt [145].
In vivo vizsglatok szerint a PACAP tjut a vr-agy gton [13]. A PACAP
hatsosnak bizonyult patknyon ksrletesen elidzett globlis s foklis agyi iszkmia
eltt, valamint utn adva, tovbb retina-degenerci esetben is [8, 11]. Viselkeds-
vizsglatok alapjn kimutattk, hogy Huntington-kr llatksrleti modellje esetben a
PACAP-al elkezelt patknyokban hiperkinzia nem alakult ki, s az aszimmetrikus
mozgs is megsznt a kezels utni 10. napon [146]. A Parkinson-kr llatksrletes
modelljben a PACAP-al trtn elkezels cskkentette a hipokinzia slyossgt,
valamint teljes felgygyulshoz s az aszimmetrikus jelek megsznshez vezetett a
kezels utni 10. napon [123].
2.6.2. A poli (ADP-ribz)-polimerz gtlsa
A PARP egy kromoszmlis enzim, amely olyan folyamatok mkdsben vesz
rszt, mint a DNS javts [37], s a programozott sejthallnak, az apoptzisnak a
ltrejtte. Oxidatv stressz hatsra kialakul DNS trs kvetkeztben aktivldik,
melynek eredmnyeknt a nikotinamid adenin-dinukleotidrl (NAD+) ADP-ribz
egysgeket transzferl nukelris fehrjkre. Ez a rendkvl energia ignyes folyamat,
halmozott stressz hatsra kialakul tlmkdsvel a NAD+ deplcijt, ATP vesztst
s a sejt energia-homeosztzisnak sszeomlsa rvn nekrotikus ton bekvetkez
sejthallhoz vezet [27]. Mikzben a PARP hossz tv gtlsa elvileg mutagenezist s
karcinogenezist induklhat, az akut szakban hozzjrulhat az energia-hztarts
rendezdshez s az energia-homeosztzis fenntartshoz.
16
A PARP kzponti szerepet jtszik a kaszpztl-fggetlen, apoptzis-indukl
faktor (apoptosis-inducing factor, AIF) kzvettette apoptzis ltrejttben, valamint az
NF-kappaB-ton keresztl gyulladsos citokinek s meditorok felszabadulst is
befolysolja [83].
Az elmlt vek sorn fny derlt arra, hogy a PARP aktivldsa szerepet
jtszhat a kaszpz-fggetlen apoptzis ltrejttben [43, 158], ezrt a PARP gtlk
fontos terpis lehetsgnek szmtanak a koponyasrls okozta agyi krosods sorn
ltrejv nekrzis, illetve apoptzis ltrejttnek cskkentsben [128].
Korbbi vizsglatok tbbfle PARP gtlk, mint pldul benzamid analg
vegyletek (3-aminobenzamid) s az isoquinolin szrmazkok hatst vizsgltk
koponyasrls okozta agyi krosods esetben [16, 17, 86, 128]. A klnbz
llatksrletes modelleken vgzett sikeres ksrletek eredmnyeinek alapjn remnyeink
szerint a PARP gtl vegyletek is fontos szerepet jtszhatnak a ksbbi klinikai
kezelsek sorn.
17
3. CLKITZSEK
Amint a Bevezetsben tallhat tblzatbl kitnik, a koponya-trauma hatsa
rendkvl sszetett, komplex folyamatainak kvetse mg in vitro modellksrletekn,
vagy egyszer llatksrletes, rgcsl modellen sem knny. ppen ezrt a
koponyatrauma patolgis hatsnak egyes rszleteire prbltunk fkuszlni a jelen
disszertci alapjt kpez vizsglatokban, mely krdseket a rendelkezsnkre ll
mdszerek hasonlsga is sszekapcsolja. Minthogy a msodlagos koponyatraums
elvltozsok kz tartoz iszkmis krosods elfordulsa s lokalizcija
rapszodikus, radsul tovbb bonyoltja a fenti kpet, az iszkmit egy jl
reproduklhat nem-koponyatraums modellben vizsgltuk.
A munka sorn feltett alapvet krdsek az albbiak voltak:
Van-e neuroprotektv hatsa a hipofzis adenilt-ciklz aktivl polipeptidnek
(PACAP-nak) a centrlis folyadk-perkusszis (CFP) patkny-modellel vgzett traums
agysrls esetn?
Van-e neuroprotektv hatsa az L-2286-nak (egy j fejleszts PARP-
inhibitornak) a Marmarou-fle impakt accelercis patkny-modell vgzett traums
agysrls esetben?
Mi a sorsa a tranziens foklis agyi iszkmia okozta stt (ultrastruktulis
kompakcit szenvedett) idegsejteknek nem-nekrotikus s nem-excitotoxikus szveti
krnyezetben?
18
4. AZ AGYALAPI MIRIGY ADENILT-CIKLZ AKTIVL POLIPEPTID
(PACAP) NEUROPRTEKTV HATSNAK IMMUNHISZTOKMIAI
VIZSGLATA A CENTRLIS FOLYADK-PERKUSSZIS (CFP) PATKNY-
MODELLLEL VGZETT AGYSRLS ESETBEN
A fejezet alapjul szolgl publikci:
Kvesdi, E.; Tams, A.; Regldi, D.; Farkas, O.; Pl, J.; Bukovics, P.; Dczi, T.; Bki,
A.: Posttraumatic administration of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in
central fluid percussion injury in rats. Neurotox. Res. 2008, 13:71-8
19
4.1. Bevezets
A PACAP szerkezetileg a szekretin/glkagon/vazoaktv intestinlis peptid
csaldba tartozik. Elsknt birka hipotalamusz-bl izolltk adenilt-ciklz aktvl
hatsa alapjn [98]. Tbb tanulmny szerint szmos in vivo s in vitro neuroprotektv
hatsa ismert [7, 137, 154]. Sajnlatos mdon az in vivo neuroprotektv hats pontos
mechanizmusa nem tisztzott mg pontosan. Az in vivo tanulmnyok a PACAP
apoptzis s gyullads gtl hatst bizonytjk. Agyi granulris sejtekben
szignifiknsan kpes gtolni a kaszpz-3 aktivtst [154], valamint hatst gyakorol a
mitokondrilis tjrhatsgra, ugyanis gtolja az akonitz enzim mitokondrilis
klcium-felvtel induklta inaktivldst. Az akonitz egy kulcsfontossg
mitokondrilis enzim, amely befolysolja az idegsejtek letkpessgt [145].
Korbbi kutatsok alapjn a PACAP hatsosnak bizonyult patkny ksrletes
globlis s foklis agyi iszkmia esetben srls eltti, illetve utni kezelsek esetben
[124, 125, 150], Parkinson-krban s retinlis degenerci esetben is [11, 121, 123,
150].
Az utbbi nhny vig csak kevs tanulmny foglalkozott a PACAP esetleges
neuroprotektv tulajdonsgnak vizsglatval trauma okozta agy, illetve gerincvel
srls esetben. A gerincveli krosodst okoz extradural static weight
compression modelljben szignifiknsan cskkentette az apoptotikus sejtek szmt a
srlt gerincvelben [77].
Az elmlt vekben pcsi kutatk vizsgltk a PACAP neuroprotektv hatst
diffz krosodst okoz trauma modellben patknyon [49, 147]. A korbban agyi
iszkmiban hatsos dzis (125 g, srls eltti intavns kezels) nem volt hatsos,
m az intracerebroventrikulris (i.c.v.) kezels hatsosnak bizonyult [49].
A vizsglatunkban hasznlt dzis a fenti munkacsoport kutatsi eredmnyein
alapul, miszerint az i.c.v. 100 g PACAP kpes szignifiknsan cskkenteni a krosodott
axonok denzitst a kortikospinlis plya (corticospinal tract, CSpT) terletn.
4.2. Anyagok s mdszerek
4.2.1. Ksrleti llatok
A ksrleteket 350-380 g-os hm Wistar patknyokon vgeztk, amelyeket a
Pcsi Idegsebszeti Klinika kutatlaboratriumnak llathzban standard krlmnyek
kztt tartottuk, tellel s vzzel ad libitum elltva. Az llatok tartst s kezelst az
llatksrletek vgzsrl szl 243/1998. szm kormnyrendelet elrsainak
20
megfelelen vgeztk. A ksrleteket a Pcsi Tudomnyegyetem llatksrletekkel
foglalkoz Etikai Bizottsga (engedlyszm: BA 02/2000-26/2001) engedlyezte.
4.2.2. A centrlis folyadk perkusszis modell kivitelezse patknyon
sszesen 21 felntt Wistar patknyt (350-380g) hasznltunk a vizsglatokhoz.
Ebbl 18 llat rszeslt az elre meghatrozott mtti protokoll [42, 97] alapjn
kzpslyos (2 atm) CFP okoza koponyasrlsben, mg 5 llaton csak magt a mttet
vgeztk el, de traumt nem kaptak (l-mttt csoport).
