1

1

I DALIS

BIOMOLEKULöS

1 1. BALTYMAI...........................................................................................................................................5 1.1 Baltymų sud÷tis................................................................................................................................7

1.1.1 Aminorūgščių struktūra.............................................................................................................8 1.1.2 Nestandartin÷s aminorūgštys. ................................................................................................12 1.1.3 Aminorūgščių optin÷s savyb÷s. ..............................................................................................13 1.1.4 Aminorūgščių rūgštin÷s-bazin÷s savyb÷s...............................................................................14

1.2 Pirmin÷ baltymų struktūra ..............................................................................................................15 1.2.1 Peptidinis ryšys. ......................................................................................................................15 1.2.2 Baltymų pirmin÷s struktūros nustatymas. ...............................................................................16 1.2.3 Galinių aminorūgščių nustatymas...........................................................................................18 Galin÷s aminorūgštys nustatomos cheminiu.........................................................................................18 1.2.4 Polipeptidin÷s grandin÷s fragmentacija. .................................................................................21 1.2.5 Pirmin÷s struktūros nustatymo svarba. ..................................................................................23

1.3 Antrin÷ baltymų struktūra ...............................................................................................................24 1.3.1 Peptidinio ryšio struktūra.........................................................................................................24 1.3.2 α spiral÷. .................................................................................................................................25

1.19 pav. α spiral÷s vaizdas iš viršaus .........................................................................................................26 1.3.3 α-spiral÷s stabilizacija.............................................................................................................27 1.3.4 β struktūra...............................................................................................................................27 1.3.5 Superantrin÷ struktūra. ...........................................................................................................29

1.4 Fibriliniai baltymai...........................................................................................................................32 1.4.1 α keratinai. ..............................................................................................................................32 1.4.2 β keratinai. ..............................................................................................................................33 1.4.3 Kolageno tipo spiral÷. .............................................................................................................33

1.5 Tretin÷ baltymų struktūra ...............................................................................................................38 1.5.1 Baltymo molekul÷s erdvin÷ struktūra......................................................................................38 1.5.2 Tretin÷s baltymo struktūros stabilumas. .................................................................................40 1.5.3 Baltymų domenai. ...................................................................................................................41 1.5.4 Baltymų tretin÷s struktūros klasifikacija..................................................................................42 1.5.5 Baltymų judrumas. ..................................................................................................................44 1.5.6 Baltymų molekul÷s tretin÷s struktūros susidarymas...............................................................44 1.5.7 Molekuliniai šaperonai. ...........................................................................................................47

1.6 Baltymų degradacija.......................................................................................................................49 1.6.1 Kaip yra atpažįstami baltymai, kuriuos reikia degraduoti? ......................................................50 1.6.2 Proteosomos...........................................................................................................................51 1.6.3 Lizosomos...............................................................................................................................53

1.7 Ketvirtin÷ baltymų struktūra............................................................................................................54 2 FERMENTAI..........................................................................................................................................56

2.1 Fermentų klasifikacija ir nomenklatūra ..........................................................................................57 Fermento aktyvumo vienetai .....................................................................................................................59

2.2 Fermentinis kataliz÷s esm÷ ...........................................................................................................59 2.3 Fermentinių reakcijų kinetika .........................................................................................................63

2.3.1 Fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo temperatūros. .........................................63

2

2

2.3.2 Vandenilio jonų koncentracijos įtaka fermentin÷s reakcijos greičiui .......................................63 2.3.3 Substrato koncentracijos įtaka fermentin÷s reakcijos greičiui. ...............................................64 2.3.4 Michaelio konstantos prasm÷ .................................................................................................67 2.3.5 Fermentinių reakcijų kinetin÷s konstantos..............................................................................67 2.3.6 KM ir Vmax nustatymo metodai, ................................................................................................69 2.3.7 Daugiasubstratin÷s fermentin÷s reakcijos..............................................................................70

2.4 Fermentų slopikliai (inhibitoriai)......................................................................................................70 2.5 Fermentų kofaktoriai ......................................................................................................................74

2.5.1 Nikotinamidiniai kofermentai...................................................................................................75 2.5.2 Flavininiai kofermentai ............................................................................................................77 2.5.3 Kofermentas Q........................................................................................................................79 2.5.4 Kofermentas A ........................................................................................................................79 2.5.5 Lipo rūgštis..............................................................................................................................80 2.5.6 Tiamindifosfatas (TPP) ...........................................................................................................81 2.5.7 Biotinas ...................................................................................................................................81 2.5.8 Piridoksalfosfatas (PLP) .........................................................................................................81 2.5.9 Tetrahidrofolio rūgštis (THF)...................................................................................................82 2.5.10 Vitamino B12 kofermentai ........................................................................................................86 2.5.11 Metalų jonų vaidmuo fermentų veikloje ..................................................................................89

2.6 Fermento aktyvus centras..............................................................................................................90 2.7 Bendri fermentų veikimo principai..................................................................................................91

2.7.1 Substratų suart÷jimas ir orientacija.........................................................................................91 2.7.2 Perinamojo būvio stabilizacija.................................................................................................93 2.7.3 Rūgštin÷-bazin÷ kataliz÷. ........................................................................................................94 2.7.4 Kovalentin÷ kataliz÷. ...............................................................................................................96 2.7.5 Fermento substrato kompleksas destabilizuojamas d÷l įtempimo, desolvatacijos ar elektrostatinių efektų. ............................................................................................................................97 2.7.6 Metalų jonų kataliz÷. ...............................................................................................................99

2.8 Procesai vykstantys aktyviame centre ...........................................................................................99 2.8.1 Karboksipeptidaz÷s veikimo mechanizmas............................................................................99 2.8.2 Fermento chimotripsino veikimo mechanizmas ...................................................................102

2.9 Fermentų aktyvumo reguliacija ....................................................................................................108 2.9.1 Grįžtama kovalentin÷ modifikacija. .......................................................................................108 2.9.2 Proteolizin÷ aktyvacija ..........................................................................................................110 2.9.3 Alosterin÷ reguliacija.............................................................................................................113 2.9.4 Reguliaciniai baltymai ...........................................................................................................116

2.10 Izofermentai..............................................................................................................................117 2.11 Kataliziniai antikūnai (abzimai) .................................................................................................117 2.12 Tunelinis efektas fermentin÷je kataliz÷je .................................................................................118

3 NUKLEORŪGŠTYS ............................................................................................................................120 3.1 Nukleorūgščių sud÷tis ..................................................................................................................121

3.1.1 Heterociklin÷s baz÷s ir pentoz÷ ............................................................................................121 3.1.2 Nukleozidai ...........................................................................................................................123 3.1.3 Nukleotidai ............................................................................................................................124 3.1.4 Cikliniai nukleotidai ...............................................................................................................126 3.1.5 Minorin÷s baz÷s ir minoriniai nukleotidai ..............................................................................127 3.1.6 Polinukleotidin÷s grandin÷s susidarymas.............................................................................129

3

3

3.2 DNR struktūra ..............................................................................................................................130 3.2.1 DNR pirmin÷ struktūra ..........................................................................................................130 3.2.2 Antrin÷ DNR struktūra...........................................................................................................130 3.2.3 Tretin÷ DNR struktūra...........................................................................................................135 3.2.4 Eukariotų DNR organizacija..................................................................................................137

3.3 Ribonukleorūgštys........................................................................................................................140 3.3.1 Informacin÷ RNR (iRNR) ......................................................................................................140 3.3.2 Pernašos RNR (tRNR)..........................................................................................................141 3.3.3 Ribosomin÷s RNR (rRNR)....................................................................................................143

4 ANGLIAVANDENIAI............................................................................................................................145 4.1 Monosacharidai............................................................................................................................145

4.1.1 Monosacharidų stereoizomerija............................................................................................145 4.1.2 Monosacharidų dariniai.........................................................................................................151

4.2 Disacharidai .................................................................................................................................156 4.3 Aukštesnieji oligosacharidai .........................................................................................................158 4.4 Polisacharidai...............................................................................................................................160

4.4.1 Krakmolas.............................................................................................................................160 4.4.2 Glikogenas............................................................................................................................161 4.4.3 Celiulioz÷ ..............................................................................................................................161 4.4.4 Kiti polisacharidai ..................................................................................................................162

4.5 Glikozaminoglikanai .....................................................................................................................163 4.6 Proteoglikanai ..............................................................................................................................166 4.7 Glikoproteinai. ..............................................................................................................................168 4.8 Peptidoglikanai.............................................................................................................................171 4.9 Ląstelių paviršiaus sacharidai ......................................................................................................174

5 . LIPIDAI ..............................................................................................................................................177 5.1 Riebalų rūgštys ............................................................................................................................179 5.2 Paprastieji lipidai ..........................................................................................................................181

5.2.1 Acilgliceroliai .........................................................................................................................181 5.2.2 Vaškai ...................................................................................................................................182

5.3 Sud÷tiniai lipidai ...........................................................................................................................182 5.3.1 Glicerofosfolipidai .................................................................................................................182 5.3.2 Sfingolipidai...........................................................................................................................186

5.4 Lipidų dariniai ...............................................................................................................................190 5.4.1 Steroidai................................................................................................................................190 5.4.2 Riebaluose tirpūs vitaminai ...................................................................................................192 5.4.3 Terpenai................................................................................................................................197 5.4.4 Eikozanoidai..........................................................................................................................198

5.5 Inkariniai baltymai ........................................................................................................................204 6 Biologin÷s membranos........................................................................................................................207

6.1 Bendrosios biologinių membranų savyb÷s...................................................................................208 6.2 Biologinių membranų chemin÷ sud÷tis. .......................................................................................208

6.2.1 Membraniniai lipidai ..............................................................................................................208 6.2.2 Fosfolipidų sudaromos struktūros.........................................................................................208 6.2.3 Fosfolipidinio dvisluoksnio judrumas ....................................................................................210 6.2.4 Membraniniai baltymai. .........................................................................................................212

6.3 Biologinių membranų struktūra ....................................................................................................215

4

4

6.4 Medžiagų pernešimas pro biologines membranas ......................................................................216 6.4.1 Medžiagų pernešimo pro membranas bendra charakteristika .............................................216 6.4.2 Medžiagų pernešimas kanalais ............................................................................................219 6.4.3 Kalio jonų kanalai..................................................................................................................220

6.5 Medžiagų pernešimo energetika..................................................................................................223 6.5.1 Pasyvi pernaša .....................................................................................................................223 6.5.2 Aktyvi pernaša ......................................................................................................................224 6.5.3 Nuo ATP priklausančios pernešimo sistemos ......................................................................224 6.5.4 Na+/K+ ATPaz÷ .....................................................................................................................226 6.5.5 Ca2+

pernešimas. Ca2+ ATPaz÷. ...........................................................................................228 6.5.6 Medžiagų pernešimas naudojant saul÷s šviesos energiją....................................................230

6.6 Signalo perdavimo keliai ..............................................................................................................232 6.6.1 Su G-baltymais susijungę receptoriai ...................................................................................233 6.6.2 Vieno transmembraninio segmento katalizinis receptorius ..................................................239 6.6.3 Oligomeriniai joniniai kanalai ................................................................................................240

5

5

I DALIS BIOMOLEKUL öS

1 1. BALTYMAI Baltymai yra gausiausia biologinių makromolekulių klas÷ randama visose ląstel÷se.

Baltymų įvairov÷ yra labai didel÷, nei viena makromolekulių klas÷ negali lygintis su baltymais pagal atliekamų funkcijų gausumą.

Baltymai (proteinai) didel÷s molekulin÷s mas÷s organin÷s medžiagos , sudarytos iš aminorūgščių, sujungtų peptidiniu ryšiu. Baltymo pavadinimas yra kilęs iš vokiečių kalbos žodžio eiweiss, kuris reiškia kiaušinio baltymas. Kitas naudojamas baltymo vardas proteinas yra kilęs iš graikų kalbos žodžio protos, reiškiančio - pirmas, svarbiausias. Baltymai yra vienas svarbiausių ląstel÷s komponentų ir kiekybiškai, ir kokybiškai. Pavyzdžiui, bakterijose Escherichia coli, kurių gausu žmogaus žarnyne, esama per 4000 skirtingų baltymų, kurie sudaro per 15% ląstel÷s sauso svorio. 2000 metais buvo išaiškintas žmogaus genomas, jame yra per 40000 genų, tai sudaro tiktai du kartus daugiau nei mus÷s ar kirm÷l÷s genai. Tačiau žmogaus organizmas yra žymiai sud÷tingesnis, baltymų skaičius didesnis, nes transkripcijos ir transliacijos metu vyksta įvairios modifikacijos. Baltymuose galimos įvairios potransliacin÷s modifikacijos – jie gali būti glikozilinami, fosforilinami, ubikvitilinami, metilinami, kai kuriuose baltymuose yra iškerpami oligopeptidiniai fragmentai ir likusios baltymo dalys sujungiamos. .

Baltymų, ekspresuojamų ląstel÷je arba organe tam tikru laiku ir specifin÷mis sąlygomis visuma yra vadinama proteoma. Proteomika tiria visus ląstel÷je ekspresuojamus baltymus, jų kiekį, pasiskirstymą, funkcijas ir sąveiką su kitomis molekul÷mis. Šiuo metu mokslininkų laukia didelis darbas nustatant visus žmogaus baltymus.

Baltymai ląstel÷se atlieka labai daug įvairių funkcijų. Pagrindin÷s baltymų funkcijos yra šios:

1) katalizin÷ - tai yra viena svarbiausių baltymų funkcijų. Baltymai - fermentai katalizuoja ląstel÷je vykstančias chemines reakcijas, tod÷l jos vyksta labai dideliais greičiais, švelniose sąlygose. Visiems gerai žinomi virškinimo fermentai pepsinas, tripsinas, chimotripsinas skaido baltymus, riebalus hidrolizuoja lipaz÷s, angliavandenius - amilaz÷s, maltaz÷ ir kt.

2) pernašos - baltymai organizme perneša įvairias medžiagas - nuo elektronų iki makromolekulių. Hemoglobinas išnešioja deguonį iš plaučių į audinius, žmogaus serumo albuminas perneša kraujyje riebalų rūgštis. Labai svarbi pernašos baltymų klas÷ yra membranose esantys baltymai - nešikliai ir kanalai. Šie baltymai pro ląstel÷s ar organelių membranas perneša jonus, aminorūgštis, angliavandenius, baltymus bei kitas medžiagas būtinas ląstel÷s medžiagų apykaitai.

3) struktūrin÷ – baltymai, susijungę su lipidais, sudaro biologines membranas. Pagrindinis jungiamojo audinio baltymas yra kolagenas, plaukai, nagai taip pat yra baltymai.

4) hormonin÷ - baltymai reguliuoja medžiagų apykaitą. Pvz., insulinas mažina cukraus koncentraciją kraujyje, somatotropinis hormonas reguliuoja augimą.

5) apsaugin÷ - organizme sintetinami antikūnai apsaugo jį nuo bakterijų, pašalinių baltymų. Virusin÷ infekcija žmogaus organizme iššaukia baltymo interferono sintezę, kuris stabdo tolesnį virusų dauginimąsi.

6) energetin÷ - oksiduojantis baltymų aminorūgštims, išsiskyrusi energija panaudojama organizmo energetiniams poreikiams tenkinti.

7) motorin÷ - raumenys yra sudaryti iš aktino ir miozino, kurie cheminę energiją paverčia mechanine. Bakterijų baltymas flagelinas reikalingas, kad jos jud÷tų. Tubulinas,

6

6

kinezinas, dineinas ir kiti baltymai reikalingi viduląsteliniam pūslelių ir organelių jud÷jimui. Yra nustatyta, kad pernešant protonus pro ATPsintazę sukasi atiinkamos baltymo molekul÷s dalys.

8) toksinai - choleros, botulizmo, difterijos, gangrenos toksinai yra baltymai. Botulizmo toksinas turi peptidazinį aktyvumą ir inhibuoja sekretorinių pūslelių susijungimą su sinapsių membrana.

9) infekcin÷ medžiaga – baltymas prionas atsakingas už neurodegeneratyvinių ligų išsivystymą žmogaus ir gyvulių organizmuose.

10) receptorin÷ - baltymai receptoriai, išsid÷stę ant membranų paviršiaus, sąveikauja su hormonais, neuromediatoriais, šviesa ir kitomis medžiagomis ir perduoda signalą per membraną. Skonio, uosl÷s ir kiti receptoriai taip pat yra baltymai.

11) reguliatorin÷ - baltymai gali prisijungti prie nukleorūgščių, kitų baltymų ir keisti jų biologinį aktyvumą.

12) atsargin÷ maisto medžiaga - pieno kazeinas, kiaušinio, grūdų baltymai yra kaupiami ir panaudojami organizmo energetiniams ir statybiniams poreikiams.

13) egzotiniai baltymai - antifrizinis baltymas pažemina šiaur÷je plaukiojančių žuvų kraujo, kai kurių daržovių vidin÷s terp÷s užšalimo temperatūrą , baltymas monelinas yra kelis tūkstančius kartų saldesnis už cukrų, moliuskai, jūrų kriaukl÷s išskiria baltymus, kurie priklijuoja jas prie įvairių paviršių. Labai svarbias funkcijas atlieka oligopeptidai ir nedidel÷s molekulin÷s mas÷s polipeptidai - pvz., oksitocinas (9 aminorūgštys) yra hormonas, melitinas (26 aminorūgštys), antamanidas (ciklinis dekapeptidas) - toksinai, kai kurie antibiotikai gramicidinas, valinomicinas, didinantys membranų pralaidumą jonams, taip pat yra peptidai. Neuropeptidai - endorfinai, enkefalinai reguliuoja smegenų veiklą. Saldiklis aspartamas yra aspartilfenilalanino metilo esteris. Jis yra per 200 kartų saldesnis nei sacharoz÷ ir plačiai naudojamas maisto g÷rimų gamyboje, maisto pramon÷je. Tripeptidas glutationas labai svarbus palaikant ląstel÷je oksidacinį redukcinį potencialą. Baltymai, kuriuos sudaro tiktai aminorūgštys, vadinami paprastaisiais baltymais arba proteinais. Tačiau dažnai į baltymų sud÷tį įeina įvairios organin÷s ar neorganin÷s medžiagos. Tokie baltymai vadinami sud÷tiniais baltymais arba proteidais. Sud÷tiniai baltymai sudaro makromolekulines struktūras, dalyvauja įvairiose reakcijose. Sud÷tinių baltymų pavyzdžiai pateikti 1.1 lentel÷je.

1.1 lentel÷. Sud÷tiniai baltymai

Pavadinimas Nebaltymin÷ dalis Pavyzdys Nukleoproteinai Nukleorūgštys Ribosomos, chromosomos,

virusai Glikoproteinai Angliavandeniai Imunoglobulinai,

glikoforinas Lipoproteinai Lipidai Kraujo lipoproteinai,

membranos Fosfoproteinai Fosforo rūgštis Pieno kazeinas Metaloproteinai Geležis

Cinkas Kalcis Selenas Varis

Fe-S baltymai Karboksipeptidaz÷ Kalmodulinas Glutationo peroksidaz÷ Citochromo c oksidaz÷

7

7

Hemoproteinai Hemas Hemoglobinas, citochromai

Flavoproteinai Flavinas Sukcinato dehidrogenaz÷ Baltymo molekul÷s dydis, molekulin÷ mas÷ yra labai įvairi. Citochrome c yra 104

aminorūgštys, kurios yra vienoje polipeptidin÷je grandin÷je. Fermentas glutamino sintetaz÷ sudarytas iš dvylikos atskirų baltyminių subvienetų ir jo molekulin÷ mas÷ siekia 620 kDa. Viena polipeptidin÷ grandin÷ žinduolių raumenų baltymo titino turi beveik 27000 aminorūgščių (1.2 lentel÷).

Molekulin ÷ mas÷ (Mm) išreiškiama daltonais (Da). Vienas daltonas yra lygus 1/12 anglies atomo mas÷s. Molekulinis svoris (santykinis molekulinis svoris) yra konkrečios molekul÷s mas÷s ir 1/12 anglies atomo mas÷s santykis ir yra neturintis dimensijos dydis. Yra nekorektiška molekulinį svorį išreikšti daltonais.

Kai kurie baltymai sudaryti iš vienos polipeptidin÷s grandin÷s, kiti iš - kelių, jie vadinami oligomeriniais. Individualios grandin÷s gali būti vienodos arba skirtingos. Polipeptidin÷s grandin÷s dažniausiai sujungtos silpnais nekovalentiniais ryšiais. Hemoglobinas sudarytas iš 4 polipeptidų, vadinamų subvienetais. Insulino, chimotripsino polipeptidin÷s grandin÷s yra sujungtos kovalentiniu ryšiu.

Žinodami baltymo molekulinę masę, apytikriai galime apskaičiuoti aminorūgščių skaičių, padaliję masę iš 110. Nors aminorūgščių molekulin÷s mas÷s vidurkis yra 138, tačiau baltymuose vyrauja nedidel÷s rūgštys. Be to susidarant peptidiniam ryšiui yra pašalinamas vanduo.

1.2 lentel÷. Baltymų molekulin÷s mas÷s Molekulin÷

mas÷ (Da) Aminorūgščių liekanų skaičius

Polipeptidinių grandinių skaičius

Citochromas c (žmogaus) 13000 104 1 Ribonukleaz÷ (jaučio kasa) 13700 124 1 Lizocimas (kiaušinio ) 13930 129 1 Mioglobinas (arklio širdis) 16890 153 1 Chimotripsinas (jaučio kasa)

21600 241 3

Chimotripsinogenas (jaučio kasa)

22000 245 1

Serumo albuminas (žmogaus)

68500 609 1

Heksokinaz÷ (miel÷s) 102000 972 2 Glutamino sintetaz÷ (E.coli) 619000 5628 12 Titinas (žmogaus) 2993000 26926 1

1.1 Baltymų sud÷tis

Hidrolizuojant baltymus rūgštimis (6N HCl, 110 0C, 24 val.), šarmais, proteolitiniams fermentais (peptidaz÷mis) baltymai suskyla iki aminorūgščių. Baltymai sintezuojami iš 20 aminorūgščių, tačiau po polipeptidin÷s grandin÷s susidarymo, jos gali būti modifikuojamos, tod÷l hidrolizavus baltymus gauname per 250 skirtingų aminorūgščių. Hidrolizuojant baltymus rūgštimis, suskyla triptofanas, tod÷l jis nustatomas kitais metodais. Aminorūgščių glutamino ir asparagino γ ir β amidiniai ryšiai yra labilūs rūgštin÷je terp÷je. Azotas išsiskiria amoniako pavidalu. Nustačius NH3 kiekį galima įvertinti tiktai bendrą asparagino ir glutamino kiekį.

8

8

1.1.1 Aminorūgščių struktūra

Aminorūgštimis vadinamos organin÷s medžiagos, turinčios karboksi- (−COOH) ir amino- (−NH2) grupes, kurių bendra formul÷ yra ši:

C H

COOH

R

H2N α

Aminorūgštys, kurios įeina į baltymų sud÷tį yra α-aminorūgštys: karboksi- ir

aminogrup÷s yra prijungtos prie α anglies atomo. Aminorūgštys viena nuo kitos skiriasi savo radikalu R. 20 aminorūgščių yra vadinamos standartin÷mis aminorūgštimis, iš jų yra sintezuojami baltymai, jos skiriasi nuo nestandartinių aminorūgščių, kurios susidaro modifikuojant į baltymo molekulę įjungtas aminorūgštis. Sisteminis aminorūgščių pavadinimas sudaromas pagal IUPAC ir IUMBM reikalavimus. Jeigu R grup÷ yra –CH3 tada sisteminis aminorūgšties pavadinimas yra 2-aminopropano rūgštis, trivialus jos vardas, kuris naudojamas biochemijoje yra alaninas. Tradiciškai aminorūgštys žymimos trijų raidžių santrumpa - valinas (Val), leucinas (Leu). Kadangi šiuo metu žinoma daugelio baltymų aminorūgščių seka, pereinama prie vienos raid÷s simbolio - valinas (V), leucinas (L), taip yra patogiau išreikšti pirminę baltymų struktūrą.

NH2 C

H

H

COOH NH2 C

CH3

H

COOH NH2 C

CH

COOH

H

CH3CH3

NH2 C

CH2

H

COOH

CHCH3 CH3

NH2 C

CH

H

COOH

CH3

CH2

CH3

NH2 C

CH2

H

COOH

NH2 C

CH2

H

COOH

N

NH2 C

CH2

H

COOH

CH2

S

CH3

CH2

CNH

CH2 CH2

COOH

H

Šonin÷s grandin÷s nepolin÷s

Glicinas Alaninas Valinas Gly (G) Ala (A) Val (V)

Leucinas Izoleucinas Fenilalaninas Leu (L) Ile (I) Phe (F)

Triptofanas Metioninas Prolinas Trp (W) Met (M) Pro (P)

9

9

NH2 C

C

H

COOH

H

H OH

NH2 C

C

H

COOH

CH3

H OH

NH2 C

CH2

COOH

H

OH

NH2 C

CH2

COOH

H

SH

NH2 C

CH2

COOH

H

CO NH2

NH2 C

CH2

COOH

H

CH2

CO NH2

Šonin÷s grandin÷s polin÷s, neturi krūvio

Serinas Treoninas TirozinasSer (S) Thr (T) Tyr (Y)

Glutaminas Asparaginas Cisteinas Gln (Q) Asn (N) Cys (C)

10

10

NH2 C

CH2

COOH

H

COO

NH2 C

CH2

COOH

H

CH2

COO

Šonin÷s grandin÷s neigiamo krūvio

Glutamo rūgštis Asparto rūgštis Glu (E) Asp (D)

-

-

NH2 C

CH2

COOH

H

CH2

CH2

CH2

NH3

NH2 C

CH2

COOH

H

CH2

CH2

NH

C NH2

NH2

NH2 C

CH2

COOH

H

NHNH

Šonin÷s grandin÷s bazin÷s, teigiamo krūvio

+

+

+

Lizinas Argininas Histidinas Lys (K) Arg (R) His (H)

1.1 pav. Aminorūgščių struktūra ir pavadinimai.

Kaip matome, aminorūgštys skiriasi radikalais, kurie suteikia aminorūgščiai atitinkamas chemines savybes, skirtingą krūvį, dydį, tirpumą vandenyje. Aminorūgštis galime suskirstyti pagal įvairius kriterijus. Pagal aminorūgšties hidrofobiškumą jos skirstomos į hidrofobines ir hidrofilines , hidrofilin÷s geriau tirpsta vandenyje, hidrofobin÷s – organiniame tirpiklyje. Kiekybiškai tai galima įvertinti nustačius hidrofatiškumo indeksą. Jis įvertina netiktai aminorūgšties pasiskirstymą organin÷je ir neorganin÷je terp÷je, bet ir aminorūgšties radikalo dydį, jo ervinę struktūrą bei kitus parametrus. Bendros aminorūgščių savyb÷s pateiktos 1.3 lentel÷je. Labai hidrofobiškos aminorūgštys yra Leu, Ile, Val. Hidrofilinių aminorūgščių grupei priklauso Glu, Asp, Lys, Arg, Ser ir kitos.

Aminorūgštys, turinčios dvi aminogrupes, vadinamos diaminoaminorūgštimis (Lys, Arg), o tos, kurių sud÷tyje dvi karboksigrup÷s, - dikarboksiaminorūgštimis (Glu, Asp). Asparto ir glutamo rūgščių karboksigrup÷ fiziologin÷se sąlygose yra disocijavusi ir molekul÷ tampa anijonu, tod÷l jos vadinamos atitinkamai aspartatu ir glutamatu. Lizino ir arginino pakaite esančios aminogrup÷s, esant neutraliam terp÷s pH, yra įkrautos teigiamai ( -NH3+), šios aminorūgštys yra hidrofilin÷s, o baltymai, tokie kaip histonai, protaminai, kurių sud÷tyje daug Lys ar Arg turi teigiamą krūvį.

Dviejose aminorūgštyse (Cys, Met) yra sieros atomas. Cisteino sud÷tyje yra merkaptogrup÷ –SH. Ši grup÷ yra chemiškai aktyvi, ji dažnai randama fermentų aktyviame centre. Dvi cisteino molekul÷s gali tarpusavyje susijungti kovalentiniu disulfidiniu ryšiu (S-S tilteliu), ir

11

11

sudaryti cistiną (1.7 pav.). Šis kovalentinis ryšys stabilizuoja baltymo tretinę struktūrą, sujungia kelias polipeptidines grandines pirmin÷je struktūroje.

1.3 lentel÷. Aminorūgščių savyb÷s Aminorūgštis mol.

mas÷ Da

pK1 (-COOH)

pK2 (-NH3

+) pKR

(R grup÷s) pI Hidrofa-

tiškumo indeksas *

Paplitimas baltymuose (%)

Nepolin÷s, R grup÷s alifatin÷s

Glicinas 75 2,34 9,6 5,97 -0,4 7,2 Alaninas 89 2,34 9,69 6,01 1,8 7,8 Valinas 117 2,32 9,62 5,97 4,2 6,6 Leucinas 131 2,36 9,60 5,98 3,8 9,1 Izoleucinas 131 2,36 9,68 6,02 4,5 5,3 Metioninas 149 2,28 9,21 5,74 1,9 2,3 R grup÷s aromatin÷s

Fenilalaninas 165 1,83 9,13 5,48 2,8 3,9 Tirozinas 181 2,20 9,11 10,07 5,66 -1,3 3,2 Triptofanas 204 2,38 9,39 5,89 -0,9** 1,4 Polin÷s, R grup÷s neturi krūvio

Serinas 105 2,21 9,15 5,68 -0,8 6,8 Prolinas 115 1,99 10,96 6,48 1,6 5,2 Treoninas 119 2,11 9,62 5,87 -0,7 5,9 Cisteinas 121 1,96 10,28 8,18 5,07 2,5 1,9 Asparaginas 132 2,02 8,80 5,41 -3,5 4,3 Glutaminas 146 2,17 9,13 5,65 -3,5 4,2 Neigiamą krūvį turinčios R grup÷s

Asparto rūgštis 133 1,88 9,60 3,65 2,77 -3,5 5,3 Glutamo rūgštis

147 2,19 9,67 4,25 3,22 -3,5 6,3

Teigiamą krūvį turinčios R grup÷s

Lizinas 146 2,18 8,95 10,53 9,74 -3,9 5,9 Argininas 174 2,17 9,04 12,48 10,76 -4,5 5,1 Histidinas 155 1,82 9,17 6,00 7,59 -3,2 2,3 * hidrofatiškumo indeksas naudojamas įvertinti aminorūgšties pasiskirstymą hidrofilin÷je terp÷je (- ženklas) ir hidrofobin÷je terp÷je ( + ženklas). ** nustatant Trp hidrofatiškumo indeksą kitais metodais gaunamos didesn÷s reikšm÷s pI – izoelektrinis taškas

12

12

Į serino, treonino ir tirozino sud÷tį įeina hidroksigrup÷, jos vadinamos hidroksir ūgštimis. Hidroksigrup÷ sudarydama vandenilinius ryšius stabilizuoja baltymo tretinę struktūrą. Ji dažnai randama fermento aktyviame centre, reakcijos metu sudaro tarpiniai junginiai. Hidroksigrup÷ prijungia įvairias chemines grupes pvz. fosforilo, acilo.

Histidinas, priklausomai nuo terp÷s pH, gali protonizuotis ir būti teigiamai įkrautas arba neutralus. Histidinas dažnai aptinkamas fermento aktyviame centre, jis gali būti protonų donoras ar akceptorius, dalyvauja rūgštin÷je-bazin÷je kataliz÷je.

Hidrofobin ÷s aminorūgštys stabilizuoja baltymo erdvinę struktūrą, būdamos fermento aktyviame centre dalyvauja fermento ir substrato komplekso susidaryme.

Prolinas n÷ra tipiška aminorūgštis, į jos sud÷tį įeina imino grup÷, kuri įjungta į žiedą, polipeptidin÷s grandin÷s judrumas toje vietoje, n÷ra laisvo sukimosi tarp N-Cα. Ta polipeptidin÷ grandin÷s dalis, kuriosje yra prolinas, nesudaro α spiral÷s. 1.1.2 Nestandartin÷s aminorūgštys.

Nestandartin÷s aminorūgštys susidaro modifikavus aminorūgštis jau po baltymo biosintez÷s . Jų skaičius įvairiuose gyvūnuose, augaluose, grybuose gali siekti per 250.

Į kolageno sud÷tį įeina 4-hidroksiprolinas ir 5-hidroksilizinas, kurie susidaro oksiduojant proliną ar liziną. Šios amino rūgštys stabilizuoja kolageną. Sergant skorbutu prolinas n÷ra hidroksilinamas, kolageno molekul÷ tampa nestabili, padid÷ja kapiliarų pralaidumas. 6-N-metillizinas yra raumenų baltyme miozine. γγγγ-karboksiglutamatas randamas protrombine, kuris reikalingas kraujo kreš÷jimui, sutrikus glutamato karboksilinimui sutrinka kraujo kreš÷jimas. Fibriliniame baltyme elastine aptinkamas desmozinas, kuris yra 4 lizino molekulių junginys.

Ypatingą vietą užima selenocisteinas (cisteino molekul÷je sieros atomas pakeistas selenu). Selenocisteinas susidaro iš serino baltymų biosintez÷s metu ir įeina į keletos baltymų sud÷tį. Ypatingai svarbi yra glutationo peroksidaz÷, kuri dalyvauja nukenksminant aktyvias deguonies formas.

Svarbų vaidmenį vaidina aminorūgščių kovalentin÷ modifikacija. Aminorūgštys yra glikozilinamos, prijungiant angliavandenius ar jų darinius prie hidroksiaminorūgščių arba prie asparagino. Fosforilinant modifikuojama aminorūgščių serino, tirozino ar treonino hidroksigrup÷.

Kai kurios aminorūgštys ar jų dariniai yra biologiškai aktyvios medžiagos. Jos neįeina į baltymų sud÷tį, tačiau labai svarbios metabolizmui. Aminorūgščių dekarboksilinimo produktai γγγγ-aminosviesto rūgštis (GABA ), dopaminas yra neuromediatoriai, juos išskiria nervin÷s ląstel÷s. Homocisteinas - aminorūgščių metabolizmo tarpinis produktas, tiroksinas - hormonas, Žinduoliai sintezuoja histaminą, kuris kontroliuoja kraujagyslių susitraukimą, bei HCl išsiskyrimą skrandyje. Citrulinas, ornitinas yra karbamido ciklo tarpiniai produktai, S-adenozilmetioninas (SAM) - metilo grup÷s donoras įvairių medžiagų metilinimo reakcijose.

13

13

NH

COOH

OH

4-hidroksiprolinas

H2N-CH-COOH

CH2

CH

COOHHOOC

γ-karboksiglutamo rūgštis

H2N-CH-COOH

CH2

CH2

CH-OH

CH2

NH2

5-hidroksilizinas

H2N-CH2

CH2

CH2

COOH

γ-aminosviestorūgštis (GABA)

NH

N

CH2CH2 NH2

histaminas

OH

OH

CH2CH2 NH2

dopaminas

SeH CH2

CH

COO

NH3

+

-

Selenocisteinas 1.2 pav. Nestandartin÷s aminorūgštys ir aminorūgščių dariniai

1.1.3 Aminorūgščių optin÷s savyb÷s. Šviesos sugertis. Paprasti baltymai nesugeria matomos šviesos, sud÷tiniai, kurių

sud÷tyje yra chromoforin÷ grup÷ yra spalvoti. Ultravioletin÷je spektro dalyje baltymai sugeria šviesą d÷ka aromatinių aminorūgščių. Triptofanas ir tirozinas sugeria 280nm bangos ilgio šviesą. Fenilalaninas sugeria 260nm bangos ilgio šviesą, jo sugertis gerokai silpnesn÷ nei tirozino ar triptofano. Triptofanas šviesą sugeria stipriausiai (1.3 pav.) Matuojant sugertį ultravioletin÷je spektro dalyje (λ = 280nm) galima nustatyti baltymo koncentraciją. Peptidin÷ grup÷ sugeria 190-200nm bangos ilgio šviesą. Kiekviena aminorūgštis turi charakteringą magnetinio branduolinio rezonanso spektrą, ši jų savyb÷ panaudojama baltymų tretin÷s struktūros nustatymui.

. 1.3pav. Aminorūgščių sugertis ultravioletin÷je spektro dalyje

14

14

Aminorūgščių optinis aktyvumas. Visų aminorūgščių, išskyrus gliciną, α anglies atomas sujungtas su keturiais skirtingais radikalais: aminogrupe, karboksigrupe, radikalu R ir vandenilio atomu. Toks asimetrinis α-anglies atomas yra chiralinis centras. Keturi radikalai sujungti su α-anglies atomu, gali įgauti dvi skirtingas erdvines konfigūracijas, kurios yra veidrodinis viena kitos atspindys. Šios dvi stereoizomerų formos vadinamos enantiomerais. Visos molekul÷s, kurios turi chiralinius atomus yra optiškai aktyvios, tai yra suka poliarizacijos plokštumą. Pagal savo absoliutinę geometrinę konfigūraciją, aminorūgštys gali būti L- arba D- eil÷s ( lyginama su glicerolio aldehidu ).

C H

COO

R

H3N+

-

C NH3

COO

R

H+

-

L-aminorūgštis D-aminorūgštis

H

CHO

CH2OH

OH C

L-glicerolio aldehidas D-glicerolio aldehidas

OH

CHO

CH2OH

H C

1.4 pav. Aminorūgščių ir glicerolio aldehido D ir L optinių izomerų palyginimas Baltymų sud÷tyje randamos tiktai L-aminorūgštys. D-aminorūgštys įeina į antibiotikų (

pvz. gramicidino, valinomicino, aktinomicino D ) sud÷tį, yra bakterijų sienel÷s komponentai. Trys aminorūgštys – izoleucinas, treoninas ir 4-hidroksiprolinas turi po du chiralinius

centrus, tod÷l gali tur÷ti po keturis diastereomerus. Kita sistema, nusakanti radikalų išsid÷stymą apie chiralinį centrą ir šiuo metu plačiau naudojama organin÷je chemijoje, yra R,S sistema. Ji tiksliau nusako molekulių su keliais chiraliniais centrais konfigūraciją. 1.1.4 Aminorūgščių rūgštin÷s-bazin÷s savyb÷s.

Kiekviena aminorūgštis turi dvi funkcines grupes (-COOH, -NH2), kurios gali disocijuoti ar prijungti protonus. Aminorūgščių karboksigrup÷s pK1 yra apie 2, o amino grup÷s pK2 svyruoja nuo 9 iki 11 (1.3 lentel÷). Aminorūgštys neutraliame tirpale yra dipoliai (arba cviterjonai ), jų karboksigrup÷ disocijavusi (COO- ), o amino grup÷ yra protonizuota ( NH3

+). Aminorūgšties jonizacijos laipsnis keičiasi priklausomai nuo terp÷s pH, rūgštin÷je terp÷je aminorūgštis įgauna teigiamą krūvį, o šarmin÷je terp÷je atvirkščiai - tampa neigiama. Izoelektriniame taške (pI) aminorūgšties teigiamų ir neigiamų krūvių skaičius yra lygus ir ji nejuda elektriniame lauke. Izoelektrinis taškas apskaičiuojamas žinant grupių pK. pI = 1/2(pK1 + pK2)

H3N-+

C COOH

R

H

NH2 C COO

R

H

H3N+

C COO

R

H

-

rūgštin÷ terp÷ neutrali terp÷ šarmin÷ terp÷ 1.5 pav. Aminorūgščių jonizacijos priklausomyb÷ nuo terp÷s pH.

Lizinas yra diaminorūgštis, ji turi ε−aminogrupę, kurios pKR = 10,53. Did÷jant tirpalo pH, pirmiausia deprotonizuojasi lizino karboksigrup÷, po to α-aminogrup÷ ir v÷liausiai ε-aminogrup÷. Šiuo atveju lizino izoelektrinis taškas apskaičiuojamas kaip abiejų aminogrupių pKR ir pK2 vidurkis (pI = 9,74). Rūgštinių aminorūgščių pI lygus abiejų rūgštinių grupių pK vidurkiui.

15

15

1.2 Pirmin ÷ baltymų struktūra

Baltymai sudaryti iš daugelio aminorūgščių, tod÷l baltymo molekul÷s architektūra yra labai

sud÷tinga. išskiriami ir nagrin÷jami keturi skirtingi baltymų organizacijos lygiai: a) pirmin÷ struktūra - aminorūgščių seka polipeptidin÷je grandin÷je, b) antrin÷ struktūra - polipeptidin÷ grandin÷ susisuka į spiralę arba sudaro β struktūrą, vandeniliniai ryšiai sujungia peptidin÷je grup÷je esančias C=O ir N-H grupes, c) tretin÷ struktūra – polipeptidin÷s grandin÷s išsid÷stymas erdv÷je, sąveikaujant aminorūgščių šoniniams radikalams molekul÷ sudaro kompaktišką trimatę struktūrą, d) ketvirtin÷ struktūra – baltymai gali būti sudaryti iš kelių polipeptidinių grandinių, vadinamų subvienetais, kurie susijungia silpnais nekovalentiniais ryšiais. 1.2.1 Peptidinis ryšys.

Baltymuose vienos aminorūgšties α-karboksigrup÷ susijungia su kitos rūgšties aminogrupe ir susidaro amidinis ryšys (-N-C-), kuris vadinamas peptidiniu ryšiu . Aminorūgšties (radikalas R2) aminogrup÷ reaguoja kaip nukleofilas ir pakeičia pirmos aminorūgšties (radikalas R1) hidroksigrupę, susidarant peptidiniam ryšiui. Aminogrup÷ yra geras nukleofilas, o hidroksigrup÷ yra bloga nueinanti grup÷. Chemin÷je laboratorijoje sintetinti baltymus yra labai sud÷tinga, vienas funkcines grupes reikia aktyvuoti, kitas blokuoti. V÷liau blokuotes reikia pašalinti, susidariusi peptidą išgrynint ir prijungti naują aminorūgštį. Gyvame organizme peptidinio ryšio susidarymas ir baltymų biosintez÷ vyksta dideliais greičiais, efektyviai, specifiškai, be pašalinių produktų.

H3N C C OH

R

H

O

H3N C C O

O

R

H

H3N C C N

R

H

O

C

H

COO

R

H

1 2 1

+

2+++ - -

H2O

peptidin÷ grup÷ 1.6 pav. Peptidinio ryšio susidarymas

Susijungusios dvi aminorūgštys sudaro dipeptidą, trys - tripeptidą. Daugelio aminorūgščių junginys yra vadinamas polipeptidu. Polipeptin÷s grandin÷s galas, kuriame yra laisva amino grup÷ vadinamas N galu, o galas su laisva karboksigrupe - C galu. Aminorūgštys, įeinančios į polipeptidinę grandinę, vadinamos aminorūgščių liekanomis ir jų pavadinimas sudaromas keičiant galūnę –inas ar –o į –il. Dipeptidas sudarytas iš valino ir glicino vadinamas valilglicinas. Polipeptidai, kurių molekulin÷ mas÷ yra didesn÷ nei 5000Da yra vadinami baltymais. Kai kuriuose baltymuose sutinkamas dar vienas kovalentinio ryšio tipas - disulfidinis (-S-S-) ryšys arba –SS- tilteliai. Jis susidaro susijungus dviem cisteino molekul÷ms. Dvi cisteino molekul÷s, sujungtos disulfidiniu ryšiu, duoda naują aminorūgštį cistiną.

16

16

CH

CH2

SH

COO

H3N+

-

SH

CH2

CH

COO-

H3N

2H+ + 2e-

2H+ + 2e-

CH

CH2

S

COO

H3N+

-

S

CH2

CH

COO-

H3N+

cisteinas cistinas

+

1.7 pav. Disulfidinio ryšio susidarymas Disulfidiniai ryšiai sujungia atskiras polipeptidines grandines ( pvz. insulino, chimotripsino molekul÷se) arba susidaro toje pačioje polipeptidin÷je grandin÷je ir stabilizuoja baltymo tretinę struktūrą.

1953m. Sengeris (F.Sanger) nustat÷ pirmo baltymo, hormono insulino, kuris reguliuoja cukraus koncentraciją kraujyje, aminorūgščių seką, tai yra pirminę struktūrą. 1966m. mokslininkas buvo apdovanotas Nobelio premija. Po 24 metų Sengeriui buvo įteikta antra Nobelio premija už laim÷jimus nustatant DNR pirminę struktūrą.

Insulinas yra sudarytas iš dviejų polipeptidinių grandinių (A grandin÷je 21 aminorūgštis, o B grandin÷je - 30), sujungtų dviem disulfidiniais ryšiais.

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala

S S

S

S

S

S

A

B

1.8 pav. Insulino molekul÷s pirmin÷ struktūra. Šiuo metu ištobul÷jus pirmin÷s struktūros nustatymo metodams yra nustatyta per 30000

baltymų pirminių struktūrų (2005 metai). 1.2.2 Baltymų pirmin ÷s struktūros nustatymas.

Pirminei struktūrai nustatyti naudojami įvairūs metodai. Aminorūgščių seka paprasčiausiai ir lengviausiai nustatoma žinant DNR pirminę struktūrą. Yra lengviau nustatyti DNR nukleotidų seką ir, vadovaujantis genetiniu kodu, kokie tripletai kokias aminorūgštis koduoja, rasti baltymo aminorūgščių seką. Proteomikoje taikomas masių spektroskopijos metodas, paremtas polipeptidinių fragmentų, susidariusių “apšaudžius” baltymus elektronais, santykin÷s molekulin÷s mas÷s ir krūvio santykio nustatymu. Šis metodas labai perspektyvus tiriant proteomą ir nustatant labai mažų baltymų kiekių aminorūgščių sekas.

Cheminiu metodu tiriamos nedidelių baltymų struktūros, jis padeda patikslinti aminorūgščių sekas, nustatytas pagal DNR nukleotidų seką. Šiuo metodu buvo nustatyta pirmųjų baltymų insulino, ribonukleaz÷s ir kitų aminorūgščių sekos.

Cheminis baltymų pirmin÷s struktūros nustatymas yra sud÷tingas, reikalaujantis didelių sąnaudų metodas. Jo pagrindiniai etapai yra šie:

17

17

1. Baltymas išgryninamas, gaunamas homogeninis preparatas. 2. Nustatomos N- ir C-galin÷s aminorūgštys. 3. Nustatoma iš kelių, kovalentiškai sujungtų polipeptidinių grandinių sudarytas

baltymas. 4. Jeigu baltymo molekul÷je yra daugiau nei viena polipeptidin÷ grandin÷, jos

atskiriamos ir kiekviena analizuojama atskirai. 5. Suardomi disulfidiniai ryšiai. Jei yra kelios polipeptidin÷s grandines, tada

disulfidiniai ryšiai suardomi prieš 4 etapą. 6. Nustatoma kiek ir kokių aminorūgščių yra polipeptidin÷je grandin÷je. 7. Edmano metodu nustatomos aminorūgščių seka N gale. 8. Polipeptidin÷ grandin÷ suskaidoma į trumpesnius fragmentus, kiekviename

nustatoma aminorūgščių seka. 9. Naudojant skirtingus tiriamos polipeptidin÷s grandin÷s fragmentacijos būdus,

gaunami nauji peptidai, juose nustatoma aminorūgščių seka. Būtina, kad naujai gautų fragmentų aminorūgščių sekos persidengtų su 8 etape gautų polipeptidų aminorūgščių sekomis.

10. Iš 8 ir 9 etapuose gautų rezultatų rekonstruojama aminorūgščių seka baltymo molekul÷je.

11. Nustatomos -S-S- ryšių buvimo vietos. Kokios aminorūgštys ir kiek jų yra nustatoma hidrolizavus baltymą Šteino ir Muro

(U.Stein, S.Moore) sukonstruotu automatiniu aminorūgščių analizatoriumi. Nustačius galines aminorūgštis, galima sužinoti iš kelių, disulfidiniais tilteliais sujungtų,

polipeptidų sudarytas baltymas. Disulfidiniai ryšiai suardomi juos redukuojant 2-merkaptoetanoliu ar oksiduojant

peroksiskruzdžių rūgštimi.

18

18

NH

C CO

H

CH2

S

S

CH2

C CO

H

NH

NH

C CO

H

CH2

SO3

SO3

CH2

C CO

H

NH

H CO

OOH

NH

C CO

H

CH2

S

S

CH2

C CO

H

NH

NH

C CO

H

CH2

SH

SH

CH2

C CO

H

NH

(HS-CH2CH2OH)

Peroksiskruzdžių rūgštis

-

-

Merkaptoetanolis

1.9 pav. Disulfidinio ryšio suardymas peroksiskruzdžių rūgštimi ir merkaptoetanoliu

Tioliai redukuoja cistiną iki dviejų cisteino molekulių liekanų. Tolimesn÷se gryninimo stadijose aktyvios –SH grup÷s blokuojamos alkilinančiais reagentais, tokiais kaip jodacetatu.

1.2.3 Galinių aminorūgščių nustatymas.

Galin÷s aminorūgštys nustatomos cheminiu metodu. Cheminiu agentu pažymima

atitinkama aminorūgštis, baltymas skaidomas iki aminorūgščių ar peptidų ir identifikuojama pažym÷ta aminorūgštis.

N-galo nustatymas. Yra keletas efektyvių N-galin÷s aminorūgšties nustatymo metodų. Sengerio metodas. Prie baltymo molekul÷s N-galin÷s aminorūgšties aminogrup÷s

prijungiamas dinitrofluorbenzenas. Hidrolizuojant baltymus rūgštimi, jie suskyla iki aminorūgščių, kurių galin÷ pažym÷ta benzeno žiedu (DNF-aminorūgštis) ir nustatoma chromatografijos metodais. Sengerio metodo trūkumas yra tas, kad baltymas pilnai suskaidomas iki aminorūgščių ir nustatoma tik viena N galin÷ aminorūgštis.

19

19

+ NH2 CH C

R1 O

NH CH

R2

C

O

NH CH

R3

Dinitrofluorbenzenas polipeptidas

NH

C

O

NH CH

R2

C

O

NH CH

R3

dinitrofenilpolipeptidas

NH3 CH

R

n

+ COOH+

DNF-aminorūgštis laisvos aminorūgštys

NO2

O2N CH

R1

NH

COOH

NO2

O2N CH

R1

6M HCl

F

NO2

O2N

1.10 pav. N-galinių aminorūgščių nustatymas Sengerio metodu

Plačiausiais naudojamas Edmano (P.Edman) metodas. Šiuo metodu prie polipeptidin÷s grandin÷s N-galo prijungiamas fenilizotiocianatas (FITC) ir nuo polipeptidin÷s grandin÷s galo viena po kitos atskeliamos aminorūgštys feniltiohidantoino darinio pavidalu.

Kiekvieną degradacijos etapą sudaro trys stadijos: • Fenilizotiocianatas silpnai šarmin÷je terp÷je prijungiamas prie baltymo N-galin÷s

aminorūgšties, susidarant feniltiokarbamoil (FTK) peptidui. • Rūgštin÷je terp÷je, naudojant bevandenę trifluoracto rūgštį, atskyla N-galin÷

aminorūgštis anilinotiazolinono pavidalu • Anilinotiazolinonas rūgštin÷je terp÷je izomerizuojasi į feniltiohidantoino aminorūgšties

darinį, kuris nustatomas chromatografiškai. Sutrump÷jusi viena aminorūgštimi polipeptidin÷ grandin÷ v÷l veikiama fenilizotiocianatu ir procesas kartojamas daug kartų.

20

20

N C S + NH2 CH C

R1 O

NH CH

R2

C

O

NH CH

R3

NH C

S

NH CH C

R1 O

NH CH

R2

C

O

NH CH

R3

R1

NH

NO S

H3N CH C

O

NH CH

R2R3

+

FITC polipeptidas su n aminorūgščių

FTK-peptidas

+

S NH

NH

O

R

H

+

anilinotiazolinonas

feniltiohidantoino aminorūgšties darinys

CF3COOH

1

polipeptidas su n-1aminorūgščių

pH = 9,0

1.11 pav. N-galin÷s aminorūgšties nustatymas Edmano metodu.

Remiantis Edmano metodu yra sukurti automatiniai prietaisai (sekvenatoriai). kuriais

galima nustatyti 100 aminorūgščių polipeptido seką. Naujausios kartos sekvenatoriais 70 N-galinių aminorūgščių nustatymui užtenka 5-10 pikomolių (1pikomol = 10-12 mol) baltymo.

Dimetilaminonaftalen-5-sulfonilchloridas (dansilchloridas) reaguodamas su pirminiais aminais sudaro dansilintus polipeptidus. Po rūgštin÷s hidroliz÷s dansilinta N-galin÷ aminorūgštis intensyviai fluorescuoja ir chromatografiškai galima nustatyti iki 100 pmol aminorūgšties.

21

21

+ NH2 CH C

R1 O

NH CH

R2

C

O

NH CH

R3

dansilchloridas polipeptidas

N(CH3)2

S OO

Cl

NH CH C

R1 O

NH CH

R2

C

O

NH CH

R3

N(CH3)2

S

dansilpolipeptidas

NH CH C

R1 ONH3 CH

R

n

N(CH3)2

S

H+

OH+ COOH

+

dansilaminorūgštis(fluorescuojanti)

laisvos aminorūgštys

O

O

O

O

1.12 pav. N-galin÷s aminorūgšties nustatymas su dansilchloridu

N-galin÷ms aminorūgštims nustatyti taip pat naudojami fermentai aminopeptidaz÷s, kurios atskelia po vieną aminorūgštį nuo N galo.

C-galin÷s aminorūgšties nustatymas. Polipeptidin÷s grandin÷s C galui nustatyti plačiausiai naudojamos egzopeptidaz÷s. Karboksipeptidaz÷ A, B, C ir Y skirtingu efektyvumu ir specifiškumu, nuosekliai atskelia po vieną aminorūgštį nuo C galo (1.4 lentel÷). C-galinių aminorūgščių pašalinimo greitis yra įvairus, tod÷l susidaro skirtingų aminorūgščių mišinys kurį sunku analizuoti. Dažniausiai nustatoma tiktai viena ar kelios C-galin÷s aminorūgštys. 1.2.4 Polipeptidin÷s grandin÷s fragmentacija.

Jeigu polipeptidin÷ grandin÷ labai ilga, keli šimtai ir daugiau aminorūgščių, Edmano metodu nustatoma tiktai nedidel÷ dalis aminorūgščių sekos. Toliau tiriant baltymą, jis suskaidomas į atskirus fragmentus. Polipeptidinę grandinę galima hidrolizuoti rūgštimis, specifin÷mis peptidaz÷mis (fermentais, katalizuojančiais peptidinio ryšio hidrolizę), įvairiomis chemin÷mis medžiagomis (ciano bromidas specifiškai skelia polipeptidinę grandinę ties aminorūgštimi metioninu). Baltymuose metionino kiekis esti nedidelis. Skaidant baltymą, turintį

22

22

4 metioninus, BrCN susidaro 5 fragmentai. Plačiausiai naudojami fermentai, kurie hidrolizuoja peptidinius ryšius molekul÷s viduje (endopeptidaz÷s). Virškinamojo trakto fermentas tripsinas pagreitina hidrolizę tų peptidinių ryšių, kurių sudaryme dalyvauja Lys ar Arg aminorūgščių karboksigrup÷s. Chimotripsinas specifiškas aromatin÷ms aminorūgštims – Phe, Tyr, Trp. Skrandyje esantis pepsinas hidrolizuoja peptidinį ryšį ties aromatin÷mių aminorūgščių aminogrupe. Įvairių endo- ir egzopeptidazių veikimo specifiškumas pateiktas 1.4 ir 1.5 lentel÷se. 1.4 lentel÷. Įvairių egzopeptidazių specifiškumas Fermentas Šaltinis Specifiškumas Karboksipeptidaz÷ A Jaučio kasa Rn ≠ Arg, Lys,Pro; Rn-1 ≠Pro Karboksipeptidaz÷ B Jaučio kasa Rn = Arg, Lys; Rn-1 ≠Pro Karboksipeptidaz÷ C Citrusinių lapai Visos laisvos C-galin÷s

aminorūgštys; pH optimumas = 3.5 Karboksipeptidaz÷ Y Miel÷s Visos laisvos C-galin÷s

aminorūgštys; tačiau reakcija l÷tai vyksta kai Rn =Gly

Leucino aminopeptidaz÷ Kiaul÷s inkstai R1 ≠ Pro Aminopeptidaz÷ M Visos laisvos N-galin÷s aminorūgštys

Rn – C galin÷ aminorūgštis, Rn-1 antra nuo galo aminorūgštis, R1-N-galin÷ aminorūgštis 1.5 lentel÷. Endopeptidazių specifiškumas Fermentas Šaltinis Specifiškumas Pastabos Tripsinas Jaučio kasa Rn-1 teigiamai

įkrautos aminorūgštys: Arg, Lys; Rn ≠ Pro

Labai specifiškas

Chimotripsinas Jaučio kasa Rn-1 = aromatin÷s aminorūgštys: Trp, Phe, Tyr; Rn ≠ Pro

L÷čiau skaido , kai Rn-1 = Asn, His, Met, Leu

Elastaz÷ Jaučio kasa Rn-1 mažos neutralios aminorūgštys: Ala, Gly, Ser, Val; Rn ≠ Pro

Termolizinas Bacillus thermoproteolyticus

Rn = Ile, Met, Phe, Trp, Tyr, Val ; Rn-1 ≠ Pro

Kartais hidrolizuoja ties Rn = Ala, Asp, His, Thr; atsparus temperatūrai

Pepsinas Jaučio skrandžio gleivin÷

Rn = Leu, Phe, Trp, Tyr; Rn-1 ≠ Pro

Gana nespecifiškas; pH optimumas = 2

Endopeptidaz÷ V8 Staphylococcus aureus

Rn-1 = Glu, Asp

-NH-CH-C-NH-CH-C-

OO Rn

skaidomas peptidinis ryšys

Rn-1

23

23

Suskaidžius baltymą į fragmentus , nustatoma kiekvieno iš jų aminorūgščių seka. Po to lygindami įvairiuose fragmentuose persidengiančias aminorūgštis nustatome viso baltymo pirminę struktūrą.

H3N-Gly- Val- Lys-Leu -Phe -Asn- Ser-Arg-Trp-Asp-Val-COO-

Tripsinas

H3N-Gly- Val- Lys-COO- + H3N- Leu -Asn-Phe - Ser-Arg-COO- + H3N-Trp-Asp-Val-COO-

H3N-Gly- Val- Lys-Leu -Phe -Asn- Ser-Arg-Trp-Asp-Val-COO-

Chimotripsinas

H3N-Gly- Val- Lys- Leu -Asn-Phe-COO- + H3N- Ser-Arg-Trp-COO- + H3N-Asp-Val-COO-

Gly- Val- Lys Leu -Asn-Phe - Ser-Arg Trp-Asp-Val

Gly- Val- Lys- Leu -Asn-Phe Ser-Arg- Trp Asp-Val

a)

b)

c)

+++

+

+

+ + +

1.13 pav. Oligopeptido hidroliz÷ ir sekvenavimas a) tripsinas skaido polipeptidinę grandinę ties karbonilo grupe bazinių aminorūgščių, b)

chimotripsinas skaido polipeptidinę grandinę ties karbonilo grupe aromatinių ar didelių hidrofobinių aminorūgščių Phe, Tyr, Trp, c) Edmano metodu nustačius aminorūgščių seką kiekviename fragmente, jie sudedami taip, kad persidengtų atitinkamos aminorūgštys.

Šiuo metu nustatyta tūkstančių baltymų pirmin÷ struktūra ir jų aminorūgščių sekos pateiktos duomenų bankuose (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/access.html arba http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein. Informacijos apie įvairias duomenų bazes galima rasti tinklalapyje http://www.ibt.lt/lithuanian/nuorodos.htm) 1.2.5 Pirmin ÷s struktūros nustatymo svarba.

Pirmin÷s struktūros nustatymas yra svarbus keliais aspektais: 1) žinant nežinomos funkcijos baltymo pirminę struktūrą duomenų bankuose galima

ieškoti homologiškų baltymų su žinoma funkcija ir prognozuoti tiriamo baltymo funkciją. 2) nustačius aminorūgščių seką, galime prognozuoti baltymo antrinę, tretinę struktūras.

Šiuo metu sudarytos kompiuterin÷s programos, kuriomis galima nustatyti polipeptidin÷s grandin÷s α spiralinius segmentus ar β struktūras,

3) nustatyi membraninių baltymų sritis, esančias hidrofobiniame dvisluoksnyje, 4) nustačius baltymo pirminę struktūrą galima diagnozuoti kai kuriuos susirgimus.

Pavyzdžiui, ligonių, sergančių siklemija, hemoglobino molekul÷je glutamatas pakeistas į valiną, 5) žinant įvairių baltymų sekas galima spręsti apie šių baltymų evoliucinį išsivystymą.

Įvairių organizmų baltymai, turintys didelę aminorūgščių sekų homologiją, gali būti kil ę iš vieno pirmtako

6) galima prognozuoti, kaip evoliucijoje keisis baltymo aminorūgščių seka ir kaip keisis baltymo struktūra. Tokie tyrimai yra labai svarbūs tiriant įvairių virusinių infekcijų, pavyzdžiui, gripo viruso, pasireiškimą.

24

24

1.3 Antrin ÷ baltymų struktūra

Baltymų molekul÷s erdvinio išsid÷stymo pagrindas yra peptidinis ryšys ir jo erdvin÷ struktūra. 1951m. Amerikos mokslininkai Polingas (L.Pauling) ir Kori (R.Corey) pasiūl÷ antrinę baltymų struktūrą - αααα spiralę ir ββββ struktūrą. 1.3.1 Peptidinio ryšio struktūra.

Tiriant aminorūgštis ir oligopeptidus rentgeno spindulių difrakcijos metodu buvo pasteb÷ta, kad peptide, amidinio C-N ryšio ilgis yra trumpesnis nei tipiškas C-N ryšys, bet ilgesnis negu dvigubas C=N ryšys. Taip pat ryšys tarp karbonilo anglies ir deguonies ilgesnis nei tipiškas C=O ryšys. Ryšio C-N ilgis peptidin÷je grup÷je lygus 0,133nm, tai yra tarpin÷ reikšm÷ tarp C-N viengubo ryšio (0,149nm) ir C=N dvigubo ryšio (0,127nm). Mažiau ryškus yra C=O ryšio pailg÷jimas nuo 0,121nm iki 0,123nm. Tai rodo, kad peptidinis

. 1.14 pav. Peptidin÷ grup÷, ryšių ilgiai ir kampų dydžiai nustatyti kristalografin÷s analiz÷s

metodu. ryšys yra iš dalies dvigubas (~40%) ir jį geriausiai atspindi rezonansin÷ forma ( 1.15 pav.). Peptidin÷ grup÷ gali būti kelių formų - neutrali (a), polin÷ (b) ir tarpin÷ (c).

CN

H

O

CN

H

O-

+CαCα

CαCα

CN

H

O

CαCα

δ+

δ−

(a) (b)(c) 1.15 pav. Peptidinio ryšio struktūros

Deguonis yra iš dalies neigiamas, o azotas įgauną teigiamą krūvį, tod÷l peptidinis ryšys yra dipolis.

Kadangi peptidin÷ grup÷ yra dalinai konjuguota, formuojantis ryšiui dalyvauja π elektronai, tod÷l n÷ra laisvo sukimosi apie C-N ryšį ir peptidin÷ grup÷ yra plokščia (komplanari). Atomai (Cα-C-N-Cα) yra vienoje plokštumoje. Rezonansin÷ šios plokščios struktūros stabilizacijos energija yra 88kJ/mol.

25

25

1.16 pav. Plokščios peptidin÷s grup÷s sukimasis

Kadangi peptidinis ryšys yra iš dalies dvigubas, peptidin÷ grup÷ gali būti vienos iš dviejų konfigūracijų cis arba trans (1.17 pav.). Trans konfigūracijoje du α anglies atomai, prijungti prie peptidin÷s grup÷s, yra priešingose peptidinio ryšio pus÷se. Cis konfigūracijoje α anglies atomai yra toje pačioje plokštumos pus÷je ir erdv÷je suart÷ja.

1.17 pav. Peptidinio ryšio cis, trans konfigūracijos

Susidarius peptidiniam ryšiui šios dvi konfigūracijos savaime negali pereiti viena į kitą. Baltymuose dažniausiai aptinkama trans konfigūracija , nes cis konfigūracijoje tarp aminorūgščių šoninių radikalų galimi stereocheminiai trukdymai. Išimtį sudaro peptidinis ryšys, kurio sudaryme dalyvauja prolinas. Specifinis fermentas – prolino cis-trans izomeraz÷ katalizuoja cis-trans per÷jimą ir baltymo molekul÷je peptidinis ryšys įgauna cis konfigūraciją.

Polipeptidin÷ grandin÷ gali suktis tiktai apie -N-Cα−α−α−α− ( φφφφ phi kampas) ir -Cαααα-C- ( ψψψψ psi kampas) ryšius. Daugumą polipeptidin÷s grandin÷s konformacijų ir struktūrų galima aprašyti žinant φ ir ψ kampų dydžius. Kai kampai φ ir ψ yra 1800, grandin÷ visiškai ištemptos konformacijos. Teoriškai kampai φ ir ψ gali įgauti bet kokią reikšmę tarp +1800 ir –1800 tačiau erdviškai uždraustos tos konformacijos, kai atstumai tarp atomų mažesni nei van der Valso spinduliai. Leistinos kampų φ ir ψ reikšm÷s, tai yra galimos polipeptidų konformacijos pavaizduojamos Ramachandrano (G.N. Ramachandran) diagrama.

Polingas ir Kori pasiūl÷ dvi galimas baltymų antrines struktūras : α − spiralę β − struktūrą

1.3.2 αααα spiral÷. α spiral÷ yra labai svarbus baltymų struktūrinis elementas, ji yra fibriliniuose baltymuose,

tokiuose kaip plaukų keratinas, raumenų aktomiozinas bei sutinkama globuliniuose baltymuose.. Polipeptidin÷ grandin÷, sudaryta iš L-aminorūgščių, susisuka į dešiniojo sukimosi spiralę, sukimasis vyksta pagal laikrodžio rodyklę. α spiral÷je kampai φ ir ψ yra nuo -500 iki -600. D-aminorūgštys sudaro stabilesnę kairiojo sukimosi spiralę. Spiral÷s žingsnis, t.y. atstumas tarp vijų, lygus 0,54nm. Viename žingsnyje telpa 3,6 aminorūgščių likučiai arba 13 atomų, tod÷l klasikin÷ α spiral÷ dar žymima 3,613. Identiškumo periodas lygus 5 žingsniams arba 18

26

26

aminorūgščių. Cilindro, ant kurio išsid÷sto Cα atomai, skersmuo lygus 1,1nm.. Kiekvienos peptidin÷s grup÷s karbonilo deguonis ir imino grup÷s vandenilis sudaro vandenilinius ryšius su kas ketvirta iš eil÷s peptidin÷s grup÷s -CO ir –NH ir stabilizuoja spiralę. Kiekvienas aminorūgšties likutis išsid÷stęs kaimynin÷s aminorūgšties bei spiral÷s atžvilgiu identiškai. Reikia pabr÷žti, kad grup÷s C=O ir –N-H ir tarp jų susidarę vandeniliniai ryšiai yra kolinearūs, tai yra išsid÷stę vienoje ties÷je ir yra lygiagretūs spiral÷s ašiai. (Vandenilinis ryšys yra stipriausias, kai ryšį sudarantys elektroneigiami atomai ir vandenilio atomas yra vienoje ties÷je). Aminorūgščių šoniniai radikalai yra nukreipti į spiral÷s išorę taip, kad nesusidarytų erdviniai trukdymai.

1.18 pav. Baltymų α spiral÷

Pažiūr÷jus į spiralę iš viršaus matome tokį vaizdą - cilindro karkasą sudaro polipeptidin÷ grandin÷, vidus tuščias, į išorę išsid÷stę aminorūgščių šoniniai radikalai. Priklausomai nuo to, kokios aminorūgštys įeina į polipeptidinę grandinę ir kokia tvarka jos išsid÷sto, polipeptidin÷ grandin÷ gali būti amfifilin ÷. Šiuo atveju vienoje cilindro pus÷je kaupiasi hidrofobin÷s aminorūgštys, kitoje – hidrofilin÷s. Amfifilin÷s spiral÷s išsid÷sto baltymo molekul÷s paviršiuje, hidrofiliniai aminorūgščių radikalai nukreipti į išorę ( į vandenį), o hidrofobiniai į baltymo vidų. Tokios amfifilin÷s α spiral÷s labai svarbios membraniniuose baltymuose, susidarant jonų kanalams, formuojant integraliojo baltymo aktyvų centrą.

1.19 pav. α spiral÷s vaizdas iš viršaus

27

27

Šalia šios klasikin÷s α spiral÷s gali būti ir kito tipo spiral÷s, besiskiriančios spiral÷s žingsnio ilgiu ir atomų skaičiumi žingsnyje. Dešinio sukimo 310 spiral÷je žingsnis yra 0,6nm, viename žingsnyje yra 3 aminorūgščių likučiai ir telpa 10 atomų. Šis tipas randamas α spiral÷s galuose jai pereinant į kitas struktūras. ππππ spiral÷ (4,416 spiral÷) aptinkama retai, tiktai kaip ilgesnių spiralių segmentas. 1.3.3 αααα-spiral÷s stabilizacija.

α spiralę stabilizuoja vandeniliniai ryšiai tarp peptidinių grupių –C=O ir –NH. Vieno vandenilinio ryšio energija yra nedidel÷ (2-10 kJ/mol), tačiau formuojantis α spiralei šių ryšių susidaro daug ir jie užtikrina spiral÷s stabilumą. Vandeniliniai ryšiai yra ypač stiprūs baltymo hidrofobin÷je dalyje, kur nepatenka vandens molekul÷s ir nekonkuruoja d÷l vandenilinio ryšio sudarymo.

Polipeptidin÷s grandin÷s stabilizacijai labai svarbūs aminorūgščių šoniniai radikalai . Jie gali stabilizuoti arba destabilizuoti spiralę. Alaninas dažniausiai aptinkamas spiraliniuose segmentuose, jo nedidelis, neturintis krūvio šoninis radikalas –CH3 erdviškai atitinka α spiral÷s konformaciją. Glicinas, kurio radikalas yra –H, destabilizuoja spiralę. Esant glicinui susidaro labai daug skirtingų konformacijų su plačiu spektru φ ir ψ kampų, išsisukusios spiral÷s entropija padid÷ja. Jeigu arti vienas kito išsid÷sto dikarboksi- (Glu, Asp) ar diamino- (Lys, Arg) aminorūgščių šoniniai radikalai, tai d÷l elektrostatin÷s sąveikos radikalai stengiasi suart÷ti (jei šalia skirtingo krūvio radikalai) arba nutolti (jei krūviai vienodi) ir α spiral÷s stabilumas sumaž÷ja. Spiralę destabilizuoja tokių aminorūgščių kaip triptofanas, fenilalaninas hidrofobiniai bei šakotų aminorūgščių valino ar izoleucino radikalai.

Ypatinga vaidmenį vaidina prolinas. Prolino buvimo vietose α spiral÷ praktiškai nesusidaro. Azoto atomas yra pirolidino žiede ir susidariusiame peptidiniame ryšyje negalimas laisvas sukimasis apie Cα-N ryšį (kampas φ), be to azoto atomas nedalyvauja vandenilinio ryšio formavime.

Spiral÷s stabilumą veikia spiral÷s galuose esančios aminorūgštys. Kadangi kiekvienas peptidinis ryšys yra dipolis, tai ilg÷jant polipeptidinei grandinei dipolių krūviai sumuojasi ir α spiral÷s N galas turi teigiamą, o C galas neigiamą krūvį. α spiral÷s N gale esančios neigiamai įkrautų aminorūgščių šoniniai radikalai sąveikauja su spiral÷s N gale teigiamo ženklo dipoliu ir stabilizuoja spiralę. Teigiamai įkrautos aminorūgštys N gale, atvirkščiai - destabilizuoja spiralę.

Baltymuose α spiralinių segmentų kiekis yra labai skirtingas. Vienuose beveik visas baltymas sudarytas iš α spiralinių segmentų, kituose jie neaptinkami. Mioglobinas pirmas baltymas, kurio nustatyta erdvin÷ struktūra, sudaro aštuonis skirtingus α spiralinius segmentus. Vidutiniškai aminorūgštys, esančios α spiraliniuose segmentuose, sudaro yra apie 26% baltymo. Į spiralinį segmentą įeina nuo 4-5 iki 40 aminorūgščių, vidutiniškai 12 aminorūgščių.

Yra didel÷ baltymų šeima, kurioje dvi dešinio sukimo amfifilin÷s α spiral÷s yra susisukusios tarpusavyje ir sudaro kairiojo sukimo superspiralę. Tokias susisukusias spirales pirmą kartą pasteb÷jo Krikas (F.Crick), tirdamas plaukų ir odos keratinus. Šio tipo struktūros nustatytos DNR surišančiose baltymuose, pvz. leucino užtrauktuke, mielių transkripcijos faktoriuje GCN4. Raumenų baltymai miozinas, tropomiozinas, odos ir plaukų keratinai sudaryti iš tarpusavyje susisukusių α spiralinių grandinių. 1.3.4 ββββ struktūra Ji yra dar vadinamas β−lakštas, β−klostytas lakštas, β−klostyta struktūra.

Tai yra antra plačiai aptinkama baltymų erdvin÷ struktūra. Šiuo atveju polipeptidin÷ grandin÷ yra labiau ištempta nei α spiral÷, kampas φ lygus –1190 ar -1390, o ψ - +1130 ar +1350.

28

28

Ši ištempta polipeptidin÷ grandin÷ vadinama ββββ juosta (β strand) ir žymima . β juostoje atstumas tarp gretimų aminorūgščių α anglies atomų yra 0,32-0,34nm, o α spiral÷je 0,15nm. Baltymuose retai aptinkama individuali β juosta, ji yra nestabili, dažniausiai kelios juostos (dvi ir daugiau) tarpusavyje sujungtos vandeniliniais ryšiais ir sudaro β lakštą (β sheet). Kadangi β lakštas sudaro klostytą struktūrą, kuri vadinama ββββ klostytu lakštu (β pleated sheet). β-struktūrą stabilizuoja vandeniliniai ryšiai, kurie susidaro tarp juostose esančių -CO ir -NH grupių. Jie gali susidaryti arba tarp atskirų polipeptidinių grandinių arba tarp toje pačioje grandin÷je esančių juostų. β juostos lakštuose gali būti lygiagrečios, arba antilygiagrečios.

I) II

1.20 pav. Baltymo β struktūra. I - β juostos išsid÷sčiusios lygiagrečiai (a) ir antilygiagrečiai (b), II - β klostytas lakštas.

Kada polipeptidin÷s grandin÷s antilygiagrečios, vandeniliniai ryšiai yra vienoje ties÷je, tokia struktūra yra stabilesn÷, negu sudaryta iš lygiagrečių polipeptidinių grandinių.

Kai kurie baltymai sudaryti beveik vien iš juostų, kituose jų kiekis yra nedidelis. Lakštai gali sudaryti amfifilines struktūras, vienoje lakšto pus÷je išsid÷sto hidrofobiniai aminorūgščių radikalai, kitoje hidrofiliniai. Ta polipeptidin÷s grandin÷s pus÷, kurioje išsid÷sto hidrofobiniai aminorūgščių radikalai, nukreipta į baltymo molekul÷s vidų ,o hidrofiliniai radikalai kontaktuoja su vandeniu. Daugumos baltymų β juostos yra

A B

1.21 pav. Išlinkę β lakštai (A), β-statin÷ (B) išlinkusios ir sudaro įvairias struktūras. β struktūra gali suformuoti statin÷s formos darinį. Tokios β-statin÷s randamos bakterijų ir mitochondrijų išorin÷je membranoje ir sudaro poras, pro kurias praeina iki 600 Da molekulin÷s mas÷s medžiagos. Hidrofobiniai aminorūgščių šoniniai radikalai

29

29

yra nukreipti į statin÷s išorę ir sąveikauja su membranos lipidų angliavandeniliniais radikalais. Viduje statin÷s susidaro hidrofilinis, vandens pripildytas kanalas.

β-klostytos struktūros aptinkamos fibriliniuose baltymuose, pvz. šilko baltyme fibroine, voratinkliuose. β juostos esančios skirtingose polipeptidin÷s grandin÷s vietose ir suart÷ja, sudarydamos lakštus tiktai tada, kai susidaro tretin÷ baltymo struktūra. 1.6 lentel÷. Polipeptidinių grandinių konformacijų idealūs φ ir ψ kampų dydžiai Konformacija φ (N-Cα) ψ (C-Cα) α spiral÷ (dešinio sukimo) −570 −470 α spiral÷ (kairio sukimo) +570 +470 310 spiral÷ (dešinio sukimo) −490 −260 β lygiagreti klostyta struktūra - 1190 +1130 β antilygiagreti klostyta struktūra - 1390 +1350 kolageno spiral÷ -510 +1350 Pilnai ištempta grandin÷ -1800 +1800

Baltymų struktūroje greta sričių, turinčių reguliarią α spiralių ir β juostų struktūrą, sutinkamos polipeptidin÷s grandin÷s atkarpos, kurios n÷ra struktūrizuotos. Susidaro kilpos, linkiai, kurie sujungia α spiralių ar β juostų galus, polipeptidin÷ grandin÷ keičia savo orientaciją erdv÷je ir įgauna atitinkamą erdvinę struktūrą. α spiralin÷s grandin÷s ar β juostos galus jungia įvairaus ilgio oligopeptidai. Jeigu segmentus jungia ilgesn÷s, neturinčios reguliarios struktūros polipeptidin÷s grandin÷s dalys, jos vadinamos kilpomis. Kilpose dažnai būna hidrofilin÷s aminorūgštys, šios struktūros randamos baltymo molekul÷s paviršiuje ir sudaro vandenilinius ryšius su vandeniu. Kilpos, kurias sudaro iki penkių aminorūgščių, yra vadinamos linkiu. Dažniausiai aptinkamas ββββ-linkis, kai 4 aminorūgščių oligopeptidas sujungia dvi antilygiagrečios β juostas ir polipeptidin÷ grandin÷ 1800 kampu keičia savo kryptį. Pirmosios aminorūgšties, esančios linkyje, peptidin÷ grup÷ sudaro vandenilinį ryšį su ketvirtos aminorūgšties peptidine grupe. Šiuose linkiuose dažniausiai aptinkamos glicino ir prolino aminorūgštys.

1. 22 pav. Polipeptidin÷s grandin÷s β-linkis.

1.3.5 Superantrin÷ struktūra. Dažnai baltymuose pasikartojančios substruktūros yra vadinamos superantrine struktūra

arba motyvais. Jų struktūrinis lygis yra aukštesnis nei antrin÷s struktūros, tačiau žemesnis negu susiformavusių tretin÷s struktūros struktūrinių domenų. Superantrin÷ struktūra yra kombinacija α spiral÷s ir β juostos, sujungtų kilpomis ar linkiais. Baltymuose randami įvairūs motyvai:

1. αα motyvas, kai du α spiraliniai segmentai sujungti nespiralizuota kilpa, tokia struktūra dar vadinama spiral÷-kilpa-spiral÷ H-L-H (helix-loop-helix)

30

30

2. Dvi antilygiagrečios α spiral÷s sujungtos trumpu oligopeptidu (H-T-H), spiral÷s keičia savo kryptį 1800.

3. Plačiai aptinkamas yra βαβ motyvas, kur dvi lygiagrečios β juostos yra sujungtos α spiraliniu segmentu.

4. Aptinkamas β plaukų smeigtuko formos (hairpin) motyvas, kai antilygiagrečios β juostos sujungtos 3-5 aminorūgščių ilgio oligopeptidu.

5. Baltymuose sutinkamas struktūra sudaryta iš keturių α spiralių, kurios sudaro ryšulį (four-helix bundle).

6. Motyvas, kuris susidaro susijungus β juosta-α spiral÷-β juosta-α spiral÷-β juosta (βαβαβ) šis vienetas yra vadinamas Rosmano susilankstymas (fold)

7. Antilygiagrečios β juostos sudaro “Graikiško rakto” topologiją Pavadinimas kilęs d÷l analogijos su geometriniais raštais, kurie puošia Graikų keramiką. Šis motyvas sudarytas iš keturių antilygiagrečių β juostų, kurios sujungtos kilpomis ar linkiais.

8. β-juosta-kilpa-α spiral÷–kilpa, toks motyvas pasikartoja kelis kartus. Apie 10% fermentų turi tokius fragmentus. Lygiagrečios β klost÷s sudaro statin÷s vidų, o α spiral÷s dengia jos išorę.

9. β vingiuotas (β meander) motyvas. Antilygiagrečios β juostos sudaro lakštą, kur juostos sujungtos kilpomis arba linkiais. Lakšte gali būti viena arba kelios plaukų segtuko formos struktūras, tačiau dažniausiai juostos sujungtos kilpomis.

10. Superspiral÷s (coil-coil) motyvas sudarytas iš dviejų amfifilinių spiralių, kurios sąveikauja hidrofobin÷mis pus÷mis. Tokia struktūra yra leucino užtrauktuke.

H-L-H motyvas H-T-H motyvas βαβ motyvas β-plaukų segtukas

Graikiško rakto formos motyvas Vingiuota struktūra 1.23 pav. Superantrin÷s struktūros pavyzdžiai

- α spiralinis segmentas, β- juosta

Struktūriniai motyvai plačiai sutinkami DNR surišančiuose reguliatoriniuose baltymuose. Cinko pirštai . Motyvas aptinkamas daugelyje DNR surišančių baltymų, sudarytas iš 28

aminorūgščių likučių, kurio seka yra –CX2-4CX3FX5LX2HX3H-. Motyvo pavadinimas kilęs nuo cinko surišimo srities, kuri peptide suformuoja piršto formos kilpą. Cinkas jungiasi su konservatyvių His ir Cys molekulių liekanomis. Kilpa, jungiantį sekoje antrą Cys ir pirmą His

31

31

liekanas yra polin÷ ir susiriša su didžiuoju DNR molekul÷s griovio 5 bazių poromis, iš dalies jį apsukdama. Jie randami transkripcijos faktorių sud÷tyje. Cinko pirštai įeina į steroidinius hormonus surišančio receptoriaus domeną, kuris jungiasi su DNR.