A mtti eljrs sorn az llatokat 5 percig elaltattuk 4% isoflurn (Abbot
Laboratories (Magyarorszg) Kft.), 70% N2O s 30% O2 keverkvel. Intubls utn a
mtt alatt a patknyokat mlyen altattuk 1-2% isoflurn, 70% N2O s 30% O2
elegyvel, altatgp segtsgvel (Inspira ASV, Harvard Apparatus USA). Az llatok
testhmrsklett minden mtt alatt llandan mrtk s 37 C-on tartottuk egy
specilis ftpad segtsgvel (FHC BOWDOINHAM ME 04008 USA Temperature
Control). Az artris oxign szaturcit az egyik hts vgtagon elhelyezett pulzus-
oximter (NONIN 8600 V) segtsgvel folyamatosan ellenriztk egszen az llatok
bredsig a mttek utn. Intubls utn az llatokat sztereotaxis kszlkben
rgztettk, majd a fejtet brn ejtett hosszanti bemetszssel feltrtuk a koponya
Lambda s Bregma varratok kztti rszt. Kt 1 mm-es lyukat frtunk a koponya jobb
oldali frontlis s occipitalis rszbe 1 mm-re a Bregma s Lambda varratoktl, majd
ezekbe a korona jobb rgztse cljbl kismret csavarokat rgztettnk; 4,8 mm
tmrj koponyalket frtunk a Lambda s Bregma varratok kztti kzpvonalon a
durt srtetlenl hagyva. A korona f rszeknt a lyuk felett manyagbl kszlt
gynevezett sapkt rgztettnk, majd fogszati akrill segtsgvel a kt korbban mr
rgztett csavarokat s a sapka krli terleteken a sapka magassgval megegyez
szintig kialaktottuk a koront. Az akrill megszradsa utn a sapkt fiziolgis
soldattal tltttk fel. A ksrlet llatokat kzvetlenl a trauma kpzse eltt levettk
az altatgprl, majd az llatok a FP berendezsre felhelyezve kzpslyos (2 atm)
koponyatraumban rszesltek. A trauma utn az llatok a spontn lgzs visszatrsig
megfigyels alatt lltak, s ha 20 mp alatt nem trt vissza a spontn lgzs, akkor
llegeztet gpre kerltek, ahol 100% O2-t kaptak a lgzs normalizldsig. A mtt
vgn az llatok fejbrt sszevarrtuk, s egyesvel visszahelyeztk a sajt ketreckbe.
21
4.2.3. I.c.v. PACAP kezels
A hatanyag kezelt csoportban esetben (n=8) 30 perccel a trauma utn
folyamatos altats alatt a Bregmt 0:0 koordintj pontnak tekintve (Paxinos s
Watson, 1997) az AP:-1,0; L: 1,5; V:-3,5; agyterlet felett fogszati fr segtsgvel,
mikroszkpos kontroll alatt megnyitottuk a koponyt, s i.c.v. kezelssel 100 g
PACAP-ot 5l fiziolgis soldatban feloldva juttattunk be a jobb oldali agykamrba.
Mg a vehikulum kezelt csoport (n=8) esetben ezzel megegyez mdon fiziolgis
soldatot kapott.
4.2.4. Immunhisztokmia
Trauma utn kt rval az llatokat intraperitonilis pentobarbiturttal
tlaltattuk. Ezt kveten szven keresztl elbb fiziolgis soldattal, majd 4%-os
paraformaldehiddel perfundltuk ket. Az agyakat a gerincvel agytrzsi szakaszval
egytt eltvoltottuk a fixlt llatokbl s egy jszakn keresztl fixl oldatban troltuk
(4%-os paraformaldehid). Az agytrzsi rszbl egy medilis 5mm szles blokkot
vgtunk ki specilis agyfeldaraboldst segt eszkzzel (Braintree Scientific Inc.),
majd vibratm segtsgvel 30 m-es szeletekre vgtuk. Ezeket 0,1 M-os foszft
pufferben troltuk az immunhisztokmiai protokoll elvgzsnek megkezdsig. Az gy
elksztett metszeteket kt rszre osztottuk a ktfle immunhisztokmiai vizsglathoz.
A krosodott axonlis transzport vizsglathoz bta-amiloid prekurzor protein
C-terminusra (APP) hat poliklonlis antitesttel imunhisztokmiai vizsglatot
vgeztnk. Az APP a gyors axonlis transzporttal szlltdik. A koponyatrauma okozta
agysrls kvetkeztben ltrejv axonlis krosods sorn az axoplazmatikus
transzport krosodik s az APP felhalmozdik a krosods helyn [22, 23, 26, 74, 92,
117, 118]. Az RMO-14 antitest a trauma kvetkeztben konformci vltazson tesett
neurofilamentumok M alegysgn tallhat rod-domn-hez ktdve a citoszkeleton
krosodsnak (NFC) kimutatsra alkalmas [23, 87, 105, 117].
Az agyszeleteken 30 percig 0,5 %-os hidrogn-peroxidal trtn endogn
peroxidz blokkolsa utn a szeletek 3x10 percig trtn foszft pufferes (phosafate
buffered saline, PBS) mossa kvetkezett. Ezutn Stone lersa alapjn [141] citrt-
pufferben antign-feltrs kvetkezett. jbli 3x10 percig tart PBS-es moss utn a
httrgtls miatt a metszeteket PBS s a Vectastain ABC standard "Elite" kit (Vector)
1%-os lszrumban inkubltuk 35 percig. Ezutn a primer antitesttel trtn kezels
22
kvetkezett, ami APP jells esetben nyl-anti-APP s lszrum keverkt (1:500),
mg RMO-14 jells esetben egr monoklonlis RMO-14 antitest s lszrum
keverkt (1:500) jelenti egy jszakn t trtn inkublssal. Msnap 3x10 percig tart
PBS-es moss utn a szekunder antitestel 1 rn t tart inkubls kvetkezett. jbli
3x10 perces PBS ben trtn moss s avidin biotin-peroxidz komplexel trtn
inkubls utn a szeleteket 3x10 percig PBS-ben mostuk. Ezutn az immunhisztokmiai
komplexet a lthatv ttel miatt 0,05%-os diamino-benzidin (DAB) s 0,01%-os
hidrogn peroxid oldattal elhvtuk. A DAB-al trtn elhvs utn a metszeteket mg
1x10 percig PBS-ben mostuk, majd a metszetek desztilllt vzbl val trgylemezre
felhzsa s 30 percig tart szradsa utn lefedtk a fnymikroszkpos vizsglathoz.
A szvettani vizsglatok elemzse Image-Pro Plus v5.0.1 segtsgvel
Az APP illetve RMO-14 immunopozitv axonokat fnymikroszkp (Nikon),
hozzkapcsolt digitlis fnykpezgp (Spot Rt), valamint szmtgpes kpvizsgl
programmal (Image-Pro Plus v5.0.1) elemeztk. A korbbi lersok alapjn a DAI
legfkppen rintett terlete a CSpT s a medilis hosszanti kteg (medial longitudinal
fascicle, MLF) agytrzsi szakasza, ezrt ezeket a terleteket elemeztk az
immunhisztokmiai protokoll elvgzse utn. llatonknt 6 agytrzsi szakaszrl
ksztettnk digitlis kpet 20-szoros nagytsban. 45.000 m2-es terleten mind a
CSpT, mind az MLF terletn a krosodott axonokat sszeszmoltuk.
Statisztikai analzis
A PACAP s a vehikulummal kezelt csoport kztti krosodott axonok
denzitsbeli (tlag/mm2) klnbsgt Student-fle t-prbval hasonltottuk ssze.
Szignifiknsnak tekintettk a klnbsget, ha a p rtk kisebb volt, mint 0,05.
4.3. Eredmnyek
Az l-mttt llatok immunhisztokmiai vizsglatnak fnymikroszkpos
elemzse krosodott axonokat nem mutatott ki. Az APP immunopozitv axonok
morfolgiai kpe megduzzadt, rszben sztszakadt axondarabokat mutatott. Az RMO-
14 immunopozitv axonok lobulltak s rszben vagy teljes mrtkben sztszakadtak a
fnymikroszkpos kpen. Ezek a megfigyelsek megegyeznek a ms kutatk ltal
korbban mr hasonl tllsi idt kveten lert krosodott axon-alakokkal [22, 24,
23
139]. Sem az APP, sem az RMO-14 immunoreaktv axonok morfolgiai jellege nem
klnbztt a PACAP-, illetve a vehikulum kezelt csoportban.
Az eredmnyek fnymikroszkpos valamint statisztikai elemzse sorn
megllaptottuk, hogy a kzpslyos CFP okozta koponyatrauma utn 30 perccel
trtn i.c.v. PACAP kezels szignifiknsan cskkentette mind az APP, mind az RMO-
14-immunopozitv axonok denzitst a CSpT-ben a vehikulummal kezelt llatokhoz
viszonytva. Ezzel szemben az MLF-ben szignifikns klnbsget nem tapasztaltunk
sem az APP, sem az RMO-14-immunopozitv axonok denzitsban a PACAP s
vehikulummal kezelt csoport kztt (2-5. bra).