1.24 pav. Cinko pirštai Leucino užtrauktukas. Šis struktūrinis motyvas aptinkamas DNR surišančiuose

baltymuose. Dvi lygiagrečios α spiral÷s susisuka viename gale ir praplat÷ja kitame gale, kur prie jo jungiasi DNR. α spiral÷s cilindras yra amfifilinis, vienoje pus÷je išsid÷sto hidrofobin÷s aminorūgštys, daugiausiai leucinas. Leucinas išsid÷sto išilgai polipeptidin÷s grandin÷s reguliariai kas septinta aminorūgštis. Kitoje cilindro pus÷je aptinkamos teigiamai ar neigiamai įkrautos aminorūgštys (Asp, Glu, Arg ir Lys) ir neturinčios krūvio polin÷s rūgštys (Gln, Thr, Ser). Hidrofobin÷ sąveika tarp Leu molekulių stabilizuoja dviejų spiralių dimerizaciją.

1.25 pav. Leucino užtrauktukas

32

32

1.4 Fibriliniai baltymai.

Baltymai pagal savo erdvinę struktūrą gali būti suskirstyti į tris grupes: globuliniai, fibriliniai ir membraniniai. Gausiausia klas÷ yra globuliniai baltymai, kurių molekul÷s turi kompaktišką, globul÷s formą. Fibrilinių baltymų molekul÷s yra ištemptos, pailgos formos. Tokie baltymai yra mechaniškai atsparūs, netirpūs vandenyje ir praskiestuose druskų tirpaluose. Membraniniai baltymai turi hidrofobin÷s sritis, kuriomis įsiterpia į membraną.

Dauguma fibrilinių baltymų atlieka struktūrinę funkciją, įeina į odos, sausgyslių, kaulų, plaukų sud÷tį. Kai kurie fibriliniai baltymai, kaip raumenų baltymai, cil÷s, atlieka motorinę funkciją.

Vienas iš plačiausiai paplitusių fibrilini ų baltymų yra keratinas. Tai yra mechaniškai tvirtas ir chemiškai atsparus baltymas. Jis yra pagrindinis plaukų, ragų, nagų baltymas. Keratinai skirstomi į α keratinus, kuriuos turi žinduoliai ir β keratinus būdingus paukščiams ir reptilijoms, vabzdžiams. Žinduoliai turi per 30 skirtingų keratino rūšių. 1.4.1 αααα keratinai.

Rentgeno struktūrin÷s analiz÷s duomenys rodo, kad plaukų baltymo α keratino dvi α spiralin÷s grandin÷s susisuka į kairio sukimo superspiralę. Polipeptidin÷s grandin÷je kas ketvirta aminorūgštis yra nepolin÷ ir susidarant superspiralei jos paslepiamos molekul÷s viduje ir papildomai stabilizuoja superspiralę. N ir C galo domenai yra judrūs ir superspiral÷s susijungia galva -uodega į ilgas fibriles. Dvi tokios fibril÷s sudaro 2,0-3,0nm storio protofilamentą. Savo ruožtu susijungę du protofilamentai sudaro protofibril ę (4,0-5,0nm diametras). Keturios protofibril÷s susijungia į mikrofibril ę (~8 nm storio). Makrofibril ÷s yra sudarytos iš mikrofibrili ų, sujungtų, turtingu sieros amorfiniu baltymu. Plauko skersnuo yra ~ 20µm, jis yra sudarytas iš negyvų ląstelių, kurių pluošteliai ~200nm skersmens makrofibrilių orientuoti išilgai plauko.

1.26 pav. Keratino struktūra

33

33

α-keratino molekul÷je yra daug sieros turinčių aminorūgščių, kurios sudaro disulfidinius ryšius tarp gretimų polipeptidinių grandinių. Jos sąlygoja keratinų netirpumą ir atsparumą tempimui. Daug sieros turi plaukų, ragų, nagų keratinai, jie yra tvirti ir nelankstūs. Odos keratinuose disufidinių ryšių skaičius yra mažesnis, tod÷l oda yra lanksti. Disulfidiniai ryšiai gali būti suardomi juos redukuojant merkaptanais. Plaukų cheminis sušukavimas remiasi α spiralinių grandinių ištempimu ir per÷jimu į β struktūrą, bei disulfidinių ryšių redukcija ir oksidacija. 1.4.2 ββββ keratinai.

Vabzdžiai sintetina šilką ir sudaro tokias struktūras kaip kokonus, voratinklius, lizdus. Dauguma šilkų sudaryti iš fibrilinio baltymo fibroino ir lipnaus amorfinio baltymo sericino, kuris suriša fibriles. Suaugusi kandis sekretuoja peptidazę (kokonazę), kuri hidrolizuoja sericiną ir kandis praskirdama fibroiną išlenda iš kokono. Gaminant šilkinius audinius sericinas yra pašalinamas virinant šarminiuose tirpaluose.

Šilko baltyme fibroine, išskirtame iš šilkaverpių Bombyx mori , polipeptidin÷ grandin÷ sudaro antilygiagretų β klostytą lakštą, kuriame polipeptidin÷s grandin÷s išsid÷sto lygiagrečiai pluošto ašiai. Aminorūgščių sekos analiz÷ parod÷, kad polipeptidin÷je grandin÷je aptinkamas šešių aminorūgščių likučių pasikartojimas

(-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-)n Susidariusioje polipeptidin÷je grandin÷je glicino šoninis radikalas (-H) yra nukreiptas į vieną lakšto plokštumos pusę, o serino (-CH2OH) ir alanino (-CH3) - į priešingą. Šilko pluoštas susiformuoja taip, kad tarpusavyje kontaktuoja klostyto lakšto šonai su į vieną pusę nukreiptais glicino radikalais ir į priešingą pusę žiūri serino ir alanino radikalai. Šilko pluoštai yra tvirti ir atsparūs tempimui. Lankstumą sąlygoja Van der Valso j÷gos, kurios susidaro tarp gretimų lakštų ir jie gali jud÷ti vieni kitų atžvilgiu.

Gly

Ala

0.35nm

0.57nm

1.27 pav. Šilko fibroino polipeptidinių grandinių išsid÷stymas

1.4.3 Kolageno tipo spiral÷.

Kolagenas yra jungiamojo audinio fibrilinis baltymas randamas kremzl÷se, sausgysl÷se, odoje, kraujagysl÷se, akies skleroje ir ragenoje, kauluose, dantyse. Žinduolių organizmuose jis sudaro per 25% visų baltymų. Kai kuriuose organuose kolagenas yra sudaro g÷lį ir išsid÷sto neląsteliniame užpilde. Kituose organuose kolageno molekul÷s suformuoja tvirtas fibriles, suteikiančias atsparumą tempimui (sausgysl÷s), mechaniniam poveikiui (kaulai).

34

34

Elektronin÷s mikroskopijos ir rentgeno struktūrin÷s analiz÷s duomenys parod÷, kad kolageno molekul÷ yra pailgo 300nm ilgio ir 1,5nm skersmens stulpelio formos. Ši molekul÷ yra vienas iš ilgiausių žinomų baltymų. Kolageno molekul÷je trys kairio sukimo polipeptidin÷s grandin÷s susisuka į dešinio sukimosi trigub ą superspiralę. (ji dar bivo vadinama protokolagenu). Molekulę stabilizuoja vandeniliniai ryšiais tarp atskirų polipeptidinių grandinių. Molekul÷s stabilumui palaikyti yra labai svarbi aminorūgštis hidroksiprolinas . Tiriant kolageno aminorūgščių sud÷tį pasirod÷, kad baltymo molekul÷je yra per 30% glicino ir daug prolino ir hidroksiprolino. Glicino molekul÷ yra nedidel÷, jos radikalas (-H) lengvai telpa trigubos superspiral÷s viduje ir leidžia susidaryti kompaktiškai, labai atspariai tempimui molekulei. Kolageno molekul÷ išlaiko tokią pat apkrovą, kaip tokio paties skersmens plieno viela. Kolageno molekul÷je randamos nestandartin÷s aminorūgštys 4-hidroksiprolinas, 3-hidroksiprolinas ir 5-hidroksilizinas.

N

OH

COOH

H2N-CH2-CH-CH2-CH2-C-COOH

OH NH2

NCOOH

OH

1 234

4-hidroksiprolinas 3-hidroksiprolinas

5-hidroksilizinas Polipeptidin÷je grandin÷je yra pasikartojanti aminorūgščių -Gly-X-Y - seka, kur Y

dažniausiai prolinas ar hidroksiprolinas. Didelis aminorūgščių prolino, hidroksiprolino ir glicino kiekis sąlygoja, kad polipeptidin÷ grandin÷ nesusisuka į klasikinę α spiralę ir nesudaro β

1.28 pav. Kolageno struktūra

struktūros. Kolageno spiral÷ yra labiau ištempta nei α spiral÷, atstumas tarp aminorūgščių likučių yra 0,29nm, tuo tarpu α spiral÷je jis lygus 0,15nm. Spiral÷s žingsnyje yra 3,3 aminorūgščių likučiai. Glicinas išsid÷sto grandin÷s viduje taip kad –NH grup÷ sudaro vandenilinius ryšius su gretimos X ar Y aminorūgšties –CO grupe. Trigubą spiralę papildomai stabilizuoja vandeniliniai ryšiai sudaryti su hidroksiprolino –OH grupe.

35

35

Kolageno molekul÷s yra glikozilintos jo sud÷tyje yra 0,4-12% angliavandenių. Gliukoz÷, galaktoz÷ ir jų disacharidai kovalentiškai prijungiami prie 5-hidroksilizino prieš susidarant trigubai spiralei.

1.29 pav. Kolageno fibril÷s ir jų susidarymas Kolageno fibril÷s stabilizuojamos susidarant vidumolekuliniams (kolageno molekul÷je tarp

atskirų grandinių) ir tarpmolekuliniams (tarp atskirų kolageno molekulių) kovalentiniams ryšiams tarp lizino, hidroksilizino ir histidino molekulių. Vidumolekuliniai skersiniai ryšiai susidaro tarp lizino molekulių. Lizino oksidaz÷ savo sud÷tyje turinti vario jonus ir katalizuoja lizino ir hidroksilizino šonin÷s grandin÷s aminogrup÷s oksidaciją iki aldehido. Susidaro alilizino ar alihidroksilizino likučiai, kurie reaguoja su lizino aminogrupe susidarant Šifo bazei. Kovalentinis ryšys sujungia polipeptidines grandines superspiral÷s viduje. (1.30 pav. a ). Dvi

36

36

gretimų kolageno superspiralių alilizino molekulių aldehido grup÷s spontanin÷s aldolin÷s

kondensacijos

NH

CH

CO

CH2-CH2-CH2-CH2-NH3 NH3-CH2-CH2-CH2-CH2

NH

CH

CO

C-CH2-CH2-CH2

O

H

NH

CH

CO

NH

CH

CO

CH2-CH2-CH2-CH- N=CH-CH2-CH2-CH2

NH

CH

CO

NH

CH

CO

CH2-CH2-CH2-CH2-NH3

NH

CH

CO

CH2-CH2-CH2-CH=C--CH2-CH2

NH

CH

CO

H

+ +

Lizino oksidaz÷

+

Alilizino liekana

CO

Šifo baz÷

a)

b)

÷

1.30 pav. Kolageno fibril÷s stabilizuojamos kovalentiniais ryšiais

reakcijos metu taip pat gali susijungti kovalentiniu ryšiu. Tarpmolekuliniai skersiniai ryšiai susidaro, reaguojant lizino ir dviem hidroksilizino

molekul÷ms, susidarant hidroksipiridino struktūrai. Tokie skersiniai ryšiai susidaro tarp vienos kolageno molekul÷s N galo ir gretimos C galo.

Tarpmolekulinių kovalentinių ryšių skaičius did÷ja gyvūnui augant. Kolageną galima ekstrahuoti tiktai iš jaunų gyvulių. Želatina gaunama iš kolageno yra nevisavertis maisto produktas, kadangi joje nedaug būtinų organizmui aminorūgščių.

Kolageno biosintez÷s metu į polipeptidinę grandinę įjungiami prolinas ir lizinas. Toliau endoplazminiame tinkle vyksta šių aminorūgščių potransliacin÷ modifikacija. Prolino hidroksilinimą katalizuoja fermentas prolino hidroksilaz ÷. Šio fermento aktyviame centre yra redukuotas Fe2+ jonas. Fermento aktyvumo palaikymui reikalinga askorbo rūgštis, kuri redukuoja geležies joną. Negaunant askorbo rūgšties, geležis oksiduojasi ir fermentas netenka aktyvumo.

37

37

OO

OH OH

OO

O O

C CH2OH

OH

H

Askorbo rūgštis Dehidroaskorbo rūgštis

C CH2OH

OH

H

Hidroksilinimo reakcijoje dalyvauja deguonis, α ketoglutaratas ir askorbo rūgštis. Panašios

chemin÷s reakcijos vyksta ir hidroksilinant liziną.

N CO

H H

N CO

H OH

+ O2 +

COO-

CH2

CH2

CO

COO-

Prolinas α ketoglutaratas

Prolino hidroksilaz÷ Fe2+

+ CO2 +

COO-

CH2

CH2

COO-

+

4-hidroksiprolinas Sukcinatas

1.31 pav. Hidroksiprolino susidarymas kolageno molekul÷je. Kai organizmas negauna pakankamai vitamino C (askorbo rūgšties) n÷ra sintetinamas

hidroksiprolinas bei hidroksilizinas, tod÷l sumaž÷ja kolageno stabilumas. Padid÷ja kraujagyslių pralaidumas, kraujuoja dantenos, susidaro vidin÷s kraujosruvos, žmogus suserga skorbutu.

Žmogaus organizme yra per 20 skirtingų kolageno tipų. I tipo kolageno yra daugiausiai, jis randamas odoje, sausgysl÷se, kauluose. Į jo sud÷tį įeina dvi α1 ir viena α2 tipo polipeptidin÷s grandin÷s. Jis sintetinamas fibroblastuose ir sekretuojamas į užląstelinę erdvę, kur polimerizuojasi . II tipo kolagenas aptinkamas kremzl÷se, III tipo yra kraujagyslių sienel÷je ir žarnyne, jie yra sudaryti iš trijų identiškų polipeptidinių grandinių.

38

38

1.5 Tretin ÷ baltymų struktūra

Baltymo molekul÷s išsid÷stymas erdv÷je yra vadinamas tretine baltymo struktūra.

Polipeptidin÷ grandin÷ erdv÷je dažniausiai susisuka į kompaktišką globulę. Jeigu už pirmin÷s struktūros susidarymą atsakingi peptidiniai ryšiai, antrin÷s – vandeniliniai, tai tretin÷ struktūra susidaro d÷l sąveikos tarp aminorūgščių šoninių radikalų. Vandeniniame tirpale globulinių baltymų atomai supakuoti molekul÷s šerdyje. Hidrofobin÷s aminorūgščių šonin÷s grup÷s yra globul÷s viduje, o hidrofilin÷s nukreiptos į išorę. Visos hidrofilin÷s grup÷s esančios globul÷s viduje sudaro vandenilinius ar elektrostatinius ryšius. Baltymo molekul÷s viduje yra α spiralių ir β struktūrų fragmentai, kuriuos jungia kilpos, linkiai.

Polipeptidin÷ grandin÷ erdv÷je sudaro struktūrą, kurios vidin÷ energija yra minimali, aminorūgščių šoniniai radikalai tarpusavyje ar su vandeniu sudaro maksimalų skaičių galimų cheminių ryšių. Baltymai, turintys tą pačią aminorūgščių seką turi tą pačią erdvinę struktūrą, aminorūgščių išsid÷stymo seka nulemia baltymo konformaciją. Tretin÷ struktūra atsakinga už baltymo funkcijas. Ypatingai tai svarbu fermentams. Formuojantis aktyviam centrui aminorūgščių šoniniai radikalai, esantys skirtingose polipeptidin÷s grandin÷s vietose, suart÷ja ir dalyvauja kataliz÷je. 1.5.1 Baltymo molekul÷s erdvin÷ struktūra.

Pagrindinis baltymų trijų dimensijų (3D) erdvin÷s struktūros, tai yra tretin÷s struktūros tyrimo metodas yra rentgeno struktūrin ÷s analiz÷s metodas. Šio metodo skiriamoji geba yra apie 0,1nm ir galima nustatyti kiekvieno atomo buvimo vietą erdv÷je. Vienas iš rentgeno struktūrin÷s analiz÷s metodo sunkumų yra gauti baltymo kristalą bei kristalą su įvestu izomorfiniu sunkiojo metalo atomu. Šiuo metu plačiai naudojamas baltymo kristalinimas, kuriame metionino aminorūgštis yra pakeista selenometioninu, tai palengvina tretin÷s struktūros nustatymą. Tretin÷ baltymo struktūra taip pat nustatoma branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) metodu. Juo galima tirti iki 40 kDa molekulin÷s mas÷s baltymus. Metodo privalumas yra tas, kad naudojamas baltymo tirpalas, o ne kristalas, tai pilniau atspindi baltymo natyvią konformaciją. Prasid÷jus membraninių baltymų struktūros tyrimams buvo gauti tiktai dviejų dimensijų (2D) baltymo kristalai, kurie analizuojami elektronine ir krioelektronine mikroskopija . Pirmas membraninis baltymas, kurio nustatyta struktūra ~1nm skiriamąja geba ir jo išsid÷stymas membranoje buvo bakteriorodopsinas, išskirtas iš halofilinių bakterijų. Baltymų paviršiui tirti vis plačiau naudojama atomin÷s j÷gos mikroskopija. Panaudojant kompiuterines programas, žinant tiktai pirminę struktūrą teoriškai galima apskaičiuoti atomų išsid÷stymą baltymo molekul÷je, tačiau šis metodas kol kas reikalauja detalesnių studijų.

Nustačius tretinę struktūrą, duomenys yra patalpinami duomenų baz÷se, kuriomis galima naudotis. Viena iš pagrindinių tretinių struktūrų duomenų bazių yra serveryje http://www.rcsb.org/pdb/ Informaciją apie įvairias duomenų bazes galima surasti http://www.ibt.lt/lithuanian/nuorodos.htm.

Pirmas baltymas, kurio nustatyta tretin÷ struktūra, tai yra kiekvieno atomo išsid÷stymas erdv÷je buvo mioglobinas išskirtas iš kašaloto raumenų. Šis baltymas dalyvauja deguonies kaupime žinduolių raumenyse. Baltymas sudarytas iš vienos 153 aminorūgščių polipeptidin÷s grandin÷s ir prostetin÷s grup÷s - hemo. Deguonis prisijungia prie hemo.

39

39

H3C

CH3

H3C

H3C

Fe

CH2CH2COOH

CH CH2

N

N

N

N CH2CH2COOH

CH2 CH

1.32 pav. Hemas (geležies protoporfirinas IX) Hemas (arba geležies protoporfirinas) yra komplanari ciklin÷ sistema susidedanti iš

centrinio Fe2+ atomo, sujungto su keturiais pirolo žiedais. Pirolo žiedai tarpusavyje susijungę metino –CH- tilteliais. Geležis keturiais koordinaciniais ryšiais susijungia su 4 pirolo žiedų azotais ir dviem su polipeptidin÷s grandin÷s histidino aminorūgštimis. Deguonis, prisijungdamas prie hemo, pakeičia vieną histidino molekulę ir lieka susirišęs koordinaciniais ryšiais. Hemai taip pat įeina į citochromų sud÷tį (Žr.sk).

Kendriu (E.Kendrew) su bendradarbiais apie 1950m. gavo baltymo mioglobino, išskirto iš kašaloto raumenų, kristalą, ir atlikę rentgeno struktūrinę analizę nustat÷ atomų išsid÷stymą erdv÷je. Jie pasteb÷jo, kad baltymas sudaro kompaktišką globulę. Molekul÷je yra 8 α spiraliniai segmentai kuriuos sudaro 7-26 aminorūgštys, kitos aminorūgštys sudaro linkius ir kilpas tarp α spiralių. Keturiuose linkiuose yra prolino aminorūgštis. Baltymo molekul÷s viduje išsid÷sto nepolin÷s aminorūgštys (Leu, Val, Phe), globul÷s viduje n÷ra H2O. Viduje esančios hidrofobin÷s aminorūgštys sudaro hidrofobinį branduolį. Molekul÷s išor÷je išsid÷sto polin÷s aminorūgštys (Asp, Glu, Lys, Arg), kurios su vandeniu sudaro vandenilinius ryšius. Tokiu būdu vandenyje polipeptidin÷ grandin÷ susisuka taip, kad nepoliniai aminorūgščių šoniniai radikalai nukreipti į molekul÷s vidų, o poliniai - į išorę.

1.33 pav. Mioglobino molekul÷s struktūra

Tiriant daugelio baltymo globul÷je esančių aminorūgščių išsid÷stymą, buvo pasteb÷ta, kad • nepolinių aminorūgščių Met, Val, Leu, Ile, Phe šoniniai radikalai nukreipti į baltymo

molekul÷s vidų ir nekontaktuoja su vandeniu. Hidrofobin÷ sąveika tarp šių radikalų sąlygoja baltymo tretin÷s struktūros stabilumą.

• aminorūgščių Lys, Arg, His, Asp, Glu įkrauti šoniniai radikalai yra baltymo paviršiuje ir su vandeniu sudaro vandenilinius ryšius. Būdamos baltymo molekul÷s viduje, funkcin÷s grup÷s

40

40

tarpusavyje sudaro ryšius ir dažniausiai atlieka specifines chemines funkcijas - įeina į fermento aktyvų centrą, suriša metalo jonus, kofermentus.

• polin÷s aminorūgštys Tyr, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln paprastai randami baltymo molekul÷s išor÷je, tačiau gali būti aptinkamos ir molekul÷s viduje ir tarpusavyje sudaro vandenilinius ryšius. Poliniai aminorūgščių šoniniai radikalai, esantys baltymo molekul÷s paviršiuje, sąlygoja baltymo tirpumą vandenyje.

1.5.2 Tretin ÷s baltymo struktūros stabilumas. Tretinę struktūrą palaiko cheminiai ryšiai tarp aminorūgščių šoninių radikal ų.

Dažniausiai tai silpni nekovalentiniai ryšiai, kurie lengvai suyra pakitus temperatūrai, terp÷s pH, joninei j÷gai. Šis antrin÷s ir tretin÷s struktūros suardymas vadinamas denatūracija. Baltymų natyvios struktūros stabilumą užtikrina labai didelis skaičius silpnų, nekovalentinių ryšių, kurių ryšio energija yra 2 eil÷m mažesn÷, negu kovalentinio ryšio, tačiau didelis skaičius ryšių užtikrina molekul÷s stabilumą. Tretinę struktūrą stabilizuoja šie ryšiai:

1. disulfidinis ryšys – stiprus kovalentinis ryšys susidaro tarp dviejų cisteino molekulių (1.7

pav.), esančių toje pačioje polipeptidin÷je grandin÷je. Disulfidinis ryšys sujungia dvi Cys molekules, kurios yra nutolusios polipeptidin÷je grandin÷je, tačiau suart÷ja formuojantis erdvinei struktūrai. Disulfidiniai ryšiai dažniausiai aptinkami baltymuose, kurie funkcionuoja už ląstel÷s ribų – užląsteliniai fermentai, antikūnai, plazmos baltymai. Viduląsteliniuose baltymuose cisteino merkaptogrup÷ palaikoma redukuoto yra glutationo.

2. hidrofobin ÷ sąveika susidaro tarp nepolinių aminorūgščių (Leu, Ile, Phe, Ala, Trp, Val) šoninių radikalų. Tai yra vienas iš svarbiausių veiksnių, stabilizuojančių baltymo erdvinę struktūrą. Baltymui, susisukant į kompaktišką molekulę, nepoliniai aminorūgščių šoniniai radikalai pereina iš hidrofilin÷s vandens apsupties į dehidratuotą baltymo šerdį. Hidrofobiniai aminorūgščių radikalai, esantys vandenyje, struktūrizuoja šalia esančias vandens molekules ir jos išsid÷sto tvarkingai apie radikalą. Sistemos tvarkingumas did÷ja, entropija maž÷ja ir sistema tampa mažiau stabili. Kai hidrofobiniai radikalai suart÷ja, vanduo išstumiamas iš tarpo tarp jų. Sistemos entropija padid÷ja ir energetiškai naudingiau, kai hidrofobiniai radikalai išsid÷sto vieni šalia kitų.

3. joninis ryšys susidaro tarp aminorūgščių radikalų, turinčių priešingą krūvį. Tarp teigiamai ir neigiamai įkrautų funkcinių grupių susidaro joninis ryšys. Jonizuotos teigiamos lizino, arginino aminogrup÷s sudaro joninį ryšį su disocijavusiomis neigiamomis glutamo arba asparto rūgščių karboksigrup÷mis. Neutraliame pH aminogrup÷ bus įkrauta teigiamai, o karboksigrup÷ – neigiamai, tarp jų susidarys elektrostatin÷s traukos j÷gos. Tokios jonų poros dar vadinamos druskų tilteliais. Joninio ryšio energija yra nedidel÷, jo disociacijos energija artima vandeniliniam ryšiui.

4. vandenilinis ryšis • susidaro tarp dviejų elektroneigiamų atomų ( O, N, kartais S) per vandenilio

atomą. Vandenilinio ryšio energija yra nedidel÷ (10-40kJ/mol), tačiau didelis jų skaičius yra svarus ind÷lis makromolekul÷s stabilumui. Jie yra tarp aminorūgščių šoninių radikalų, pvz., serino, tirozino ar treonino -OH ir lizino, arginino, asparagino ar glutamino NH2, tarp histidino imidazolo žiedo ir serino -OH.

• susidaro tarp aminorūgščių šoninių radikalų ir polipeptidin÷s grandin÷s peptidin÷s grup÷s -CO ir -NH,

• susidaro β struktūroje tarp ištemptų polipeptidinių grandinių peptidin÷s grup÷s -CO ir -NH.

41

41

• pastaruoju metu parodyta, kad vandenilinio ryšio sudaryme gali dalyvauti aromatinių žiedų π elektronai, bei –C-H vandenilis

5. Van der Valso sąveika. Kai du atomai priart÷ja vienas prie kito, jų elektronų debes÷liai veikia vienas kitą ir susidaro momentinis dipolis. Du dipoliai silpnai traukia vienas kitą ir atomai suart÷ja. Šio ryšio disociacijos energija yra apie 4kJ/mol. Kai du branduoliai suart÷ja labai arti, tarp jų atsiranda atostūmio j÷gos.

Pra÷jus daugiau nei 40 metų nuo pirmo baltymo mioglobino tretin÷s struktūros nustatymo

dabar žinoma per 20000 baltymų erdvin÷ struktūra, visų jų struktūroje randami tie patys pagrindiniai elementai - α spiral÷, β juosta, linkis, kilpa. Mioglobinas turi tik α spiralinius segmentus. Nedideliame baltyme ribonukleaz÷je A (14,6kDa, 129 aminorūgštys), išskirtoje iš jaučio, yra didelis antilygiagrečių β juostų fragmentas, keletas trumpų α spiralių, kilpų. Daugumos žinomų globulinių baltymų apie 30% aminorūgščių likučių yra randami α spiral÷se ir per 28% β klost÷se. α spiralinių segmentų ilgis yra 10-25 aminorūgščių, o β klost÷se aptinkama 3-10 aminorūgščių. 1.5.3 Baltymų domenai. 2001m. nustačius žmogaus genomą buvo pasteb÷ta, kad didžiausias skirtumas tarp žmogaus ir kirm÷lių bei musių ( jų genomai taip pat nustatyti) yra baltymų sud÷tingume. Žmogaus baltymai sudaryti iš didesnio skaičiaus domenų, juose aptinkami visai nauji domenai. Baltymas susidedantis daugiau nei 200 aminorūgščių turi domeninę struktūrą. Domenai - tai diskretiški, nepriklausomai susisukantys baltymų tretin÷s struktūros funkciniai ir struktūriniai elementai. Jie gali tur÷ti nuo 20-30 iki 300 aminorūgščių, vidutiniškai per 100 aminorūgščių ir dalyvauja susidarant natyviai baltymo konformacijai. Domenai tarpusavyje susijungę judria polipeptidine grandin÷le. Dalin÷s proteoliz÷s metu lengvai peptidinis ryšys hidrolizuojamas ir domenai atskiriami (1.34 pav.).

1.34 pav. Troponino domenin÷ struktūra Judrūs sujungimai leidžia domenams jud÷ti erdv÷je, tai yra labai svarbu jungiantis substratui su fermentu, reguliuojant fermento aktyvumą. Jungiantis gliukozei su fermento heksokinaz÷s aktyviuoju centru, du domenai susiglaudžia ir uždaro substratus aktyviame centre, neleisdami ATP sąveikauti su vandens molekul÷mis. Fosforilo liekana nuo ATP pernešama ant gliukoz÷s, o ne ant vandens. Kiekviename glicerolio aldehido 3-fosfato dehidrogenaz÷s subvienete yra du domenai, vienas suriša kofaktorių NAD’ ą, kitas - glicerolio fosfatą. Tiriant tretines baltymų struktūras, pasirod÷, kad domenai, turintys analogiškas funkcijas pasižymi ne tik didele aminorūgščių homologija, bet jų erdvin÷s struktūros taip pat labai panašios. Tokių domenų

42

42

struktūrų tyrimas yra perspektyvus kompiuterin÷s analiz÷s metodais. Yra žinoma daug domenų, dalyvaujančių atpažinimo, signalo perdavimo, susirišimo reakcijose. SH2 domenai. Į jų sud÷tį įeina apie 100 aminorūgščių, kurios jungiasi su taikinio peptide esančiu fosfotirozinu. Daug skirtingų citozolio baltymų jungiasi su fosforilintais receptoriais. Tokie baltymai kaip protoonkogeno produktas Src, GTPazę aktyvuojantis baltymas (GAP), fosfolipaz÷ Cγγγγ turi vieną ar kelis SH2 domenus. Domeno pavadinimas kilęs Src homologijos 2 (SH2) Jie pirmą kartą nustatyti tirozino kinaz÷se giminingose Src. Labai svarbūs signalo perdavimo kaskadose. SH3 domenai. Dauguma receptorinių tirozino kinazių savo sud÷tyje be SH2 domenų turi ir 50-75 aminorūgščių ilgio SH3 domenus, kurie susiriša su daug prolino turinčiais baltymais. PDZ domenas Į jo sud÷tį įeina per 90 aminorūgščių, kurios sudaro baltymus atpažįstančius modulius. Šie domenai randami baltymuose (baltymo kinaz÷se, baltymo tirozino fosfataz÷se, azoto oksido sintaz÷je), dalyvauja receptorių klasterizacijoje, surišant efektorinius fermentus su receptoriais. PDZ domenas specifiškai susijungia su taikinio baltymo 4-5 C-galo aminorūgštimis. PDZ domenas dažnai susiriša su jonų kanalais ar transmembraniniais receptoriais. PTB domenas. Fosfotiroziną surišantis (PTB) domenas prisijungia prie fosforilinto tirozino bei prie rūgštinių fosfolipidų. Fosfotirozinas susiriša su PTB domeno teigiamai įkrauta sritimi, kurios sud÷tyje yra Ser, Lys ir dvi Arg aminorūgštys. PH domenas Plekstrino homologijos (PH) domenai randami baltymuose, kurie dalyvauja viduląsteliniame signalo pernešime. PH domenai susiriša su fosfoinozitidais ir su baltyminiais taikiniais plazmin÷je membranoje, kur jie sąveikauja su kitais signaliniais domenais ir baltymais. WW domenai Šių domenų sud÷tyje yra dvi Trp aminorūgštys (tod÷l pavadinimas WW domenas) kurios jungiasi su Pro, esančiu PPXY segmente. Šis domenas randamas daugelyje signalinių ir reguliatorinių baltymų. 1.5.4 Baltymų tretin ÷s struktūros klasifikacija

Yra kelios skirtingos tretin÷s struktūros klasifikacijos schemos. Viena iš plačiausiai naudojamų yra CATH, ji pateikta serveryje (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath/). Šioje sistemoje yra keturi pagrindiniai hierarchijos lygiai: klas÷ (C-lygis), architektūra (A-lygis), topologija (T - lygis) ir homologiškos superšeimos (H-lygis). Klas÷ nustatoma pagal tai, kokie antrin÷s struktūros elementai randami ir kaip jie išsid÷sto. Šiame lygyje baltymai skirstomi į kelias grupes - α klas÷, β klas÷, α-β klas÷ ir baltymai, turintys nedidelius antrin÷s struktūros fragmentus. α klas÷je baltymai sudaryti daugiausiai iš α spiralinių segmentų, β klas÷je vyrauja β juostos. α-β klas÷je yra α/β ir α+β struktūros. Baltymo architektūra nusako molekul÷s formą, kurią nulemia antrinių struktūrų išsid÷stymas, bet neįvertina ryšių tarp antrin÷s struktūros elementų. Baltymo topologija. Struktūros sugrupuojamos į supakuotų baltymų šeimas, atsižvelgiant į molekul÷s formą ir ryšius tarp antrin÷s struktūros elementų. Homologiškos

43

43

superšeimos. Šiai grupei priklauso baltymai kurie turi vieną pirmtaką ir yra homologiški.

1.35 pav. Tretin÷s baltymų struktūros pagal CATH klasifikaciją. C – klas÷, A – architektūra, T

- topologija α spiralių, β juostų, linkių, kilpų skaičius ir išsid÷stymas baltymuose yra skirtingas. Pagal šių

struktūrų buvimą, jų tarpusavio išsid÷stymą globuliniai baltymai gali būti labai įvairūs (1.36 pav.). Antilygiagrečių α α α α spiralių baltymai. Juose dominuoja ryšuliukai antilygiagrečiai išsid÷sčiusių α spiralinių segmentų. Tokios struktūros randamos miohemeritrine, gripo viruso hemaglutinine HA2, tobako mozaikos viruse ir kituose baltymuose. Kitą didelę klasę sudaro baltymai, kuriuose randamos lygiagrečios arba antilygiagrečios ββββ juostos. Lygiagrečiose β klostytose struktūrose hidrofobiniai aminorūgščių šoniniai radikalai gali išsid÷styti abiejose lakšto pus÷se. Tai rodo, kad tokio tipo β struktūros nekontaktuoja su vandeniu ir sudaro baltymų šerdis. Triozių fosfato izomeraz÷je, piruvato kinaz÷s I domene baltymo molekul÷s šerdį sudaro β juostų statin÷, cilindro šonus dengia α spiral÷s. Baltymo globul÷se aptinkamos ir antilygiagrečios ββββ juostos. Hidrofobiniai radikalai yra tiktai vienoje lakšto pus÷je, o hidrofiliniai – kitoje, tod÷l šios struktūros gali sąveikauti viena puse su vandeniu. Tokios struktūros gali tur÷ti cilindro ar statin÷s formą. Antilygiagrečios β juostos randamos tripsino slopiklyje, papaino II domene. Pakalnut÷s

44

44

baltymas konkanavalinas A, γ kristalinas turi daug antilygiagrečių β klostytų struktūrų, sudarančių Graikiško rakto superantrinę struktūrą ir neturi α spiralių.

Integraliuosiuose membraniniuose baltymuose polipeptidin÷s grandin÷s dalis esanti membranoje sudaryta iš nepolinių aminorūgščių. Polipeptidin÷ grandin÷ α spiraliniais segmentais ar β juostomis kelis kartus perveria membraną. (žr. sk.)

.

Ribonukleaz÷s slopiklis β statin÷ Konkanavalinas A 1.36 pav. Kai kurių baltymų struktūros

1.5.5 Baltymų judrumas. Baltymo molekul÷je yra organizuotos ir neorganizuotos struktūros. Labai svarbu

pažym÷ti, kad šios struktūros dažnai juda labai greitai. Vyksta momentin÷s osciliacijos apie vieną, labai stabilią konformaciją. Baltymai yra dinamin÷s struktūros. Jud÷ti gali atskiri atomai, aminorūgščių šoniniai radikalai, net atskiri domenai. Atomai vibruoja labai greitai (10-15-10-11 s) ir nedideliais atstumas (~0,05nm). Atomų grup÷s ar domenai juda gerokai l÷čiau ir didesniais atstumais. Dideli konformaciniai pakitimai vyksta reaguojant antigenui su antikūnu, fermentui su substratu, receptoriui su ligandu. Jud÷jimo greitis gali būti 10-9-10-3s ir grup÷s gali jud÷ti kelių nm atstumu. 1.5.6 Baltymų molekul÷s tretin÷s struktūros susidarymas.

Baltymo polipeptidin÷ grandin÷ sintetinama ribosomoje. Kaip ir kada vyksta erdvin÷s struktūros susidarymas? Ar polipeptidin÷ grandin÷ iš karto susisuka į natyvią konformaciją ar pradžioje sintetinama linijin÷ molekul÷ ir tik po to formuojasi tretin÷ struktūra? Gal būt pradžioje

45

45

susidaro tiktai nedideli antrin÷s struktūros elementai, kurie yra tretin÷s struktūros susidarymo iniciacijos centrai?

Globulinių baltymų susiformavimas yra termodinamiškai naudingas procesas. Susisukimo laisvosios energijos pokytis yra neigiamas (∆G<0). Šis Gibso laisvoji energijos pokytis susideda iš keletos termodinaminių faktorių, ∆G=∆H-T∆S. Susisukant polipeptidinei grandinei, susiformuoja tvarkinga struktūra, tod÷l šio proceso entropija (∆S) sumaž÷ja ir procesas turi būti energetiškai nenaudingas. Tod÷l entropijos sumaž÷jimą turi kompensuoti kitos sąveikos. Pagrindinis faktorius, suteikiantis ∆G neigiamą ženklą ir energetiškai naudingą baltymų susisukimą yra entalpija (∆Η). Susiformuojant baltymų tretinei struktūrai susidaro maksimalus cheminių ryšių skaičius tarp aminorūgščių funkcinių grupių molekul÷s viduje bei su vandeniu.

1.37 pav. Baltymų tretin÷s struktūros susidarymo modelis

Po linijin÷s polipeptidin÷s grandin÷s fragmentų sintez÷s, pirmiausiai susidaro lokaliniai

antrin÷s struktūros elementai - α spiral÷s ir β struktūros. Sąveikaujant aminorūgščių šoniniams radikalams, šie elementai suart÷ja ir susiformuoja superantrin÷s struktūros motyvai. Procesas tęsiasi kol susidaro domenai. V÷liau susiformuoja nepilnai susisukęs baltymas, vadinamas išlydyta (molten) globule. Tolimesn÷se stadijose domenai suart÷ja ir išlydyta globul÷ pereina į natyvų baltymą (1.37 pav.).

1950 metais Anfinsenas (C.Anfinsen) tyr÷ ribonukleaz÷s A, skaidančios ribonukleorūgštis, denatūracijos ir renatūracijos procesus. Baltymų denatūracija vadiname procesą, kurio metu pakinta baltymo antrin÷, tretin÷s struktūros, baltymas praranda savo biologinį aktyvumą. Baltymą denatūruoti galime pak÷lus temperatūrą, paveikus rūgštimis, šarmais, medžiagomis suardančiomis vandenilinius, hidrofobinius ir kitus ryšius. Paveikus ribonukleazę 8M karbamidu suardomi vandeniliniai ryšiai, o merkaptoetanolis redukuoja disulfidinius ryšius.

46

46

Baltymas denatūruojasi ir fermentas prarado aktyvumą. Dializ÷s metu pašalinus denatūruojančius agentus, baltymas atgavo fermentinį aktyvumą, tai reiškia, kad atsistat÷ natyvi tretin÷ struktūra. Šis procesas vadinamas renatūracija. Ribonukleaz÷je yra 8 cisteino aminorūgštys ir susidaro 4 disulfidiniai tilteliai.

1.38 pav.Ribonukleaz÷s denatūracijos, renatūracijos schema Aktyviame fermente disulfidiniai ryšiai turi susidaryti tiktai tarp atitinkamų aminorūgščių.

Renatūruojantis baltymui formuojasi termodinamiškai stabiliausia konformacija, kuri sutvirtinama disulfidiniais ryšiais. Ribonukleaz÷s renatūracijos greitis padid÷ja, esant terp÷je fermentui baltymo disulfido izomerazei, kuri katalizuoja atsitiktinį naujų disulfidinių ryšių susidarymą ir skilimą. Šis eksperimentas parod÷, kad pirmin ÷je struktūroje yra užrašyta visa informacija apie erdvines baltymo struktūras.

Tačiau ląstel÷je baltymų susisukimas n÷ra atsitiktinis konformacijų su minimalia laisvąja energija ieškojimas. Levintalio paradoksas sako, kad baltymui ribonukleazei (124 aminorūgštys) galimos 1050 konformacijos. Jeigu naujos konformacijos susidarymas trunka 10-13 sekund÷s, tai atsitiktinis visų galimų konformacijų susidarymas ir pilnas baltymo susisukimas užmtų 1030 metų. Bakterijos E.coli 100 aminorūgščių baltymą susintetina per 5s. Vadinasi baltymo molekul÷s susipakavimas n÷ra atsitiktinis procesas.

Polipeptidin÷s grandin÷s susisukimas yra sud÷tingas ir pilnai nenustatytas procesas. Kruopštūs tyrin÷jimai leido pasiūlyti keletą susisukimo modelių. Vienas iš jų sako, kad tretin÷ struktūra greitai susidaro iš antrin÷s struktūros branduolių (nucleation-condensation). Antras modelis yra hidrofobin÷s griūties (hydrophobic collapse) modelis, kuris akcentuoja hidrofobin÷s sąveikos svarbą, ši sąveika kompaktizuoja baltymo molekulę ir baltymo susisukimas vyksta apibr÷žtame tūryje ir sumaž÷ja konformacinių būvių skaičius.

47

47

1.5.7 Molekuliniai šaperonai. Gyvame organizme baltymų koncentracija yra labai didel÷, susisukimo procesas vyksta

neatsitiktinai, o dalyvaujant papildomiems baltymams. Sintetinantis polipeptidinei grandinei, joje yra daug hidrofobinių segmentų, kurie tarpusavyje gali susijungti, agreguotis su kitomis molekul÷mis, ar su hidrofobiniais ląstel÷s komponentais. Dažniausiai tokiu atveju susidaro neaktyvios molekul÷s. Neseniai atrasta baltymų šeima pavadinta molekuliniais šaperonais. Jie atlieka daug svarbių funkcijų: a) reikalingi polipeptidin÷s grandin÷s susisukimui in vivo, b) dalyvauja baltymų monomerams jungiantis į oligomerus, c) išvynioja baltymus pernešant juos per membranas. d) apsaugo baltymus nuo denatūracijos. e) dalyvauja baltymų degradacijoje, jie palengvina molekulei išsivynioti ir patekti į proteosomas. Dauguma šių baltymų buvo nustatyti kaip šiluminio streso baltymai (Hsp), jų sintez÷ indukuojama ląstelei patekus į aukštesnę temperatūrą ar kitokias nepalankias sąlygas.

Molekuliniai šaperonai skirstomi į dvi klases. Pirma klas÷, kuriai priklauso Hsp70 baltymai, vadinami tiesiog šaperonais, kita klas÷ - šaperoninai (Hsp60). Taip pat yra rasti košaperonai ( Hsp10, DnaJ, GrpE ir kiti).

Hsp70 (70 kDa molekulin÷ mas÷) baltymai randami eukariotuose ir prokariotuose ir pasižymi dideliu konservatyvumu. Žinoma, kad Hsp70 baltymai prisijungia prie ką tik iš÷jusios iš ribosomos polipeptidin÷s grandin÷s hidrofobinių segmentų. Šaperonai taip pat jungiasi prie denatūruoto ar agreguoto baltymo hidrofobinių sričių. Tokios “uždengtos “ hidrofobin÷s sritys nesąveikauja su kito baltymo ar membranų hidrofobin÷mis dalimis ir nesusidaro neaktyvūs baltymų agregatai ar netaisyklingai susisukęs baltymas. Šaperono-baltymo kompleksas lengvai disocijuoja ir baltymo hidrofobin÷s sritys gali susijungti tarpusavyje, susidarant funkcionuojančiam baltymui. Bakterijose Hsp70 šeimą sudaro DnaK, DnaJ, GrpE baltymai, o eukariotuose – Hsp70, BiP, Hsp40. DnaK ir Hsp70 turi ATPazinį aktyvumą.

Hsp70 sistemos veikimas geriausiai ištirtas prokariotų DnaK, DnaJ ir GrpE baltymų komandoje. Iš÷jęs iš ribosomų nedidelis 6-10 hidrofobinių aminorūgščių peptidinis segmentas susijungia su DnaK baltymu. Peptido-DnaK kompleksas reaguoja su ATP. Prijungus prie komplekso DnaJ stimuliuojama ATP hidroliz÷, keičiasi DnaK ir peptido konformacija. Susidarius DnaK-peptidas-DnaJ-ADP kompleksui toliau formuojasi natyvi baltymo konformacija ir susiformavęs baltymas disocijuoja nuo šaperonų. Kitas šios komandos baltymas GrpE katalizuoja ADP/ATP mainus. Hsp 70 baltymai veikia pradin÷se baltymo formavimosi stadijose, o šaperoninai - v÷lesn÷se stadijose.

Antra grup÷ yra šaperoninai (Hsp60). Jie padeda susiformuoti tretinei struktūrai tų baltymų, kurių natyvi struktūra nesusidar÷ veikiant vien Hsp70. Bakterijose randami GroEL-GroES, o mitochondrijose Hsp60-Hsp10 šaperoninai. GroEL baltymai sudaro 15nm ilgio ir 14nm pločio cilindrą su 5.0nm anga, į kurią gali įeiti baltymai. Cilindras suformuotas iš dviejų žiedų

48

48

kiekvienas turi po 7 identiškus ~60kDa subvienetus.

1.39 pav. Šaperoninų GroEL-GroES struktūra Subvienetai turi tris domenus – apikalinį, tarpinį ir ekvatorialinį. Apikalinis domenas

sudaro cilindro išorinius vartus, tarpinis sujungia apikalinį su dideliu

1.40 pav. Šaperonino GroEL ir GroES veikimo mechanizmas. 1 stadija -nesusisukęs baltymas prisijungia prie GroEL, 2 stadija – Prie kiekvieno GroEL heptamero subvieneto prisijungia ATP, 3 stadija – hidrolizuojama ATP, atsipalaiduoja 14 ADP ir GroES, 4 stadija –ATP ir GroES prisijungia prie kitos cilindro pus÷s, 5 stadija – baltymas susisuka viduje cilindro, 6 stadija – pilnai susisukęs baltymas išeina iš šaperonino, 7 stadija – nesusisukęs baltymas dar kartą prisijungia prie GroEL. ekvatorialiniu domenu, kuriame yra nukleotidus surišančios sritys. Prisijungus prie ekvatorialinio domeno ATP, keičiasi ekvatorialinio ir apikalinio domenų konformacija, hidrofobin÷s aminorūgštys nukreipiamos į cilindro centrinę dalį ir reaguoja su blogai susisukusio baltymo

49

49

komplementariais paviršiais. Cilindrą iš vienos pus÷s dengia mažesnis baltymas GroES, kuris yra žiedas, sudarytas iš 7 subvienetų. Neturintis natyvios konformacijos baltymas įlenda pro GroEL-GroES cilindro trans galą (prie kurio n÷ra prijungtas GroES). Prie kiekvieno ekvatorialinio domeno subvieneto prisijungia po ATP molekulę. ATP hidrolizuojama, atsipalaiduoja ADP ir nuo cis galo disocijuoja GroES. Prisijungus naujoms ATP molekul÷ms GroES sąveikauja su cilindro trans galu, uždarydamas besiformuojantį baltymą GroEL ertm÷je. Hidrolizuojantis ATP keičiasi domenų konformacija polipeptidas prisijungia prie šaperonino hidrofobinių sričių ir baltymas susisuka į taisyklingą struktūrą. Baltymas gali daug kartų grįžtamai prisijungti ir disocijuoti nuo cilindro vidaus sienų, kiekvieną kartą hidrolizuojantis ATP. Baltymui įgavus natyvią konformaciją, jis išeina iš šaperonino. Vienas susisukimo ciklas tęsiasi 15-20s ir reikalauja daugelio (iki kelių šimtų) ATP molekulių.

Natyviai baltymo struktūrai yra svarbūs teisingai susidarę disulfidiniai tilteliai. Šį procesą palengvina fermentas baltymo disulfido izomeraz÷, kuri katalizuoja vienų disulfidinių ryšių suyrimą ir naujų -S-S- tiltelių susidarymą.

Tretin÷s struktūros susidaryme dalyvauja fermentas prolino cis-trans izomeraz÷, katalizuojanti cis-trans izomerizaciją peptidiniame ryšyje, kurį sudaro prolinas.

Endoplazminiame tinkle greta šaperonų BiP, Hsp70, Hsp90 rasti membraninis baltymas kalneksinas ir lumene esantis baltymas kalretikulinas, kurie padeda susisukti glikozilintiems baltymamas. Jie yra endoplazminio tinklo lektinai, specifiškai prisijungiantys prie daug manoz÷s turinčių N-glikanų. Šie lektinai veikia ir kaip šaperonai ir kaip receptoriai glikozilintų baltymų sekrecijoje.

Netaisyklingas baltymų susisukimas. Kartais baltymų susisukimas vyksta klaidingai ir susidaro neteisingai susisukę baltymai. Paprastai šie baltymai yra suardomi, tačiau jeigu kokyb÷s kontrol÷s sistemos veikia neefektyviai, kaupiasi ląsteliniai ar užląsteliniai tokių baltymų agregatai. Tokios netaisyklingai susisukusių baltymų nuos÷dos yra daugelio ligų priežastis.

Netaisyklingai susisukę baltymai gali būti d÷l geno mutacijų arba susidaryti spontaniškai. Kai kurie baltymai po nenormalaus proteolitinių skaidymo suformuoja ilgus, fibrilinių baltymų sankaupas, sudarytas iš β klostytų lakštų. Tokie savaimingai susidarę baltymų agregatai vadinami amiloidais ir yra daugelio neurodegeneratyvinių ligų priežastimi, ypatingai Alzheimerio ligos atveju. Pagrindinis amiloidin÷s plokštel÷s komponentas yra nedidelis 40-43 rūgščių Aββββ peptidas. Šis peptidas agreguoja ir kaupiasi smegenyse. Aβ peptidų agregatai randami smegenų parenchimoje ar išsid÷sto aplink kraujagysles. Šios amiloidin÷s plokštel÷s yra neurotoksiškos.

Prionas sudaro baltymų pluoštelius, kurie atsideda smegenyse ir sukelia tokias ligas kaip tarnsmissible spongiforminę encefalopatiją (jų tarpe ir Kreutcfeldo-Jakobo ligą) žmonių organizmuose, avių kempinligę, karvių spongiforminę encefalopatiją. 1.6 Baltymų degradacija.

Organizme baltymų gyvenimo trukm÷ yra labai įvairi. Ląstel÷je baltymai yra pastoviai ardomi ir resintetinami. Baltymų degradacija yra labai svarbus ląstel÷s metabolizmo reguliacijos mechanizmas. Ląstel÷s baltymų gyvenimo trukm÷ gali svyruoti nuo kelių minučių iki valandų ar parų. Ornitino dekarboksilaz÷, baltymo kinaz÷s, HMG-KoA sintetaz÷s gyvavimo pusperiodis yra <0,2val., ubikvitino, kalmodulino, citochromo P450 – 9-40 val, histonų, hemoglobino, glikogeno fosforilaz÷s >200val. Ląstel÷je taip pat turi būti suardomi pažeisti baltymai. Eukariotų ląstel÷se rastos dvi Ca2+ aktyvuojamos peptidaz÷s vadinamos kalpainais, didel÷ (Mm 700kDa) neutrali sudaryta iš daugelio baltymų peptidaz÷ ir nuo ATP priklausoma peptidaz÷ vadinama proteosoma. Baltymai taip suskaidomi viduląstelin÷se organel÷se lizosomose esančių proteolitinių fermentų

50

50

vadinamų katepsinais. Prokariotuose yra nustatytos citozolin÷s, priklausomos nuo ATP peptidaz÷s.

Proteolitinių sistemų funkcija yra ši: • atpažinti ir suardyti tuos baltymus, kurie sintez÷s metu nesudar÷ taisyklingų struktūrų • suardyti genetiškai pažeistus baltymus • suardyti “pasenusius” baltymus • moduliuoti pagrindinių reguliatorinių baltymų kiekį,

• suskaidyti trumpai gyvenančius baltymus, pavyzdžiui ciklinus, reguliuojančius ląstel÷s ciklą

• suskaidyti transkripcijos faktorius • suskaidyti reguliatorinius baltymus

• reguliuoti fermentin÷s kataliz÷s greitį, keičiant baltymo kiekį ląstel÷je • dauguma stuburinių organizmų ląstelių membranos paviršiuje turi trumpus viduląstelinių

baltymų fragmentus, kurie sukelia imuninį atsaką. Parodyta, kad šie antigeniniai peptidai susidaro proteosomose suskaidžius baltymus. Kai kurie nedideli peptidai susijungia su audinių suderinamumo kompleksu I (MHC I) išeina iš ląstel÷s ir eksponuojami išorin÷je membranos pus÷je. Antigeniniai peptidai atsakingi už imuninį atsaką, jų d÷ka ląstel÷ atpažįsta, kuri yra sava, o kuri svetima ir turi būti nužudyta.

1.6.1 Kaip yra atpažįstami baltymai, kuriuos reikia degraduoti? 1980m. buvo surastas baltymas ubikvitinas, kuris kovalentiškai prisijungia prie

degraduojamų baltymų ir juos pažymi. Tokie “pažym÷ti” baltymai v÷liau atpažįstami proteosomų ir suskaidomi. Ubikvitilinimas yra plačiausiai paplitęs baltymų žym÷jimas proteosomin÷je degradacijos sistemoje

. 1.41 pav. Ubikvitino molekul÷ Ubikvitinas yra labai konservatyvus nedidel÷s molekulin÷s mas÷s (8,5kDa 76

aminorūgštys) baltymas, kuris specifiškai prijungiamas prie degraduojamo baltymo lizino ε-aminogrup÷s. Ubikvitino prijungime dalyvauja trys baltymai E1, E2 ir E3. E1 yra ubikvitin ą aktyvuojantis baltymas. Ubikvitino C galin÷ glicino aminorūgštis tioesteriniu ryšiu susijungia su E1 cisteino merkaptogrupe. Pradžioje ubikvitinas yra aktyvuojamas, reaguojant jam su ATP. Susidaręs ubikvitiniladenilato tarpininkas prijungiamas prie E1 (1 stadija 1.42 pav.). Antroje stadijoje ubikvitinas prijungiamas prie ubikvitin ą pernešančio baltymo (E2) -SH grup÷s. E2-S~ubikvitinas gali būti transformuojamas dviem keliais a) ubikvitinas tiesiogiai prijungiamas prie baltymų pvz., histonų laisvų amino grupių, tačiau šis kelias n÷ra svarbus baltymų degradacijai. b) ubikvitino baltymo ligaz÷ (E3) atpažįsta degraduojamą baltymą (3 stadija 1.42 pav.) ir prijungia ubikvitino C-galinę aminorūgštį prie lizino ε-NH2 sudarydama izopeptidinį ryšį. Ubikvitinas turi

51

51

7 lizino aminorūgštis, kurios sudaro izopeptidinius ryšius su gretimų ubikvitino molekulių C galine glicino aminorūgštimi. Prie degraduojamo baltymo gali prisijungti net 50 ir daugiau ubikvitino molekulių sudarydami šakotas struktūras.

O

H

O

O O

O O

O

ubikvitinas-C

(tioesteris)

(Gly C gale)1.

2.

3.

+ ATP ubikvitinas-C~AMP + PPn

ubikvitinas-C~AMP + E1-SH ubikvitinas-C~S-E1 + AMP

ubikvitinas-C~S-E1 + E2-SH ubikvitinas-C~S-E2 + E1-SH

ubikvitinas-C~S-E2 + E3 : baltymas ubikvitinas-baltymas + E3 + E2-SH

E3 + baltymas E3 : baltymas(taikinys)

E1

1.42 1.42 pav. Ubikvitino prijungimas prie degraduojamo baltymo

Šiuo metu žinomos per 4 E3 fermento šeimos, kurios atpažįsta ir atrenka baltymus degradacijai. Atpažinimo procesas yra svarbiausias baltymų degradacijos procese, tačiau jis n÷ra pilnai išaiškintas. Fermentas gali atpažinti polipeptidin÷s grandin÷s N galo specifinę aminorūgščių seką. Baltymai turintys gale Met, Ser, Ala, Thr, Val, Gly, Cys yra atsparūs ubikvitilinimui ir proteolitinei degradacijai. Tačiau baltymų turinčių N gale Arg, Lys, His, Phe, Tyr, Trp, Leu, Asn, Gln, Asp ar Glu gyvenimo pusperiodis yra tiktai nuo 2 iki 30 min. Tiriant aminorūgščių seką trumpai gyvenančių baltymų buvo nustatytos nedidel÷s konservatyvių amino rūgščių prolino (P), glutamo (E) , serino (S) ir treonino (T) sekos (PEST), kurios pavadintos “destrukcijos d÷žute”. Kai kurie E3 fermentai atpažįsta fosforilintus ląstel÷s ciklo reguliatorius baltymus ir juos ubikvitilina.

Laisvieji radikalai oksiduoja liziną, argininą, tiroziną, proliną. Tokie oksiduoti baltymai yra labai geri citozolinių peptidazių taikiniai. 1.6.2 Proteosomos.

1968 m eritrocitų ekstraktuose elektronin÷s mikroskopijos metodu buvo pasteb÷tos pailgos, cilindro formos dalel÷s. Panašios struktūros buvo rastos daugelio organizmų ląstelių branduoliuose ir citozolyje. Buvo nustatyta, kad tai naujo tipo hidrolizuojantis baltymus multifermentinis kompleksas pavadintas proteosoma.

Proteosomos yra pagrindin÷ eukariotinių ląstelių branduolio ir citoplazmos peptidaz÷. Jos suskaido nesusisukusius, blogai susisukusius baltymus, kontroliuoja daugumos baltymų gyvenimo trukmę, generuoja peptidinius antigenus, reguliuoja signalo perdavimo kelius, transkripciją

Eukariotų ląstel÷se 26S proteosoma yra pagrindin÷ nelizosomin÷ peptidaz÷, kuri panaudodama ATP skaido pažym÷tus ubikvitinu baltymus. Ši molekulin÷ mašina (molekulin÷ mas÷ >2,5MDa) sudaryta iš dviejų subkompleksų – 20S proteosomos, sudarančios proteolitinę šerdį, ir 19S reguliatorin÷s dalel÷s.

52

52

1.43 pav. 26S proteosoma. 20S proteosoma yra cilindro formos baltyminis kompleksas, sudarytas iš dviejų skirtingų

subvienetų (α ir β), kurie susijungę po 7 suformuoja keturis žiedus. Išorinius cilindro žiedus sudaro α, o du vidinius žiedus - β subvienetai. Taigi 20S proteosoma yra α7β7β7α7 kompleksas. Ji sudaro 14,8nm ilgio ir 11,3nm diametro tuščiavidurį cilindrą, turintį centrinį kanalą (diametras ~ 1,3nm) ir tris dideles ertmes. Vidinę ertmę (~5nm diametro), suformuoja β žiedai. Fermento aktyvus centras išsid÷stęs β subvieneto centrin÷je ertm÷je. Prokariotų proteosomų aktyviame centre rasta treonino aminorūgštis. Šios proteosomos gali būti skaitomos naujo tipo peptidaz÷mis greta jau žinomų serino- asparto- cisteino- ir metalopeptidazių. Proteosomos turi minimun penkis endopeptidazinius aktyvumus – hidrolizuoja peptidinį ryšį po teigiamų, neigiamų ir hidrofobinių aminorūgščių liekanų. Susidarę 3-30 aminorūgščių oligopeptidai, išeina iš proteosomos ir citozolinių peptidazių suskaidomi iki aminorūgščių.

1.44 pav. 20S proteosomos (A) ir šaperonino GroEL vaizdas

53

53

Febs letters 2005

19S reguliatorin÷ dalel÷ dengia 20S proteosomos dalį, ji disocijuoja į dvi dalis –pagrindą ir dangtelį. Pagrindas sudarytas iš 6 subvienetų turinčių ATPazinį aktyvumą. ATP hidroliz÷s energija panaudojama degraduojamo baltymo išsukimui ir patekimui į 20S komplekso kanalą. Dangtelis dengia pagrindą, jis atpažįsta ubikvitinizuotus baltymus ir atskelia ubikvitino molekules. Ubikvitinas n÷ra suskaidomas, o grįžta į citozolį. 19S dalel÷ prisijungdama prie vieno ar abiejų 20S dalel÷s galų atidaro arba uždaro proteosomos kanalą ir reguliuoja baltymų patekimą.

1.45 pav. Proteosomų veikimo schema /Nature review. Molecular Cell Biology vol. 5,

p177-187, 2004 Ubikvitinizuotas baltymas prisijungia prie 19S subvieneto, panaudojant ATP hidroliz÷s

energiją baltymas išsukamas ir polipeptidin÷ grandin÷ įlenda į 20S komplekso kanalą. 19S reguliatorin÷ dalel÷ hidrolizuoja izopeptidinį ryšį ir atpalaiduoja ubikvitiną, kuris gali pažym÷ti kitus degraduojamus baltymus. Baltymas gali įeiti tiek N- tiek C-galu. β subvienetuose yra peptidaz÷s aktyvus centars, kuriame baltymai suskaidomi iki 7-13 aminorūgščių oligonukleotidų, kurie išeina iš proteosomos pro laisvą, neuždengtą 19S dalele galą..

26S kompleksas degraduoja ubikvitinizuotas baltymus, tuo tarpu 20S proteosoma in vitro skaido tiktai denatūruotus ar oksiduotus baltymus.

Baltymų ubikvitilinimo ir skaidymo pažeidimas gali sukelti įvairius patologinius nukrypimus. Sutrikus baltymų skaidymui, organizme padid÷ja „nenormalių“ baltymų koncentracija. Pagreit÷jęs baltymų skaidymas gali sumažinti reikalingų baltymų kiekį. Žmogaus papilomos virusas aktyvuoja E3 fermentą ir did÷ja ubikvitinizacija ir p53 proteoliz÷. Baltymas p53 reguliuoja DNR reparaciją, gali išsivystyti nekontroliuojamas ląstelių dalijimasis. Ubikvitilinimo pažeidimai gali sukelti cistinę fibrozę, skatinti neurodegeneratyvines ligas (Alzhaimerio, Parkinsono, Kreutzfeldo-Jakobso).

1.6.3 Lizosomos.

54

54

Lizosomose yra apie 40 tipų hidrolitinių fermentų, tai yra įvairios peptidaz÷s (vadinamos katepsinais), nukleaz÷s, glikozidaz÷s, lipaz÷s, fosfolipaz÷s, fosfataz÷s, sulfataz÷s ir kiti fermentai. Lizosomų membranoje yra H+ ATPaz÷, kuri perneša protonus į lizosomas ir palaiko lizosomų viduje rūgštų pH (pH~5,0). Dauguma lizosominių baltymų yra glikozilinti, tai juos apsaugo nuo žemo pH ir savų peptidazių. Lizosomose degraduojami ilgai gyvenantys membraniniai baltymai, taip pat baltymai patenkantys endocitoz÷s, autofagijos, fagocitoz÷s keliais. Kai kurie citozoliniai baltymai turi specialią aminorūgščių seką (KFERQ), jie pernešami į lizosomas nuo receptorių priklausomu keliu. Lizosomose yra skirtingo specifiškumo endo- ir egzopeptidaz÷s. Pagrindin÷s lizosomin÷s endopeptidaz÷s yra D ir L katepsinai. Katepsinai B ir H bei dipeptidil-peptidaz÷ I, kuri turi endo- ir egzopeptidazinius aktyvumus. Lizosomose randamos dipeptidaz÷s ir tripeptidaz÷s, kurios suskaido oligopeptidus iki aminorūgščių. Susidariusios laisvos aminorūgštys ir nedideli oligopeptidai (di- tri-) pernešami į citozolį, kur jie suskaidomi ar panaudojami medžiagų apykaitos procesuose. 1.7 Ketvirtin ÷ baltymų struktūra

Gamtoje sutinkama daug oligomerinių baltymų sudarytų iš kelių polipeptidinių grandinių, vadinamų subvienetais, sujungtų nekovalentiniais ryšiais. Šių subvienetų erdvinis išsid÷stymas vadinamas baltymo ketvirtine struktūra. Dauguma baltymų, kurių molekulin÷ mas÷ >100kDa sudaryti iš to paties ar skirtingų tipų subvienetų. Ketvirtinę struktūrą palaiko silpni vandeniliniai, elektrostatiniai, hidrofobiniai ryšiai. Subvienetus lengva atskirti vienus nuo kitų pakeitus tirpalo pH ar joninę j÷gą. Ketvirtin÷ baltymų struktūra yra svarbi įvairiais aspektais: • reguliuoja fermento katalizinį aktyvumą, baltymo kinaz÷ A sudaryta iš dviejų katalizinių ir

dviejų reguliatorinių subvienetų. Reguliatoriniams subvienetams prisijungus cAMP, jie disocijuoja ir fermentas įgauna kinazinį aktyvumą.

• padidina baltymo veikimą, pavyzdžiui hemoglobino molekul÷je yra stebimas deguonies prisijungimo kooperatyvus efektas,

• suartina fermento aktyvaus centro funkcines grupes ir suformuoja aktyvų centrą. Fermentas β−galaktozidaz÷ skaido laktozę tiktai susijungus keturiems subvienetams,

• stebima genetin÷ ekonomija, reikalingas tiktai vienas genas koduoti subvienetą • padid÷ja baltymo stabilumas, sumaž÷ja santykis paviršius/tūris, hidrofobin÷s grup÷s esančios

subvieneto paviršiuje paslepiamos globul÷s viduje, oligomeras yra stabilesnis negu monomerai.

Hemoglobinas sudarytas iš 4 subvienetų, dviejų α ir dviejų β (α2β2). Kiekvienas subvienetas suriša molekulinį deguonį, tačiau tetramero efektyvumas didesnis. Kalio jonų kanalas KcsA yra sudarytas iš keturių subvienetų, kurių kiekvienas turi po du transmembraninius segmentus. Susijungę keturi subvienetai suformuoja labai specifišką kanalą ir kalio jonai praeina per membraną tarp šių subvienetų. Fermentas aspartato transkarbamoilaz÷ sudaryta iš dviejų tipų subvienetų: 6 katalizinių ir 6 reguliatorinių.

55

55

1.46 pav. Hemoglobino struktūra

56

56

2 FERMENTAI Organizme chemin÷s reakcijos dideliais greičiais vyksta specifinių baltyminių

katalizatorių vadinamų fermentais d÷ka. Fermentai yra baltymai, greitinantys chemines reakcijas. Dauguma ląstel÷s baltymų yra fermentai, kai kurie struktūriniai baltymai kaip aktino ir miozino kompleksas pasižymi kataliziniu aktyvumu. Yra rasta daugiau nei 3500 skirtingų fermentų ir jų skaičius nuolat auga.

Fermentų panaudojimas ir tyrimas prasid÷jo gilioje senov÷je. Procesai, kurių metu yra virškinami baltymai, angliavandeniai, riebalai, gaunamas vynas, rauginamas pienas yra greitinami baltyminių katalizatorių. 1835m. Bercelius (J.Berzelius) parod÷, kad amilaz÷ skaido krakmolą, tai buvo pirma nuoroda į kataliz÷s reiškinius biologin÷se sistemose. 19a. viduryje Pasteras (L.Pasteur) padar÷ išvadą, kad cukraus virtimas į alkoholį miel÷se yra katalizuojamas “fermentų” ir šis procesas buvo pavadintas fermentacija. Pasteras galvojo, kad šis procesas vyksta tiktai gyvuose organizmuose ir neatskiriamas nuo natyvios ląstelin÷s struktūros. Ši vitalizmo teorija gyvavo ilgus metus. Biuchneris (E.Buchner) 1897m. parod÷, kad ir suardytų mielių ląstelių ekstraktai fermentuoja cukrų į alkoholį tokiu pat būdu kaip ir gyvos ląstel÷s. Kiunas (F.H.Kühne) 1876m. biologiniams katalizatoriams išskirtiems iš mielių, dav÷ enzimų (gr.en+zyme miel÷se) vardą. Tod÷l fermentai dar yra vadinami enzimais, o mokslas tiriantis biologin÷s kataliz÷s ypatumus – enzimologija. Samneris (J.Sumner) 1926m. išskyr÷ ir gavo fermento ureaz÷s, skaidančios karbamidą iki NH3 ir CO2, kristalus. Jis parod÷, kad šie kristalai yra baltymai ir postulavo, kad visi fermentai yra baltymai. Teiginys, kad fermentai yra baltymai galutinai buvo patvirtintas tik po to, kai Nortropas (J.Nortrop) ir Kunicas (M.Kunitz) gavo virškinimo fermentų pepsino ir tripsino kristalus ir parod÷ jų baltyminę kilmę. Šiuo metu yra nustatyta, kad katalizin÷mis savyb÷mis pasižymi kai kurios RNR ir jom buvo duotas ribozimų vardas. Taip pat galima gauti katalizinius antikūnus, greitinančius kai kurių medžiagų virsmus, jie pavadinti abzimais.

Kaip katalizatoriai fermentai turi visas nebiologiniams katalizatoriams būdingas savybes: 1. Efektingi mažose koncentracijose. 2. Reakcijos metu nepasikeičia. 3. Katalizatoriai neveikia reakcijos pusiausvyros, jie katalizuoja ir tiesioginę ir grįžtamą reakcijas

ir tiktai padidina reakcijos pusiausvyros pasiekimo greitį. Kadangi katalizatoriai greitina tiek tiesioginę, tiek grįžtamą reakciją, tod÷l jie negreitina

termodinamiškai nevykstančių procesų. Būdami baltymais jie turi visas jiems būdingas savybes. Katalizinis aktyvumas priklauso

nuo natyvios baltymo konformacijos. Jeigu baltymas denatūruojamas ar disocijuoja į subvienetus katalizinis aktyvumas prarandamas. Suskaidžius fermentą iki aminorūgščių, jis visada netenka katalizinio aktyvumo. Fermentai neatsparūs temperatūros, rūgščių, šarmų, druskų ir kitų chemiškai agresyvių medžiagų poveikiui.

Fermentai gana ryškiai skiriasi nuo nebiologinių katalizatorių: 1. Fermentai yra specifiški, jie dažniausiai katalizuoja tiktai vieno substrato virtimą produktu,

reakcijos metu nesusidaro pašalin÷s medžiagos. Fermentai skaidantys baltymus, nekatalizuoja nukleorūgščių virsmų ir atvirkščiai. Yra fermentų, kurie atskiria net optinius izomerus, tai yra aukščiausias specifiškumo lygis. Pvz. D-aminorūgščių oksidaz÷s oksiduoja tiktai D-aminorūgštis, o L-aminorūgščių oksidaz÷s - tik L-aminorūgštis. Mažiausias reaguojančios molekul÷s struktūros pakitimas gali pakeisti fermentin÷s reakcijos greitį.

57

57

2. Fermento aktyvumas žymiai didesnis negu nebiologinių katalizatorių. Fermentų katalizuojamos reakcijos yra 1010 -1016 kartų greitesn÷s negu be katalizatoriaus. Fermentin÷s reakcijos greitis keliom eil÷m didesnis, negu veikiant cheminiais katalizatoriais. Viena fermento katalaz÷s molekul÷ per sekundę suskaido per 40000000 vandenilio peroksido molekulių į vandenį ir deguonį.

3. Fermentų veikla yra reguliuojama, priklausomai nuo ląstel÷s, organizmo poreikių fermento aktyvumą galima padidinti arba sumažinti. Tai yra viena iš svarbiausių fermentų savybių. Fermentinis aktyvumas gali būti reguliuojamas juos kovalentiškai modifikuojant, proteolitiškai aktyvuojant, alosteriškai reguliuojant, prijungiant įvairius reguliatorinius baltymus, aktyvatorius, slopiklis.

4. Fermentin÷s reakcijos vyksta švelniose sąlygose - atmosferos sl÷gyje, reakcijos terp÷s pH neutralus, temperatūra neaukšta. Priešingai - cheminiai katalizatoriai dažnai veikia aukštoje temperatūroje ir sl÷gyje, esant didel÷ms rūgščių ar šarmų koncentracijoms.

2.1 Fermentų klasifikacija ir nomenklat ūra

Intensyvus enzimologijos vystymasis suk÷l÷ daug painiavos fermentų pavadinimuose. Anksčiau, kiekvienas mokslininkas naujai atrastam fermentui suteikdavo savo vardą pagal radimo vietą ar bendrą katalizuojamą reakciją. Fermentas, katalizuojantis maisto virškinimą buvo pavadintas pepsinu (graikiškai pepsis reiškia virškinimą), lizocimas gavo pavadinimą d÷ka savo sugeb÷jimo lizuoti bakterijas. Atsirado tokie biologinių katalizatorių vardai kaip tripsinas, pepsinas. Padaug÷jus ištirtų fermentų skaičiui, fermento vardas buvo sudaromas iš substrato, kurio virsmus katalizuoja fermentas pavadinimo ir galūn÷s -az÷, pvz. arginaz÷, maltaz÷. Kadangi skirtingi fermentai gali veikti į skirtingas substrato molekul÷s vietas, tai fermentus prad÷jo vadinti taip, kad būtų išreikšta veikimo kryptis, pvz. laktato dehidrogenaz÷.

1961m. buvo įvesta vieninga fermentų klasifikacija. Šios klasifikacijos pagrindu yra paimta chemin÷ reakcija, kurią katalizuoja fermentas. Fermentų klasifikaciją ir nomenklatūrą galima rasti internete /http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ Fermentas įgauna pavadinimą susidedanti iš: a) substrato pavadinimo , b) žodžio, kuris nustato chemin÷s reakcijos tipą ir turi galūnę -az÷.

Fermentai skirstomi į 6 klases: 1. Oksidoreduktaz÷s. 2. Transferaz÷s. 3. Hidrolaz÷s. 4. Liaz÷s. 5. Izomeraz÷s. 6. Ligaz÷s (sintetaz÷s). 1. Oksidoreduktaz÷s katalizuoja oksidacijos-redukcijos procesus. Dauguma šios klas÷s fermentų yra vadinami dehidrogenaz÷mis, kai kurie oksidaz÷mis, oksigenaz÷mis peroksidaz÷mis ar reduktaz÷mis.

C2H5OH + NAD CH3CHO + NADH + H

Alkoholiodehidrogenaz÷

++

2. Transferaz÷s katalizuoja reakcijas, kurių metu chemin÷s grup÷s pernešamos tarp atskirų molekulių. Grup÷s pernešimo reakcijose substrato molekul÷ dažnai kovalentiniu ryšiu prisijungia prie fermento ar kofermento.

58

58

O

CH2

CH2

COO

COO

H

CH2

CH2

COO

H3N

COO

O

CH3

COO

C HH3N

CH3

COO+

-

+ C

-

C+

-

-

C

-

+

-

Alaninas α-Ketoglutaratas Piruvatas Glutamatas

Alanino aminotransferaz÷

Šiai grupei priklauso kinaz÷s, katalizuojančios fosforilo pernešimą nuo ATP ant substrato. 3. Hidrolaz÷s katalizuoja reakcijas, kurių metu vyksta viduje molekulių esančių cheminių ryšių hidrolitinis skaidymas. Jos yra transferazių speciali klas÷, pernešančių atitinkamas chemines grupes ant vandens.

P O

O

O

O

P O

O

O

OH P O

O

O

H2O+- -

--

-

-2

Pirofosfatas Fosfatas

Pirofosfataz÷

4. Liaz÷s katalizuoja reakcijas, kurių metu funkcin÷s grup÷s prijungiamos prie dvigubų ryšių arba dvigubas ryšis susidaro, pašalinant chemines grupes.

CH3

O

CH3

OH

O O

OO

+

Piruvatodekarboksilaz÷

C

-

C C

C

Piruvatas Acetaldehidas Anglies dioksidas

+ H+

5. Izomeraz÷s katalizuoja izomerizacijos reakcijas (grup÷s pernešamos molekul÷s viduje).

OCH2OPO3

HH

OHH

OH

OH

HOH

H O

CH2OPO3

H

OH

H

H

OHOH

CH2OH

2- 2-

Gliukoz÷s 6-fosfatas Fruktoz÷s 6-fosfatas

Gliukoz÷s 6-fosfato izomeraz÷

6. Ligaz÷s katalizuoja naujų cheminių ryšių (C-C, C-S, C-O, C-N) susidarymą kondensacijos reakcijose, naudojant ATP didžiaenergių ryšių skilimo energiją.

59

59

H

CH2

CH2

COO

H3N

COO

H

CH2

CH2

CONH2

H3N

COO

C+

-

-

+ ATP + NH4+

C+

-

+ ADP + Pn

Glutamino sintetaz÷

Glutamatas Glutaminas Kiekviena klas÷ dalinama į poklasę, ši skirstoma į popoklasę. Kiekvienam fermentui yra

suteikiamas fermentų komisijos (EC - Enzyme Commission) numeris, pvz. EC 1.1.1.1 - pirmas skaičius nurodo klasę, antras - poklasę, trečias - popoklasę, o paskutinis fermento eil÷s numerį. Fermento, oksiduojančio alkoholį, tradicinis ir plačiai naudojamas pavadinimas yra alkoholio dehidrogenaz÷, pagal pasiūlytą EC nomenklatūrą jis vadinamas alkoholio: NAD oksidoreduktaz÷ (EC 1.1.1.1). ( 1 klas÷ - oksidoreduktazių klas÷, 1 poklas÷ – veikia į CH-OH grupes, 1 popoklas÷ – elektronų ir protonų akceptorius NAD ar NADP, 1 - pirmas eil÷s numeris). Fermentų komisijos rekomenduota klasifikacija ir nomenklatūra privaloma mokslin÷se publikacijose, tačiau praktikoje plačiai naudojami trivialūs pavadinimai. Fermento aktyvumo vienetai

Fermento aktyvumas išreiškiamas panaudoto substrato ar susidariusio produkto koncentracijos pokyčiu per laiko vienetą. Daugumoje atvejų fermento molin÷ koncentracija n÷ra žinoma, tod÷l Tarptautin÷ fermentų komisija 1961m pasiūl÷ fermento vieneto sąvoką. Tarptautinis fermento vienetas (IU), (labai dažnai jis vadinamas fermento vienetu (U)), tai yra fermento kiekis, kuris katalizuoja 1µµµµmol substrato virtimą į produktą per vieną min, esant optimaliom sąlygom. Optimalios reakcijos sąlygos yra optimalus pH, optimali temperatūra, šios sąlygos kiekvienam fermentui gali būti skirtingos.

1972 metais pereinant prie SI sistemos buvo rekomenduota naudoti katalą. Katalas yra fermento kiekis, katalizuojantis 1M substrato virtimą į produktą per 1s. Vienas katalas lygus 6*107 tarptautinių vienetų. Tai yra labai didelis vienetas ir praktiškai retai naudojamas. Fermento specifinis aktyvumas yra fermento vienetų skaičius vienam mg baltymo (U/mg) arba SI sistemoje katalų skaičius 1 kg fermento (kat/kg).

Atskirais atvejais atitinkamos laboratorijos įsiveda savo fermento vieneto sąvokas. Pavyzdžiui restrikcijos endonukleazių vienas fermentinis vienetas yra fermento kiekis per 60min hidrolizuojantis 1µg DNR, reakcijos terp÷s tūris yra 50µl.

2.2 Fermentinis kataliz÷s esm÷

Fermentinę reakciją galime užrašyti šia lygtimi E + S ES EP E + P

kur E, S ir P yra atitinkamai - fermentas, substratas ir produktas. Susidarę fermento ir substrato bei fermento ir produkto kompleksai atitinkamai žymimi ES ir EP. Katalizatoriaus funkcija yra padidinti reakcijos greitį, pagreitinant pusiausvyros pasiekimą. Chemin÷ reakcija gali būti aprašoma reakcijos potencialine kreive (2.1 pav.)

60

60

2.1 pav. Reakcijos potencialin÷ kreiv÷ nekatalizuojamai (A) ir katalizuojamai (B) reakcijai.

Pagrindiniame būvyje kiekviena substrato ar produkto molekul÷ turi charakteringą laisvosios energijos kiekį. Į kurią pusę vyks fermentin÷ reakcija nurodo substrato ir susidariusio produkto pagrindinių būvių laisvosios energijos reikšm÷s. Jeigu substrato pagrindinio būvio energija didesn÷ nei produkto, laisvosios energijos (Gibso energijos) skirtumas ∆∆∆∆G<<<<0 yra neigiamas, tai chemin÷ reakcija nukreipta į produkto susidarymo pusę, jei ∆∆∆∆G>0, chemin÷ reakcija nukreipta į substrato susidarymo pusę, pusiausvyra nusistovi, kai ∆∆∆∆G = 0.