2. bra: Megduzzadt, rszben sztszakadt APP immunopozitv axonok
fnymikroszkpos kpe a kortikospinlis pyban (CSpT, A s B) s a medilis
longitudinlis ktegben (MLF, C s D) a PACAP (A s C) illetve vehikulummal kezelet
(B s D) llatok esetben.
24
3.bra: Lobullt, rszben vagy teljes mrtkben sztszakadt RMO-14 immunopozitv
axonok a kortikospinlis pyban (CSpT, A s B) s a medilis longitudinlis ktegben
(MLF, C s D) a PACAP (A s C) illetve vehikulummal kezelet (B s D) llatok
esetben.
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
vehikulum-CSpT PACAP-CSpt vehikulum-MLF PACAP-MLF
AP
P im
mum
orea
ktv
axo
nok
den
zt
sa
*
4. bra: APP immunopozitv axonok tlagos denzitsa CSpT s a MLF terletn a
PACAP s vehikulummal kezelet llatok esetben. Az adatok tlag/mm2 SEM-ben
kifejezve (*p< 0,05 a vehikulum kezelt csoporthoz viszonytva).
25
100
150
200
250
300
350
vehikulum-CSpT PACAP-CSpt vehikulum-MLF PACAP-MLF
RM
O-1
4 im
mu
nor
eakt
v a
xon
ok
den
zt
sa
*
5. bra: RMO-14 immunopozitv axonok tlagos denzitsa a CSpT s az MLF terletn
a PACAP s vehikulummal kezelet llatok esetben. Az adatok tlag/mm2 SEM-ben
kifejezve (*p< 0,05 a vehikulum kezelt csoporthoz viszonytva).
4.4. Megbeszels, kvetkeztetsek
Munknk az els olyan tanulmny, amely a CFP modellben bizonytotta a
PACAP neuroporotektv hatst DAI esetben. Eredmnyeink jl mutattk, hogy a
kzpslyos CFP modell okozta srls utn 30 perccel trtn i.c.v. 100 g PACAP
kezels szignifiknsan kpes volt cskkenteni a krosodott axonok denzitst a CSpT-
ben. Megfigyelseink altmasztjk azokat a korbbi tapasztalatokat [137], melyek
szerint a diffz TAI impakt acceleris modellje esetben, a PACAP hatkony
gtlszerknt mkdik az axonlis krosods kvetkeztben ltrejv intraaxonlis
transzportzavar s NFC kivdsben.
Megfigyelseink ezen kvl jl egybevgnak azokkal a korbbi tanulmnyokkal,
amelyek a PACAP neuroprotektv hatst vizsgltk klnbz in vitro s in vivo
vizsglatok sorn. E szerint in vitro krlmnyek kztt a klnbz sejtvonalakon
vgzett ksrletek sorn hatkony apoptzist gtl hatssal rendelkezik [132, 137], in
vivo mind az tmeneti (tranziens), mind a tarts (permanens) foklis iszkmia
llatksrletes modellek esetben cskkenti az elhalt agyterlet nagysgt [125, 137].
Teljes agyi iszkmia esetben az i.c.v. vagy intravns PACAP kezels gtolja az
iszkmia okozta sejtpusztulst a hippokampusz CA1 regijnak terletn [133]. A
Parkinson-kr llatksrletes modelljben a subtancia nigra dopamintermel
26
sejtcsoportjait megvdi a programozott sejthalltl (apoptzis), valamint ezzel egytt
javtja funkcionlis kimenetelt [122, 123].
Habr azok a folyamatok, melyekben a PACAP in vivo neuroprotektv
tulajdonsga rvnyesl egyelre mg nem tisztzottak, az in vitro tanulmnyok szerint
a PACAP mind apoptzis-, mind gyulladsgtl hatssal rendelkezik. TAI esetben a
PACAP szignifiknsan gtolja a kaszpz aktivtst valamint az apototikus kaszkd
ltrejttben kulcsfontossg szerepet jtsz molekulk mkdst [25, 48]. Ez a hats
szintn megfigyelhet idegsejtkultrkban s in vivo retina-sejttenyszetben is [120,
137]. A TAI ltrejttben fontos szerepet jtszik az intraaxonlis mitokondriumok
integrtsnak megvltozsa [24, 25, 106]. A kros mitokondrilis klcium akkumulci
inaktivlja az akonitz enzim mkdst, amely a f mitokondrilis enzim s
befolysolja az idegsejtek letkpessgt. A PACAP ezt az inaktivcit gtolva kpes
befolysolni ezt a megvltozott mitokondrilis integrtst [145].
A ksrlet f megllaptsa, hogy CFP utn 30 perccel trtn i.c.v. 100 g
PACAP kezels szignifiknsan cskkenti mind az APP, mind az RMO-14
immunopozitv axonok denzitst.
Mg az axonlis transzportzavar nem csak az egyetlen axonpusztulshoz vezet
t, mgis az anterogrd transzport ilyen jelleg krosodsa, valamint az ennek
kvetkeztben ltrejv axonszakads megakadlyozsa a DAI egyik lehetsges
kulcsfontossg kezelsi mdjaknt azonosthat. Megjegyzend viszont, hogy a
PACAP neuroprotektv tulajdonsga csak a CSpT terletn volt szignifikns. Ezen
plyarendszeren a krosodott axonok denzitsa valamint az tmrjk s lefutsuk ms,
mint ami a medilis hosszanti kteg terletn lv axonokra jellemz [92, 140], ez
rszben magyarzhatja az eredmnyekben tapasztalt eltrst. Annak ellenre, hogy az
utbbi vekben kiterjed kutats folyt olyan j hatanyagok kifejlesztsre s
tesztelsre, amelyek kpesek gtolni a DAI ltrejttt okoz patobiolgiai
mechanizmusokat, egyetlen klinikai vizsglatban alkalmazott hatanyag sem bizonyult
hatkonynak. Ezrt az aprlkos preklinikai kivlaszts felttlenl szksges ahhoz,
hogy a ksbbiekben a klinikai tesztelsek sorn a kivlasztott szer maximlis
hatkonysgot nyjtson.
Vizsglatainkat sszegezve azt szndkoztuk bemutatni, hogy a PACAP
axonoprotektv hatssal rendelkezik, mely nem csak az impakt accelercis, hanem a
CFP llatksrletes modellben kivltott DAI esetben is igazolhat. A korbbi, valamint
27
a most bemutatott eredmnyek alapjn a PACAP potencilis jelltnek szmt, mint
lehetsges hatanyag a koponyasrls okozta agyi krosodsok klinikai kezelsben.
28
5. AZ L-2286-EGY J POLI (ADP-RIBZ) POLIMERZ INHIBITOR
NEUROPROTEKTV HATSNAK VIZSGLATA MARAMROU-FLE
IMPAKT ACCELERCIS PATKNY MODELLEL VGZETT
KOPONYATRAUMA ESETBEN
A fejezet alapjul szolgl publikci:
Kvesdi, E.; Bukovics, P.; Besson, V.C.; Pl, J.; Nyirdi, J.; Lckl, J.; Smegi, B.;
Dczi, T.;Herndi, I. and Bki, A.: A novel PARP inhibitor L-2286 in a rat model of
impact acceleration head injury: an immunohistochemical and behavioral study. Int J
Mol Sci. 2010 Mar 26;11(4):1253-68.
29
5.1.Bevezets
A PARP egy kromoszmlis enzim, amely a sejtmagban tallhat, s fontos
szerepet jtszik a sejtek letciklusban [34, 39, 158]. Olyan folyamatok mkdsben
vesz rszt, mint pldul a DNS javts [37], s a programozott sejthallnak, az
apoptzisnak a ltrejtte [70].
A fehrje hrom f strukturlis domnbl ll [126]:
1. DNS kt domn, amely kt cink ujjat tartalmaz
2. automodifikcis domn
3. katalitikus domn
A katalitikus domn felels a NAD+ nikotinamidd s ADP-ribzz trtn
talaktsrt [75]. Normlis krlmnyek kztt a PARP a DNS-t javt
folyamatokban jtszik szerepet, ezrt mkdsnek gtlsa a rkos betegek
kemoterpis kezelsben hasznosthat [69]. PARP tlmkds esetben az ADP-ribz
nagymrtk polimerizcijhoz vezet, melynek kvetkeztben a NAD+ szintje
nagymrtkben lecskken az intracellulris ATP szinttel egytt, ami nekrotikus ton
bekvetkez sejthallhoz vezet [100]. A PARP mkdsnek ilyen jelleg aktivldsa
fontos az olyan agyi szveti krosodsok ltrejttnek folyamatban, amelyek
sszefggsben vannak a megnvekedett oxidatv stresszel, agyi iszkmival [45, 46],
Parkinson-krral, amit 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hoznak ltre [34],
valamint gerincveli srls esetben is [129].
A PARP kzponti szerepet jtszik a kaszpztl-fggetlen, AIF kzvettette
apoptzis ltrejttben. Az AIF egy evolcisan konzervlt mitokondrilis flavoprotein,
amely a mitokondrilis membrn depolarizcija utn szabadul fel [144]. Az
idegsejtekben az AIF-medilta apoptzis in vivo krlmnyek kztt oxidatv stressz
[43, 158] ksrletes koponyatrauma okozta agysrls s agyi iszkmia esetben jn
ltre. Az utbbi vekben fny derl arra, hogy a PARP aktivldsa szerepet jtszhat a
kaszpz-fggetlen apoptzis ltrejttben. Ezrt a PARP gtlk fontos terpis
lehetsgnek szmtanak koponyasrls okozta agyi krosods sorn ltrejv nekrzis
illetve apoptzis ltrejttnek cskkentsben [128]. A PARP gtlk neuroprotektv
hatsnak bizonyultak szlts, folyadk perkusszis koponyatrauma modellben,
valamint a Parkinson-kr llatksrletes modelljeiben [2, 34, 46, 73, 86].
Az olyan PARP gtlkat, mint a benzamid analg vegyletek s az isoquinolin
szrmazkok, mr korbban is alkalmaztk a PARP mkdsnek vizsglatra
koponyasrls okozta agyi krosods esetben [16, 17, 86, 128]. A klnbz
30
llatksrletes modelleken vgzett sikeres ksrletek eredmnyeinek alapjn a PARP
gtl vegyletek is fontos szerepet jtszhatnak a ksbbi klinikai kezelsek sorn.
Ksrletnk sorn egy j fejleszts quinazolinone szrmazk PARP gtl, az L-
2286 (2-[(2-piperidin-1-yletil)thio]quinazolin-4(3H)-one) (6.bra) hatst vizsgltuk
Marmarou-fle impakt accelercis modell okozta koponyasrls [53, 90] esetben a
diffz axonlis krosodsra specifikus immunhisztokmiai mdszerekkel, valamint
magatartsvizsglatokkal.
6. bra. Az L-2286 szerkezeti kplete [108]
A vizsglat els lpse az L-2286 dzis-hats grbjnek meghatrozsa volt. A
msodik lpsben az gy meghatrozott hatsos dzis hatst vizsgltuk trauma utn
kzvetlenl, illetve 30 perccel trtn kezels utn egyrszt APP s RMO-14
immunhisztokmiai vizsglattal az agytrzsben, msrszt klnbz
magatartsvizsglatokkal.
5.2. Anyagok s mdszerek
5.2.1. Ksrleti llatok
A ksrleteket sszesen 68 darab 300-350 g-os hm Wistar patknyokon
vgeztk, amelyeket a Pcsi Tudomnyegyetem, Termszettudomnyi Kar, Ksrletes
llattani s Neurobiolgiai Tanszk llathzban standard krlmnyek kztt
tartottunk, tellel s vzzel ad libitum elltva. Az llatok tartst s kezelst az
llatksrletek vgzsrl szl 243/1998. szm kormnyrendelet elrsainak
megfelelen vgeztk. A ksrleteket a Pcsi Tudomnyegyetem llatksrletekkel
foglalkoz Etikai Bizottsga (engedlyszm: BA 02/2000-21/2006) engedlyezte.
31
5.2.2. Marmarou-fle impakt accelercis modell patknyon
A mtti eljrs sorn az llatokat 5 percig elaltattuk 4% isoflurn (Abbot
Laboratories (Magyarorszg) Kft.), 70% N2O s 30% O2 keverkvel. Intubls utn a
mtt alatt a patknyokat mlyen altattuk 1,5 % isoflurn, 70% N2O s 30% O2
elegyvel altatgp segtsgvel (Inspira ASV, Harvard Apparatus USA). Az llatok
testhmrsklett minden mtt alatt llandan mrtk s folyamatosan 37 C-on
tartottuk egy specilis ftpad segtsgvel (FHC BOWDOINHAM ME 04008 USA
Temperature Control). Az artris oxign szaturcit az egyik hts vgtagon
elhelyezett pulzus-oximter (NONIN 8600 V) segtsgvel folyamatosan ellenriztk
egszen az llatok bredsig a mttek utn. Intubls utn az llatokat sztereotaxis
kszlkben rgztettk, majd a fejtet brn ejtett hosszanti bemetszssel feltrtuk a
koponya Lambda s Bregma varratok kztti rszt. A koponya felszn alapos
letiszttsa utn a Lambda s Bregma kraniometris pontok kztti tr kzepre, a
kzpvonalba egy rozsdamentes fmkorongot (10mm tmrj s 3mm vastagsg)
rgztettnk, amivel kivdhet egy esetleges koponyatrs. A slyos koponyasrls
ltrehozsa cljbl kt mter magassgbl 450g slyt ejtettnk az llat
koponyacsontjhoz rgztett fmkorongra. Trauma utn a korongot eltvoltottuk a
koponya felsznrl, majd a mtt utn az llatok a spontn lgzs visszatrsig
megfigyels alatt lltak, s ha 20 mp-ig nem trt vissza a spontn lgzs, akkor azonnal
vissza lettek helyezve az altatgpre, ahol 100% O2-t kaptak a lgzs
normalizldsig. A mtt vgn az llatok fejbrt sszevarrtuk, s egyesvel
visszahelyeztk a sajt ketreckbe. Az l-mttt llatokon ugyan ezt a mtti eljrst
alkalmaztuk, de traumban nem rszesltek.
5.3. Immunisztokmia
I.c.v. L-2286 dzis-hats grbjnek megllaptsa APP immunhisztokmiai
vizsglattal
Harminc perccel a trauma utn folyamatos altats alatt dzisonknt 5-5 llatot
10, 50 illetve 100 g/patkny 5 l fiziolgis soldatban feloldott, i.c.v. adott L-2286-al
kezeltnk a kvetkez koordintk alapjn a Bregmt 0:0 koordincis pontnak
tekintve: AP:-1,0; L: 1,5; V:-3,5;. A vehikulum kezelt csoport (n=5) ugyanekkora
mennyisg fiziolgis soldatot kapott a hatanyaggal kezelt csoportokkal megegyez
mdon. Trauma utn 2 rval ezeket az llatokat a 4.2.5. Immunhisztokmia-rszben
32
ismertetett eljrsnak vetettk al azzal a klnbsggel, hogy csak az APP-
immunopozitv axonok denzitst hatroztuk meg a CSpT agytrzsi szakaszban.
Terpis ablak meghatrozsa i.c.v. 100 g/patkny L-2286 esetben
A vizsglat kvetkez rszben az llatok egy rszt kzvetlenl (n=6), a msik
rszt 30 perccel a trauma utn (n=6) az elbb ismertetett mdon i.c.v. 100 g/patkny
L-2286-tal kezeltnk, melyet a jobb oldali agykamrba juttattunk (oldszer: 5l
fiziolgis soldat). A kt kezelsi idpontnak megfelelen a 2 vehikulum kezelt
csoportot (n=6;6) ezzel megegyez mdon 5l/patkny fiziolgis soldattal kezeltk.
Az immunhisztokmiai vizsglathoz a trauma utn 2 rval ezeket az llatokat is a
4.2.5. Immunhisztokmia-rszben ismertetett eljrsnak vetettk al.
A szvettani metszetek elemzse Image-Pro Plus v 5.0.1. segtsgvel
Az APP immunopozitv axonokat fnymikroszkp (Nikon), illetve
hozzkapcsolt digitlis fnykpezgp (Spot Rt), valamint szmtgpes kpvizsgl
program segtsgvel (Image-Pro Plus v5.0.1) elemeztk. llatonknt 6 agytrzsi
szakaszrl ksztettnk digitlis kpet 10-szeres nagytsban. 180.000 m2-es terleten
mind a CSpT, mind az MLF terletn a krosodott axonokat sszeszmoltuk.
Statisztikai analzis
Az L-2286, illetve vehikulum kezelt csoport kztti krosodott axonok
denzitsbeli (tlag/mm2) klnbsgt mindkt vizsglati idpontban Student-fle t-
prbval hasonltottuk ssze. Szignifiknsnak tekintettk a klnbsget, ha a p rtk
kisebb volt, mint 0,05.
5.4. Magatartsvizsglatok
Beam-balance teszt
A mtt eltt 1 nappal minden egyes ksrleti llatot addig edzettk, amg
kpesek lettek az egyenslyukat megtartani 60 mp-ig egy 1,5cm szlessg fbl
kszlt gerendn, amit 60cm magassgban helyeztnk el egy szivacsprna felett.