Chemin÷s reakcijos A + B = C + D laisvosios energijos ∆G pokytis išreiškiamas lygtimi

[A][B]

[C][D]RTlnGG 0 +∆=∆

Laisvosios energijos pokytis priklauso nuo standartin÷s laisvosios energijos pokyčio ∆G0, reaguojančių medžiagų koncentracijų, temperatūros (T) ir dujų konstantos (R). Laisvosios energijos pokyčiai matuojami standartin÷se sąlygose (temperatūra 298K, dujų sl÷gis 1atm., reagentų koncentracija 1M). Šis laisvosios energijos pokytis vadinamas standartiniu laisvosios energijos pokyčiu ir žymimas ∆G0. Reakcijos gyvame organizme vyksta vandeniniuose tirpaluose, kur vandenilio jonų koncentracija lygi 10-7g-ekv./l, vandens koncentracija yra 55,5M, tod÷l biochemijoje įvertinamos šios sąlygos ir standartinis laisvosios energijos pokytis žymimas ∆∆∆∆G0/. Chemin÷s reakcijos savaimingai vyksta laisvosios energijos maž÷jimo kryptimi. Kaip matome iš pav.2.1 produkto pagrindinio būvio laisvoji energija žemesn÷ nei substrato, taigi reakcija vyksta produkto susidarymo kryptimi. Pusiausvyros neveikia katalizatorius. Kad pusiausvyra nukreipta į produkto susidarymą dar nereiškia, kad substrato virtimo į produktą greitis yra didelis. Reakcijos greitis priklauso nuo energetinio barjero, kurį reikia įveikti, pereinant substratui į produktą.

Šis energetinis barjeras atspindi energiją, reikalingą tarpinių nestabilių krūvių susidarymui, cheminių ryšių persitvarkymui ir kitoms transformacijoms, reikalingoms chemin÷s

61

61

reakcijos vyksmui. Ši “kalno“ viršūn÷, kur chemin÷ reakcija gali vykti tiek produkto tiek substrato susidarymo kryptimi yra vadinama pereinamuoju būviu.

Pereinamasis būvis n÷ra fiksuotas cheminis tarpininkas. Tai yra trumpalaikis molekulinis momentas, kai cheminių ryšių susidarymas vyksta tam tikru momentu, o produkto ar substrato susidarymo tikimyb÷ yra vienoda. Kad vyktų reakcija, molekul÷s turi pereiti šį barjerą, tai yra jos turi gauti papildomos energijos. Pereinamojo būvio gyvenimo trukm÷ trumpa ~10-13s. Jo energija yra didel÷ , jis labai nestabilus.

Energijos skirtumas tarp pagrindinio ir pereinamojo būvio vadinamas aktyvacijos energija (∆EA). Aktyvacijos energija yra tas energijos kiekis, kurį reikia suteikti molekulei, kad susidarytų pereinamąsis būvis ir įvyktų chemin÷ reakcija. Reakcijos greitį atspindi ∆EA, kuo aktyvacijos energija mažesn÷, tuo reakcijos greitis didesnis.

Kiekvienos chemin÷s reakcijos greitis lygus reaguojančių medžiagų koncentracijos ir reakcijos greičio konstantos, žymimos simboliu k, sandaugai. Jeigu turime monomolekulinę reakciją S→P, tai reakcijos greitis lygus V=k[S], čia turime pirmo laipsnio reakciją, reakcijos greičio konstantos dimensija yra (s-1). Jeigu reakcijoje dalyvauja du substratai, tai reakcijos greitis priklauso nuo abiejų substratų koncentracijų V=k[S1] [S2], k yra antro laipsnio reakcijos greičio konstanta, jos dimensija (M-1s-

1). Iš pereinamojo būvio teorijos nustatyta, kad ryšys tarp reakcijos greičio konstantos ir

aktyvacijos energijos išreiškiamas šia lygtimi:

RT

E-/ A

ehTk

=k

k/-Bolzmano konstanta (k/=1,381x10-23J/K) h-Planko konstanta ( h=6,626x10-34J s) R-dujų konstanta (8,315 J/mol K) T- absoliuti temperatūra.

Reakcijos greitį galima padidinti keliant temperatūrą, tuo pačiu didinat molekulių, turinčių pakankamai energijos pereiti aktyvacijos barjerą, skaičių. Tačiau fermentai yra baltymai, pak÷lus temperatūrą jie denatūruojasi. Kitas būdas padidinti reakcijos greitį yra sumažinti aktyvacijos energiją. Katalizatoriai padidina reakcijos greit į, sumažindami aktyvacijos energiją. Kinetinis barjeras vienodai sumažinamas tiek tiesioginei tiek grįžtamai reakcijoms, tod÷l katalizatorius jas vienodai greitina. Šį principą gerai iliustruoja vandenilio peroksido H2O2 skilimas. Organizme šią reakciją katalizuoja, esantis kraujyje, ląstelių peroksisomose, fermentas katalaz÷.

H2O2

Katalaz÷H2O + 1/2O2

2.1 lentel÷je pateikti duomenys akivaizdžiai rodo, kad fermentas veikia žymiai efektyviau nei nebiologinis katalizatorius ir ryškus reakcijos greičio padid÷jimas sąlygojamas aktyvacijos energijos sumaž÷jimo. 2.1 lentel÷. Vandenilio peroksido skaidymo reakcijos greičiai ir aktyvacijos energija

Katalizatorius Reakcijos greitis V /sant. vienetai/

Aktyvacijos energija ∆EA

kJ/mol be katalizatoriaus 1 75

Pt 2 104 50 Katalaz÷ 108 8-12

62

62

Praktiškai reakcijos metu susidaro keli tarpiniai fermento substrato (ES) ar fermento produkto (EP) kompleksai, kurie užima reakcijos potencialin÷je kreiv÷je “sl÷nius” (2.1B pav.). Bendrą reakcijos greitį sąlygoja ta stadija, kurios ∆EA didžiausias. Chemin÷s reakcijos pusiausvyra priklauso nuo ∆∆∆∆G0/ , o reakcijos greitis nuo ∆∆∆∆EA. Standartin÷se sąlygose pusiausvyros konstanta žymima K pus.' ir yra lygi:

[S]

[P]'K pus. =

Ryšys tarp laisvosios energijos pokyčio ir pusiausvyros konstantos duotas lentel÷je 2.2 ir aprašomas lygtimi:

∆G0/ =-RTln[ K pus.' ]

2.2 lentel÷. Ryšys tarp pusiausvyros konstantos ir laisvosios energijos pokyčio K pus.' ∆G0/ J/mol

10-6 34,2 10-3 17,1 10-1 5,7 1 0 101 −5,7 103 −17,1

Kaip matome, kuo ∆G0/ neigiamesnis tuo reakcijos pusiausvyra labiau pastumta į produkto susidarymo pusę.

Kod÷l fermentai greitina reakcijas? Iš kur gaunama energija reikalinga sumažinti ∆EA? Fermentai yra ypatingai efektyvūs katalizatoriai. Esant fermentams reakcijos greitis gali

padid÷ti 1010-1016 kartų. Reaguojant fermentui su substratu susidaro fermento substrato kompleksas. Šio komplekso susidarymo aktyvacijos energija yra žemesn÷ negu tiesiogiai iš substrato gauti produktą. Reakcija yra nukreipiama mažiau energijos reikalaujančiu keliu. Reaguojant substratui ir fermentui tarp aktyvaus centro katalizinių grupių ir substrato molekulių susidaro trumpalaikiai cheminiai ryšiai, kurie aktyvuoja reaguojančias medžiagas. Energija, reikalinga ∆EA sumažinimui, gaunama iš silpnų, nekovalentinių ryšių, susidarančių tarp substrato ir fermento. Susidarant kiekvienam silpnam ryšiui (vandeniliniam, elektrostatiniam, hidrofobiniam ar van der Valso) išsiskiria nedidelis energijos kiekis. Sąveikos metu išsiskyrusi energija vadinama surišimo energija. Surišimo energija yra pagrindinis laisvosios energijos šaltinis, kurį fermentas panaudoja aktyvacijos energijos sumažinimui.

Fermentų veikimą aiškina du pagrindiniai fundamentalūs principai : 1. Fermento katalizin÷ j÷ga gaunama d÷ka laisvosios energijos, kuri išsiskiria susidarant

silpniems ryšiams tarp substrato ir fermento. 2. Fermento aktyvus centras yra komplementarus ne substratui, bet reakcijos, kurią

katalizuoja fermentas, per÷jimo būvio tarpininkui. Silpna sąveika tarp fermento ir substrato yra optimizuojama per÷jimo būvyje. Aktyvus centras geriau prijungia pereinamojo būvio tarpininką nei substratą ar produktą.

63

63

2.3 Fermentinių reakcijų kinetika

Tiriant fermentinių reakcijų mechanizmus labai svarbu yra susipažinti su fermentinių reakcijų kinetika. Nustačius fermentin÷s reakcijos greičio priklausomybę nuo įvairių aplinkos faktorių, galima prognozuoti fermentinių reakcijų mechanizmus. Griežtas fermentinių reakcijų kinetikos aprašymas yra gana sud÷tingas, tod÷l kinetin÷s lygtys dažnai labai supaprastinamos, aprašomi tiktai pagrindiniai modeliai. Modelių matematin÷ analiz÷ reikalinga tam, kad būtų galima patikslinti ar pasiūlytas mechanizmas sutinka su eksperimentuose gautais kinetiniais rezultatais. Pagrindinis fermentin÷s kinetikos tyrimo tikslas yra panaudojus gautą eksperimentinį rezultatą geriau suprasti fermento veikimo molekulinį mechanizmą.

Fermentin÷s reakcijos greitis priklauso nuo įvairių faktorių: • reaguojančių medžiagų chemin÷s prigimties, • temperatūros, • vandenilio jonų koncentracijos, • substrato koncentracijos • įvairių aktyvatorių ar slopiklių. 2.3.1 Fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo temperatūros.

Fermentin÷s reakcijos kaip visos chemin÷s reakcijos didinant temperatūrą greit÷ja. Pak÷lus temperatūrą 10 laipsnių chemin÷s reakcijos greitis padid÷ja 2-3 kartus. Kadangi fermentai yra baltymai, tai temperatūrai pasiekus 60-700C, jie denatūruojasi, suyra aktyvus centras ir fermentin÷s reakcijos greitis maž÷ja. Fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo temperatūros vaizduojama varpo formos kreive.

Įvairūs fermentai pasiekia maksimalų greitį, esant įvairioms temperatūroms, jie turi skirtingą temperatūrinį maksimumą. Dažniausiai jis yra lygūs 300-400C. Tačiau fermentų, išskirtų iš termofilinių bakterijų, gyvenančių aukštos temperatūros vandenyse, šis maksimumas yra žymiai didesnis (80-900C).

2.3.2 Vandenilio jonų koncentracijos įtaka fermentin÷s reakcijos greičiui

Fermentin÷s reakcijos greitis priklauso nuo terp÷je esančių vandenilio jonų koncentracijos. Baltymo molekul÷je yra poliniai aminorūgščių šoniniai radikalai, kofaktoriai, kurių jonizacijos laipsnis priklauso nuo pH. Jie sudaro fermento aktyvų centrą ar palaiko baltymo tretinę struktūrą. Substrato molekul÷s taip pat gali būti jonizuotos ir su fermentu jungiasi tik viena forma - teigiama, neigiama ar neutrali. Tiriant reakcijos greičio priklausomybę nuo pH, daugumoje atveju gaunama varpo formos kreiv÷ (2.2 pav.). Dažniausiai fermentai yra aktyvūs, esant neutraliam terp÷s pH, jų veikimo optimumas yra arti 7,0. Tačiau skrandyje esančio proteolitinio fermento pepsino pH optimumas yra 1,5. Šarmin÷s fosfataz÷s yra aktyviausios, esant pH ∼ 10.

64

64

2.2 pav. Fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo vandenilio jonų koncentracijos. A – tripsinas, B - pepsinas

Kod÷l pakeitus vandenilio jonų koncentraciją kinta fermentin÷s reakcijos greitis? Dideli pH pokyčiai pakeičia baltymo struktūrą, jis denatūruoja, suyra aktyvus centras ir fermentas praranda savo aktyvumą. Nedideli pH pokyčiai gali pakeisti:

1) substrato jonizacijos laipsnį, tod÷l substratas sunkiau jungiasi su fermentu, 2) kofaktorių susirišimą su baltymu, 3) aktyviame centre esančių aminorūgščių disociaciją, tod÷l:

a) pakinta fermento susijungimas su substratu, b) sumaž÷ja kataliz÷s greitis, nes aminorūgščių funkcin÷s grup÷s nebegali būti

protonų donorais ar akceptoriais ir dalyvauti rūgštin÷je-bazin÷je kataliz÷je. Tiriant fermentin÷s reakcijos greičio priklausomybę nuo pH, galima apskaičiuoti funkcinių

grupių, esančių fermento aktyviame centre pK ir tuo pačiu nustatyti, kokia aminorūgštis yra aktyviame centre. Tačiau šiuos rezultatus reikia vertinti labai atsargiai. Baltymo molekul÷je aminorūgščių funkcinių grupių pK gali kisti priklausomai nuo hidrofobin÷s ar hidrofilin÷s apsupties. Pavyzdžiui, greta lizino esantis teigiamas radikalas gali sumažinti ε−NH2 grup÷s pK, o neigiamas krūvis jį padidinti. Šios amino grup÷s pK baltyme gali skirtis 2 ir daugiau vienetų nuo jos reikšm÷s tirpale.

2.3 lentel÷. Kai kurių fermentų pH optimumai

Fermentas pH optimumas Pepsinas 1,5 Katalaz÷ 7,6 Tripsinas 7,7 Arginaz÷ 9,7 2.3.3 Substrato koncentracijos įtaka fermentin÷s reakcijos greičiui.

Vienas iš pagrindinių faktorių veikiančių fermentin÷s reakcijos greitį yra substrato koncentracija. Fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo substrato koncentracijos aprašoma hiperbole ir pavaizduota 2.3 pav. Esant žemoms substrato koncentracijoms reakcijos greitis tiesiogiai priklauso nuo jo koncentracijos, kaip būdinga pirmojo laipsnio reakcijoms. Toliau didinant substrato koncentraciją reakcijos greitis l÷t÷ja ir pasiekiamas pastovus greitis, kuris vadinamas maksimaliu reakcijos greičiu (Vmax). Šioje kreiv÷s dalyje fermentin÷s reakcijos greitis aprašomas kaip nulinio laipsnio reakcija. Did÷jant substrato koncentracijai reakcijos greitis neauga, mes turime prisotinimą, ir visas fermentas yra susijungęs su substrato molekul÷mis.

65

65

2.3 pav. Fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo substrato koncentracijos

Fermentin÷s reakcijos greičio priklausomybei nuo substrato koncentracijos paaiškinti 1903m Anri (V.Henri) pasiūl÷, kad fermentas (E) susijungia su substratu (S), susidaro fermento substrato (ES) kompleksas, kuris skyla į fermentą ir produktą (P). Kiekybiškai šis procesas buvo aprašytas 1913m Michaelio (L.Michaelis) ir Menten (M.Menten). Jie matavo fermento invertaz÷s, kuri katalizuoja sacharoz÷s skilimą į gliukozę ir fruktozę, pradinio reakcijos greičio (Vo) priklausomybę nuo substrato koncentracijos. Gautiems rezultatams paaiškinti buvo pateiktas paprastas modelis. Jie pasiūl÷, kad fermentas susiriša su substratu, susidaro tarpinis fermento substrato kompleksas, kuris v÷liau skyla į fermentą ir produktą.

E + S ES E + Pk+1 k+2

k-1 k-2 kur k+1 fermento substrato komplekso susidarymo iš substrato ir fermento greičio konstanta k-1 fermento substrato komplekso disociacijos į fermentą ir substratą greičio konstanta k+2 fermento substrato komplekso skilimo į fermentą ir produktą greičio konstanta k-2 fermento substrato komplekso susidarymo iš fermento ir produkto greičio konstanta Fermento substrato komplekso skilimas į fermentą ir produktą yra reakcijos greitį limituojanti stadija.

Michaelio ir Menten interpretacija buvo pagilinta 1925m Brigso (G.E.Briggs) ir Haldano (J.B.S.Haldane). Jie įved÷ reakcijos stacionarumo sąlygą: fermento substrato komplekso

koncentracija laikui b÷gant yra pastovi d[ES]

dt= 0 . Susidaręs ES suyra dviem keliais - disocijuoja

į fermentą ir substratą arba skyla į produktą ir fermentą. Galima įvesti pažym÷jimą, kad bendra fermento koncentracija E0 yra lygi: [E0]=[E]+[ES], kur [E] yra laisvo fermento koncentracija, o [ES] fermento koncentracija, esanti fermento substrato komplekse.

Tiriant fermentin÷s reakcijos greičio priklausomybę nuo substrato koncentracijos, reikia įvertinti tą faktą, kad fermentai katalizuoja grįžtamas reakcijas ir susidaręs produktas gali virsti substratu. Tod÷l matuojamas pradinis reakcijos greitis V0, kai substrato koncentracija žymiai didesn÷ negu fermento ir fermento substrato komplekso susidarymas praktiškai nepakeičia substrato koncentracijos. Matuojant pradiniu laiko momentu, substrato koncentracijos pokyčiai yra labai nežymūs, susidariusio produkto koncentracija labai nedidel÷, tod÷l į k-2 galime nekreipti d÷mesio. Fermentin÷s reakcijos greitis aprašomas lygtimi

E + S ES E + Pk+1 k+2

k-1 Pradinis reakcijos greitis išreiškiamas šia lygtimi:

66

66

[ES]kdt

dP

dt

dSV 20 +==−=

Kadangi [ES] ir k+2 eksperimentiškai išmatuoti yra sunku, tai V0 apskaičiuojame, išreiškiant ES koncentraciją kitais būdais. ES susidarymo greitis V0

/ = k+1[E][S] ES skilimo greitis V0

// = k-1[ES] + k+2[ES]

Kadangi d[ES]

dt= 0

tai [ES] koncentracija yra pastovi, fermento substrato komplekso susidarymo

ir skilimo greičiai yra vienodi. k+ + −

+ + + −

− − == −

− − − =

1[E][S] k [ES] k [ES] 0

[E] [E ] [ES]

k [E ][S] k [ES][S] k [ES] k [ES] 0

2 1

o

1 o 1 2 1 [ES](k+1[S]+k+2 +k-1) = k+1[Eo][S]

[ES]k [E ][S]

k [S] k k1 o

1 2 1

=+ +

+

+ + − skaitiklyje ir vardiklyje esančias reikšmes padaliname iš k+1

[ES][E ][S]

[S]k k

k

o

2 1

1

=+ ++ −

+

Santykis k k

k+1

+ −+2 1 buvo pažym÷tas KM ir ši konstanta pavadinta Michaelio konstanta.

bK

k k

kM2 1

1

= ++ −

+

Reakcijos greitis yra produkto susidarymo greitisV k [ESo 2= + ] , taigi V

k [E ][S] K [S] o

2 o M

= +

+

(1) Gavome Michaelio ir Menten lygties išraišką. Panagrin÷kime konkrečius atvejus: 1) Paimkime sąlygas, kai [S] >> KM Šiuo atveju reakcijos greitis bus lygus Vo = k+2[Eo] = Vmax, reakcijos greitis nepriklauso nuo substrato koncentracijos ir apsprendžiamas tik fermento substrato komplekso skilimo į produktą greičio konstantos ir pradin÷s fermento koncentracijos. Kadangi fermentin÷s reakcijos greitis nepriklauso nuo substrato koncentracijos, pasiekiamas maksimalus reakcijos greitis, kuris žymimas Vmax. Michaelio ir Menten lygties (1) išraišką galime pertvarkyti:

2) Jeigu substrato koncentracija žymiai mažesn÷ nei KM ([S]<<KM ), tai lygtis

(2) transformuojama į:

VV [S]

K [S]omax

M

=+

67

67

M

max0 K

[S]VV =

Esant mažom substrato koncentracijoms reakcija yra pirmo laipsnio ir gauname tiesinę fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷s nuo substrato koncentracijos dalį (2.3 pav.)

2.3.4 Michaelio konstantos prasm÷

Pasinaudodami lygtimi (2) galime išsiaiškinti KM prasmę. Paimame 2max

0

VV = ir įstatę į (2) lygtį

gauname, kad KM = [S]. Tokiu būdu, Michaelio konstanta yra lygi substrato koncentracijai, kuriai esant reakcijos greitis yra lygus pusei maksimalaus. KM yra substrato koncentracijos, reikalingos efektyviai katalizei, matas. KM turi substrato koncentracijos dimensiją (M). Kaip matome, heksokinaz÷ katalizuoja fosforilinimą dviejų heksozių – gliukoz÷s ir fruktoz÷s, tačiau gliukoz÷ yra žymiai geresnis substratas, reakcijos maksimalus greitis pasiekiamas, esant gliukoz÷s koncentracijai 30 kartų mažesnei negu fruktoz÷s. 2.4 lentel÷. Kai kurių fermentų KM. Fermentas Substratas KM (mM) Heksokinaz÷ ATP

D-gliukoz÷ D-fruktoz÷

0,4 0,05 1,5

Piruvato karboksilaz÷

HCO3-

piruvatas ATP

1,0 0,4 0,06

Karboanhidraz÷ Bikarbonatas 12,0 β-galaktozidaz÷ D-laktoz÷ 4,0 2.3.5 Fermentinių reakcijų kinetin÷s konstantos Daugumos fermentų katalizuojamų reakcijų greičio priklausomyb÷ nuo substrato koncentracijos išreiškiama hiperbole ir kinetika aprašoma Michaelio ir Menten lygtimi (išimtis yra reguliuojami fermentai). Vmax ir KM yra nustatomi kiekvienam individualiam fermentui, tačiau šie parametrai duoda nepakankamai informacijos apie fermentin÷s reakcijos atskirų etapų skaičių, greitį. Įvairių fermentų KM gali smarkiai kisti net tam pačiam fermentui, priklausomai nuo substrato prigimties (lentel÷ 2.4).

Michaelio ir Menten lygtyje reakcijos greitį limituojanti konstanta yra k+2, kai k+2<<k-1

tada KM tampa lygi k-1/k+1, ji yra vadinama ES komplekso disocijacijos konstanta Ks. 1

1s k

kK

+

−=

Esant šioms sąlygoms, KM atspindi fermento giminingumą substratui ES komplekse. Kartais

k+2>>k-1 , tada KM = k+2/k+1. Kai konstantų k+2 ir k-1 dydžiai yra panašaus dydžio tada KM yra visų trijų konstantų funkcija.

Įvairių fermentų Vmax taip pat žymiai skiriasi. Jeigu fermentin÷ reakcija vyksta tiktai per vieną ES tarpininką, tada Vmax lygus k+2[Eo]. Tačiau dažnai fermentin÷se reakcijose susidaro keli tarpiniai fermento substrato kompleksai ir

E + S ES E + Pk+1 k+2

k-1 k-2

EPk+3

k-3

68

68

reakciją limituojanti stadija n÷ra ES skilimo į produktą etapas. Prisotinimo atveju dauguma fermento yra EP formoje ir reakcijos greitį sąlygoja konstanta k+3 Tod÷l buvo įvestas bendresnis parametras, kuris atspindi reakciją limituojančią stadiją. Tokia konstanta buvo pavadinta katalizin÷ konstanta (kkat). Michaelio ir Menten lygtyje kkat yra lygi k+2.

Kaip buvo parodyta 2.3 pav. reakcijos greitis tampa pastovus, kai substrato koncentracija yra didel÷. Šiuo atveju fermentas yra pilnai prisotintas substratu, reakcijos greitis yra nulinio laipsnio ir art÷ja prie maksimalaus. Reakcijos greitis yra užrašomas viena iš šių formulių:

][Ek][EkVV 0kat02max === + (3)

Reakcijos greičio konstanta k+2 tampa lygi katalizinei reakcijos greičio konstantai kkat, kadangi prisotinimo substratu atveju visos fermento molekul÷s yra ES formoje.

Pertvarkius (3) lygtį gauname: ][E

Vk

0

maxkat =

Katalizin÷ konstanta yra lygi Vmax padalintam iš viso fermento koncentracijos, arba tai yra substrato molekulių skaičius, kurį viena fermento molekul÷ paverčia produktu per vieną sek. Katalizin÷ konstanta yra fermento veikimo matas, kokiu greičiu fermentas katalizuoja reakciją. Ji yra dar vadinama fermento apsisukimų skaičius. 2.5 lentel÷. Kai kurių fermentų apsisukimų skaičius

Fermentas Substratas kkat (s-1)

Katalaz÷ H2O2 40 000 000 Karboanhidraz÷ HCO3

−

1 000 000

Acetilcholino esteraz÷ Acetilcholinas 140 000 β-laktamaz÷ Benzilpenicilinas 2 000 Fumaraz÷s Fumaratas 800 Lizocimas Peptidoglikanas 0,5

Kinetin÷s konstantos kkat ir KM paprastai naudojamos tiriant ir palyginant įvairių fermentų veikimą. Norint įvertinti fermento efektyvumą, nei viena konstanta to pilnai neatspindi. Du fermentai, katalizuojantys skirtingas reakcijas gali tur÷ti tą pačią kkat . Be to, kkat charakterizuoja fermentą, kai jis yra prisotintas substratu. Fiziologin÷se sąlygose substrato koncentracija yra neaukšta ir fermentas yra retai prisotintas substratu.

Fermento kataliziniam aktyvumui nusakyti geriausia yra įvertinti abi konstantas kkat ir KM. Kai KM >>[S] reakcijos greitį galime išreikšti:

]][S[EK

k

[S]K

][S][EkV 0

M

kat

M

0kat0 =

+=

Faktorius kkat/KM yra geriausias kinetinis parametras lyginant fermentų katalizinį efektyvumą. V0 priklauso nuo dviejų reaguojančių medžiagų [E0] ir [S], tod÷l ši lygtis yra antro laipsnio reakcijos greičio lygtis ir konstanta kkat/KM antro laipsnio reakcijos greičio konstanta, kurios dimensija yra M-1s-1. Esant substrato koncentracijai žemiau prisotinimo lygio, šio parametro viršutin÷ riba yra greitis, kuriuo substratas ir fermentas difunduoja vandeniniame tirpale, tai yra difuzijos greitis. Difuzijos kontroliuojama greičio konstanta yra 108-109 M-1s-1 . Paprastai fermento katalizuojamos reakcijos greitis negali viršyti difuzijos kontroliuojamo substrato susijungimo su fermentu greičio. Kai kuriuose fermentiniuose kompleksuose stebimas tunelinis efektas, kai reakcijos produktai pereina nuo vieno fermento aktyvaus centro ant kito, be susimaišymo su terpe, tada kkat/KM yra didesn÷.

69

69

2.6 lentel÷. Įvairių fermentų kkat, KM ir kkat/KM Fermentas Substratas kkat (s

-1) KM (M) kkat / KM (M-1 s-1)

Pepsinas -Phe-Gly- 0.14 3*10-4 1,7*103

Acetilcholino esteraz÷

Acetilcholinas 1,4*104 9*10-5 1,6*108

Karboanhidraz÷ Bikarbonatas 4,0*105 2,6*10-2 1,5*107 Fumaraz÷ Fumaratas 8*102 5*10-6 1,6*108 β-laktamaz÷ Benzilpenicilinas 2,0*103 2*10-5 1*108 2.3.6 KM ir V max nustatymo metodai,

Iš principo KM ir Vmax galima eksperimentiškai nustatyti iš fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷s nuo substrato koncentracijos grafiko (2.3 pav.), tačiau taip apskaičiuota Vmax reikšm÷ yra netiksli. Esant labai didel÷ms substrato koncentracijoms V0 asimptotiškai art÷ja prie Vmax, tačiau praktiškai jį pasiekti yra labai sunku. Fermentin÷s reakcijos yra grįžtamos, fermento aktyvumą gali inhibuoti didel÷s tiek substrato, tiek produkto koncentracijos.

Praktikoje KM ir Vmax nustatymui naudojama Michaelio ir Menten lygties transformuota išraiška, kurią pasiūl÷ Lainuiveras (H.Lineweaver) ir Berkas (D.Burk).

VV [S]

K [S]omax

M

=+

Apskaičiavus fermentin÷s reakcijos greičio priklausomybę 1/V0 nuo substrato koncentracijos

[S]V

[S]K

V

1

max

M

0

+=

maxmax

M

0 V

1

S

1

V

K

V

1 +=

a) kai 1/[S] = 0, tada 1/V0 = 1/Vmax b) kai 1/V0 = 0, tada 1/[S] = -1/KM

-1/KM

1/V0

1/[S]

1/Vmax

V0

V0/[S]

AB

Vmax

Vmax/KM

Nuokrypis = -KM

-KM

[S]/V0

[S]

C

Nuokrypis = 1/Vmax

2.4 pav. Fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo substrato koncentracijos Lainuivero Berko (A), Edi ir Hofšti (B) ir Heines ir Vulf koordinat÷se.

Nubraižius fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷s nuo substrato koncentracijos atvirkštin÷se koordinat÷se (1/V0 nuo 1/[S]) grafiką, gauname tiesę, ties÷s susikirtimo su abscisių

70

70

ašimi taškas yra lygus -1/KM, o susikirtimo su ordinačių ašimi taškas lygus 1/Vmax. Kreiv÷s nuokrypis yra KM/Vmax. Šio metodo trūkumas yra tas, kad dauguma eksperimentinių taškų grupuojasi kair÷je grafiko dalyje, kur substrato koncentracijos yra didel÷s. Tod÷l matuojant V0 , esant mažoms substrato koncentracijoms, net nedidel÷s eksperimentin÷s klaidos duoda didelius netikslumus KM ir Vmax. reikšm÷se.

Edi (G.S.Eadie) ir Hofšti (B.H.J.Hofstee) KM ir Vmax skaičiavimui pasiūl÷ kitą Michaelio ir Menten lygties transformaciją. Atidedant V0 prieš V0/[S] gauname tiesę, ant abscisių ašies atkertančią atkarpą lygią Vmax/KM, o ant ordinačių – Vmax. Ties÷s nuokrypis lygus –KM (2.4B pav.). Skaičiuojant Edi ir Hofšti metodu gaunamos tikslesn÷s Michaelio konstantos ir Vmax reikšm÷s.

Heines (Hanes) ir Vulf (Woolf) pasiūlytoje transformacijoje ant ordinačių ašies atidedamas [S]/V0 o ant abscisių – [S]. Atid÷jus eksperimentinius taškus (2.4Cpav.), gaunama ties÷, kuri ant abscisių ašies atkerta –KM, o ant ordinačių KM/Vmax.

2.3.7 Daugiasubstratin÷s fermentin÷s reakcijos

Dauguma fermentų katalizuoja reakcijas, dalyvaujant dviem ar daugiau substratų. Pavyzdžiui gliukoz÷, katalizuojant heksokinazei, reaguoja su ATP ir virsta gliukoz÷s 6-fosfatu.

Gliukoz÷ + ATP gliukoz÷s 6-fosfatas +ADP Tokios reakcijų kinetika taip pat aprašoma Michaelio ir Menten lygtimi. Esant keliems substratams, galimi įvairūs fermento ir substrato ar fermento ir produkto kompleksų susidarymo keliai. Substrato ir fermento sąveika gali būti atsitiktin ÷ (a) kai kiekvienas substratas atsitiktinai sudaro trinarį ES1S2 kompleksą. Prisijungimas gali būti tvarkingas (b) kai vienas substratas prisijungia pirmas, kitas po to.

E + S1 + S2 ES1S2 E +P1 + P2

ES1

ES2

(a)

. .

E +P1 + P2(b)E + S1

ES1 + S2ES1S2

Fosforilinant gliukozę, prie fermento heksokinaz÷s pirma prisijungia gliukoz÷, o tiktai po to ATP Ping-pong mechanizmas (c) Šiuo atveju pradžioje prie fermento prisijungia pirmas substratas. Antras substratas (S2) prisijungia tiktai po to, kai atsipalaiduoja pirmas produktas (P1).

E + S1ES1 E'P1

E' E'S2 E + P2

P1S2

(c)

Toks mechanizmas sutinkamas malonil-KoA biosintez÷je, kurią katalizuoja malonil-KoA sintetaz÷ ir kituose procesuose. 2.4 Fermentų slopikliai (inhibitoriai)

Slopikliais (inhibitoriais) vadinamos medžiagos, kurios l÷tina fermentin÷s reakcijos greitį. Šis reiškinys yra labai paplitęs gamtoje, kadangi specifin÷s, nedidel÷s molekulin÷s mas÷s medžiagos, metalų jonai, prisijungdami prie fermento gali keisti fermentin÷s reakcijos greitį, reguliuoti įvairius metabolinius procesus. Dauguma toksinių medžiagų, vaistų slopina atitinkamus fermentus, tuo pasireiškia jų naudingas ar žalingas veikimas. Pavyzdžiui aspirinas

71

71

(acetilsalicilo rūgštis) slopina ciklooksigenazę (ji dar vadinama prostaglandinų H2 sintaz÷), fermentą, dalyvaujantį pradin÷se prostaglandinų sintez÷s stadijose ir mažina žmogaus kūno temperatūrą, inhibuoja trombocitų agregaciją ir kraujo kreš÷jimą. Ciklooksigenaz÷s aktyvumas slopinamas acetilinant fermento aktyviame centre esantį seriną. Vaistas metotreksatas, naudojamas onkologijoje, slopina fermentą dihidrofolato reduktazę ir stabdo navikinių ląstelių dauginimąsi. Gerai žinomas nuodas cianidas, blokuoja mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷s fermentą citochromo c oksidazę ir mažina ATP sintez÷s greitį. Fermentų slopikliai plačiai panaudojami fermento aktyvaus centro, jo veikimo mechanizmo tyrimui.

Fermentui, reaguojant su slopikliu (I) susidaro fermento slopiklio (EI) kompleksas. Priklausomai nuo EI komplekso tvirtumo (nuo slopinimo konstantos Ki ) slopinimas gali būti grįžtamas ir negrįžtamas .

E + I EIk+i

k-i

E + S ES E + P

K i =[E] [I]

[EI] Jeigu k+i >> k-i, tai slopinimas negrįžtamas , jeigu k+i≤k -i, tai - grįžtamas. Negrįžtamo slopinimo atveju susidaręs EI kompleksas labai l÷tai disocijuoja. Diizopropilfluorfosfatas, zarinas yra žinomi nervinių dujų komponentai, jie kovalentiškai prisijungia prie fermento acetilcholino esteraz÷s aktyviame centre esančios aminorūgšties serino hidroksigrup÷s ir negrįžtamai blokuoja fermentą. Nervinio impulso perdavimas sustabdomas ir ištinka raumenų paralyžius. Alkilinantys agentai, tokie kaip jodacetamidas, p-chlormerkuribenzoatas, prisijungdami prie fermento aktyviame centre esančios aminorūgšties cisteino merkaptogrup÷s taip pat negrįžtamai stabdo fermento veikimą.

(CH3)2CHOP F

CH3

O

Zarinas

(CH3)2CHOP F

(CH3)2CHO

O

Diizopropilfluorfosfatas Grįžtamo slopinimo atveju, sumažinus slopiklio koncentraciją (dializuojant tirpalą) fermento slopiklio kompleksas lengvai disocijuoja į laisvą fermentą ir slopiklį, fermento aktyvumas atsistato. Grįžtamas slopinimas skirstomas į konkurencinį, nekonkurencinį, bekonkurencinį, mišrų ir kitus. Esant konkurenciniam slopinimui slopiklis ir substratas jungiasi prie tos pačios fermento vietos ir didel÷s substrato koncentracijos sumažina slopiklio veikimą. Slopiklis reaguoja tiktai su laisvo fermento molekule.

EI

E + S ES E + P+I

k+1

k-1

kk+2

Ki

72

72

)I]/K[(1K[S]

[S]VV

iM

max0 ++

=

Dažnai substratas ir slopiklis turi panašias struktūras ir konkuruoja vienas su kitu d÷l susirišimo su fermento aktyviuoju centru. Klasikinis konkurencinio slopinimo pavyzdys yra fermento sukcinato dehidrogenaz÷s veikimo stabdymas. Šio fermento aktyvumą blokuoja malono rūgštis. Slopiklio struktūra yra labai panaši į substrato turi viena -CH2- mažiau, jie abu sąveikauja su ta pačia fermento aktyvaus centro vieta. Padidinus gintaro rūgšties koncentraciją, sumaž÷ja malono rūgšties poveikis ir atvirkščiai.

COOH

CH2

CH2

COOH

FAD

COOH

CH

HC

COOH

FADH2

COOH

CH2

COOH

+ +

Gintaro rūgštis Fumaro rūgštis Malono rūgštis

Alkoholio dehidrogenaz÷ katalizuoja etilo ir metilo alkoholių oksidaciją. Metanolis yra labai nuodingas, net nedideli jo kiekiai sukelia apakimą ir mirtį. Metanolio oksidacijos produktas formaldehidas yra labai toksiškas. Apsinuodijus metanoliu duodama gerti ar leidžiamas į kraują etanolis. Etanolis ir metanolis konkuruoja tarpusavyje d÷l prisijungimo prie fermento aktyvaus centro, tod÷l dideli etilo alkoholio kiekiai apsaugo organizmą nuo metanolio poveikio.

Statino vaistai gali būti konkurencinių slopiklių pavyzdžiai. Atrovastatinas, simvastatinas reaguoja su hidroksimetilglutaril-KoA reduktaze (HMG-KoA reduktaz÷ žr sk) ir slopina pirmą cholesterolio biosintez÷s reakciją. Vaisto struktūra yra panaši į hidroksimetilglutaril- KoA

O-KoA

C O

OOH

CH3

O

OH

C O

OOH

H

O

CH3

CH3

- -

HMG-KoAsubstratas

Lovastatinaskonkurencinis inhibitorius

Nekonkurencinio slopinimo atveju substratas ir slopiklis reaguoja ne su ta pačia fermento vieta ir substrato perteklius nesumažina slopiklio poveikio. Slopiklis gali nepriklausomai prisijungti prie laisvo fermento ir prie fermento substrato komplekso ir sudaryti EI ar EIS kompleksus. Nekonkurencinis slopiklis sumažina laisvo fermento, galinčio susijungti su substratu, koncentraciją.

73

73

E + S ES E + P+I

+I

EI + S EIS

k+1

k-1

k+2

KiK i

Nekonkurencinio slopinimo metu substratas ir slopiklis nekonkuruoja tarpusavyje.

Pradinis reakcijos greitis išreiškiamas formule

Mi

max0 K)[I]/K[S](1

[S]VV

++=

Bekonkurencinio slopinimo metu slopiklis reaguoja tik su ES, o nereaguoja su laisvu E.

Bekonkurencinio slopiklio prijungimas iššaukia fermento aktyvaus centro konformacinius pakitimus ir fermentin÷s reakcijos greičio sumaž÷jimą.

E + S ES E + P

+

I

EIS

K i

Norint nustatyti slopinimo rūšį, matuojama fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo substrato koncentracijos, esant ir nesant slopikliui. Nubraižoma priklausomyb÷ 1/V0 nuo 1/[S].

1/V0

1/[S]

1/V0

1/[S]-1/KM

1/Vmax

1/V0

1/[S]

A B C

+I-I

+I

+I-I-I

2.5 pav. Fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo substrato koncentracijos konkurencinio (A) ir nekonkurencinio (B) ir bekonkurencinio (C) slopinimo atvejais

Konkurencinio slopinimo metu, esant didel÷m substrato koncentracijoms, substratas pilnai išstumia slopiklį iš fermento aktyvaus centro, tod÷l Vmax nekinta, o KM did÷ja (2.5A pav.). Nekonkurencinio slopinimo metu Vmax sumaž÷ja, o KM nekinta.

74

74

Mišraus slopinimo atveju slopiklis jungiasi ne prie aktyvaus centro, bet prie kitos srities. Jis gali prisijungti arba prie E arba prie ES. Mišraus slopiklio poveikyje kinta ir tiek KM, tiek Vmax.

Praktikoje mišrus ir bekonkuretinis slopinimas dažniausiai stebimas, kai fermentas raeguoja su dviem ar daugiau substratų.

Alosterinį slopinimą apžvelgsime nagrin÷dami fermentų reguliaciją (skyrius 2.9.3) Yra rastos chemin÷s medžiagos, kurios pačios yra netoksiškos, tačiau patekusios į organizmą jos metabolizuojamos ir susidarę produktai slopina fermentų veikimą. Tokios medžiagos yra vadinamos save žudantys slopikliai. Sintetinant naujus vaistus yra labai svarbu nustatyti ne tiktai naujų cheminių medžiagų , bet ir ląstel÷je susidariusių metabolitų poveikį gyvybin÷ms organizmo funkcijoms. Plačiai žinoma yra fluoracto rūgštis, sutinkama kai kuriuose augaluose ir naudojama kaip pesticidas. Fluoracto rūgštis organizme susijungia su KoA, susidaręs fluoracetil-KoA virsta į fluorcitratą, kuris inhibuoja fermentą akonitazę.

F CH2

C

O

S KoA

H

C

C

CH2

COO

COO

F

OH

COO

CH2

COOF ~-

-

-

-

KoA-SH

Fluoracetatas Fluoracetil-KoA Fluorcitratas Trikarboksirūgščių ciklas yra blokuojamas, organizme kaupiasi citrinos rūgštis ir gyvūnas žūna (žr. sk. ). Fluoruracilas naudojamas kaip priešv÷žinis vaistas. Jis organizme paverčiamas į fluordeoksiuridilatą, kuris inhibuoja timidilato sintazę, stabdoma aktyvi DNR sintez÷, tod÷l sul÷t÷ja ląstelių dalijimasis (žr. sk.). 2.5 Fermentų kofaktoriai

Dažnai į fermentų sud÷tį be baltymin÷s dalies įeina nedidel÷s molekulin÷s mas÷s organin÷s medžiagos ar jonai, kurie vadinami kofaktoriais ir kurie yra būtini fermento veikimui. Fermentų kofaktorius galima suskirstyti į dvi grupes: 1. Kofermentai 2. Metalų jonai Kofermentais vadinamos nedidel÷s molekulin÷s mas÷s organin÷s medžiagos, kurios būdamos fermento aktyviame centre dalyvauja kataliz÷je. Vienas iš plačiausiai sutinkamų kofermentų yra NAD.

glicerolio aldehido 3-fosfatas

1,3-bisfosfoglicerolio rūgštis

NAD+

NADH + H+

pieno rūgštis

piruvo rūgštis

GAPDH LDH

Veikiant glicerolio aldehido 3-fosfato dehidrogenazei (GAPDH), glicerolio aldehido 3-fosfatas oksiduojasi ir redukuojamas NAD+. Susidaręs NADH disocijuoja nuo fermento, susijungia su laktato dehidrogenaze (LDH) ir redukuoja piruvo rūgštį. Tokiu būdu NAD pagalba elektronai ir protonai nuo glicerolio aldehido 3-fosfato yra pernešami ant piruvo rūgšties.

75

75

Kofermentai yra silpnai susirišę su fermentu ir pašalinami nuo baltymo jį dializuojant. Baltymin÷ fermento dalis yra vadinama apofermentu, o kofermento ir apofermento junginys, t.y. pilnas fermentas - holofermentu. Holofermentas = apofermentas + kofermentas

Tiriant kofermentų cheminę struktūrą buvo parodyta, kad labai dažnai į kofermentų sud÷tį įeina vitaminai ar jų dariniai. Žmogaus organizmas nesugeba sintetinti vitaminų, tod÷l jų negaunant su maistu, nesusidaro kofermentai, sutrinka atitinkamų fermentų veikla, pakinta medžiagų apykaita. Fermentinių reakcijų metu kofermentai chemiškai pakinta (oksiduojami, redukuojami, prijungiamos įvairios funkcin÷s grup÷s), tačiau veikiant tam pačiam ar kitiems fermentams yra regeneruojami. Kai kada yra sunku atskirti kofermentą nuo kosubstrato, kosubstratai yra pastoviai regeneruojami ir pakartotinai dalyvauja reakcijose. Jeigu kofermentas prisijungęs prie apofermento stipriu kovalentiniu ryšiu, jis yra vadinamas prostetine grupe, (tai gali būti FAD, FMN, biotinas, lipo rūgštis). Pavyzdžiui fermente sukcinato dehidrogenaz÷je FAD yra prijungtas kovalentiniu ryšiu ir dializuojant fermentą jis n÷ra pašalinamas. Pagrindiniai kofermentai pateikti 2.7 lentel÷je. 2.7 lentel÷. Kofermentų pavyzdžiai

Kofermentas Katalizuojamos reakcijos tipas Reakcijos metu pernešama grup÷

Kofermento sud÷tyje esantis

vitaminas NAD, NADP oksidacijos - redukcijos reakcija hidrido jonas niacinas(PP) FAD, FMN oksidacijos - redukcijos reakcija protonai ir

elektronai riboflavinas

(B2) Kofermentas Q

(KoQ) oksidacijos - redukcijos reakcija protonai ir

elektronai

Kofermentas A (KoA)

acilo grup÷s aktyvacija ir pernaša R-CO- pantoteno rūgštis(B5)

Lipo rūgštis acilo grup÷s pernaša, oksidacija-redukcija

R-CO- lipo rūgštis

Tiamindifosfatas aldehido grup÷s pernaša R-CHO tiaminas (B1)

Biotinas karboksilinimas Bikarbonatas biotinas (H) Piridoksalfosfatas peramininimas

dekarboksilinimas racemizacija

-NH2 CO2

piridoksinas (B6)

Tetrahidrofolio rūgštis

vieno anglies atomo pernešimas -CH 3 -CHO -CH2-

folio rūgštis (Bc)

Ciankobalaminas deoksiadenozil-

kobalaminas metilkobalaminas

vidumolekuliniai persitvarkymai ribonukleotidų redukcija

metilo grup÷s pernešimas

-CH3

B12

2.5.1 Nikotinamidiniai kofermentai

76

76

Nikotinamidadenindinukleotidas (oksiduotas, redukuotas, fosforilintas oksiduotas ir fosforilintas redukuotas) šios formos atitinkamai žymimos NAD+, NADH, NADP+, NADPH. NAD dalyvauja daugelyje oksidacinių redukcinių reakcijų, kuriose nuo substrato (S) yra paimami ir pernešami elektronai ir protonai. Žinoma daugiau nei 200 fermentų, kurie katalizuoja vandenilio atomo (protono ir elektrono) pernešimą nuo substrato ant NAD+ ar NADP+. Šie fermentai priklauso oksidoreduktazių klasei, tačiau paprastai jie vadinami dehidrogenaz÷mis.

SH2 + NAD+ S + NADH + H

++

2H , 2e -

N

COOH CONH2

N

N

NCH3

Nikotino rūgštisNiacinasVitaminas PP

Nikotinamidas Nikotinas

Į nikotinamidinių kofermentų sud÷tį įeina vitaminas PP arba niacinas. Esant jo trūkumui susergama pelagra.

N

N N

N

NH2

O

H

OH

H

OH

HH

P

O

O

H2CO

P

O

O

O

H

OH

H

OH

HH

H2C

N

CONH2

O

+

NADP molekul÷je prie 2' anglies atomo riboz÷je prijungta fosforo rūgšties liekana

O-

-

2 '

Nikotinamidadenindinukleotidas (fosfatas)

Kaip matome iš chemin÷s formul÷s į NAD‘o sud÷tį įeina du nukleotidai - nikotinamido ir adenino, kurie sujungti esteriniu ryšiu. NADP molekul÷je fosforo rūgštis prijungta prie adeninnukleotido riboz÷s 2/ anglies atomo.

Nežiūrint į tai, kad NAD molekul÷ yra didel÷, reakcija vyksta tiktai su nikotinamido žiedu. Likusi molekul÷s dalis reikalinga kofermento prijungimui prie apofermento ir jo orientavimui aktyviame centre.

77

77

N

H

CONH2

+SH2 +

R

S +

N

HH

CONH2

R

H++

2e + 2H+-4

pro-Spro-R

4

2.7 pav. NAD redukcijos reakcija Nikotinamidiniai kofermentai (žinomi kaip piridininiai nukleotidai) yra elektronų ir

protono nešikliai. Reakcijoje nuo substrato ant NAD+ arba NADP+ yra pernešamas hidrido jonas. Oksiduojantis substratui NAD+ prisijungia du elektronus ir vieną protoną (hidrido H- joną), o vienas protonas išeina į terpę. Tiriant NADH ir NADPH struktūras buvo parodyta, kad nikotininiame žiede pozicija prie C-4 yra prochiralin ÷. Kaip parodyta paveiksle, vandenilio atomas nukreiptas nuo puslapio plokštumos į skaitytoją yra “pro-R” vandenilis, kadangi jį pakeitus deuteri anglies atomas įgauna R-konfigūraciją. Pakeitus kitoje žiedo plokštumos pus÷je esantį vandenilį gausime S-konfigūraciją. Fermentai, kurie naudoja nikotinamidinius kofermentus dažniausiai yra stereospecifiški jie paima vandenilį arba nuo pro-R arba pro-S pad÷ties. Fermento aktyvus centras yra asimetriškas. Reik÷tų pažym÷ti, kad į daugelio kofermentų ir kitų biologiškai aktyvių medžiagų sud÷tį įeina adenino žiedas. Daugelis baltymų, fermentų turi specialias nukleotidus, labai dažnai adeninnukleotidus, surišančias sritis. Jos yra domenuose, kurių struktūros yra panašios.

NAD ir NADP atlieka specializuotus vaidmenis. NAD+ dalyvauja katabolin÷je oksidacijoje, susidaręs NADH oksiduojamas mitochondrijose ir išsiskyrusi energija panaudojama ATP sintezei. NADPH pagrindinai susidaro pentozinių fosfato ciklo metu ir jis dalyvauja anaboliniuose procesuose - riebalų rūgščių, steroidų sintez÷je. Fermentai specifiškai prisijungia NAD ar NADP ir katalizuoja atitinkamas reakcijas. 2.5.2 Flavininiai kofermentai

Į flavininių kofermentų FAD (flavinadenindinukleotidas) ir FMN (flavinmononukleotidas) sud÷tį įeina vitaminas B2 arba riboflavinas (7,8-dimetil-10-(1/-D-ribitil)izoaloksazinas). Prie izoaloksazino žiedo yra prijungtas D-ribitolis. Ryšys tarp šių dviejų

78

78

medžiagų n÷ra glikozidinis, ir molekul÷ n÷ra “tikras” nukleotidas, tačiau istoriškai jis taip yra

vadinamas.

N

N N

N

NH2

O

H

OH

H

OH

HH

H2COP

O

O

O

C

CH2

HOH

C HOH

C HOH

CH2

N

N

N

N O

HO

CH3

CH3

Izoaloksazinas

D-ribitolis

Ribofla-vinas

PO

O

O

FMN

Flavinadenindinukleotidas

Flavinai yra geltonos spalvos, iš to kilęs jų pavadinimas (lotyniškai flavus yra geltonas). Oksiduotas izoaloksazino žiedas sugeria šviesą 450nm (matoma šviesa). Kada žiedas redukuojamas flavinas blykšta. Flavininiai kofermentai gali būti trijuose oksidaciniuose-redukciniuose būviuose. Pilnai oksiduotas flavinas prisijungia vieną elektroną ir protoną tampa semichinonu. Esant fiziologiniam pH m÷lynos spalvos (λmax = 570nm) semichinonas yra neutralus radikalas. Šarmin÷je terp÷je jis disocijuoja ir tampa raudonos spalvos (λmax= 490nm) anijoniniu radikalu. Prisijungus antram elektronui jis pilnai redukuojamas. Flavininiai kofermentai dalyvauja vieno ar dviejų elektronų pernešimo reakcijose, katalizuojamose sukcinato dehidrogenaz÷s, riebalų rūgščių acil-KoA dehidrogenaz÷s, mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷s NADH dehidrogenaz÷s ir kitų fermentų. Daugumoje flavoproteinų flavino nukleotidai prie baltymo prijungti silpnais nekovalentiniais ryšiais, kai kuriuose fermentuose pavyzdžiui sukcinato dehidrogenaz÷je, ryšys yra kovalentinis. Labai svarbi šių kofermentų savyb÷ yra ta, kad jų standartinis oksidacinis redukcinis potencialas keičiasi jungiantis jam su baltymu ir labai priklauso nuo hidrofobinio ar hidrofilinio apsupimo. Pavyzdžiui sukcinato dehidrogenaz÷je, surišto FAD‘o E0/ artimas 0, tuo tarpu laisvo FAD‘o E0/ = -0.219V.

79

79

N

N

N

N O

HO

CH3

CH3

R

N

N

N

N O

HO

CH3

CH3

H

H

R

N

N

N

N O

HO

CH3

CH3

H

C

R

N

N

N

N O

HO

CH3

CH3

C

R

H ,e+ -

2H ,2e+ -

FAD, FMN(geltonas)

FADH2, FMNH2

FADH, FMNH(semichinonas m÷lynas)

-

..

Semichinono anijonas (raudonas)

H ,e+ -

H ,e+ -

2.8 pav. FAD ir FMN oksidaciniai-redukciniai būviai.

2.5.3 Kofermentas Q

Kofermentas Q (KoQ) dar vadinamas ubichinonu, dalyvauja elektronų ir protonų pernešime nuo vieno fermento ant kito oksidacinio fosforilinimo ir fotosintez÷s procesų metu. Jis prisijungia vieną elektroną ir protoną, susidarant semichinonui arba prijungus 2 elektronus ir du protonus virsta pilnai redukuota forma ubichinoliu KoQH2.(žr. sk)

(CH2-CH=C-CH2)10-H

CH3

CH3O

CH3O

O

O

CH3

Ubichinonas KoQ 2.5.4 Kofermentas A Pantoteno rūgštis dar vadinama vitaminu B3 įeina į kofermento A (KoA) sud÷tį. Pantoteno rūgštis sujungta su 3/-fosfoadenozino difosfatu ir β−merkaptoetilaminu. Kofermentas aktyvuoja ir perneša acilo grupę, kuri prisijungia prie β−merkaptoetilamino -SH grup÷s, susidarant tioesteriams. Šio tioesterio hidroliz÷s energija aukšta (∆G0/ -31,4 kJ/mol) tod÷l acilo pernešimo potencialas yra didelis ir aktyvuota grup÷ lengvai prijungiama prie įvairių akceptorių. Norint pažym÷ti svarbų –SH grup÷s vaidmenį, kofermentas A dažnai žymimas KoASH. Aktyvuota acilo grup÷ dalyvauja acetoacetato, citrato, riebalų rūgščių

80

80

HS-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-C-C-CH2-O-P-O-P-O-CH2

CH3

CH3O

O

-

OH

H

O

O-

O3PO-2

N

N N

N

NH2

O

HH

OH

HH

β-merkaptoetilaminas

pantoteno rūgštis3'-fosfoadenozino difosfatas

sintez÷se, vaidina svarbų vaidmenį piruvato, α−ketoglutarato dehidrogenazin÷se reakcijose. Riebalų rūgščių sintaz÷je, acilą pernešančio baltymo (APB) sud÷tyje taip pat yra pantoteno rūgštis. KoA atlieka dvi pagrindines funkcijas:

a) aktyvuoja acilo grupę, b) aktyvuoja acilo grup÷s Cα vandenilio atomą, palengvindamas jo kaip protono

disocijaciją. Kaip nikotinamidiniuose ir flavininiuose kofermentuose, KoA adeninnukleotidinę dalį

atpažįsta apofermentas.

2.5.5 Lipo rūgštis Lipo rūgštis yra dviejose formose – atviros grandin÷s redukuota ir uždaro ciklo oksiduota

forma. Redukuota turi dvi –SH grupes, kurios gali grįžtamai oksiduotis iki -S-S-. Lipo rūgštis kovalentiškai prijungta prie baltymo molekul÷s lizino ε−aminogrup÷s. Ji perneša acilo liekaną ir randama tokiuose stambiuose fermentiniuose kompleksuose kaip piruvato ir α−ketoglutarato dehidrogenaz÷je. Lipo rūgštis sujungia acilo ir elektronų pernešimo reakcijas α−ketorūgščių oksidacijoje ir dekarboksilinimo (žr.sk).

SS

SHSH

COOH

O

NH NH

CO

SHS

COOH

CH3-CO

Lipo rūgštis, oksiduota forma lizinas baltymo polipeptidin÷ grandin÷

Lipo rūgštis, redukuota forma

C

Lipo rūgties acetilinta forma

~1,5nm

81

81

2.5.6 Tiamindifosfatas (TPP)

N

S

N

N

CH2

CH3

CH3

H

NH2

CH2

CH2

O P O P O

O

O O

O

+

2

rūgštinis protonas

- -

-

--

Į kofermento tiamindifosfato sud÷tį įeina vitaminas B1 (tiaminas). Jis yra oksidacinio dekarboksilinimo ir kitų fermentinių reakcijų kofermentas. Tiamindifosfatas dalyvauja reakcijose, kuriose cheminis ryšys, esantis šalia karbonilgrup÷s (keto ar aldehido) skaidomas arba sintetinamas. α−ketorūgščių (piruvo ar α−ketoglutaro) dekarboksilinimo reakcijose susidaro anglies dvideginis ir aldehidas. Acetolaktato sintazin÷je reakcijoje dvi piruvato molekul÷s kondensuojasi susidarant hidroksiketonui. Chemin÷s reakcijos vyksta prisijungiant atitinkamoms grup÷ms prie tiazolo žiede esančio C2 atomo. Protonas prie C2 yra rūgštinis, jis lengvai disocijuoja ir susidaręs karbanijonas yra labai reaktyvus. Prie tiazolo žiedo prisijungus karbonilgrupei, pagreit÷ja dekarboksilinimo reakcijos. Tiamindifosfatas yra kofaktorius tokių fermentų kaip piruvato dekarboksilaz÷, piruvato dehidrogenaz÷, α−ketoglutarato dehidrogenaz÷, transketolaz÷ ir kitų (žr. sk). 2.5.7 Biotinas

Biotinas dalyvauja daugelyje fermentinių karboksilinimo reakcijų, kaip karboksigrupių nešiklis. Biotinas yra kovalentiškai prisijungtas prie baltymo lizino ε−aminogrup÷s ir šis ε-N-biotinil-L-lizinas yra vadinamas biocitinu . Biotino žiedo sistema yra prijungta prie baltymo 1.6nm ilgio judria “ranka”, tod÷l karboksigrupę galima pernešti nuo vieno substrato ant kito. Biotinas sutinkamas įvairiuose fermentuose – acetil-KoA karboksilaz÷je, propionil-KoA karboksilaz÷je, piruvato karboksilaz÷je ir kituose (žr. sk.).

COOHS

NHNH

O

S

NHN

O

CONH

OH

O

C

Biotinas Karboksibiotinas sujungtas su baltymu

Biotinas labai tvirtai susiriša su randamu kiaušiniuose baltymu avidinu, tod÷l avidinas ir biotinas plačiai naudojami biotechnologiniuose procesuose įvairių medžiagų gryninimui. 2.5.8 Piridoksalfosfatas (PLP) Vitamino B6 (piridoksolis) biologiškai aktyvi forma yra kofermentas piridoksalfosfatas. Piridoksalfosfatas dalyvauja daugelyje aminorūgščių apykaitos reakcijų – peramininimo, α− ir β−dekarboksilinimo, β− ir γ−eliminacijos, racemizacijos ir aldolin÷s kondensacijos reakcijose. Šio kofermento chemin÷s savyb÷s susijusios su jo sugeb÷jimu sudaryti stabilias Šifo bazes su aminorūgščių α−amino grup÷mis, bei stabilizuoti reakcijos tarpininkus. Piridoksalfosfatas su

82

82

fermentu jungiasi kovalentiškai per lizino ε−aminogrupę (žr. sk.).

N

CH2OHOH

CH3

CHO

H

N

OH

CH3

H

CHO

N

CH2OHOH

CH3

CH2NH2

H

CH2 O P O

O

O

N

CH2OHOH

CH3

CH2OH

H

+ + +

Piridoksalis Piridoksalfosfatas Piridoksaminas

+

Piridoksolis 2.5.9 Tetrahidrofolio r ūgštis (THF)

Folio rūgšties dariniai (folatai) dalyvauja įvairiuose medžiagų apykaitos procesuose pernešant vieno anglies atomo funkcines grupes. THF yra 6-metilpterino junginys su p-aminobenzenkarboksirūgštimi ir glutamatu. Prie p-aminobenzenkarboksirūgšties gali prisijungti iki 7 glutamato molekulių.

NH

N

NH

NH

NH

CH2

HHH

ONH-CH-CH2-CH2-CO

n

5 COO-

CO

H2N

10

p-aminobenzen-karboksirūgštis

glutamatas (n=1-7)

O

6-metilpterinas

Tetrahidrofolatas (pteroilglutamo rūgšties anijonas)

-

Viduje ląstelių folatas yra paverčiami aktyvia forma - tetrahidrofolatu , redukuojant pteridino žiedą. Redukcija vyksta dviem etapais, katalizuojant NADPH atrankiai dihidrofolato reduktazei. Pirmoje redukcijos reakcijoje susidaro 7,8-dihidrofolatas, kuris redukuojamas iki tetrahidrofolato (5,6,7,8-tetrahidrofolatas).

83

83

NH

N

N

N

CH2

H

O NH

R

NH

N

N

N

CH2

H

O NH

R

H

HNH

N

CH2

H

O NH

R

H

H

H

N

NH

H2N H2N H2N

NADPH +H+

NADP+ NADPH +H+

NADP+

Folatas 7,8-Dihidrofolatas Tetrahidrofolatas (THF)

8 7

56

2.9 pav. Folato redukcijos reakcija.

Žinduoliai nesintetina folio rūgšties, tod÷l ją turi gauti su maistu arba ją sintetina žarnyno mikroorganizmai.

Dihidrofolato reduktaz÷ yra plačiai klinikoje naudojamų antimetabolitų veikimo taikinys. Antimetabolitai yra sintetiniai junginiai, dažnai metabolitų struktūriniai analogai, kurie įsiterpia į vietoje metabolito į sintetinamus junginius. Vieni iš tokių yra folato analogai – aminopterinas ir ametopterinas (metotreksatas). Jie per 1000 kartų stipriau susiriša su tetrahidrofolato reduktaze nei įprasti substratai ir slopina fermento aktyvumą. Šie vaistai plačiau naudojami kraujo v÷žio gydymui, inhibuodami timidino nukleotidų ir tuo pačiu DNR biosintezę. (žr.skyrių).

N

N

N

N

CH2

NH

NH2

NH2

O

Glu

N

N

N

NH

CH2

NCH3

NH2

NH2

O

NH

CH

CH2

CH2

COO

COO

C

Aminopterinas

C -

-

Ametopterinas (metotreksatas) Antibakteriniai vaistai sulfonamidai tokie kaip sulfanilamidas yra p-

aminobenzenkarboksirūgšties struktūriniai analogai. Jie pakeičia p-aminobenzenkarboksirūgštį folato molekul÷je ir inhibuojama THF sintez÷. Kadangi žinduoliai nesintetina THF tai sulfonamidai neveikia jų organizmų ir slopina tiktai mikroorganizmų dauginimąsi.

NH2 S NH

O

O

R NH2

O

Sulfonamidai(R=H, sulfanilamidas)

C OH

p-Aminobenzenkarboksirūgštis

84

84

Tetrahidrofolatas prisijungia vieno anglies atomą - metilo, metileno, formino pavidalu. Vieno anglies atomo fragmentai prijungiami prie THF rūgšties N-5, N-10 atomų arba sujungia N-5 ir N-10 atomus (2.11 pav.).

Tetrahidrofolatas prisijungia vieno anglies atomo fragmentą iš įvairių šaltinių. Katalizuojant formiltetrahidrofolato sintetazei nuo ATP priklausomu keliu formiatas aktyvuojamas ir susidaro N10-formil-THF (2.11 pav.(4)). Skaidant histidiną susidaro N5-formimino-THF. Tačiau dauguma organizmų aktyvuotą vieno anglies atomo fragmentą gauna iš serino β-anglies atomo arba oksiduojant gliciną (2.10 pav.). Pirma reakcija yra katalizuojama serino transhidrometilaz÷s. Šiai grįžtamai reakcijai reikalingas piridoksalfosfatas (PLP), kuris sudaro Šifo bazę su serinu.

NH

NH

CH2

H

N

N

CH2

H

CH2

H C

CH2OH

NH3

COO

CH2

COO

NH3

5

10

5

10

Serinas Tetrahidrofolatas Glicinas N5,N10-Metilen-THF

+-

+

-

+ +PLP

2.10 pav. N5,N10-metilen-tetrahidrofolio rūgšties sintez÷.

Daugiafermentinis kompleksas gliciną skaidanti sistema yra mitochondrijose, jis katalizuoja glicino skaidymą ir N5,N10-metilen-THF susidarymą. (2.11 pav.).

Kada aktyvuotas vieno anglies atomo fragmentas yra prijungtas prie tetrahidrofolio rūgšties, jis gali būti tiesiogiai panaudojamas biosintez÷ms arba vyksta jo oksidaciniai-redukciniai virsmai. 2.11 pav. parodytos pagrindin÷s reakcijos, kuriose dalyvauja vieno anglies atomo fragmentas. Grįžtamos fermentin÷s reakcijos, katalizuojamos N5,N10-metilentetrahidrofolato dehidrogenaz÷s metu, N5,N10-metilen-THF oksiduojamas į N5,N10-metenil-THF (reakcija 7), arba negrįžtamos N5,N10-metilentetrahidrofolato reduktaz÷s metu, N5,N10-metilen-THF redukuojamas į N5-metil-THF (reakcija 8).

85

85

N

CH NH

CH2

NH

H

N

C NH

CH2

H

OH

N

N

CH2

H

CH

NH

N

CH2

H

CHO

N

N

CH2

H

CH2

N

CH3 NH

CH2

H

5

10

5

10

5

10

5

10

Histidinas

+

5

10

5

10

THF

DHF

NH4

CO2

Glicinas NAD+

+

Glicinas

Serinas

Homocisteinas Metioninas R-SH R-S-CH3

N5-Metil-THF

N5,N10-Metilen-THF

N5,N10-Metenil-THF N5-Formil-THFN10-Formil-THF

N5-Formimino-THF

H2O

NH3

H2O H2OATP

ATP

Purinonukleotidai1

2 3

4

Formiatas + THF

THF + CO2

NADP+, H2O

dUMP

dTMP

NADPH

5

67

NADPH

NADH

8

9

1011

12

13

2.11 pav. Tetrahidrofolato dariniai ir jų tarpusavio virsmai. Vieno anglies atomo fragmentai reikalingi purino nukleotidų, serino, glicino metionino,

cholino, dTMP sintez÷ms. Esant folato trūkumui labiausiai sutrinka DNR biosintez÷ d÷l sul÷t÷jusios dTMP sintez÷s. DNR biosintez÷s sutrikimai ypač atsiliepia žmonių kraujodarai.

Prokariotuose, N10-formil-THF dalyvauja baltymų biosintez÷je (žr. skyrius). dTMP sintez÷je ,tetrahidrofolato kofermentai yra netiktai vieno anglies atomo donorai, bet veikia ir kaip reduktorius.

Kitas pterino kofermentas yra 5,6,7,8-tetrahidrobiopterinas, turintis trijų anglies atomų ilgio šoninę grandinę, vietoje ilgos šonin÷s grandin÷s, esančios tetrahidrofolato molekul÷je. Šis

86

86

kofermentas n÷ra vitamino darinys, jis sintetinamas gyvūnų ir kitų organizmų. Tetrahidrobiopterinas yra hidrolazių kofaktorius, dalyvauja fenilalanino virtime į tiroziną (skyrius ). Jis taip pat dalyvauja azoto monoksido sintez÷je iš arginino, reakcijoje katalizuojamoje azoto

oksido sintaz÷s.

NH

N

NH

NH

HHH

CH

NH2

OCH

CH3

OHOH5,6,7,8-Tetrahidrobiopterinas

12

3 4 5 6

78

2.5.10 Vitamino B12 kofermentai Vitaminas B12 arba kobalaminas, yra grup÷ kobaltą turinčių medžiagų žinomų kaip korinoidai. Vitaminą B12 sintetina tiktai mikroorganizmai, gyvūnuose šį vitaminą sintetina mikroflorą arba jie gauna su maistu valgydami kepenis, kiaušinius, kiaulieną, vištieną ar gerdami pieną. Vaistin÷ kobalamino forma yra cianokobalaminas, kuri susidaro kofermento išskyrimo metu. Organizme sutinkami hidroksikobalaminas ir akvokobalaminas, kurie paverčiami į aktyvius kofermentus: 5/-deoksiadenozilkobalaminą ir metilkobalaminą. Tretin÷ 5/-deoksiadenozilkobalamino struktūra rentgenostruktūrin÷s analiz÷s metodu nustatyta 1961m. Hodžkin (D.Hodgkin). Kofermento pagrindą sudaro korino žiedas su centre esančiu kobalto jonu. Korino žiedas yra panašus į hemo porfirino žiedą, išskyrus, tai kad du pirolo žiedai korine sujungti tiesiogiai, o ne per -CH2 - grupę. Kobaltas koordinaciniais ryšiais susijungęs su keturiais pirolo azotais. Vienas aksialinis kobalto ligandas yra dimetilbenzimidazolo azoto atomas. Kitas aksialinis kobalto ligandas gali būti –CN (ciankobalaminas), -CH3 (metilkobalaminas), -OH (hidroksikobalaminas), vanduo (akvakobalaminas) arba 5/-deoksiadenozilo 5/-anglies atomas (5/-deoksiadenozilkobalaminas).

87

87

. Ciankobalaminas

Yra žinoma per 15 skirtingų reakcijų, kuriose dalyvauja vitaminas B12 Pagrindinai kofermentas dalyvauja trijuose reakcijų tipuose:

1. Vidumolekuliniai persitvarkymai

H

H

H H

O SKoA

O

O

H

H

H H

O SKoA

O

O

C C

H Y

C C

HY

C C

C

C-

C C

C

C-

L-metilmalonil-KoA Sukcinil-KoA

Metilmalonil-KoA mutaz÷

Adenozilkobalaminas

2. Ribonukleotidų redukcija iki deoksiribonukleotidų (vyksta mikroorganizmuose)

88

88

O

H

OH OH

O

H

OH H

P OO

O

O

P O

O

O

CH2P OO

O

O

P O

O

O

CH2 Baz÷Baz÷-

- -

-

- -

3. Metilo grup÷s pernešimas

COO

CH

CH2

H3N

CH2

SH

COO

CH

CH2

H3N

CH2

S CH3

-+

N5-Metiltetrahidrofolatas

Tetrahidrofolatas

-+

Homocisteinas Metioninas

Metionino sintaz÷

Metilkobalaminas

Vidumolekuliniuose persitvarkymuose ir ribonukleotidų redukcijoje dalyvauja 5/-

deoksiadenozilkobalaminas, o metilo grup÷s pernešimo reakcijose - metilkobalaminas. 5/-deoksiadenozilkobalaminas yra metilmalonil-KoA mutaz÷s kofaktorius, o metilkobalaminas yra fermento metionino sintaz÷s kofaktorius. Metionino sintaz÷ katalizuoja homocisteino virtimą į metioniną ir šioje reakcijoje taip pat dalyvauja folatas. Tai yra vienintel÷ organizmo reakciją, kur reikalingi abu kofaktoriai – N5-metiltetrahidrofolatas ir vitaminas B12.

Negaunant vitamino B12 žmogaus organizme išsivysto perniciozin÷ ir megaloblastin÷ anemija bei įvairūs neurologiniai sutrikimai. Perniciozin÷ anemija dažniausiai sukelia ne paties vitamino B12 trūkumas, o jo neįsisavinimas. Žarnyne vitaminas B12 susiriša su vidiniu faktoriumi, šis kompleksas jungiasi su specifiniais receptoriais ir pernešamas per gleivin÷s ląsteles į kraują. Nesant vidinio faktoriaus vitaminas B12 neabsorbuojamas.

Megaloblastin÷ anemija, kurią sukelia vitamino B12 trūkumas, susijusi su folato metabolizmo inhibicija. Kobalamino trūkumas stipriausiai pasireiškia greitai besidalijančiose ląstel÷se – kaulų čiulpų eritropoetin÷se bei žarnyno gleivin÷s ląstel÷se. Šie audiniai intensyviai sintetina nukleotidus ir nukleorūgštis, kurių sintezei reikia N5,N10 -metilen- ir N10 –formiltetrahidrofolio rūgšties. Nuo vitamino B12 priklausomas homocisteino virtimas į metioniną yra pagrindinis kelias, kuriuo regeneruojamas tetrahidrofolatas. Metilkobalaminas perneša metilo grupę ant homocisteino ir susidaro metioninas, N5-metiltetrahidrofolatas savo ruožtu metilina kobalaminą. Metioninas naudojamas S-adenozilmetionino sintezei, kuris yra pagrindinis metilo grup÷s donoras įvairiose metilinimo reakcijose. Kai vitamino B12 kiekis yra mažas, N5-metil-THF rūgšties panaudojimas metionino sintezei sul÷t÷ja. (2.11 pav.). Metionino trūkumo organizmas nejaučia, nes jo pakankamai gauna su maistu. N5,N10-metilen-THF redukcija į N5-metil-THF yra negrįžtama reakcija (2.11 pav.), tod÷l N5-metil-THF pastoviai sintetinasi. Žinduolių metionino sintaz÷ yra vienintelis fermentas, kuris panaudoja N5-metil-THF, sumaž÷jus šio fermento aktyvumui, ląstel÷je kaupiasi N5-metil-THF ir kitų tetrahidrofolio kofermentų koncentracija tampa nepakankama (2.12 pav.). Nesant metilo ir metileno terahidrofolio darinių sutrinka

89

89

nukleorūgščių ir jų darinių biosintez÷.

Metilen-THF

THF

Metil-THFB12

CH3-B12

Metioninas

Homocisteinas

2. 12 pav. Ryšys tarp folato ir B12 metabolizmo.

Neurologiniai susirgimai vyksta d÷l nervinių ląstelių demielinizacijos. Oksiduojant nelyginio anglies atomų skaičiaus riebalų rūgštis, skaidant aminorūgštis treoniną, izoleuciną ar valiną susidaro metilmalonil-KoA. Sintetinant membraninius lipidus, metilmalonil-KoA pakeičia dalį malonil-KoA, tod÷l sintetinamos šakotos grandin÷s riebalų rūgštys, kurios destabilizuoja membranas. Trūkstant vitamino B12 sumaž÷ja S-adenozilmetionino, kuris yra pagrindinis metilinimo agentas ir dalyvauja mielino bazinių baltymų metilinime. Dideli folato kiekiai gali apsaugoti nuo megaloblastin÷s anemijos susijusios su vitamino B12 trūkumu, bet neapsaugo nuo neurologinių pažeidimų.

2.5.11 Metalų jonų vaidmuo fermentų veikloje Šiuo metu per 30% žinomų fermentų veiklai būtini metalų jonai. Dažniausiai fermentų veikimui reikalingi Fe2+, Zn2+, Mg2+, Cu2+, Co2+, Mo2+, Ca2+, K+, Na+ ir kiti jonai. Vieniems fermentams metalų jonai yra būtini fermento aktyvumui, kitais atvejais katalizin÷ reakcija tiktai stimuliuojama. Metalų jonai: • stabilizuoja baltymo struktūrą • dalyvauja substrato surišime su fermentu • dalyvauja kofermento prijungime prie baltymo • tiesiogiai dalyvauja fermentin÷se reakcijose:

• veikia kaip Luiso rūgštys • dalyvauja oksidacin÷se redukcin÷se reakcijose

Metalų jonai palaiko baltymo antrinę, tretinę ar ketvirtinę struktūras. Tokie fermentai katalizuoja chemines reakcijas, tačiau jie nestabilūs. Jų aktyvumas sumaž÷ja nežymiai pakeitus tirpalo pH ar temperatūrą. Metalų jonai stabilizuoja baltymo molekul÷s optimalią konformaciją. Ca2+ stabilizuoja fermento amilaz÷s struktūrą, fermentas tampa atsparesnis temperatūros poveikiui. Alkoholio dehidrogenaz÷ sudaryta iš keturių subvienetų ir įeina keturi Zn2+ jonai. Pašalinus Zn2+, fermentas disocijuoja į subvienetus ir praranda katalizinį aktyvumą. Kinazinių reakcijų substratas yra ne laisva ATP4- molekul÷, o ATP4--Mg2+ kompleksas. Mg2+ tiesiogiai nereaguoja su fermentu, bet dalyvauja ATP molekul÷s stabilizacijoje ir substrato molekul÷s neigiamo krūvio neutralizacijoje, tuo palengvindamas substrato susijungimą su fermento aktyviuoju centru. Metalų jonai aktyviai dalyvauja elektrofilin÷je kataliz÷je. Pereinamieji metalai Fe2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+, turi laisvą d elektronų orbitalę ir jie gali veikti kaip elektronų gaudykl÷s. Į fermento karboanhidraz÷s sud÷tį įeina Zn2+ jonai, kurie dalyvauja H+ ir OH- jonų susidaryme iš vandens. Fe2+ jonai įeina į citochromų, Fe-S baltymų sud÷tį ir tiesiogiai dalyvauja oksidacijos redukcijos reakcijose, pernešant elektronus.

90

90

2.6 Fermento aktyvus centras.

1894m. Fišeris (E.Fisher) savo elegantiškoje fermento veikimo mechanizmo rakto ir spynos hipotez÷je aiškino, kad substratas yra raktas, o fermento aktyvus centras yra spyna. Substratas turi atitikti fermento aktyvų centrą kaip raktas spyną, jis turi būti specifiškas fermentui, tada fermentin÷ reakcija vyksta efektyviai. Tačiau baltymai yra lanksčios, dinamin÷s struktūros, baltymo konformacija kinta vykstant cheminiams virsmams. Košlandas (D.Koshland) pasteb÷jo, kad reaguojant substratui su fermentu aktyvaus centro konformacija pasikeičia, substratas indukuoja katalizinių aminorūgščių šoninių radikalų persitvarkymą erdv÷je. Jo hipotez÷je fermento aktyvus centras yra kaip pirštin÷, o substratas - ranka. Pirštin÷ įgauna rankos formą. Ši hipotez÷ buvo pavadinta indukuoto atitikimo hipoteze.

Fermento aktyvus centras yra ta fermento molekul÷s dalis, prie kurios prisijungia substratas ir vyksta katalizin÷ reakcija. Aktyvus centras susidaro susiformuojant tretinei baltymo struktūrai. Aminorūgščių šoniniai radikalai, esantys įvairiose polipeptidin÷s grandin÷s vietose suart÷ja, baltymo globul÷je susidaro plyšys ar įdubimas, prie kurio prisijungia substratas. Į fermento aktyvų centrą taip pat gali įeiti kofermentas, prostetin÷ grup÷ bei metalų jonai.

2.9 lentel÷ Aminorūgščių aktyvių šoninių grupių funkcijos Aminorūgštis

Aktyvi grup÷

Krūvis, esant pH 7

Tipin÷ jonizuojamos grup÷s pKa baltymuose

Pagrindin÷s funkcijos

Aspartatas -COO- -1 4-5 Suriša katijonus, perneša protonus

Glutamatas -COO- -1 4-5 Suriša katijonus, perneša protonus

Histidinas Imidazolas ~ 0 6-7 Perneša protonus Cisteinas -CH2SH ~ 0 8-9,5 Yra nukleofilas,

kovalentiškai prijungia acilo grupę

Tirozinas Fenolio 0 9,5-10 Sudaro vandenilinius ryšius su ligandais, gali būti protonų donoras

Lizinas -NH3+ +1 ~10 Suriša anijonus,

perneša protonus, prijungia kofaktorius, sudaro tarpinius junginius

Argininas Guanidino +1 ~12 Suriša anijonas Serinas -OH 0 ~16 Yra nukleofilas,

reakcijose kovalentiškai prijungia acilo grupę

Aminorūgščių šoniniai radikalai atlieka dvi pagrindines funkcijas:

1) prijungia ir erdv ÷je orientuoja substrato molekules. Tokios aminorūgštys dar vadinamos kontaktin÷mis ir jų išsid÷stymas sąlygoja fermento specifiškumą. Stereospecifiniam surišimui, reikalingi mažiausiai trys sąveikos taškai.

91

91

2) dalyvauja laikinų cheminių ryšių su substrato molekul÷mis susidaryme, katalizuoja cheminę reakciją. Šios aminorūgščių funkcin÷s grup÷s gali būti protonų ar elektronų donorais ir akceptoriais, sudaryti laikinus kovalentinius ryšius su substrato molekul÷mis, stabilizuoti pereinamąjį būvį.

Į fermento aktyvų centrą dažniausiai įeina tos aminorūgštys, kurių šoniniai radikalai yra chemiškai aktyvūs, kurie sudaro įvairaus stiprumo ryšius su substrato molekul÷mis, dalyvauja chemin÷se reakcijose. Tai gali būti cisteinas (-SH), serinas (-OH), treoninas (-OH), asparto, glutamo rūgštys (-COOH), lizinas (-NH2), argininas (-NH2), tirozinas (-OH), histidinas (imidazolo žiedas). Labai svarbų vaidmenį fermento aktyvaus centro susidaryme vaidina hidrofobin÷s aminorūgštys, kurios dalyvauja substrato surišime, sudaro palankią aplinką vykti cheminei reakcijai. Fermentas su substratu dažniausiai susiriša nestipriais nekovalentiniais vandeniliniais, elektrostatiniais, hidrofobiniais ar van der Valso ryšiais.

2.7 Bendri fermentų veikimo principai

Tiriant metilfosfoesterio esterio hidroliz÷s greitį buvo apskaičiuota, kad hidrolizinio skaidymo greitis be katalizatoriaus Vbe kat yra lygus 1*10-15, prid÷jus šarmin÷s fosfataz÷s jis siekia 1.4*101.

CH3-O-PO3H2 + H2O CH3OH + H3PO4

Greitis padid÷ja 1.4* 1016 kartų. Fermentas ureaz÷ katalizuoja karbamido hidrolizę iki amoniako ir anglies dvideginio. Be fermento hidroliz÷s reakcijos greičio konstanta lygi 3*10-10 s-1, prid÷jus fermento konstanta išauga iki 3*104 s-1. Katalizuojamos reakcijos greitis išauga 1014 kartų, o aktyvacijos energija sumaž÷ja 84 kJ/mol. Kas sąlygoja tokį didelį chemin÷s reakcijos greičio išaugimą?