Minden ksrleti csoportban lv llatot mtt utn 1 rval s a mttet kveten 1-7
napig naponta egyszer teszteltk, majd az egyes csoportok napi eredmnyeit rtkeltk.
A kvetkez besorolsi rendszer alapjn rtkeltk az egyes llatok
teljestmnyt [33]:
33
1. egyenslyi helyzetet vesz fel a gerendn
2. megfogja a gerenda oldalt s/vagy egyenetlen mozgsokat tesz
3. tkarolja a gerendt vagy csszkl rajta leess nlkl
4. megksrli az egyenslyi helyzet felvtelt, de ekzben leesik
5. fgg a gerendn, majd leesik
6. egyltaln nem ksrli meg a fentmaradst a gerendn
Open-field teszt
Az open-field tesztet a trauma utni spontn lokomotoros aktivits vizsglatra
hasznltuk. Az eszkz egy 70x70cm alapterlet s 50cm magassg a lda, amelynek
az alja 16 egyenl mret ngyzetre van osztva. A centrlis zna a doboz kzepn lv
2x2 ngyzet, a perifris zna a kls maradk 3x4 ngyzet. A vizsglat napjn fl
rval a tesztels eltt az llatokat a vizsglszobba vittk. Ezutn minden egyes
llatot 5 perces idtartamra az open-field kzepre helyeztk s videokamera
segtsgvel rgztettk az egyes llatok tevkenysgt. A crossingok (min. 3 lb egy
ngyzetben) s gaskodsok szmt rtkeltk az 5 perces vizsglati idtartam alatt.
Emelt keresztpall teszt
Az emelt keresztpall teszt a szorongs vizsglatra alkalmas. Az eszkz 1m
magassgban helyezkedik el. Ngy, kzpen egymsba nyl egyenl mret karbl ll
(45 cm hossz s 10 cm szles 1-1 kar), amelybl 2 kar 3 oldala teljesen nyitott (nyitott
kar), viszont a msik 2 kar 3 oldala 30cm magas fallal van krlvve (zrt kar). A
vizsglat napjn fl rval a tesztels eltt az llatokat a vizsglszobba vittk. Ezutn
minden egyes llatot 5 perces idtartamra a berendezs kzepre helyeztnk s
videokamera segtsgvel rgztettk az egyes llatok tevkenysgt. A felvtelek
alapjn a kvetkez paramtereket vizsgltuk az egyes csoportokban: fejbedugsok
(head dip) szma a nyitott karba, a mells kt lbbal val belpsek szma a nyitott
karba, valamint a nyitott illetve zrt karban tlttt idtartam.
Statisztikai analizis
A magatartsvizsglatok sorn az egyes csoportokban szerepl llatok adatait
sszestettk. A beam-balance teszt eredmnyeit nem-parametrikus Dunn-fle poszt
teszttel kiegsztett egyutas ANOVA teszttel rtkeltk. Az open-field s az emelt
34
keresztpall tesztek adatait Dunnett-fle poszt teszttel kiegsztett egyutas ANOVA-
teszttel rtkeltk. Minden esetben a klnbz csoportok kztti eredmnyek
sszehasonltsakor *p
35
8.bra APP-IR axonok a CSpT terlet 2 rval a koponyasrls utn vehikulum (A)
illetve i.c.v. 100 g/patkny L-2286-al trtn kezels esetben (B).
A szvettani vizsglatok msodik rszben az els vizsglat sorn hatsosnak
bizonyult dzist vizsgltuk a trauma utn kt klnbz idpontban trtn kezels utn
immr nem csak APP, hanem RMO-14 immunhisztokmiai analzissel is.
Az APP immunhisztokmiai analzis fnymikroszkppal trtn elemzse sorn
megllaptottuk, hogy mind a trauma utn kzvetlenl, mind a 30 perccel trtn i.c.v.
100 g/patkny L-2286-al trtn kezels a vehikulummal kezelt llatok eredmnyeihez
kpest szignifiknsan cskkentette a krosodott axonok denzitst (krosodott axonok
szma/mm2) mind a CSpT-ben, mind az MLF-ben. A kt kezelsi idpont kztt
statisztikai klnbsg nem volt kimutathat (9. s 11. bra).
Az RMO-14 immunopozitv axonok esetben az elbbiekhez hasonlan mindkt
idpontban trtn kezels hatsosnak bizonyult, vagyis mind az azonnali, mind a
trauma utn 30 perccel trtn kezels szignifiknsan cskkentette az RMO-14
immunopozitv axonok szmt mindkt vizsglt agyterleten. Megjegyzend viszont,
hogy ellenttben az APP immunhisztokmiai vizsglattal, ebben az esetben a kt
kezelsi idpont kztt szignifikns klnbsg volt kimutathat, miszerint a slyos
trauma utn kzvetlenl beadott 100 g/patkny L-2286 nagyobb mrtkben kpes
36
cskkenteni az RMO-14 immunopozitv axonok szmt, ami mind a CSpT, mind az
MLF terletn egyarnt megfigyelhet volt (10. s 11. bra).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
vehikulum L-2286 azonnali
kezels
L-2286 30 min kezels
AP
P im
mu
nre
akt
v ax
onok
tl
ag d
enz
tsa
CSpT
MLF
** ** ** **
9. bra APP immunoreaktv axonok denzitsa a CSpT s MLF terltn. Az adatok
tlag/mm2 SEM-ben kifejezve (** p
37
vehikulum L-2286 azonnali
kezels
P rtk a
vehikulumhoz
kpest
L-2286 30
percel a
trauma utn
p rtk a
vehikulumhoz
APP immunopozitiv
axonok
CSpT 345,6141,56 72,508,54 p
38
beam-balance beli teljestmnyhez kpest- az els vizsglati idpont teljestmnyt
leszmtva a teljes vizsglat alatt szignifiknsan jobban tejestettek.
A kt kezelsi mdot sszehasonltva megllapthatjuk, hogy a beam-balance
tesztben ugyan mindkett javtja a krosodott motoros funkcikat, de a trauma utn 30
perccel trtn i.c.v. 100 g/patkny L2286-al trtn kezels hatsosabbnak tnik,
mint a trauma utn azonnal trtn kezels ( 12. s 13. bra).
0
1
2
3
4
5
6
7
1 ra 1 nap 2 nap 3 nap 4 nap 5 nap 6 nap 7napId
rt
k
l-mttt
vehikulum
0 min
30 min
*
** * **
***
****
12.bra Az i.c.v. 100 g/patkny L-2286 hatsa a beam-balance tesztben. Az adatok
beam-balance rtek SEM-ben kifejezve (*p
39
l-mttt vehikulum p rtk az l-
mttthz kpest
L-2286
azonnali kezels
p rtk a
vehikulumhoz
kpest
L-2286 30 perccel
a trauma utn
p rtk a
vehikulumhoz
kpest
Beam-balance
1 ra (rtk) 1 6 p
40
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Dara
bszm
/5 p
erc
l-mttt
vehikulum
0 min
30 min
*
14.bra L-2286 hatsa a mosakodsok szmra az open-field tesztben. Az adatok
darabszm/5 perc SEM-ben kifejezve (*p
41
0
2
4
6
8
10
12
Dara
bszm
/5perc
l-mttt
vehikulum
0 min
30 min
**
15.bra Az i.c.v. 100g/patkny L-2286 hatsa a fejbettel nyitott karba paramterre.
Az adatok darabszm/5 perc SEM-ben kifejezve (*p
42
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Id (m
p)
l-mttt
vehikulum
0 min
30 min
****
17.bra Az i.c.v. 100g/patkny L-2286 hatsa a nyitott karban tlttt idre. Az adatok
mp SEM-ben kifejezve (*p
43
kvetkeztben krosodott motoros teljestmnyt (beam-balance teszt), s
nagymrtkben cskkenteni a trauma utn kialakul szorongs szintjt (emelt
keresztpall teszt), vagyis javtja a funkcionlis kimenetelt.
E vizsglatok nem nyjtottak arra vlaszt, hogy a PARP inhibitor pozitv hatst
kizrlag a DAI gtlsa rvn okozza, vagy esetleg szerepet jtszhat a Marmarou-fle
koponyatrauma modellben igazolt diffz neurlis krosods kivdse is.
44
6. TRANZIENS FOKLIS AGYI ISZKMIA OKOZTA STT
IDEGSEJTEK SORSA NEM-NEKROTIKUS ES NEM EXCITOTOXIKUS
SZVETI KRNYEZETBEN: NEUROBIOLGIAI KVETKEZTETSEK
A fejezet alapjul szolgl publikci:
Kvesdi E., Pl J., Gallyas F.: The fate of dark neurons produced by transient focal
cerebral ischemia in a non-necrotic and non-excitotoxic environment: neurobiological
aspects. Brain Res. 2007 May 25;1147:272-83.
45
6.1. Bevezets
Tbb mint egy vszzada Flesh [52] mutatott r arra, hogy klnbz
neurolgiai betegsgek kvetkeztben meghaltak agyban drmai mrtkben (>50%)
zsugorodott s hiperkromatikus idegsejtek tallhatk, klnfle lokalizciban s
klnfle arnyban. Ezen - tradicionlisan stt-nek nevezett - idegsejtek
patogenezise vitatott trgy a neuropatolgiban [4], amely ezeket ngy morfolgiai
tpusba sorolja [67]: Huntington tpusuak (Huntington-krban), artefakt tpusuak (post
mortem kpzdnek klnbz mechanikai hatsokra), reverzibilis tpusuak
(hipoglikmia, epilepszia vagy iszkmia korai stdiumban), valamint irreverzibilis
tpusak (hipoglikmia, epilepszia vagy iszkmia ksi stdiumban tallhatk meg).
Az utbbi nhny vben egyes kutatk j eredmnyeket mutattak be
koponyatrauma, elektromos sokk, vagy hipoglikmia hatsra - viszonylag p szveti
krnyezetben kpzd - stt idegsejtek kpzdsi mechanizmusra, regenercis
kpessgre illetve pusztulsnak mdjra vonatkozan [35, 56, 57, 160]. Ezekbl arra
lehet kvetkeztetni, hogy a stt idegsejteknek egyetlen sejtbiolgiai tpusa van, a
fenti ngy morfolgiai tpust a kros krnyezet erszakolja rjuk [60].
Jelen ksrlet sorn az arteria cerebri media - intraluminrisan bevezetett
vkony filamentel val [82]egy-rs elzrsnak hatsra p szveti krnyezetben -
kpzd stt idegsejtek morfolgiai vltozsait kvettk nyomon a tllsi id
fggvnyben, abbl a clbl, hogy iszkmia esetben is igazak-e a fenti hrom esetben
talltakbl levont neurobiolgiai kvetkeztetsek.
6.2. Anyagok s mdszerek
6.2.1. Ksrleti llatok
A ksrleteket 200-220 g-os hm Wistar patknyokon vgeztk, amelyeket a
Pcsi Idegsebszeti Klinika kutatlaboratriumnak llathzban standard krlmnyek
kztt tartottuk, tellel s vzzel ad libitum elltva. Az llatok tartst s kezelst az
llatksrletek vgzsrl szl 243/1998. szm kormnyrendelet elrsainak
megfelelen vgeztk.
6.2.2. Patkny tranziens foklis agyi iszkmia modell
A mttek alatt az llatokat altatgp segtsgvel (SurgiVet respirator,
Waukesha, WI, USA) llegeztettk 2,5% isoflurane, 30% oxign s 67,5% dinitrogn-
oxid keverkvel. 24 patkny esetben a jobb oldali arteria cerebri media-t a Koizumi
s mtsai. ltal lert mtti eljrs szerint [82]1 rra lezrtuk. A mtt sorn a nyakon a
46
jobb oldali arteria carotis terlett feltrtuk, majd az arteria carotis f s
pterigopalatinus gt elktttk. A arteria carotis kls gn keresztl egy lekerektett
vg 4-0-s manyag sebszeti fonalat vezettnk fel az arteria cerebri media-hoz, majd
1 rn keresztl ott tartottuk. Vgl a fonalat eltvoltotuk s a keringst
helyrelltottuk.
Kzvetlenl ezutn 3 darab patknyt szven keresztl perfundltunk 500 ml
glutraldehides fixlval. A tbbi llat esetben klnbz tllsi idket alkalmaztunk,
ezen idpontokban a perfzi eltt az llatokat intraperitonilisan 25 mg/ml thiopental
s 5 mg/ml diazepam 1:1 arny keverkvel 2 ml-t beadva testsly-kilogrammonknt
tlaltattuk. Glutraldehides fixls esetben a tllsi idk a kvetkezk voltak: 1 ra, 4
ra, 1 nap, 2 nap s 1 ht (vizsglati idpontonknt 3 darab llat), mg a formaldehides
fixls esetben: 1 ra, 1 nap s 2 nap (vizsglati idpontonknt 2 darab llat).
Tovbbi 9 llat a fent ismertetett mtti eljrson keresztl esett t (l-mttt,
tovbbiakban kontroll llatok), de ezeknl a fonalat kzvetlenl a behelyezs utn
eltvoltottuk. Ezen kontroll patknyok kzl hrmat kzvetlenl a mtt utn, majd a
maradk 3-3 patknyt 1 rval illetve 24 ra elteltvel szven keresztl perfundltuk.
6.2.3. Szvettani feldolgozs
A szven keresztli perfzi utn 1 nappal az agyakat eltvoltottuk a
koponybl [29]. A glutraldehiddel fixlt agyak kzps 2/3-rszbl 150 m
vastagsg metszeteket ksztettnk frontlis skban metszve vibratom segtsgvel.
Minden tdik metszetet egy specilis ezstzsi eljrssal festettnk meg, amely
specifikus a stt idegsejtekre [59] s reproduklhat eredmnyt kpes nyjtani [103].
A mdszer alapjn a metszeteket felszll alkohol-sorban (1-propanol) vztelentettk,
majd 16 h-n t 56 C fokon 0,8 % knsavat s 2 % vizet tartalmaz l-propanol oldatban
inkubltuk (szterifikci). Ezutn a metszeteket rehidrltuk leszll alkohol sorban (1-
propanol), 10 percig 1 %-os ecetsavba helyeztk, majd egy specilis fizikai elhv
oldatba mertettk, amg vilgos barnv vltak.
Az elektronmikroszkpos szvettani feldolgozshoz 2x2 mm2-es darabokat
vgtunk ki a caudo putamen s temporlis cortex azon terleteirl, ahol az ezstzs
utn kompaktldott idegsejteket vagy axonokat tartalmaztak az elbb ismertetett
eljrssal megfestett metszetek. Ezeket a darabokat egy rn keresztl,
szobahmrskleten utfixltuk 2 %-os ozmium tetroxid s 3 %-os klium ferrocianid
47
1:1 arny keverkvel, ezutn Durcupan ACM-be gyaztuk, majd 1 m vastagsg
flvkony metszeteket ksztettnk. Ezeket a metszeteket 0,05 % toluidin kket, 0,05 %
ntrium-tetrabortot s 0,1 % szacharzt (pH 9,5) tartalmaz oldatba helyeztk 1 percre,
90 Celsius fokon. A metszetek toluidin-kkkel val festsvel azonostottuk a vizsglni
kvnt terleteket. Ezutn vkony (50 nm) vastagsg metszeteket ksztettnk,
amelyeket gridekre hztunk, majd 5%-os uranil-acetttal 2 percig s 0,5 %-os lom-
citrttal 1 percig kezeltk a metszetek kontrasztostsnak cljbl. Az ultrastrukturlis
vizsglatokat JEOL JEM 1200EX tpus transzmisszis elektronmikroszkppal
hajtottuk vgre.
A formaldehiddel fixlt agyak kzps 2/3-t paraffinba gyaztuk, majd 10 m
vastagsg szeltekre metszettk sznkamikrotm segtsgvel. Minden tizedik metszetet
0,1 %-os krezil ibolyval (oldszer: 0,01%-os ecetsav) vagy 1%-os savany fukszin
(oldszer: 0,01%-os ecetsav) oldattal festettk. Ezekbl a metszetekbl olyan
terleteket vlasztottunk ki az apoptzis vizsglathoz, amelyek az elbb emltett festsi
eljrsok sorn krosodott idegsejteket tartalmaztak. Az gy kivlasztott darabokat in
situ sejthall detektl (TUNEL) kereskedelmi forgalomban kaphat kit-el (Roche, Cat.
No. 11684817910) a termk hasznlati utastsa szerint feldolgoztuk s
fnymikroszkppal rtkeltk.
6.3. Eredmnyek
6.3.1. Fnymikroszkpos megfigyelsek
A filament eltvoltsa utn azonnal fixlt patknyokban a jobb oldali caudo
putamen nhny idegsejtjnek szma-dendrit domnje homognen ezstzdtt (18.
bra a). Ez volt megfigyelhet nhny piramis sejtnl is a jobb oldali temporlis cortex
terletn (19. bra a). Az 1, vagy tbb rt tllt llatoknl a natv, festetlen metszeten
megfigyelhet volt a krosodott (nekrotikus, excitotoxikus) terlet elhelyezkedse fzis-
kontraszt vizsglat alapjn (20. bra e). Az 1 napig tlltetett llatoknl ezen a terleten
a temporlis cortex szmos megduzzadt dendritet s asztrocita nylvnyt, tovbb
norml kinzet idegsejtet, oligodendroglit, pericitt s endothel sejtet tartalmaztak,
tovbb nhny stt idegsejtet. Egy, 4 s 24 ra tlls utn a krosodott
idegsejtek szmjban s dendritjei mentn mitokondrium mret ezst-gbk voltak
megfigyelhetk (18. bra b s 19. bra c), ami a regenerld stt idegsejtekre
jellemz tulajdonsg [35]. Egy ra tlls utn a nekrotikus terleten ill. 1 s 4 ra
tlls utn a temporlis cortex excitotoxikus terletn szmos olyan homognen-
48
ezstzdtt idegsejt figyelhet meg, amelyek szma-dendrit domnjeit nem lehetett
kln-kln megfigyelni (18. bra d; 19. bra b).