Fermentin÷s reakcijos pagreit÷jimą aiškina nedidelis skaičius faktorių: • Substratų suart÷jimas ir orientacija. • Pereinamojo būvio stabilizacija • Bendra rūgštin÷-bazin÷ kataliz÷. • Kovalentin÷ kataliz÷. • Metalų jonų kataliz÷. • Fermento substrato kompleksas destabilizuojamas d÷l įtempimo, desolvatacijos ar

elektrostatinių efektų. Susidarant fermento substrato kompleksui, entropija sumaž÷ja. 2.7.1 Substratų suart÷jimas ir orientacija. Labai svarbus faktorius didinantis fermentin÷s reakcijos greitį yra substratų suart÷jimas ir orientacija. Molekul÷ms, esant tirpale ar dujin÷je faz÷je, did÷jant reaguojančių molekulių koncentracijai did÷ja tarpusavio susidūrimų skaičius ir reakcijos greitis išauga. Fermentai turi specifines substrato molekulių prijungimo vietas, tod÷l reaguojančios medžiagos “paimamos” iš tirpalo ir koncentruojamos viena šalia kitos.

Tirdami suart÷jimo efektus fermentin÷se reakcijose, chemikai sintetino modelinius substratus ir lygino tarpmolekulinių reakcijų greičius su atitinkamų ar panašių vidumolekulinių reakcijų greičiais. Tipinis pavyzdys yra p-nitrofenilacetato hidroliz÷ katalizuojama imidazolo.

92

92

+2H O

NNH + CH3COOH HO NO2 (a)NNH

NNH

NO22H O

COOHNO2HO

C

O

+

k=35 M- 1

min -1

k=839 min - 1

(b)

H3C C

O

NO2O

NNH

imidazolas p-nitrofenilacetatas

+

p-nitrofenolis

modelinis substratas 2.13 pav. Substratų suart÷jimo poveikis katalizei.

Tam tikrose sąlygose, šios bimolekulin÷s reakcijos (a) greičio konstanta yra 35 M-1 min-1 Analogiškos pirmo laipsnio vidumolekulin÷s reakcijos (b) greičio konstanta yra 839 min-1. Šių dviejų konstantų santykis lygus:

(839 min-1)/(35 M-1 min-1) = 23.9M Tai rodo, kad, norint bimolekulin÷je reakcijoje pasiekti tokį patį greitį kaip vidumolekulin÷je reakcijoje, imidazolo koncentracija tur÷tų būti 23.9M. Suart÷jimo efektas padidina “efektyvią” substratų koncentraciją, palyginus su esančia tirpale, reakcija vietoje bimolekulin÷s, tampa monomolekuline, tod÷l padid÷ja ir reakcijos greitis. Didel÷ efektyvi substrato koncentracija palengviną greitesnį pereinamojo būvio susidarymą. Šis efektas vadinamas suart÷jimo efektu. Efektyvi kataliz÷ reikalauja silpno reaguojančių medžiagų susirišimo su aktyviuoju centru, nes labai stipri sąveika l÷tins katalizę. Suart÷jimo efektas padidina reakcijos greitį iki 10000 kartų, panašus pagreit÷jimas pasiekiamas stabilizuojant pereinamąjį būvį. Cheminiai ryšiai susidarantys formuojantis ES kompleksui ir stabilizuojantys pereinamąjį būvį yra tie patys – elektrostatin÷ sąveika, vandeniliniai ryšiai, hidrofobin÷s sąveika, van der Valso j÷gos. Elektrostatin÷ sąveika yra žymiai stipresn÷ hidrofobin÷je aplinkoje negu vandenyje. Kadangi aktyvus centras yra baltymo molekul÷s viduje ir jame gausu hidrofobinių aminorūgščių, tod÷l krūvių sąveika aktyviame centre yra stipri. Aspartato, glutamato, lizino, arginino, histidino liekanos aktyviame centre gali sudaryti jonų poras. Aminorūgštys turinčios savo radikaluose elektroneigiamus atomus (N,O,S) sudaro tarpusavyje ar su substrato molekul÷mis vandenilinius ryšius. Hidrofobin÷s aminorūgštys tokios kaip leucinas, fenilalaninas, triptofanas dalyvauja surišant aktyviame centre substrato hidrofobinius radikalus. Substrato surišimas su fermentu negali būti labai stiprus, tai yra KM neturi būti labai žema.

Fermentai ne tik palaiko substratus ir katalizines grupes greta vienas kito, bet atitinkamos funkcin÷s grup÷s yra orientuojamos viena kitos atžvilgiu, kad erdv÷je susidarytų palankiausia cheminei reakcijai pad÷tis.

93

93

HOOCOH

O

O

CH3

CH3

CH3

CH3

HOOCOH

O

OCH3

CH3

CH3

CH3

.

.

.

(a)

(b)

reakcijos greičio konstanta

-H2O

-H2O 5,9 10-6

1,5 106

2.14 pav. Orientacijos poveikis vidumolekulin÷ms reakcijoms .

2.14 pav. parodyta, kad metilgrup÷ (b) orientuoja karboksigrupę ir aromatinio žiedo hidroksigrupę taip, kad reakcijos greitis išauga 2.5x1011 kartų. Fermento funkcija yra orientuoti substrato molekulę ir katalizines funkcines grupes optimaliausiu reakcijai būdu. 2.7.2 Perinamojo būvio stabilizacija Fermentai padidina chemin÷s reakcijos greitį stabilizuodami pereinamąjį būvį. Energija, reikalinga iš fermento substrato (ES) komplekso susidaryti pereinamojo būvio kompleksui (ES*) yra mažesn÷, negu tiesiai iš substrato gauti pereinamąjį būvį S* nefermentin÷se reakcijose. Fermentas ir substratas susijungia silpnais ryšiais. Jeigu ES kompleksas yra tvirtas, tada energijos sąnaudos iš ES gauti ES* yra žymiai didesn÷s. Ypatingai stipriai susirišus substratui su fermentu kataliz÷s procesas stabdomas. Fermentas turi orientuoti ir surišti substratą prieš susidarant pereinamajam būviui ir fermento ir substrato surišimo energija neturi būti didel÷. Nustatytos įvairių fermentų Michaelio konstantos rodo, kad fermentai nepatenka į termodinaminę duobę, tai yra substratas su fermentų nesusiriša labai stipriai. Daugumos fermentų KM yra 10-4M eil÷s, tai rodo silpną substrato susirišimą. Fermentai paprastai kofermentams turi nedideles KM (10-6 - 10-5 M). Pagrindinis faktorius didinantis fermento katalizinę galią yra didesnis pereinamojo būvio tarpininko susirišimas su aktyviuoju centru, palyginus su prisijungimu substrato ar produkto. Šis reiškinys vadinamas pereinamojo būvio stabilizacija. Įtempimas ir deformacija tai buvo du terminai, kuriais buvo aiškinama fermentin÷ kataliz÷. Buvo manoma, kad fermentai kaip ir kieti katalizatoriai (aktyvuota anglis, Pt ir kiti) katalizuoja reakcijas fiziškai ar elektriškai deformuodami substratus. Per÷jimo būvio stabilizacija, sustipr÷jęs ryšys tarp fermento ir substrato pereinamajame būvyje pilniau paaiškina substrato įtempimo ir kataliz÷s reiškinius. Fišeris rakto ir spynos teorijoje pasiūl÷, kad fermentai yra kieti, nelankstūs šablonai ir prisijungia tiktai tam tikrą substratą kaip raktą. Priimtas fermento specifiškumo ir kataliz÷s aiškinimas detalizuoja, kad raktas yra ne substratas, o pereinamasis būvis. Po to kai fermentas prisijungia substratą jis jį pakeičia ir substratas įgauna pereinamojo būvio struktūrą. Maksimalus ryšių skaičius tarp fermento ir substrato susidaro tiktai pereinamajame būvyje ES*.

94

94

Fermento aktyvus centras savo forma ir chemin÷mis savyb÷mis turi b ūti komplementarus pereinamajam būviui . Kadangi energijos skirtumas tarp ES ir ES* yra žymiai mažesnis nei tarp S ir S*, tod÷l kkat yra didesn÷ negu kn (nekatalizuojamos reakcijos greičio konstanta). Pereinamojo būvio analogai yra stabilūs junginiai, kurių struktūra panaši į pereinamojo būvio tarpininką. Tokie cheminiai junginiai buvo sintetinti, nustatytos jų surišimo konstantos yra didel÷s, tod÷l jie yra potencialūs fermentinių reakcijų slopikliai. Tiriant adenozino deaminazę, buvo sintetintas per÷jimo būvio analogas, kuris su fermentu susirišo labai stipriai. Adenozino deaminaz÷ katalizuoja adenozino virtimą į inoziną. Pirmoje reakcijos stadijoje prijungiama vandens molekul÷ ir kovalentinis hidratas (pereinamasis būvis) greitai virsta produktu inozinu (pav 2.11). Fermento slopiklis yra purino ribonukleozidas (pav 2.11B) kuris vietoje aminogrup÷s turi vandenilį, tod÷l vyksta tiktai pirma fermentin÷s reakcijos stadija – hidroksigrup÷s prijungimas. Susidaręs per÷jimo būvio analogas yra efektyvus konkurencinis slopiklis, jo Ki yra lygi 3*10-13M. (Adenozino deaminaz÷s pereinamojo būvio kovalentinio hidrato giminingumo konstanta yra 3*10-17) Labai panašus konkurencinis slopiklis 1,6-dihidropurino ribonukleozidas (2.15 pav. C) neturi hidroksigrup÷s prie C6, jo Ki tiktai 5*10-6M. Buvo padaryta išvada, kad adenozino deaminaz÷ specifiškai ir efektyviai suriša pereinamojo būvio analogą ir pereinamojo būvio tarpininką, surišimas vyksta per hidroksigrupę esančią prie šešto anglies atomo

N

N

N

N

NH2

NH

N

N

N

OHNH2

NH

N

N

N

ONH3

N

N

N

N

H

NH

N

N

N

OHH

NH

N

N

N

HH

Riboz÷

H2O

Riboz÷ Riboz÷

Adenozinas Kovalentinis hidratas Inozinas

A

C

Riboz÷

H2O

Riboz÷H2O Riboz÷

Purino ribonukleozidas Pereinamojo būvio 1,6-Dididropurino ribonukleozidas (substrato analogas) analogas (konkurencinis slopiklis)

B

66

6

2.15 pav. Adenozino deaminaz÷s inhibicija pereinamojo būvio analogu. A – Adenozino deamininimas, B- Pereinamojo būvio analogo susidarymas, C – Konkurencinis slopiklis. 2.7.3 Rūgštin÷-bazin÷ kataliz÷.

95

95

Rūgštin÷s-bazin÷s kataliz÷s metu reakcija pagreitinama kataliziškai pernešant protoną. Ši kataliz÷s rūšis plačiai paplitusi organin÷je chemijoje, dažnai sutinkama fermentin÷se reakcijose. Yra du rūgštin÷s-bazin÷s kataliz÷s tipai:

1) specifin÷ rūgštin÷-bazin÷ kataliz÷, kai H+ (H3O+) ar OH- , greitina cheminę reakciją.

Jeigu protonai pernešami tarp reakcijos tarpininko ir vandens greičiau negu tarpininkas suskyla į reakcijos produktus, tada susidaręs tarpininkas yra stabilizuojamas. Jokia papildoma kataliz÷ kitais protonų donorais ar akceptoriais nevyksta.

2) bendra rūgštin÷-bazin÷ kataliz÷, kada reakciją katalizuoja kita rūgštis ar baz÷ dažniausiai tai yra aminorūgščių šoniniai radikalai, o ne tiesiogiai H+ ar OH-. Bendra rūgštin÷-bazin÷ kataliz÷ vyksta tada, kai protonai yra pernešami pereinamajame būvyje. Šią katalizę gerai iliustruoja p-nitrofenilacetato hidroliz÷, kurioje imidazolas veikia kaip bendroji baz÷.

H3C

O

2H OO NO2NO2CH3COOH

NO2H3C

O

NO2O CH3

C O

O H

O-

CH3COOH

NH NH H

O

:

H+

NO2

+C HO+

C +HO

..

p-nitrofenilacetatas p-nitrofenolis

2.16 pav. p-Nitrofenilacetato hidroliz÷, esant imidazolui Protono pernešimas nuo vandens ant imidazolo, palengvina substrato karbonilin÷s grup÷s anglies atomo ataką hidroksilo anijonu. Protono pernešimas, matyt stabilizuoja pereinamąjį būvį ir vanduo tampa nukleofiliškesnis be žymaus hidroksilo jonų koncentracijos padid÷jimo. Bazei ar protonų akceptoriui žym÷ti plačiai naudojamas simbolis B:. BH+ nurodo konjuguotą rūgštį arba protonų donorą. Protonų akceptorius paimdamas protoną, dalyvauja O-H, N-H ir net C-H ryšių suardyme

X H X -..:B H B

+

Bendroji baz÷ B: dalyvauja ir kitų cheminių ryšių suardyme, pvz. C-N. Baz÷ paima iš vandens protoną ir generuoja aktyvų OH-. Bendroji rūgštis BH+ katalizuoja kovalentiniu ryšio suyrimą protonizuodama atomą, dalyvaujantį ryšio sudaryme.

Fermento funkcin÷ grup÷, kaip H+ pernešantis agentas bus efektyviausia, esant reakcijos terp÷s pH artimai grup÷s pKa. Kadangi histidino imidazolo žiedo pKa artima 7.0, tai histidinas yra labai efektyvus kaip bendroji baz÷ ar rūgštis. Daugumos biocheminių reakcijų metu vyksta rūgštin÷-bazin÷ kataliz÷. Tai peptidinio ir esterinio ryšio hidroliz÷, tautomerizacija. Aminorūgščių Asp, Glu, His, Cys, Tyr, Lys šoniniai radikalai dažnai dalyvauja bendroje rūgštin÷je-bazin÷je kataliz÷je.

96

96

2.10 lentel÷. Aminorūgštys bendroje rūgštin÷je-bazin÷je kataliz÷je. Aminorūgšties liekana Bendra rūgštin÷ forma

(protonų donoras) Bendra bazin÷ forma (protonų akceptorius)

Glu, Asp R-COOH R-COO-

Lys, Arg R-NH3+ R-NH2

Cys R-SH R-S- His

NNH

R

H+

NNH

R

Ser R-OH R-O- Tyr

R OH

R O-

Rūgštin÷s-bazin÷s kataliz÷s tyrimas nefermentin÷se reakcijose parod÷, kad šis faktorius

fermentinę reakciją gali pagreitinti 10-100 kartų. Panašų ind÷lį įneša ir kovalentin÷ kataliz÷.

2.7.4 Kovalentin÷ kataliz÷. Kai kurie fermentai greitina cheminę reakciją, sudarydami tarpinius aktyvius

kovalentinius junginius tarp fermento ir substrato. Reakcijoje AX + Y AY + X

susidaro kovalentinis tarpininkas – A-Fermentas. AX +Y + Fermentas A-Fermentas +X+Y Fermentas + AY + X Fermento akceptorin÷ grup÷ turi būti geresn÷ atakuojanti grup÷ negu Y ir geresn÷

nueinanti grup÷ negu X. Dauguma fermentų, katalizuojančių reakcijas kovalentin÷s kataliz÷s keliu, turi ping-pong kinetinį mechanizmą.

Fermentin÷s reakcijos gali būti klasifikuojamos pagal vykstančią elektrofilinę ar nukleofilinę katalizę, priklausomai kuris efektas turi didesnę įtaką ir kas yra reakcijos greitį limituojanti stadija. Medžiagos nukleofiliškumas yra artimas jo bazingumui. Nukleofilin ÷s kataliz÷s mechanizmas panašus į bendrą rūgščių-bazių katalizę, išskyrus tai, kad katalizatorius nukleofiliškai atakuoja sudarydamas kovalentinį ryšį. Kuo stabilesnis susidaro kovalentinis ryšys, tuo sunkiau jį suardyti galutin÷se fermentin÷s reakcijos stadijose. Geras kovalentinis katalizatorius turi tur÷ti dvi sunkiai suderinamas savybes – aukštą nukleofiliškumą ir galimybę sudaryti lengvai nueinančią grupę. Grup÷s, turinčios judrius protonus tokios kaip imidazolas ir merkaptogrup÷ yra geri kovalentiniai katalizatoriai. Fermento aktyvaus centro aminorūgščių šoniniai radikalai (amino-, karboksi-, hidroksi-, merkapto- grup÷s, imidazolo žiedas) teikia katalizei nukleofilinius centrus. Šios grup÷s atakuoja substrato elektrofilinius centrus ir susidaro fermento ir substrato kovalentinis tarpininkas. Tipiniai substrato elektrofiliniai centrai yra fosforil-, acil-, glikozilgrup÷s. Susidaręs kovalentinis tarpininkas v÷liau yra atakuojamas vandens molekul÷s ar kito substrato, susidarant galutiniam produktui.

97

97

R C

O

Y

XE..

R C Y

X

E

O-

R C

O

Y

X E

+ -

acil fermentas

2.17 pav. Kovalentinio acilfermento susidarymo mechanizmas Kovalentin÷s elektrofilin ÷s kataliz÷s metu dažniausiai dalyvauja fermentų kofaktoriai, kurie sudaro elektrofilinius centrus. Aminorūgščių šoniniai radikalai ir kofermentai dalyvauja kovalentin÷je kataliz÷je. Serinin÷se, cisteinin÷se peptidaz÷se hidroksi- ir merkaptogrup÷s yra geri nukleofilai ir reakcijos metu susidaro tarpiniai kovalentiniai kompleksai. Kai kurie kofermentai: tiamindifosfatas, piridoksalfosfatas funkcionuoja kaip kovalentiniai katalizatoriai. Žinoma daugiau nei 100 fermentų kataliz÷s metu sudarančių tarpinius kovalentinius kompleksus. 2.11 lentel÷. Fermentai, sudarantys kovalentinius tarpininkus Fermentai Reaguojanti grup÷ Kovalentinis tarpininkaas 1. Chimotripsinas Elastaz÷ Esteraz÷s Subtilizinas Tripsinas

-CH2-OH (serinas)

-CH2-O-CO-R (acil-serinas)

2. Fosfoglicerolio aldehido dehidrogenaz÷ Papainas

-CH2-SH (cisteinas)

-CH2-S- CO-R (acilcisteinas)

3. Šarmin÷ fosfataz÷ Fosfogliukomutaz÷

CH2-OH (serinas)

-CH2-O- PO32-

(fosfoserinas) 4. Fosfogliceromutaz÷ Sukcinil-KoA sintetaz÷s

Histidinas Fosfohistidinas

5. Aldolaz÷ Dekarboksilaz÷s Aminotransferaz÷s

R- NH3+

(lizinas)

R-N=C< (Šifo baz÷)

2.7.5 Fermento substrato kompleksas destabilizuojamas d÷l įtempimo, desolvatacijos ar elektrostatinių efektų.

Fermentin÷s reakcijos greitis kinta tod÷l kad: a) Fermento substrato kompleksas destabilizuojamas d÷l įtempimo, desolvatacijos ar

elektrostatinių ir kitų efektų, tampa reakcingesnis substratas b) susijungus substratui su fermentu sumaž÷ja entropija. Susijungus substratui su fermentu, fermentas susiriša su per÷jimo būviu stipriau nei su

substratu. Kai substratas prisijungia, vyksta molekul÷s konformaciniai pasikeitimai.

98

98

Lizocimas katalizuoja polisacharido, sudarančio bakterijų sieneles, hidrolizę. Jis yra geras fermento, stabilizuojančio pereinamąjį būvį pavyzdys. Daugumoje organizmo sekretų - ašarose, seil÷se, nosies gleiv÷s yra lizocimo, kuris apsaugo nuo bakterijų infekcijos. Lizocimo substratas yra polisacharidas, sudarytas iš N-acetilgliukozamino (NAG) ir N-acetilmuramo rūgšties (NAM).

OCH2OH

HH

H NHCOCH3

H

CH-CH3

COOH

OCH2OH

HH

H NHCOCH3

HOH

OHO

CH2OH

HH

H NHCOCH3

H

CH-CH3

COOH

OCH2OH

HH

H NHCOCH3

HOH

OHO

CH2OH

HH

H NHCOCH3

H

CH-CH3

COOH

OCH2OH

HH

H NHCOCH3

HOH

OHOO O

NAG NAM

OO O

NAG NAM

OO O

NAG NAM

A B C D E F

Lizocimas specifiškai hidrolizuoja glikozidinį ryšį tarp NAM C-1 ir NAG deguonies

atomo prijungto prie C-4. Lizocimo aktyviame centre yra griovys, kuriame jungiasi šešios monosacharido liekanos (žymimos nuo A iki F). Glikozidinis ryšys suardomas tarp D ir E monosacharidų. Jungiantis oligosacharidui su fermento aktyviuoju centru, su fermento aktyviuoju centru vyksta N-acetilmuramo rūgšties, esančios D pad÷tyje angliavandenio konformacijos pakitimas, k÷d÷s konformacija pereina į pusiau k÷d÷s konformaciją.

OHOHO

RO NH

O

CH3

OHOHO

RO NH

CH2OH

O

CH3

C

CH2OH

K÷d÷s konformacija Pusiau k÷d÷s konformacija

C

Aktyviame centre prie skaidomo glikozidinio ryšio C-1 atomo yra dvi dikarboksiaminorūgštys Glu35 ir Asp52. Glu35 yra nepolin÷je aplinkoje ir jo karboksigrup÷ yra nejonizuota, jos pKa yra apie 6.5. Asp52 yra labiau polin÷je aplinkoje, jos pKa yra 3,5 ir ji yra jonizuota. Lizocimo veikimo pH optimumas yra 5. Glu35, kuris esant pH=5 protonizuotas, veikia kaip rūgštinis katalizatorius ir perduoda protoną deguoniui, sudarančiam glikozidinį ryšį tarp D ir E liekanų. Dalis substrato surišto E ir F srityse difunduoja iš aktyvaus centro ir jo vietą užima vandens molekul÷. Susidariusi oksokarbkatijono tarpininką stabilizuoja aspartato neigiama karboksigrup÷. Protonas nuo vandens pernešamas ant konjuguotos baz÷s Glu35, o hidroksilo anijonas prijungiamas prie oksokarbkatijono. Produktas pašalinamas iš fermento aktyvaus centro.

Tirpale esančios substrato molekul÷s yra solvatuotos, jų stabilumas yra didesnis nei desolvatuotų. Pereinant substrato molekul÷ms iš tirpalo į aktyvų centrą substratas yra desolvatuojamas, jis tampa mažiau stabilus, t.y. labiau chemiškai aktyvus.

Kai substratas patenka į aktyvų centrą, jo įkrautos grup÷s gali būti priverstos sąveikauti su aktyviame centre esančiomis to paties ženklo įkrautomis grup÷mis, tod÷l stebima elektrostatin÷ destabilizacija.

Susidarant fermento substrato kompleksui fermentas ir substratas yra žymiai labiau organizuoti palyginus su laisvu fermentu ir substratu sumaž÷ja entropija ir sistemos stabilumas sumaž÷ja.

99

99

Dauguma fermentų naudoja keletą chemin÷s reakcijos greičio padidinimo strategijų. Chimotripsinas, katalizuojantis peptidinio ryšio hidrolizę, dalyvauja rūgštin÷je-bazin÷je, kovalentin÷je kataliz÷je, lizocimas – rūgštin÷je-bazin÷je kataliz÷je, substrato deformacijoje. 2.7.6 Metalų jonų kataliz÷.

Per 30% visų fermentų aktyvumui reikalingi metalų jonai. Metalų fermentai stipriai suriša dažniausiai pereinamųjų metalų Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, ar Co3+ jonus. Fermentai, kurie silpnai suriša tokius šarminių ar žem÷s šarminių metalų Na+, K+, Mg2+ ar Ca2+ jonus vadinami metalų aktyvuojamais fermentais. Metalų jonų vaidmuo:

• dalyvauja substrato surišime ir orientavime aktyviame centre, • dalyvauja oksidacin÷se redukcin÷se reakcijose, • būdami katijonais elektrostatiškai stabilizuoja ar ekranuoja neigiamą krūvį, • stabilizuoja pereinamąjį būvį, • veikia kaip elektrofiliniai katalizatoriai, stabilizuoja reakcijos metu susidariusį neigiamą

krūvį ar padid÷jusi elektronų tankį. Taip veikia kepenų alkoholio dehidrogenaz÷je Zn2+ jonas,

• kitas svarbus metalų (Me2+) vaidmuo yra sustiprinti nukleofilo paj÷gumą esant neutraliam pH. Koordinuojantis su metalų jonais did÷ja nukleofilo rūgštingumas, protonas lengviau disocijuoja.

Me2+ + NukH ↔ Me2+ ( NukH) ↔ Me2+ (Nuk-) + H+ 2.8 Procesai vykstantys aktyviame centre

2.8.1 Karboksipeptidaz÷s veikimo mechanizmas Panagrin÷kime fermento karboksipeptidaz÷s A aktyvų centrą ir jo veikimo mechanizmą.

1967m. Lipskombas (Lipskomb) nustat÷ tretinę šio fermento struktūrą. Fermento molekulin÷ mas÷ 34000Da, polipeptidin÷ grandin÷ sudaryta iš 307 aminorūgščių, yra vienas disulfidinis ryšys. Karboksipeptidaz÷ A yra egzopeptidaz÷ ją išskiria kasa prokarboksipeptidaz÷s pavidalu. Prokarboksipeptidaz÷ aktyvuojama proteolitin÷s aktyvacijos metu. Fermentas katalizuoja peptidinio ryšio hidrolizę, atskeldamas po vieną aminorūgštį nuo polipeptidin÷s grandin÷s C galo. Karboksipeptidaz÷ A aktyviausia, kai galin÷s aminorūgštys yra aromatin÷s ar hidrofobin÷s. Karboksipeptidaz÷ B lengviau hidrolizuoja peptidinį ryšį, kurį sudaro aminorūgštys turinčios bazinius šoninius radikalus.

-

H3N.....CO-NH-CH-CO-NH-CH-COO + H2O

H3N.....CO-NH-CH-COO

R 1

12

2R

R R

H3N-CH-COO+

karboksipeptidaz÷

+

+ -

- -+

Chemin÷s reakcijos metu hidrolizuojamas peptidinis ryšys. Prie C galin÷s aminorūgšties

(R1) imino (-NH) grup÷s prisijungia protonas, o hidroksigrup÷ reaguoja su R2 aminorūgšties karbonilgrupe, susidarant karboksilatui. Hidrolizuojant peptidinį ryšį m÷gintuv÷lyje be fermento, naudojama koncentruota rūgštis, aukšta temperatūra. Fermentų poveikyje ši reakcija vykdoma neutralioje terp÷je, esant vandenilio jonų koncentracijai 10-7 g-ekv./l.

100

100

Karboksipeptidaz÷ A yra tipiškas Zn fermentas, be to prisijungiant substratui vyksta dideli baltymo molekul÷s konformaciniai pakitimai. Molekul÷s forma yra elipsoidas ir joje randama 38% α-spiralinių segmentų ir 17% β struktūrų. Aktyvus centras išsid÷stęs baltymo molekul÷s paviršiaus įdubime, kur Zn2+ jonas sujungtas koordinaciniais ryšiais su polipeptidin÷je grandin÷je esančiais His69 ir His196 bei aminorūgšties Glu72 abiem karboksigrup÷s deguonies atomais ir vandens molekule. Prisijungus substrato molekulei, cinkas šeštą koordinacinį ryšį sudaro su hidrolizuojamo peptidinio ryšio karbonilo deguonimi.

Zn2+

H2O

COH

Zn2+

H2O

COH

C O

His196His69

O

His196His69

O

Glu72 Glu72 Substrato surišimui yra svarbios šios aminorūgštys: Arg71, Arg127, Asn144, Arg145,Tyr248, ir Glu270. Tiriant karboksipeptidaz÷s veikimo mechanizmą buvo plačiai naudojami slopikliai arba l÷tai reaguojantys substratai. Iškristalinus fermentą su l÷tai hidrolizuojamu substratu glicil-L-tirozinu ir atlikus rentgenostruktūrinę analizę buvo parodyta, kaip dipeptidas reaguoja su fermentu: 1. Dipeptido tirozino šoninis radikalas patenka į fermento aktyvaus centro hidrofobinę kišenę. Į šią kišenę gali patekti tik aromatin÷s ar didel÷s apimties hidrofobin÷s aminorūgštys. 2. Cinkas, esantis aktyviame centre, sudaro koordinacinį ryšį su karbonilin÷s grup÷s deguonimi. Prisijungus substratui, vanduo, kuris buvo aktyviame centre pašalinamas. 3. Arg145 pajuda 0,2nm ir sudaro elektrostatinį ryšį su substrato galine karboksigrupe. Susidarant fermento substrato kompleksui, kinta Glu 270 pad÷tis erdv÷je. 4. Tyr 248 hidroksigrup÷ pasislenka per 1.2nm prie iminogrup÷s ir su ja sudaro vandenilinį ryšį. Jud÷jimas vyksta d÷ka rotacijos apie Cα-Cβ ryšį. Šie fermento aktyvaus centro konformaciniai pakitimai gerai sutinka su Košlando pasiūlyta indukuoto atitikimo teorija. Konformacinių pakitimų d÷ka, iš aktyvaus centro yra pašalinamos molekul÷s vandens ir plyšys užsidaro. Karboksipeptidaz÷s A veikimo modelis buvo pasiūlytas naudojant benzoilglicilfenilalaniną (2.18 pav.). Šiame komplekse karbonilgrup÷ nesudaro koordinacinio ryšio su Zn2+, bet sudaro vandenilinį ryšį su Arg 127 guanidinogrupe. Fermento substrato komplekse Glu270 veikia kaip bendroji baz÷, kuri prisijungia protoną nuo susijungusios su Zn2+ jonais vandens molekul÷s (18(a)pav.) Gem-diolinis (geminalinis) tarpininkas stabilizuojamas sudarant koordinacinį ryšį su Zn2+ (jis gali sudaryti šešis koordinacinius ryšius) (b). Substrato karbonilgrup÷s ataką vandens molekule palengvina Zn2+. Produktai susidaro, kai Glu270 veikia kaip bendroji rūgštis ir duoda protoną nueinančios aminorūgšties azotui (c).

101

101

CH2

CH2

HC

HN

C

C

CC

C

NHO

O

OO

H2N

H

H N

O

O

O

O

NHZn

2+

HH

CH2

CH2

HC

C

C

C

C

C

NHO

O

OO

H2N

H

H N

O

O

O

NH

Zn2+

H

CH2

HC

C

C

CO

OO

H2N

H

H N

O

NH

Zn2+

-

CO

O

-

CH3 N C

O

O

:

144Asn

Arg

Tyr

145

248

Glu

Ser

Tyr His

GluHis

Arg

Arg

270

197

198 127

72

69196

71

:

144Asn

Arg

Tyr

145

248

Glu

Ser

TyrHis

GluHis

Arg

Arg

270

197

198

127

72

69196 71

O

O

OH

144Asn

Arg

Tyr

145

248

Ser

TyrHis

GluHis

Arg71

Arg127

197

198 72

69196

O

H3NGlu270 +

(a)

(b)

(c)

+

+

+

-

-

-

-

NH

-

H

102

102

2.18 pav. Karboksipeptidaz÷s veikimo modelis, skaidant substratą benzoilglicilfenilalaniną Genų inžinerijos eksperimentai privert÷ atsisakyti ilgą laiką vyravusio fermento veikimo mechanizmo, kuriame protono donoro vaidmuo buvo skiriamas Tyr248. Kryptingos mutagenez÷s metodu Tyr248 buvo pakeistas į Phe ir fermento aktyvumas beveik nesumaž÷jo. Įdomu, kad Tyr248 mutantai silpniau suriša substratą, matomai Tyr248 sudaro vandenilinį ryšį su substratu. 2.8.2 Fermento chimotripsino veikimo mechanizmas

Peptidaz÷s katalizuoja peptidinio ryšio hidrolizę baltymuose ar peptiduose. Šiuo metu rekomenduojama proteazes arba proteolizinius fermentus vadinti peptidaz÷mis. Jos gali būti endopeptidaz÷s (skaido peptidinius ryšius viduje polipeptidin÷s grandin÷s) ar egzopeptidaz÷s (atskeliančios aminorūgštis nuo grandin÷s galo) kaip aminopeptidaz÷s ( atskelia nuo baltymo N-galo) ar karboksipeptidaz÷s (atskelia nuo C-galo). Serinin÷s peptidaz÷s yra grup÷ peptidazių, turinčių panašų veikimo mechanizmą ir erdvinę struktūrą, jų aktyviame centre yra serino hidroksigrup÷. Šiems fermentams priklauso virškinimo fermentai chimotripsinas, tripsinas, elastaz÷, kurie sintetinami neaktyvūs kasoje ir aktyvuojami jiems patekus į plonąsias žarnas. (žr.skyr. 2.9.2) Peptidaz÷s hidrolizuoja peptidinius ryšius, tačiau turi skirtingą specifiškumą.

Endopeptidaz÷ chimotripsinas yra vienas iš serininių peptidazių atstovų, sintetinamas kasoje neaktyvaus profermento chimotripsinogeno formoje, kuris plonosiose žarnose proteolitin÷s aktyvacijos metu verčiamas chimotripsinu.. Fermentas greitai hidrolizuoja peptidinį ryšį, kai karbonilgrup÷ priklauso aromatin÷ms aminorūgštims ( R1 = Phe, Tyr, Trp) ir l÷tai ties Leu, Asn, Glu, His, Met, Ser Thr.

H3N.....-NH-CH-CO-NH-CH-CO-

H3N..... -NH-CH-COO

1 2RR

H3N-CH-CO -

1R R 2

+

+ --

+

....COO + H2O

....COO-

-

-+

Chimotripsino (molekulin÷ mas÷ 25 kDa) molekul÷ sudaryta iš 3 polipeptidinių grandinių

sujungtų dviem disulfidiniais tilteliais. Peptidinio ryšio hidroliz÷ nesant katalizatoriaus yra labai l÷ta, neutraliame pH ir 250C temperatūroje t1/2 yra ~300-600 metų. Chimotripsinas padidina baltymų hidroliz÷s greitį 109 karto. Fermento poveikyje vanduo tiesiai neprisijungia prie peptidin÷s grup÷s, reakcija vyksta susidarant tarpiniam acilfermentui, kuris jau atakuojamas vandens.

Chimotripsinas veikia ir kaip peptidaz÷ ir kaip esteraz÷. Chimotripsino esterazinio aktyvumo tyrimas leido išaiškinti fermento veikimo mechanizmą. Chimotripsinas hidrolizuoja p-nitrofenilacetatą ir susidaro acetatas ir p-nitrofenoliatas. Reakcija vyksta per dvi stadijas.

103

103

CH3

O

O NO2

CH3

O

NO2OO

C

p-Nitrofenilacetatas

H20

2H+

Chimotripsinas

C - -

Acetatas p-Nitrofenoliatas

. 2.19 pav. p-Nitrofenolio hidroliz÷ katalizuojant chimotripsinui

Pirmoje stadijoje labai greitai susidaro spalvotas p-nitrofenoliatas, kurio kiekis lygus

esančio fermento kiekiui. Antroje stadijoje p-nitrofenoliatas susidaro l÷tai, tačiau pastoviu greičiu, nepriklausančiu nuo substrato koncentracijos. Eksperimentiniai duomenys rodo, kad pirmoje stadijoje p-nitrofenilacetatas greitai reaguoja su fermentu atsipalaiduoja p-nitrofenoliatas, o acetatas kovalentiniu ryšiu prisijungia prie fermento ir susidaro acetilfermentas. Antroje stadijoje acetilfermentas l÷tai hidrolizuojamas ir atsipalaiduoja acetatas. Chimotripsino katalizuojama peptido hidroliz÷ vyksta tuo pačiu mechanizmu, susidarant kovalentiniam acilfermento tarpininkui.

Fermento aktyviame centre nustatyti 3 aminorūgščių likučiai – His57, Asp102 ir Ser195. Diizopropilfluorfosfatas (DIPFP) negrįžtamai inhibuoja chimotripsiną. Jis kovalentiniu ryšiu specifiškai prisijungia tiktai prie Ser195, esančio aktyviame centre ir nereaguoja su kitomis baltymo serino hidroksigrup÷mis. His57 buvo nustatytas prijungiant afininę žymę – p-toluensulfonilfenilalanino chlormetilketoną (TosPheCH2Cl). Šis slopiklis yra panašus į dirbtinį fermento substratą p-toluensulfonilfenilalanilgliciną ir tvirtai susijungia su fermento His57 aminorūgštimi. Rentgenostruktūrin÷s analiz÷s metodu aktyviame centre buvo nustatyta Asp102 aminorūgštis.

104

104

Fermento katalizuojamoje peptidinio ryšio hidroliz÷s reakcijoje galima išskirti dvi stadijas – acilinimą (2.20 pav. a). ir deacilinimą (2.20 pav. b). Acilinimo stadijos metu suardomas peptidinis ryšys gaunamas produktas P1 ir susidaro tarpinis acilfermento kompleksas. Deacilinimo metu, hidrolizuojant acilfermetą susidaro antras produktas P2 ir regeneruojamas fermentas. A) acilinimo stadija: 1 Substratas prisijungia prie fermento aktyvaus centro. Substrato prijungime labai svarbų

vaidmenį vaidina aminorūgšties R1 šoninis radikalas, reakcija vyksta greičiausiai, kai šis radikalas yra aminorūgščių Phe, Tyr, Trp aromatinis žiedas. Substrato surišimui reikalingos Gly216, Gly226, Gly189 aminorūgščių liekanos.

2 Acilinimo stadijoje Ser195 deguonies atomas yra nukleofilas ir atakuoja skaidomą peptidinį ryšį. Serino hidroksimetilo grup÷ yra silpnas nukleofilas, jos pK yra apie 16. Fermente Ser195 hidroksigrup÷ sudaro vandenilinį ryšį su His57, kuris savo ruožtu vandeniliniu ryšiu susijungęs su Asp102. Šių ryšių d÷ka padidinamas serino -OH nukleofiliškumas. Šios trys aminorūgštys yra vadinamos katalizine triada.

3 His57 funkcionuoja kaip bendroji baz÷, ji paima protoną nuo Ser195 hidroksigrup÷s ir padidina deguonies nukleofiliškumą. Susidariusi ant imidazolio jono teigiamą krūvį stabilizuoja Asp102 molekul÷s karboksigrup÷. Asparto karboksigrup÷ yra viena iš keletos –COO- grupių, kurios pasl÷ptos baltymo globul÷s viduje. Nukleofilinis serino deguonis atakuoja skaidomo peptidinio ryšio karbonilo anglies atomą, susidarant tetraedriniam tarpininkui (E-TI1), kuris yra šios reakcijos pereinamasis būvis. Susidariusiame tetraedriniame tarpininke ryšys tarp anglies ir deguonies (C=O) keičiasi iš dvigubo į ilgesnį viengubą ryšį (C__O-). Tada neigiamą krūvį turintis deguonis (oksianijonas) juda į laisvą vietą, vadinamą oksianijono plyšiu, kur sudaro vandenilinius ryšius su peptidin÷s grandin÷s aminorūgščių Gly193 ir Ser195 -NH grup÷mis Šie vandeniliniai ryšiai stabilizuoja pereinamąjį būvį, geriau prijungdami oksianijoninę substrato formą prie fermento.

4 His57, prisijungęs protoną (imidazolio jonas) veikia kaip rūgštinis katalizatorius duodamas protoną skaidomo peptidinio ryšio azoto atomui. Susidariusi laisva karbonilgrup÷ prijungiama

105

105

prie fermento serino hidroksigrup÷s ir susidaro

Asp CH2

CH2 CH2

C

C

C

OO

O

O

O

HH

H

H

H

N N

His

102

57

195

N

N

N

Gly

Ser

193

2 1R R

-(1)

Asp CH2

CH2 CH2

C

C

CO

O

OO

HH

H

H

H

N N

His

102

57

195

N

N

N

Gly

Ser

193

2

1R

R-

(2)

Asp CH2

CH2

C

C

OO

H

H

H

His

102

57

195

N

N Gly

Ser

193

-

CH2

CO

H

H

N

2

1R

R

NN +

-

O

Asp CH2

CH2

C

C

OO

H

H

H

His

102

57

195

N

N Gly

Ser

193

-

CH2

CO

HN2

1

R

R

NN

H

substratas

E+S

E-S

oksianijonoplyšys

E-TI 1(3)

Produktas P1

α

α

α

α

Acilfermentas(4)

2.20 pav. Chimotripsino veikimo mechanizmas (a)

106

106

O

CH2

CH2

C

C

OO

H

H

H

His

102

57

195

N

N Gly

Ser

193

-

CH2

CO

HO

1R

NN +

-

H

O

Asp CH2

CH2

C

C

OO

H

H

H

His

102

57

195

N

N Gly

Ser

193

-

α

CH2

CO

R

NN

H

HO

(6)

CH2

CH2 CH2

C

C

CO

O

OO

HH

H

H

H

N N

His

102

57

195

N

N

O

Gly

Ser

193

1R

-

Asp CH2

CH2 CH2

C

C

OO

O

OH

H

H

HN N

His

102

57

195

N

N Gly

Ser

193

-

oksianijonoplyšys

1

E-P2 (7)

E + P

2

C1

R O + +-H

Produktas P

2

Asp

Asp

(5)

(8)

α

α

α

H2O

E-TI 2

2.20 pav. Chimotripsino veikimo mechanizmas (b) tarpinis acilfermentas.. Pirmasis produktas (P1) pasišalina nuo fermento. B) Deacilinimo stadija

107

107

5 Produktą P1 aktyviame centre pakeičia vanduo. 6 Acilfermentas yra nestabilus ir jį lengvai hidrolizuoja vanduo Acilfermento hidroliz÷

prasideda, kai vanduo duoda protoną His57 ir suteikia galimybę OH- atakuoti karbonilinę grupę. Susidaro antras tetraedrinis E-TI2 tarpininkas, kuris stabilizuojamas oksianijono plyšyje.

7 Tapęs imidazolio katijonu His57 yra rūgštis, ji duoda protoną serinui, suyra tetraedrinis E-TI2 tarpininkas ir susidaro antras produktas (P2).

8 Iš aktyvaus centro pasišalina produktas (P2) ir regeneruojamas chimotripsinas. Šis fermentas yra ryškus pavyzdys kaip realizuojami pagrindiniai fermentin÷s kataliz÷s

principai – pereinamojo būvio susidarymas ir jo stabilizacija, rūgštin÷-bazin÷, kovalentin÷ kataliz÷s.

Jaučio chimotripsinas, jaučio tripsinas ir kiaul÷s elastaz÷ yra homologiški baltymai, jų pirmin÷s struktūros yra ~40% identiškos ir jų tretin÷s struktūros taip pat panašios. Aminorūgščių seka ties serinu aktyviame centre yra vienoda – Gly-Asp-Ser-Gly. His yra greta Ser ir susidaro vandenilinis ryšys tarp histidino imidazolo žiedo ir serino hidroksigrup÷s. Kitas histidino azoto atomas sudaro vandenilinį ryšį su asparto karboksigrupe. Serinin÷s peptidaz÷s pasižymi skirtingu substratiniu specifiškumu. Specifiškumą substratui sąlygoja nedideli pakitimai fermento aktyviojo centro kontaktin÷je dalyje, kuri prijungia substratą (2.21 pav.) Chimotripsinas greičiausiai katalizuoja peptidinio ryšio hidrolizę ties aromatin÷mis aminorūgštimis, tod÷l kad substratą surišanti sritis sudaryta iš nepolinių aminorūgščių šoninių radikalų. Tripsinas (2.21 B pav.), substratą surišančioje srityje, turi gilią “specifinę kišenę”, kurioje yra aspartatas suteikiantis neigiamą krūvį. Tai paaiškina, kod÷l tripsinas katalizuoja peptidinio ryšio hidrolizę ties teigiamai įkrautomis lizino ir arginino aminorūgštimis. Elastaz÷je, specifin÷ kišen÷ sudaryta iš nedidelių, nepolinių radikalų, tod÷l į ją gali patekti nedidel÷s aminorūgštys tokios kaip alaninas, glicinas, valinas . Tripsino molekul÷je pakeitus Asp189→Lys189, fermentas praranda specifiškumą bazin÷ms aminorūgštims.

CH2

CH N

HO

CH N

HO

CH3

NH3

CH2

CH2

CH2

CH2

CH N

HO

+

Asp

Val Thr

Phe Lys Ala

A B

C

-

2.21 pav. Serininių peptidazių substratą surišanti sritis. A- chimotripsinas, B – tripsinas, C - elastaz÷

Panašų veikimo mechanizmą turi ir kitos peptidaz÷s. Papainas, išskirtas iš papaja Carica papaja vaisių yra vienas iš didel÷s cisteino (tiolinių) peptidazių atstovų. Joms priklauso bromelainas iš ananasų, aktinidinas iš kivi vaisių. Fermento aktyviame centre cisteino siera yra nukleofilas, kuris atakuoja peptidinį ryšį. Šalia išsid÷sto histidinas, kuris paima protoną nuo –SH grup÷s ir didina jos nukleofiliškumą. Dauguma lizosominių peptidazių, vadinamų katepsinais yra nedideli 20-40 kDa glikoproteinai turintys aktyviame centre cisteiną.

108

108

Didel÷ grup÷ cisteino, aspartatui specifinių peptidazių (kaspaz÷s) vaidina labai svarbų vaidmenį programuotoje ląstel÷s žūtyje (apoptoz÷je).

Asparto peptidaz÷s. Šiai grupei priklauso skrandžio peptidaz÷s pepsinai ir gastriksinas. Pepsinai nepasižymi dideliu specifiškumu, tačiau hidrolizuoja peptidinius ryšius tarp hidrofobinių aminorūgščių. Chimozinas (renninas) iš veršiuko šliužo (ketvirtojo skrandžio) skaido pieno κ−kazeiną tarp Phe ir Met. Jis sumažina pieno micelių stabilumą ir pienas sutraukiamas. Fermentas naudojamas sūrių gamyboje.. Fermentas reninas yra glikoproteinas, susidaro inkstuose ir kraujo plazmoje iš prorenino, hidrolizuoja angiotenzinogeno molekul÷je peptidinį ryšį tarp dviejų Leu-Leu molekulių. Susidaręs angiotenzinas I dalyvauja kraujo spaudimo reguliacijoje.. Šių peptidazių aktyviame centre yra dvi asparto rūgšties karboksigrup÷s. Viena iš šių grupių yra nukleofilas, o kita yra protonų donoras skaidomai grupei. 2.9 Fermentų aktyvumo reguliacija

Viena iš svarbiausių fermentų savybių yra jų aktyvumo reguliacija, tod÷l ląstel÷s metabolizmas yra koordinuotas ir kontroliuojamas. Priklausomai nuo įvairių reguliatorių, aplinkos sąlygų, nuo substratų ar produktų pertekliaus ar trūkumo, kinta fermento aktyvumas.

Fermentų aktyvumas gali būti reguliuojamas dviem keliais: A keičiant fermento koncentraciją, B keičiant fermento aktyvumą

Fermento koncentracija yra keičiama: • reguliuojant fermento sintez÷s greitį genų raiškos. Pavyzdžiui E.coli, auginamos

terp÷je be disacharido laktoz÷s nesintetina fermento β−galaktozidaz÷s. Pra÷jus keliom minut÷ms po laktoz÷s įd÷jimo, ekspresuojamas genas ir prasideda fermento β−galaktozidaz÷s sintez÷. Fermentas katalizuoja laktoz÷s hidrolizę iki gliukoz÷s ir galaktoz÷s. Laktoz÷s koncentracijai sumaž÷jus, fermento sintez÷ sustoja.

• reguliuojant fermentų degradacijos greitį. Ląstel÷je proteosomų ir kitų proteolitinių fermentų aktyvumas yra keičiamas, tuo pačiu reguliuojama baltymo gyvenimo trukm÷.

Šiuo būdu fermentų aktyvumas kontroliuojamas visuose organizmuose, tačiau fermentų sintez÷ ir degradacija yra l÷tas procesas, kuris.gali tęstis nuo kelių minučių iki kelių valandų. Fermentinių reakcijų greita reguliacija vyksta moduliuojant reguliacinius fermentus. Dauguma tokių fermentų katalizuoja metabolinių kelių pirminius etapus. Reguliacinių fermentų aktyvumas kinta priklausomai nuo aplinkos signalų, tokiu būdu ląstel÷s ir organizmai gali prisitaikinti prie kintančių aplinkos sąlygų, keisdamos metabolinių procesų greitį. Reguliacinių fermentų aktyvumas išauga padid÷jus atitinkamų substratų ar sumaž÷jus produktų koncentracijoms ir atvirkščiai. Galimi keli reguliacijos būdai:

• grįžtama kovalentin÷ modifikacija, • proteolitin÷ aktyvacija, • alosterin÷ reguliacija, • konkurencinis, nekonkurencinis slopinimas, • stimuliacija ar slopinimas atitinkamais reguliaciniais baltymais,

2.9.1 Gr įžtama kovalentin÷ modifikacija. Kai kurių fermentų katalizinis aktyvumas yra didinamas arba mažinamas kovalentiškai

prijungus prie jų atitinkamas chemines grupes. Fermentų aktyvumas kinta paveikus ląsteles išoriniais stimulais – hormonais, augimo faktoriais ir kitomis medžiagomis, kurios keičia antrinių

109

109

informacijos tarpininkų (cAMP, cGMP, Ca2+, IP3 ir kitų ) viduląstelinę koncentraciją. Jie aktyvuoja fermentus, kurie kovalentiškai modifikuoja baltymus. Viena iš plačiausiai paplitusių modifikacijų yra fosforo rūgšties liekanos prijungimas . Reakciją katalizuoja fermentai baltymo kinaz÷s, kurie perneša galinę fosforo rūgšties liekaną nuo ATP ant reguliuojamo baltymo. Dažniausiai fosforilinamos aminorūgščių serino, tirozino, treonino hidroksigrup÷s, ar histidino imidazolo žiedas. Fosforilinus baltymą, vienų fermentų aktyvumas gali padid÷ti, kitų – sumaž÷ti. Įvedus į baltymo molekulę du neigiamus krūvius atsiranda papildomi joniniai ryšiai su teigiamai įkrautomis lizino ar arginino aminorūgštimis arba stebimos atostūmio j÷gos tarp fosfato ir glutamato ar aspartato karboksigrupių. Fosforilinus baltymą, gali pakisti jo konformacija arba keistis substrato surišimo su fermento aktyviuoju centru efektyvumas. Pradinis fermento aktyvumas atstatomas pašalinus fosforo rūgšties liekaną. Fosfoesterinio ryšio hidrolizę katalizuoja fosfataz÷s.

ATP ADP

Fermentas

OH

Fermentas

OPO32-

H3PO4 H2O

Proteino kinaz÷

Proteino fosfataz÷

Vienas iš geriausiai ištirtų fermentų reguliuojamas grįžtamos kovalentin÷s modifikacijos

būdu yra glikogeno fosforilaz÷, katalizuojanti glikogeno skaidymą. (žr. skyrius 7.5). Fosforilaz÷s kinaz÷ prijungia fosforo rūgšties liekaną prie Ser14 hidroksigrup÷s ir aktyvuoja fermentą. Prijungus neigiamą krūvį turinčią fosforo rūgšties liekaną, keičiasi baltymo erdvin÷ struktūra. Polipeptidin÷je grandin÷je esantys nespiralizuoti aminorūgščių segmentai spiralizuojasi, susidaro joninis ryšys tarp neigiamai įkrautos fosfato grup÷s ir teigiamos arginino aminorūgšties radikalo. Susiformuoja papildomi vandeniliniai ryšiai. Pakitus baltymo konformacijai kinta substrato ir moduliatoriaus prisijungimo efektyvumas, vyksta T→R per÷jimas, taip pat pasireiškia alosterin÷ reguliacija. (žr. skyrių 2.9.3)

Prijungus fosforo rūgšties liekaną prie izocitrato dehidrogenaz÷s, fermento aktyvumas slopinamas. Izocitrato molekul÷ jungiasi su baltymu per serino hidroksigrupę. Modifikavus fermentą, baltymo molekul÷je atsiranda papildomas neigiamas krūvis ir vietoje vandenilinio ryšio, kuriuo jungiasi substratas su fermentu, pradeda veikti atostūmio j÷gos tarp izocitrato karboksigrup÷s ir fermento aktyviame centre esančio fosfato.

Labai svarbūs fosforilinimo reiškiniai signalo perdavimo procesuose. Paveikus atitinkamus receptorius hormonais, augimo faktoriais ar kitais efektoriais yra autofosforilinama receptoriaus tirozino hidroksigrup÷. Toliau signalas perduodamas per baltymo kinazes, fosforilinami taikinio baltymai, kinta fermentų aktyvumai, metabolitų koncentracijos, vyksta ląstelių diferencijacija, proliferacija ir kiti procesai.

Fermentai gali būti modifikuojami ne tik juos fosforilinant, bet adenilinant, uridilinant , ADP-ribozilinant , metilinant .( 2.12 lentel÷)

110

110

2.12 lentel÷. Kovalentin÷ modifikacijos būdai Modifikuojanti grup÷ Modifikuojamos

aminorūgštys Fosforilinimas -PO3H2 Tyr, Ser, Thr, His Adenilinimas AMP Tyr Uridilinimas UMP Tyr ADP ribozilinimas ADP-riboz÷ Arg, Gln, Cys, diftamidas

(modifikuotas histidinas) Metilinimas -CH3 Glu

ADP-ribozilinimas n÷ra labai plačiai paplitęs, tačiau labai svarbus kai kurių toksinų veikimui. ADP-riboz÷ ant baltymo yra pernešama nuo NAD’o. Paveikus difterijos toksinu, ADP-riboz÷ prijungiama prie elongacijos faktoriaus 2 ir inhibuojama baltymų biosintez÷. Choleros toksinas, sekretuojamas Vibrio cholerae yra 84kDa baltymas suadytas iš dviejų subvienetų. B subvienetas prisijungia prie ląstel÷s paviršiaus esančio receptoriaus (gangliozido GM1), o patekęs į ląstel÷s vidų A subvienetas aktyvuoja ADP riboziltransferazę, kuri katalizuoja G baltymo α subvieneto Arg aminorūgšties ADP-ribozilinimą. Ribozilinto α subvieneto slopinamas GTPazinis aktyvumas ir jis tampa negrįžtamu adenilato ciklaz÷s aktyvatoriumi.

O

H

OH

H

OH

HH

CH2 O P O P O CH2

O O

O OO

HH H

H

OHOH

Ade

Fermentas

NAD nikotinamidas

- -

Fermentas

2.22 pav. ADP ribozilinimo reakcija

Žarnyno epitelinių ląstelių adenilato ciklaz÷s aktyvumas lieka pastoviai aukštas, tod÷l padid÷ja Cl-, HCO3

- ir vandens sekrecija į žarnyną. Elektrolitų praradimas ir organizmo dehidratacija gali būti mirties priežastimi. Glutamino sintetaz÷s aktyvumas reguliuojamas fermentą adenilinant arba uridilinant. ( skyrius ). Prijungus metilo grupę nuo S-adenozil-metionino prie bakterijų chemotaksio baltymo yra reguliuojamas bakterijų jud÷jimas prie atraktanto (pavyzdžiui cukraus) arba plaukimas nuo repelento. 2.9.2 Proteolizin÷ aktyvacija

Yra grup÷ fermentų, kurie organizme sintetinami neaktyvūs ir yra aktyvuojami hidrolizuojant vieną ar kelis neaktyvaus fermento pirmtako, vadinamo zimogenu arba profermentu, peptidinius ryšius.

Šie proteolitin÷s aktyvacijos reiškiniai plačiai paplitę virškinimo, kraujo kreš÷jimo procesuose, programuotos ląstel÷s žūties atveju, be to, kai kurie hormonai, pvz. insulinas sintetinamas neaktyvaus proinsulino pavidalu ir aktyvuojamas atskeliant oligopeptidą.

2.13 lentel÷. Kasos ir skrandžio zimogenai

Sintez÷s vieta Zimogenas Aktyvus fermentas Skrandis Pepsinogenas pepsinas,

Kasa Chimotripsinogenas chimotripsinas Kasa Tripsinogenas tripsinas Kasa Prokarboksipeptidaz÷ karboksipeptidaz÷

111

111

Proteolitin÷ aktyvacija, skirtingai nuo kitų reguliavimo kelių yra negrįžtama. Aktyvuojant

zimogenus pakinta pirmin÷ baltymo struktūra, keičiasi ir tretin÷. Tripsinogenas (245 aminorūgštys) yra aktyvuojamas plonosiose žarnose hormonų

kontroliuojamos enteropeptidaz÷s, atskeliant nuo polipeptidin÷s grandin÷s N galo heksapeptidą Val-(Asp)4-Lys. Aktyvus tripsinas gali katalizuoti tolimesnę tripsinogeno hidrolizę, taigi tripsinogeno aktyvacija yra autokatalizin÷.

Pepsinogenas gaminamas skrandžio pagrindinių ląstelių yra neaktyvus profermentas, kuris skrandyje aktyvuojamas HCl ir pepsino, atskeliant 42 aminorūgščių oligopeptidą nuo polipeptidin÷s grandin÷s N galo.

Kasoje sintetinamas neaktyvus chimotripsinogenas sudarytas iš vienos 245 aminorūgščių polipeptidin÷s grandin÷s, kurios erdvinę struktūrą palaiko 5 disulfidiniai ryšiai. Patekęs į plonąsias žarnas zimogenas yra aktyvuojamas. Tripsino poveikyje hidrolizuojamas peptidinis ryšys tarp Arg15 ir Ile16 ir susidaro π chimotripsinas. Aktyvus π chimotripsinas veikia kitą π chimotripsino molekulę, atskeliami 2 dipeptidai Ser14-Arg15 bei Thr147-Asn148 ir susidaro subrendusi peptidaz÷ - α chimotripsinas. (2.24 pav.)

Trys grandin÷s A, B ir C sujungtos disulfidiniais ryšiais. Skylant peptidiniam ryšiui tarp Arg15 ir Ile16, susidaro naujas teigiamas krūvis ant N-galin÷s aminorūgšties Ile16, kuris sudaro elektrostatinį ryšį su Asp194 karboksigrupe. Kinta baltymo struktūra ir susiformuoja fermento aktyvus centras, kuriame aminorūgštys Asp102-His57-Ser195 sudaro katalizinę triadą, bei atsiranda oksianijonis plyšis.(žr.skyrių 2.8.2)

S - S S - S

S - S S - S

S - S S - S

15 16

13 16 146 149

245

245

Chimotripsinogenas /neaktyvus/

π chimotripsinas /aktyvus/

α chimotripsinas /aktyvus/

Tripsinas

π chimotripsinas

Ser14 - Arg15Thr147 - Asn148

A grandin÷ B grandin÷ C grandin÷

Leu Ile Tyr Ala1

1

Arg Ilepeptidinis ryšys skyla ties Arg15

1 42 58 122 136 168 182 191 201 220 245

S - S S - S S - S

2.24 pav. Chimotripsino proteolitin÷ aktyvacija

Programuotos ląstelių žūties (apoptoz÷s) metu labai svarbų vaidmenį vaidina proteolitiniai fermentai vadinami kaspaz÷mis. Tai yra cisteinin÷s peptidaz÷s aktyviame centre turinčios cisteiną

112

112

ir specifiškai skaidančios baltymą prie asparto aminorūgšties. Jos yra sintetinamos prokaspazių pavidalu ir aktyvuojamos ląstel÷s išor÷s ar vidaus faktorių.

pav. Kaspaz÷s 7 proteolitin÷ aktyvacija. A-prokaspaz÷ 7, B- aktyvuota kaspaz÷ 7. Geltoni

rutuliukai aminorūgštis cisteinas, m÷lyni – du argininai ir lizinas. Kaspaz÷je 7 bazin÷s aminorūgštys ir cisteinas suart÷ja ir suformuoja aktyvų centrą kuris skaido polipeptidą ties asparto amino rūgštimi. (Oranžine spalva pažym÷tas polipeptidp fragmentas). (PDB filas)

Kitas įdomus pavyzdys yra hormono insulino susidarymas iš proinsulino. Kasoje insulinas sintetinamas preproinsulino pavidalu. Pradžioje nuo preproinsulino N galo nuskeliamas 23 aminorūgščių signalinis peptidas, reikalingas baltymo pernešimui pro endoplazminio tinklo membraną ir gauname proinsuliną (2.25 pav.). Peptidaz÷s pašalina proinsulino molekul÷s viduje tarp 31 ir 65 aminorūgšties oligopeptidą (C peptidas) ir susidaro aktyvus insulinas. Insulinas sudarytas iš dviejų grandinių A (21 aminorūgštis) ir B (30 aminorūgščių), kurios sujungtos dviem disulfidiniais ryšiais.

2.25 pav. Proinsulino aktyvacija

113

113

Neaktyvių zimogenų sintez÷ yra labai svarbi organizmo ląstelių struktūros palaikymui. Peptidaz÷s yra sintetinamos kasoje, jos aktyvuojamos ir skaido baltymus žarnyne. Tripsinas aktyvuoja chimotripsinogeną, prokarboksipeptidazę A ir B bei profosfolipazę A2. Ankstyva tripsino aktyvacija pavyzdžiui kasoje gali sukelti nepataisomus pakitimus, aktyvuoti fermentai suardo pačias ląsteles. Iš tiesų, sergant pankreatitu, aktyvus tripsinas ir chimotripsinas atsipalaiduoja kasoje ir sutrinka jos funkcijos. Kasa papildomai save apsaugo sintetindama baltymą vadinama kasos tripsino slopikliu . Susijungęs su tripsinu jis jį inhibuoja. Ryšys tarp tripsino ir jo slopiklio yra viena iš stipriausių nekovalentinių sąveikų žinomų biochemijoje. Viena iš sistemų atsparių peptidazių veikimui yra kraujas, apie 10% kraujo serumo baltymų yra peptidazių slopikliai.

α−proteinaz÷s slopiklis inhibuoja neutrofilų elastazę. Sumaž÷jus šio slopiklio aktyvumui išsivysto plaučių emfizema, degeneratyvin÷ plaučių liga, kurią sukelia elastinių fibrili ų hidroliz÷. Rūkančių žmonių α−proteinaz÷s slopiklio aktyvumas sumaž÷ja d÷l aktyviame centre esančios aminorūgšties metionino oksidacijos.

Žarnyno epitelin÷s ląstel÷s apsisaugo nuo peptidazių poveikio glikozilindamos savo paviršiaus baltymus.

2.9.3 Alosterin÷ reguliacija

Alosteriniai baltymai yra tokie baltymai, kurie turi dvi ar daugiau stereospecifiškai skirtingas receptorines sritis. Viena iš jų yra aktyvus centras ir suriša substratą, kita alosterin÷ sritis (gr.allos kita) suriša reguliatorinę molekulę. Alosterinių fermentų konformacija ir aktyvumas kinta prijungus atitinkamus aktyvatorius ar slopiklius, kurie vadinami alosteriniais moduliatoriais arba alosteriniais efektoriais. Jie jungiasi prie fermento nekovalentiniais ryšiais ir dažniausiai kitoje nei fermento aktyvus centras srityje. Alosteriniai fermentai dažnai sudaryti iš kelių subvienetų, reguliatorin÷ sritis ir aktyvus centras gali būti skirtinguose subvienetuose. Prisijungęs alosterinis efektorius keičia baltymo konformaciją, tod÷l gali keistis fermento giminingumas substratui, gali būti modifikuojamas maksimalus fermentin÷s reakcijos greitis arba gali keistis abu parametrai. Efektoriai, kurie mažina fermento aktyvumą vadinami neigiamais efektoriais arba alosteriniais slopikliais, o tie kurie didina fermento aktyvumą – teigiamais efektoriais arba alosteriniais.aktyvatoriais

Alosterinių reakcijų efektoriais gali būti ir substratai. Kai efektorius ir substratas yra identiški jie vadinami homotrofiniais efektoriais. Hemoglobinas yra alosterinis baltymas sudarytas iš keturių subvienetų. Prisijungus deguonies molekulei prie vieno iš subvienetų, kinta kitų konformacija ir pager÷ja deguonies molekuliųsurišimas. Deguonis yra homotrofinis efektorius. Dažnai alosterinis substratas veikia kaip teigiamas efektorius. Substrato molekul÷ prisijungusi prie alosterinio centro padidina kito substrato susirišimą su aktyviuoju centru ir fermento katalizinis aktyvumas padid÷ja. Šis efektas vadinamas teigiamu homotrofiniu efektu. Jeigu efektoriaus struktūra skiriasi nuo substrato struktūros, tada turime heterotrofin į efektorių.

Tiriant multifermentinių reakcijų kinetiką dažnai stebima grįžtamo ryšio slopinimas. Šio tipo slopinimu efektyviai reguliuojamos daugiastadijin÷s fermentin÷s reakcijos. Susikaupus galutinio ar tarpinio produkto didesn÷ms koncentracijoms, slopinamos pradin÷s proceso stadijos ir substrato skaidymas sul÷t÷ja ir ląstel÷je nesikaupia tarpiniai metabolitai.

A B C D PE1 E2 E3 E4

114

114

Šio daugiastadijinio proceso galutinis reakcijos produktas (P) inhibuoja fermentą (E1), kuris katalizuoja pirmą fermentinio proceso stadiją.

Grįžtamojo ryšio inhibicijos ir alosterin÷s reguliacijos pirmieji eksperimentiniai rezultatai buvo gauti, tiriant fermentą aspartato transkarbamoilazę (ATKaz÷), kuri katalizuoja karbamoilaspartato susidarymą. Ši reakcija yra pradin÷ metabolinio kelio, kurio metu sintezuojami pirimidino nukleotidai, stadija (žr.skyrius 15.4.7).

H2N-CO-O-PO3H3N-CH-COO

CH2

COOH

H3N-CO-NH-CH-COO

CH2

COOH

2- + CTP- -++

Karbamoilfosfatas Aspartatas Karbamoilaspartatas

ATKaz÷

2.26 pav. Transkarbamoilazin÷ reakcija

Kondensuojantis karbamoilfosfatui ir aspartatui, susidaro karbamoilaspartatas, kuris toliau yra panaudojamas CTP sintezei . Alosteriškai reguliuojamų fermentų kinetin÷s kreiv÷s skiriasi nuo nereguliuojamų. Daugumai alosterinių fermentų reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo substrato koncentracijos išreiškiama sigmoidine kreive, o ne hiperbole. Sigmoidin÷ priklausomyb÷ atspindi kooperatyvinę sąveika tarp atskirų baltymo subvienetų. Struktūros pakitimai viename subvienete perduodami kitiem subvienetams, efektas atsiranda d÷l nekovalentin÷s sąveikos tarp atskirų subvienetų.

2.27 pav. Fermentines reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo substrato koncentracijos alosteriniams fermentams. Sigmoidin÷ kreiv÷ alosteriniams fermentams (2 kreiv÷), teigiamo (1 kreiv÷) ir neigiamo (3 kreiv÷) moduliatoriaus poveikis: Vmax nekinta, kinta K0,5.

Aspartatas ir karbamoilfosfatas susiriša su fermentu kooperatyviai, jie didina fermentin÷s reakcijos greitį, jie yra teigiamis homotrofiniai efektoriai.

CTP, kuris yra galutinis metabolinio kelio produktas, inhibuoja aspartato transkarbamoilazę. CTP poveikyje susilpn÷ja fermento paj÷gumas surišti substratą. Vmax nekinta, o KM did÷ja kaip ir konkurencin÷s inhibicijos metu. CTP yra neigiamas heterotrofinis efektorius.

115

115

ATP stimuliuoja fermentinę reakciją. ATP yra teigiamas heterotrofinis efektorius. Jis padidina substratų susirišimą su fermentu.

Reguliuojami baltymai dažniausiai sudaryti iš kelių vienodų arba skirtingų subvienetų subvienetų. Jeigu baltymas sudarytas iš vienodų subvienetų, tai kiekvienas gali tur÷ti ir katalizinį ir reguliatorinį centrą. Vienas centras suriša moduliatorių, kitas substratą, tačiau tarp šių centrų yra ryšys, prisijungus efektoriui kinta aktyvaus centro konformacija. Reguliuojamų baltymų sudarytų iš skirtingų subvienetų struktūra yra sud÷tingesn÷, vieni subvienetai gali prijungti efektorius, kiti – substratus.

Alosteriškai reguliuojamas fermentas turi mažiausiai vieną substratą, kuriam reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo substrato koncentracijos išreiškiama sigmoidine kreive, o ne hiperbole. Alosteriniam fermentui fosfofruktokinazei-1 reakcijos greičio priklausomyb÷s nuo ATP koncentracijos grafikas yra hiperbol÷, tačiau fruktoz÷s 6-fosfato atžvilgiu gauname sigmoidine kreivę.

Alosterinių baltymų ir fermentų savybes aiškina dvi hipotez÷s: suderinto veikimo ir nuoseklaus veikimo.

Suderinto veikimo hipotezę pasiūl÷ Mono (J.Monod), Vaimanas (J.Wyman) ir Šanže (J.P. Changeux). Jie galvojo, kad, kad alosteriniai fermentai susideda iš kelių identiškų subvienetų, kurie gali būti dviejose, skirtingose konformacijose: 1) R konformacija (relax-relaksuota), jos giminingumas substratui ir aktyvatoriui yra didelis. 2) T konformacija (tense-įtempta), jos giminingumas substratui mažas, bet suriša slopiklį.

Daroma prielaida, kad molekul÷s simetrijos išlaikymui subvienetai turi būti toje pačioje konformacijoje arba R arba T, ir negali būti kartu susijungę RT. Tirpale tarp šių formų nusistovi pusiausvyra, kuri nukreipta į T formos pusę. Pereinant iš T būvio į R visų subvienetų konformacija keičiasi suderintai.

TT RR

Esant terp÷je nedidel÷ms substrato koncentracijoms jis jungiasi su R forma. Susidarius substrato ir R formos kompleksui pusiausvyra pastumiama iš T į R ir padaug÷ja aktyvių centrų, galinčių surišti substrato molekules. Pavyzdžiui, jeigu fermentas sudarytas iš dviejų subvienetų ir prie R formos prisijungia viena S molekul÷, tai papildomai du T formos subvienetai pereina į R ir atsiranda jau 3 aktyvūs centrai, prie kurių jungiasi substratai. Tokiu būdu pasireiškia substrato kooperatyvinis poveikis ir stebima sigmoidin÷ reakcijos greičio priklausomyb÷ nuo substrato koncentracijos.

Analogiškai aiškinamas alosterinio aktyvatoriaus poveikis. Aktyvatorius stipriau susiriša R konformacija, ir fermentas iš T formos pereina į R. Esant didel÷m aktyvatoriaus koncentracijoms, visa T forma pereina į R ir substrato kooperatyvinis efektas sumaž÷ja, nes visas fermentas yra R formoje. Tod÷l fermentin÷s reakcijos greičio priklausomyb÷s nuo substrato koncentracijos grafikas iš sigmoidin÷s kreiv÷s pereina į hiperbolę. Alosterinio slopiklio poveikis yra atvirkščias - slopiklis I susijungia tik su T forma ir neleidžia T formai pereiti į R. Nuoseklaus veikimo modelį pasiūl÷ Košlandas. Jis pasteb÷jo, kad reaguojant substratui su fermento aktyviuoju centru kinta baltymo konformacija. Baltymo molekul÷je subvienetai gali

116

116

būti skirtingose R ir T formose. Aktyvi forma pereina į neaktyvią priklausomai nuo efektoriaus prisijungimo. Prisijungus substratui prie R formos, keičiasi jo ir greta esančio subvieneto konformacija ir T forma pereina į R. Ši hipotez÷ nereikalauja abiejų subvienetų simetrijos. Jeigu sąveika tarp subvienetų yra didel÷, tai vieno subvieneto konformacijos pakeitimas pakeis ir kito subvieneto konformaciją. Aktyvatorius prisijungęs prie R subvieneto indukuoja T formos per÷jimą į R ir padid÷ja substrato prisijungimas. Slopiklis, pastumia pusiausvyrą į T formos pusę.

SS

Simetrinis baltymo Asimetrinis baltymo dimeras dimeras Alosteriniai fermentai dažniausiai sudaryti iš kelių subvienetų, kurie skirtingai sujungia ligandus. Aspartato transkarbamoilaz÷ (ATKaz÷) yra hetero multikomponentinis α6 β6 -tipo baltymas, sudarytas iš 12 subvienetų. Paveikus ATKazę sufhidrilinių grupių blokatoriumi p-chlormerkuribenzoatu, fermentas disocijuoja į du 100 kDa katalizinius (K) ir tris 34 kDa reguliatorinius (R) subvienetus (pav.2.28). Katalizinis subvienetas katalizuoja substratų susijungimą ir produkto susidarymą, tačiau su juo nesusiriša ir jo neveikia alosteriniai moduliatoriai ATP ir CTP. Kiekvienas katalizinis subvienetas sudarytas iš trijų vienodų 34 kDa polipeptidinių grandinių turinčių po tris aspartato ir karbamoilfosfato surišimo vietas. Reguliatorinis subvienetas sudarytas iš dviejų polipeptidinių grandinių (17 kDa), jis neturi fermentinio aktyvumo ir prijungia po du ekvivalentus ATP ar CTP. Tokiu būdu ATKaz÷s holofermentas sudarytas iš dviejų katalizinių ir trijų reguliatorinių subvienetų.

ATKaz÷

Kataliziniai Reguliatoriniaisubvienetai subvienetai

p-chlormerkuribenzoatas

2.28 pav. ATKaz÷s subvienetų organizacija ir p-chlormerkuribenzoato poveikis fermento disociacijai.

Šios prielaidos buvo patikrintos tiriant fermento aspartato transkarbamoilaz÷s struktūrą. Tyrimai atlikti 1977m Šachmano (H.Schachman) ir kolegų parod÷, kad esant CTP ATKaz÷s sedimentacijos greitis yra 3 procentais didesnis nei esant ATP. Esant CTP molekul÷s forma tampa kompaktiškesn÷ ir fermentas greičiau s÷da jį ultracentrifuguojant. Šie eksperimentai sutinka su dviejų skirtingų konformacijų modelio buvimu.

2.9.4 Reguliaciniai baltymai

117

117

Fermentų aktyvumas gali būti reguliuojamas prijungiant specifinius baltymus. Prisijungę prie fermento jie keičia jo aktyvumą. Pavyzdžiui nuo cAMP priklausoma baltymo kinaz÷ A yra sudaryta iš 2 katalizinių ir 2 reguliatorinių subvienetų.(skyrius 7.8.5) Prisijungę reguliatoriniai subvienetai mažina katalizinių subvienetų aktyvumą. Disocijavus reguliatoriniams subvienetams, katalizinių subvienetų aktyvumas atsistato.

Kai kurie fermentai yra reguliuojami keliais mechanizmais. Glikogeno fosforilaz÷ katalizuoja pirmą glikogeno metabolizmo reakciją. Šis etapas labai svarbus angliavandenių metabolizme. Fermentas yra aktyvuojamas kovalentin÷s modifikacijos būdu, jo aktyvumas taip pat reguliuojamas alosteriškai, prijungiant AMP. Bakterin÷ glutamino sintetaz÷ atlieka labai svarbų vaidmenį įjungiant redukuotą azotą į ląstel÷s metabolizmą. Jis yra reguliuojamas alosteriškai (žinoma per 8 alosterinius moduliatorius), ir grįžtamos kovalentin÷s modifikacijos būdu. Šis fermentas taip pat reguliuojamas kitais reguliatoriniais baltymais. (žr.skyrius)

2.10 Izofermentai

Kai kurios to paties tipo reakcijos yra katalizuojamos skirtingų fermentų. Skirtingi fermentai, katalizuojantys tą pačią cheminę reakciją yra vadinami izofermentais. Daugybin÷s fermentų formos gali skirtis viena ar keliomis aminorūgštimis arba gali būti išsid÷sčiusios skirtinguose ląstel÷s kompartmentuose, pavyzdžiui citozolin÷ ir mitochondrin÷ malato dehidrogenaz÷s. Izofermentai gali skirtis savo elektriniu krūviu, kartais molekuline mase ir yra atskiriami elektroforez÷s, jonin÷s chromatografijos, gel-filtracijos metodais. Jie gali tur÷ti skirtingas katalizines konstantas KM ir Vmax, skirtingą temperatūrinį stabilumą, pH optimumą. Izofermentai gali būti skirtingai reguliuojami. Aspartato virtimo į liziną, metioniną, treoniną ir izoleuciną pirmą stadiją katalizuoja trys izofermentai, kurie reguliuojami skirtingais moduliatoriais.

Izofermentai gali būti sudaryti iš skirtingų subvienetų. Laktato dehidrogenaz÷ yra tetrameras kurio sud÷tyje dviejų tipų subvienetai. Vieno tipo subvienetai daugiausiai randami širdies (H tipas) raumenyje, kito tipo išskirti iš skeletinių raumenų bei kepenų (M tipas). Ekstraktai iš įvairių audinių gali tur÷ti iki penkių skirtingų laktato dehidrogenaz÷s frakcijų. Penkios izofermentų formos susidaro susijungiant skirtingiems subvienetams - H4, H3M, H2M2, HM3, M4.

Kreatino kinaz÷ turi tris izofermentas. Kiekvienas izofermentas yra dimeras sudarytas iš dviejų polipeptidų , vadinamų B ir M subvienetais, kuriem susijungus galimos trys kombinacijos: Kreatino kinaz÷ 1 (CK1) sudaryta iš BB, CK2 - MB ir CK3 - MM. Kiekvienam izofermentui yra būdingas skirtingas judrumas elektriniame lauke. Izofermentų koncentracijos matavimas kraujo plazmoje plačiai naudojamas medicinoje įvairių ligų diagnostikoje. Pakitus organo ląstelių membranų laidumui, izofermentai iš ląstel÷s išeina į kraują. Miokardo raumenyje per 5% kreatino kinaz÷s yra MB izofermentas. Šio izofermento atsiradimas kraujuje rodo miokardo pažeidimus. Laktato dehidrogenaz÷s H4 izofermento patekimas į kraują susijęs su pokyčiais miokarde, o padid÷jęs M4 kiekis nurodo kepenų funkcijos sutrikimą. 2.11 Kataliziniai antik ūnai (abzimai)

Fermento aktyvus centras yra komplementarus ne substratui, o pereinamojo būvio tarpininkui. Galima susintetinti baltymą, kuris tur÷tų “aktyvų centrą” komplementarų pereinamojo būvio tarpininkui ir toks baltymas tur÷s katalizinių savybių. Vieni iš tokių katalizatorių yra kataliziniai antik ūnai arba abzimai

118

118

Antikūnai yra imunoglobulinai. Kaip ir kiti antikūnai, kataliziniai antikūnai susidaro paveikus organizmą antigenais. Cheminiais metodais yra sintetinamas antigenas tokios struktūros, kuri atitinka fermentin÷s reakcijos pereinamojo būvio tarpininką. Įmunizavus gyvuliukus tokiu analogu juose susidaro antikūnai, kurie gali susijungti su pereinamojo būvio tarpininku. Atliekant reakciją in vitro abzimas stengsis normalų substratą paversti chemiškai aktyviu, pereinamojo būvio tarpininku. Tokiu būdu, kataliziniai antikūnai pagreitina reakciją, prisijungdami substratą ir paversdami jį pereinamojo būvio tarpininku, kuris lengvai virsta produktu. Galima sintetinti esterių analogus, pakeičiant anglies atomą fosforo atomu. Susintetintas ciklinis fosfonato esteris yra panašus į natūralų pereinamojo būvio tarpininką. Sukurti antikūnai prieš šį fosfonatą veikia kaip fermentai, pagreitindami hidroksiesterių hidrolizę per 1000 kartų.

OH

O

O

hidroksiesteris

O

O O

ciklinis per÷jimo būvis

O

O OH

+

OP

OO

ciklinis fosfonato esteris 2.29 pav. Kataliziniai antikūnai specifiškai reaguoja su pereinamojo būvio tarpininku 2.12 Tunelinis efektas fermentin÷je kataliz÷je

Tunelinį efektą galima apibr÷žti kaip tiesioginį smulkių molekulių pernešimą tarp dviejų baltymų, tarp dviejų baltymų subvienetų ar domenų be šių molekulių disocijacijos į tirpalą. Šios mažos molekul÷s ar cheminių reakcijų tarpininkai gali būti chemiškai nestabilūs arba gali būti išsišakojimo keliai įvairiuose metaboliniuose procesuose, abiem atvejais tuneliavimas yra metaboliškai naudingas.

Fermentin÷s reakcijos greitį sąlygoja substrato ir fermento difuzijos greičiai. Tačiau yra fermentinių reakcijų, kurių greitis viršija difuzijos greitį. Dažniausiai tai yra fermentiniai kompleksai, katalizuojantys vieną po kitos einančias chemines reakcijas. Tada vieno fermento produktas tiesiogiai patenka į kito fermento katalizinį centrą be per÷jimo į terpę. Kinetiniai ir struktūriniai tyrimai parod÷, kad glikoliz÷je tunelinis efektas yra tarp fermentų glicerolio aldehido 3-fosfato dehidrogenaz÷s ir fosfoglicerato kinaz÷s. Tarp šių baltymų pereina 1,3-bisfosfogliceratas. Neseniai išaiškintos struktūros dar dviejų fermentų, karbamoilfosfato sintetaz÷s ir fosforibozilpirofosfato amidotransferaz÷s, kuriose nustatytas tuneliavimo efektas.

Vienas iš ryškiausių tunelinio efekto pavyzdžių yra fermento triptofano sintaz÷s veikimas. Triptofano sintaz÷ išskirta iš bakterijų, sudaryta iš dviejų α ir dviejų β subvienetų ir yra

119

119

geriausiai charakterizuotas substratą tuneliuojantis multifermentinis kompleksas. Ji katalizuoja paskutines dvi L-triptofano sintez÷s stadijas, kai iš indolo glicerofosfato susidaro triptofanas.