Egy ill. 2 nap tlls utn nhny stelltum illetve piramis idegsejtnl
megfigyelhet volt a szma homogn ezstzse, mg a dendritekben a
mitokondriumoknl nagyobb mret ezst-gbk lltak (18. bra c; 19. bra d), ami a
pusztul "stt" idegsejtek jellegzetes tulajdonsga [35]. Egy nap tlls utn a
krosodott terlet szli terletn (penumbra zna) ezstzd neuronlis elemek
tmr halmaza volt megfigyelhet (18. bra e). Ezeknl az llatoknl az ezstzs
utn mind pusztul, mind regenerld stt idegsejtek voltak thatk, klnsen az
excitotoxikus terlet perifrijn (19. bra e). Hat nap tlls utn csak nhny
fagocitl sejt jelenlte jelezte a mr elpusztult stt idegsejtek helyt (20. bra d).
Toluidin-kkkel homognen festdtek a frissen-kpzdtt stt idegsejtek magja,
citoplazmja s f dendritjei mind a temporlis cortex, mind a caudo putmen terletn
(21. bra a). Egy nappal ksbb a "stt" idegsejtek festdsnek intenzitsa megntt
(20. bra b). Kt napot tllt llatoknl viszont mr fragmentldsuk (20. bra c), mg
6 nap tlls utn pusztulsukat bizonyt fagocitk voltak megfigyelhetk (20. bra d).
TUNEL-pozitv sejtmagok a csak a nekrotikus terletek szli rszein voltak
megfigyelhetek, fleg az egynapos tlls utn (20. bra f).
49
18.bra: Ezstzdtt stt idegsejtek fnymikroszkpos kpei a caudo putamen
terletn az arteria cerebri media 1 rs elzrsa utn. Egy rs arteria cerebri media
elzrs utn azonnal perfundlt (a), 1 rt (b and d) vagy 1 napot (c s e) tllt llatok
szvettani kpei.
50
19.bra Ezstzdtt stt piramidlis idegsejtek a temporlis cortex terletn az
arteria cerebri media 1 rs elzrsa utn. Egy rs arteria cerebri media elzrs utn
azonnal perfundlt (a), 1 rt (b s c),1 napot (d) vagy 2 napot (e) tllt llatok
fnymikroszkpos szvettani kpei. A rmai szmok az rintett krgi rteget jelenti.
20.bra Toluidin-kkkel jellt stt piramidlis idegsejtek a temporlis kreg
terletn (ad), emelkedett fzis-kontraszt a caudo putamen nekrotikus terletein (e),
TUNEL-jellt sejtmagok a nekrotikus terlet szli terletn (f). Egy rs arteria
cerebri media elzrs utn azonnal perfundlt (a), 1 rt (b s e), 1 napot (c s f)
valamint 6 napot (d) tllt llatok fnymikroszkpos kpei.
51
6.3.2. Elektronmikroszkpos megfigyelsek
A filament eltvoltsa utn azonnal perfundlt llatoknl nhny
kompaktldott idegsejt volt megfigyelhet (20. bra a). Ezekben az ultrastrukturlis
elemek kztti tvolsgok drmai mrtkben lecskkentek, az ER ciszterni
sszeszkltek, mg a Golgi-appartus ciszterni kitgultak, a mitokondriumok mrete
vltozatlan maradt, az ER-ciszternkhoz nem-ktdtt riboszmk egymshoz-
kapcsoldott formban (poliriboszma) voltak jelen. A sejtmag szmos kismret
kromatin-gbt tartalmazott. Egy rs tlls esetben sok kompaktldott idegsejt volt
megfigyelhet. Ellenttben az azonnal perfundlt llatokkal, a riboszmk egymshoz
nem-ktdtt (sequestered) formban voltak jelen, s tbb, feltnen nagy
mitokondriumot tartalmaztak (21. bra b) a megnvekedett fzis-kontraszt terlet
kzelben.
Egyill. 4 ra tlls utn a kompaktldott idegsejtekben az ER ciszterni mr
normlis mretv alakultak vissza (22. bra a). Egy- ill. 2-napos tlls utn szmos
normlis kinzet idegsejt szmja s dendritjei mitokondrium-mret membrn-
rvnyt (whorl) tartalmazott (22. bra b,d,e). Ezek kzl nhny a szmt vagy a
dendritet ppen elhagyni ltszott (22. bra c,f). Ugyanezen a terleten nhny "stt"
idegsejt olyannyira kompaktldott, hogy a klnbz ultrastruktrs elemeket tbb
nem lehetett elklnteni egymstl s emellett sok, klnbz mret
membrnkitremkedst is tartalmazott. Mellettk glikognszemcsket tartalmaz,
duzzadt asztrocitk voltak megfigyelhetk. Kt napos tlls esetn a korbbi
membrnkitremkedsek membrnba csomagolt, kompakt s homogn
fragmentumokk alakultak t (23. bra a), amelyeket a 6-napot tllt llatokban
asztrocitk, vagy mikroglia sejtek rszben, vagy egszben fagocitltak (23. bra b,c). Az
1 napot tllt latokban a nekrotikus vagy excitotoxikus terleteken nhny "stt"
idegsejt mg kompaktabb s elektrondenzebb vlt, mg msok megduzzadtak, st -
rszben, vagy egszben sztzilldtak (24. bra ad). Ezen utbbi sejtek duzzadt
dendritekkel s glikognszemcsket nem tartalmaz asztrocitkkal voltak krlvve
(24. bra a, d). Kt ill. 6 nap elteltvel a "stt" idegsejtek a nekrotikushoz-hasonl
feldaraboldson mentek keresztl (24. bra e, f). A nekrotikus terletek szln lv,
kompaktldott-ultrastruktrj sejtekben - az 1-napot tllt llattoknl - a sejtmagok
nhny kerekded (apoptotikus) kromatin-gbt tartalmaztak (25. bra a, b). A 2 vagy
tbb napot tllt patknyokban az ilyen sejtek kzl nhny a nekrotikushoz-hasonl
fragmentldson mentek keresztl (25. bra c), mg msok membrnnal burkolt,
52
kompakt s homogn fragmentumokk estek szt, amelyeket glikogn-tartalm
asztrocita nylvnyok vettek krl. Ezeket mikroglia- vagy asztrocita-sejtek
fagocitltk (25. bra d, e).
21.bra: jonnan kpdtt kompaktlodott stt s nem kompaktldott idegsejtek
elektronmikroszkpos kpei a caudo putamen-ben azonnali perfzi (a) illetve 1 rs
tlls utn az arteria cerebri media elzrsa utn.
53
22.bra: Regenerld stt idegsejtek szmja s dendritjei a temporlis cortex-ben
(a, b s f) valamint a caudo putamen-ben (ce) 1rs (a), 1 napos (b, d s e) illetve 2
napos (c s f) tlls esetben.
23.bra A klnbz apoptotikus ton valeltvoltds p szveti krnyezetben a
caudo putamen (a s b) valamint a neocortex (c) terletn 2 napos (a) illetve 6 napos (b
and c) tlls esetben.
54
24.bra A temporlis cortex terletn lv stt idegsejtek nekrotikushoz hasonl
eltvolitdsnak klnbz fzisai excitotoxikus szveti krnyezetben. Egy rs (a), 1
napos (bd) illetve 2 napos(e s f) tlls esetben.
55
25.bra jonnan kpzdtt apoptotikus idegsejt (a s b), apoptotikus idegsejt
nekrotikushoz hasonli eltvoltdsa a caudo putamen nekrotikus szveti krnyezetben
(c), illetve apoptotikushoz hasonl eltvoltdsa a nekrotikus terlet szli rszn (d s
e). Egy napos tlls (a s b), illetve 2 napos tlls (ce) esetben.