NH

C C CH2O PO3H2

OHOH

H HNH

NH

CH2CH-COOH

NH2

Indolo 3-glicerofosfatas (IGP) Indolas (I) Triptofanas (Trp)

GAP Ser

2.30 pav. Triptofano sintaz÷s katalizuojama reakcija Fermento α subvienetas turi statin÷s struktūrą ir katalizuoja indolo-3-glicerofosfato (IGP) skilimą iki indolo (I) ir glicerolio aldehido 3-fosfato (GAP). β subvienetas katalizuoja triptofano susidarymą iš serino ir indolo. Į α subvienetą patenka indolo-3-glicerofosfatas, jis skyla į GAP ir indolą. GAP išeina iš fermento aktyvaus centro į terpę, o indolas baltymo viduje esančiu 2.5nm ilgio tuneliu keliauja į β subvienetą. β subvienete reakcija vyksta dviem stadijom (2.31 pav.).

1) patekęs į aktyvų centrą serinas reaguoja su prijungtu prie β subvieneto piridoksalfosfatu (PLP), susidaro pusiau stabilus α−aminoakrilato E(A-A) tarpininkas.

2) atkeliavęs tuneliu indolas reaguoja su E(A-A), susidarant triptofanui.

PF

IGP

Ser

I

I

(A-A)Trp Trp

I

IGP

3PGA 3PGA

2.31 pav. Triptofano sintaz÷s subvieneto funkcionavimas bifermentiniame komplekse. Didelis reakcijos efektyvumas pasiekiamas pernešant pirmos reakcijos produktą (indolą) nuo α−subvieneto per tunelį tiesiai prie β−subvieneto. Tokiu būdu susidaręs fermentin÷s reakcijos tarpininkas pereina nuo vieno katalizinio centro prie kito, nepereidamas į terpę ir nesusimaišydamas su kitomis medžiagomis. To pasekoje žymiai padid÷ja reakcijos greitis.

GAP GAP

120

120

3 NUKLEORŪGŠTYS Deoksiribonukleorūgščių (DNR) atradimas siejamas su Mišerio (F.Miesher) vardu, kuris

1869m. iš leukocitų branduolių išskyr÷ medžiagą, kurios sud÷tyje buvo anglis, vandenilis, deguonis, azotas ir fosforas. Mišeris ją pavadino nukleinu, kadangi ji buvo rasta branduoliuose. Ši medžiaga pasižymi rūgštin÷mis savyb÷mis, randama visose gyvūnų, augalų, mikroorganizmų ląstel÷se ir buvo pavadinta nukleorūgštimi. Greitai po to Hope Zeileris (F.Hoppe-Seyler) iš mielių išskyr÷ ribonukleorugštį (RNR).

1944m. Eiveris (O.Avery), Makliaudas (C.MacLeod) ir Makartis (M.McCarty) parod÷, kad DNR yra ta medžiaga, kuri kaupia ir perneša genetinę informacij ą. 1953m. Votsonas (J.D.Watson) ir Krikas (F.H.C.Crick) pasiūl÷ DNR dvigubos spiral÷s modelį ir nuo tų metų prasid÷jo molekulin÷s biologijos era.

Nukleorūgščių struktūros ir funkcijų tyrimai ypatingai produktyvūs buvo paskutinius kelis dešimtmečius. Rekombinantinių DNR technologijų sukūrimas sudar÷ galimybes manipuliuoti DNR molekul÷mis laboratorijoje. Genetin÷s inžinerijos pasiekimai plačiai panaudojami praktikoje. Visų ląstelių genomai sudaryti iš DNR. Kai kuriuose virusuose genetin÷ informacija užrašyta RNR molekul÷je. Genomas gali būti sudarytas iš vienos DNR molekules (kaip yra bakterijose) arba kelių. Eukariotuose genomin÷ DNR randama branduolyje. Mitochondrijose ir chloroplastuose yra sava autonomin÷ DNR, koduojanti specifinių baltymų sintezę.

Informacija apie aminorūgščių seka polipeptidin÷je grandin÷je yra užkoduota DNR molekul÷je, nukleotidų sekoje. Transkripcijos procese ši informacija perduodama RNR molekul÷ms. Baltymų biosintez÷s (transliacijos) metu aminorūgštys polipetidin÷je grandin÷je išsid÷sto pagal RNR nukleotidų sekoje užrašyta informaciją.

Nukleorūgštys yra didel÷s molekulin÷s mas÷s polimerin÷s medžiagos, sudarytos iš nukleotidų, sujungtų 3/,5/-fosfodiesteriniu ryšiu. Yra dvi nukleorūgščių klas÷s – deoksiribonukleorūgštys (DNR) ir ribonukleorūgštys (RNR). DNR molekul÷je sukaupta visa genetin÷ informacija reikalinga organizmo vystymuisi, kuri perduodama iš kartos į kartą. DNR yra paveldimumo medžiaga. DNR dalis, kuri atsakinga už biologiškai aktyvaus produkto sintezę vadinama genu, jo produktas gali būti baltymas arba RNR. Vienintel÷ žinoma DNR funkcija yra genetin÷s informacijos saugojimas ir perdavimas iš kartos į kartą. Ląstel÷s gali tur÷ti tūkstančius genų, tod÷l DNR molekul÷s yra labai didel÷s. Didžiausios DNR molekul÷s yra žinduolių ir augalų chromosomose, jų DNR sudaryta iš kelių šimtų tūkstančių kilobazių (kb). Žmogaus genomo DNR molekul÷je yra 3200000 kb . Praeito tūkstantmečio pabaigoje buvo nustatytas pilnas žmogaus genomas

RNR funkcija yra realizuoti DNR molekul÷je sukauptą genetinę informaciją, jos dalyvauja baltymų biosintez÷je. Ribosomin÷ RNR (rRNR) yra ribosomų komponentas, kuriose sintetinami baltymai. Informacin ÷ (mesendžerin÷) RNR (iRNR) yra tarpininkas, kuris perneša informaciją apie baltymo sintezę į ribosomas. Pernašos RNR (tRNR) prijungia specifines aminorūgštis ir perneša jas į ribosomas, kur sintetinama polipeptidin÷ grandin÷. Retrovirusuose genetin÷ informacija užkoduota RNR molekul÷se. Kai kurios RNR molekul÷s turi katalizinį aktyvumą ir vadinamos ribozimais.

121

121

3.1 Nukleorūgščių sud÷tis

Hidrolizuojant nukleorūgštis jos suskyla iki nukleotidų, kurie toliau skyla iki nukleozidų ir fosforo rūgšties. Nukleozidai sudaryti iš heterociklin÷s baz÷s ir pentoz÷s.

Nukleorūgštys

Nukleotidai

Nukleozidai Fosforo rūgštis

Heterociklin÷s Pentoz÷ baz÷s 3.1 pav. Nukleorūgščių skaidymo schema

3.1.1 Heterociklin÷s baz÷s ir pentoz÷ Iš nukleorūgščių hidrolizatų buvo išskirtos heterociklin÷s baz÷s, kurios yra purino ar

pirimidino dariniai.

N

N N

NN

N

12

345

6 78

9

Purinas Pirimidinas

12

3 45

6

Nukleorūgščių sud÷tyje yra penkios pagrindin÷s baz÷s - adeninas, guaninas (purino

baz÷s) bei uracilas, citozinas, timinas (pirimidino baz÷s). Sutrumpintai timinas žymimas (Thy), citozinas - (Cyt), uracilas – (Ura) adeninas – (Ade) ir guaninas – (Gua). DNR sud÷tyje būna adeninas, guaninas, timinas ir citozinas. RNR sud÷tyje - timinas yra pakeistas uracilu.

122

122

N

N NH

N

NH2

NH

N NH

N

O

NH2

NH

NH

O

O

NH

NH

O

O

CH3 N

NHO

NH2

1

2 345

6 78

9

Purino baz÷s

Adeninas (Ade) Guaninas (Gua)

12

3 45

6

Pirimidino baz÷s

Uracilas (Ura) Timinas (Thy) Citozinas (Cyt)

6-Aminopurinas 2-Amino-6-oksopurinas

2,4-Dioksopirimidinas 2,4-Diokso-5-metil- 2-Okso-4-amino- pirimidinas pirimidinas

3.2 pav. Heterociklin÷s baz÷s, įeinančios į nukleorūgščių sud÷tį. Kadangi heterociklin÷s baz÷s turi amino- ir ketogrupes, galima izomerizacija, kuri

vadinama tautomerija . Bazių hidroksigrup÷s gali būti laktamin÷s-laktimin÷s, o aminogrup÷s – aminin÷s-iminin÷s tautomerinių formų. Nukleorūgštyse dažniausiai sutinkama laktamin÷ –aminoforma, tada baz÷s žiedas yra plokščias ir išlaiko aromatiškumą.

NH

N NH

N

O

NH2

Guanino aminin÷ Guanino iminin÷ forma forma

NH

NH

O

O

NH

NH

OH

OH

Uracilo laktamin÷ Uracilo laktimin÷ forma forma

NH

NH

NH

N

O

NH

3.3 pav. Heterociklinių bazių tautomerin÷s formos Į nukleotidų sud÷tį įeina dviejų rūšių pentoz÷s. DNR molekul÷se randama D-2/-

deoksiriboz÷, o RNR – D-riboz÷. Nukleotiduose pentoz÷s būna ciklin÷je β−furanozin÷je (uždaras

123

123

penkianaris žiedas) formoje, kuri yra pusiausvyroje su linijine molekul÷s forma.

C

C

C

C

CH2OH

H

H

H

H

O

OH

OH

OH

O

CH2OH

H

OH

H

OH

HH

OH

Riboz÷ Riboz÷(linijin ÷ forma) (ciklin÷ forma)

O

CH2OH

H

OH

H

OH

HH

OH O

CH2OH

H

OH

H

H

HH

OH

Riboz÷ Deoksiriboz÷β-D-ribofuranoz÷ 2-deoksi-β-D-ribofuranoz÷

1'

2'3'

5'

6'

3.4 pav. Pentoz÷s linijin÷ ir ciklin÷ formos Ribofuranoz÷s žiedas nukleotiduose n÷ra plokščias jis yra voko formos ir gali būti

keturiose skirtingose konformacijose. Keturi iš penkių anglies atomų visada yra vienoje plokštumoje. Penktas atomas (C-2/ ar C-3/) yra toje pačioje (endo) arba priešingoje (egzo) plokštumoje atitinkamai C-5/ atomui.

OO 1/1/

2/

2/

3/

3/

4/

4/5/ 5/

baz÷ baz÷

C 3/ -endo C 2/ -endo 3.5 pav. Ribofuranoz÷s žiedo konformacijos

3.1.2 Nukleozidai Nukleorūgštyse yra du nukleozidų tipai –ribonukleozidai (RNR) ir

deoksiribonukleozidai (DNR). Nukleozidai susidaro heterociklin÷ms baz÷ms β−N-glikozidiniu ryšiu susijungus su pentoze. Ryšio susidaryme dalyvauja pirimidino baz÷s N-1 atomas arba purino baz÷s N-9 atomas. Norint atskirti atomų numeraciją heterociklin÷je baz÷je nuo pentoz÷s, angliavandeniuose anglies atomai numeruojami pridedant ( / )- 1/, 2/ ir tt. Baz÷ sujungta su pentoze β−N-glikozidiniu ryšiu, kuris jungia C-1/ riboz÷s ar deoksiriboz÷s anglies atomą su atitinkamu heterociklin÷s baz÷s azoto atomu. Nukleotidų pavadinimai sudaromi naudojant bazių vardus, pvz. ribonukleozidas, į kurio sud÷tį įeina adeninas vadinamas adenozinu (sisteminis pavadinimas 9−Ν−β−D-ribofuranoziladeninas vartojamas retai), jo analogas deoksiribonukleozidas vadinamas deoksiadenozinas. Kiti ribonukleozidai vadinami - guanozinas, uridinas, timidinas ir citidinas (3.1 lentel÷). Kadangi timinas retai sutinkamas ribonukleoziduose, deoksitimidinas dažniausiai vadinamas timidinu. Nukleozidai žymimi trijų raidžių sutrumpinimu – Ado, Guo, Cyd, Thd, Urd. Žymint deoksinukleozidus, pridedama raid÷ d – dAdo, dGuo, dCyd, dThd. Tačiau pateikiant nukleorūgščių pirminę struktūrą, tai yra nukleotidų seką polinukleotidin÷je grandin÷je, tradiciškai naudojamas vienos raid÷s žymuo A, T, G, C, U. Tai gali būti ir nukleotidas ir nukleozidas ir baz÷.

124

124

N

NN

N

NH2

O

H

OH

H

OH

HH

N

NHN

N

O

NH2O

H

OH

H

OH

HH

N

NN

N

NH2

O

H

OH

H

H

HH

O

H

OH

H

OH

HH

N

NH

O

OO

H

OH

H

H

HH

N

NH

O

O

CH3

O

H

OH

H

OH

HH

N

NH

NH2

O

HOCH2 HOCH2 HOCH2

Adenozinas (Ado) Guanozinas (Guo) Deoksiadenozinas (dAdo)

HOCH2 HOCH2 HOCH2

Uridinas (Urd) Deoksitimidinas Citidinas (Cyd) (Timidinas(Thd)

β-N-glikozidinis ryšys

3.7 3.6 pav. Nukleozidų struktūros

Nukleoziduose sukimasis apie viengubą glikozidinį ryšį, jungiantį bazę su pentoze d÷l

erdvinių trukdymų yra apsunkintas. Nukleozidai ir nukleotidai gali būti dviejose konformacijos sin- ir anti-. Anti- konformacijoje adenino žiedas ir –CH2OH grup÷ prijungta prie riboz÷s 5/ anglies atomo yra priešingose pus÷se. Nukleorūgštyse dominuoja anti konformacija.

N

NN

N

NH2

O

H

OH

H

OH

HH

O

H

OH

H

OH

HH

N

N N

N

NH2

HOCH2 HOCH2

anti-Adenozinas sin-Adenozinas 3.7 pav. Nukleozidų konformacijos

3.1.3 Nukleotidai

Nukleotidai yra nukleozidų fosfatai. Hidrolizuojant RNR šarmais gauname nukleozido 2/-fosfato ir nukleozido 3/-fosfato mišinį. Nukleozido 5/- fosfatai gaunami hidrolizuojant DNR ar RNR atitinkamais fermentais. Nukleotidai susidaro esterifikuojant fosforo rūgštimi nukleozido riboz÷s hidroksigrupę. Fosforo rūgštis gali būti prijungta prie hidroksigrupių, esančių ties 2/, 3/, 5/ anglies atomais. Dauguma ląstel÷je nukleotidų esterifikuoti ties 5/ anglies atomu. Nukleotidų pavadinimas sudaromas iš nukleozido vardo pridedant prie atitinkamo anglies atomo fosforo

125

125

rūgšties liekaną – adenozino 5/-fosfatas, guanozino 3/-fosfatas ir tt. (sutrumpintai - 5/-AMP, 5/-GMP, 5/-TMP, 5/-CMP, 5/-UMP). Kadangi fosforo rūgštis dažniausiai esterifikuoja 5/-hidroksigrupę, tod÷l rašoma tiktai AMP, GMP, TMP, CMP, UMP. Kitais atvejais nurodoma, prie kurios anglies atomo prijungta fosforo rūgšties liekana. Nukleotido sud÷tyje yra fosforo rūgštis, tod÷l jie dar vadinami rūgštimis -– adenilo rūgštis, guanilo rūgštis, timidilo rūgštis, citidilo rūgštis ir uridilo rūgštis. Nukleozidų fosfatas fiziologin÷se sąlygose yra anijonas ir jie vadinami atitinkamai adenilatas, guanilatas ir tt.

N

NN

N

NH2

O

H

OH

H

OH

HH

N

NHN

N

O

NH2O

H

O

H

OH

HH

P OO

O

O

H

OH

H

OH

HH

N

NH

O

O

O

HH

OH

HH

N

NH

NH2

O

O P O CH2

O

O

O P O CH2

O

O O

P OO

O

HOCH2

HOCH2

-

-

--

Adenozino 5/-fosfatas Guanozino 3/-fosfatas

-

-

--

Uridino 5/-fosfatas Citidino 5/-fosfatas

5/

3/

3/5/

3.8 pav. Purino ir pirimidino nukleotidai

3.1 lentel÷. Bazių, nukleozidų ir nukleotidų pavadinimai. Baz÷ Nukleozidas Nukleotidas

Adeninas (Ade) Adenozinas (Ado) Adenozino 5/-monofosfatas,

adenilo rūgštis (AMP), adenilatas Guaninas (Gua) Guanozinas (Guo) Guanozino 5/-monofosfatas,

guanilo rūgštis (GMP), guanilatas Citozinas (Cyt) Citidinas (Cyd) Citidino 5/-monofosfatas, citidilo

rūgštis (CMP), citidilatas Timinas (Thy) Timidinas (Thd) Timidino 5/-monofosfatas, timidilo

rūgštis (TMP), timidilatas Uracilas (Ura) Uridinas (Urd) Uridino 5/-monofosfatas, uridilo

126

126

rūgštis (UMP), uridilatas Prie nukleotido fosforilo grup÷s gali prisijungti papildomos fosforo rūgšties liekanos,

susidarant fosfoesteriniams ryšiams. Prie AMP prijungus dar vieną fosforo rūgšties liekaną susidaro adenozino 5/-difosfatas arba ADP, prijungus trečią liekaną gauname adenozino 5/-trifosfatą (ATP). ATP yra pagrindin÷ organizmo energetin÷ molekul÷, naudojama chemin÷m sintez÷m, mechaniniam darbui, medžiagų pernešimui pro membraną.

O

HOH

H

OH

HH

N N

NN

NH2

P OO

O

CH2P

O O

OP

O

O

O O

AMP

ADP

ATP

3.9 pav. Adenozino fosfatų struktūra. Fosforo rūgšties liekanos yra prijungiamos ir prie kitų nukleozidų, susidarant GDP, UDP,

CDP, TDP arba GTP, UTP, CTP, TTP. Nukleotidai, kurių sud÷tyje yra deoksiriboz÷, vadinami deoksiribonukleotidais ir žymimi pridedant raidę d – dAMP, dADP, dATP ir analogiškai likusieji. Gamtoje sutinkami ir polifosfatai, pvz. adenozino tetrafosfatas, adenozino pentafosfatas.

Laisvi nukleotidai ląstel÷je atlieka daug svarbių funkcijų. Jie gali būti energijos šaltiniai (ATP,GTP), dalyvauti angliavandenių biosintez÷je (UTP,ATP), signalo perdavime (cAMP, cGMP). 3.1.4 Cikliniai nukleotidai

Nukleozidų monofosfatuose viena fosforo rūgšties molekul÷ gali esterifikuoti dvi tos pačios riboz÷s hidroksigrupes ir susidaro cikliniai mononukleotidai. Jeigu fosforo rūgšties molekul÷ sujungia AMP ir GMP molekul÷se 3/ ir 5/ hidroksigrupes, susidaro ciklinis adenozino 3/,5/-monofosfatas ( ciklo-AMP, cAMP) arba ciklinis guanozino 3/,5/-monofosfatas (ciklo-GMP, cGMP). Jie yra antrin÷s signalin÷s molekul÷s ir yra labai svarbūs metabolizmo reguliatoriai, , dalyvauja įvairiuose signalo pernešimo keliuose. Jie perneša informaciją nuo užląstelinių hormonų viduląsteliniams fermentams. cAMP susidaro iš ATP katalizuojant adenilato ciklazei. Analogiškai iš GTP gaunamas cGMP. (plačiau žr. signalo perdavimo keliai sk).

127

127

N

NN

N

NH2

O

HH

OH

HH

OP

O

CH2

O

N

NHN

N

O

NH2O

HH

OH

HH

OP

O

CH2

O

Adenozino 3/,5/-ciklofosfatas Guanozino 3/,5/-ciklofosfatas 3.10 pav. Cikliniai mononukleotidai. 3.1.5 Minorin ÷s baz÷s ir minoriniai nukleotidai

DNR ir RNR sud÷tyje randamos modifikuotos baz÷s ir nukleotidai.. Jų kiekis nukleorūgštyse būna nedidelis (išskyrus t-RNR) tod÷l jos vadinamos minorin÷s baz÷s ar

128

128

nukleotidai. DNR molekul÷je tai dažniausiai metilintos baz÷s, virusuose jos gali būti

N

N N

N

NH

CH3

N

NH

N

N

NH2

CH3

O

N

NH

N

N

NH

O

CH3

NH

N N

N

O

NH

N

NH2

O

CH2OH

NH

NHO

O

NH

NO

O

CH3NH

NO

S

NH

NO

OH

HH

H

NH

N

NH2

O

CH3

N

N

NH2

O

CH3

riboz÷ riboz÷ riboz÷

+

N6-Metiladenozinas 7-Metilguanozinas N2-Metilguanozinas

riboz÷ riboz÷

riboz÷

Inozinas 5-Hidroksimetilcitidinas 3-Metilcitidinas

riboz÷

Ribotimidinas 4-Tiouridinas Pseudouridinas Dihidrouridinas

riboz÷ riboz÷

riboz÷

riboz÷

5-Metilcitidinas 3.11 pav. Minorin÷s baz÷s ir nukleozidai hidroksimetilintos ar glikozilintos. Minorin÷s baz÷s reguliuoja DNR replikaciją, apsaugo

genetinę informaciją nuo nukleazių poveikio. Ypatingai daug minorinių bazių randame tRNR. Minorinių bazių ir nukleozidų pavyzdžiai pateikiami 3.11 pav.

129

129

3.1.6 Polinukleotidin÷s grandin÷s susidarymas

Nukleorūgštys yra linijiniai polimerai, kuriuose nukleotidai sujungti 3/,5/-fosfodiesteriniais ryšiais. Polinukleotidai sudaryti iš ribonukleotidų vadinami ribonukleorūgštimis ar RNR. Deoksiribonukleotidų polimerai vadinami deoksiribonukleorūgštimis ar DNR. DNR sud÷tyje gali būti šimtai milijonų mononukleotidų.

O

H

O

H

OH

HH

P OO

O

AdeO P O CH2

O

O

OCH2

H

O

H

OH

HH

Ura

P OO

O OCH2

H

O

H

OH

HH

Gua

P OO

O OCH2

H

O

H

OH

HH

Cyt

O

H

O

H

H

HH

P OO

O

AdeO P O CH2

O

O

OCH2

H

O

H

H

HH

Thy

P OO

O OCH2

H

O

H

H

HH

Gua

P OO

O OCH2

H

O

H

H

HH

Cyt

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

5/

3/ galas 3/ galas

DNR RNR

5/

Fosfodiesterinisryšys

5'

3'

3.12 pav. DNR ir RNR polinukleotidinandin÷s fragmentas, nukleotidai sujungti 3/,5//-

fosfodiesteriniais ryšiais. Visi fosfodiesteriniai ryšiai grandin÷je turi vienodą orientaciją, grandin÷ turi du galus 3/

galą ir 5/ galą. Nukleotidų seką polimerin÷je grandin÷je galime pavaizduoti schematiškai. Fosforo rūgšties liekana žymima P, vertikali linija nurodo ribozę ar deoksiribozę, viršuje 1/ anglies atomas, apačioje – 5/. Linija, jungianti dvi ribozes atspindi 3/,5/-fosfodiesterinį ryšį. Susitarta, kad užrašant bazių seką, kair÷je pus÷je yra 5/ galas.

130

130

P P P PP OH

G C A TA

3' galas5' galas

Nukleotidų seką galima užrašyti tokiu būdu – pApGpCpApT arba pAGCAT. 3.2 DNR struktūra

Galima išskirti tris nukleorūgščių struktūrinius lygius. Pirmin ÷ struktūra yra nukleotidų išsid÷stymo seka polinukleotidin÷je grandin÷je. Polinukleotidin÷s grandin÷s (atskiros grandin÷s ar tos pačios grandin÷s segmentai) susijungusios vandeniliniais ir hidrofobiniais ryšiais sudaro spiralizuotą antrin ę struktūrą. Tretin ÷ struktūra yra antrin÷s struktūros išsid÷stymas erdv÷je, tai gali būti DNR superspiral÷, RNR dobilo formos molekul÷s išsid÷stymas erdv÷je, eukariotuose DNR susijungia su baltymais ir sudaro chromosomą.

3.2.1 DNR pirmin ÷ struktūra

DNR pirmin÷ struktūra yra nukleotidų išsid÷stymo seka. DNR pirmin÷s struktūros nustatymas šiuo metu yra greitas ir nereikalaujantis didelių sąnaudų darbas. Po 1975m. buvo pasiūlyta keletas metodų DNR pirmin÷s struktūros nustatymui. Chemin÷s modifikacijos ir skaidymo metodas pasiūlytas Maksamo (A.Maxam) ir Žilberto (W.Gilbert), o grandin÷s terminacijos metodą pirmas panaudojo Sengeris (F.Senger). 2000m buvo nustatyta žmogaus genomo pilna nukleotidų seka. 3.2.2 Antrin ÷ DNR struktūra

1953m .Votsonas (J.D.Watson) ir Krikas (F.H.C.Crick) pasiūl÷ DNR antrin ÷s struktūros modelį. Šie metai skaitomi molekulin÷s biologijos gimimo metais. Votsono ir Kriko DNR struktūros modelis paaiškino paveldimumo, genetin÷s informacijos pernešimo, genetin÷s informacijos realizavimo principus. Votsonas ir Krikas kurdami DNR antrin÷s struktūros modelį naudojosi žinomais eksperimentiniais faktais:

1. Čargafo (E.Chargaff) taisykl÷mis. Čargafas nustat÷, kad DNR molekul÷je molinis adenino kiekis yra lygus moliniam timino kiekiui (A*=T), o molinis guanino kiekis yra lygus moliniam citozino kiekiui (G=C). Purino bazių suma yra lygi pirimidino bazių sumai (A+G = C+T).

2. Rentgenostruktūrin ÷s analiz÷s duomenimis gautais Franklin (R.Franklin) ir Vilkinso (M.Wilkins) kurie parod÷, kad DNR molekulių pluoštai turi du periodiškumo maksimumus, vienas 0,34nm kitas – 3,4nm.

* Autoriai bazių žym÷jimui naudojo vienos raid÷s kodą A, G, C, T. Remdamiesi šiais faktais Votsonas ir Krikas pasiūl÷ DNR dvigubos spiral÷s modelį. DNR

erdvin÷s struktūros pagrindin÷s savyb÷s yra šios: • DNR molekul÷ sudaryta iš dviejų polinukleotidinių grandinių. • Dvi polinukleotidin÷s grandin÷s sukasi viena apie kitą ir apie bendrą ašį,

susidarant dvigubai spiralei. Spiral÷ yra dešinio sukimo, jos diametras yra 2,0nm. • Spiral÷s karkasą sudaro grandin÷, sudaryta iš pentoz÷s ir fosforo rūgšties

liekanų, sujungtų 3/,5/ fosfodiesteriniu ryšiu, pentoz÷ ir fosforo rūgties liekana nukreiptos į spiral÷s išorę ir su vandeniu sudaro vandenilinius ryšius. Fosfato

131

131

grup÷, dalyvaujanti fosfodiesteriniu ryšio sudaryme turi pKa apie 2, tod÷l polinukleotidin÷ grandin÷ esant pH 7 yra polianijonas.

• Polinukleotidin÷s grandin÷s yra antilygiagret÷s, spiral÷s viename gale yra polinukleotidin÷s grandin÷s riboz÷s 5/ galas, kitame – 3/ galas.

• Purino ir pirimidino baz÷s nukreiptos į spiral÷s vidų ir kompaktiškai sud÷tos panašiai į monetų stulpelį.

• Kiekviena vienos grandin÷s baz÷ yra suporuota su priešais esančia kitos grandin÷s baze. Poruojamos tiktai atitinkamos baz÷s. Prieš adeniną visada yra timinas, o prieš guaniną stovi citozinas. Tai reiškia kad baz÷s yra komplementarios. Šis pasiūlymas gerai paaiškina Čargafo eksperimentinius rezultatus.

• Bazių plokštumos yra lygiagret÷s viena kitai ir statmenos spiral÷s ašiai. • Spiral÷s žingsnis yra 3,4nm, atstumai tarp bazių plokštumų yra 0,34nm, į spiral÷s

žingsnį telpa 10 bazių porų.

Spiral÷s stabilumą palaiko : • hidrofobin ÷ sąveika, hidrofobinių purino ir pirimidino žiedų buvimas spiral÷s viduje,

padidina jos stabilumą, • „stekingo” sąveika, sud÷tos viena ant kitos bazių poros sudaro van der Valso

kontaktus. Nors vienetiniai ryšiai tarp bazių yra silpni, didel÷se DNR molekul÷se ši sąveika labai svarbi,

• vandeniliniai ryšiai tarp atitinkamų bazių, adeninas su timinu sudaro du vandenilinius ryšius, guaninas su citozinu - tris, kadangi spiral÷s viduje yra hidrofobin÷ aplinka, tai vandeniliniai ryšiai tarp bazių yra žymiai stipresni, nei vandenyje.

• baziniai baltymai histonai, protaminai, bei poliamidai neutralizuoja neigiamai įkrautas ir destabilizuojančias spiralę fosforo rūgšties liekanas.

• dvivalenčiai katijonai , dažniausiai Mg2+, kurie jungiasi prie neigiamai įkrautų fosforo rūgšties liekanų.

3.13 pav. Votsono ir Kriko DNR struktūros modelis /Lehninger/

Dvigubos spiral÷s išor÷je susidaro du grioviai kurie sukasi tarp pentoz÷s-fosfato grandin÷s. Grioviai yra nevienodo dydžio: vienas yra didysis griovys, kitas - mažasis griovys. Griovio kraštuose esančių bazių funkcin÷s grup÷s gali sąveikauti su skirtingais baltymais

132

132

, 3.14 pav. Vandeniliniai ryšiai tarp komplementarių bazių. Adeninas su timinu sudaro du vandenilinius ryšius, o citozinas su guaninu – tris.

Dviguba DNR spiral÷ skirtingose sąlygose gali tur÷ti įvairias konformacijas. Sintetinių oligonukleotidų rentgeno struktūriniai tyrimai parod÷. DNR yra dinamin÷ molekul÷ ir jos konformacija kinta priklausomai nuo sąlygų, nuo susirišimo su baltymais.

Detalesni DNR struktūros tyrimai parod÷, kad skirtingomis sąlygomis kristalinant DNR galimos įvairios DNR struktūros. Votsono ir Kriko pasiūlyta klasikin÷ DNR struktūra buvo pavadinta B-struktūra. A-strukt ūra (A-DNR) yra dešinio sukimo spiral÷, jos diametras yra apie 2,6nm, viename spiral÷s žingsnyje yra 11 bazių porų, žingsnio ilgis yra 2,8nm, atstumai tarp bazių porų – 0,26nm. Bazių plokštumos n÷ra statmenos spiral÷s ašiai, bet pakrypusios 200 laipsniu kampu. Z-tipo DNR struktūra yra kairio sukimo, ji neturi mažojo ir didžiojo griovio, jos diametras yra apie 1,8nm, viename spiral÷s žingsnyje yra 12 bazių porų, žingsnio ilgis yra 4,5nm, atstumai tarp bazių porų – 0,37nm

3.2 lentel÷. Įvairios DNR struktūros

A forma B forma Z forma Spiral÷s tipas Dešinio sukimo Dešinio sukimo Kairio sukimo Diametras ~2,6nm ~2,0nm ~1,8nm Bazių porų skaičius spiral÷s žingsniui

11 10,5 12

Atstumas tarp bazių plokštumų

0,26nm 0,34nm 0,37nm

Spiral÷s žingsnis 2,8nm 3,4nm 4,5nm Glikozidinio ryšio konformacija

Anti Anti Anti pirimidinams ir sin purinams

133

133

3.15 pav. DNR struktūros A, B ir Z formos Yra nustatytos kelios neįprastos DNR struktūros, sudarytos iš trijų ar keturių polinukleotidinių grandinių. Nukleotidai, dalyvaujantys klasikinių Votsono ir Kriko porų susidaryme gali sudaryti papildomus vandenilinius ryšius, ypatingai su funkcin÷mis grup÷mis esančiomis didžiajame griovyje. Pavyzdžiui protonizuota citidino liekana sudaro vandenilinius ryšius su poros G-C guanozino liekana. Timidinas susiriša su poros A-T adenozinu. Tokios nekanonin÷s poros yra vadinamos Hukstino (K.Hoogsteen) poros ir jos formuoja trigubą DNR spiralę. Polinukleotidai turintys polipirimidino ar polipurino fragmentus suformuoja DNR struktūrą vadinamą H-DNR.

3.16 pav. H-DNR struktūra.

Eksperimentin÷mis sąlygomis rekombinacijos arba reparacijos metu trys polinukleotidin÷s grandin÷s gali susijungti ir sudaryti trigubą spiralę. Sumaišius sintetinius polimerus poli(A) ir polideoksi(U) susidaro struktūra, sudaryta iš trijų polinukleotidinių garndinių. DNR denatūracija

Fiziologin÷se sąlygose dviguba spiral÷ yra stabilesn÷ nei atskiros vijos, tai paaiškina, kod÷l in vivo dominuoja dviguba spiral÷. Kartais nedidel÷s DNR dvigubos spiral÷s sritys yra

134

134

suardomos ir išsukamos. Šie pažeidimai vyksta DNR replikacijos, reparacijos, rekombinacijos ir transkripcijos metu. Spiral÷s išsukimas ir vijų atskyrimas vadinamas denatūracija .

Dvigubą grandinę galima denatūruoti pak÷lus temperatūrą, paveikus chemin÷mis medžiagomis ardančiomis vandenilinius ryšius - karbamidu ar guanidino chloridu. Kylant temperatūrai vandeniliniai, hidrofobiniai ryšiai suyra ir abi grandin÷s atsiskiria. Temperatūra, kuriai esant pus÷ DNR molekul÷s yra vienos grandin÷s, vadinama lydymosi temperatūra

. 3.17 pav. DNR denatūracijos priklausomyb÷ nuo temperatūros. DNR molekul4,

kurioje daugiau GC porų lydosi aukštesn÷je temperatūroje (raudona kreiv÷). Denatūracijos procesą galima sekti matuojant ultravioletin÷s šviesos sugertį 260nm

bangoje. DNR sugertį ultravioletin÷je spektro dalyje sąlygoja heterociklin÷s baz÷s. Heterociklinių molin÷s sugerties koeficientai pateikti 3.3 lentel÷je.

3.3 lentel÷ Nukleotidų molin÷s sugerties koeficientai 260 nm bangoje, ε260 (M

-1cm-1) AMP 15400 GMP 11700 UMP 9900 dTMP 9200 CMP 7500 Pereinant DNR molekulei iš dvigubos spiral÷s į denatūruotą būvį, sugertis išauga 12-40%

. Per÷jimas vyksta siaurame temperatūros intervale. Sigmoidinis lydymosi temperatūros kreiv÷s charakteris rodo, kad denatūracija yra kooperatyvinis procesas. Kiekviena DNR rūšis turi charakteringą lydymosi temperatūrą, molekul÷s, kurių sud÷tyje yra daugiau GC porų lydosi aukštesn÷je temperatūroje, kur daugiau AT - žemesn÷je. Tai yra tod÷l, kad G-C sudaro tris vandenilinius ryšius , o pora A-T tiktai du. L÷tai atšaldant denatūruotą DNR vyksta renatūracija ir v÷l gali susidaryti natyvi dviguba spiral÷. Ši DNR savyb÷ naudojama nustatyti skirtingų organizmų ar to paties organizmo genomo panašias DNR sekas. Kaitinant izoliuotą žmogaus ir pel÷s DNR ji pilnai denatūruojama, po to palaikius kelias valandas 65 0C temperatūroje, dauguma DNR renatūruojasi. Žmogaus DNR grandin÷s susilies su žmogaus, o pel÷s DNR susilies tarpusavyje. Tačiau tam tikros žmogaus DNR grandin÷s dalys, turinčios komplementarias bazes susilies su pel÷s DNR ir susidarys hibridin ÷ dviguba spiral÷. Kuo evoliucijos eigoje skirtingos organizmų rūšys yra arčiau viena kitos, tuo DNR hibridizacija efektyvesn÷. Žmogaus DNR geriau hibridizuojasi su pel÷s DNR negu su mielių DNR. Denatūracijos ir renatūracijos principas panaudojamas polimerazin÷s grandinin÷s reakcijos metode.

135

135

3.2.3 Tretin ÷ DNR struktūra

DNR molekul÷s yra labai ilgos, jų sud÷tyje yra nuo kelių tūkstančių bazių porų (virusuose) iki milijonų bazių porų bakterijose ir milijardų - augaluose ir gyvūnuose. DNR molekulin÷ mas÷ nustatoma hidrodinaminiais, autoradiografijos metodais, matuojant molekul÷s ilgį elektronin÷s mikroskopijos pagalba. (DNR molekul÷je bazių poros molekulin÷ mas÷ yra 660Da ir atstumas tarp bazių 0,34nm). Bazių porų skaičius ir molekul÷s kontūro ilgis pateikti lentel÷je 3.5 lentel÷ Kai kurių DNR molekulių dydžiai /Voet 861

Organizmas Bazių porų skaičius (kb)

Molekul÷s ilgis (µm)

Polioma SV40 5,1 1,7 Bakteriofagas 48,6 17 Bakteriofagai T2, T4, T6 166 55 Mycoplasma hominis 760 260 Escherichia coli 4700 1600 Miel÷s (17 haploidinių chromosomų) 13500 4600 Drosophila (4 haploidin÷se

chromosomose) 165000 56000

Žmogus (23 haploidin÷se chromosomose) 2900000 990000 kb - kilobazių poros = 1000 bazių porų (bp) Eukariotų branduolio chromosoma sudaryta iš vienos linijin ÷s dvigrand÷s DNR. Tiriant

prokariotų DNR buvo parodyta, kad jų visas genomas yra vienoje, dažniausiai žiedin÷je dvigrand÷je DNR molekul÷je. Dauguma bakterijų taip pat turi nedideles žiedines nechromosomines DNR molekules, kurios vadinamos plazmid÷mis. Plazmid÷s yra nedidel÷s, kelių tūkstančių bazių porų žiedin÷s DNR, jose yra genai suteikiantys bakterijoms atsparumą antibiotikams, jos palengvina genetin÷s informacijos perdavimą iš vienos bakterijos į kitą. Bakterijos gali tur÷ti šimtus plazmid÷s kopijų, kurios replikuojamos nepriklausomai nuo chromosomin÷s DNR dalijimosi.. DNR rekombinantin÷s technologijos naudoja plazmides kaip genų vektorius. Eukariotų mitochondrijų ir chloroplastų DNR taip pat yra žiedin÷. Kai kurių virusų, pvz. fago φX174 DNR yra viengrand÷, jos galai kovalentiškai sujungti ir sudaro žiedą.

DNR molekul÷s ilgis yra žymiai didesnis nei ląstel÷s, kurioje ši DNR yra. Bakterijų E.coli ilgis yra apie 2µm, joje yra viena chromosoma sudaryta iš 4,7*106 bp, jos ilgis yra 1,6mm. Diploidin÷je žmogaus ląstel÷je DNR turi 6*109 bp, kurios išsid÷sto 46 chromosomose. Visa DNR, kurios ilgis yra per 2m randama branduolyje, jo diametras yra tiktai10 µm. Šie faktai rodo, kad DNR molekul÷ erdv÷je susipakuoja, sudarydama tretin ę struktūrą.

Žiedin÷ DNR gali tur÷ti dvi formas – relaksuotą ir superspiralizuotą. Superspiralizuota molekul÷ papildomai susisuka, kai susisuka pati dviguba spiral÷. Superspiralizacija n÷ra retas atvejis. Dauguma gamtinių žiedinių DNR yra superspiralizuotos – jos turi kairio sukimo superspiralinius susisukimus. Dešin÷ superspiralizacija yra vadinama teigiama, o kair÷ – neigiama.

Relaksuotos ir spiralizuotos DNR molekul÷s skiriasi tiktai savo topologija, tod÷l jos vadinamos topoizomerais. Topoizomerai gali pereiti vienas į kitą tiktai įkirpus ir v÷l sujungus polinukleotidin÷s grandines. Ląstel÷je šią procedūrą atlieka fermentai topoizomeraz÷s, jos reguliuoja gamtinių DNR molekulių superspirališkumą.

136

136

Superspiralinių DNR molekulių susidarymui reikalinga energija. Prokariotin÷se ląstel÷se yra speciali topoizomeraz÷ vadinama giraze, kuri įveda kairio sukimo superspiralizuotus segmentus, panaudodama ATP hidroliz÷s energiją. Topoizomeraz÷s, kurios tiktai relaksuoja DNR nereikalauja ATP.

Dvigrand÷ žiedin÷ bakterijų DNR gali sudaryti superspiralę, grandin÷s gali underwound (neigiama superspiralizacija) ir overwound (teigiama superspiralizacija). DNR superspiralizacija yra analogiška kelių vijų virv÷s susukimui arba išsukimui, taip kad susidaro torsin÷ įtampa. Neigiama superspiralizacija iššaukia torsines j÷gas, kurios sąlygoja išsisukimą, tuo tarpu teigiama superspiralizacija susuka spiralę. DNR dvigubos spiral÷s viena arba abi grandin÷s gali nutrūkti ir linijin ÷ molekul÷ susisuka priešingomis kryptimis. Grandin÷s susijungia ir sudaro žiedinę superspiralizuotą struktūrą. Dauguma bakterijų chromosomų yra superspiralizuotos ir turi kelis superspiralizuotus segmentus kiekvienai 1000 bazių porų

. 3.18 pav. Superspiralizuotos DNR topologija. Uždara žiedin÷ DNR, DNR su dviem

neigia ?internetas/

Gamtoje dvigrand÷ DNR yra superspiralizuota neigiamai. Judant baltyminiams kompleksams išilgai DNR (pvz. replikaciniam ir transkripciniam kompleksui) abi grandin÷s yra lokaliai išskiriamos. Tokio komplekso priekyje DNR sūkių yra daugiau, o už judančio komplekso – mažiau. Atsiradusią torsinę įtampą DNR molekul÷ kompensuoja superspiralizuodamasi. Priekyje susidaro teigiamos superspiralin÷s vijos, o už išvyniotos DNR – neigiamos superspiralin÷s DNR vijos. Ląstel÷je ši problema sprendžiama pasitelkiant specialius fermentus – topoizomerazes. Topoizomeraz÷s įkerpa vieną (I-o tipo topoizomeraz÷s)arba dvi (II-o tipo topoizomeraz÷s) DNR grandines (žr. sk. DNR replikacija). Taip yra laikinai suformuojami laisvi galintys suktis DNR galai, kuriuos išsukant arba užsukant sumažinamas arba padidinamas DNR sukibimų skaičius. Laisvi galai v÷l yra kovalentiškai sujungiami tų pačių topoizomerazių. Tokiu būdu, superspiralizacija, kuomet ji trukdo jud÷ti baltymams arba jų kompleksams, yra panaikinama. Yra topoizomerazių –girazių, kurios veikia priešingai – naudodamos ATP energiją sukuria papildomas vijas DNR, ir ji neigiamai superspiralizuojasi. Dar vieno tipo giraz÷s –atvirkštin÷s giraz÷s sukuria teigiamą DNR superspiralizaciją.

Žmogaus genomo regionuose, kurie kontroliuoja genus sutinkamos invertuotos arba polindromin÷s DNR sekos. Polindromai yra žodžiai ar fraz÷s, kurie turi tą pačią prasmę skaitant juos iš vienos ar kitos pus÷s, pavyzdžiui žodis savas. Tokiuose DNR segmentuose, vandeniliniai ryšiai tarp komplementarių bazių vienoje spiral÷je suyra ir baz÷s sudaro vandenilinius ryšius su gretimomis grandin÷mis. Susiformuoja kryžiaus formos struktūra (3.19 pav.). Kryžiaus formos struktūrų funkcija n÷ra pilnai nustatyta, manoma, kad kad šie pasikartojimai yra kaip molekuliniai jungikliai replikacijai ir transkripcijai.

137

137

3.19 pav. Kryžiaus formos DNR struktūros Įvairių biocheminių reakcijų metu žiedin÷ DNR gali sudaryti mazgus, katenanus (3.20

pav.). Šios struktūros turi įtakos replikacijos, transkripcijos procesams.

3.20 pav. DNR molekul÷ gali sudaryti mazgus (a) ir katenanus (b)

3.2.4 Eukariotų DNR organizacija. Tipin÷s žmogaus ląstel÷s skersmuo yra 20 µm, joje yra 23 poros dvigrand÷s DNR, kurių

kiekviena turi po 1,3*108 bp (žmogaus viso DNR turi 3*109 bp). Tai atitinka 5cm ilgio DNR molekulę. Visų 46 DNR molekulių ilgis siekia daugiau nei 2m ir šios molekul÷s yra branduolyje, kurio skersmuo tiktai 5-10µm. Šis uždavinys išsprendžiamas supakuojant DNR, susukant ją apie baltymus. Susidariusi struktūra vadinama chromosoma. Metafaz÷s metu, (kai chromosomos yra labiausiai kondensuotos), didžiausia chromosoma yra apie 10µm ilgio ir jos gerai matomos mikroskopu.

Eukariotin÷se ląstel÷se jų dalijimosi metu DNR ir baltymo struktūra kinta. Interfaz÷s metu, tarp dviejų ląstel÷s dalijimųsi chromosomin÷ medžiaga chromatinas yra amorfin÷ ir atsitiktinai pasiskirsto branduolyje. Interfaz÷s S faz÷je DNR replikuojasi ir ir iš kiekvienos chromosomos susidaro dvi seserin÷s chromosomos (vadinamos chromatid÷mis) Mitoz÷s profaz÷s stadijoje chromosomos stipriau kondensuojasi ir sudaro lengvai nustatomas seserinių chromatidžių poras. Chromatinas yra DNR vijų kompleksas su baltymu interfaziniame brandolyje. Chromatino baltymai yra dviejų rūšių: histonai ir nehistoniniai baltymai

138

138

(topoizomeraz÷s, SMC baltymai). Histonai yra pagrindiniai struktūriniai baltymai, tuo tarpu nehistoniniai baltymai yra įvairesni, jie dalyvauja struktūros palaikyme ir reguliacijoje.

Histonai yra nedidel÷s molekulin÷s mas÷s, baziniai baltymai, kurių sud÷tyje daug bazinių lizino ir arginino aminorūgščių, kurių teigiami krūviai sudaro joninius ryšius su neigiamai įkrautomis polinukleotidin÷s grandin÷s fosfato molekul÷mis. Yra žinomos penkios skirtingos histonų grup÷s, kurios skiriasi molekuline mase ir aminorūgščių sud÷timi: H1, H2A, H2B, H3 ir H4. ( 3.6 lentel÷ )

3.6 lentel÷ Histonų charakteristikos. Garret naujas Histonas Lizino ir

Arginino santykis Mm

(Da) Aminorūgščių

skaičius H1 59/3 21000 213 H2A 13/13 14000 129 H2B 20/8 13800 125 H3 13/17 15300 135 H4 11/14 11300 102 Histoniniai baltymai gali būti modifikuojami – metilinami, acetilinami, fosforilinami,

glikozilinami, ADP-ribozilinami. Šios modifikacijos keičia histonų sąveiką su DNR, keičia chromatino struktūrines ir funkcines savybes, kinta transkripcijos reguliacija.

Kada chromatinas paveikiamas žemos jonin÷s j÷gos (<5mM) druskos tirpalais, jis išsisuka ir elektronin÷s mikroskopijos nuotraukose atrodo kaip v÷rinys karoliukų. Karoliukai yra DNR-histonų kompleksas vadinamas nukleosoma.

3.21 pav. Nukleosomos struktūra. Šerdį sudaro 8 histono molekul÷s, apie kurias apsisuka

DNR. (Life science of biology by Purves & Helly, 5th ed. 1997) Į nukleosomą įeina viena molekul÷ histono H1 ir po dvi molekules histonų H2A, H2B, H3

ir H4 ir DNR. H2A, H2B, H3 ir H4 molekul÷s sudaro baltyminį kompleksą histono oktamerą, apie kurį apsisuka DNR. B formos DNR molekul÷s per 150 bazių porų 1,65 karto apjuosia histoninius baltymus ir suformuoja šerdies dalelę. Šerdies daleles jungia per 50bp ilgio DNR vadinama jungtuku. Histonas H1 jungiasi su jungtuko DNR ir su šerdies dalele.

DNR apsukimas apie nukleosomas šerdį sumažina DNR ilgį apie 7 kartus. Bendras DNR ilgio sumaž÷jimas susidarant chromosomai yra per 10000 kartų, d÷ka aukštesnio lygio struktūrizacijos. Aukštesnio laipsnio chromatinas susidaro nukleosomoms susivyniojant į solenoido pavidalo struktūrą, vadinama 30nm filamentas (fibre). DNR kompaktizuojama per 100 kartų. 30nm filamentas susisuka į kilpą ir šešios kilpos prisijungia prie pamato (scafolld) į kurio sud÷tį įeina histonas H1, topoizomeraz÷ II ir SMC baltymai. Ši struktūra vadinama rozete ,

139

139

kurios tarpusavyje susisuka ir susidaro chromosoma. (3. pav.)

3.22 pav. DNR išsid÷stymas eukariotų chromosomoje. (pav.iš Lenindžerio) Skirtingose chromosomose chromatino susipakavimas gali skirtis, tod÷l šiuo metu n÷ra vieningo medelio detaliai chromosomos struktūrai. Bakterij ų DNR susipakavimas

Nors histonai randami tiktai eukariotuose, bakterijų DNR kondensuotoje formoje jungiasi su baziniais baltymais (jie vadinami į histonus panašūs baltymai) ir sudaro kompaktiškesnes struktūras. Jos nesudaro į nukleosomas panašių dalelių ir didel÷ dalis DNR yra nesusijungusi su baltymu. Bakterijose DNR vienoje ar keliose vietose yra susijungusi su plazmine membrana.

140

140

Bakterijų chromosomos sudaro struktūras, kurios vadinamos nukleoidu. E.coli į histonus panašūs baltymai vadinami HU jie yra dimerai ir per kelias min prisijungia ar disocijuoja nuo DNR. Stabili DNR-baltymo struktūra n÷ra rasta. Bakterijose ląstel÷s dalijimosi ciklas trunka apie 15min, tuo tarpu eukariotų ląstel÷s gali nesidalinti net m÷nesius. Greitesn÷ medžiagų apykaita bakterijose reikalauja, kad didesn÷ dalis DNR turi replikuotis ar transkribuotis.

3.3 Ribonukleorūgštys

DNR molekul÷je yra užkoduota genetin÷ informacija, tačiau pati DNR molekul÷ tiesiogiai baltymų biosintez÷je nedalyvauja. Informacija yra realizuojama RNR pagalba. Yra sintetinamos trys pagrindin÷s RNR rūšys – informacin÷, transportin÷ ir ribosomin÷ ribonukleorūgštys. Informacin ÷ RNR (iRNR) koduoja aminorūgščių seką baltymo molekul÷je. Pernašos RNR (tRNR) prijungia atitinkamą aminorūgštį ir atneša ją į ribosomas, kur aminorūgštys sujungiamos į polipeptidinę grandinę. Ribosomin÷s RNR ( rRNR) susijungusios su baltymais sudaro ribosomas ir katalizuoja peptidinio ryšio susidarymą. Eukariotų ląstelių branduolyje taip pat surastos mažosios branduolio RNR (mbRNR) bei branduolio heterogenin÷s RNR (hbRNR). Mažosios branduolio RNR (snRNR) turi 100-200 nukleotidų, jos susijungia su specifiniais baltymais, sudaro kompleksus vadinamus mažosios ribonukleoproteinin÷s dalel÷s. Jos sutinkamos tiktai eukariotuose, jų branduolyje, ir dalyvauja RNR brendime, bei jų pernešime iš branduolio į citozolį. Branduolio heterogenin÷s RNR tai bendra citoplazminių RNR pirmtakų frakcija. Kai kurių virusų genetin÷ informacija užrašyta RNR molekul÷je. RNR molekul÷s yra linijin÷s ir dažniausiai sudarytos iš vienos polinukleotidin÷s grandin÷s. Miel÷se rastos dvigrandin÷s RNR.

RNR išskirtų iš bakterijų E.coli bendra charakteristika pateikta 3.7 lentel÷je. 3.7 lentel÷ E.coli RNR charakteristikos

Tipas Sedimentacijos koeficientas

Molekulin÷ mas÷ Da

Nukleotidų skaičius

Visos ląstel÷s RNR dalis (%)

iRNR 6-25 25000-1000000

75-3000 ~2

tRNR ~4 23000-30000 73-95 16 rRNR 5

16 23

35000 550000 1100000

120 1542 2904

82

3.3.1 Informacin ÷ RNR (iRNR) Informacinių RNR (jos dar yra vadinamos mesendžerin÷mis RNR) grandinių ilgis yra

labai įvairus ir priklauso nuo baltymo, kurio sintezę koduoja ilgio. Jos sintetinamos transkripcijos proceso metu. Informacija apie aminorūgščių seką polipeptidin÷je grandin÷je yra užrašyta iRNR polinukleotidin÷s grandin÷s bazių sekoje ir transliacijos (baltymų biosintez÷s) metu perduodama baltymo molekulei. Prokariotuose viena iRNR gali koduoti dviejų ir daugiau baltymų sintezę, tokios iRNR vadinamos policistronin÷mis. Eukariotuose iRNR koduoja tiktai vieno baltymo sintezę ir yra vadinama monocistronine. Ji yra sintetinama branduolyje žymiai ilgesnio pirmtako pavidale, kuris vadinamas heterogenin÷ branduolio RNR (hbRNR). hbRNR turi nukleotidų sekas, kurios nekoduoja baltymo ir yra vadinamos intronais, jos išsid÷sto tarp koduojančių sekų, vadinamų egzonais. Intronai pašalinami RNR brendimo metu. Eukariotų iRNR pirmin÷ struktūra

141

141

turi kelis bendrus bruožus. Polinukleotidin÷s grandin÷s 5/ gale yra modifikuotas nukleotidas - 7-metilguanozino 5/-trifosfatas, vadinamas „kepur÷“.

NH2

OCH3

O

H

H

H

H

HH

O P O P O P O CH2

O O

O O O

O

3. 23 pav. Informacin÷s RNR 5/ galo nukleotidas 7-metilguanozino 5/-trifosfatas “kepur÷” Už keliasdešimties nukleotidų nuo „kepur÷s“ yra inicijuojantis kodonas, dažniausiai

AUG. Koduojamo baltymo i-RNR nukleotidų seka baigiasi vienu iš terminuojančių kodonų – UAG, UUA ar UGA. Daugumos iRNR 3/ gale yra 100-200 nukleotidų seka, sudarytų iš adenozino monofosfato liekanų - polyA. Poliadenilinimas padidina iRNR stabilumą, jos tampa atsparesn÷s nukleaz÷ms.

3.3.2 Pernašos RNR (tRNR) Pernašos RNR yra nedidel÷s molekulin÷s mas÷s ribonukleorūgštys, pernešančios

aminorūgštis į ribosomas. Jos randamos bakterijose ir eukariotų citozolyje ir į jų sud÷tį įeina nuo 73 iki 95 mononukleotidų liekanų, tai atitinka molekulinę masę nuo 24000 iki 31000 Da. Mitochondrijose ir chloroplastuose esančios tRNR yra mažesn÷s. Ląstel÷je turi būti mažiausiai viena tRNR pernešanti specifinę aminorūgštį, yra 32 tRNR reikalingos atpažinti visus aminorūgščių kodonus, ( tam tikros tRNR atpažįsta daugiau nei vieną kodoną). Kai kurios ląstel÷s aminorūgščių pernešimui naudoja daugiau nei 32 tRNR.

Pirmin ÷ struktūra. 1965m. Holi (R.W.Holey) nustat÷ tRNR, kuri miel÷se perneša aminorūgštį Ala pirminę struktūrą (tRNRAla). Ji sudaryta iš 76 mononukleotidų, iš kurių dešimt yra modifikuoti. Daugumos tRNR polinukleotidin÷s grandin÷s 5/ gale yra guanilatas , kuris yra fosforilintas. Visų tRNR 3/ gale yra trijų nukleotidų CCA seka. Aminorūgštis prisijungia prie tRNR gale esančio adenozino 3' OH grup÷s. tRNR sud÷tyje yra didelis kiekis (iki 25%) minorini ų nukleotidų ir bazių tokių kaip inozinas, pseudouridinas, dihidrouridinas, metilintų guanozino, adenozino. Molekul÷s viduje yra antikodonas, t.y. trys nukleotidai, kurie jungiasi su iRNR kodonu.

Antrin ÷ struktūra. tRNR molekul÷s yra sudarytos iš vienos polinukleotidin÷s grandin÷s, tačiau gali suformuoti dešinio sukimo A-tipo spiralinius segmentus (jie yra vadinami stiebeliais), kuriuos stabilizuoja vandeniliniai ryšiai tarp komplementarių bazių A-U ir G-C. Spiralizuotas dalis jungia kilpos. tRNR polinukleotidin÷s grandin÷ sudaro dobilo lapo formos struktūrą (3.24 pav.)

142

142

3.24 pav. Mielių tRNRAla antrin÷ struktūra. Simboliai: m1G – 1-metilguanozinas, D – 5,6-

dihidrouridinas, m2G – N2-dimetilguanozinas, I – inozinas, m1I – 1-metilinozinas, ψ - pseudouridinas. Brūkšneliai tarp bazių simbolizuoja vandenilinius ryšius. Variabilios kilpos ilgis skiriasi įvairiose tRNR.

Aminorūgštis prisijungia prie tRNR aminorūgšties akceptorinio galo, kuris visų tRNR yra CCA. Aminorūgšties karboksigrup÷ prisijungia prie adenozino pentoz÷s 2/ ar 3/ hidroksigrup÷s. Antikodonin ÷je kilpoje yra trys nukleotidai, vadinami antikodonu, kurie komplementariai susijungia su iRNR kodonu. D kilpoje randamas minorinis nukleotidas dihidrouridinas ( iš čia kilo kilpos pavadinimas), o TψψψψC kilpoje yra ribotimidinas (T) ir pseudouridinas (ψ), kuriame ryšys tarp baz÷s ir riboz÷s yra ne C-N, bet C-C. D ir TψC kilpos vaidina svarbų vaidmenį tRNR molekul÷s erdvin÷s struktūros susidaryme. Variabilioje kilpoje yra nuo 3 iki 21 nukleotido.

Tretin ÷ struktūra. tRNR tretin÷ struktūra buvo nustatyta 1974 metais Ričo (A.Rich), Kimo (S.H.Kim) ir Klago (A.Klug). Dobilo lapo tRNR molekul÷ erdv÷je susisuka į L formos trijų dimensijų struktūrą. Kiekviena L molekul÷s šaka yra per 6,0nm ilgio. tRNR molekul÷s plotis yra 2,0 – 2,5nm, dvi molekul÷s gali tuo pačiu metu ribosomoje prisijungti prie gretimų iRNR kodonų. Aminorūgščių akceptorinis galas yra viename L formos molekul÷s gale, o antikodonas yra kitame gale esančioje kilpoje (3.25 pav.). Susidariusi kompaktiška molekul÷ yra labai stabili, d÷ka susidariusių vandenilinių ryšių tarp D, TψC ir variabilioje kilpoje esančių nukleotidų. Susidaro bazių poros, kurios skiriasi nuo klasikinių Votsono Kriko bazių porų (pavyzdžiui pora G−ψ). Struktūrą taip pat stabilizuoja neįprasti vandeniliniai ryšiai tarp bazių ir fosfato liekanų ar bazių ir riboz÷s 2/-OH grupių.

143

143

3.25 pav. tRNR tretin÷ struktūra

3.3.3 Ribosomin÷s RNR (rRNR) rRNR laisva nerasta o susijungusi su baltymais sudaro ribosomas, kuriose sintetinami

baltymai. Prokariotų ląstel÷se randamos trijų rūšių rRNR – 5S, 16S ir 23S (S (Svedbergas) –sedimentacijos konstanta, kuri nusako molekul÷s sedimentacijos greitį ultracentrifūgoje ir susijusi su molekul÷s ar dalel÷s molekuline mase ir forma). Iš eukariotų išskirtos keturios rRNR - 5S, 5,8S, 18S ir 28S rRNR

Pirmin ÷ RNR struktūra. 1967m. Sendžeris nustat÷ 16S rRNR pirminę struktūrą. šiuo metu pagal nukleotidų seką DNR molekul÷je lengva sužinoti pirmines RNR struktūras. rRNR taip pat randami modifikuoti nukleotidai – pseudouridinas, ribotimidilin÷ rūgštis, bei metilintos baz÷s. rRNR yra labai konservatyvios pagal savo pirminę ir antrinę struktūras.

Antrin ÷ struktūra. Ribosomin÷s RNR polinukleotidin÷je grandin÷je komplementarios baz÷s susijungia vandeniliniais ryšiais ir susidaro trumpi spiraliniai segmentai, kuriuos jungia nespiralizuotos kilpos. Daugiausiai vandeniliniais ryšiais jungiasi kanonin÷s baz÷s (A-U ir G-C) Suporuoti nukleotidai išsid÷sto vienas virš kito ir suformuoja A-tipo dvigubos spiral÷s fragmentus. Ji skiriasi nuo klasikin÷s B-tipo DNR dvigubos spiral÷s tuo, kad viename žingsnyje yra 11 bazių porų o ne 10. A-tipo spiral÷je yra siauras ir gilus mažasis griovys ir l÷kštas, platus didysis griovys, kuriuo RNR sąveikauja su kita RNR arba su baltymu. RNR molekul÷se sutinkami ir ne Votsono ir Kriko bazių poros kaip G-U ir G-A. . 16S rRNR antrin÷ struktūra pateikta 3.26 pav.

,

144

144

3.26 pav. 16S ribosomin÷s RNR antrin÷ struktūra.

Tretin ÷ struktūra Tretinę RNR struktūrą palaiko dviejų tipų sąveika – vandeniliniai ryšiai tarp nukleotidų

ir sąveika tarp gretimų bazių aromatinių žiedų. Ilgą laiką buvo manoma, kad ribosomin÷ RNR sudaro karkasą, prie kurio jungiasi ribosominiai baltymai kurie katalizuoja peptidinio ryšio susidarymą. Nustačius archebakterijų 50S ribosomų subvieneto struktūrą, (~0,3nm skiriamoji geba) pasirod÷, kad peptidiltransferazinį centrą sudaro glaudžiai supakuota rRNR, o baltymo molekul÷s išsid÷sto struktūros pakraščiuose minimum 1,8nm nuo aktyvaus centro. Buvo parodyta, kad baltymo funkcija yra suformuoti ir palaikyti tokią erdvinę rRNR struktūrą, kuri gal÷tų veikti kaip ribozimas ir katalizuotų peptidinio ryšio susidarymą.

SANTRAUKA Eukariotinių ląstelių chromatino pagrindą sudaro nukleosomas, sudarytos iš histonų ir

per 200bp DNR molekul÷s. Nukleosomos šerdis sudaryta aštuonių histonų (po dvi kopijas H2A, H2B, H3 ir H4)k urias apvynioja DNR. Nukleosomas organizuotos į 30nm filamentus, kurie prisijungia prie pamato baltymų – histono H1, topoizomeraz÷s II ir SMC baltymų. Bakterijų chromosomos taip pat kompaktizuojamos į ir sudaro nukleoidus. Į histonus panašūs baltymai sudaro trumpalaikius kompleksus su DNR.

145

145

4 ANGLIAVANDENIAI Angliavandeniai (karbohidratai, sacharidai) yra labai svarbi visų gyvų organizmų sud÷tin÷

dalis. Gyvūnų ir žmogaus organizme jų yra nelabai daug, bet jie vaidina pagrindinį vaidmenį energetiniame organizmo režime. Augalin÷se ląstel÷se angliavandeniai gali sudaryti 90% ir daugiau jų sauso svorio. Pats terminas angliavandeniai pasiūlytas prieš 100 metų. Tais laikaisbuvo manoma, kad tai yra medžiagos sudarytos iš anglies ir vandens, o jų kurių sud÷tį galima išreikšti formule Cn(H2O)n. V÷liau pasirod÷, kad kai kuriems angliavandeniams, pvz. deoksiribozei ši formul÷ netinka, tačiau pavadinimas išliko. Angliavandeniai yra polihidroksialdehidai ar polihidroksiketonai arba medžiagos, kurias skaidant jie susidaro. Taip pat naudojamas terminas yra sacharidai. Šis terminas yra kilęs iš graikiško žodžio sakcharon reiškiančio cukrus.

Angliavandenių fiziologinis vaidmuo: 1) energijos šaltinis - oksiduojantis gliukozei ir kitiems angliavandeniams, išsiskyrusi

energija panaudojama ATP sintezei, kuri yra pagrindin÷ ląstel÷s energetin÷ valiuta, 2) struktūrinis elementas - įeina į bakterijų ir augalų ląstelių sienelių sud÷tį, v÷žiagyvių

chitinį apvalkalą, 3) atsargin÷ maisto medžiaga - ląstel÷je kaupiamas krakmolas, glikogenas, 4) įeina į nukleorūgščių, antibiotikų sud÷tį, iš jų sintetinamas aminorūgščių anglies

skeletas, kiti biologiškai aktyvūs junginiai, 5) angliavandeniai, susijungę su baltymais ar lipidais (glikoproteinai, proteoglikanai ir

glikolipidai) yra svarbūs sudarant tarpląstelinius kontaktams, užląstelin÷s matricos sudaryme, ląstelių atpažinimo, recepcijos procesuose, prijungiant virusus, antikūnus.

Angliavandenius galima skirstyti į šias grupes: 1) monosacharidai – hidroliz÷s metu neskyla į mažesn÷s molekulin÷s mas÷s

monosacharidus. Plačiausiai paplitęs monosacharidas sudarytas iš šešių anglies atomų yra D-gliukoz÷.

2) oligosacharidai - molekul÷s sudarytos iš 2-10 monomerų sujungtų glikozidiniais ryšiais. Dažniausiai sutinkami yra disacharidai - yra sacharoz÷, laktoz÷, maltoz÷.

3) polisacharidai - polimerai sudaryti iš šimtų ir tūkstančių monosacharidų. Kai kurie polisacharidai kaip celiulioz÷, chitinas yra linijin÷s molekul÷s, kiti – glikogenas, amilopektinas yra šakotos molekul÷s.

4.1 Monosacharidai

Į monosacharidus galime žiūr÷ti kaip į daugiahidroksialkoholius, kuriuose viena hidroksigrup÷ yra oksiduota iki aldehido- arba ketogrup÷s. Jie yra gerai tirpūs vandenyje ir netirpsta nepoliniuose tirpikliuose. Dauguma yra saldūs. Pagal funkcines grupes jie skirstomi į dvi klases: aldozes, turinčias aldehidogrupę ir ketozes, kurių sud÷tyje yra ketogrup÷. Priklausomai nuo anglies atomų skaičiaus monosacharidai skirstomi į triozes (C3), tetrozes (C4), pentozes (C5), heksozes (C6), heptozes (C7) ir tt.

4.1.1 Monosacharidų stereoizomerija. Mažiausias monosacharidas yra trioz÷. Yra dvi trioz÷s – glicerolio aldehidas ir

dihidroksiacetonas (1,3-dihidroksipropanonas). Dihidroksiacetonas ir glicerolio aldehidas turi tą pačią atomų sud÷tį. Jie yra struktūriniai izomerai. Aldoz÷s, turinčios mažiausiai tris anglies atomus, o ketoz÷s su mažiausiai keturiais anglies atomais turi chiralinius centrus suka poliarizacijos plokštumą, tai yra jos yra optiškai aktyvios. Asimetrinio anglies atomo

146

146

konfiguraciją galima apibūdinti R, S sistema, tačiau biochemijoje tradiciškai naudojama D ir L eil÷s terminologija. Aldotrioz÷s glicerolio aldehido C-2 atomas yra sujungtas su keturiais skirtingais pakaitais ir yra chiralinis (stereogeninis) atomas. Šis junginys turi 2 stereoizomerus - D-glicerolio aldehidą ir L-glicerolio aldehidą . Tokie junginiai yra vadinami enantiomerais, jie yra vienas kitos veidrodinis atspindys. D-eilei priskiriami tie angliavandeniai, kuriuose prie paskutinio chiralinio atomo (toliausiai nutolusio nuo karbonilgrup÷s) hidroksigrup÷ yra toje pačioje pus÷je kaip ir D-glicerolio aldehido, tai yra vaizduojant Fišerio projekcijoje hidroksigrup÷ yra dešin÷je pus÷je. Į kokią pusę dešinę (+) ar kairę (-) sacharido molekul÷ suks poliarizacijos plokštumą, priklauso nuo visų molekul÷je esančių chiralinių centrų. Gamtoje dominuoja D eil÷s monosacharidai. Iš L stereoizomerų gamtoje palitusi L-arabinoz÷, kuri įeina į glikoproteinų sud÷tį. Dihidroksiacetonas neturi chiralinio atomo ir yra optiškai neaktyvus. Monosacharidų konfiguracijai vaizduoti naudojamos Fišerio projekcin÷s formul÷s

C

CH2OH

C

H O

L-Glicerolio aldehidas

OH H C

CH2OH

C

H O

D-Glicerolio aldehidas

H OH

C

CH2OH

O

CH2OH

Dihidroksiacetonas

C

C

C

H OH

O H

HOH

OHH C

C OHH

CH2OH

C

C

C

OH H

O H

OHH

HOH C

C HOH

CH2OH

C

C

O H

OHH

HOH C

C HOH

CH2OH

D-Gliukoz÷ L-Gliukoz÷ L-arabinoz÷

1

2

3

4

5

6

Heksoz÷s turinčios daugiau nei vieną chiralinį atomą yra erdviniai izomerai. Tie, kurie

n÷ra vienas kito veidrodinis atspindys vadinami diastereomerai pavyzdžiui gliukoz÷, manoz÷, galaktoz÷. Diastereomerai, kurių tiktai vieno iš kelių chiralinių atomų konfiguracija yra skirtinga vadinami epimerais. D-gliukoz÷ ir D-manoz÷, D-riboz÷ ir D-arabinoz÷ yra epimerai. Molekul÷s, su n asimetrinių centrų turi 2n stereoizomerų. Šešių anglies atomų aldoz÷s turi keturis asimetrinius centrus, t.y. 24 = 16 stereoizomerų. D-aldozių stereochemija ir pavadinimai pateikti pav.

147

147

C

C

H OH

HOH

OHH C

C OHH

CHO

CH2OH

C

C

CHO

OH H

HOH

OHH C

C OHH

CH2OH

C

C

H OH

OHH

HOH C

C OHH

CHO

CH2OH

C

C

CHO

OH H

OHH

HOH C

C OHH

CH2OH

C

C

H OH

HOH

HOH C

C OHH

CHO

CH2OH

C

C

CHO

OH H

HOH

HOH C

C OHH

CH2OH

C

C

H OH

OHH

OHH C

C OHH

CHO

CH2OH

C

C

CHO

OH H

OHH

OHH C

C OHH

CH2OH

C

CHO

HOH

OHH C

C OHH

CH2OH

C

CHO

OHH

HOH C

C OHH

CH2OH

C

CHO

HOH

HOH C

C OHH

CH2OH

C

CHO

OHH

OHH C

C OHH

CH2OH

CHO

HOH C

C OHH

CH2OH

CHO

OHH C

C OHH

CH2OH

CHO

C OHH

CH2OH

D-Aloz÷ D-Altroz÷ D-Gliukoz÷ D-Manoz÷ D-Guloz÷ D-Idoz÷ D-Galaktoz÷ D-Taloz÷

D-Riboz÷ D-Arabinoz÷ D-Ksiloz÷ D-Liksoz÷

D-Eritroz÷ D-Treoz÷

D-Glicerolio aldehidas

4.1 pav. D-aldozių struktūra pagrindiniai atstovai. Gamtoje plačiausiai paplitusios aldoheksoz÷s yra D-gliukoz÷ (Glc), D-manoz÷ (Man) ir

D-galaktoz÷ (Gal) bei ketoheksoz÷ D-fruktoz÷ (Fru). Ketozių pagrindinių atstovų formul÷s pateiktos 4.2 pav.

148

148

C

C

CH2OH

OHH

OHH C

C OHH

CH2OH

C

CH2OH

OHOH

OHH C

C OHH

CH2OH

C

CH2OH

OHH

HOH C

C OHH

CH2OH

C

C

CH2OH

HOH

HOH C

C OHH

CH2OH

O OC O C O

C

C

CH2OH

OHH

OHH C

CH2OH

O C

C

CH2OH

HOH

OHH C

CH2OH

O

C

C

CH2OH

OHH

CH2OH

OC

C

CH2OH

HOH

CH2OH

O

C

CH2OH

CH2OH

O

D-Psikoz÷ D-Fruktoz÷ D-Sorboz÷ D-Tagatoz÷

D-Ribulioz÷ D-Ksilulioz÷

Dihidroksiacetonas

L-Eritrulioz÷ D-Eritrulioz÷

4.2 pav. D-ketozių pagrindiniai atstovai. Angliavandenių molekul÷s, į kurių sud÷tį įeina daugiau nei 4 anglies atomai, tirpaluose

n÷ra atviros grandin÷s, jos sudaro vidinius ciklinius hemiacetalius. Hemiacetaliai ar hemiketaliai susidaro reaguojant atitinkamai aldehidogrupei su hidroksigrupe arba ketogrupei su hidroksigrupe. (4.3 pav.). Gliukoz÷s molekul÷je C-1 aldehidin÷ grup÷ reaguoja su C-5 arba su C-4 hidroksigrupe ir susidaro vidinis molekulinis hemiacetalis

149

149

RO

HR R C

OH

OR

H

R R R C

OH

OR

R

O

R

C + HO1

2 21

Aldehidas Alkoholis Hemiacetalis

C + HO12

2

1

Ketonas Alkoholis Hemiketalis

3 3

4.3 pav. Hemiacetalių ir hemiketalių susidarymas Dažniausiai susidaro šešianaris piranozinis žiedas arba penkianaris furanozinis žiedas.

O O

Piranas Furanas Analogiškai reaguoja ketohksozių C-2 ketogrup÷ su atitinkama hidroksigrupe. Tirpaluose

nusistovi dinamin÷ pusiausvyra tarp ciklin÷s ir atviros struktūros. Kada monosacharidai yra įjungiami į polisacharido molekulę, polimeras sąlygoja koks ciklas susidarys. Biologiniuose polimeruose stabilizuojama viena iš jų.Tirpaluose D-riboz÷ yra mišinys furanozin÷s ir piranozin÷s formų. Ribonukleorūgštyse sutinkama ribofuranoz÷, tuo tarpu kai kuriuose augalinių ląstelių sienelių polisachariduose pentoz÷ yra piranozin÷je formoje. . Linijin÷s ciklinių monosacharidų formul÷s neatspindi molekul÷s realios formos, tod÷l dažnai naudojamos erdvin÷s projekcin÷s formul÷s (4.5 pav.) pasiūlytos Hoverto (W.Haworth).

150

150

OCH2OH

HH

OHH

OH

OH

HOH

H

OCH2OH

HH

OHH

OH

OH

HH

OH

C

C

C

H OH

O H

HOH

OHH C

C OHH

CH2OH

C

C

C

H OH

H

HOH

OHH C

CH

CH2OH

HO

O

D-Gliukoz÷linijin ÷ forma

Fišerio Hovertoprojekcin÷ formul÷ projekcin÷ formul÷

1

D-Gliukoz÷ciklin÷ forma

α-D-Gliukoz÷α-D-Gliukopiranoz÷

β-D-Gliukoz÷β-D-Gliukopiranoz÷

23

4

5

6

1

5

1

C

C

CH2OH

HOH

OHH C

C OHH

CH2OH

OO

OH

OH

H

HH

CH2OH CH2OH

OH

D-Fruktoz÷ α-D-Fruktofuranoz÷

1

2

3

4

5

6

1

25

6

4.4 pav. Hoverto projekcinių formulių sudarymas Susidarant ciklinei struktūrai pirmas anglies atomas tampa papildomu chiraliniu centru, ir

yra vadinamas anomeriniu anglies atomu (jis dar yra vadinamas glikozidiniu anglies atomu) arba anomeriniu centru. Hemiacetalin÷ gliukoz÷ yra dviejų diastereomerinių α ir β formų. Priklausomai nuo OH grup÷s pad÷ties prie pirmo gliukoz÷s anglies atomo turime dar 2 gliukoz÷s stereoizomerus α-D-gliukozę ir β-D-gliukozę, kurie vadinami anomerais. Ištirpinus išvalytą anomerą vandenyje gaunamas α ir β formų mišinys, tarp kurių nusistovi pusiausvyra. Pavyzdžiui vandenyje gliukoz÷s α-piranozin÷ forma sudaro 36%, o β-piranozin÷ forma 64%. Furanozin÷s formos kiekis yra labai nedidelis. Monosacharidai tirpaluose savaimingai gali pereiti iš α į β

151

151

formas. Šio per÷jimo metu kinta poliarizacijos plokštumos sukimo kampas ir šis reiškinys vadinamas mutarotacija . In vivo per÷jimą katalizuoja fermentai mutarotaz÷s.

OCH2OH

HH

OHH

OH

OH

HOH

H

α-D-Gliukoz÷

OCH2OH

HH

OHH

OH

H

OHOH

H

α-D-Manoz÷

OCH2OH

HOH

HH

OH

OH

HOH

H

α-D-Galaktoz÷

OCH2OH

H

OH

H

H

OHOH

CH2OH

α-D-Fruktoz÷ 4.5 pav. Monosacharidų projekcin÷s Hoverto formul÷s Hauverso projekcin÷ formul÷ nepilnai atspindi erdvinę molekul÷s struktūrą. Fizikiniais

tyrimo metodais nustatyta, kad piranoz÷s žiedas n÷ra plokščias, o įgauna k÷d÷s ar valties konformacijas. Daugumai monosacharidų stabilesn÷ k÷d÷s konformaciją.

O

H

OHOH

H

H

OH

OH

H

H

α-D-Gliukopiranoz÷K÷d÷s konformacija

CH2OH

4.1.2 Monosacharidų dariniai Gyvuose organizmuose sutinkami įvairūs monosacharidų dariniai, kurie svarbūs kaip

struktūriniai komponentai ar tarpiniai metabolizmo produktai. Monosacharidų fosfatai

Labai dažnai tarpiniai angliavandenių metabolizmo produktai yra jų esteriai su fosforo rūgštimi (fosfatai). Tai gali būti pentozių, heksozių, glicerolio aldehido fosfatai ir kt. Dažniausiai reaguoja hidroksigrup÷s prie C-1 ir C-6 anglies atomų, tod÷l turime gliukoz÷s 1-fosfatą, gliukoz÷s 6-fosfatą. Juos plačiau nagrin÷sime angliavandenių metabolizmo skyriuje. (Skyrius) Deoksisacharidai,

Tai yra monosacharidai, kuriuose viena ar kelios hidroksigrup÷s yra pakeistos vandeniliu.

OCH2OH

H

OH

H

H

HH

OH

2-Deoksi-β-D-riboz÷

OCH3

H

OHOH

H

H

OH

H

OH

H

-L-Fukoz÷α

OCH3

OH

HOH

H

OH

H

H

OHH

-L-Ramnoz÷α 4.6 pav. Deoksisacharidai 2-Deoksi-D-riboz÷ yra DNR komponentas. L-ramnoz÷ (6-deoksi-L-manoz÷) ir L-fukoz÷

(6-deoksi-L-galaktoz÷) sutinkama gyvūnuose, augaluose, mikroorganizmuose, įeina į polisacharidų, glikoproteinų, glikolipidų sud÷tį. Jie yra vieni iš nedaugelio sutinkamų L enantiomerų. Ramnoz÷ įeina į ouabaino, toksinio širdies glikozido sud÷tį. Ouabainas yra vienas iš veikliausių Na+,K+-ATPaz÷s slopiklių.

152

152

OCH3

OH

HOH

H

OH

H

H

OH

O

O

OH

OH

OH

CH2

CH3

OH

OH

Ouabainas

Aminosacharidai Angliavandenių molekul÷se hidroksigrupę pakeitus amino grupe gauname

aminosacharidus. Svarbesnieji atstovai yra D-gliukozaminas ir D-galaktozaminas, bei jų acilinti dariniai. Jie įeina oligosacharidų, polisacharidų sud÷tį. Chitinas yra N-acetilgliukozamino (GlcNAc, jis yra dar trumpinamas NAG) polimeras, acilinti aminosacharidų dariniai randami glikoproteinuose, proteoglikanuose, peptidoglikanuose.

OCH2OH

HH

OHH

OH

NH2

HOH

H

D-Gliukozaminas (GlcN)

OCH2OH

HH

OHH

OH

NH

HOH

H

CH3

C O

N-Acetil-D-gliukozaminas (GlcNAc)

OCH2OH

HOH

HH

OH

NH

HOH

H

CH3

C O

N-Acetil-D-galaktozaminas (GalNAc)

153

153

C

C

C

CH3-CO-NH H

HOH

OHH C

C OHH

CH2OH

OH

C

CH2

COOH

O

H

N-acetilneuramino rūgštis (linijin÷ forma)

OH

R

HOH

H

H

HOH

COOHCH3-CO-NH

OHH C

C OHH

CH2OH

R

N-acetilneuramino rūgštis (piranozin÷ forma)

piruvorūgštiesliekana

N-acetil-manozaminas

OCH2OH

HH

OHH

O

NH

HOH

H

CH3

C O

CH3-CH-COOH

N-acetilmuramo rūgštis (NAM) 4.7 pav. Aminosacharidai N-acetilmuramo rūgštis (NAM) yra vienuolika anglies atomų turintis sacharidas,

susidedantis iš D-pieno rūgšties, eteriniu ryšiu sujungtos su GlcNAc C-3 atomu. N-acetilmuramo rūgštis susijungusi su N-acetilgliukozaminu sudaro glikaną, pagrindinį bakterijų ląstelių sienel÷s komponentą. N-acetilneuramino rūgštis, sudaryta iš N-acetilmanozamino ir piruvo rūgšties sutinkama glikoproteinuose ir glikolipiduose. N-acetilneuramino rūgštis ir jos dariniai dažnai vadinami sialo rūgštimis ir apsprendžia ląstel÷s paviršiaus neigiamą krūvį.

Modifikuoti sacharidai yra sud÷tingų oligo- ir polisacharidų monomerai. Rašant tokių molekulių struktūras, naudinga naudoti angliavandenių sutrumpintus pavadinimus. Dažniausiai naudojamų angliavandenių sutrumpinimai duodami lentel÷je 4.1.

4.1 lentel÷ Monosacharidų ir jų darinių pavadinimų naudojami sutrumpinimai

154

154

Sacharid ų alkoholiai

Hidrinant sachariduose aldehido arba ketogrupę susidar

o daugiahidroksialkoholiai. Redukuojant gliukozę gauname gliucitolį, labiau paplitęs jo pavadinimas yra sorbitolis. Iš manoz÷s susidaro manitolis, o iš riboz÷s - ribitolį (adonitolį). Sacharidų alkoholiai yra saldūs, tod÷l sorbitolis, manitolis, ksilitolis vartojami kaip saldikliai kramtomos gumos ir kitų produktų gamyboje. Glicerolis ir mio-inozitolis yra svarbūs lipidų komponentai. Inozitolio yra devyni stereoizomerai, paveiksle pateikta inozitolio, išskirto iš širdies raumenų (tod÷l priešd÷lis mio) formul÷. Inozitolis lengvai fosforilinamas, susidarę inozitolio fosfatai pvz. Inozitolio 1,4,5-trisfosfatas, labai svarbus signalo perdavimo grandin÷s ar keliuose. Ribitolis įeina į FMN ir FAD, teichoinių rūgščių sud÷tį.

CH2OH

C

C

C

C

CH2OH

H

OH

OHH

H

OH

H OH

CH2OH

C

C

C

C

CH2OH

H

OH

OHH

H

OH

OH H CH2OH

C

C

C

CH2OH

OH

OH

OHH

H

H

D-sorbitolis D-manitolis D-ribitolis

H

OHOH

HH

OHH

OH

OH

HH

OH

mio-Inozitolis

1

23

4

5 6

4.8 pav. Sacharidų alkoholiai

Sacharidų rūgštys Monosacharidai turintys aldehidogrupę lengvai oksiduojami silpnais oksidatoriais tokiais

kaip Fe3+ ar Cu2+ jonais. Aldehidogrup÷ oksiduojama į karboksigrupę. Gliukoz÷ ir kiti angliavandeniai turintys aldehidogrupę ir galintys redukuoti Fe3+ ar Cu2+ jonus vadinami redukuojantys cukrai . Oksiduojant angliavandenius gauname įvairias rūgštis. Galime oksiduoti aldehidogrupę prie C-1, hidroksigrupę prie C-6 anglies atomo arba abi grupes kartu. Aldoz÷s aldehidogrup÷ lengvai oksiduojasi, susidarant atitinkamoms aldono rūgštims. Oksiduojant gliukozę gauname gliukono rūgštį, galaktozę - galaktono rūgštį. Vandeniniuose tirpaluose hidroksigrup÷ reaguoja su karboksigrupe, susidarant δ-laktonui arba γ-laktonui. Oksiduojanti tiktai hidroksigrupę prie C-6 atomo susidaro urono rūgštys - gliukurono, idurono. Redukuojant gliukurono rūgštį gauname gulono rūgštį, iš kurios yra sintetinama askorbo rūgštis (vitaminas C). Ji yra reduktorius ir oksiduojasi iki dehidroaskorbo rūgšties. Oksiduojant netiktai aldehidogrupę,

Monosacharidai Monosacharidų dariniai Arabinoz÷ Ara Gliukono rūgštis GlcA Fruktoz÷ Fru Gliukurono rūgštis GlcUA Fukoz÷ Fuc Galaktozaminas GalN Galaktoz÷s Gal Gliukozaminas GlcN Gliukoz÷ Glc N-Acetilgalaktozaminas GalNAc Liksoz÷ Lyx N-Acetilgliukozaminas GlcNAc

(arba NAG) Manoz÷ Man Muramo rūgštis Mur Riboz÷ Rib N-Acetilmuramo rūgštis MurNAc

(arba NAM) Ksiloz÷ Xyl N-Acetilneuramino

rūgštis (arba sialo rūgštis) NeuNAc (arba Sia)

155

155

C

C

C

H OH

O H

HOH

OHH C

C OHH

COOH

C

C

C

H OH

O H

HOH

OHH C

C OHH

CH2OH

C

C

COOH

H OH

HOH

OHH C

C OHH

COOH

C

C

COOH

H OH

HOH

OHH C

C OHH

CH2OH

OH

H

OHH

OH

OH

HH

OH

COOH

OH

H

OHH

OH

OH

H

CH2OH

O

D-gliukurono rūgštis D-gliukoz÷

D-gliukaro rūgštis

D-gliukono rūgštis

D-δ-gliukolaktonas

D-gliukurono rūgštis ciklin÷ forma

oksidacija C-1

oksidacija C-6

oksidacija C-1 ir C-6

4.9 pav. Sacharidų rūgščių susidarymas bet ir pirminę hidroksigrupę (C-6) susidaro polihidroksidikarboksirūgštys vadinamos

aldaro rūgštimis. Oksiduojant gliukozę gauname gliukaro rūgštį, ji yra dar vadinama cukraus rūgštimi, oksiduojant manozę – manaro (manocukraus) rūgštį, o galaktozę – galaktaro (gleivių) rūgštį.

156

156

C

C

CH2OH

H OH

HOH

OHH C

C OHH

COOH

D-gulono rūgštis

C

C

C

OH

OH

H C

C HOH

CH2OH

O

C

C

C

O

O

H C

C HOH

CH2OH

O

L-askorbo rūgštis

O O

L-dehidroaskorbo rūgštis

-2H

OO

H

OH OH

CHOH

CH2OH

L-askorbo rūgštis

OH

H

OHH

OH

OH

HH

OHCOOH

L-idurono rūgštis 4.10 pav. Kai kurios sacharidų rūgštys 4.2 Disacharidai

Oligosacharidais vadinami tokie angliavandeniai, kurių molekul÷s sudarytos iš kelių (2-

10) monosacharidų, sujungtų O-glikozidiniais ryšiais. Glikozidinis ryšys susidaro reaguojant vieno angliavandenio hidroksigrupei su kito anomeriniu anglies atomu. Glikozidiniai ryšiai yra stabilūs šarmin÷je terp÷je, bet lengvai hidrolizuojami rūgštimis. Paprasčiausi disacharidai sudaryti iš dviejų monosacharidų yra maltoz÷, laktoz÷ ir sacharoz÷. Maltoz÷, izomaltoz÷, celiobioz÷ yra homodisacharidai sudaryti iš vieno tipo monosacharidų, sacharoz÷, laktoz÷ yra heterodisacharidai, sudaryti iš skirtingų monosacharidų.

Maltoz÷. Maltoz÷je dvi gliukoz÷s molekul÷s sujungtos α-(1→4)-glikozidiniu ryšiu. Ryšys susidaro tarp C-1 (anomerinio anglies atomo) vienos gliukoz÷s molekul÷s ir C-4 anglies atomo kitos gliukoz÷s. Kadangi lieka laisvas C-1 anomerinis atomas, tai maltoz÷ yra redukuojantis sacharidas. Ji gaunama hidrolizuojant krakmolą fermentu amilaze ir yra salyklos, susidarančios daiginant grūdus komponentas. Maltoz÷je ir celiobioz÷je gliukoz÷s molekul÷s yra sujungtos α−(1→4)-glikozidiniu ryšiu.

Izomaltoz÷. Labai panaši į maltozę yra, kurioje gliukoz÷s molekul÷s sujungtos α−(1→6)-glikozidiniu ryšiu, ji susidaro hidrolizuojant kai kuriuos bakterinius polisacharidus, pvz. dekstranus.

Celiobioz÷. Šioje molekul÷je ryšys tarp gliukoz÷s molekulių yra β−(1→4)-glikozidinis. Celiobioz÷ gaunama hidrolizuojant celiuliozę, reakciją katalizuoja fermentas celiuliaz÷.

157

157

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

H

O

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

H

OHOH

Maltoz÷α-D-gliukopiranozil-(1 4)-D-gliukopiranoz÷

1 4

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

H

OHOH

O

Celiobioz÷β-D-gliukopiranozil-(1 4)-D-gliukopiranoz÷

1 4

Laktoz÷ Disacharidas laktoz÷ randamas piene tod÷l vadinamas pieno cukrumi, jis labai

svarbus žinduolių maisto komponentas ankstyvose augimo stadijose. Hidrolizuojant laktozę susidaro D-galaktoz÷ ir D-gliukoz÷, kurios sujungtos β−(1→4)-glikozidiniu ryšiu. Žarnyne laktoz÷ n÷ra tiesiogiai absorbuojama į kraują, o yra suskaidoma. Laktoz÷s hidrolizę katalizuoja laktaz÷ (bakterijose ji vadinama β-galaktozidaz÷). Kai kurie žmon÷s neturi laktaz÷s, jų žarnyne kaupiasi neabsorbuota laktoz÷ ir padid÷jus disacharido koncentracijai didelis vandens kiekis pereina iš ląstelių į žarnyną, tod÷l stebima diar÷ja.

Sacharoz÷. Disacharidas susidaro susijungus α-D-gliukozei ir β-D-fruktozei (1→2)-glikozidiniu ryšiu. Sacharoz÷je n÷ra laisvų hemiacetalinių grupių ir ji neturi aldehidams būdingų redukcinių savybių. Sacharoz÷s hidrolizę katalizuoja sacharaz÷. Šis fermentas taip pat vadinamas invertaze, nes hidroliz÷s metu susidaro du monosacharidai ir keičiasi poliarizacijos plokštumos sukimo kampas. Fotosintez÷s metu sintetinama augaluose ir žmogus vartoja ją kaip stalo cukrų gautą pagrindinai iš cukrinių runkelių ar cukrašvendrių Susidarant medui, g÷lių nektare esanti sacharoz÷ hidrolizuojama iki gliukoz÷s ir fruktoz÷s. Įdomu pažym÷ti, kad meduje esanti fruktoz÷ pagrindinai yra β-D-fruktopiranozin÷je formoje.

158

158

OH

O

CH2OH

OH

H

H

OH

CH2OH

OHOCH2OH

HH

H

OH

OH

H

H

O

Sacharoz÷α-D-gliukopiranozil-(1 2)-β-D-fruktofuranozidas

1 2

OCH2OH

HOH

H

OH

OH

HO

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

H

OHH

Laktoz÷β-D-galaktopiranozil-(1 4)-β-D-gliukopiranoz÷

Trehalioz÷. Sudaryta iš dviejų gliukoz÷s molekulių, sujungtų α−(1→1)-glikozidiniu ryšiu. Ji yra vabzdžių hemolimfos pagrindinis komponentas, tarnauja kaip atsargin÷ maisto medžiaga grybuose (ypač miel÷se) bei dumbliuose. Taip pat buvo parodyta, kad trehalioz÷ yra gamtinis krioprotektorius, apsaugantis organizmą nuo didelių temperatūros svyravimų.

4.3 Aukštesnieji oligosacharidai

Gamtoje sutinkami ir kiti oligosacharidai, kurie yra natūralūs augalų ir medžių saldžių nektarų ir sulčių komponentai arba yra polisacharidų hidroliz÷s produktai. Labai įdomi yra cikloamilozių (pvz. ciklopentaamiloz÷, cikloheptaamiloz÷) junginių grup÷, sudarytų iš gliukoz÷s molekulių. Tirpaluose šie cikliniai junginiai sudaro įvairių dydžių “molekulines kišenes”, į kurias savitai gali patekti įvairaus dydžio molekules. Molekul÷s sud÷tyje yra daug chiralinių atomų, tod÷l šios molekul÷s panaudojamos nedidelių organinių stereoizomerų atskyrimui.

Stachioz÷ (Gal−α(1→6)-Gal−α(1→6)-Glc-β−(1→1)-Fru) plačiai sutinkama pupose, žirniuose. Šis oligosacharidas n÷ra virškinamas žmogaus žarnyno fermentų, bet metabolizuojamas žarnyno mikrofloros. Metabolizmo metu žarnyne išsiskiria dujų perteklius.

Gana plačiai yra paplitęs glikozidas amigdalinas randamas migdoluose, vyšnių, abrikosų kauliukuose. Amigdalino pagrindą sudaro disacharidas gentobioz÷ Pats amigdalinas n÷ra toksiškas, veikiant fermentui β-glikozidazei jis hidrolizuojasi ir išsiskiria HCN, kuris yra stiprus nuodas.

Trisacharidas rafinoz÷ randamas cukriniuose runkeliuose.

159

159

OCH2OH

OHOH

OH

OO

CH2

OHOH

OH

O C

CN

H

Amigdalinas

OCH2OH

OH

OH

OH

OCH2

OH

OH

OHO

OCH2

OHOH

OH

O

OCH2OH

OH

OHCHčOH

O

Stachioz÷

Galaktoz÷

Galaktoz÷

Gliukoz÷

Fruktoz÷

OCH2OH

OH

OH

OHO

OCH2OH

OH

OH

OCH2

OHOH

OHO

CH2OH

Rafinoz÷

Galaktoz÷

Gliukoz÷

Fruktoz÷

4.11 pav. Aukštesnieji oligosacharidai

160

160

Oligosacharidai yra kai kurių antibiotikų - streptomicino, bleomicino A2, aburamicino C ir kitų sud÷tin÷ dalis.

4.4 Polisacharidai

Polisacharidai (dar vadinami glikanais) yra viena iš gausiausių organinių molekulių rūšių sutinkamų žem÷je. Polisacharidais mes vadiname netiktai polimerus sudarytus iš monosacharidų, sujungtų glikozidiniais ryšiais, bet ir polimerines medžiagas, kuriose prie monosacharidų ar jų darinių kovalentiškai prijungtos aminorūgštys, peptidai, baltymai ir kiti junginiai. Polisacharidai būna linijiniai ir šakoti. Dažniausiai sutinkami –(1→4)- ir –(1→6)- tipo ryšiai, tačiau monosacharidai gali susijungti ir –(1→2)-, -(1→3)- ir kitais ryšiais. Be to dar gali būti dviejų α ir β formų. Polisacharidus galima suskirstyti į dvi grupes:

a) homopolisacharidai (homoglikanai), jie sudaryti iš vienodo tipo monosacharidų, pvz. gliukanai (sudaryti tiktai iš gliukoz÷s), mananai (iš manoz÷s), galaktanai (iš galaktoz÷s) ir kt.

b) heteropolisacharidai (heteroglikanai), sudaryti iš skirtingų rūšių monosacharidų. Polisacharidų sintezei n÷ra vieningos matricos, jie sintetinami prijungiant prie esančios

grandin÷s naujus monosacharidus, tod÷l naujai organizme sintetinti polimerai net ir tame pačiame organizme gali būti įvairaus ilgio, įvairios molekulin÷s mas÷s.

Polisacharidus galima suskirstyti ir pagal jų biologines funkcijas. Krakmolas ir glikogenas yra atsargin÷s maisto medžiagos, celiulioz÷, chitinas, bakterijų sienelių peptidoglikanai yra struktūriniai elementai, glikozaminoglikanai, proteoglikanai sudaro ekstraląstelinį matriksą, atlieka apsauginę funkciją.

4.4.1 Krakmolas Vienas iš svarbiausių homopolisacharidų, kuriuos žmogus gauna su maistu yra

krakmolas, sudarytas iš gliukoz÷s molekulių. Krakmolas yra mišinys dviejų polisacharidų - amiloz÷s ir amilopektino. Amiloz÷ krakmole sudaro 10-30%, o amilopektinas 90-70%. Amiloz÷ yra linijinis polisacharidas, kuriame gliukoz÷s molekul÷s yra sujungtos α−(1→4)-glikozidiniu ryšiu. Polisasacharidin÷s grandin÷s ilgis būna nuo 100 iki 1000 D-gliukoz÷s molekulių liekanų. Amiloz÷ blogai tirpsta vandenyje sudaro miceles, kuriose amiloz÷ susisuka į spiralę, kuri stabilizuojama vandenilinių ryšių tarp hidroksigrupių. Viename žingsnyje yra šešios gliukoz÷s molekul÷s. Paveikus krakmolą jodu, jis patenka į amiloz÷s spiral÷s vidų ir sudaro m÷lynos spalvos kompleksinį junginį.

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

HOCH2OH

HH

H

OH

OH

H

H

O O

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

H

OO

Amiloz÷

1 4

α

Amilopektino molekul÷ yra šakota, joje be α−(1→4)-glikozidinių ryšių susidaro

α−(1→6)-glikozidiniai ryšiai. Atsišakojimai sutinkami kas 20-30 gliukoz÷s molekulių liekanų. Amilopektino molekul÷se gliukoz÷s skaičius yra labai įvairus ir molekulin÷ mas÷ siekia iki 100 milijonų Da. Krakmolas ląstel÷se saugomas plastidžių stromoje grūdelių pavidalu.

161

161

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

H

OO

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

HOH

H

H

OH

OH

H

H

O O

CH2

O

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

H

O

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

H

O

1

6

α−(1 6)

α−(1 4) Amilopektinas

Žmogaus organizme krakmolas skaidomas, veikiant amilazei ir hidrolizuojančiam α−(1→6)-glikozidinius ryšius fermentui (gen÷jimo fermentas). Amilaz÷s yra grup÷ hidrolazių, kurios hidrolizuoja α−(1→4)-glikozidinius ryšius oligosachariduose ar polisachariduose - krakmole, glikogene, dekstrinuose. α ir γ amilaz÷s randamos gyvūnuose (α amilaz÷ seil÷se ir kasoje, γ - kepenyse) ir augaluose. β amilaz÷ randama tiktai augalų s÷klose. α amilaz÷ yra endoglikozidaz÷ (skaido glikozidinius ryšius viduje molekul÷s), o β ir γ amilaz÷s yra egzoglikozidaz÷s. α amilaz÷s poveikyje susidaro dekstrinai, kurie toliau skaidomi į maltozę, gliukozę ir šakotus oligosacharidus. β ir α amilaz÷s atskelia gliukozę nuo neredukuojančio galo. β amilaz÷s poveikyje susidaro maltoz÷, o γ amilaz÷ atskelia gliukozę. Nepilnos krakmolo hidroliz÷s metu gaunamas įvairių dekstrinų mišinys.

4.4.2 Glikogenas Randamas gyvulių organizmuose ir yra pagrindin÷ gliukoz÷s saugojimo forma. Pagal savo

struktūrą jis panašus į amilopektiną, tiktai jo šakotumas yra didesnis. α−(1→6)-glikozidiniai ryšiai susidaro kas 8-12 gliukoz÷s molekulių, be to atšakose yra mažiau gliukoz÷s molekulių. Molekulin÷ mas÷ siekia keletą milijonų Da. Glikogeno molekul÷je yra vienas redukuojantis galas ir daug neredukuojančių. Glikogeno gausu kepenyse ir raumenyse žinduoliuose jis gali sudaryti 10% kepenų ir 2% raumenų mas÷s. Kai organizmui reikia papildomos energijos, nuo šakotos glikogeno molekul÷s vienu metu gali būti atskeliama daug gliukoz÷s molekulių, kurios yra greitai oksiduojamos. 4.4.3 Celiulioz÷

Augaluose plačiai sutinkamas gliukoz÷s polimeras celiulioz÷. Celiulioz÷ yra gausiausia biosferoje sutinkama organin÷ medžiaga. Jos daug medienoje ir ypač medviln÷je. Ji yra augalinių ląstelių sienelių pagrindas. Celiulioz÷ yra linijinis biopolimeras sudarytas iš gliukoz÷s molekulių (į celiuliozę įeina 10000 – 15000 D-gliukoz÷s vienetų) sujungtų β−(1→4)-glikozidiniais ryšiais. Ištemptos, k÷d÷s formos gliukoz÷s molekul÷s sudaro linijines struktūras. Lygiagrečiai išsid÷sčiusios polisacharidin÷s grandin÷s tarpusavyje susijungia vandeniliniais ryšiais. Ši struktūra panaši į šilko baltymo fibroino β-struktūrą, celiulioz÷s fibril÷s yra mechaniškai patvarios, atsparios tempimui. Medviln÷ yra praktiškai gryna celiulioz÷, medienoje celiulioz÷ sudaro per 50% .

162

162

OCH2OH

HH

H

OH

OH

HO

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

HOO O

1 4

β

Celiulioz÷

Žmogaus organizmas neturi fermento celiuliaz÷s, kuri skaido β−(1→4)-glikozidinius ryšius, tod÷l negali panaudoti celiulioz÷s maistui. Atrajojančių gyvūnai virškinimo trakte yra celiuliazę produkuojančios bakterijos, kurios hidrolizuoja celiuliozę ir organizmas panaudoja susidariusią gliukozę. Termitai gyvena simbioz÷je su mikroorganizmais Trichonympha, kurie išskiria į termitų virškinamąjį traktą celiuliazę, tod÷l maistui vartoja medieną. Dauguma grybų į aplinką išskiria celiuliazes ir jie gali gyventi ant medžių ir panaudoti celiuliozę kaip anglies šaltinį.

4.4.4 Kiti polisacharidai Hemiceliulioz÷s. Tai yra augalų ląstel÷s sienel÷je esančių didel÷s molekulin÷s mas÷s

polisacharidų mišinys. Polisacharidin÷s grandin÷s gali būti ksilanai, gliukomananai, galaktanai. Jų sud÷tyje gali būti urono rūgštys, angliavandeniai gali būti acetilinti.

Dekstranai. Miel÷se ir bakterijose sintetinami dekstranai, t.y. šakoti polimerai, sudaryti iš gliukoz÷s molekulių sujungtų α−(1→6)-glikozidiniais ryšiais. Atsišakojimo vietose sutinkamos – α−(1→2), α−(1→3), α−(1→4)-glikozidiniais ryšiais prijungti oligosacharidai. Dekstranų grandin÷s skersiniais ryšiais sujungtos epichlorhidrinu ir sudaro por÷tas struktūras, plačiai naudojami kolon÷lių chromatografijoje Sephadex ir Bio-gel pavadinimais.

Chitinas. Į vabzdžių, v÷žiagyvių, vorų egzoskeletą, grybų ląstelių sienelę įeina polisacharidas chitinas, kuris sudarytas iš N-acetilgliukozamino sujungto β−(1→4)-glikozidiniais ryšiais. Kaip ir celiulioz÷ chitino molekul÷s sudaro ištempto kaspino struktūras. Jeigu celiulioz÷s polisacharidin÷s grandin÷s yra išsid÷sčiusios lygiagrečiai viena kryptimi, tai chitino atveju jos gali būti ir priešingų krypčių. N-acetilgliukozamino molekul÷s, esančios atskirose polisacharidin÷se grandin÷se, tarpusavyje sudaro vandenilinius ryšius, kurie ir suteikia chitino molekulei didelį mechaninį atsparumą. Chitinas sudaro matriksą ant kurio vyksta mineralizacija, tai suteikia papildomą atsparumą.

OCH2OH

HH

H

OH

NH

H

OO

OCH2OH

HH

H

OH

NH

HO

C O

CH3

C O

CH3

C O

CH3

OCH2OH

HH

H

OH

NH

HO1 4

β

Chitinas

163

163

Alginatai. Polisacharidai išskiriami iš rudųjų jūros dumblių gerai suriša metalų jonus, ypatingai kalcį. Juose β-D-manurono arba α−L-gulurono rūgštys yra sujungtos (1→4)-glikozidiniais ryšiais.

Agaras. Labai svarbus polisacharidų mišinys išskirtas iš jūros raudonųjų dumblių yra agaras (agar agaras), sudarytas iš agaroz÷s ir agaropektino. Agaroz÷ yra linijinis polimeras sudarytas iš D-galaktoz÷s ir 3,6-anhidro-L-galaktoz÷s, sujungtų β−(1→4) ryšiu. Agaropektinas yra šakota molekul÷. Agaropektinas išskirtas iš įvairių dumblių gali tur÷ti prijungtą piruvatą, L-arabinozę, D-gliukuronatą. Agaro molekul÷je heteropolisacharidai dažnai yra sulfatuoti. Agaroz÷ sudaro dvigubą spiralę, kurios centrin÷ ertm÷ užpildyta vandeniu. Agaroz÷ ir agaropektinas vandenyje yra labai stipriai hidratuoti g÷liai. Chemiškai apdorota agaroz÷ praranda daugumą neigiamų krūvių ir yra naudojama makromolekulių dažniausiai DNR gryninimui komerciniu Sepharoz÷s pavadinimu. Agaras sudaro g÷lius ir naudojamas mikrobiologijoje, farmacijoje, maisto pramon÷je.

OCH2OH

OH

H

O

OH

O

O

O

OOH

n

CH2

Agaroz÷

3

6β

4

1

Pektinai. Sutinkami augaluose ir dumbliuose. Į polimero sud÷tį įeina D-galakturono

rūgšties liekanos sujungtos β−(1→4)-glikozidiniais ryšiais. Karboksigrup÷s gali būti metilintos. Tirpūs pektinai randami augalų sultyse, netirpūs sudaro tarpląstelines medžiagas. Kadangi pektinai turi daug hidroksigrupių, gali surišti vandenį ir sudaro g÷lius, panaudojami maisto,

farmacijos pramon÷je.

O

OH

OH

COO

O

O

OH

COO

O

OH

n

O

Pektinas

α α1 4

-

-

Inulinas. Didel÷s molekulin÷s mas÷s augalų rezervinis polisacharidas. Sudarytas iš 20-30

fruktofuranoz÷s liekanų, sujungtų β−(1→2)-glikozidiniais ryšiais. Vartojamas kaip maistas diabetikams.

4.5 Glikozaminoglikanai

Glikozaminoglikanai anksčiau buvo vadinami mukopolisacharidais. Tai yra šeima linijini ų polimerų, sudarytų iš pasikartojančių disacharidų. Vienas iš disacharido komponentų yra aminosacharidas - gliukozaminas arba galaktozaminas. Aminosacharidas gali būti acetilintas - N-acetilgliukozaminas arba N-acetilgalaktozaminas. Kitas komponentas daugumoje yra urono rūgštis. Dažniausiai sutinkama L-gliukurono ar L-idurono rūgštys. Kai kuriuose glikozaminoglikanuose prie vienos ar kelių hidroksigrupių esteriniu ryšiu yra prijungtos sieros

164

164

rūgšties molekul÷s. Karboksi- ir sulfogrup÷s suteikia molekulei neigiamą krūvį. Glikozaminoglikanų molekul÷s yra plonos, ištemptos formos, jų tirpalai pasižymi dideliu klampumu. Glikozaminoglikanai yra jungiamojo audinio ekstraląsteliniame matrikse, kuriame įterptos kolageno ir elastino skaidulos. Užląstelinis užpildas palaiko ląsteles viena šalia kitos ir sudaro poringą medžiagą, kuria deguonis ir maisto medžiagos difunduoja prie atskirų ląstelių. Glikozaminoglikanai prijungti prie baltymų sudaro proteoglikanus.

Hialurono r ūgštis sudaro gyvulinių ląstelių užląstelinį matriksą. Ji turi pasikartojančius, β−(1→3)-glikozidiniu ryšiu sujungtus dimerus. Dimerą sudaro β−(1→4)-glikozidiniu ryšiu sujungtos D-gliukuronato ir N-acetil-D-gliukozamino molekul÷s (pav. 4.12 a). Į hialurono rūgšties sud÷tį gali įeiti iki 50000 disacharido molekulių, molekulin÷ mas÷ viršija 1*106 Da. Molekul÷s turi daug anijoninių grupių, molekul÷ yra stipriai hidratuota ir sudaro klampius, skaidrius tirpalus. Ši medžiaga įeina į akies stiklakūnį, sinovialinį skystį, sausgysles, yra labai svarbi sąnarių tepamoji medžiaga. Ji randama kai kurias patogenines bakterijas gaubiančiose kapsul÷se. Hialurono rūgštį skaidantis fermentas hialuronidaz÷ randama bakterijose, daugelyje gyvūnų audinių, gyvat÷s ir vabzdžių toksinuose, jis palengvina bakterijų patekimą į ląstelę.

Heparinas yra viena iš didžiausią neigiamą krūvį turinčių molekulių. Susideda iš α(1→4)-glikozidiniu ryšiu sujungtų D-gliukuronato sulfato arba L-iduronato sulfato ir N-sulfo-D-glukozamino sulfato. Skirtingai nuo kitų glikozaminoglikanų, heparine sacharidai sujungti α−glikozidiniais ryšiais (4.12 b pav.) Vienam disacharidui tenka apie 2,5 sulfato liekanų. Jis elektrostatine sąveika jungiasi su antitrombinu III ir stabdo kraujo kreš÷jimą. Heparinas plačiai naudojamas medicinoje kaip agentas mažinantis kraujo kreš÷jimą. Heparansulfatai turi panašius kaip heparine pasikartojančius disacharidus, tačiau daugiau acetilintas ir turi mažiau N-sulfo grupių. Jo gausu kraujagyslių, smegenų ląstelių sienelių paviršiuje.

Chondroitinsulfatai tai yra polisacharidai sudaryti iš 30-50 disacharidų sujungtų β−(1→4)-glikozidiniu ryšiu. Disacharide D-gliukuronatas ir N-acetil-D-galaktozamino–4-sulfatas arba N-acetil-D-galaktozamino 6-sulfatas sujungti β−(1→3)-glikozidiniu ryšiu (pav. 4.12 c). Jie yra vieni iš gausiausiai sutinkamų glikozaminoglikanų. Įeina į sausgysles, kremzles bei kitus jungiamuosius audinius.

Keratansulfatai turi β−(1→4)-glikozidiniu ryšiu sujungtus D-galaktozę ir N-acetil-D-gliukozamino 6-sulfato liekanas. Juose n÷ra urono rūgščių. Sulfato kiekis varijuoja, sulfogrup÷ gali būti prijungta ir prie galaktoz÷s. Disacharidai, kurių skaičius siekia 25, jungiasi β−(1→3)-glikozidiniu ryšiu (pav 4.12 d). Randami sausgysl÷se, kremzl÷se bei kituose jungiamuosiuose audiniuose.

Dermatansulfato molekul÷je L-iduronatas ir N-acetil-D-galaktozamino-4-sulfatas surišti β−(1→3)-glikozidiniu ryšiu (pav. 4.12 e). Svarbus užląstelinio odos matrikso komponentas.

165

165

OH

H

OH

OH

H

COO

OCH2OH

H

H

H

NHCOCH3-

O

-

OOH

H

n

D-gliukuronatas N-acetil-D-glukozaminas

ββ

Hialuronatas

1

3

4 1 (a)O

OCOO

HH

H

OH

OSO3

H

H

OO

OCH2OSO3

HH

H

OH H

H

NHSO3

O-

- -

- n

D-gliukuronato2-sulfatas

N-sulfo-D-gliukoz-amino-6-sulfatas

αα

Heparinas

1 4 (b)

OCOO

HH

H

OH

OH

H

OCH2OSO3

HOH

H

H

NHCOCH3-

OO

n

- -

O

D-gliukuronatas N-acetil-D-galaktoz-amino-6-sulfatas

β β

Chondroitin-6-sulfatas

1

3

4(c)

166

166

-

OCH2OH

HOH

H OH

H

OCH2OSO3

HH

H

OH H

NHCOCH3

O

-

O

n

O

D-Galaktoz÷ N-Acetil-D-gliukoz- amino-6-sulfatas

ββ

Keratansulfatas

1 4 1

3

(d)

OH

cooH

H

OH

OH

H

OCH2OH

H

H

H

NHCOCH3

-

-

-O

O3SO

O

n

O

L-Iduronatas N-Acetil-D-galaktoz- amino-4-sulfatas

β β

Dermatansulfatas

1 4

3

1(e)

4.12 pav. Glikozaminoglikanų pasikartojančių disacharidų struktūra 4.6 Proteoglikanai

Tai didel÷s molekulin÷s mas÷s ląstel÷s paviršiaus ir užląstelinio matrikso polianijonai, kuriose prie baltymo molekul÷s kovalentiniu ryšiu prijungti glikozaminoglikanai. Angliavandeniai sudaro iki 95% proteoglikanų mas÷s. Glikozaminoglikanų karboksi- ir sulfogrup÷s suteikia molekulei didelį neigiamą krūvį, tod÷l molekul÷s prijungia daug vandens ir proteoglikanų tirpalai yra klampūs ir elastingi, atsparūs spaudimui. Proteoglikanuose glikozaminoglikanas dažniausiai O-glikozidiniu ryšiu prijungtas prie baltymo serino aminorūgšties hidroksigrup÷s. Proteoglikanuose taip pat gali būti O- ir N-ryšiu prijungti kiti oligosacharidai.

Proteoglikanai yra įvairios molekulin÷s mas÷s junginiai, jie išsid÷sto įvairiose ląstel÷s vietose. Tokie proteoglikanai kaip serglicinas, versikanas, ar kremzlių matrikso proteoglikanas tirpūs vandenyje ir sutinkami užląsteliniame užpilde. Sindekanas yra integralusis transmembraninis baltymas (4.13 pav.).

167

167

.

4.13 pav. Sindekanas, membraninis proteoglikanai Jis gali sąveikauti su įvairių molekulių tiek oligosacharidiniais tiek baltyminiais

komponentais. Pavyzdžiui sindekanas ląstel÷s viduje susiriša su citoskeleto baltymu aktinu. Išor÷je jis susiriša su fibronektinu, užląsteliniu baltymu, kuris savo ruožtu jungiasi su įvairiais ląstel÷s paviršiaus komponentais. Tokiu būdu proteoglikanas palengvina užląstelinių komponentų susirišimą. Padeda prie matrikso ir ląstel÷s paviršiaus prisijungti augimo faktoriams ir kitoms tirpioms molekul÷ms.

Proteoglikanai gali reguliuoti. augimo procesus. Proteoglikanai ir glikozaminoglikanai jungiasi prie fibroblastų augimo faktorių ir apsaugo juos nuo degradacijos bei prailgina jų aktyvumą.

Vienas iš geriausiai ištirtų yra kremzlių proteoglikanas, kuris padaro kremzles lanksčias ir elastingas. Šis kompleksinis makromolekulinis agregatas turi charakteringą šepečio formą. Hialurono rūgšties molekul÷s yra surištos su proteoglikano molekul÷mis.

168

168

Hialurono rūgštis

Surišimo baltymas

N-ryšiu prijungtioligosacharidai

O-ryšiu prijungtioligosacharidai

Keratansulfatas

Chondroitinsulfatas

Šerdies baltymas

4.14 pav. Kremzl÷s proteoglikano struktūros modelis Centrinę molekul÷s giją sudaro hialurono rūgštis, prie kurios nekovalentiniu ryšiu per

specialų surišimo baltymą prisijungia šerdies baltymai. Šerdies baltymo N gale yra nedidelis kiekis angliavandenių, kurie per serino molekulę prie baltymo prisijungia O-ryšiu ir per asparaginą N-ryšiu. Kitoje dalyje prie šerdies O-ryšiu per trumpus oligosacharidinius inkarus, jungiasi keratansulfato grandin÷s (apie 50molekulių) . Trečią sritį sudaro prie baltymo prisijungusios chondroitinsulfato (~100) molekul÷s Hialurono rūgšties molekul÷s ilgis varijuoja nuo 400 iki 4000nm ir gali sujungti 100 ir daugiau proteoglikano molekulių. Kremzlių proteoglikanų agregatai yra didel÷s molekulin÷s mas÷s Mm >2*108 Da)

Kremzl÷se prie kolageno molekulių tinklo prisijungia proteoglikanai. Tąsumą suteikia kolagenas, o charakteringas kremzlių stangrumą apsprendžia proteoglikanai. Kada kremzl÷s yra suspaudžiamos (einat ar b÷gant) vanduo yra išstumiamas iš proteoglikano molekul÷s. Neigiami krūviai neleidžia kremzliniam audiniui per daug susispausti. Vanduo reabsorbuojamas ramyb÷s būvyje. Ši grįžtama hidratacija suteikia kremzl÷ms elastingumą.

4.7 Glikoproteinai.

Beveik visi sekretuojami ar susirišę su ląstel÷s išorine membrana eukariotų baltymai yra glikozilinti. Glikoproteinai, yra baltymai, prie kurių kovalentiškai prijungtos viena ar kelios oligosacharidin÷s grupes. Jie randami plazmin÷s membranos išorin÷je pus÷je, ekstraląsteliniame matrikse, kraujyje. Viduje ląstel÷s jie sutinkami endoplazminiame tinkle, Goldžio aparate, sekretorin÷se granul÷se, lizosomose. Glikoproteinuose angliavandenių kiekis įvairus. Imunoglobulinuose IgG jų yra nedaug (4%), tuo tarpu eritrocitų membranoje esantis glikoforinas turi per 60% angliavandenių. Sacharidai gali tolygiai išsid÷styti polipeptidin÷je grandin÷je, arba koncentruotis tam tikrose srityse. Eritrocitų baltymo glikoforino molekul÷je 16 oligosacharidinių grandinių prisijungę prie N-galo, nukreipto į eritrocitų išorę. Glikoproteinams priklauso daugelis kraujo plazmos baltymų, fermentai, hormonai, membraniniai receptoriai, pernašos baltymai,

169

169

imunoglobulinai. Dauguma sekretuojamų ir membraninių baltymų yra glikoproteinai. Glikoproteinų, esančių plazmin÷je membranoje, oligosacharidin÷ dalis nukreipta į membranos išorę. Glikoproteinai labai svarbūs ląstelių tarpusavio atpažinimo procesuose, sudarant tarpląstelinius kontaktus. Normalios ir navikin÷s ląstel÷s skiriasi savo paviršiniais glikoproteinais. Jos skirtingai susiriša su lektinais. Normalių ląstelių augimas sustoja kai viena ląstel÷ paliečia kitą. Navikin÷se ląstel÷se tokios kontrol÷s n÷ra. Bakterijos per savo baltymus adhezinus prisijungia prie infekuojamos ląstel÷s paviršiuje esančių glikoproteininių receptorių ir tai yra pirminis infekcijos etapas.

Glikozilinimas keičia baltymo chemines ir fizines savybes. Angliavandeniai stabilizuoja baltymo konformaciją, didina baltymo tirpumą, apsaugo nuo proteoliz÷s. Įvairiai glikozilinti baltymai skirtingai susisuka, sudaro unikalias tretines struktūras. Eukariotuose, potransliacinis glikozilinimas Goldžio aparate, yra labai svarbus nukreipiant baltymus į jų buvimo vietas. Angliavandenių kaip molekulių žymenų vaidmenį geriausiai charakterizuoja lizosomin÷s peptidaz÷s. Šie fermentai sintezuojami endoplazminiame tinkle, pernešami į Goldžio aparatą, kur jie modifikuojami prijungiant manoz÷s-6-fosfatą. Taip pažym÷ti baltymai patenka į lizosomas, tuo tarpu kai kiti glikoproteinai sekretuojami už ląstel÷s ribų arba įjungiami į išorinę membraną. Oligosacharidai vaidina labai svarbų vaidmenį baltymų degradacijoje. Pašalinus kraujo plazmos glikoproteinuose sialo rūgštis, pagreit÷ja šių baltymų pašalinimas iš kraujo. Tokie glikoproteinai yra atpažįstami receptorių, patenka į kepenis ir degraduojami, tokiu būdu reguliuojama glikoproteinų gyvenimo trukm÷.

Oligosacharidin÷je grandin÷je gali būti įvairūs monosacharidai. Eukariotų glikoproteinuose dažniausiai pasitaiko aštuoni angliavandeniai: heksoz÷s - L-fukoz÷, D-galaktoz÷, D-gliukoz÷ ir D-manoz÷; aminosacharidai – N-acetil-galaktozaminas, N-acetilgliukozaminas, sialo rūgštis (dažniausiai N-acetilneuramino rūgštis) ir pentoz÷ D-ksiloz÷. Šie angliavandeniai jungiasi α - arba β-glikozidiniais ryšiais. Ryšiai jungia įvairius anglies atomus. Heksoz÷se ir heksoz÷s aminuose glikozidiniu ryšio sudaryme dalyvauja C-1, kuris jungiasi su kitos heksoz÷s C-2, C-3, C-4 ar C-6 bei aminosacharido C-3, C-4 ar C-6 anglies atomais. Sialo rūgštyje ryšį sudaro C-2 atomas.

Angliavandeniai prie polipeptidin÷s grandin÷s prijungiami dviem pagrindiniais būdais, susidarant O-glikozidiniam ryšiui su Ser arba Thr hidroksigrupe (O-ryšys) arba prijungiant glikaną N-glikozidiniu ryšiu prie asparagino amidinio azoto (N-ryšys). Kai kuriuose glikoproteinuose baltymas prijungtas prie etanolamino, kuris surištas su šakotu oligosacharidu ir prie jo prijungtu lipidu.

O-ryšys. O-ryšiu prijungtuose angliavandeniuose ryšys dažniausiai susidaro tarp N-acetilgalaktozamino ir baltymo serino ar treonino aminorūgščių hidroksigrup÷s. Prie GalNAc gali būti prijungti kiti sacharidai – galaktoz÷, ksiloz÷, sialo rūgštys. Kolageno molekul÷je su galaktoze jungiasi hidroksiprolino ar hidroksilizino hidroksigrup÷.

NH-CO-CH3

OCH2OH

OH

OHH

H

HH

N-acetilgalaktozilserinas

O CH2

CH

CO

NH

170

170

O-ryšiu sujungti sacharidai sudaro per 80% mucinų mas÷s. Mucinai , yra labai ilgi (150-200 nm ilgio) ir dideli (~107 Da) gleivių glikoproteinai. Jų sud÷tyje daug sialo rūgščių, angliavandeniai yra dažnai sulfatuoti. Sacharidai išsid÷sto netolygiai, o tam tikrose klasteriuose. Dideli neigiamai įkrautų angliavandenių kiekiai ir aminorūgšties prolino suardo tretinę baltymų struktūrą ir molekul÷ įgauna ištemptą formą. Jie sudaro klampias tinklines struktūras, apsaugančias kv÷pavimo ir virškinimo traktuose epitelinių ląstelių membranas nuo įvairių cheminių ir mechaninių pažeidimų. Kai kurie virusų glikoproteinai taip pat turi O-ryšiu prijungtus oligosacharidus. Dauguma, ląstel÷s paviršiuje esančių, receptorių turi O-ryšiu prijungtus oligosacharidus.

Įdomi O-jungtimi sujungtų glikoproteinų šeima leidžia žuvims gyventi Arkties ir Antarktidos jūrų regionuose, kur vandens temperatūra siekia -1,90C. Šių žuvų kraujyje randamas antifrizinis baltymas. Šis glikoproteinas turi peptidą, kurio struktūra (Ala-Ala-Thr)n-Ala-Ala, kur n=4,5,6,12,17,18,35,45,50). Prie kiekvieno treonino prijungtas disacharidas β-galaktozil-(1→3)-α-N-acetilgalaktozaminas. Šis antifrizinis glikoproteinas neleidžia susidaryti ledo kristaliukams.

N-ryšys. Susidaro prie asparagino molekul÷s amidinio azoto β-N-glikozidiniu ryšiu prijungus N-acetilgliukozaminą (NAG) ir kartais N-acetilgalaktozaminą.. Nustatyta, kad Asn yra polipeptidin÷s grandin÷s sekoje Asn-X-Ser ar Asn-X-Thr, kur X bet kuri aminorūgštis, išskyrus Pro ar Asp.

NH-CO-CH3

OCH2OH

OH

NH-CO-CH2-CH

OH

H

H

H

H

N-Acetilgliukozaminas

(Asn)

CO

NH

N-ryšiu susijungę oligosacharidai sutinkami daugelyje baltymų – IgG, IgM ribonukleaz÷je

B, ovalbumine ir kituose. N-ryšiu sujungtų glikoproteinus galima suskirstyti į 3 klases: a) turinčius didelį manoz÷s kiekį, b) kompleksinius c) hibridinius. N-sujungti glikoproteinai turi unikalią šerdies struktūrą, kur prie asparagino yra prijungtos

dvi N-acetilgliukozamino liekanos, savo ruožtu sujungtos su manoz÷s liekanų triada (pav. 4.15) . Kiti angliavandeniai yra prijungiami prie manoz÷s liekanų. Tai rodo vienodus pradinius sintez÷s etapus. N-sujungtų oligosacharidų sintez÷ prasideda nuo susidarymo oligosacharidų sudarytų iš 14 monosacharidų (iš jų 9 yra manoz÷s), kurie prijungti prie lipido dolicholio. Tolimesn÷se biosintez÷s stadijose oligosacharidas pernešamas ant naujai sintetinamo baltymo asparagino rūgšties. Veikiant glikozidaz÷ms kai kurios manoz÷s molekul÷s pašalinamos ir vietoje jų prijungiamos fukoz÷, galaktoz÷, GlcNAc, sialo rūgštys. Fermentai prijungiantis sacharidus (transferaz÷s) ir atskeliantys (glikozidaz÷s) yra endoplazminiame tinkle ir Goldžio aparate.

171

171

OCH2OH

OHOH OH

O

HH

H H

O

CH2

O

OH

OCH2OH

OHOH OH

HH

H H

H

HO

OCH2OH

OH

NH-CO-CH3H

HO

OCH2OH

OH

NH-CO-CH3

NH-CO-CH2-CH(Asn)

H

H

H

O

Man

Man Man GlcNAc GlcNAc

α

α

β β

1,3

1,6

1,4 1,4

4.15 pav. N-ry6ius sujungtų glikoproteinų šerdis.

Šie fragmentai randami kraujo serumo glikoproteinuose, imunoglobulinuose.

-CO-NH-CH-CO-NH

CH2

CO

NH

GalNAc

GlcNAc

Man Man

Man

-CO-NH-CH-CO-NH

CH2

CO

NH

GalNAc

Man Man

Man

Man

Man Man

NANR

Gal

GalNAc

L-Fuc

NANR

Gal

GalNAc

GalNAcGalNAc

Asn Asn

NANR

Gal

GlcNAc

NANR

Gal

Žmogaus IgG

GlcNAc

NANR

Gal

Serumo glikoproteinai

4.16 pav. N-ryšiu sujungtų glikoproteinų oligosacharidin÷s grandin÷s. 4.8 Peptidoglikanai

Gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų, dumblių ląstelių sienel÷s turi tvirtą peptido-polisacharido sluoksnį vadinama peptidoglikanu arba mureinu (lot. Murus - siena). Jis sudaro bakterijų sienelę, kuri suteikia ląstelei formą, o jai patekus į hipotoninį tirpalą apsaugo nuo

172

172

osmotinio šoko. Peptidoglikaną sudaro linijinis polimeras heteropolisacharidas muraminas sudarytas iš sujungtų β−(1→4)-glikozidiniu ryšiu N-acetilgliukozamino (NAG) ir N-acetilmuramo (NAM) rūgšties. Linijinius polimerus kovalentiškai sujungia trumpi oligopeptidai. Savita peptidoglikano struktūra priklauso nuo bakterijų rūšies.

OCH2OH

HH

H NHCOCH3

H

CH-CH3

CO

OCH2OH

HH

H NHCOCH3

HOH

OH

n

NH

OO O

CH

CO

CH3

NH

CH

CH2

COO-

CH2

CO

NH

CH

CO

(CH2)4-NH3

L-Ala

D-Izoglutamatas

+

NH

CH

COO-

CH3D-Ala

L-Lys

NAG NAM

4.17 pav. Peptidoglikano struktūra Bakterijose Staphylococus aureus prie muramino yra prijungtas tetrapeptidas L-Ala-D-

IzoGlu-L-Lys-D-Ala. L-alanino amino grup÷ amidiniu ryšiu sujungta su NAM pieno rūgšties karboksigrupe. Izoglutamatas (IzoGlu) yra glutamo rūgšties forma, kai peptidinį ryšį tarp glutamato ir lizino sudaro γ o ne α karboksigrup÷. Įvairiose bakterijose gali būti skirtingas aminorūgščių sąstatas, tačiau visada randamos ir D- ir L- aminorūgštys. Susidarant kovalentiniams ryšiams tarp gretimų tetrapeptidų gaunama tvirta tinklin÷ struktūrą.

173

173

CH-CH3

CO

(Gly)5

Gramteigiamos

GramneigiamosC

O Ala

IzoGlu

Lys

Ala

Ala

Glu

Lys

Ala

C

O

Ala

Glu

Lys

Ala

-(NAG-NAM)n-

-(NAG-NAM) n-

-(NAG-NAM)n-

4.18 pav. Gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų peptidoglikanas

Gramneigiamose bakterijose lizino ε-aminogrup÷ tiesiogiai jungiasi su gretimo tetrapeptido D-alanino -COOH grupe. Gramteigiamose bakterijose vieno tetrapeptido aminorūgšties L-liziną ir kito tetrapeptido D-alaniną sujungia peptidas, susidedantis iš penkių glicino molekulių. Tokie tarpusavio ryšiai suformuoja labai didelę ir tvirtą makromolekulę, kuri sąlygoja ląstel÷s sienel÷s mechaninį patvarumą. D-aminorūgščių buvimas suteikia atsparumą peptidaz÷ms. Gramneigiamų bakterijų vidinę membraną gaubia plonas peptidoglikano sluoksnis. Tuo tarpų gramteigiamos bakterijos neturi išorin÷s membranos, o sienel÷ yra stora (apie 25nm) sudaryta iš kelių peptidoglikano sluoksnių. Jų paviršių dengia teichoinin÷s rūgšties molekul÷s. Teichoin÷ rūgštis yra polimeras, kuriame glicerolis arba ribitolis sujungti fosfato tilteliais. Prie jų yra prijungti D-alaninas ir N-acetilgliukozaminas (NAG) (4.19 pav.).

P

O

O O

O

CH2

CH

CH2

P

O

O O

O

CH2

CH

CH2

O

P

O

O O

OCH2OH

HH

OHH

OH

NHCOCO3

HO

H

NH3 C C

H

CH3

O

O+

NAG

D-Ala-

-

-

174

174

4.19 pav. Teichoin÷s rūgšties fragmentas, prie glicerolio fosfato karkaso prijungtas D-Ala ir NAG.

Fermentas lizocimas, esantis ašarose, gleiv÷se, kiaušinio baltyme, bakteriofaguose katalizuoja β−(1→4)-glikozidinio ryšio tarp NAG ir NAM hidrolizę ir bakterijų lizę. Lizocimą 1922m. atrado anglų bakteriologas Flemingas (A.Fleming). Jis taip pat pasteb÷jo, kad pel÷siai Penicillium notatum lizuoja gretimai esančias bakterijas. Buvo nustatyta, kad jie sekretuoja antibiotiką peniciliną. Penicilinas specifiškai susijungia su transpeptidaze ir stabdo gretimų tetrapeptidų surišimą. Paveikus antibiotiku sustoja bakterijų augimas. Penicilinas selektyviai toksiškas bakterijoms ir neveikia eukariotų. Atsparios penicilinui bakterijos, sintetina fermentą penicilazę, suardančią β-laktaminio žiedo amidinį ryšį, susidariusi penicilinoin÷ rūgštis yra neaktyvi. Chemin÷s sintez÷s keliu yra gaunami įvairūs penicilino dariniai, kurie atsparūs penicilazei. Benzilpeniciline R yra benzilo grup÷, o ampiciline –aminobenzilo grup÷.

N

S

CH3

COO

CH3

O

NH

CO

R

NH

S

CH3

COO

CH3

NH

CO

R

C

O

O-

C

HC

-

Penicilinas

penicilaz÷ HC

-

Penicilinoin÷ rūgštis 4.20 pav. Penicilaz÷s poveikis

4.9 Ląstelių paviršiaus sacharidai

Įvairios ląstel÷s savo paviršiuje prie baltymų arba lipidų turi prijungtus sacharidus, kurie yra šių ląstelių žymenys. Tokie pažym÷ti ląstelių paviršiniai sacharidai specifiškai sąveikauja su kitomis ląstel÷mis arba molekul÷mis. Organizmas gali atpažinti savo ląsteles, tuo tarpu svetimos ląstel÷s iššaukia imuninį atsaką. Kai kurios gyvūnų ląstel÷s yra padengtos storu polisacharidų sluoksniu, vadinamu glikokaliksu . Glikokalikso oligosacharidai, prijungti prie baltymų arba lipidų, sąveikauja su kitomis medžiagomis: žarnyne su bakterijomis, kituose audiniuose su tarpląstelinio matrikso kolagenu.

Oligosacharidams ir polisacharidams, kurie yra ląstelių paviršiniai žymenys, turi būti juos atpažįstantys baltymai. Viena tokių baltymų klas÷ yra imunoglobulinai. Kiti baltymai specifiškai ir tvirtai susiriša su ląstelių paviršiaus sacharidais yra lektinai. Lektinai pirmą kartą atrasti augaluose ir dalyvauja ląstelių tarpusavio sąveikos ir atpažinimo reakcijose. Lektinai dalyvauja surišant kolageną tarpląsteliniame matrikse tuo pačiu palaiko audinių ir organų struktūrą. Žarnyno bakterijų ląstelių sienelių lektinai palengvina bakterijų prisirišimą prie žarnyno epitelio glikokalikso. Išgryninti lektinai laboratorijoje naudojami glikoproteinų gryninimui ir nustatymui.

Ląstelių paviršiaus oligosacharidai svarbūs ląstel÷s-ląstel÷s sąveikoje. Žinoma, kad navikinių ląstelių paviršiaus oligosacharidai yra modifikuoti.

Kod÷l oligosacharidai dažnai yra ląstelių žymenys? Oligosacharidai, būdami neilgos grandin÷s, gali tur÷ti labai skirtingas struktūras. Jie gali būti sudaryti iš skirtingų monosacharidų (dažnai modifikuotų), gali jungtis įvairiais ryšiais, gali sudaryti šakotas struktūras. Monosacharidai jungiasi –(1→2)-, -(1→3)-, -(1→4)-, -(1→6)-, -(2→3)- ir –(2→6)-ryšiais, gali būti α arba β konfigūracijos. Oligosacharidai yra ypatingai stiprūs antigenai, tod÷l prieš juos

175

175

sintezuojami antikūnai. Manoma kad pirmi antikūnai pasigamino prieš bakterijas, kurių paviršius buvo padengtas oligosacharidais.

Gramneigiamų bakterijų E.coli ir Salmonella typhimurium paviršių dengia lipopolisacharidų sluoksnis. Jis yra pirminis antikūnų, kuriuos sintetina stuburinių imunin÷ sistema bakterin÷s infekcijos metu, šaltinis.

GlcN GlcN

Kdo-Kdo-Kdo

Hep

Hep-Hep

Glc-Gal

Gal

Glc-GlcNAc

Gal

Rha

Man-AbeOAc

Gal-Man

Rha

Man-AbeOAc

Man-AbeOAc

Rha

Gal-Glc n 10>-

Lipidas A

Šerdis

O-specifin÷grandin÷

4.21 pav. Bakterijų lipopolisacharidai Salmonella typhimurium lipopolisacharido molekul÷je galima išskirti tris dalis: lipidą A,

šerdį ir O-specifinę grandinę. Lipidą A sudaro gliukozaminas (GlcN), prie kurio prijungtos šešios riebalų rūgščių liekanos. Hidrofobin÷s angliavandenilin÷s grandin÷s įsiterpia į gramneigiamų bakterijų išorin÷s membranos dvisluoksnį, o į bakterijos išorę nukreiptas hidrofilinis oligosacharidas. Į šerdies sud÷tį įeina Kdo (2-keto-3-deoksioktanoatas), Hep (L-glicerolio D-manoheptoz÷), Glc (Gliukoz÷), Gal (Galaktoz÷), GlcNAc (N-acetilgliukozaminas). Skirtingos bakterijos turi konservatyvią šerdį ir lipidą A. O-specifin÷ sritis apsprendžia bakterijų serotipą (imunologinį reaktyvumą). Šioje dalyje sutinkama ramnoz÷ (Rha), manoz÷ (Man), gliukoz÷ (Glc), galaktoz÷ (Gal) bei 3,6-dideoksiheksoz÷ (AbeOAc), abekvoz÷, tivelioz÷. E.coli oligosacharidai yra panašūs. Kai kurių bakterijų lipopolisacharidai yra žmogui ir kitiems gyvūnams toksiški. Gramneigiamų bakterijų sienel÷s paviršiuje yra tiek daug lipopolisacharidų molekulių, kad ląstel÷s paviršius pilnai padengtas O-specifin÷mis grandin÷mis.

176

176

OC

HOH

HH

OH

H

HOH

COO

CH2OH

OH H

OCH3

HOH

HH

H

H

HOH

H OCH3

HH

OHH

H

H

OHOH

H

OC

HH

OHH

OH

H

OHOH

H

CH2OH

OH H

2-keto-3-deoksioktanoatas L-glicerolio D-manoheptoz÷ (Kdo)

Abekvoz÷ Tiveloz÷

-

4.22 pav. Gramneigiamų bakterijų O-antigenų monosacharidai.

177

177

5 . LIPIDAI Lipidais vadinamos nepolin÷s medžiagos, kurios iš organizmų ekstrahuojamos organiniais

tirpikliais tokiais kaip chloroformas, etanolis, eteris, ir kurios blogai tirpsta vandenyje. Tai yra didel÷ įvairių organinių medžiagų grup÷, besiskirianti savo struktūra, funkcijomis, chemin÷mis savyb÷mis. Riebalai, aliejai, vaškai, membranų lipidai, kai kurie vitaminai ir hormonai priklauso šiai margai junginių grupei. Gyvajame pasaulyje jie yra arba hidrofobiniai arba amfifiliniai junginiai. Lipid ų klasifikacija

Yra įvairios lipidų klasifikacijos priklausomai nuo chemin÷s sud÷ties, fizikinių, cheminių savybių. Lipidus galime suskirstyti į 3 grupes:

1) paprasti lipidai , 2) sud÷tiniai lipidai, 3) lipidų dariniai.

Paprastieji lipidai skirstomi: a) acilgliceroliai - glicerolio ir riebalų rūgščių esteriai, b) vaškai - aukštesniųjų alkoholių ir riebalų rūgščių esteriai. Sud÷tiniai lipidai skirstomi :

a)-glicerofosfolipidai - į jų sud÷tį įeina glicerolis, riebalų rūgštys, fosforo rūgštis prie kurios gali būti prijungtas pakaitas - cholinas, serinas, etanolaminas, ar kiti alkoholiai.

b) sfingolipidai - sudaryti iš aminoalkoholio sfingozino, riebalų rūgšties ir polin÷s galvos. Sfingolipidai gali būti skirstomi į:

• sfingomielinus - sudarytus iš sfingozino, riebalų rūgščių, fosforo rūgšties ir dažniausiai cholino.

• cerebrozidus - kurie yra sfingozino, riebalų rūgščių ir monosacharidų dariniai. • gangliozidus - sudarytus susijungus sfingozinui, riebalų rūgštims ir

oligosacharidui, prie kurio prijungta sialo rūgštis, suteikianti neigiamą krūvį. Lipidų dariniai. Šiai grupei priklauso

a) steroidai, b) lipid ų kilm÷s vitaminai, c) terpenai, d) eikozanoidai. Lipidus galima klasifikuoti ir pagal į jų sud÷tį įeinančias sud÷tines dalis. Lipidai, į kurių

sud÷tį įeina fosforo rūgštis vadinami fosfolipidais. Glicerofosfolipiduose alkoholis yra glicerolis, o sfingolipidų molekul÷se - sfingozinas. Glikolipid ų sud÷tyje yra angliavandeniai jie gali glikoglicerolipidai arba glikosfingolipidai (cerebrozidai, gangliozidai). Steroidų, terpenų, lipidų kilm÷s vitaminuose molekul÷s sudarytos iš izopreno, tod÷l jos vadinamos izoprenoidais. Terpenų pavadinimas naudojamas vadinti augaluose randamiems izoprenoidams.

Kitas variantas lipidų klasifikacijos /Kokia recenzentų nuomon÷, kuri geresn÷??) Lipidus galima suskirstyti į 2 grupes:

1. Lipidai, kuriuos hidrolizuojant išsiskiria riebalų rūgtis 2. Lipidai, kurie savo sud÷tyje neturi riebalų rūgšties

178

178

LIPIDAI

Turi riebalų rūgštį Neturi riebalų rūgšties

Paprastieji Sud÷tiniai

Steroidai Ekozanoidai Terpenai Vitaminai

Acilgliceroliai Vaškai Glicerofosfolipidai Sfingolipidai

Sfingomielinai Cerebrozidai Gangliozidai

Lipid ų funkcijos: • Viena svarbiausių lipidų funkcijų yra energetin÷. Oksiduojant 1g riebalų išsiskiria apie 38kJ(9

kcal) energijos, tuo tarpu oksiduojant tokį pat kiekį angliavandenių gauname 17kJ(4 kcal). Riebalų rūgščių energetin÷ vert÷ didesn÷ nei kitų medžiagų, kadangi jos yra labiau redukuotos bei mažiau hidratuotos.

• Lipidų molekul÷se yra saugoma metabolin÷ energija. Riebalai pagrindinai kaupiasi riebalinių ląstelių (adipocitų) citozolyje riebalų ląšelių pavidalu.

• Vaškai sutinkami augaluose, sudaro papildomą apsauginį sluoksnį. Bit÷s iš vaško gamina korius.

• Riebalai apsaugo organizmą nuo termininio, fizinio poveikio. • Lipidai yra svarbūs ląstel÷s struktūros palaikyme. Fosfolipidai, susijungę su baltymais sudaro

membranas, kurios apgaubia ląstelę, organeles. • Lipidai dalyvauja įvairių medžiagų pernešime organizme. Pavyzdžiui cholesterolis

acilgliceroliai, fosfolipigai po organizmą pernešami susijungęs su lipoproteinais. • Steroidų klasei priklauso cholesterolis, kuris labai svarbus membranų struktūros palaikymui, iš

jo sintetinamas vitaminas D, tulžies rūgštys, lytiniai hormonai ( estrogenas, testosteronas), adrenokortikotropiniai hormonai.

• Eikozanoidai dalyvauja kraujospūdžio reguliavime, kūno temperatūros palaikyme, lygiųjų raumenų susitraukimo žinduoliuose reguliavime.

• Terpenai, tokie kaip karotinoidai svarbūs fotosintez÷je, reg÷jimo procese. Augalų eterinių aliejų kvapas sąlygojamas terpenų. Giberelinai - augalų augimą skatinančios medžiagos taip pat yra priklauso šiai medžiagų grupei.

• Lipidai gali būti fermentų kofaktoriai, elektronų ir protonų nešikliai • Lipidiniais inkarais prie membranos yra prijungiami įvairūs baltymai • Gali būti viduląsteliniai informacijos nešikliai • Lipidai plačiai naudojami kosmetikoje, maisto pramon÷je

179

179

5.1 Riebalų rūgštys

Daugumos lipidų sud÷tyje randamos riebalų rūgštys. Riebalų rūgštys yra ilgos angliavandenilin÷s grandin÷s monokarboksirūgštys. Gamtoje aptinkama apie 100 riebalų rūgščių, turinčių 4-36 anglies atomus, jos retai būna laisvos, dažniausiai yra esterifikuotos. Bendra riebalų rūgščių formul÷ yra ši: 3 2 1 CH3-(CH2)n-CH2-CH2-COOH ω β α

Riebalų rūgščių anglies atomų numeracija pradedama nuo karboksigrup÷s anglies atomo, kuris žymimas 1. 2 ir 3 ir tt. Anglies atomai taip pat gali būti žymimi atatinkamai Graikų ab÷c÷l÷s raid÷mis α, β, γ ir t.t. α pažymimas C-2 anglies atomas. Gamtoje dažniausiai sutinkamos riebalų rūgštys, kurių molekul÷s turi lyginį anglies atomų skaičių ir molekul÷s yra nešakotos. Riebalų rūgštys gali būti sočios ir nesočios. Gali būti vienas ar keli dvigubi ryšiai. Labai svarbios organizmo vystymuisi yra polinesočios riebalų rūgštys (PUFA). Nesočiose riebalų rūgštyse dvigubi ryšiai nesudaro konjuguotos sistemos ir yra atskirtos metileno (-CH2-) grupe -CH=CH-CH2-CH=CH-. Be to nesočios riebalų rūgštys yra cis konfiguracijos. Dvigubo ryšio pad÷tis žymima simboliu ∆, skaičiais pažymint tarp kokių C atomų šis ryšys susidaro. Pavyzdžiui C18:1∆9 reiškia , kad riebalų rūgštis sudaryta iš 18 anglies atomų, turi vieną dvigubą ryšį kuris yra tarp 9 ir 10 anglies atomų. Kartais naudojama alternatyvi terminologija: omega (ω). Nesočiose riebalų rūgštyse gali būti nurodoma galutinio dvigubo ryšio buvimo vieta angliavandenilin÷je grandin÷je. Šis dvigubas ryšys dažniausiai būna 3, 6 arba 9 anglies atomai nuo grandin÷s galo. Linoleno rūgštis (C18:3∆9,12,15) yra ω−3, linolo ( C18:2∆9,12 ), arachidono (C20:4∆5,8,11,14) - ω−6 riebalų rūgštys, o oleino (C18:1∆9). - ω−9. Gamtoje sutinkamos riebalų rūgštys dažniausiai sudarytos iš 12-24 anglies atomų. Dažniausiai sutinkama gyvūnuose, augaluose ir mikroorganizmuose soti riebalų rūgštis yra palmitino (16:0). Stearino rūgštis gausiai sutinkama gyvūnuose, jos mažai yra augaluose. Plačiai paplitusi gyvajame pasaulyje yra miristo rūgštis. Oleino rūgštis (18:1) pagrindin÷ monoenin÷ rūgštis augaluose ir gyvūnuose. Linolo rūgštis (18:2) pagrindinį augalų lipidų rūgštis. Gyvūnai ją gauna tiktai su maistu. Arachidono rūgštis yra svarbi gyvūnų fosfolipidų sudedamoji dalis. 5.1 lentel÷. Pagrindin÷s riebalų rūgštys, sutinkamos gyvūnų organizmuose Anglies atomų skaičius

Dvigubų ryšių skaičius

Trivialus ir sistematinis pavadinimas (IUPAC)

Lydymosi temperatūra

Formul÷

12 0 Lauro C12:0 Dodekano

44,2 CH3(CH2)10COOH

14 0 Miristo C14:0 Tetradekano

53,9 CH3(CH2)12COOH

16 0 Palmitino C16:0 heksadekano

63,1 CH3(CH2)14COOH

18 0 Stearino C18:0 Oktadekano

69,6 CH3(CH2)16COOH

20 0 Arachido C20:0 Eikozano

76,5 CH3(CH2)18COOH

180

180

16 1 Palmitooleino C16:1∆9

9-heksadeceno

-0,5 CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH

18 1 Oleino C18:1∆9 9-oktadeceno

13,4 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH

18 2 Linolo C18:2∆9,12

9,12-oktadekadieno

-5 CH3(CH2)4(CH=CHCH2)2(CH2)6COOH

18 3 α−linoleno C18:3∆9,12,15 9,12,15-oktadekatrieno

-11 CH3CH2(CH=CHCH2)3(CH2)6COOH

18 3 γ−linoleno C18:3∆6,9,12

6,9,12-oktadekatrieno

CH3(CH2)4(CH=CHCH2)3(CH2)3COOH

20 4 Arachidono C20:4∆5,8,11,14

5,8,11,14-eiko-sotetraeno

-49,5 CH3(CH2)4(CH=CHCH2)4(CH2)2COOH

24 1 Nervono C24:1∆15

15-tetrakozeno

41 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)13COOH

Sočių riebalų rūgščių ir nesočių, turinčių trans konfiguraciją, angliavandenilin÷s grandin÷s susipakuoja kompaktiškai, sudarydamos tvarkingas ištemptas struktūras. Esant cis dvigubam ryšiui molekul÷je susidaro kinkas (lūžis) ir grandin÷s išsid÷sto netvarkingai. Riebalų rūgštys blogai tirpsta vandenyje, žinduolių organizmuose jos pernešamos susijungusios su serumo baltymais. Ilgos alkilin÷s riebalų rūgštys suteikia molekulei hidrofobinį charakterį, aišku, kad junginiai, kurių sud÷tyje yra kelios riebalų rūgščių molekul÷s bus hidrofobiniai. Lipidai netirpsta vandenyje ir riebalų rūgščių molekul÷s susijungusios sudaro membranų dvisluoksnius. Riebalų rūgščių, o taip pat junginių, į kurių sud÷tį įeina riebalų rūgštys, lydymosi temperatūra priklauso

HOOCHOOC HOOC

1110 1230 1230

cis

5.1 pav. Riebalų rūgščių angliavandenilinių grandinių konformacijos

181

181

nuo anglies atomų skaičiaus ir nuo prisotinimo laipsnio. Kambario temperatūroje, sočios riebalų rūgštys nuo C12:0 iki C24:0 yra vaško konsistencijos, tuo tarpu nesočios, turinčios tokį pat anglies atomų skaičių, yra skystos.

Riebalų rūgštys yra silpnos rūgštys, jų pK~4,5. Esant fiziologiniam pH, jos yra anijonai (RCOO-), tod÷l mes turime kalb÷ti apie stearatą ar oleatą, o ne apie stearino ar oleino rūgštis. Neigiamas karboksigrup÷s krūvis daro molekulę hidrofiline, o ilga uodega – labai hidrofobine. Riebalų rūgštys yra amfifilin÷s molekul÷s, vandens oro paviršiuje jos sudaro monosluoksknius, kur hidrofilin÷s karboksigrup÷s nukreiptos į vandenį, o hidrofobin÷s angliavandenilin÷s grandin÷s išsid÷sto ore. Purtant riebalų rūgščių tirpalą vandenyje susidaro micel÷s, kuriose riebalų rūgščių karboksigrup÷s nukreiptos į išorę, o angliavandenilin÷s grandin÷s – į vidų.

Į membranas įeinančiuose lipiduose riebalų rūgštys gali būti labai įvairios. Mikroorganizmų membranų riebalų rūgštys būna su šakota grandine, pvz. tuberkulo stearino (10-metilstearino) rūgštis, bei turinčios ciklopropano, ciklopentano ( laktobacilo, strekulo rūgštis) žiedus, hidroksiriebalų rūgštys.

CH3

CH3O

OH

O

OH

O

OH

OH H

C

Tuberkulo stearino rūgštis

C

Laktobacilo rūgštis

C

Ricinolio rūgštis (12-hidroksioleino rūgštis) Aukštesnieji gyvūnai nesintetina tokių polinesočių riebalų rūgščių kaip linolo ir α linoleno

jas organizmas turi gauti su maistu, jos vadinamos būtinosiomis. Jos turi mažiausiai vieną dvigubą ryšį esantį po C-9 anglies atomo. Daug būtinų riebalų rūgščių turi žuvys (lašiša, silk÷), gyvenančios giliuose, šaltuose vandenyse. Šiose žuvyse riebalai yra raumenyse ir odoje. Žinduolų kepenyse iš linoleno rūgšties desatūracijos ir grandin÷s ilginimo reakcijų eigoje gali būti sintezuojama γ linoleno ir arachidono rūgštys. Arachidono rūgštis yra prostaglandinų, tromboksanų, leukotrienų pirmtakas.

5.2 Paprastieji lipidai

Paprastieji lipidai skirstomi į dvi grupes: a) acilgliceroliai - sudaryti iš glicerolio ir riebalų rūgščių, b) vaškai - sudaryti iš aukštesniųjų alkoholių ir riebalų rūgščių

5.2.1 Acilgliceroliai Acilgliceroliai, nepolin÷s, hidrofobin÷s, vandenyje netirpios medžiagos dar vadinamos trigliceridai, riebalai arba neutralūs riebalai. Jie yra glicerolio ir riebalų rūgščių esteriai.

CH2O-CO-(CH2)n-CH3

CHO-CO-(CH2)n-CH3

CH2O-CO-(CH2)n-CH3

182

182

Prie glicerolio gali būti prijungta 1, 2 ir 3 riebalų rūgščių liekanos , taigi sintetinami mono-, di- ir triacilgliceroliai.

Į triacilglicerolių sud÷tį įeinančios riebalų rūgštys gali būti vienodos, pavyzdžiui tristearinas ar trioleoinas. Gamtoje dažniausiai sutinkami mišiniai, su skirtingo ilgio ir sotumo laipsnio riebalų rūgštimis. Svieste daug palmitino (C16:0), s÷menų aliejaus pagrindinę dalį sudaro linoleno (C18:3) rūgštis. Triacilglicerolių lydymosi temperatūra priklauso nuo nesočių riebalų rūgščių buvimo. Augaluose dominuoja nesočios riebalų rūgštys tod÷l triacilgliceroliai kambario temperatūroje yra skysti, ir vadinami aliejais.

Triacilgliceroliai yra efektyvi energijos saugojimo forma. Jie yra labiau redukuoti nei angliavandeniai ar baltymai. Be to jie yra mažiau hidratuoti negu glikogenas. Tod÷l tos pačios mas÷s riebalai yra beveik šešis kartus efektyvesnis energijos šaltinis nei hidratuotas glikogenas. Gyvūnuose riebalai sintezuojami ir saugomi riebalinio audinio ląstel÷se (adipocituose) riebalų lašelių pavidalu. Daugelio augalų s÷klose jie saugomi aliejaus pavidale ir riebalų oksidacijos energija panaudojama joms dygstant. Vyrų organizme apie 21% o moterų apie 26% kūno svorio sudaro riebalai, ir badaujant gali apsirūpinti energija 2-3 m÷nesiam. Glikogeno atsargų užtenka tiktai vienai parai. Riebalai yra labai svarbūs palaikant organizmo šiluminį režimą. Banginiai, ruoniai, pingvinai, žąsys turi ženklius poodinius riebalų sluoksnius. Kašalotui dideli triacilglicerolių ir vaškų kiekiai padeda keisti kūno tankį ir išlaikyti kūną įvairiame gylyje. Kupranugario kuproje sukaupti triacilgliceroliai, juos oksiduojant susidaro vanduo ir gali patenkinti organizmo poreikius vandeniui. 5.2.2 Vaškai

Vaškai yra esteriai, sudaryti iš ilgų anglies grandinių (C16 - C30) alkoholių ir riebalų rūgščių (C14 - C36). Į vaškų sud÷tį įeina cetilo (C16), cerilo (C26), miricilo (C30) ir kiti alkoholiai.Vaškų sud÷tyje dažniausiai yra ilgos grandin÷s, sočios ar nesočios, lyginio anglies atomų skaičiaus monokarboksirūgštys. Bendra vaškų formul÷: CH3-(CH2)n-O-CO-(CH2)n-CH3 Vaškus sekretuoja augalai, gyvūnai. Vaškų funkcija yra sudaryti apsaugines dangas. Paukščių plunksnos ir gyvūlių kailis turi vaškinį apdangalą, kuris apsaugo nuo sušlapimo. Lapų ir vaisių vaškin÷ danga sumažina vandens nuostolius, apsaugo nuo infekcijos. Pagrindinis bičių vaško komponentas yra miricilpalmitatas, CH3-(CH2)29-O-CO-(CH2)14-CH3

Vaškai plačiai panaudojami farmacijoje, kosmetikoje. Lanolinas, vienas kremų sudedamųjų dalių yra mišinys vaškų, riebalų rūgščių, alkoholių ir neutralių riebalų. Į geriausių kosmetinių kremų sud÷tį įeina spermacetas. Kašaloto galvoje randama per 4 tonas spermaceto aliejaus, kurio pagrindin÷s sudedamosios dalys yra vaškai ir triacilgliceroliai. Spermacetas 370C temperatūroje yra skystas, o 310C sukiet÷ja, tod÷l plačiai naudojamas kosmetikoje. 5.3 Sud÷tiniai lipidai

5.3.1 Glicerofosfolipidai Glicerofosfolipidų (jie dar vadinami arba fosfogliceridai). Pagrindą sudaro glicerolis, kurio dvi hidroksigrup÷s yra esterifikuotos riebalų rūgštimis, o prie trečios prijungta fosforo rūgštis ir alkoholis (X). Daugiausiai jie yra sutinkami biologin÷se membranose.

183

183

O

OCH2O P

O

CH2-OH1

2

3

COH H

-

-

5.2 pav. L-Glicerolio-3-fosfato stereochemin÷ konfiguracija. H ir OH prijungti prie C-2 yra prieš lapo plokštumą, o C-1 ir C-3 – už plokštumos

CH

CH2O

CO

O

OP

O

X

CR2

R1

O

CH2O

O

5.3 pav. Bendra glicerofosfolipidų formul÷

Junginys, kurio Fišerio projekcija parodyta 5.2 pav. gali būti vadinamas L-glicerolio-3-fosfatas arba D-glicerolio-1-fosfatas. Tačiau naudojant stereospecifinį ženklinimą (sn), pirmą poziciją užima grup÷, esanti prochiralinio centro pro-S pad÷tyje, ši medžiaga yra vadinama sn-glicerolio 3-fosfatas. Prijungus prie glicerolio 3-fosfato dvi riebalų rūgščių liekanas, susidaro fosfatidin÷ rūgštis (5.3 pav. X=H). Galima laikyti, kad fosfatidin÷ rūgštis yra vienas iš paprasčiausių glicerofosfolipidų. Glicerofosfolipidai skiriasi vienas nuo kito pagal tai koks pkaitalas (X) yra prisijungęs prie fosfatidin÷s rūgšties ir kokios riebalų rūgštys esterifikuoja. Dažnai sn-1 pad÷tyje yra sočios riebalų rūgštys –stearino, palmitino, o sn-2 – nesočios oleino, linolo, linoleno.

CH2O

CH O C

O

O P

O

O

C CH3

O

OH2C

CH3

-

- Fosfatido rūgštis

Prisijungus cholinui, susidaro fosfatidilcholinas (arba lecitinas), prisijungus etanolaminui - fosfatidiletanolaminas (kefalinas), prisijungus serinui susidaro fosfatidilserinas. Jeigu X grup÷ yra mio-inozitolis turime fosfatidilinozitol į. Fosforilinus inozitolio hidroksigrupes ties 3, 4 ar 5 anglies atomais, gauname įvairius fosfolipidus. Labai svarbus yra fosfatidilinozitolio-4,5-bisfosfatas, kadangi yra pirmtakas mažiausiai trijų antrinių informacijos nešiklių: inozitolio-1,4,5-trisfosfato (modifikuoja viduląstelinį kalcio kiekį), diacilglicerolio (reguliuoja kai kurias baltymų kinazes C) bei fosfatidilinozitolio-3,4,5-trisfosfato (dalyvauja signalo perdavimo procesuose). Fosfatidilglicerolis susidaro susijungus gliceroliui su fosfatidine rūgštimu. Jeigu fosfatidinę rūgštį sujungsime su fosfatidilgliceroliu, gausime difosfatidilglicerolį arba kardiolipin ą, kuris daugiausiai sutinkamas mitochondrijų vidin÷je membranoje ir bakterijų membranose.

CH

CH2O

C

O

OP

O

CH2-CH2-N-CH3

CR2

R1

O

CH2O

O

Fosfatidilcholinas

CH3

CH3

+

O

CH

CH2O

C

O

OP

O

CH2-CH-NH3

CR2

R1

O

CH2O

O

Fosfatidilserinas

+

O

COO-

184

184

CH

CH2O

C

O

OP

O

CH2-CH2-NH3

CR2

R1

O

CH2O

O

Fosfatidiletanolaminas

+

O

CH2O

CH

CH2O

O

C

P

O

O

R

OHO

OHOH

OH

OH

O

CR O

Fosfatidilinozitolis

1

2 3

4

56

CH

CH2O

C

O

OP

O

CH

CHOH

CH2

CR2

R1

O

CH2O

O

O

C R2

CH2 OO

O

P O

C R1

OO HC

CH2O

OKardiolipinas

2

5.4 pav. Glicerofosfolipidų struktūros. R1 ir R2 – riebalų rūgščių liekanos.

Glicerofosfolipidų struktūros turi bendrą bruožą, visos molekul÷s turi hidrofobinę uodegą, sudarytą iš riebalų rūgščių angliavandenilin÷s grandin÷s ir hidrofilin÷s galvos. Ši hidrofilin÷ galva gali tur÷ti neigiamą krūvį (fosfatidilserinas, kardiolipinas) ar būti neutrali (fosfatidilcholinas). Glicerofosfolipidai kaip ir triacilgliceroliai dažniausiai yra mišiniai, besiskiriantys riebalų rūgščių sąstatu. Dažniausiai prie pirmo anglies atomo yra prijungta soti riebalų rūgštis, o prie antro– nesoti. Pavyzdžiui 1-stearoil-2-oleil-3-fosfatidilcholinas.

Fosfolipidus hidrolizuoja fermentai fosfolipaz÷s. Atsk÷lus vieną riebalų rūgštį, susidaro lizofosfolipidai, kurie yra detergentai. Specifinių fosfolipazių poveikis parodytas 5.5 pav.

CH

CH2O

C

O

OP

O

CH2-CH2-N-CH3

CR2

R1

O

CH2O

O

CH3

CH3

+

O

Fosfolipaz÷ A1

Fosfolipaz÷ A2

Fosfolipaz÷ C

Fosfolipaz÷ D

5.5 pav. Specifinių fosfolipazių veikimas

185

185

Vienas iš gyvačių kobros (Naja naja) nuodų komponentas yra fosfolipaz÷ A2, kuri katalizuoja fosfoacilglicerolių fosfoesterinio ryšio prie C-2 atomo hidrolizę. Patekus gyvat÷s nuodams į kraują, hidrolizuojami eritrocitų membranoje esantys acilgliceroliai, susidaro lizofosfolipidai. Jie veikia kaip detergentai, suardo eritrocitų membranas, vyksta raudonųjų kraujo kūnelių hemoliz÷ ir organizmas žūna. Tačiau avys yra atsparios gyvačių nuodų fosfolipazei A2, nes jų eritrocitų membranos išoriniame sluoksnyje yra ne fosfoacilgliceroliai, o sfingolipidai. Fosfolipaz÷s A2 poveikyje nuo membraninių fosfolipidų atskeliama arachidono rūgštis, iš kurios sintetinami eikozanoidai. Alkilgliceroliai Kai kuriuose audiniuose sutinkami lipidai, kuriuose glicerolio molekul÷je prie hidroksigrup÷s yra prijungta ne rūgšties, bet alkoholio molekul÷, susidaro eterinis, o ne esterinis ryšys. Ši eteriniu ryšiu prijungta angliavandenilin÷ grandin÷ gali būti soti kaip yra alkilglicerolipiduose, arba gali tur÷ti dvigubą ryšį tarpC-1 ir C-2. Šiuo atveju susidarę produktai vadinami plazmalogenais.