6.4. Megbeszls, kvetkeztetsek
Az iszkmia a kerings elzrdst jelenti. Ez az ltalunk alkalmazott foklis
tranziens iszkmia esetben csak rszben valsul meg, mert a caudo putamenben a
nekrotikus terlet centrlis illetve perifris rszn, valamint a temporlis cortex
citotoxikus illetve viszonylag p szomszdos rszn ms-ms mrtkben cskken az
raml vr mennyisge [89]. Ezrt az a biokmiai kaszkd, amely az ultrastrukturlis
kompakcit elidzi, nagyban klnbzhet ezeken a terleteken. Ennek ellenre az
alapvet morfolgiai tulajdonsgok minden jonnan-kpzdtt stt" idegsejtben - gy
a caudo putamen stellatum sejtjeiben, mind a temporlis cortex piramis sejtjeiben -
megegyeztek. Megegyeztek tovbb az egyb noxk (mechanikus, elektromos,
hipoglikmis) ltal okozott stt idegsejtek morfolgiai kpvel. Mindebbl arra
kvetkeztethetnk, hogy a stt idegsejtek kpzdse egy inicil s egy vgrehajt
fzisbl ll. Az inicici mechanizmusa sokfle lehet, mg a vgrehajts mechanizmusa
fggetlen az inicil noxa milyensgtl, tovbb az rintett idegsejtek feno- ill. kemo-
56
tipustl. Ez a tny megersti a stt idegsejtek kpzdsi mechanizmusval
kapcsolatos korbbi elkpzelsnket.
A koponyatrauma s az elektromos sokk [35], tovbb a hipoglikmia [56]
hatsra kompaktldott (stt) idegsejtek egy hnyada regenerldik. Ennek
fnymikroszkpos jele az ezstzds szemcsss vlsa, majd eltnse; kezdeti
fzisnak elektronmikroszkpos jele az, hogy az ER ciszternk visszanyerik eredeti
trfogatukat, majd az egyb ultrastrukturlis elemek kztti tvolsg fokozatosan
normalizldik, kzben pusztul mitokondriumokbl membrn-rvnyek keletkeznek,
amelyek egy-kt nap mlva elhagyjk az idegsejteket. A klnflekppen elidzett
stt idegsejtek sejtbiolgiai azonossgra vonatkoz elkpzelsnket altmasztja az
a tny, hogy esetnkben ugyanezeket a regenercira-utal morfolgiai elvltozsokat
tapasztaltuk.
A koponyatrauma s az elektromos sokk tovbb a hipoglikmia hatsra
kompaktldott (stt) idegsejtek egy msik hnyada elpusztul. A nem-nekrotikus,
nem-excitotoxikus illetve nem-kontzis agyi terleteken ezen noxk hatsra
kompaktldott idegsejtek pusztul hnyada az apoptotikus sejtekhez hasonl mdon
(homogenizci, felszin-konvolci, fragmentci majd fagocitzis) tvoltdik el az
agyszvetbl, amint ezt esetnkben is tapasztaltuk. Ebbl arra kvetkeztethetnk, hogy
a stt idegsejtek nem nekrzis tjn pusztulnak el, amint ezt korbban gondoltk
azon az alapon, hogy a nekrotikus, a citotoxikus illetve a kontzis agyi terleteken a
stt idegsejtek a nekrotikus idegsejtekhez hasonl mdon (duzzads, diszintegrci,
diszperzi) tvoltdnak el az agyszvetbl. Minthogy az emltett fizikai noxk esetn
az ultrastrukturlis kompakci pillanatszer, az apoptotikus pusztulsi md is
elkpzelhetetlen. gy a stt idegsejteknek sajt pusztulsi mechanizmussal kell
rendelkeznik.
Esetnkben a nekrotikus krnyezetbe kerlt apoptotikus idegsejtek is a
nekrotikushoz hasonl mdon tvoltdtak el az agyszvetbl; apoptotikus eredetkre
csak a visszamaradt nagy kromatin-gbk utaltak. Azaz a nekrotikus krnyezet
rknyszertett egy nekrotikus eltvoltsi mechanizmust az apoptotikusan elpusztult
idegsejtekre. Ennek analgijra felttelezzk, hogy a nekrotikus krnyezet a nem-
apoptotikus s nem-nekrotikus (sajt) mechanizmussal pusztul stt idegsejtekre is
rknyszert egy nekrotikus eltvoltsi mechanizmust.
57
7. J EREDMNYEK SSZEFOGLALSA
7.1.
A kzpslyos centrlis folyadk perkusszis (CFP) modellel vgzett
ksrleteinkkel bizonytottuk, hogy a CFP utn 30 perccel i.c.v.-beadott 100 g PACAP
szignifiknsan cskkenti mind az APP, mind az RMO-14 immunopozitv axonok
denztst, azaz a PACAP-nak neuroporotektv hatsa van a TAI mindkt megjelensi
formja, az axonduzzads/ballonkpzds s az ultrastrukturlis kompakci esetben.
A PACAP neuroprotektv hatsa nem volt szignifikns a medilis hosszanti
ktegben. Magyarzatul szolglhat az, hogy ezen idegplya terletn az p axonok
tmrje s lefutsa ms, mint a kortikospinlis plya terletn, ahol a protektv hats
szignifiknsnak bizonyult.
Eredmnyeink altmasztjk a TAI impakt acceleris modellje esetben
tapasztaltakat, miszerint a PACAP hatkonyan cskkenti a maradandan krosodott
axonok szmt a koponyatrauma kvetkeztben kialakul intraaxonlis transzportzavar
s a neurofilament kompakci esetben.
7.2.
A Marmarou-fle impakt accelercis modellel vgzett ksrleteinkkel
bizonytottuk, hogy a koponyatrauma utn azonnal, vagy 30 perccel ksbb i.c.v.-
beadott 100 g L-2286 (egy jonnan kifejlesztett PARP-gtl) szignifiknsan cskkenti
mind az APP, mind az RMO-14 immunpozitiv axonok denzitst, mind a CSpT-ben
mind pedig az MLF-ben; azaz az L-2286-nak neuroporotektv hatsa van a TAI mindkt
megjelensi formja, az axonduzzads/ballonkpzds s az ultrastrukturlis kompakci
esetben.
Az APP-immunopozitv s RMO-14-immunopozitv axonok denzitsnak az
i.c.v.-beadott 100 g L-2286 hatsra val cskkense eltr mrtk volt. Ez a tny
arra utal, hogy a szban-forg axon-krosodsok heterogn jelensgek, klnbz
tengely-fonatokban klnbz valsznsggel aktivldnak.
Az i.c.v.-beadott 100g L-2286 neuroprotektv hatsa a magatartsvizsglatok
sorn is bizonytst nyert. Nevezetesen: a beam-balance teszt esetben szignifiknsan
javtotta a krosodott motoros funkcikat, valamint az emelt-kersztpall tesztben
szignifiknsan cskkentette a trauma utn gyakran fellp szorongs mrtkt.
58
7.3.
Az ltalunk alkalmazott foklis tranziens iszkmia esetben a stt idegsejtek
kpzdsre s morphologiai sajtossgaira vonatkoz j megfigyelsket tettnk.
Mindkt vizsglt agyterleten (caudo putamen centrlis illetve perifris rsze,
valamint a temporlis cortex citotoxikus illetve viszonylag p szomszdos rsze) a ms-
ms mrtkben cskken vrtramls ellenre az alapvet morfolgiai tulajdonsgok
minden jonnan kpzdtt stt" idegsejtben azonosak voltak. Megegyeztek tovbb
az egyb kros behatsok (mechanikus, elektromos, hipoglikmis noxa) ltal okozott
stt idegsejtek morfolgiai kpvel.
Mindebbl arra kvetkeztethetnk, hogy a stt idegsejtek kpzdse egy
inicil s egy vgrehajt fzisbl ll. Az inicici mechanizmusa sokfle lehet, mg a
vgrehajts mechanizmusa fggetlen az inicil noxa milyensgtl, tovbb az rintett
idegsejtek feno- ill. kemo-tipustl. Ez a tny megersti a stt idegsejtek kpzdsi
mechanizmusval kapcsolatos korbbi elkpzelsnket.
59
8. AZ RTEKEZS ALAPJT KPZ PUBLIKCIK
1. Kvesdi, E.; Tams, A.; Regldi, D.; Farkas, O.; Pl, J.; Bukovics, P.; Dczi, T.;
Bki, A. Posttraumatic administration of pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide in central fluid percussion injury in rats. Neurotox. Res.
2008,Apr;13(2):71-8 If.: 2,828
2. Kvesdi, E.; Bukovics, P.; Besson, V.C.; Pl, J.; Nyirdi, J.; Lckl, J.; Smegi, B.;
Dczi, T.;Herndi, I. and Bki, A. A Novel PARP Inhibitor L-2286 in a Rat Model of
Impact Acceleration Head Injury: An Immunohistochemical and Behavioral Study. Int J
Mol Sci. 2010 Mar 26;11(4):1253-68.If.: 1,387
3. Kvesdi E., Pl J., Gallyas F. The fate of dark neurons produced by transient focal
cerebral ischemia in a non-necrotic and non-excitotoxic environment: neurobiological
aspects. Brain Res. 2007 May 25;1147:272-83. If.: 2,296
sszestett impakt faktor: 6,511
60
9. EGYB EREDETI KZLEMNYEK
1. Lckl J, Farkas O, Pl J, Kvesdi E, Czeiter E, Szellr D, Dczi T, Komol