CH2O-CH=CH-(CH2)n-CH3

CH

CH2O

O

O CH2-CH2-N CH3

CH3

CH3CH3-(CH2)n

O

P

OC+

O

Plazmalogenai Alkilacilini ų glicerofosfolipidų molekul÷s sutinkamos įvairiuose organuose. Apie pusę širdies fosfolipidų sudaro palzmalogenai. Viena iš paplitusių žinduoliuose “signalinių” molekulių yra trombocitus aktyvuojantis faktorius (TAF). Alkilin÷ grup÷ (R) prie pirmo anglies atomo yra C16 grandin÷s alkoholis, tačiau acilo grup÷ prie C-2 yra acto rūgšties liekana. Ji suteikia molekulei

tirpumą vandenyje.

CH2O

CH

CH2O

O

O CH2-CH2-N CH3

CH3

CH3CH3

(CH2)15-CH3O

P

OC+

O

Trombocitus aktyvuojantis faktorius Jis atsipalaiduoja iš leukocitų ir stimuliuoja trombocitų agregaciją, kraujagyslių išsipl÷timą bei serotonino išsiskyrimą iš trombocitų. Jis svarbus uždegiminiuose ir alerginiuose procesuose. Galaktolipidai ir sulfolipidai Augalų tilakoidų membranose yra plačiai paplitę galaktolipidai. Juose prie 1,2-diacilglicerolio C-3 anglies atomo glikozidiniu ryšiu yra prijungtos viena ar dvi galaktoz÷s liekanos. Galaktolipidai yra gausi membraninių lipidų grupių. Šie lipidai neturi fosforo rūgšties ir neturi krūvio. Augalų membranose taip pat randami sulfolipidai, kuriuose sulfogliukoz÷ glikozidiniu ryšiu prijungta prie 1,2-diacilglicerolio.

186

186

CH2O

CH O C R

O

C R

O

H2COCH2OH

HOH

HH

OH

OH

HH

O

CH2O

CH O C R

O

C R

O

H2COH

H

OHH

OH

OH

HH

O

CH2O S

O

O

Monogalaktozildiacilglicerolis Sulfolipidas

-

-

Archebakterij ų membraniniai lipidai

Archebakterijos gyvena ekstremaliose sąlygose - aukštoje temperatūroje, rūgščioje terp÷je, didel÷s koncentracijos druskų tirpaluose. Jų membraniniai lipidai turi ilgos grandin÷s šakotus angliavandenilius, kurie prijungti prie glicerolio. Ryšys tarp glicerolio ir angliavandenilio yra eterinis, jis yra atsparesnis hidrolizei negu esterinis. Angliavandenilių galai gali būti kovalentišlai sujungti tai padidina membranų stabilumą.

5.3.2 Sfingolipidai Sfingolipidų pagrindą sudaro C18 amino alkoholis sfingozinas, prie kurio prijungta riebalų rūgštis ir pakaitas.

C

OH

H CH=CH-(CH2)12-CH3

NH3H C

CH2OH

+

Sfingozinas

C

OH

H CH=CH-(CH2)12-CH3

NH-CO-(CH2)n-CH3H C

CH2OH

Ceramidas Prie sfingozino molekul÷s amino grup÷s prijungus riebalų rūgšties liekaną gauname ceramidą. Sfingomielinas. Jie yra pagrindiniai sfingolipidų atstovai, susidaro prijungus prie ceramido fosfocholinui ar fosfoetanolaminui. Nors sfingomielinų struktūra skiriasi nuo glicerofosfolipidų, tačiau jų konformacija ir krūvių pasiskirstymas yra labai panašūs. Jie turi hidrofilinę “galvą” ir

187

187

hidrofobinę “uodegą”. Sfingomielinas kaip glicerofosfolipidai yra fosfolipidas. Sfingomielinai pagrindinai sutinkami gyvūnų ląstelių plazmin÷je membranoje, jų labai daug aksonus gaubiančiuose mielino apdangaluose.

C

OH

H CH=CH-(CH2)12-CH3

NH-CO-(CH2)n-CH3H C

CH O P

O

O

O-CH2-CH2-N(CH3)3

-H

+

Sfingomielinas Cerebrozidai. Prijungus prie ceramido monosacharidą, susidaro cerebrozidai. Gliukocerebroziduose yra prijungta β−D-gliukoz÷, jie sutinkami įvairių audinių ląstelių membranose. Galaktocerebrozidai sutinkami nervų ląstelių membranose ir turi prijungtą β−galaktozę. Cerebrozidų sud÷tyje n÷ra fosforo rūgšties, tod÷l jie yra neutralios molekul÷s.

OCH2OH

HH

OHH

OH

OH

HH

O CH2

C NH C

O

R

C

H

CH=CH-RHO

H

OCH2OH

HOH

H

OH

OH

HH

O CH2

C NH C

O

R

C

H

CH=CH-RHO

H

H

Gliukocerebrozidas Galaktocerebrozidas Galaktocerebroziduose prie galaktoz÷s 3 anglies atomo hidroksigrup÷s gali būti prijungtas sulfatas, gauname sulfatidus, kurie turi neigiamą krūvį. Globozidai yra neutralūs glikosfingolipidai, kuriuose prie ceramido yra prijungtos kelios angliavandenių D-gliukoz÷s, D-galaktoz÷s ar N-acetil-galaktozamino molekul÷s.

188

188

OCH2OH

H

H OH

HH

O CH2

OH

C NH C

O

R

C

H

CH=CH-RHO

H

HO

SO3-

Sulfatidai

Gangliozidai

Į gangliozidų sud÷tį įeina ceramidas, prie kurio prijungti oligosacharidai su viena ar keliomis sialo rūgšties molekul÷mis. Esant neutraliam terp÷s pH, jie yra neigiamai įkrauti. Gangliozidai sudaro 5-8% visų smegenyse esančių lipidų. Sialo rūgštys yra acilinta neuramino rūgštis, dažniausiai sutinkama N-acetil-neuramino rūgštis Gangliozidai vaidina labai svarbų vaidmenį tarpląstelinių kontaktų susidaryme, ląstelių atpažinime, tod÷l labai svarbūs ląstelių diferenciacijos ir proliferacijos procesuose. Gangliozidai taip pat yra kurių hormonų, toksinų - choleros, tetanus ir kitų receptoriai. Yra nustatyta, kad choleros toksinas jungiasi prie gangliozido GM1, esančio epitelinių ląstelių paviršiuje. Glikosfingolipidai yra kraujo grupių A,B ir O determinantai.

O

OH

NH

CH

H

H

H

HH

CO CH3

OH

CH

CH2OH

OHCOO-

OH

5.6 pav. N-acetilneuramino rūgštis (NANR), sialo rūgštis.

Gangliozidų įvairov÷ yra labai didel÷, monosacharidai tarpusavyje gali jungtis (1→4); (1→3) α ir β glikozidiniais ryšiais. Gangliozidų struktūros pakitimai sukelia įvairius neurologinius susirgimus, pavyzdžiui Tay-Sachs ligą. Kai kurių gangliozidų struktūros parodytos 5.7 pav.

189

189

OCH2OH

HOH

HH

OH

OH

HH

OCH2OH

OH

HH NH

HH

HO

COCH3

O

OCH2OH

H

HH OH

HH

O

OCH2OH

H

H

OH

OH

HH

O

CHOH

CHOH

CH2OH

COO

H

H

H

OH

H

NH

COCH3

H C

OH

C

H

NH

CO

R

CH2

O

CH

CH

-

O

N-Acetil-D-Galaktoz÷ D-galaktoz÷s aminas D-Galaktoz÷ D-Gliukoz÷

Sialo rūgštis

GM1

GM2

GM3

1

31 4 1 4

3

2

5.7 pav. Gangliozidų GM1, GM2 ir GM3 struktūros.

Kraujo grupi ų sistema. Žmogaus eritrocitų paviršius yra padengtas kompleksu specifinių antigeninių determinančių, dauguma iš jų yra polisacharidai. Yra žinoma per 100 kraujo grupių determinančių, priklausančių 21 nepriklausomai kraujo grupių sistemai. Plačiausiai palitusi yra ABO sistema. Pagal šią sistemą žmon÷s skirstomi į A, B, AB ir O tipus. To paties tipo žmonių kraujas gali būti perpilamas be žalingų pasekmių. O tipo individų serumas turi antikūnus, kurie susijungia su A ir B tipo individų eritrocitų antigenais ir vyksta agliutinacija. B tipo žmonių serumas sąveikauja su A tipo ląstel÷mis ir agliutinuoja bei atvirkščiai. Visų keturių tipų individai neturi antikūnų prieš O tipo eritrocitus.

Kraujo ABO tipai yra sąlygojami specifinių kraujo grupių determinančių, kurios yra prijungtos prie eritrocitų ar endotelinių ląstelių paviršiaus glikosfingolipidų ar glikoproteinų. Minimalios struktūros, prijungtos prie oligosacharido (R) ir apsprendžiančios kraujo grupes yra parodytos 5.8 pav.

190

190

A tipas GalNAcα(1 3)Galβ(2 R 2

Fucα1

B tipas Galα(1 3)Galβ(2 R 2

Fucα1

O tipas Galβ(2 R 2

Fucα1

Kur R yra oligosachardas prie kurio prijungta antigenin÷ determinant÷

3(4)GlcNAcb-(1 3)Gal1b-(1 4)Glcb-(1 ceramidas (Ser, Thr)5.8 pav. Kraujo grupių determinant÷s.

Biocheminis ir genetinis kraujo grupių pagrindas yra nustatytas. Yra trys alel÷s, kurios

koduoja fermentą glikoziltransferazę. A tipo individuose šis 303 aminorūgščių fermentas perneša N-acetilgalaktoz÷s aminą nuo nešiklio (UDP-N-acetilgalaktoz÷s amino) ant galinio O tipo sacharido. B tipo individai turi transferazę, kuri skiriasi vos 4 aminorūgštimis ir prijungia galaktozę prie O tipo determinant÷s. O tipo alel÷s fermentas yra neaktyvus, d÷l vienos baz÷s delecijos. MN kraujo grupių sistema surišta eritrocitų membraniniu glikoproteinu glikoforinu. Šis baltymas taip yra gripo viruso, maliarinio parazito Plasmodium falciparum receptorius. 5.4 Lipid ų dariniai

5.4.1 Steroidai Steroidų molekul÷s pagrindas yra ciklopentanoperhidrofenantreno žiedas, kurį sudaro keturi sujungti žiedai. Ši molekul÷ yra plokščia ir gana nelanksti. Dauguma žmogaus organizme sutinkamų steroidų yra metilinti ties C-10 ir C-13, bei turi šonines alifatines grandines prijungtas prie C-17.

12

34

56

7

8910

1112

13

14 1516

17

A B

C D

Steroliai yra steroidų grup÷s atstovai, turintys prie C-3 atomo -OH grupę. Cholesterolis

yra gausiausiai sutinkamas gyvūnuose sterolis. Ši molekul÷ yra amfifilin÷, turi polinę -OH grupę prie C-3 ir didelę likusią nepolinę molekul÷s dalį. Augalų ląstelių membranose randami stigmasterolis ir β−β−β−β−sitosterolis, o grybų ir mielių membranose ergosterolis. Prokariotai, išskyrus

191

191

mikoplazmas, sterolių nesintetina. Cholesterolis įeina į gyvūnų plazminių membranų sud÷tį, iš jo yra sintetinamos tulžies rūgštys, steroidiniai hormonai, vitaminas D. Cholesterolis ir jo esteriai yra svarbus kraujo plazmos lipoproteinų komponentas.

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

3 5 6

19

18

17

20

Cholesterolis

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

C2H5

StigmasterolisCH3

CH3

CH3

OH

CH3

CH3C2H5

β-Sitosterolis

CH3

CH3

CH3

OH

CH3

CH3CH3

Ergosterolis Tulžies rūgštys cholio, deoksicholio, bei jų junginiai su glicinu (glikocholio rūgštis) bei taurinu (taurocholio rūgštis) turi hidrofilinę uodegą, kuri suteikia joms tirpumą vandenyje. Jos žarnyne veikia kaip detergentai, emulguoja riebalus tuo palengvindamos acilglicerolių hidrolizę.

OH OH

CH3

OH

COOH

CH3

CH3

Cholio rūgštis

OH

CH3

OH

COOH

CH3

CH3

Deoksicholio rūgštis

Steroidiniai hormonai .

Gyvūnuose steroidai, sintetinami iš cholesterolio, sudaro penkias hormonų šeimas: androgenus, estrogenus, progestinus, gliukokortikoidus ir mineralokortikoidus. Androgenai, tokie kaip testosteronas bei estrogenai (estradiolis) dalyvauja lytinių požymių ir lytinių funkcijų išsivystyme. Progestinas (progesteronas), kontroliuoja mensturacinį ciklą ir n÷štumą. Iš gliukokortikoid ų, plačiausiai paplitęs kortizolis, kontroliuoja angliavandenių, baltymų ir riebalų metabolizmą. Mineralokortikoidai (aldosteronas, korteksonas) audiniuose reguliuoja druskų (Na+, K+ ir Cl-) balansą.

192

192

.O

CH3

OHCH3

OH

OHCH3

Testosteronas Estradiolis

O

CH3

CH3

OCH3

O

CH3

CH3

O

OH OH

CH2OH

Progesteronas Kortizolis

O

CH3

OO

CH2OHOH

Aldosteronas 5.9 pav. Steroidinių hormonų struktūros

5.4.2 Riebaluose tirpūs vitaminai Riebaluose tirpių vitaminų grupei priklauso vitaminai A, D, E, ir K. Visi jie turi izopreno liekanas. Vitaminas A Vitamino A aktyvios formos yra retinolis, retinalis ir retinoin÷ rūgštis. Dauguma augalų sintetina karotinoidus, šviesą sugeriančius pigmentus, kurie gyvūnuose, fermentų poveikyje suskyla į vitaminą A.

CH3 CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3 CH3

β−karotinas

193

193

CH3 CH3

CH3

CH2OH

CH3 CH3

Retinolis (vitaminas A)

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

Retinalis (pilnai trans-retinalis)

CH

O

CH3 CH3

CH3

CH3

CH3

∆ -cis-retinalis CH

O11

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

Retinoin÷ rūgštis

COH

O

Vitaminas A organizme atlieka daug funkcijų. Jis oksiduojasi iki ∆-cis-retinalio, kuris

susijungęs su baltymu opsinu duoda rodopsiną, akies tinklain÷s pigmentą, dalyvaujantį šviesos sug÷rime. Rodopsinas sugeria šviesos kvantą, vyksta eil÷ biocheminių procesų, kurių metu perduodamas nervinis impulsas. ∆11-cis-retinalis izomerizuojasi į pilnai trans-retinalį ir disocijuoja nuo baltymo opsino. V÷liau cis izomeras pereina trans, formą, susijungia su baltymu opsinu ir rodopsinas pasiruošęs sugerti naują šviesos kvantą.

Rodopsinas

trans-retinalis

∆ -cis-retinalis

opsinas

opsinasnervinis impulsas

11

hν

5.10 pav. Vitamino A vaidmuo reg÷jimo procese

Organizme retinolis yra paverčiamas į retinilfosfatą, kuris kaip ir dolicholfosfatas yra glikozilo donoras glikoproteinų ir glikozaminoglikanų sintez÷je. Retinolis ir retinoin÷ rūgštis susijungusi su viduląsteliniais receptoriais ir chromatinu reguliuoja ląstel÷s augimą ir

194

194

diferenciaciją. Vitaminas A reikalingas epitelinių ląstelių vientisumui palaikyti. Trūkstant retinolio sintetinamos didel÷s molekulin÷s mas÷s keratino formos ir sutrinka gleivių glikoproteinų sintez÷. Epitelin÷s ląstel÷s pradeda džiūti ir keratinizuotis. Vitamino A trūkumas sukelia anemiją, d÷l to, kad sutrinka geležį pernešančio baltymo transferino biosintez÷. β−karotinas pasižymi antioksidacin÷mis savyb÷mis. Vitaminas A kaupiasi kepenyse, ir jo perdozavimas yra toksiškas organizmui. Vitaminas D

Vitaminas D turi būti laikomas daugiau hormonu o ne vitaminu. Cholekalciferolis (D3) susidaro odoje fotochemin÷s reakcijos metu apšvietus 7-dehidrocholesterolį UV spinduliais. Vitamino D3 yra daug jūros žuvyse, kepenyse ir kiaušinio trynyje. Vitaminas D2 (ergokalciferolis) yra komercinis preparatas, gaunamas paveikus UV miel÷se esantį ergosterolį. Juo papildomai gali būti praturtinamas pienas, sviestas. Vitaminas D3 pats n÷ra biologiškai aktyvus, bet iš jo kepenyse ir inkstuose sintetinamas 1,25-dihidroksicholekalciferolis, kuris kartu su paratiroidiniu hormonu reguliuoja kalcio pernašą žarnyne ir inkstuose, bei palaiko pusiausvyrą tarp kalcio ir fosfato šalinimo ir kaupimo kauluose. Jis padidina Ca2+koncentraciją serume skatindamas Ca2+ absorbiją iš žarnyno ir stimuliuodamas jo išsiskyrimą iš kaulų. Didel÷s paratiroidinio hormono koncentracijos stimuliuoja 1,25-dihidroksicholekalciferolio susidarymą. Kartą susidaręs 1,25-dihidroksicholekalciferolis veikia žarnyno epitelin÷se ląstel÷se kaip tipiškas steroidinis hormonas. Jis indukuoja baltymo kalbindeno, reikalingo Ca2+ pernešimui, sintezę. Kauluose su paratiroidiniu hormonu stimuliuoja Ca2+ ir fosfato išsiskyrimą, sukelia kaulų demineralizaciją. Paratiroidinis hormonas kartu su 1,25-dihidroksicholekalciferoliu padidina Ca2+ rezorbciją inkstų kanal÷liuose tuo pačiu sumažina jo pašalinimą per inkstus. Šių dviejų hormonų veikla reguliuojama Ca2+ koncentracijos serume. Vitamino D trūkumas sukelia rachitą.

195

195

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

OH7-Dehidrocholesterolis

UV (odoje)

CH3

CH3

CH3

CH3

CH2

OHVitaminas D3 (cholekalciferolis)

I etapas kepenyseII etapas inkstuose

1,25-Dihidroksicholekalciferolis

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

OH OH

CH2

1

25

910

CH3

CH3

CH3

OH

CH3

CH3CH3

Ergosterolis

UV

CH3

CH3

CH2

OH

CH3

CH3CH3

Vitaminas D2 (Ergokalciferolis)

Vitaminas E Vitaminas E yra tokoferolių mišinys. Pagrindinis atstovas yra α−tokoferolis, sutinkamas vištų kiaušiniuose, augalų aliejuose, ypač gausiai kviečių gemaluose. Vitaminas E pasižymi antioksidaciniu poveikiu. Kadangi jis yra lipofilinis, jis akumuliujasi karujo lipoproteinuose, ląstelių, organoidų membranose, riebaliniame audinyje. Tokoferoliai neutralizuoja aktyvius deguonies radikalus apsaugodami baltymus, nesočias riebalų rūgštis nuo oksidacijos.

196

196

CH3

CH3

OHCH3

O

CH3 CH3 CH3CH3

Vitaminas E (α−Tokoferolis) Vitaminas K Vitaminas K1 randamas žaliose daržov÷se, o K2 yra sintetinamas žarnyno bakterijų. Jis yra lipidinis kofaktorius reikalingas normaliam kraujo kreš÷jimui. Vitaminas K dalyvauja potransliacin÷je protrombino modifikacijoje. Modifikuojamos glutamo rūgšties molekul÷s, esančios polipeptidin÷s grandin÷s N gale. Katalizuojant fermentui glutamil karboksilazei, kurio aktyvumui būtinas vitaminas K, karboksilinama glutamo rūgštis iki γ−γ−γ−γ−karboksiglutamato

NH

CH

CO

CH2

CH2

COO-NH

CH

CO

CH2

CH

COO

COO-

Glutamilo karboksilaz÷vit K , CO2

-

γ−karboksiglutamo rūgštis yra geras chelatorius ir suriša Ca2+ jonus. Protrombino-Ca2+

kompleksas susijungia su membranomis, kur vyksta proteoliz÷ ir susidaro aktyvus trombinas. Protrombinas yra proteolitinis fermentas, hidrolizuojantis specifinius peptidinius ryšius fibrinogeno molekul÷je ir paleidžiama kraujo kreš÷jimo kaskada. Karboksiglutamo rūgšties liekanas turi netiktai protrombinas ( dar vadinamas faktorius II), bet ir kiti kreš÷jimo faktoriai VII, IX, X, bei plazmos baltymai C, M, S ir Z.

197

197

O

O

CH3

R

Vitaminas K1 (filochinonas)

R= -CH2-CH=C-CH2-(CH2-CH2-CH-CH2)3-H

CH3 CH3

Vitaminas K2 (menachinonas)

R= -(CH2-CH=C-CH2)8-H

CH3

Vitaminas K3 (menadionas)

R= - H

Neseniai buvo parodyta, kad vitaminas K reikalingas γ−karboksiglutamo rūgšties susidarymui baltyme osteokalcine. Osteokalcinas suriša Ca2+ ir reikalingas kaulų formavimuisi. Vitamino K trūkumas gali būti siejamas su osteoporoze.

5.4.3 Terpenai

Terpenai yra lipidų dariniai, kurią sudaro susijungusios kelios izopreno (C5) molekul÷s.

CH2CH2

CH3

Monoterpenai (C10) sudaryti iš dviejų izopreno molekulių, diterpenai (C20) turi keturias

izopreno molekules. Susijungusios izopreno molekul÷s gali sudaryti linijines arba ciklines struktūras. Monoterpenai plačiai paplitę aukštesniuosiuose augaluose. Triterpenų (C30) atstovai skvalenas ir lanosterolis yra cholesterolio sintez÷s pirmtakai. Karotinoidai, fotosintez÷s pigmentai, yra tetraterpenų (C40) atstovai. β−karotinas yra vitamino A pirmtakas, o panašus į jį likopenas yra pomidorams suteikiantis spalvą pigmentas. Ilgos grandin÷s poliizoprenoidų molekul÷s su gale esančia hidroksigrupe yra vadinami poliprenoliai. Vienas iš jų atstovų yra dolicholis, kurio sud÷tyje yra 16-22 izopreno vienetų. Dolicholio fosfatai gyvūnuose perneša angliavandenių liekanas glikoproteinų biosintez÷je.

Poliprenilin÷s grup÷s yra inkarai, kurie prijungia kai kuriuos baltymus prie membranų. Monoterpenai Diterpenai

198

198

Limonenas

OH

Mentolis

CH2OH

Fitolis

Triterpenai

Skvalenas

OH

Lanosterolis Tetraterpenas

Likopenas

H[-CH2-C=CH-CH2-] -CH2-CH-CH2-CH2-O-P-O16-22

O

O-

-CH3 CH3

Dolicholio fosfatas 5.4.4 Eikozanoidai

Eikozanoidai yra polinesočiųjų riebalų rūgščių, turinčių 20 anglies atomų, dažniausiai arachidono rūgšties oksiduoti dariniai (graikiškai eikosi reiškia dvidešimt). Yra kelios eikozanoidų klas÷s: prostaglandinai, leukotrienai, tromboksanai, prostaciklinai ir lipok sinai.

Eikozanoidai pagal savo veikimo pobūdį yra panašūs į hormonus, tačiau yra jie sintetinami ne specializuotose liaukose, bet nedideliais kiekiais beveik visose ląstel÷se. Jie veikia sintez÷s vietoje o n÷ra išnešiojami po visą organizmą kaip pavyzdžiui hormonas insulinas. Eikozanoidai n÷ra saugomi, jų gyvenimo pusperiodis yra labai trumpas ir jie metabolizuojami iki neaktyvių produktų. Eikozanoidai bet sintetinami de novo iš arachidono rūgšties, tose ląstel÷se, kurias jie veikia. Žmogaus organizmas per parą išskiria apie 1mg eikozanoidų.

199

199

Jie yra aktyvūs labai mažose koncentracijose (< 1nmol) ir veikia specifinius ląstel÷s receptorius esančius ant branduolio ir plazmin÷s membranos. Eikozanoidai svarbūs uždegiminiuose procesuose, imuninio atsako susidaryme, sergant alergin÷mis ir navikin÷mis ligomis, sutraukia arba atpalaiduoja lygiuosius raumenis, reguliuoja bronchų spindį, mažina kraujospūdį, slopina skrandžio sulčių sekreciją, dalyvauja ląstelių augimo reguliacijoje ir kituose procesuose (5.2 lentel÷). 5.2 lentel÷. Eikozanoidų fiziologinis poveikis Poveikis Eikozanoidas Kraujagyslių vazodilatacija (išsipl÷timas) PGA, PGD, PGE1, PGE2, PGI2, TXA2

Raumenų susitraukimas LTC4, LTD4, LTE4

Chemoatraktantai T ląstel÷ms PGE2, LTB4

Imuninio atsako supresuoja LTB4

Chemotaksis LTB4, LXA Trombocitų funkcijos TXA2, PGI2

Skausmo tarpininkas PGE2, PGI2

Paveikus ląsteles mitogenais, citoksinais, endotoksinais aktyvuojama fosfolipaz÷ A2 ir iš

membraninių fosfolipidų atsipalaiduoja arachidono rūgštis.. Eikozanoidai iš arachidono rūgšties susidaro pagrindinai dviem keliais: ciklooksigenaziniu keliu, sintetinami prostaglandinai, tromboksanai ir prostaciklinai, o lipoksigenaziniu keliu sintetinami leukotrienai ir lipoksinai (5.11 pav.).

Fosfolipidai(membraniniai)

Arachidono rūgštis (C20:4∆5,8,11,14)

Lipoksigenazinis kelias

Leukotrienai

Ciklooksigenazinis kelias

Prostaglandinai

Tromboksanai

Prostaciklinai

Linolo rūgštis (C18:2∆9,12)

Lipoksinai

Fosfolipaz÷ A2

5.11 pav. Eikozanoidų susidarymo bendra schema. Prostaglandinai. Pirmieji du išskirti prostaglandinai buvo pavadinti prostaglandinais E ir F, atitinkamai pagal jų tirpumą eteryje ir fosfatiniame buferyje. Yra trys pagrindin÷s prostaglandinų kals÷s – A, E ir F. Naudojami sutrumpinti jų pavadinai PGA, PGE ir PGF. Prostaglandinai yra hipotetin÷s prostano rūgšties dariniai

200

200

CH3

COOH

2

3

4

5

6

78

9

10

1112

1314

1516

17

18

19

20

1

Prostano rūgštis Kiekvienas prostaglandinas turi ciklopentano žiedą su dviem šonin÷mis grandin÷mis. Prie vienos iš jų yra prijungta karboksigrup÷. Dauguma prostaglandinų šonin÷je grandin÷je turi 2 dvigubus ryšius. Dvigubų ryšių kiekį šonin÷je grandin÷je nurodo apatinis indeksas prostaglandinas PGE2 turi du dvigubus ryšius.

201

201

OH

OH

COOH

COOH

COOH

O

O

COOH

O

O

COOH

O

OH

COOH

COOH

O

O

O

CH3

OHOH

COOH

OH PGF2

Arachidono rūgštis

2O2 COXciklooksigenazinis aktyvumas

Arachidono rūgštis

2O2

OOH

OH

PGG2

COXperoksidazinis aktyvumas

COXciklooksigenazinis aktyvumas

PGH2

OH PGE2

Prostaciklinas PGI2

OHTromboksanas TXA2

Tromboksano sintaz÷

Prostaciklinų sintaz÷

PGF sintaz÷

PGE sintaz÷

2GSH

GSSG+H2O

5.12 pav. Eikozanoidų sintez÷s ciklooksigenazinis kelias. Prostaglandinus sintetina ir išskiria beveik visos organizmo ląstel÷s, išskyrus eritrocitus. Jie veikia per cAMP, tod÷l jų poveikis yra daugialypis

202

202

Prostaglandinų sintez÷. Prostaglandinai sintetinami iš turinčių 20 anglies atomų polinesočiųjų riebalų rūgščių. Veikiant fosfolipazei A2 nuo membraninių fosfolipidų fosfatidilcholino, fosfatidiletanolamino glicerolio sn-2 pad÷ties atskeliama arachidono rūgštis. Fosfolipazę aktyvuoja hormonai bradikininas, adrenalinas, gyvačių nuodai melitinas, trombinas. Arachidono rūgšties oksidacinę ciklizaciją katalizuoja prostaglandinų G/H sintaz÷, plačiai naudojamas jos pavadinimas yra ciklooksigenaz÷. Šis fermentas randamas mikrosomose ir turi du katalizinius aktyvumus – ciklooksigenaz÷ katalizuoja dviejų deguonies molekulių prijungimą ir arachidono rūgšties ciklizaciją, susidarant cikliniam 9,11-endoperoksidui 15-hidroksiperoksidui (PGG2). PGG2 yra paverčiamas į PGH2 dalyvaujant redukuotam glutationui.

Žinduolių ciklooksigenaz÷ turi du panašius pagal savo struktūrą, substratinį specifiškumą, kinetines charakteristikas izofermentus, vadinamus COX-1 ir COX-2. COX-1 susidaro beveik visose ląstel÷se konstitutyviai ir pastoviai sintetina prostaglandinus, reikalingas normaliam skrandžio, inkstų funkcionavimui, trombocitų agregacijai. COX-2 yra indukuojamas fermentas tose ląstel÷se, kurios atsakingos už uždegiminius, imuninius procesus (neutrofilai, makrofagai, mast ląstel÷s). Šio fermento sintez÷ indukuojama trombocitus aktyvuojančio faktoriaus, mitogenų, citokinų (pvz. interleukino-1), bakterijų lipopolisacharidų.

Tolimesn÷se eikozanoidų sintez÷s stadijose, veikiant atitinkamiems fermentams PGE sintazei, PGF sintazei ir kitiems sintetinami kiti prostaglandinai, prostaciklinas, tromboksanai ( 5.12 pav.) Prostaglandinų sintez÷ slopinama įvairių vaistų. Kortizolis, hidrokortizonas, betametazonas (steroidiniai priešuždegiminiai hormonai) slopina fosfolipaz÷s A2 aktyvumą, ir tod÷l iš fosfolipidų neatsipalaiduoja arachidono rūgštis. Aspirinas, indometacinas, ibuprofenas, fenilbutazonas (nesteroidiniai priešuždegiminiai hormonai) slopina ir COX-1 ir COX-2, tod÷l nesintetinamas prostaglandinas PGH2 ir kiti eikozanoidai. Priešuždegiminis aspirino poveikis susijęs su COX-2 aktyvumo sumaž÷jimu. Ibuprofenas specifiškiau veikia COX-2, bet yra silpnesnis slopiklis nei aspirinas. Pastovus ir ilgalaikis aspirino vartojimas pradeda stipriai mažinti konstitutyvios COX-1 formos sintezę sumaž÷ja bazinis prostaglandinų kiekis ir tuo pasireiškia toksinis jo poveikis (pažeidžiamas skrandis, inkstai, sutrinka kraujo kreš÷jimas). Esant aspirinui, eikozopentaeno rūgštis yra oksiduojama COX-2 ir susidaro prieuždegimin÷s medžiagos vadinamos rezolvinais. Aspirino nepageidautinas poveikis mažinamas kuriant naujas chemines medžiagas, specifiškai veikiančias COX-1 arba COX-2. 1998m prad÷tas vartoti vaistas Celebrex, kuris 400 kartų stipriau susiriša su COX-2 negu su COX-1 ir specifiškiau veikia uždegiminius procesus. Tromboksanai ir prostaciklinai. Šiuos eikozanoidus sintetina kraujagyslių lygieji raumenys, endotelis ir trombocitai. Tromboksanai susidaro iš PGH2 tipo prostaglandinų ir turi šešių anglies atomų ciklą su jame esančiu deguonies atomu. Tromboksanas TXA2 pagrindinai susidaro trombocituose ir indukuoja trombocitų agregaciją, kraujo krešulių susidarymą ir kraujo tekm÷s sul÷t÷jimą. TXA2 stimuliuoja kraujagyslių ir bronchų susitraukimą, yra stiprus vazokonstriktorius. Tromboksanas slopina adenilato ciklazę. Prostaciklinas (PGI2) sintetinamas kraujagyslių endotelio ir lygiųjų raumenų ląstel÷se ir yra ženklus hemostaz÷s reguliatorius. Jis didina kraujagyslių spindį ir mažina kraujo kreš÷jim ą. PGI2 slopina trombocitų agregaciją, jo poveikyje padid÷ja cAMP koncentracija. PGI2 veikia priešingai nei TXA2 , šių dviejų eikozanoidų poveikyje reguliuojamas kraujo spaudimas. Leukotrienai ir lipoksinai. Uždegiminiai procesai ir alergin÷s reakcijos (hiperjautrumas) , yra susiję su leukotrienų kiekio padid÷jimu. Leukotrienai pirmą kartą rasti leukocituose, turi

203

203

konjuguotą trijų dvigubų ryšių sistemą. Leukotrienas D4 (LTD4) sukelia raumenų, kurie iškloja plaučių oro takus susitraukimą. Leokotrienų perprodukciją sukelia astmos priepuolius, tod÷l antiastmatiniai vaistai yra nukreipti prieš leukotrienų sintezę. Plaučių lygiųjų raumenų susitraukimas anafilaksinio šoko metu yra alerginis atsakas į bičių, vapsvų nuodus, kai kuriuos vaistus (pvz. peniciliną, analginą) ir kitas medžiagas. Lipoksinai susidaro iš produktų gautų veikiant arachidono rūgštį 5- ir 15-lipoksigenaz÷mis. Jie turi konjuguotą tetraeninę struktūrą ir tris hidroksigrupes. Yra žinomas dvi lipoksinų klas÷s -lipoksinas A ir lipoksinas B. Jie stimuliuoja superoksido radikalo susidarymą neutrofiluose ir dalyvauja chemotaksio procese. Leukotrienų ir lipoksin ų biosintez÷. Arachidono rūgštis, katalizuojant skirtingoms lipooksigenaz÷ms yra paverčiama į įvairias linijines hidroperoksirūgštis. Neutrofilai turi 5-lipoksigenazę, kuri oksiduoja arachidono rūgštį iki 5-hidroksi-6,8,11,14 eikozotetraenoin÷s rūgšties (5-HPETE). 5-HPETE skirtinguose audiniuose paverčiama į grupę leukotrienų. 15-lipoksigenaz÷s poveikyje susidaro 15-HPETE, iš kurios sintetinami lipoksinai.

COOH

COOH COOH

OH OH

OH

COOH

OCOOH

COOH

OH

S

Glu

Cys Gly

Arachidono rūgštis

O2

5-lipoksigenaz÷

OOH

5-HPETE

Leukotrienas A4 (LTA4)Glutationas

Leukotrienas C4 (LTC4)

OOH15-HPETE

Lipoksinas A (LXA)

O2

15-lipoksigenaz÷

LTA4

sintaz÷

LTC4

sintaz÷

5.13 pav. Leukotrienų ir lipoksinų biosintez÷.

204

204

5.5 Inkariniai baltymai

Eukariotų ląstel÷se kai kurie integralieji baltymai neperveria kiaurai membranos, o yra prikabinti per lipidinį inkarą. Šie baltymai turi kovalentiškai prijungtas angliavandenilines grandines, kurios įsiterpia į fosfolipidinį dvisluoksnį. Baltymus pagal tai koks inkaras prijungtas, galima suskirstyti į tris grupes:

Glikozilfosfatidilinozitolio (GPI) inkar ą turintys baltymai . Kai kurie ląstel÷s paviršiaus baltymai prisitvirtinę prie išorin÷s membranos per glikozilfosfatidilinozitolinį inkarą. Tai yra fermentai, receptoriai, imunin÷s sistemos baltymai. GPI inkaras sudarytas iš fosfatidilinozitolio, prie kurio prijungta tetrasacharido sudaryto iš trijų manoz÷s ir vienos N-acetilgliukoz÷s molekulių šerdis. Šerdies manoz÷ gali būti modifikuota prijungiant galaktoz÷s, N-acetilgalaktoz÷s ar manoz÷s liekanas. Šerdies manoz÷ sudaro fosfoesterinį ryšį su fosfoetanolamino liekana, kuris amidiniu ryšiu prijungtas prie baltymo C-galin÷s aminorūgšties karboksigrup÷s. GPI inkarai plačiai paplitę, prijungiant paviršiaus antigenus, adhezijos molekules, ląstel÷s paviršiaus hidrolazes. Tokiu būdu prie membranos yra prijungiama šarmin÷ fosfataz÷. Glikozilfosfatidilinozitoliniu inkaru prijungti baltymai, gali būti pašalinti paveikus fosfolipaze C ir D. Jau yra žinoma per 100 įvairių baltymų, tokiu būdu prijungtų prie membranos.

CO

NH

CH2

CH2

O

PO O

O

H

OHOH

HOH

H

OH

HO

H

O

H

P O

O

O

CH2

CH O

CH2 O CO

CO

R

R

Baltymas

Man Man Man GlcNAc

-

1

2

α−(1 6)

Tetrasacharido šerdis

Fosfo-etanol-aminas

Fosfatidilinozitolis

-

α−(1 2) α−(1 4)

α−(1 6)

Riebalų rūgščių inkaras. Riebalų rūgštis yra kovalentiškai prijungta prie baltymo

molekul÷s amidiniu arba tioesteriniu ryšiu . Miristo rūgštis prie N-galin÷s glicino aminorūgšties prisijungia amidiniu ryšiu. Palmitino, stearino, oleino rūgštys sujungtos tioesteriniu ryšiu su polipeptidin÷s grandin÷s viduje esančia cisteino aminorūgšties merkaptogrupe. Kai kuriais atvejai palmitilinti baltymai gali būti prenilinami. Palmitilinti baltymai citozolyje, prijungiami prie plazmin÷s membranos vidin÷s pus÷s. Miristilinti baltymai randami įvairiuose ląstel÷s kompartmentuose – endoplazminiame tinkle, plazmin÷je membranoje, branduolyje. Tokie

205

205

baltymai yra c-AMP priklausomos baltymo kinaz÷s katalizinis subvienetas, pp60scr tirozino kinaz÷, G baltymų α subvienetas, virusų gag baltymas. Baltymai prijungti tioesteriniu ryšiu yra kai kurių virusų paviršiaus glikoproteinai, transferino receptorius ir kiti.

CNH

CH2

CNH

baltymas

O

Omiristo (C14) rūgštis

O

CH2

CH

CO

CH2

NH

C

Palmitino (C16) rūgštisS

Baltymas Prenilinti baltymai tai yra trečia inkarinių baltymų klas÷. Baltymai yra prijungti prie

plazmin÷s ar organelių vidin÷s membranos pus÷s per izoprenoidines grupes. Tai gali būti 15 anglies atomų turinti farnezilo arba 20 anglies atomų turinti geranilgeranilo liekanos.

CH2CH

CH3

CH2

CH3

CH3 CH3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3

CH3

C

Izoprenas

HC

Farnezilo liekana

HC

Geranilgeranilo liekana Lipidin÷ liekana kovalentiniu tioeteriniu ryšiu dažniausiai yra prijungta prie

aminorūgšties cisteino, esančio baltymo C galiniame tetrapeptide CaaX.

206

206

CH2

CH

CO

OCH3

NH

CH2

CH

CO

OCH3

NH

S

S-Geranilgeranil cisteino metilo esterisbaltymas

S

S-Farnezilcisteino metilo esteris

baltymas Visi lipidiniai inkarai prijungiami jau po baltymų biosintez÷s. Mutavus baltymų

prenilinimo vietą Cys, blokuojamas jų prisijungimas prie membranos. Baltymas p21ras (Ras) baltymas, 21 kDa baltymas, koduojamas ras geno tik prisijungęs prie plazmin÷s membranos veikia kaip ląstel÷s augimo ir dalijimosi reguliatorius. Mutantiniai Ras baltymai gali transformuoti ląsteles ir dažnai sukelia žmogaus organizme v÷žį. Branduolio laminai, kurie išsid÷tę prie vidin÷s branduolio membranos pus÷s prijungti prie membranos prenilo liekana. Prenilinimas svarbus baltymo-baltymo sąveikai.

207

207

6 Biologin ÷s membranos Biologin÷s membranos yra būtina visų gyvų sistemų dalis. Jos gaubia ląstelių vidinį turinį, atskiria jas nuo aplinkos. Eukariotin÷se ląstel÷se daugumą vidinių struktūrų, tokių kaip branduolys, mitochondrijos, chloroplastai, lizosomos, peroksisomos, endosomos, endoplazminis tinklas, Goldžio aparatas yra nuo citozolio atskirti membranomis. Uždaruose kompartmentuose vyksta tarpusavyje atskirti ir skirtingai reguliuojami specifiniai biocheminiai procesai. Glikoliz÷ vyksta citozolyje, trikarboksirūgščių ciklas, riebalų rūgščių oksidacija mitochondrijų užpilde, riebalų rūgščių sintez÷ citozolyje.

Nudažius ląsteles, organeles osmio tetroksidu arba kalio permanganatu ir analizuojant elektroniniu mikroskopu, matomi trys sluoksniai tai yra dengiančios membranos. Dažai jungiasi prie hidrofilinių dalių ir susidaro du paviršiniai (2-2,5nm) storio tamsūs sluoksniai yra atskirti 2,5-3,5nm šviesiu tarpu.

6.1 pav. Biologin÷s membranos elektronin÷s mikroskopijos nuotrauka. Matomi du tamsūs ir vienas šviesus sluoksnis. Pagrindin÷s membranų funkcijos yra šios:

1. Atskiria ląstel÷s vidų ar organeles nuo aplinkos, palaiko pastovią jonų ir medžiagų koncentraciją, sudaro barjerą įvairių medžiagų laisvam pra÷jimui.

2. Jos pasižymi selektyviu pralaidumu, reguliuoja viduląstelinę medžiagų koncentraciją. Ląstelei reikalingos maisto medžiagos iš aplinkos pereina į citozolį ar į organeles, kur vyksta išorinių maisto ir energijos šaltinių medžiagų apykaita. Membranos reguliuoja vidinę metabolitų koncentraciją, vykdo galutinių medžiagų apykaitos procesų produktų pašalinimą. Palaiko atitinkamą jonų koncentraciją ląstel÷je ar organel÷se, kuri ženkliai skiriasi nuo aplinkos. Transporteriai perneša baltymus, angliavandenius, lipidus, jonus ir kitas medžiagas į ląstelę arba iš jos. Pernešimo sistemos transportuoja nukleorūgštys per membranas, įgalindamos genetin÷s informacijos pasikeitimą tarp organizmų. Toksiniai junginiai pašalinami iš ląstel÷s.

3. Membranų paviršiuje yra išsid÷stę receptoriai, kurie priima įvairius išor÷s ar vidinius signalus, tokius kaip hormonai, augimo faktoriai, šviesa, sl÷gis ir kiti ir perduoda informaciją į ląstel÷s vidų. Membranos turi informacinę funkciją.

Dauguma labai svarbių biocheminių procesų vyksta membranose. Medžiagų nešikliai, kanalai, reguliuojantys jonų srautus yra membraniniai baltymai. Elektronų pernešimo grandin÷, ATP sintez÷s fermentai išsid÷sto mitochondrijų vidin÷je membranoje. Fotosintez÷s šviesos stadija - saul÷s šviesos sug÷rimas, elektronų pernešimas, NADP redukcija, ATP sintez÷, vandens fotoliz÷ yra procesai, kuriuose dalyvauja baltymai išsid÷stę chloroplastų, fotosintetinančių bakterijų membranose. Įvairūs membranų komponentai yra atsakingi už tarpląstelinius kontaktus,

208

208

recepciją. Nervinio impulso pernešime pagrindinį vaidmenį atlieka membranos ir jose esantys baltymai. 6.1 Bendrosios biologinių membranų savyb÷s.

Biologin÷s membranos yra plokščios struktūros, kurios sudaro uždaras ertmes. Daugumos membranų storis nustatytas įvairiais metodais yra 6-10nm. Pagrindiniai membranų komponentai yra lipidai, baltymai ir angliavandeniai . Baltymų ir lipidų santykis yra įvairus ir gali kisti nuo 1:4 iki 4:1. Membranos, kuriose vyksta intensyvi medžiagų apykaita turi daugiau baltymų, pvz. mitochondrijų vidin÷ membrana. Tokiose membranose, kurių pagrindin÷ funkcija yra izoliuoti ląstel÷s turinį nuo aplinkos (nervų mielino apdangalas), lipidai sudaro iki 80%. Membraniniai lipidai yra amfifiln÷s molekul÷s, vandenyje jos spontaniškai susijungia ir sudaro uždaras struktūras, sudarytas iš dviejų lipidų molekulių sluoksnių. Susidariusio lipidinio dvisluoksnio struktūra palaikoma hidrofobin ÷s sąveikos. Lipidinis dvisluoksnis nepralaidus hidrofilin÷ms medžiagoms. Lipidiniame dvisluoksnyje išsid÷sto baltymai, kurie atsakingi už įvairias membranų funkcijas – pernešimo, receptorines, fermentines. Membranų lipidai ir baltymai išsid÷sto asimetriškai. Membranos yra skystakristalin÷s struktūros, baltymų ir lipidų molekul÷s juda membranoje.

6.2 Biologinių membranų chemin÷ sud÷tis.

Pagrindin÷s membranų sud÷tin÷s dalys yra baltymai ir lipidai . Lipidai sudaro barjerą medžiagų per÷jimui, tuo tarpu baltymai membraną padaro selektyvią, jie katalizuoja membranose vykstančias reakcijas. Angliavandenių kiekis nedidelis (<5%), jie yra prisijungę prie baltymų (glikoproteinai) arba lipidų (glikolipidai). 6.2.1 Membraniniai lipidai

Mielino membranoje rasta per 1500 skirtingų lipidų. Daugumos randami tiktai p÷dsakai, apie 30 sutinkami didesniais kiekiais. Eukariotų ląstelių membranų pagrindiniai lipidai yra fosfolipidai, glikolipidai ir cholesterolis. Membranose vyrauja penkios fosfolipidų rūšys: fosfatidilcholinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilglicerolis ir sfingomielinas. Dažnai sutinkami nedideli kiekiai fosfatidilinozitolio. Gyvūnų ląstel÷se gausiausi fosfolipidai yra fosfatidilcholinas, o bakterijose fosfatidiletanolaminas. Kiekviena biologin÷ membrana turi jai charakteringą lipidų sud÷tį. Smegenų audinio membranose yra didelis kiekis fosfatidilserino, sfingolipidų, tuo tarpu širdies ir plaučių membranose daug fosfatidilglicerolio. E.coli ląstel÷se yra per 80% fosfatidiletanolamino, 15% fosfatidilglicerolio ir 5% difosfatidilglicerolio (kardiolipino). Dideli kardiolipino kiekiai randami tiktai bakterijose ir vidin÷je mitochondrijų membranoje. Mitochondrijose, endoplazminiame tinkle ir branduolio membranose beveik nerandama sfingomielino. Plazmin÷je membranoje, endoplazminiame tinkle, chloroplastuose yra glikolipidų. Cerebrozidų ir jų sulfato esterių ypatingai gausu mieline. Gramneigiamų bakterijų išorin÷se membranose randami lipopolisacharidai.

Cholesterolis sudaro per 17% mielino lipidų, jis randamas taip pat plazmin÷je membranoje. Tačiau jis nesutinkamas bakterijose ir labai nežymus kiekiai yra mitochondrijose.

Lipidai skiriasi netiktai pagal savo hidrofilinę galvą, bet ir riebalų rūgščių sud÷timi. Lipidai, turintys tą pačią galvą, dažniausiai yra mišinys su skirtingomis riebalų rūgštimis, tod÷l reik÷tų naudoti terminus fosfatidilcholinai, fosfatidilserinai ir kiti.

Lipidų struktūros yra nagrin÷jamos skyriuje “5.Lipidai”. 6.2.2 Fosfolipidų sudaromos struktūros

209

209

Reikia pažym÷ti, kad į membranas sudarantys lipidai yra amfifilin ÷s medžiagos, turinčios hidrofobinę uodegą ir hidrofilinę galvą. Fosfolipidai labai blogai tirpsta vandenyje (~10-10M) tod÷l stengiasi sudaryti struktūras, kuriose hidrofobiniai radikalai būtų nukreipti į nepolinę aplinką, o hidrofiliniai sudarytų ryšius su vandeniu. Priklausomai nuo lipidų rūšies, nuo jų koncentracijos, nuo tirpiklio, lipidai sudaro įvairias struktūras – monosluoksnį, dvisluoksnį, uždaras membranines pūsleles, heksagonalinę, kūbinę ir kitas struktūras.

Energetiškai patvariausia ir dažniausiai sutinkama struktūra yra fosfolipidinis dvisluoksnis. Hidrofobin÷s riebalų rūgščių angliavandenilin÷s grandin÷s suart÷ja ir suformuoja dvisluoksnį. Hidrofobin÷s uodegos kompaktiškai išsid÷sto dvisluoksnio viduje ir tarpusavyje sudaro hidrofobinius ryšius. Polin÷s galvut÷s nukreiptos į vandens fazę ir vandeniliniais ryšiais susijungia su vandeniu.Hidrofobin ÷ sąveika atsakinga už dvisluoksnio stabilumą. Ši dvisluoksn÷ lipidin÷ struktūra yra visų biologinių membranų pagrindas.

6.2 pav. Fosfolipidinis dvisluoksnis. Amfifilinių fosfolipidų angliavandenilin÷s uodegos

nukreiptos į dvisluoksnio vidų, o polin÷s galvut÷s yra išor÷je ir sąveikauja su vandeniu. Dvisluoksnio susidarymas priklauso nuo lipidų sud÷ties, nuo santykio lipidų ir tirpiklio.

Vandenyje toks plokščias dvisluoksnis yra nestabilus, jo šonai sulimpa ir susidaro uždaros sferin÷s pūslel÷s, kurios vadinamos liposomomis. Pūslelių vidin÷ ertm÷ yra atskirta nuo išor÷s membrana, jos viduje gali būti įvairios biologiškai aktyvios medžiagos, jonai. Į tokios pūslel÷s membraną galima įjungti baltymus tada gaunamos proteoliposomos. Jos naudojamos kaip modelin÷s sistemos tiriant membranų struktūrą, pralaidumą, baltymų įsijungimą, jų veikimo mechanizmus.

Tam tikrose sąlygose fosfolipidai gali suformuoti netiktai dvisluoksnis. Susidariusios įvairios struktūros (lipidų polimorfizmas) atlieka svarbų vaidmenį daugelyje biologinių procesų.

Esant atitinkamai lipidų koncentracijai, vandenyje jie sudaro miceles. Lipidų monosluoksnio riebalų rūgščių angliavandenilin÷s liekanos nukreiptos į micel÷s vidų, o galvos kontaktuoja su vandeniu sudarydamos vandenilinius ryšius. Miceles suformuoja ir riebalų rūgštys. Labai svarbų vaidmenį micel÷s (chilomikronai, didelio ir mažo tankio lipoproteinines dalel÷s) atlieka acilglicerolių virškinime, pernešant triacilglicerolius, cholesterolį, fosfolipidas.

Esant Ca2+ kai kurie fosfolipidai sudaro išvirkščią heksagonalinę HII faz÷. Fosfolipidai suformuoja tvarkingai išrikiuotus heksagonaline tvarka cilindrus, kuriuose hidrofilin÷s galvut÷s nukreiptos į jų vidų, hidrofobin÷s uodegos yra cilindro išor÷je. Chloroplastuose galaktozildiacilgliceroliai nesudaro dvisluoksnių, o dominuoja heksagonalin÷s faz÷s struktūros. Šiuo metu plačiai tyrin÷jama trijų dimensijų kubin÷ faz÷

210

210

(D)

6.3 pav. Lipidų polimorfizmas

A - micel÷s, B – liposomos, C – heksagonalin÷ faz÷, D –kubin÷ faz÷

6.2.3 Fosfolipidinio dvisluoksnio judrumas Lipidai, esantys dvisluoksnio sud÷tyje yra judrūs. Jie gali suktis apie savo ašį, angliavandenilin÷s uodegos švytuoja. Fosfolipidai dvisluoksnio paviršiuje plaukioja, tai yra taip vadinama šonin÷ (lateralin÷) difuzija. Dviejų fosfolipidų molekulių pasikeitimas vietomis membranos plokštumoje vyksta ~107 s-1 dažniu. Membraniniai lipidai gali peršokti iš vienos membranos pus÷s į kitą. Šis procesas vadinamas “flip- flop” ir yra labai l÷tas. Hidrofilin÷s galvos per÷jimas per hidrofobinę dvisluoksnio dalį energetiškai nenaudingas, viena molekul÷ pasikeičia su kita per kelias minutes ar net kelias paras. Organizme ši procesą greitina baltymas flippaz÷.

6.4. pav. Fosfolipidų judrumas dvisluoksnyje.

Fosfolipidinis dvisluoksnis gali būti dviejuose būviuose kietame- g÷lio ir skystame – skystakristaliniame, kurios skiriasi savo takumu. Temperatūra, kurioje vienas būvis pereina į kitą, vadinama fazinio per÷jimo temperatūra (Tf). Žemiau fazinio per÷jimo temperatūros dvisluoksnio angliavandenilin÷s grandin÷s yra pilnai ištemptos ir glaudžiai supakuotos, jų judrumas mažas, membrana yra kieta (6.5 pav.). Aukštesn÷je temperatūroje lipidų judrumas padid÷ja, atstumai tarp angliavandenilinių grandinių išauga, padid÷ja plotas, užimamas vieno lipido, membrana suplon÷ja. Membrana pereina į skystakristalinį būvį (pav.). Membranos fazinio per÷jimo temperatūra priklauso nuo daugelio faktorių. Kuo ilgesn÷ riebalų rūgščių grandin÷, tuo didesn÷ tarpusavio hidrofobin÷ sąveika, tuo membrana kietesn÷. Įvedus nesočias riebalų rūgštis ar rūgštis su šakota grandine, fazinio per÷jimo temperatūra sumaž÷ja. Daugumos biologinių membranų fazinio per÷jimo temperatūra yra tarp 10-400 C.

211

211

6.5 pav. Dvisluoksnio struktūra skystakristaliniame (A) ir g÷lio (B) būvyje.

Fosfatidilcholino ir fosfatidiletanolamino polin÷s galvos užima panašų plotą kaip ir angliavandenilin÷s grandin÷s. Tarp šių funkcinių grupių susidaro vandeniliniai ryšiai, kurie stabilizuoja dvisluoksnį ir didina Tf. Neigiamai įkrautos fosfato grup÷s destabilizuoja membraną. Pažeminus pH, prid÷jus dvivalenčių jonų, krūvis yra ekranuojamas ir padidinama Tf.

Cholesterolis sumažina skystos membranos takumą, kadangi jo plokščias ir nejudrus žiedas neleidžia laisvai jud÷ti angliavandenilin÷m grandin÷ms. Tačiau, esant temperatūrai žemiau Tf cholesterolis didina membranos takumą, nes suardo tvarkingą grandinių išsid÷stymą.

Bakterijos, patekusios į temperatūras žemesnes už Tf, modifikuoja savo membraninius lipidus, sintetinamos daugiau lipidų su nesočiomis riebalų rūgštimis, tuo palaikydamos membranos skystakristalinę struktūrą. E.coli mutantai, nesugebantys sintetinti nesočių riebalų rūgščių, negali išgyventi nepalankiomis sąlygomis. Bacillus subtillis, kuriose beveik n÷ra nesočių riebalų rūgščių ir dauguma kitų gramteigiamų bakterijų sintetina šakotas riebalų rūgštis tuo pačiu sumažina membranos lydymosi tašką. Dar viena galimyb÷ sumažinti fazinio per÷jimo temperatūrą yra sintetinti riebalų rūgštis, turinčias žiedus, pavyzdžiui ciklopropaną.

Kod÷l membraniniai lipidai turi būti judrūs, kod÷l membrana neturi būti kieta? Biologinių membranų takumas labai svarbus fiziologinis veiksnys. Baltymams, katalizuojant chemines reakcijas, pernešant per membranas medžiagas, jonus, makromolekul÷s konformacija kinta. Membranai per÷jus į g÷lio fazę, lipidų ir baltymų konformacinis judrumas sul÷t÷ja ir sumaž÷ja jų funkcinis aktyvumas.

1970m Frai ir Edidin (L.D.Frye ir M.A.Edidin) eksperimentiškai nustat÷ membranos baltymų judrum ą. Jie naudojo fluorescuojančius antikūnus kurie specifiškai prisijungia prie atitinkamų baltymų. Žmogaus ląsteles pažym÷jo raudonai fluorescuojančiais antikūnais, o prie pelių ląstelių buvo prijungti žaliai švytintys antikūnai. Suliejus šias ląsteles buvo gautos hibridin÷s ląstel÷s. Tuojau po suliejimo viena hibrido dalis švyt÷jo žaliai, kita – raudonai. Po 40min specifiškai pažym÷ti baltymai susimaiš÷ ir hibridin÷je ląstel÷je fluorescuojanti žym÷ pasiskirst÷ tolygiai.

Membranų asimetriškumas. Yra nustatyta, kad vidin÷ ir išorin÷ membranos pus÷s ženkliai skiriasi tiek lipidų, tiek baltymų sud÷timi. Plazmin÷je membranoje fosfatidilcholinas išsid÷sto išorin÷je membranos dalyje, o aktyvios fosfatidilserino ir fosfatidiletanolamino aminogrup÷s nukreiptos į citozolio pusę. Glikolipidai paprastai yra plazmin÷s membranos išor÷je ir angliavandenių grandin÷s sąveikauja su supančiu vandeniu. Bendra taisykl÷ yra, kad

A B

212

212

angliavandeniai prijungti prie baltym ų ar lipid ų yra išoriniame ląstel÷s paviršiuje arba prijungti prie eksportuojam ų iš ląstel÷s medžiagų. Kobros nuodų fosfolipaz÷ A2 atskelia nuo fosfatidilcholino riebalų rūgštį, susidaręs lizofosfolipidas veikia kaip detergentas. Avių eritrocitai atsparūs fosfolipazei A2, kadangi išorin÷je dvisluoksnio pus÷je sutinkamas sfingomielinas, o fosfatidilcholinas ir fosfatidiletanolaminas yra vidin÷je dvisluoksnio pus÷je.

6.2.4 Membraniniai baltymai. Dvisluoksnio lipidai yra barjeras hidrofilinių medžiagų pernašai per membraną. Baltymai atsakingi už selektyvią medžiagų pernašą, už fermentines reakcijas vykstančias membranose, už signalo pri÷mimą ir perdavimą ir kitas funkcijas.

Su membranomis susijusius baltymus galima suskirstyti į tris rūšis:

a) paviršiniai, b) integralieji, c) inkariniai baltymai.

Paviršiniai baltymai silpnais elektrostatiniais, vandeniliniais ryšiais prijungti prie membranos paviršiaus ir lengvai nuo jos pašalinami, pakeitus tirpalo pH, joninę j÷gą. Integralieji baltymai vieną ar kelis kartus perveria membraną ir išskiriami tiktai ją suardžius, pavyzdžiui detergentais. Inkariniai baltymai hidrofobiniu inkaru prijungti prie membranos dvisluoksnio ir gali jud÷ti membranos paviršiuje (skyrius 5.7)..

6.6 pav Membraniniai baltymai. Pavir6iniai baltymai prisijungę prie membranos paviršiaus, integraliniai vieną ar kelis kartus perveria membraną, inkariniai baltymai hidrofobiniu inkaru prijungti prie membranos.

Integralieji membraniniai baltymai sudaro per 1/3 visų genų produktų, jų struktūros tyrimas yra labai sud÷tingas, reikalaujantis laiko ir didelių sąnaudų procesas. Šiuo metu (2005m) nustatyta per 100 integraliųjų baltymų struktūrų su skiriamąja geba 0,4nm. Membraninių baltymų struktūras galima surasti internete: (http//blanco.biomol.uci.edu/membrane_proteins_xtal.html). Santykinai nedidelis nustatytų membraninių baltymų struktūrų kiekis sąlygojamas sunkumais susijusiais su baltymų ekspresiją, gryninimu ir kristalizacija.

Integraliųjų baltymų išsid÷stymas membranoje Membraniniai (integralieji) baltymai savo savyb÷mis skiriasi nuo tirpių. Jų struktūroje

galima išskirti dvi hidrofilines sritis, kurios yra skirtingose membranos pus÷se ir hidrofobinę dalį

213

213

panirusią membranoje. Nustačius aminorūgščių sud÷tį sunku pasakyti ar tai integralusis baltymas ar tirpus citozolyje. Integraliųjų baltymų charakteringą savyb÷ yra ta, kad tos polipeptidin÷s grandin÷s dalys, kurios yra membranoje sudarytos iš hidrofobinių aminorūgščių.

Polipeptidin÷ grandin÷ membranoje yra struktūrizuota, ji sudaro energetiškai stabiliausią struktūrą, peptidin÷ grup÷s –CO deguonis ir –NH vandenilis tarpusavyje sudaro vandenilinius ryšius, o ne kontaktuoja su membranos hidrofobin÷ apsuptimi. Jeigu vandeniliniai ryšiai yra toje pačioje polipeptidin÷je grandin÷je, turime αααα spiralę, jeigu ryšiai suformuojami tarp atskirų grandinių susidaro ββββ struktūrą. Hidrofobin÷s membranos dalies storis yra ~0,4nm, jeigu baltymas sudaro α spiralę, tai membraną perveria apie 20 aminorūgščių, jeigu β struktūrą tai membranoje esanti polipeptidin÷s grandin÷s dalis uir ~10 aminorūgščių likučių.

Polipeptidin÷ grandin÷ gali vieną ar kelis kartus perverti dvisluoksnį.

6.7 pav. Polipeptidin÷s grandin÷s išsid÷stymas membranoje. Polipeptidin÷ grandin÷ vieną ar kelis kartus perveria membraną.

Eritrocitų membranos baltymas glikoforinas vieną kartą α−spiraliniu segmentu (1TM) perveria membraną. Bakteriorodopsinas turi 7 transmembraninius (7TM) α segmentus.

6.8 pav. Glikoforino išsid÷stymas membranoje

Pirmas integralusis membraninis baltymas, kurio struktūra buvo nustatyta yra bakteriorodopsinas išskirtas iš halofilinių bakterijų Halobacterium halobium. Šios bakterijos

214

214

auga ežeruose, kur NaCl koncentracija siekia 4,3M, ir suyra, esant druskos koncentracijai 2,0M (NaCl koncentracija jūros vandenyje yra apie 0,6M). Bakterijų membranoje nustatyti membraniniai lopin÷liai purpurin ÷s membranos, kuriose vienintelis baltymas yra bakteriorodopsinas. Šis baltymas turi 247 aminorūgštis ir veikia kaip protonin÷ pompa, apšvietus bakterijas, jis perneša protonus iš ląstel÷s į išorę. Susidaręs protonų gradientas panaudojamas ATP sintezei. Šviesą sugeria pigmentas retinalis, kovalentiškai prijungtas prie Lys216. Analogiškas chromoforas randamas ir rodopsine, baltyme atsakingame už reg÷jimą. Bakteriorodopsinas purpurin÷se membranose sudaro tvarkingą dviejų dimensijų kristalą. Tai leido Hendersonui ir Unvinui (R.Henderson ir N.Unwin) naudojant elektronin÷s mikroskopijos metodą, nustatyti šio baltymo dviejų dimensijų (2D) erdvinę struktūrą (~1,0nm skiriamoji geba). Praeito šimtmečio pabaigoje buvo gauti bakteriorodopsino kristalai (kristalų gavimui s÷kmingai panaudota kūbin÷ faz÷) ir nustatyta 3D struktūra. Bakteriorodopsino molekul÷je 7 α spiraliniai segmentai (po 25 aminorūgštis) beveik statmenai perveria membraną. Hidrofobiniai membraniniai segmentai sujungti, už membranos ribų esančiais hidrofiliniais polipeptidais. Viduje membranos esantys poliniai aminorūgščių šoniniai radikalai suformuoja kanalą, kuriuo keliauja protonai.

6.9 pav. Bakteriorodopsino polipeptidinių grandinių išsid÷stymas membranoje.

Pirmas membraninis baltymas, kurio nustatyta erdvin÷ (3D) struktūra buvo fotosintetiniai reakcijos centrai išskirti iš purpurinių bakterijų Rhodopseudomonas viridis ir Rhodobacter sphaeroides. Baltyminis kompleksas sudarytas iš trijų nevienodų subvienetų (M, L ir H) kurie suriša 4 chlorofilo molekules, keturis kitus chromoforus ir neheminę geležį. Šis reakcijos centras buvo nustatytas 1984m. Michelio ir bendradarbių (H.Michel, J.Deisenhofer ir R.Huber). Baltymas savo hidrofobiniais spiraliniais segmentais 11 kartų perveria membraną, hidrofilin÷s baltymo dalys nukreiptos už membranos.

Šiuo metu trijų dimensijų (3D) tretin÷s struktūros žinomos per 100 membraninių baltymų tai yra mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷s komponentai, baltymai dalyvaujantys fotosintez÷je, transporteriai, receptoriai, fermentai.

Gramneigiamų bakterijų, mitochondrijų ir chloroplastų išorin÷je membranoje rasti baltymai porinai , kurie membranoje suformuoja kanalus, praleidžiančius medžiagas mažesnes nei 600Da. Nustačius porinų tretinę struktūrą buvo parodyta, kad jie membranoje nesudaro α spiral÷s, o perveria membraną ištemptų β juostų formoje, kurios susijungia ir sudaro uždarą vandeniu užpildytą statinę, kuri praleidžia hidrofilines÷ms medžiagoms. OmpF ir PhoE išskirti iš E.coli kiekvienas monomeras membranoje sudaro statinę iš 16 antilygiagrečių β struktūrų. FhuA turi 22 β juostas ir perneša E.coli geležies-ferichromo kompleksą per išorinę membraną.

215

215

6.10 pav. Porino FhuA struktūra

6.3 Biologinių membranų struktūra

Biologin÷s membranos sudarytos iš baltymų, lipidų. Jų sud÷tyje yra nedidelis kiekis angliavandenių

Dvisluoksn÷s lipidin÷s membranos buvimas pirmą kartą buvo pasiūlytas Horterio ir Grendelio (E.Gorter F.Grendel), kurie nustat÷, kad ekstrahuotų iš eritrocitų membranos lipidų monosluoksnio užimamas plotas yra du kartus didesnis nei eritrocito paviršius. Jų modelyje neatsispind÷jo membraniniai baltymai. 1935m. Dausonas ir Danieli (J.D.Davson ir J.Danielei), o kiek v÷liau Robertsonas

6.11 pav. Biologinių membranų modelis.

(J.D.Robertson) prie dvisluoksn÷s lipidin÷s membranos prijung÷ baltymus. Membraninių baltymų išsid÷stymas, jų tarpusavio sąveika buvo įvertinta 1972m. Singerio ir Nikolsono (S.J.Singer, G.L.Nicolson) pasiūlytame takios mozaikin÷s membranos sandaros modelyje. Jie galvojo, kad membranos pagrindas yra lipidų dvisluoksnis, kuris yra skystas kaip aliejus ir kuriame plaukioja baltymai. Baltymai membranose išsid÷sto atsitiktinai ir sudaro tarytum mozaikos vaizdą.

Kai kurie baltymai yra silpnai prisitvirtinę prie membranos paviršiaus, kiti integralieji baltymai įsiterpia į dvisluoksnį. Angliavandeniai prisijungę prie baltymų arba prie lipidų. Toks

216

216

membranos sandaros modelis yra patvirtinamas elektronin÷s mikroskopijos, rentgeno spindulių difrakcijos ir kitais metodais.

6.4 Medžiagų pernešimas pro biologines membranas

Viena iš būdingiausių ir svarbiausių gyvų organizmų savybių yra skirtingos medžiagų koncentracijos palaikymas ląstel÷s viduje ir ir už jos ribų, d÷l membranų selektyvaus pralaidumo. Jonų, aminorūgščių, angliavandenių, kitų maisto medžiagų, neurotransmiterių, žalingų ląstelei produktų pernešimas per biologines membranas reikalauja daugelio specializuotų pernešimo sistemų.

Medžiagos iš tirpalo su didesne koncentraciją pereina į tirpalą su mažesne difuzijos keliu. Per÷jimas aprašomas Fiko pirmuoju difuzijos d÷sniu

= x

c D- J

δδ

J – medžiagos kiekis pernešamas per laiko vienetą, D – difuzijos koeficientas, δc/δx medžiagos cheminis gradientas

Jeigu du tirpalus atskirsime pusiau pralaidžia membrana, medžiagos koncentracijai vienoje membranos pus÷je padid÷jus, molekul÷s difunduos iš didesn÷s koncentracijos tirpalo į mažesnę. Koncentracijai abiejose membranos pus÷se susilyginus, molekul÷s jud÷s abiem kryptim vienodai ir jų koncentracija tirpaluose nesikeis.

6.4.1 Medžiagų pernešimo pro membranas bendra charakteristika

Medžiagų pernešimą per membranas galime skirstyti pagal du kriterijus:

a) pagal pernešimo mechanizmą, b) pagal energijos panaudojimą.

Biologinių membranų pagrindą sudaro fosfolipidinis dvisluoksnis, kuris nepralaidus daugumai ląstel÷s funkcionavimui reikalingų medžiagų. Pro dvisluoksnį praeina lipiduose tirpios hidrofobin÷s medžiagos (steroidiniai hormonai, lipiduose tirpūs vitaminai, kai kurie vaistai), dujos (CO2, O2), vanduo, nedidel÷s molekulin÷s mas÷s nepolin÷s molekul÷s (etanolis, karbamidas, glicerolis). Šios medžiagos tirpsta fosfolipidų dvisluoksnyje ir pereina pro membraną paprastos difuzijos būdu. Lipidinis dvisluoksnis yra nelaidus turinčioms krūvį molekul÷ms (jonams), krūvio buvimas ir molekul÷s hidratacija neleidžia medžiagai patekti į dvisluoksnio hidrofobinę dalį. Lipidinis dvisluoksnis yra 109 kartų laidesnis vandeniui nei tokiems mažiems jonams kaip K+ ar Na+. Tačiau į ląstelę, organeles turi patekti įvairios hidrofilin÷s medžiagos – jonai, aminorūgštys, angliavandeniai, nukleozidai, baltymai, nukleorūgštys ir kiti vandenyje tirpūs komponentai. Jų transportui būtinos pernašos sistemos, specialūs membraniniai baltymai. Šios medžiagos praeina palengvintos difuzijos keliu. Paprasta difuzija nuo palengvintos skiriasi keliais kriterijais. Paprastos difuzijos metu, pernešimo greitis tiesiogiai priklauso nuo medžiagos koncentracijos. Did÷jant medžiagos koncentracijai, palengvintos difuzijos atveju pasiekiamas įsotinimas ir pernešimo greitis neauga. Palengvintos difuzijos metu, procesas slopinamas specifiniais slopikliais

217

217

6.12 pav. Medžiagų pernešimo per membraną priklausomyb÷ nuo subarto koncentracijos paprastos(A) ir palengvintos difuzijos metu .

Beveik visi transmembraniniai medžiagų pernešimai vykdomi integraliųjų membraninių baltymų, kurie kartais funkcionuoja kartu su receptoriais ar receptorių domenais taipogi su citozoliniais energiją transformuojančiais ar reguliatoriniais baltymais. Kiekvienas toks kompleksas vadinamas transportinis baltymas, pernašos sistema, transporteris ar permeaz÷. Šie visi pavadinimai naudojami ekvivalentiškai. Šios pernašos sistemos padidina membranos pralaidumą atitinkamoms medžiagoms. Dauguma pernašos sistemų yra kataliziniai kompleksai analogiški fermentams.

Transportiniai baltymai yra skirstomi į dvi grupes:

a) nešikliai b) kanalai.

6.13 pav. Medžiagų pernešimas kanalais (A) ir nešikliais (B).

218

218

Nešiklis yra integralusis baltymas, kuris vienoje membranos pus÷je prie specifinių substratą surišančių vietų prijungia pernešamą medžiagą, nešiklio molekul÷ juda membranoje ir atpalaiduoją pernešamą medžiagą kitoje membranos pus÷je.

Kanalai taip pat yra integralieji baltymai, viduje molekul÷s sudarantys dažniausiai hidrofilinę ertmę pro kurią ir praeina reikalinga medžiaga. Pernešama medžiaga prisijungia prie kanalo vienoje membranos pus÷je, pereina kanalu ir atsipalaiduoja kitoje membranos pus÷je. Kanalų pralaidu,mas gali būti valdomas. Pernešimas pro kanalus vyksta greičiau nei nešiklių pagalba.

Labai dažnai abipus membranos palaikome skirtinga medžiagų koncentracija ir medžiagos turi būti pernešamos prieš koncentracijos gradientą. Pagal energetinius kriterijus medžiagų pernešimą skirstome į pasyvią pernašą (medžiaga keliauja pagal koncentracijos gradientą) ir aktyvią pernašą. Aktyvios pernašos metu medžiaga iš mažesn÷s koncentracijos pereina į didesn÷s koncentracijos tirpalą. Šio proceso metu laisvosios energijos pokytis (∆G) yra teigiamas, tod÷l turi būti panaudojama energija. Tai yra saul÷s šviesos, ATP hidroliz÷s, oksidacinių redukcinių procesų metu išsiskyrusi energija. Aktyvios pernašos keliu ląstel÷ iš aplinkos paima jai reikalingas medžiagas ir jas koncentruoja arba šalina ląstel÷je susidariusias toksinius junginius.

Medžiaga per membraną yra pernešama viena, tačiau procesas gali būti susijęs ir su kitos molekul÷s transportu. Šiems procesams aprašyti yra priimti keli terminai. Jeigu dvi medžiagos pernešamos ta pačia kryptimi, šis procesas vadinamas sąnaša (simportu) (pav. A). Jeigu jos keliauja į priešingas puses turime priešnaša (antiportą) (pav. B), medžiagos jud÷jimas viena kryptimi vadinamas viennaša (uniportu) (pav. C).

.

6.14 pav. Medžiagų pernešimo per membraną keliai: viennaša(A), sąnaša(B), priešnaša(C).

Dažniausiai per membraną pernešama nepakitusi medžiaga. Tačiau yra keletas transporterių, kurie modifikuoja pernešamą substratą. Geriausiai charakterizuota yra bakterijų fosfotransferazin÷ sistema (PTS). Ji pernešimo metu fosforilina angliavandenius, naudodama fosfoenolpiruvatą, kaip fosforilgrup÷s donorą. Angliavandeniai iš išor÷s keliauja per PTS ir į citoplazmą patenka kaip sacharidų fosfatai (gliukoz÷s -, fruktoz÷s fosfatai). Procesai, kurių metu pernešama medžiaga yra modifikuojama yra vadinami grupių translokacija

Eukariotų ląstel÷se kai kurios medžiagos į ląstelę, iš ląstel÷s arba ląstel÷s viduje tarp organelių pernešamos membranin÷se pūslel÷se. Endocitoz÷s metu baltymai, kitos medžiagos

219

219

patenka iš aplinkos į ląstelę. Nuo receptorių priklausomoje endocitoz÷je baltymai prisijungia prie ląstel÷s plazmin÷s membranos paviršiaus esančio receptoriaus. Membrana įsigaubia ir susiformuoja membranin÷ pūslel÷, kurios viduje yra pernešama medžiaga. Viduje ląstel÷s pūslel÷ atsipalaiduoja nuo membranos ir citozolyje susilieja su endosoma, susidarant lizosomai. Lizosominiai fermentai suskaido baltymus, nukleorūgštis, polisacharidus ir kitas medžiagas, o susidarę monomerais išeina į citozolį.

Egzocitoz÷ yra panašus į endocitozę procesas, vykstantis priešinga kryptimi. Sekretuojami baltymai sintetinami endoplazminiame tinkle, membranin÷se pūslel÷se jie pernešami į Goldžio aparatą, kur jie modifikuojami ir rūšiuojami. Membranin÷s pūslel÷s, kurių viduje yra makromolekul÷s, atsipalaiduoja nuo Goldžio aparato ir nukeliauja iki plazmin÷s membranos, susilieja su ja ir sekretuojami baltymai atsipalaiduoja už ląstel÷s ribų.

Pūslelin÷s pernašos būdu ląstel÷je tarp įvairių kompartmentų pernešami baltymai, lipidai, neuromediatoriai ir kitos medžiagos.

6.4.2 Medžiagų pernešimas kanalais

Kanalai arba poros yra transmembraniniai baltymai, kurie suformuoja ertmę, pro kurią praeina jonai ir įvairios molekul÷s. (Poros terminas paprastai naudojamas apibūdinant gramneigiamų bakterijų ir mitochondrijų išorin÷s membranos baltymus (porinus), o kanalas – gyvulinių ląstelių membranose). Atitinkamo dydžio, krūvio, struktūros medžiagos gali greitai difunduoti per porą ar kanalą bet kuria kryptimi, procesas nereikalauja energijos vyksta pasyvi pernaša. Kanalų vidus dažnai užpildytas vandeniu, jie praleidžia įvairios molekulin÷s mas÷s medžiagas. Vieni kanalai pasižymi labai dideliu specifiškumu (pvz. K+ kanalas 10000 kartų specifiškesnis K+ negu Na+). Pro bakterijų išorin÷s membranos porinus praeina medžiagos, kurių molekulin÷ mas÷ <600Da. Tokie porinai gali būti specifiški atitinkamoms medžiagoms pvz. maltozei, tuo tarpu visai nespecifiški jonams. Vienoms medžiagoms praeinant pro kanalą galime pasiekti įsotinimą, kitoms ne.

Kanalų struktūros ir veikimo mechanizmų nustatymas vyksta labai sparčiai. Kanalą gali sudaryti transmembraninio baltymo α spiral÷s, kurių poliniai radikalai nukreipti į molekul÷s vidų. Kanalo vidus dažniausiai yra hidrofilinis, jis gali būti užpildytas vandeniu. Jonas, prisijungdamas prie hidrofilinių radikalų keliauja skersai membranos peršokdamas nuo vienos funkcin÷s grup÷s ant kitos.

Gramneigiamų bakterijų išorin÷je membranoje rasta kitokios struktūros homotrimerinių transmembraninių baltymų šeima vadinamu porinais, kurie sudaro vandeniu užpildytas poras. Porinai leidžia bakterijų ląstel÷ms sąveikauti su aplinka, per juos pasyvios pernašos keliu praeina mažos (<600 Da) hidrofilin÷s molekul÷s. Dauguma porinų yra nespecifiniai kanalai (OmpF ir OmpC), kurių laidumą reguliuoja aplinkos pokyčiai. Keletas porinų specifiškai perneša tam tikras medžiagas. Maltoporinas, dar vadinamas LamB specifiškai praleidžia į E.coli ląsteles maltozę ir maltodekstrinus. Maltoporinas taip pat yra fago λ receptorius. FhuA perneša E.coli geležies-ferichromo kompleksą per išorinę membraną į periplazmą. Sumaž÷jus terp÷je fosfato, indukuojama sintez÷ specifinio fosfatui porino PhoE.

Porą suformuoja ištemptos polipeptidin÷s grandin÷s antilygiagret÷s β juostos,. Jos tarpusavyje susijungia vandeniliniais ryšiais ir sudaro β statinę, kurios diametras yra apie 1,0nm. Juostų, kurias jungia kilpos, skaičius yra įvairus - LamB porinas sudarytas iš 18, OmpF – 16, o

220

220

PhuA iš 22 juostų. Hidrofobiniai aminorūgščių radikalai sąveikauja su membranos fosfolipidų angliavandeniliniais radikalais. Kilpos, nukreiptos į ląstel÷s išorę yra ilgesn÷s ir labiau variabilios. Jos gali įsiterpti į statin÷s vidų ir reguliuoti poros laidumą. Siauriausioje poros vietoje yra poliniai aminorūgščių radikalai, kurie sąlygoja pernešamos medžiagos specifiškumą. Susirišus išorin÷je membranos pus÷je pvz. ferichromo-Fe kompleksui su porinu, kinta porino konformacija, kompleksas patenka į porino vidų ir translokuojamas į periplazmą.

Panašūs kanalai rasti mitochondrijų išorin÷je membranoje

Daugelį metų buvo manoma, kad vandens pra÷jimui nereikalingi baltymai. Dalis vandens praeina d÷l fosfolipidiniame dvisluoksnyje susidariusių kinkų. Šiuo metu yra rasti baltymai akvaporinai kurie dalyvauja vandens per÷jime inkstuose, smegenyse. Už akvaporinų struktūros ir funkcijų nustatymą 2003mNobelio premija suteikta Agrui (P.Agre).

6.4.3 Kalio jonų kanalai. Šie kanalai vaidina labai svarbų vaidmenį ląstel÷je palaikant K jonų koncentraciją,

nervinio impulso perdavime, širdies funkcionavime, K+ reabsorbcijoje inkstuose. Yra nustatyta daug genų, koduojančių kalio jonų kanalus. Tai yra integralieji baltymai dažniausiai 2 ar 6 kartus perveriantys membraną. Jie selektyviai praleidžia kalio jonus, laidumas K+ yra 10000 kartų didesnis nei Na+.

6.15 pav. K+ jonų kanalų polipeptidin÷s grandin÷s išsid÷stymas membranoje.

A - įtampos valdomas K+ kanalas, B - KcsA kanalas.

Kaip veikia K+ kanalas, kas sąlygoja jo specifiškumą ir didelį per 108 jonų/s pralaidumą? 1998m buvo nustatyta K+ jonų kanalo (KcsA), išskirto iš bakterijų Streptomyces lividans, tretin÷ struktūra. Tai buvo pirmas kanalas, kurio atlikta rentgenostruktūrin÷ analiz÷ nustatytas erdvinis

221

221

išsid÷stymas membranoje ir pasiūlytas veikimo mechanizmas. Šis KcsA kanalas pagal aminorūgščių sud÷tį, veikimo mechanizmą panašus į daugelio gyvūnų kalio kanalus. Kanalas sudarytas iš 4 vienodų subvienetų. Kiekvienas subvienetas turi du transmembraninius segmentus (2TM), kuriuos jungia apie 30 aminorūgščių grandin÷. Joje randamos dvi svarbios funkcin÷s dalys – selektyvumo filtras ir poros spiral÷. Poros spiral÷ įsiterpia į dvisluoksnio vidų taip, kad α spiral÷s bipolio neigiamas krūvis yra dvisluoksnio viduje. Selektyvumo filtrą sudaro nespiralizuotos polipeptidin÷s grandin÷s Thr-Val- Gly-Tyr-Gly aminorūgštys. Jų peptidin÷s grup÷s deguonies atomai (-C=O) nukreipti į kanalo vidų ir sudaro 1,2nm ilgio porą. Viso kanalo ilgis yra ~4,5nm, jo išorin÷je pus÷je yra selektyvumo filtras, centre yra užpildyta vandeniu ertm÷, kuri jungiasi su ląstel÷s vidumi 1,8nm ilgio kanalu. Šios kanalo vidus išklotas hidrofobinių aminorūgščių šoniniais radikalais ir yra hidrofobinis.

6.16 pav. KcsA kanalo struktūra. A – kanalas sudarytas iš 4 subvienetų, kiekvienas turi po 2TM α spirales, poros spiralę ir seletyvumo filtrą. B – seletyvumo filtras, jame yra 4 K+ jonai.

Hidratuoti K+ jonai įeina į kanalą iš vidin÷s pus÷s ir prieina prie selektyvumo filtro. K+jonas dehidratuojamas ir susijungia su selektyvumo filtr ą sudarančių aminorūgščių peptidin÷s grup÷s deguonies atomais. Vienu metu filtre yra keturi K+ jonai. D÷ka koncentracijos gradiento K+ jonai juda pro membraną ir iš÷jęs iš membranos kalio jonas v÷l hidratuojamas.

Kas sąlygoja kanalo specifiškumą? Pro selektyvumo filtrą praeina tiktai K+, bet ne Na+. K+ jonų spindulys yra 0,133nm o Na+ 0,95nm. Na+ jonai yra mažesni ir sunkiau sudaro ryšius su karbonilo grup÷mis. Antra svarbus faktorius sąlygojantis selektyvumą yra hidratacijos energija. Jonas patekęs į filtr ą yra dehidratuotas, Na+ dehidratacijos energija yra didesn÷ negu K+.

222

222

Kaip reguliuojamas jonų pernešimas per membranas, kaip valdomi kanalai? Membranos pralaidumas gali būti keičiamas įvairiais būdais. L÷čiausias kelias yra reguliuojant transporterio sintezę transkripcijos lygyje. Greitesnis atsakas yra įjungti baltymus į membraną (arba pašalinti juos) suliejant pūsleles, kuriose yra pernašos baltymai, su plazmine membrana. Šis mechanizmas plačiai paplitęs, didinant gliukoz÷s pernašą į raumenų ar riebalinio audinio ląsteles. Trečias ir pats greičiausias atsakas į aplinkos kitimus, ypač paplitęs nerviniame audinyje yra valdomas kanalo atidarymas ar uždarymas. Kanalai gali būti valdomi keičiant membranos potencialą (potencialo valdomi kanalai), prijungiant ligandus (ligandų cAMP, cGMP, Ca2+) valdomi kanalai), keičiant pH, sl÷gį. Kanalo laidumas gali būti reguliuojamas dviem būdais – a) keičiantis baltymo transmembraninių segmentų konformacijai kanalas atsidaro ar užsidaro, b) ‘kamuolio ir grandin÷s’ modelis. Kanalui atsidarant, ‘kamuolio domenas’ esantis citoplazmin÷je membranos pus÷je susijungia su pora ir uždaro kanalą.

Science Express 2003m

6.17 pav. Jonų kanalo valdymas „kamuolio ir grandin÷s“ metodu. A – kanalas uždarytas, B – kanalas atidarytas,

2003 m nustatyta potencialo valdomo K+ kanalo tretin÷ struktūra. Kanalas sudarytas iš 4 subvienetų. Kiekviena polipeptidin÷ grandin÷ turi 6 transmembraninius segmentus, S5 ir S6 spiral÷s ir kilpa tarp jų sudaro kanalą, jame yra selektyvumo filtras ir poros spiral÷ ( pav. A). Ši kanalo dalis yra panaši į KcsA kanalą. Pirmi 4 segmentai (S1-S4) yra potencialo jutikliai. Labai svarbus kanalo valdyme yra S4, jame yra teigiamai įkrautų aminorūgščių arginino radikalai. Pakitus membranos potencialui S4 juda skersai membranos ir atidaro kanalą.

6.18 pav. Potencialo valdomo K+ kanalo struktūra. A- kanalas uždarytas, D – kanalas atidarytas.

223

223

6.19 pav Potencialo valdomo K+ kanalo veikimo schema. Pliusais pažym÷ti aminorūgščių arginino teigiami krūviai

į kitą pusę.

6.5 Medžiagų pernešimo energetika

6.5.1 Pasyvi pernaša Pasyvios pernašos metu tirpalas ar jame ištirpusios molekul÷s keliauja pagal

koncentracijos gradientą ir nereikalauja papildomos energijos. Vanduo, dujos, hidrofobin÷s medžiagos eina pagal koncentracijos gradientą paprastos difuzijos keliu. Kitų medžiagų pernešimui reikalingi transporteriai ir vyksta palengvinta difuzija.

Pasyvios pernašos metu į ląstelę patenka įvairios medžiagos. Eritrocitų metabolizmas priklauso nuo pastovaus gliukoz÷s patekimo iš kraujo plazmos, kur jos koncentracija siekia 5mM, į eritrocitų vidų. Gliukoz÷ pereina į eritrocitus palengvintos difuzijos keliu pagal koncentracijos gradientą dalyvaujant specialiam baltymui. Šis transporteris (GLUT1) yra integralusis baltymas, turintis 12 transmembraninių segmentų, pagreitina gliukoz÷s per÷jimą 50000 kartų, palyginus su paprasta difuzija. Transmembraninių α spiralių poliniai aminorūgščių radikalai suformuoja hidrofilinį kanalą, per kurį praeina gliukoz÷s molekul÷s. GLUT1 yra specifiškas D-gliukozei. Specifiškumas D-manozei ir D-galaktozei yra 10-20 kartų mažesnis. Kadangi gliukoz÷s koncentracija kraujo plazmoje yra apie 5mM, tai transporteris yra pilnai prisotintas substratu ir pernešimas vyksta maksimaliu greičiu.

Kepenyse gliukozę perneša kitas transporteris GLUT2, sumaž÷jus angliavandenio koncentracijai kraujuje, kepenyse intensyv÷ja glikogeno skaidymas ir susidariusi gliukoz÷ pereina į kraują. Raumenyse ir riebaliniame audinyje randamas gliukoz÷s transporteris GLUT4, jo kiekį membranoje reguliuoja insulinas. Baltymas GLUT4 ląstel÷je yra įjungtas į pūslelių membraną ir saugomas. Padid÷jus gliukoz÷s koncentracijai kraujyje, pūslel÷s susilieja su plazmine membrana ir GLUT4 pereina į plazminę membraną. Padid÷jus transporterio GLUT4 kiekiui pagreit÷ja gliukoz÷s pernešimas iš kraujo į ląsteles.

Eritrocituose yra palengvintos difuzijos sistema didinanti membranos pralaidumą bikarbonatui. Trikarboksirūgščių ciklo metu susidaręs CO2 pereina per eritrocitų membraną ir, veikiant karboanhidrazei, susjungia su H2O.

-H2O + CO2 H2CO3 HCO3 + H+

Karboanhidraz÷

224

224

Bikarbonatas grįžta į kraujo plazmą ir pernešamas į plaučius. Kadangi bikarbonato tirpumas yra žymiai didesnis nei CO2, proceso efektyvumas išauga. Plaučiuose HCO3

- pernešamas į eritrocitus, kur paverčiamas į CO2, kuris jau pašalinamas iš organizmo. Bikarbonato pernešimą per eritrocitų membraną per milijoną kartų pagreitina anijonų mainų baltymas. Šis integralusis baltymas turi 12 transmembraninių segmentų ir vykdo priešnašą Cl- ir HCO3

- jonų. Chlorido pernešimas per membraną pusę tampriai susijęs su bikarbonato išnešimu 6.5.2 Aktyvi pernaša

Aktyvios pernašos metu medžiagos pernešamos per membraną prieš jų koncentracijos gradientą, tai yra iš žemesn÷s koncentracijos į aukštesnę. Pernešimas turi būti susietas su egzergonine reakcija atpalaiduojančia energiją. Aktyvi pernaša yra dviejų tipų:

a) pirmin ÷ aktyvi pernaša b) antrin ÷ aktyvi pernaša Pirminei aktyviai pernašai tiesiogiai panaudojama šviesos energija, ATP hidroliz ÷s,

oksidacinių redukcinių procesų, dekarboksilinimo, metilo grup÷s pernešimo metu išsiskyrusi energija. Plačiausiai medžiagų pernešimui per membraną naudojama ATP hidroliz÷s energija. Fermentai ATPaz÷s hidrolizuoja ATP ir perneša įvairius jonus ir molekules prieš jų koncentracijos gradientą. Tokie fermentai vadinami pompomis, siurbliais. Bakteriorodopsinas sugeria šviesos kvantą ir perneša protonus per membraną halofilin÷se bakterijose. Sukurtas elektrocheminis vandenilio jonų gradientas ATP sintez÷s varomoji j÷ga. Oksiduojant substratus elektronų pernešimo grandin÷je mitochondrijose, chloroplastuose, bakterijose, sukuriamas protonų gradientas, kuris naudojamas ATP sintezei, medžiagų pernašai.

Antrin ÷ aktyvi pernaša. Pirmin÷s pernašos metu sukurti jonų gradientai panaudojami įvairių medžiagų pernešimui prieš jų koncentracijos gradientą. Gali vykti simportas arba antiportas

Pavyzdžiui bakterijose E.coli, pernešant elektronus kv÷pavimo grandine arba hidrolizuojant ATP, ant plazmin÷s membranos sukuriamas protonų gradientas. Ląstel÷s išor÷je vandenilio jonų koncentracija padid÷ja, o viduje – sumaž÷ja. Protonams grįžtant į ląstelę pagal koncentracijos gradientą, kartu pernešama laktoz÷ prieš jos koncentracijos gradientą. Protonų ir laktoz÷s simportą vykdo transmembraninius baltymas laktoz÷s permeaz÷. Antrin÷s pernašos keliu pernešami jonai, aminorūgštys, angliavandeniai, nukleozidai ir kitos ląstelei reikalingos medžiagos. Bakterijose antrinei pernašai dažniausiai naudojamas protonų gradientas, o gyvūnų ląstel÷se – Na+ gradientas. Natrio jonų koncentracija aplinkoje žymiai aukštesn÷ nei citozolyje ir Na+/K+ ATPaz÷s.

6.5.3 Nuo ATP priklausančios pernešimo sistemos Vienas iš pagrindinių energijos šaltinių pirminei aktyviai pernašai yra ATP hidroliz÷s

energija. Fermentai, kurie katalizuoja jonų pernešimą vadinami transportin÷s ATPaz÷s arba tiesiog ATPaz÷s. Jos skirstomos į tris klases

P-tipo ATPaz÷s

V-tipo ATPaz÷s

F-tipo ATPaz÷s

6.1 lentel÷

Organizmai ar Membranos tipas ATPaz÷s vaidmuo

225

225

audiniai

P-tipo ATPaz÷s

Na+/K+ Gyvulių audiniai Plazmin÷ Palaiko aukštą [K+] ir žemą [Na+] ląstel÷je, sukuria transmembraninį potencialą, sukuria Na+ gradientą medžiagų pernešimui

H+K+ Skrandžio dengiamosios ląstel÷s

Plazmin÷ Rūgština skrandžio vidų

H+ Grybai Plazmin÷ Sukuria protonų gradientą antrinei aktyviai pernašai

H+ Aukštesnieji augalai

Plazmin÷ Sukuria protonų gradientą antrinei aktyviai pernašai

Ca2+ Gyvulių audiniai Plazmin÷ Palaiko žemą [Ca2+] citozolyje

Ca2+ Gyvulių miocitai Endoplazminis tinklas Sukaupia Ca2+ endoplazminio tinklo liumene

Cd2+, Hg2+, Cu2+

Bakterijos Plazmin÷ Išmeta katijonus iš ląstel÷s, suteikia atsparumą katijonams

V-tipo ATPaz÷s

H+ Gyvuliai Lizosomos, endosomos, sekretorin÷s veikules

Sukuria rūgštinį pH

H+ Aukštesnieji augalai

Vakuol÷s Sukuria rūgštinį pH

H+ Grybai Vakuol÷s Sukuria rūgštinį pH

F-tipo ATPaz÷s

H+ Eukariotai Vidin÷ mitochondrijų membrana

Katalizuoja ATP sintezę

226

226

H+ Aukštesnieji augalai

Tilakoidų membrana Katalizuoja ATP sintezę

H+ Prokariotai Plazmin÷ membrana Katalizuoja ATP sintezę

P-tipo ATPaz÷s.

Pavadinimas kilęs iš to, kad baltymas pernešant jonus per membranas fosforilinasi ir defosforilinasi. Visos P-tipo ATPaz÷s turi panašią aminorūgščių seką, ypatingai greta Asp aminorūgšties, kuri yra fosforilinama. Išskirtin÷ šių ATPazių ypatyb÷ yra jų inhibicija vanadatu. P-tip ATPaz÷s pereina dvi konformacijas E1 ir E2 kurios turi skirtingą giminingumą pernešamiems jonams. Šie fermentai yra integralieji baltymai, dažniausiai sudaryti iš vienos polipeptidin÷s grandin÷s. Gyvulių audiniuose Na+/K+ ATPaz÷ perneša Na+ ir K+ jonus. Ca2+ ATPaz÷ palaiko žemą Ca2+ jonų koncentraciją citozolyje. H+K+ ATPaz÷ randama skrandžio dengiamųjų ląstelių plazmin÷je membranoje perneša protonus į skrandžio vidų ir palaiko jo žemą pH. Augalų ir grybų plazmin÷je membranoje esanti H+ ATPaz÷ sukuria ant membranos protonų gradientą, kuris panaudojamas įvairių medžiagų pernešimui. Bakterijų P-tipo ATPaz÷s gali pumpuoti toksiškus jonus Hg2+ Cd2+ Cu2+ iš ląstel÷s ir padidina bakterijų atsparumą šiems jonams.

V-tipo ATPaz÷s (V nes buvo rastos vakuol÷se) atsakingos už aukštos vandenilio jonų koncentracijos palaikymą įvairiuose ląstel÷s kompartmentuose. Augalų ir grybų vakuol÷se pH palaikomas tarp 3 ir 6. ATPaz÷ esanti lizosomose sukuria žemą vandenilio jonų koncentraciją (pH 5-6), kuri reikalinga aktyvuoti lizosominius fermentus. Endosomų, sekretorinių pūslelių rūgštinimas reikalingas įvairių medžiagų pernešimui per membraną.

F-tipo ATPaz÷s. Jų pagrindinis vaidmuo yra panaudojant elektrocheminį vandenilio jonų gradientą sintetinti ATP, tod÷l jos vadinamos ATP sintaz÷mis, jų struktūra, veikimo mechanizmas bus nagrin÷jamas Xx dalyje. Hidrolizuodamos ATP jos sukuria protonų gradientą, kuris gali būti naudojamas antrinei aktyviai pernašai.

6.5.4 Na+/K+ ATPaz÷ Gyvulių ląstel÷se vidin÷ Na+ jonų koncentracija yra mažesn÷, o K+ jonų didesn÷ nei

aplinkoje. Šis jonų koncentracijos gradientas palaikomas aktyvios pernašos sistemos, esančios plazmin÷je membranoje. Fermentas Na+/K+ ATPaz÷ (Na+/K+ pompa) atrastas 1957m Skou (J.Skou), panaudodamas ATP hidroliz÷s energija perneša Na+ ir K+ jonus prieš jų elektrocheminius gradientus. Kiekvienai ATP molekulei hidrolizuojantis iki ADP ir Pn 3 Na+ jonai išnešami iš ląstel÷s, o 2K+ jonai pernešami į citozolį. Viduje ląstel÷s [Na+] = 10-15mM, [K+] = 100-140mM, o už ląstel÷s ribų ar kraujo plazmoje [Na+] = 100-140mM, [K+] = 5-10mM. K+ Jonai reikalingi kai kurių fermentų aktyvumui. Transmembraniniai Na+ ir K+ gradientai reikalingi nervinio impulso perdavimui nervin÷se ląstel÷se. Jie taip pat reguliuoja ląstel÷s tūrį ir formą. Gyvulių ląstel÷se Na+ jonų gradientas panaudojamas aminorūgščių, angliavandenių, nukleozidų ir kitų medžiagų pernešimui į ląstelę. Jonų gradiento palaikymui ląstel÷ naudoja labai daug energijos, per 20-40% visos energijos, o nervin÷se ląstel÷se net iki 70% ATP hidroliz÷s

227

227

energijos eikvojama jonų gradientų sukūrimui ir nervinio impulso

pernešimui.

6.20 pav. Na+/K+ ATPaz÷, sudaryta iš dviejų subvienetų α ir β. α turi 10 TM segmentų ir perneša Na+ ir K+ jonus, β subvienetas yra glikozilintos ir vieną kartą perveria membrana

Na+/K+ ATPaz÷ yra integralusis baltymas susidedantis iš dviejų subvienetų. Fermentinis aktyvumas, jonų pernešimo vieta, kardiotoksinių steroidų surišimo sritys yra α subvienete (mol. mas÷ 120kDa), β subvienetas (35 kDa) yra glikozilintas ir jo funkcija n÷ra pilnai išaiškinta..

Fermentas dar yra vadinamas Na+/K+ pompa, kadangi hidrolizuodamas viduląstelinį ATP pumpuoja Na+ ir K+ jonus, 3Na+ jonai išnešami iš ląstel÷s o 2K+ jonai keliauja į ląstel÷s vidų.. Reakcijos stechiometriją galima užrašyti

3Na+(vid.) + 2K+(išor.) + ATP + H2O 3Na+(išor.) + 2K+(vid.) + ADP + Pn

Na+/K+ ATPaz÷s tretin÷ struktūra n÷ra nustatyta, tačiau yra pasiūlyti keli fermento veikimo modeliai. Pernešimo metu fermentas būna dviejose konformacijose E1 ir E2. Šie du būviai turi skirtingas tretines struktūras, skirtingus katalizinius aktyvumus ir skirtingai suriša K+ ir Na+ jonus bei įvairius ligandus. E1 forma geriau suriša Na+ (KM = 0,2mM) citozolin÷je pus÷je ir reaguoja su ATP sudarydama fosforilintą tarpininką, tiktai esant Na+. Fosforilinama yra asparto aminorūgštis, susidarant reaktyviam aspartil fosfato tarpininkui. Fosforilinta forma (E2-P) turi didelį giminingumą K+ (KM = 0,05M) ir žemą Na+. E2-P forma suriša K+ išorin÷je membranos pus÷je ir fosfatas atskeliamas tiktai esant K+.

Na+/K+ ATPaz÷s veikimą galime pavaizduoti šia schema (pav. )

228

228

E1-3Na+ E1-ATP-3Na+ E1~P-3Na+

E2-2K+ E2-P-2K+ E2-P

ATP ADP

Mg2+ Mg2+

Pn H2O 2K+ (išor.)

3Na+ (išor.)

3Na+(vid.)2K+ (vid.)

1 2

6 3

5 4

CITOZOLIS

IŠORö

Pa6.21 pav. Aktyvios Na+ ir K+ pernašos, vykdomos Na+/K+ ATPaz÷s, schema

1. Vidin÷je membranos pus÷je Na+ prisijungia prie E1 ir sąveikaujant E1-3Na+ ir ATP susidaro trinaris kompleksas E1-ATP-3Na+

2. ATP hidrolizuojasi, fermentas fosforilinamas, susidaro didžiaenergis tarpininkas E1~P-3Na+

3. Didžiaenergis tarpininkas relaksuoja į žemos energijos būvį E2-P-3Na+, keičiasi jo konformacija ir Na+ jonai atsipalaiduoja jau išorin÷je membranos pus÷je.

4. 2K+ jonai iš išor÷s prisijungia prie E2-P, susidarant E2-P-2K+. 5. Fosfato grup÷ yra hidrolizuojama. 6. E2 keičia konformaciją į E1 ir K+ jonai atsipalaiduoja viduje ląstel÷s, Na+

prisijungia iš vidin÷s pus÷s ir ciklas kartojasi. Hidrolizuojant ATP, fermentas fosforilinamas, kinta jo konformacija ir Na + jonai

pernešami iš ląstel÷s, o K+ į ląstelę.

Na+/K+ ATPaz÷ inhibuojama širdies glikozidų. Digitalis, ekstraktas iš rusmen÷s lapų, sustiprina širdies raumens darbą. Jis inhibuoja Na+/K+ ATPazę, padidina Na+ koncentraciją širdies raumenyje, aktyvuoja baltymą greitinantį Na+/Ca2+ priešnašą. Padid÷jęs Ca2+ pernešimas į raumenų ląsteles sustiprina jo susitraukimą. Glikozidas ouabainas gaunamas iš rytų Azijos Ouabio medžių yra labai stiprus Na+ K+ ATPaz÷s slopiklis ir yra naudojamas kaip nuodas, vietiniai gyventojai juo ištepa str÷lių antgalius.

6.5.5 Ca2+ pernešimas. Ca2+ ATPaz÷.

Kalcio jonai labai svarbūs raumenų susitraukimui, reguliuoja daugelio fermentų aktyvumą, yra antrinis informacijos nešiklis. Ramyb÷s būsenoje raumenų ląstel÷se Ca2+ koncentracija yra labai žema ~0,1µM. Žemą Ca2+ kocentraciją ląstel÷je palaiko du fermentai - vienas išsid÷stęs plazmin÷je membranoje ir išneša Ca2+ jonus iš ląstel÷s, kitas baltymas randamas endoplazminiame tinkle. Raumenyse kalcio jonai yra sukaupiami sarkoplazminiame tinkle. At÷jus nerviniam impulsui atsidaro Ca2+ kanalai ir jis išena į citozolį, padidindamas kalcio koncentraciją iki 10µΜ. Ramyb÷s būsenoje kalcis transportuojamas i sarkoplazminį tinklą veikiant Ca2+ ATPazei. Šis baltymas (jis yra vadinamas SERCA) sudaro per 70-80% nuo visų

229

229

tinklo membranos baltymų. Fermento veikimo kinetin÷ schema panaši į Na+/K+ ATPaz÷s. Fermentas būna dviejuose būviuose E1 ir E2. ATP fosforilina fermento asparto aminorūgštį. Hidrolizuojant vieną ATP molekulę 2 Ca2+ jonai pernešami į sarkoplazminio retikulumo liumeną kartu 2-3 protonai pernešami priešinga kryptimi. Aktyvi pernaša pasiekiama keičiant kalcio surišimo vietų giminingumą, nuo didelio giminingumo (E1) iki žemo giminingumo (E2). 2000-2002 metais buvo nustatytos fermento tretin÷s struktūros E1·įvairiose konformacijose ir pasiūlytas veikimo mechanizmas ( pav.). Nustatyta, kad polipeptidin÷ grandin÷ membranoje sudaro 10 transmembraninių α spiralinių segmentų. Citozolin÷je pus÷je yra fosforilinimo (P) ir nukleotidus surišantys (N) domenai, kurie suformuoja katalizinį centrą, jame vyksta fermento fosforilinimas ir defosforilinimas. Trečias Actuator (A) domenas reikalingas perduoti konformaciniams pokyčiams iš citoplazmin÷s srities į membraninę.. Ca2+ jonai prisijungia prie transmembraninių α spiralių. Fosforilinus fermentą ir jį defosforilinus vyksta dideli domenų P ir N konformacijos pakitimai, kurie perduodami membranoje esantiems α spiraliniams segmentams. Spiraliniai segmentai pasisuka, kalcio surišimas su baltymu sumaž÷ja ir katijonas išeina į sarkoplazminio tinklo liumeną.

230

230

6.22 pav. Ca2+ ATPaz÷s struktūros modelis ir veikimo mechanizmas (T.Toyoshima, H.Nomura, T.Tsuda, Nature v.432, 361-368, 2004)

P tipo ATPaz÷ms priklauso ir skrandžio H+K+ ATPaz÷. Panaudodamas ATP hidroliz÷s energiją fermentas perneša protonus iš dengiamųjų skrandžio epitelinių ląstelių į skrandį. Procesas yra elektroneutralus, kadangi tuo pat metu K+ jonai iš skrandžio keliauja į ląsteles. Šio fermento d÷ka skrandžio skysčių pH palaikomas rūgštus pH = 0,8-1,0.

Dar viena grup÷ transporterių, pernešančių įvairias medžiagas naudojant ATP energiją vadinama ABC transporteriais. Jie turi ABC molekulinį domeną (pavadinimas kilęs iš angl.l ATP binding casette, ABC), kuris suriša ATP. Tai yra didel÷ šeima skirtingos struktūros integralinių baltymų, pernešančių įvairias medžiagas -medžiagų apykaitos produktus, lipidus, sterolius, vaistus. Pakitus šių transporterių sintezei ar aktyvumui sukelia įvairius susirgimus – cistine fibrozę (sutrinka Cl- jonų pernešimas), neurologiniai susirgimai, tinklain÷s degeneracija, cholesterolio ir tulžies rūgščių pernešimo pernešimo defektai, anemija. Vienas iš jų yra P-glikoproteinas, kurio kiekis padid÷ja navikin÷se ląstel÷se ir suteikia atsparumą įvairiems chemoterapiniams vaistams. Daugybinis atsparumas vaistams (MDR) (angl.kalba multidrug resistance) neleidžia atlikti efektyvią chemoterapiją. P-glikoproteinas yra integralusis baltymas (Mm 170 kDa) randamas atsparių vaistams navikinių ląstelių plazmin÷je membranoje. Naudodamas ATP energiją, P-glikoproteinas išneša iš ląstel÷s įvairias, struktūriškai nepanašias nepolines medžiagas prieš jų koncentracijos gradientą. Sumaž÷jus vaistų efektyviai koncentracijai navikin÷s ląstel÷s išlieka gyvos.

6.5.6 Medžiagų pernešimas naudojant saul÷s šviesos energiją Kai kurie pernašos procesai yra energizuojami ne ATP bet šviesa. Geriausiai

charakterizuotas yra bakteriorodopsinas, nuo šviesos priklausoma H+ pompa ir halorodopsinas šviesos varoma Cl- pompa. Bakteriorodopsinas yra retinalio aldehidą turintis baltymas (248 aminorūgštys, molekulin÷ mas÷ 26000) išskirtas iš halofilinių bakterijų Halobacterium halobium, H.salinarium. Jo struktūra panaši į reg÷jimo baltymą rodopsiną. Bakteriorodopsinas yra membraninis baltymas, kurio septyni α spiraliniai segmentai perveria membraną. Retinalio aldehidas kovalentiškai prijungtas prie baltymo lizino (Lys216) ε amino grup÷s. Apšvietus bakteriorodopsiną protonai iš ląstel÷s pro membraną pernešami į aplinką ir sukurtas protonų gradientas naudojamas ATP sintezei. Apšvietus bakteriorodopsiną šviesą sugeria retinalis ir vyksta baltymo ir retinolio konformaciniai pasikeitimai, kurių metu susidaro tarpin÷s bakteriorodopsino formos, sugeriančios skirtingas šviesos bangas. Apšvietus bakteriorodopsiną, sugeriantį šviesą 570nm bangoje (BR570) jis per eilę tarpinių produktų (pav.) pereina į formą M410, kuri savaimingai grįžta į BR570.

231

231

BR570

J600

L550

M410

N560

O640

H+H+

450fs

1µs

10ms

<10ms

6.23 pav. Bakteriorodopsino fotocheminis ciklas. Bakteriorodopsinui pereinant iš vienos formos į ktą vyksta jo protonizacija ir deprotonizacija.

Buvo nustatyta, kad BR570 yra protonizuotas, o pereinant į M412 protonas disocijuoja. –deprotonizuota. BR570 prie baltymo prijungtas retinalis yra pilnai trans formoje, bakteriorodopsinui sug÷rus šviesą retinalis pereina į 13-cis konfigūraciją. Izomerizuojantis retinaliui kinta Šifo baz÷s pK ir protonas nuo –NH disocijuoja ( pav.). Procesas yra grįžtamas.

NBaltymas

Lys 216

H

H+H+

N

Baltymas

trans

13-cis

+

6.24 pPav. Retinalio trans-cis izomerizacija susijusi su protono disociacija nuo Šifo baz÷s. Membranoje bakteriorodopsinas išsid÷sto taip, kad šio ciklinio proceso metu protonas paimamas iš vienos membranos pus÷s, o atiduodamas kitoje membranos pus÷je. Šiuo metu yra nustatyta erdvin÷ bakteriorodopsino struktūra ir identifikuotos aminorūgštys pernešančios vandenilio jonus. Protonas iš citoplazmos per puskanalį, kurį sudaro aminorūgštys Asp38, Asp96 pasiekia Šifo baz÷s azotą ir jį protonizuoja. Apšvietus bakteriorodopsiną protonas disocijuoja ir per kitą puskanalį į kurį įeina Asp85, Arg82 bei Glu204 atsipalaiduoja į užląstelinę erdvę. Tokiu būdu panaudojant saul÷s šviesos energiją protonai pernešami iš citoplazmos į išorę ir sukuriamas protonų gradientas.

232

232

6.25 pav. Protonų pernešimo kelias bakteriorodopsino molekul÷je.

6.6 Signalo perdavimo keliai

Organizmas, ląstel÷ iš aplinkos priima įvairius signalus juos apdoroja ir signalų poveikyje ląstel÷ atsako į juos keisdama biocheminius procesus. Mes nagrin÷sime signalo pri÷mimą ir perdavimą ląstel÷s lygyje. Ląstelių plazmin÷je membranoje yra receptoriai, kurie priima ir perduoda nepereinančius pro membraną išorinius signalus. Daugialąsteliniuose organizmuose tai yra hormonai (medžiagos kurios perduoda signalą iš vienų ląstelių kitoms), neurosiuntikliai (perduoda informaciją nerviniame audinyje) ir augimo faktoriai (baltymai reguliuojantys ląstelių proliferaciją). Šios medžiagos keliauja po organizmą, prisijungia prie specifinių ląstelių receptorių ir sukelia atsaką. Ligandas, prisijungęs prie ląstel÷s paviršiaus esančio receptoriaus, indukuoja specialaus baltymo keitiklio atsaką. Šis baltymas toliau sąveikauja su efektoriniu fermentu, kurio produktas yra antrin ÷ signalin÷ molekul÷. Ja gali būti nedidel÷s molekul÷s ar jonai (cAMP, cGMP, inozitolio fosfatai, Ca2+, acilglicerolis, NO, ceramidas ir kitos medžiagos). Signalin÷s molekul÷s difunduoja į citozolį, į branduolį, įvairias ląstel÷s organeles,. Signalo perdavimo procese labai svarbu yra signalo stiprinimas. Vienas ligando receptoriaus kompleksas gali reaguoti su keliais keitikliais. Kiekvienas keitiklis aktyvuoja kelias efektorinio fermento molekules. Susidaręs didelis skaičius antrinio signalo molekulių sąveikauja fermentais - tai dažniausiai būna baltymo kinaz÷s, kurios fosforilina daugelį taikinio baltymų. Toks signalo stiprinimas vadinamas kaskada. Tokiu būdu nedidelis kiekis ligandų, nepatekdamas į ląstel÷s vidų, stimuliuoja daugelio fermentų veiklą. Ne visi cheminiai stimulai reaguoja su receptoriais esančiais ląstel÷s paviršiuje. Steroidiniai hormonai yra tirpūs lipiduose, jie gali sąveikauti su plazmin÷je membranoje esančiais receptoriais , tačiau dažniausiai jie veikia ląstel÷s viduje. Jie praeina pro plazminę membraną, susijungia su citozoliniais baltymais – receptoriniais. Steroido-receptoriaus kompleksas difunduoja į branduolį

233

233

ir prisijungia prie DNR segmentų (vadinamų hormonų atsako elementai) ir aktyvuoja arba supresuoja atitinkamų genų veiklą. Visus receptorius, kurie dalyvauja signalo pernešime galima suskirstyti į tris klases:

• Su G-baltymais susijungę receptoriai – jie yra integraliniai (turintys 7 transmembraninius segmentus 7TM) membraniniai baltymai, išorin÷je membranos pus÷je esanti sritis jungiasi su ligandu. Prie vidin÷je membranos pus÷je esan2ios srities jungiasi baltymas keitiklis (G-baltymas)

• Vieno transmembraninio segmento katalizinis receptorius – baltymai turintys 1TM ir dvi globulines sritis, esančias abiejose membranos pus÷se. Užląstelin÷je pus÷je yra ligandą surišanti sritis, o vidin÷je – katalizinis domenas tai dažniausiai būna tirozino kinaz÷ arba guanilo ciklaz÷.

• Oligomeriniai joniniai kanalai. Jie sudaryti iš kelių subvienetų ir yra ligandų valdomi kanalai. Prisijungus specifiniam ligandui kanalai yra atidaromi. Šių kanalų ligandai yra neurosiuntikliai.

• 6.6.1 Su G-baltymais susijungę receptoriai

Su G baltymais susijungę receptoriai 7 kartus α spiraliniais segmentais perveria membraną ir yra vadinami 7 transmembraninių segmentų baltymais. (7TMS). Rodopsinas, β−adrenerginis receptorius, uosl÷s, skonio ir kiti receptoriai priklauso šiai klasei. Tai yra didel÷ receptorių šeima, visi jie turi po 7 transmembraninius segmentus ir yra vadinami serpentino receptoriai. Prisijungus ligandui prie receptoriaus, kinta jo onformacija ir yra aktyvuojamas G baltymas. Aktyvus G baltymas paleidžia tolimesnius procesus – aktyvuoja atitinkamus fermentus ar atidaro Ca2+, K+ joninius kanalu. Ligandui prisijungus prie receptoriaus, ligandą-receptoriaus kompleksas reaguoja su vidin÷je plazmin÷s membranos pus÷je esančiu G baltymu. G baltymai gali prijungti GTP arba GDP, iš to kilęs jų pavadinimas.. G baltymas yra heterotrimeras, sudaryti iš 3 subvienetų α (Μm 45-47kDa) ,β (35kDa) ir γ (7−9kDa). α ir γ subvienetai yra inkariniai baltymai, α subvienetas prijungtas prie membranos per miristo riebalų rūgštį, o γ subvienetas per prenilo liekaną. α subvienetas prijungia GDP arba GTP ir turi nedidelį GTPazinį aktyvumą. Kai prie nukleotidus surišančios srities prijungtas GDP, Gαβγ kompleksas yra nektyvus. Hormonas, prisijungęs prie receptoriaus, stimuliuoja greitus GDP-GTP mainus ant Gα subvieneto. Prisijungus GTP, kinta baltymo konformacija, α subvienetas disocijuoja ir prisijungia prie efektorinio fermento. Šiuo fermentu gali būti adenilato ciklaz÷, guanilato ciklaz÷, fosfolipaz÷ ir kiti. Prisijungus Gα(GTP) prie adenilato ciklaz÷s ji aktyvojama ir sintezuojamas cAMP. Šios signalin÷s molekul÷s sintez÷ tęsiasi tol, kol yra prijuntas Gα(GTP). α subvienetas turi GTPazinį aktyvumą tod÷l GTP l÷tai hidrolizuojamas. Susidaręs Gα(GDP) kompleksas disocijuoja nuo efektorinio fermento, susijungia su β ir γ subvienetais ir sudaro kompleksą su receptoriumi.

234

234

6.26 pav. G baltymo struktūra. Baltymas yra heterotrimeras, sudarytas iš α, β ir γ subvienetų. Yra žinomos 4 G baltymų šeimos, kurios turi skirtingą biocheminį poveikį. Vieni G baltymai gali stimuliuoti (Gs) kiti inhibuoti (Gi ) efektorinį baltymą. G baltymų α subvienetai yra skirtingi, tuo tarpu β ir γ yra panašūs. Lentel÷. G baltymų šeimos. Atstovas Funkcija Poveikis Gi Inhibuoja adenilato ciklazę Sumažina cAMP Gs Stimuliuoja adenilato ciklazę Padidina cAMP Gq Stimuliuoja fosfolipazę C Padidina inozitolio trifosfato IP3 G12 Nežinoma Hormonai, kurie prisijungia prie inhibuojančių receptorių prijungiant Gi blokuoja adenilato ciklazę. Bendras ląstel÷s atsakas į hormoną priklauso nuo esančio receptoriaus tipo ir nuo prisijungusio G baltymo. G baltymai yra universalūs signalo nešikliai. Jie yra aktyvuojami įvairių hormonų, jų poveikis pasireiškia skirtingose ląstel÷se. Adrenalinas ir gliukagonas jungiasi prie skirtingų receptorių kepenų ląstel÷se, bet abu didina cAMP koncentraciją, jų poveikis yra adityvus. Jie aktyvuoja ne tiktai adenilato ciklazę, bet ir fosfolipazę C ir A2, reguliuoja K+, Na+ ir Ca2+ kanalų pralaidumą smegenyse, širdyje ir kituose organuose, jie labai svarbūs reg÷jimo procese, kvapų suvokime. Yra nustatyta daugiau nei 100 skirtingų su G baltymais surištų receptorių ir per 20 skirtingų G baltymų. 6.2 lentel÷. G baltymai ir jų fiziologinis poveikis. G baltymas Lokalizacijos

vieta Stimulas Efektorius Efektas

Gs Kepenys Adrenalinas Gliukagonas

Adenilato ciklaz÷ Glikogeno skaidymas

Gs Riebalinis audinys

Adrenalinas Gliukagonas

Adenilato ciklaz÷ Riebalų skaidymas

Gs Inkstai Antidiuretinis hormonas

Adenilato ciklaz÷ Vandens sulaikymas

Gi Širdies raumenys Acetilcholinas Kalio kanalas Širdies darbo sumaž÷jimas

Gq Kraujagyslių lygieji raumenys

Angiotenzinas Fosfolipaz÷ C Raumenų susitraukimas,

235

235

kraujospūdžio padid÷jimas

Golf Nosies neuroepitelin÷s ląstel÷s

Kvapiosios molekul÷s

Adenilato ciklaz÷ Kvapų pojūtis

Gt (transducinas) Kolbel÷s ir lazdel÷s

Šviesa cGMP fosfodiesteraz÷

Šviesos detekcija

Signalinis kelias dalyvaujant cikliniams nukleotidams. G baltymai gali veikti įvairius efektorinius fermentus, kurie katalizuoja antrinių signalinių molekulių susidarymą. Antrin÷s signalin÷s molekul÷s ir jų funkcija pateikta lentel÷je. 6.3 lentel÷. Antrin÷s viduląstelin÷s signalin÷s molekul÷s Signalin÷ molekul÷ Signalin÷s molekul÷s

susidarymas Poveikis

cAMP Adenilato ciklaz÷ Aktyvuoja baltymo kinazes cGMP Guanilato ciklaz÷ Aktyvuoja baltymo kinazes,

reguliuoja jonų kanalus, reguliuoja fosfodiesterazes

Ca2+ Patenka iš endoplazminio tinlo ir iš užląstelin÷s erdv÷s

Aktyvuoja baltymo kinazes

IP3 Veikiant fosfatidilinozitolį fosfolipazei C

Aktyvuoja Ca2+ kanalus

Diacilglicerolis Veikiant fosfatidilinozitolį fosfolipazei C

Atyvuoja baltymo kinazę C

Fosfatidin÷ rūgštis Veikiant membranos lipidus fosfolipazes D

Aktyvuoja Ca2+ kanalus, inhibuoja adenilato ciklazć

Ceramidas Veikiant sfingomieliną fosfolipazei C

Aktyvuoja baltymo kinazes

Azoto oksidas (NO) Azoto oksido sintaz÷ Aktyvuoja guanilato ciklazę, atpalaiduoja lygiuosius raumenis

Ciklin÷ ADP-riboz÷ cADP-riboz÷s sintaz÷ Aktyvuoja Ca2+ kanalus Eukariotuose cAMP (3/,5/-ciklinis adenozino monofosfatas ir cGMP (3/,5/-ciklinis guanozino monofosfatas yra plačiausiai sutinkamos antrin÷s signalin÷s molekul÷s. Antrinių signalinių molekulių koncentracija ląstel÷je yra stipriai reguliuojama. cAMP susidaro iš ATP veikiant adenilato ciklazei, o cGMP iš GTP katalizuojant guanilato ciklazei, cikliniai nukleotidai skaidomi fosfodiesteraz÷s. Kai kurie hormonai stimuliuoja cGMP susidarymą. Guanilato ciklaz÷ katalizuoja GTP virtimą cGMP. cGMP koncentracija žymiai mažesn÷, jis dalyvauja šviesos impulso perdavime reg÷jimo procese, skonio recepcijoje. Adenilato ciklaz÷ yra integralinis baltymas. Jo katalizinis domenas sudarytas iš dviejų dalių ir nukreiptas į ląstel÷s citozolį. Gs subvienetas prisijungęs prie adenilato ciklaz÷s aktyvuoja jo katalizinį domeną ir sintezuojamas cCMP, kuris difunduoja nuo membranos paviršiaus į citozolį.

236

236

N

NN

N

NH2

O

HH

OH

HH

OP

O

CH2

O

N

NN

N

NH2

O

HH

OH

HH

OH

CH2

OPO

O

P

O

O

P

O

O O

O

O

N

NN

N

NH2

O

HH

OH

HH

OH

CH2

OPO

O

O

-

-

-

- ATP

cAMP

AMP

Adenilatociklaz÷ PPn

-

-

cAMPfosfodiesteraz÷

H2O

6.27 pav. cAMP susidarymas ir skaidymas. cAMP aktyvuoja fermentą nuo cAMP priklausomą baltymo kinazę A. Kinaz÷ sudaryta iš keturių subvienetų. Du reguliatoriniai subvienetai prisijungę prie katalizinių blokuoja fermento aktyvumą. cAMP koncentracijai citozolyje padid÷jus, keturios cAMP molekul÷s prisijungia prie reguliatorių subvienetų ir du kataliziniai subvienetai atsiskiria. Aktyvus fermentas katalizuoja taikinio baltymo serino, treonino ar tirozino aminorūgščių fosforilinimą. Fosforilinus fermentą jo aktyvumas gali padid÷ti ar sumaž÷ti (skyrius 2.9).

237

237

6.28 pav. Baltymo kinaz÷s A aktyvacija. Keturios molekul÷s cAMP prisijungia prie reguliatorinių subvienetų, tetrameras disocijuoja ir atsipalaiduoja du aktyvūs kataliziniai subvienetai. Signalo perdavimo reguliacijoje yra labai svarbu netiktai stiprinti signalą, bet ir jį sumažinti. Adenilato ciklazę aktyvuoja tiktai Gα(GTP). HIdrolizavus GTP cAMP sintez÷ sustoja. cAMP skaidymą katalizuoja cAMP fosfodiesteraz÷, kuri katalizuoja cAMP hidrolizę iki AMP. Metilinti purinai kofeinas ir teobrominas inhibuoja fosfodiesterazę ir prailgina cAMP veikimo laiką, tuo pasireiškia stimuliuojantis kavos ir arbatos poveikis.

6.29 pav. Bendras adenilato ciklaz÷s signalinis kelias. Hormono prijungimas prie stimuliuojančio receptoriaus aktyvuoja stimuliuojanti Gs ir did÷ja adenilato ciklaz÷s aktyvumas. Inhibitorinio hormono poveikis yra priešingas. cAMP aktyvuoja baltymo kinazę ir keičia ląstel÷s atsaką į stimulą. Inozitolio-fosfolipid ų signalinis kelias

238

238

Kitas labai svarbus signalo perdavimo kelias yra inozitolio-fosfolipidų signalinis kelias. Paveikus atitinkamus membraninius receptorius hormonais, augimo faktoriais susidaro inozitolio fosfatai, kurie yra labai svarbios antrin÷s signalin÷s molekul÷s Prisijungus ligandui prie specifinio receptoriaus, aktyvuojamas G baltymas Gq, kuris aktyvuoja susijungusią su vidine plazmin÷s membranos puse fosfolipazę C. Fosfolipaz÷ C katalizuoja membranoje esančio fosfatidilinozitolio 4,5-bisfosfato (PIP2) hidrolizę iki vandenyje tirpaus inozitolio 1,4,5-trisfosfato (IP3) ir diacilglicerolio. Fosfatidilinozitolio 4,5-bisfosfatas susidaro iš fosfatidilinozitolio veikiant kinazei. IP3 ir diacilglicerolis yra antrin÷s signalin÷s molekul÷s

.

CH2O

CH

CH2O

O

C

P

O

O

RO

CR O

Fosfatidilinozitolio 4,5-bisfosfatas (PIP2)

1

2 3

4

56

Fosfolipaz÷ C

CH2O

CH

CH2OH

O

C RO

CR OP

O

OHO

OH OH

OPO3

OPO3

1 4

5O

O

-

-2-

2-

Diacilglicerolis Inozitolio 1,4,5-trisfosfatas

H2O

2-

OPO3

OPO3

OHO

OH OH2-

IP3 difunduoja citozolyje ir prisijungia prie endoplazminiame tinkle esančio kalcio kanalo, kuris trumpam atsidaro ir Ca2+ iš liumeno išeina į citozolį. Kalcis taip yra antrin÷ signalin÷ molekul÷, jis aktyvuoja nuo kalcio priklausančias baltymo kinazes. Kalcio poveikis yra trumpalaikis, kadangi endoplazminio tinklo membranoje, plazmin÷je membranoje ir mitochondrijos esančios Ca ATPaz÷s aktyviai išneša Ca2+ iš citozolio. Kitas PIP2 hidroliz÷s produktas, diacilglicerolis lieka susirišęs su plazmine membrana. Diacilglicerolis ir Ca2+ aktyvuoja baltymo kinazę C, kuri fosforilina daugelį taikinio baltymų. Inozitolio-fosfolipidų kelias yra stabdomas įvairiais būdais. Hidrolizuojant su Gq susijungus GTP, G baltymas pereina į neaktyvią formą (GqGDP) ir nestimuliuoja fosfolipaz÷s C. Fiziologiniu aktyvumu pasižymi ir kiti inozitolio fosfatai – inozitolio 1,3,4,5-tetrakisfosfatas, inozitolio 4,5-bisfosfatas ir kiti. Inozitolio fosfatai yra hidrolizuojami atitinkamų fosfatazių iki neaktyvių produktų - inozitolio ir fosforo rūgšties. Diacilglicerolis paverčiamas į fosfatidatus.

239

239

6.30 pav. Inozitolio fosfolipidinis signalinis kelias. Susijungus ligandui su receptoriumi, aktyvuojama fosfolipaz÷ C (PLC), kuri hidrolizuoja PIP2 į IP3 ir diacilglicerolį (DAG). IP3 atidaro Ca2+ kanalus, kalcis kartu su diacilgliceroliu aktyvuoja baltymo kinazę C (PKC), kuri fosforilina taikinio baltymus.. Fosfatidilinozitolis n÷ra vienintelis membraninis lipidas iš kurio susidaro antrin÷s signalin÷s molekul÷s. Išoriniai signalai gali aktyvuoti hidrolazes, kurios katalizuoja membraninių sfingolipidų virtimą į sfingoziną, sfingozino 1-fosfatą ar ceramidą. Sfingozinas inhibuoja baltymo kinazę C, o ceramidas aktyvuoja baltymo kinazę. Sfingozino 1-fosfatas aktyvuoja fosfolipazę D, kuri specifiškai katalizuoja fosfatidilcholino hidrolizę. Susidarę fosfatidatas ir diacilglicerolis yra taip pat antrin÷s signalin÷s molekul÷s. 6.6.2 Vieno transmembraninio segmento katalizinis receptorius Šio tipo receptoriuose ligandas prijungiamas ir efektorin÷s funkcijos yra tame pačiame baltyme. Ligandas prisijungia prie receptoriaus užląstelinio domeno ir signalas per membranoje esantį transmembraninį segmentą perduodamas citozolyje esančiam domenui, kuris dažniausiai turi baltymo kinazinį aktyvumą, ir fosforilina aminorūgštis tiroziną, seriną, treoniną. Šios grup÷s pagrindinis atstovas yra insulinas.

Kita grup÷ receptorinių fermentų turi guanilato ciklazinį aktyvumą ir sintetina antrinę signalinę molekulę cGMP. cGMP perneša skirtingus signalus įvairiuose audiniuose. Inkstuose ir žarnyne reguliuoja druskų ir vandens pusiausvyrą, širdies raumenyje jis relaksacijos signalas, dalyvauja smegenų funkcijose.

Inkstuose guanilato ciklaz÷ aktyvuojama atrial natriuretic factor (ANF), kuris susidaro prieširdyje kaip atsakas į padid÷jusi kraujo tūrį. ANF pernešamas į inkstus ir aktyvuoja guanilato ciklazę. cGMP aktyvuoja Na+ ir tuo pačiu vandens sekreciją. Žarnyno epitelin÷se ląstel÷se cGMP reguliuoja Cl- sekreciją.

Dar vienas tipas guanilato ciklaz÷s yra citozolyje. Tai yra hemą turintys baltymas ir aktyvuojamas NO. NO, susidaręs veikiant azoto oksido sintazei difunduoja per membranas ir susijungia su guanilato ciklaz÷s hemo grupe aktyvuoja cGMP susidarymą. NO sukelia kraujagyslių išsipl÷timą, slopina trombocitų agregaciją.

240

240

6.6.3 Oligomeriniai joniniai kanalai

Receptoriai, kurie perduoda signalą keisdami membranos pralaidumą jonams yra vadinami jonotropiniais receptoriais. Tie receptoriai, kurie perduoda signalą keisdami viduląstelinių fermentų aktyvumą vadinami metabotropiniais receptoriais. Vienas iš plačiausiai paplitusių jonotropinių receptorių yra nikotininis acetilcholino receptorius. Jis yra integralinis glikoproteinas, sudarytas iš keturių skirtingų subvienetų α (54kDa), β (56kDa), γ (58kDa) ir δ (6okDa). Šis baltymas rastas neuronų posinaptin÷se membranose ir nervų ir raumenų kontaktuose.

Sužadinus neuronus acetilcholinas atsipalaiduoja į sinaptinį plyšį, sąveikauja su acetilcholino receptoriumi ir depoliarizuoja ląstelę. Acetilcholino receptorius yra alosterinis baltymas, turintis dvi acetilcholiną surišančias sritis, kurios yra α subvienetuose ir yra nutolusios nuo kanalo per 3nm. Prisijungus acetilcholinui kanalas atsidaro ir Na+ ar Ca2+ jonai praeina pro kanalą ir depoliarizuoja membraną. Posinaptiniuose neuronuose depoliarizacija generuoja veikimo potencialą, nervų ir raumenų kontakte raumeninių ląstelių depoliarizacija iššaukia raumens susitraukimą.

6.32 pav. Acetilcholino receptorius. Acetilcholinas prisijungia prie α subvienetų,

atsidarius kanalui pro jį praeina Na+ ir Ca2+ jonai.

223

II DALIS MEDŽIAGŲ APYKAITA

MEDŽIAGŲ APYKAITA........................................................................................................... 223 II DALIS ..................................................................................................................................... 226 7 MEDŽIAGŲ APYKAITA IR BIOENERGETIKA............................................................. 226

7.1 Bendra medžiagų apykaitos charakteristika ...........................................................226 7.2 Termodinamika ir bioenergetika.............................................................................231

7.2.1 ATP universali energetin÷ valiuta ..................................................................233 7.2.2 Didžiaenergiai junginiai .................................................................................235

8 GLIKOLIZö ........................................................................................................................ 237 8.1 Glikoliz÷s reakcijos ................................................................................................239

8.1.1 I glikoliz÷s stadija...........................................................................................239 8.1.2 II glikoliz÷s stadija,.........................................................................................241

8.2 Piruvato skaidymas anaerobin÷se sąlygose ............................................................243 8.3 Etanolio metabolizmas ...........................................................................................245 8.4 Fermentacijos energetika........................................................................................246 8.5 Glikogeno skaidymas (Glikogenoliz÷) ...................................................................247 8.6 Pentoz÷s fosfato kelias............................................................................................248 8.7 Kitų angliavandenių įjungimas...............................................................................254 8.8 Angliavandenių skaidymo reguliacija ....................................................................256

8.8.1 Pastero efektas ................................................................................................257 8.8.2 Glikoliz÷s procesą reguliuojantys fermentai...................................................258 8.8.3 Fruktoz÷s 2,6-bisfosfatas ir gliukoz÷s apykaitos reguliacija ..........................259 8.8.4 Heksoz÷s transporterių reguliacija..................................................................260 8.8.5 Glikogeno fosforilaz÷s reguliacija. .................................................................261

8.9 Gliukoz÷s apykaitos hormonin÷ reguliacija............................................................264 8.9.1 Insulinas..........................................................................................................264 8.9.2 Adrenalinas.....................................................................................................267 8.9.3 Gliukagonas ....................................................................................................269

9 TRIKARBOKSIRŪGŠČIŲ CIKLAS (Krebso ciklas) ........................................................ 271 9.1 Piruvato oksidacija iki acetil-KoA ir CO2 ..............................................................271

9.1.1 Piruvato dehidrogenazinio komplekso struktūra ............................................271 9.1.2 Piruvato dehidrogenazinio komplekso veikimo mechanizmas ......................272

9.2 Trikarboksirūgščių ciklo chemin÷s reakcijos .........................................................275 9.3 Trikarboksirūgščių ciklo reguliacija. ......................................................................279 9.4 Trikarboksirūgščių ciklas dalyvauja biosintez÷s procesuose..................................280 9.5 Anaplerotin÷s reakcijos. .........................................................................................281 9.6 Glioksilatinis kelias, trikarboksirūgščių ciklo modifikacija. ..................................282 9.7 Trikarboksirūgščių ciklo inhibicija fluoracetatu.....................................................285

10 LIPIDŲ SKAIDYMAS........................................................................................................ 287 10.1 Neutralių riebalų virškinimas .................................................................................287 10.2 Lipidų pernaša organizme.......................................................................................289 10.3 Viduląstelinių riebalų skaidymas............................................................................290 10.4 Riebalų rūgščių oksidacija......................................................................................290

10.4.1 Riebalų rūgščių aktyvacija..............................................................................290 10.4.2 Acil-KoA pernešimas į mitochondrijų užpildą...............................................291 10.4.3 Riebalų rūgščių β-oksidacija ..........................................................................293

224

10.5 Nesočių riebalų rūgščių oksidacija .........................................................................296 10.6 Riebalų rūgščių, turinčių nelyginį anglies atomų skaičių, oksidacija.....................298 10.7 ω riebalų rūgščių oksidacija....................................................................................299 10.8 Šakotos grandin÷s riebalų rūgščių oksidacija .........................................................300 10.9 Riebalų rūgščių oksidacija peroksisomose.............................................................301 10.10 Ketoninių junginių susidarymas ir jų oksidacija ................................................302 10.11 Fosfolipidų skaidymas........................................................................................304

11 AMINORŪGŠČIŲ KATABOLIZMAS.............................................................................. 306 11.1 Baltymų virškinimas...............................................................................................306 11.2 Aminogrup÷s pašalinimas nuo aminorūgščių.........................................................308

11.2.1 Aminorūgščių peramininimas.........................................................................309 11.2.2 Aminotransferazių veikimo mechanizmas. ....................................................310 11.2.3 Oksidacinis deamininimas..............................................................................312

11.3 Aminorūgščių dekarboksilinimas, ..........................................................................313 11.4 Amoniako surišimas ir išskyrimas. Karbamido ciklas ...........................................315

11.4.1 Amoniako šaltiniai..........................................................................................315 11.4.2 Karbamido ciklas............................................................................................317

11.5 Aminorūgščių anglies skeleto skaidymas...............................................................321 11.5.1 Aminorūgštys, kurios skaidomos iki piruvato................................................322 11.5.2 Aminorūgščių skaidymas iki acetil-KoA........................................................324 11.5.3 Aminorūgštys, kurios skaidomos iki α-ketoglutarato ....................................325 11.5.4 Aminorūgštys skaidomos iki sukcinil-KoA....................................................325 11.5.5 Aminorūgščių skaidymas iki oksalacetato......................................................326 11.5.6 Aminorūgščių, turinčių šakotus radikalus katabolizmas. ...............................327 11.5.7 Aminorūgščių katabolizmo genetiniai sutrikimai...........................................329

12 OKSIDACINIS FOSFORILINIMAS .................................................................................. 333 12.1 Mitochondrijų struktūra..........................................................................................333 12.2 Oksidacija ir energijos išsiskyrimas .......................................................................334 12.3 Mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷ .......................................................................335

12.3.1 Kv÷pavimo grandin÷s kompleksai..................................................................335 12.3.2 Oksidacinio fosforilinimo inhibitoriai ............................................................344 12.3.3 Rudųjų riebalų mitochondrijų pagrindin÷ funkcija generuoti šilumą.............346

12.4 ATP sintaz÷ ............................................................................................................347 12.5 Oksidacidacinio fosforilinimo hipotez÷s................................................................348

12.5.1 Protonų gradiento susidarymas.......................................................................349 12.6 ATP sintez÷s mechanizmas ....................................................................................350 12.7 Membranin÷s pernešimo sistemos..........................................................................353

12.7.1 ATP-ADP pernešimas ....................................................................................354 12.7.2 Citozolinio NADH pernešimo sistemos .........................................................354

12.8 ATP sintez÷s stechiometrija. ..................................................................................355 12.9 Oksidacinio fosforilinimo reguliacija.....................................................................356 12.10 Aktyvios deguonies formos/ skyrius pildomas ir taisomas/ ...............................357

13 FOTOSINTEZö................................................................................................................... 358 13.1 Chloroplastų struktūra ............................................................................................358 13.2 Šviesin÷ fotosintez÷s stadija ...................................................................................359

13.2.1 Šviesos sugertis...............................................................................................359 13.2.2 Chlorofilo vaidmuo fotocheminiame akte......................................................360 13.2.3 Šviesą sugaudanti antena ................................................................................361

13.3 Fotosintetinių bakterijų reakcinio centro struktūra ir elektronų perenešimas. .......363

225

13.3.1 Ciklin÷ elektronų pernešimo grandin÷ fosintetinančiose bakterijose .............364 13.4 Fotosintez÷ augaluose ir melsvabakter÷se. .............................................................366

13.4.1 Fotosistema I...................................................................................................368 13.4.2 Fotosistema II. ................................................................................................369 13.4.3 Deguonį išlaisvinanti sistema (DIS). ..............................................................371 13.4.4 Fotosintez÷s kvantin÷ išeiga ...........................................................................372

13.5 Nuo šviesos priklausoma ATP sintez÷ - fotofosforilinimas. ..................................373 13.6 Fotosintez÷s tamsin÷ stadija. Kalvino ciklas ..........................................................373 13.7 Fotokv÷pavimas......................................................................................................377

13.7.1 C4 augalai........................................................................................................378 13.7.2 CAM augalai...................................................................................................380

14 LIPIDŲ BIOSINTEZö ........................................................................................................ 382 14.1 Riebalų rūgščių sintez÷ , .........................................................................................382

14.1.1 Acetil-KoA pernešimas iš mitochondrijų į citozolį. .......................................383 14.1.2 Acetil-KoA karboksilinimas...........................................................................384 14.1.3 Riebalų rūgščių sintaz÷ ...................................................................................385 14.1.4 Riebalų rūgščių biosintez÷s etapai..................................................................386 14.1.5 Riebalų rūgščių sintez÷ eukariotuose .............................................................388 14.1.6 Angliavandenilin÷s grandin÷s ilginimas ir nesočių riebalų rūgščių sintez÷ ...388

14.2 Triacilglicerolių biosintez÷ .......................................Error! Bookmark not defined. 14.3 Fosfoacilglicerolių biosintez÷...................................Error! Bookmark not defined. 14.4 Cholesterolio sintez÷ ................................................Error! Bookmark not defined.

14.4.1 Mevalonato sintez÷ iš acetato ...........................Error! Bookmark not defined. 14.4.2 Cholesterolio transporto ir biosintez÷s reguliacija. .........Error! Bookmark not defined.

15 ANGLIAVANDENIŲ BIOSINTEZö ................................................................................. 403 15.1 Gliukoneogenez÷ ....................................................................................................403 15.2 Glikogeno biosintez÷, .............................................................................................407

15.2.1 Glikogeno sintez÷s reguliacija,.......................................................................409 16 NUKLEOTIDŲ APYKAITA .............................................................................................. 411

16.1 Nukleorūgščių skaidymas.......................................................................................411 16.2 . Purinų katabolizmas, ............................................................................................412

16.2.1 Šlapimo rūgšties skaidymas............................................................................414 16.3 Pirimidinų katabolizmas,........................................................................................416 16.4 Purino ir pirimidino nukleotidų sintez÷ ..................................................................418

16.4.1 Purino nukleotidų biosintez÷, .........................................................................418 16.4.2 Inozino monofosfato biosintez÷......................................................................418 16.4.3 Adenozino monofosfato (AMP) ir guanozino monofosfato (GMP) biosintez÷ 422 16.4.4 Nukleozidų di- ir nukleozidų trifosfatų sintez÷ ..............................................423 16.4.5 Purino nukleotidų biosintez÷ iš azotinių bazių...............................................424

16.10 Hipoksantino, guanino ir adenino fosforibozilinimas ir IMP,GMP ir AMP susidarymas 424 16.4.6 Purino nukleotidų sintez÷s reguliacija............................................................424 16.4.7 Pirimidino nukleotidų sintez÷.........................................................................425

16.5 Ribonukleotidų redukcija iki deoksiribonukleotidų ...............................................428 16.5.1 dTMP susidarymas .........................................................................................429

17 AMINORŪGŠČIŲ BIOSINTEZö ...................................................................................... 433 17.1 Azoto fiksacija........................................................................................................433

17.1.1 Amoniako įjungimas į glutamatą ir glutaminą ...............................................435

226

17.2 Aminorūgščių biosintez÷ ........................................................................................438 17.3 Aminorūgštys yra įvairių biomolekulių pirmtakai..................................................440 17.4 Azoto oksido sintez÷ iš arginino.............................................................................442

17.4.1 Azoto oksido sintaz÷.......................................................................................443

II DALIS Medžiagų apykaita

7 MEDŽIAGŲ APYKAITA IR BIOENERGETIKA

7.1 Bendra medžiag ų apykaitos charakteristika Cheminių reakcijų vykstančių gyvuose organizmuose ir katalizuojamų fermentų

visumą vadiname medžiagų apykaita arba metabolizmu. Tai aukštai koordinuotas, griežtai reguliuojamas, kryptingas procesas.

Medžiagų apykaitos pagrindin÷s funkcijos yra šios:, 1. ląstel÷je vykstančių procesų aprūpinimas chemine energija, kuri gaunama

akumuliuojant saul÷s šviesos energiją arba skaidant maistin÷se medžiagose esančius cheminius ryšius.

2. maisto medžiagų pavertimas ląstelei reikalingomis molekul÷mis 3. monomerinių pirmtakų polimerizacija į polimerines medžiagas, tokias kaip

baltymus, nukleorūgštis, polisacharidus ir kitus ląstel÷s komponentus. 4. biomolekulių, reikalingų specifiškoms ląstel÷s funkcijoms sintez÷ ir

skaidymas. 7.1 lentel÷ Organizmų klasifikacija pagal energijos ir anglies šaltinius.

Organizmo tipas ATP šaltinis NADPH šaltinis

Anglies šaltinis

Pavyzdys

Chemoautotrofas Neorganinių medžiagų oksidacija

Neorganinių medžiagų oksidacija

CO2 Vandenilin÷s, sieros,

geležies, ir denitrifikuo-jančios bakteri-jos

Fotoautotrofai Saul÷s šviesa H2O CO

2 Aukštesniųjų augalų

ląstel÷s, melsvadumbliai fotosintezuojančios bakterijos

Fotoheterotrofai Saul÷s šviesa Organinių medžiagų oksidacija

Organin÷s medžiagos

Purpurin÷s nesierin÷s bakterijos

Heterotrofai Organinių medžiagų oksidacija

Organinių medžiagų oksidacija

Organin÷s medžiagos

Visi aukštes-nieji gyvūnai, dauguma mi-kroorganizmų, nefotosintezuojančios augalų ląstel÷s

227

Gyvus organizmus, pagal tai kokia forma iš aplinkos paima anglį, galime suskirstyti į dvi grupes:

1. Autotrofai kaip anglies šaltinį panaudoja atmosferos anglies dvideginį. Tai yra fotosintetin÷s bakterijos, melsvabakter÷s, augalai. Melsvabakter÷s, jos dar vadinamos ciano bakterijomis arba melsvadumbliais organinių medžiagų sintezei gali panaudoti atmosferos azotą.

2. Heterotrofai anglį iš aplinkos turi gauti organinių molekulių pavidale. Aukštesniųjų gyvūnų ląstel÷s ir dauguma mikroorganizmų yra heterotrofai.

Dauguma autotrofinių organizmų yra fotosintetikai, jie saul÷s energiją transformuoja į cheminių ryšių energiją. Heterotrofiniai organizmai skaido autotrofų sintetintas organines medžiagas ir gauna energiją. Mūsų biosferoje autotrofai ir heterotrofai gyvena glaudžiame tarpusavio ryšyje.

Organin÷s medžiagos

CO2

H2O

O2

HeterotrofaiFotosintetinantys autotrofai

7.1 pav. Anglies ir deguonies apykaita tarp autotrofinių ir heterotrofinių organizmų, Gyvuose organizmuose sintetinamoms aminorūgštims, nukleotidams, bei kitiems

junginiams būtinas azotas. Daugumoje atvejų augalai azotą panaudoja amoniako ar nitratų pavidale, žinduolių organizmuose pagrindinis azoto šaltinis yra aminorūgštys ir kitos organin÷s medžiagos. Tiktai nedaugelis mikroorganizmų, tokie kaip melsvabakterijos ir kelios rūšys žem÷je simbioz÷je su augalais gyvenančių bakterijų fiksuoja atmosferos azotą. Kiti mikroorganizmai oksiduoja susidariusi amoniaką iki nitritų ir nitratų. Taigi kartu su anglies, deguonies ciklu atmosferoje sukasi ir azoto apykaitos ciklas.

228

Nitrifikuojančiosbakterijos

Azotą fiksuojančiosbakterijos

Augalai

Gyvūnai

Amoniakas

Nitritainitratai

Aminorūgštys

Atmosferos azotas

Denitrifikuojančiosbakterijos

7.2 pav. Azoto ciklas biosferoje, Metabolizmas yra visų ląstel÷je vykstančių cheminių virsmų suma. Metabolizmas

susideda iš katabolizmo ir anabolizmo: 1) katabolizmas, yra skaidymo stadija, jos metu organin÷s maisto molekul÷s (baltymai,

angliavandeniai ir riebalai) yra paverčiami į smulkesnius galutinius produktus ( CO2, NH3, pieno rūgštį, šlapimo rūgštį ir kitas). Katabolinių procesų metu išsiskyrusi energija dalinai sukaupiama ATP ir redukuotų nukleotidų (NADH, NADPH, FADH2) pavidalu, dalinai atsipalaiduoja šilumos pavidalu.

2) anabolizmas – jis dar vadinamas biosinteze, iš pirmtakų yra sintetinamos sud÷tingos, didel÷s molekulin÷s mas÷s medžiagos tokios kaip baltymai, nukleorūgštys, lipidai. Sintezei reikalinga energija (ATP) ir redukcin÷ medžiaga (NADPH) susidaro katabolizmo metu. Anabolizme proceso metu organizmas sintetina jam reikalingus cheminius junginius.

Nežiūrint į metabolinių kelių sud÷tingumą, daugumą cheminių reakcijų vykstančių gyvuose organizmuose galima suskirstyti į penkias pagrindines grupes: 1) oksidacijos ir redukcijos reakcijos, 2) reakcijos, kurių metu suyra C-C ryšys, 3) vidumolekuliniai persitvarkymai – izomerizacija, eliminacija, 4) grup÷s pernešimo reakcijos ir 6) laisvaradikalin÷s reakcijos.

Anabolizme ir katabolizmo procesus sujungia energijos ir redukuojančių ekvivalentų nešikliai.

229

ADPNADP+

NAD+

FADH2

ATPNADPHNADHFADH2

KATABOLIZMAS

ANABOLIZMAS

AngliavandeniaiRiebalaiBaltymai

H2O CO2

NH3

Metabolitai

AngliavandeniaiRiebalaiBaltymai

H2O CO2

NH3

Metabolitai

7.3 pav. Katabolizmo ir anabolizmo procesų sujungimas. Metaboliniai procesai vyksta įvairiais keliais . Šie medžiagų apykaitos keliai gali būti

linijiniai. Substratas paverčiamas į produktą nuosekliai, vienos po kitos einančių biocheminių reakcijų. Tokie procesai yra glikoliz÷ (8.1 skyrius), cholesterolio (14.4 skyrius), kai kurių aminorūgščių biosintez÷ (17 skyrius). Kai kurie keliai yra šakoti, iš vieno produkto susidaro daug skirtingų produktų, pavyzdžiui aromatinių aminorūgščių biosintez÷. Plačiai paplitę cikliniai metabolizmo keliai, kai substratas yra ir galutinis ciklo produktas. Trikarboksirūgščių ciklas (9.2 skyrius), karbamido ciklas (11.4.2 skyrius) vyksta šiuo būdu. Spiralinio metabolizmo proceso pavyzdys gal÷tų būti riebalų rūgščių oksidacija (10.4.3 skyrius). Riebalų rūgštys yra oksiduojamos atskeliant po dviejų anglies atomų fragmentą, kiekvieno ciklo metu pasikartoja tos pačios fermentin÷s reakcijos, tačiau jau su pakeistu substratu.

Medžiagų apykaitos kataboliniai ir anaboliniai keliai skiriasi: 1. Anabolinius ir katabolinius procesus katalizuoja skirtingi fermentai . 2. Energetinis aprūpinimas, katabolinių procesų metu, išsiskyrusi energija yra

sukaupiama ATP arba redukuotų nukleotidų NADH, FADH2, ir NADPH formoje. Anaboliniuose procesuose šios medžiagos yra panaudojamaos sintez÷ms.

3. Šie procesai yra skirtingai reguliuojami. 4. Kataboliniai ir anaboliniai procesai dažnai vyksta skirtingose ląstel÷s

kompartmentuose. Pavyzdžiui riebalų rūgščių biosintez÷ vyksta citozolyje, o skaidymas mitochondrijų užpilde.

Metaboliniai keliai yra unifikuoti. Pradžioje skaidymas vyksta individualiais keliais v÷liai jie susijungia. Baltymų, angliavandenių, riebalų skaidymas vyksta keliais etapais. Pirmame etape į organizmą patekusios polimerin÷s medžiagos hidrolizuojamos iki monomerų. Baltymai suskaidomi iki aminorūgščių, krakmolas ir glikogenas iki gliukoz÷s, disacharidai iki monosacharidų. Riebalai (triacilgliceroliai) suskaidomi iki glicerolio ir riebalų rūgščių. Sekančiame etape gliukoz÷ glikoliz÷s proceso metu oksiduojama iki piruvato, kuris paverčiamas acetil-KoA. Acetil-KoA patenka į trikarboksirūgščių ciklą, kurio galutiniai produktai yra CO2 ir redukuoti nukleotidai NADH ir FADH2. Redukuoti nukleotidai

230

oksidacinio fosforilinimo proceso metu oksiduojami, susidaro vanduo, o išsiskyrusi energija sukaupiama didžianerginiame junginyje ATP. Riebalų rūgščių oksidacijos metu susidaręs acetil-KoA taip pat patenka į trikarboksirūgščių ciklą. Glicerolis paverčiamas glikoliz÷s tarpiniu produktu ir suskaidomas. Galutiniai riebalų oksidacijos produktai yra CO2 ir H2O. Skaidant aminorūgštis, jose esantis azotas pašalinamas NH3 formoje, o anglies skeletas įjungiamas į glikoliz÷s, trikarboksirūgščių procesus. Tokiu būdu matome kad galutiniai baltymų, angliavandenių ar riebalų skilimo produktai yra CO 2, H2O, NH3 ir išsiskiria energija, kuri sukaupiama ATP didžiaenergių ryšių formoje.

Nesvarbu iš kur gautas acetil-KoA jis tolimesniuose virsmuose yra vienodai

skaidomas MAISTAS

Baltymai Angliavandeniai Riebalai

Aminorūgštys Gliukoz÷

Piruvatas

Acetil-KoA

Trikarboksirūgščių ciklas

NADHFADH2

ATPGTP

CO2

H2O

O2

ATP

ATP

NH3

Glikoliz÷

Oksidacinis fosforilinimas

GlicerolisRiebalų rūgštys

7.3 pav. Bendra baltymų, angliavandenių ir riebalų skaidymo schema

231

Labai svarbus metabolizmo aspektas yra jo reguliacija. Biochemin÷s reakcijos vykstančios ląstel÷je vyksta koordinuotai yra labai griežtai reguliuojamos. Reguliuojama įvairiais lygiais – organizmo lygyje tai nervin÷ ir hormonin÷ reguliacija, ląstel÷se reguliuojamas fermentų ar substratų kiekis arba fermentų aktyvumas. Kada viduląstelin÷s substrato koncentracijos yra artimos katalizuojamos reakcijos fermento KM, reakcijos greitis labai priklauso nuo substrato koncentracijos. Fermento kiekis prikaluso nuo no sintez÷s ar degradacijos greičio. Šis reguliacijos būdas yra l÷tas. Greitos reakcijos reguliacijos tipas yra fermento aktyvumo reguliacija. Tai gali būti alosterin÷ reguliacija, kovalentin÷ modifikacija, proteolitin÷ aktyvacija. Biocheminiai procesai efektyviai reguliuojami juos vykdant skirtingose ląstel÷s kompartmentuose. Riebalų rūgštys oksiduojamos mitochondrijose, o jų sintez÷ vyksta citozolyje. Šiuos du procesus katalizuoja skirtingi fermentai, erdv÷je yra atskirti reaguojančių medžiagų fondai (acetil-KoA yra substratas riebalų rūgščių sintezei ir riebalų rūgščių skaidymo tarpinis produktas). Daugialąsteliniuose organizmuose metaboliniai aktyvumai reguliuojami augimo faktorių, hormonų.

7.2 Termodinamika ir bioenergetika Bioenergetika tiria energijos panaudojimą ir pernešimą biologin÷se sistemose. Sistemos paj÷gumą atlikti darbą apsprendžia Gibso laisvoji energija (∆G). Gibso

laisvoji energija nurodo energijos kiekį galinti reakcijos metu atlikti darbą, esant pastoviai temperatūrai ir sl÷giui. Bioenergetikoje svarbu tiktai pradiniai ir galutiniai reaguojančių medžiagų energetiniai būviai, kokiu keliu reakcija vyks, koks reakcijos mechanizmas n÷ra svarbu.

Chemin÷s reakcijos kryptį ir kokiu laipsniu ji vyks apsprendžia Gibso laisvosios energijos pokytis (∆∆∆∆G). Sistemos paj÷gumas atlikti darbą sumaž÷ja, kai pasiekiama pusiausvyra. ∆G apibr÷žia pusiausvyros būvį ir yra lygi:

∆G = ∆H + ∆S ∆∆∆∆H yra entalpijos pokytis, entalpija yra reaguojančių medžiagų ir produktų šilumos

matas. ∆∆∆∆S yra entropijos pokytis, entropija yra sistemos netvarkingumo matas. Jeigu turime reakciją A ? B laisvosios energijos pokytis (∆G) numatys reakcijos

kryptį. 1) jei ∆G<0, proceso metu energija išsiskiria, jis vyksta spontaniškai, iš A susidaro

produktas B ir procesas vadinamas egzergoninis, 2) jei ∆G>0, proceso vyksmui reikalinga energija, jis savaimingai nevyksta ir yra

vadinamas endergoniniu, 3) jei ∆G=0, tai sistema yra pusiausvyroje.

Panagrin÷kime procesą A + B C + D Šios reakcijos laisvosios energijos pokytis apskaičiuojamas pagal lygtį:

[A][B][C][D]

RTlnGG 0/ +∆=∆ o _ ____

∆G0 - standartinis laisvosios energijos pokytis R – dujin÷ konstanta (8,315 J/mol K) T – absoliutin÷ temperatūra (0K)

232

Reakcija, kurios ∆G0 yra teigiamas vyks produktų susidarymo kryptimi, jeigu santykis [C][D]/[A][B] yra labai mažas ir bendras ∆G yra neigiamas.

∆G0 yra standartinis laisvosios energijos pokytis, jis lygus ∆G, kai reaguojančių medžiagų koncentracijos lygios 1M. Šiose sąlygose santykio natūrinis logaritmas lygus 0 ir ∆G = ∆G0. ∆G0 nusako reakcijos kryptį tiktai standartin÷se sąlygose.

Biochemin÷s reakcijos vyksta vandenin÷je terp÷je, kur vandens koncentracija yra lygi

55,5M ir dažniausiai neutraliuose tirpaluose, kur vandenilio jonų koncentracija lygi 10-7 g-ekv./ltr. Tod÷l biocheminiuose skaičiavimuose įvedama nauja standartin÷ laisvosios energijos pokyčio konstanta ∆G0/ kurioje įvertinami abu šie parametrai.

Reakcijos A?B laisvosios energijos pokytis (∆G) priklausys nuo reaguojančių medžiagų koncentracijos.

∆G yra tiesiogiai susijusi su pusiausvyros konstanta Kpus. Reakcijos sistemos sud÷tis (produktų ir substratų koncentracijos pastoviai keičiasi), kol pasiekiama pusiausvyra. Pasiekus pusiausvyrą nevyksta cheminių medžiagų koncentracijos pokyčiai, kiek substratų virsta į produktus, tiek pat produktų pereina į substratus. Kai santykis [C][D]/[A][B] yra pastovus, tai

[A][B][C][D]

K pus =

Pasiekus pusiausvyrą

[A][B][C][D]

RTln∆G0∆G 0/ +== ir pus

0/ RTlnKG −=∆

Ryšys tarp pusiausvyros konstantos ir laisvosios energijos pokyčio pateiktas 2.2 lentel÷je.

Standartiniai laisvosios energijos pokyčiai yra adityvūs. Ši adityvumo savyb÷ labai svarbi biocheminiuose procesuose. Jeigu turime dvi nuosekliai einančias reakcijas A→B ir B→?C, kiekviena tuei savo pusiausvyros konstantą, savo ∆G1

0/ ir ∆G20/. Kadangi reakcijos

yra einančios iš eil÷s, tai bendra reakcija yra A?C, kurios laisvosios energijos pokytis yra ∆G3

0/. Laisvosios energijos pokytis nuoseklių reakcijų yra suma individualių reakcijų laisvųjų energijos pokyčių. ∆G3

0/ = ∆G10/ + ∆G2

0/ Šis bioenergetikos principas paaiškina, kaip vyksta termodinamiškai nepalankios

reakcijos (endergonin÷s). Jos tampa termodinamiškai palankios jas sujungus su aukštai egzergonin÷mis reakcijomis. Pavyzdžiui pirmoji glikoliz÷s reakcija yra gliukoz÷s 6-fosfato

sintez÷ : Gliukoz÷s 6-fosfatas + H2O ∆G0/ = +13,8 kJ/mol Gliukoz÷ + H3PO4 Teigiamas ∆G0/ rodo, kad standartin÷se sąlygose ši reakcija nevyksta. Kita ląstel÷je

vykstanti reakcija ATP hidroliz÷s yra labai egzergonin÷. ATP + H2O ADP + H2PO4 ∆G0/ = -30,5 kJ/mol

Šios dvi reakcijos turi bendrus tarpininkus, tod÷l jas galime parašyti kaip nuoseklias reakcijas ir pritaikyti adityvumo principą

Gliukoz÷s 6-fosfatas + H2O ∆G0/ = +13,8 kJ/mol1) Gliukoz÷ + H3PO4

2) ATP + H2O ADP + H2PO4 ∆G0/ = -30,5 kJ/mol

Suma: Gliukoz÷ + ATP Gliukoz÷s 6-fosfatas + ADP ∆G0/ = -16,7 kJ/mol

Kaip jau buvo min÷ta, laisvosios energijos pokyčiai yra susiję su pusiausvyros

konstanta. Pirmos reakcijos pusiausvyros konstanta yra lygi

233

1-3

n

/

pus1 M3.9x10][P [gliukoze]

fosfatas]-6 [gliukozesK −==

Vanduo n÷ra įjungtas į šią lygtį, kadangi skaitoma, kad jo koncentracija (55,5M) praktiškai nekinta. Antros reakcijos, ATP hidroliz÷s pusiausvyros konstanta yra lygi:

M2,0x10[ATP]

][ADP][PK 5n/

2 pus ==

Dviejų, susijusių reakcijų pusiausvyros konstanta Kpus 3 lygi

2pus21

n

n/3 pus 7,8x10 ))(K(

]][[P[gliukoze]]ADP][Pfosfatas][-6 [gliukozes

K === pusKATP

Jeigu turime procesą A→B→C→D, kai kurių tarpinių individualių reakcijų ∆G gali

būti teigiamas, tačiau jei bendras ∆G yra neigiamas, reakcijos pusiausvyra bus nukreipta į galutinio produkto susidarymo pusę.

7.2.1 ATP universali energetin ÷ valiuta Reakcijos, kurių ∆G yra teigiamas nukreipiamos termodinamiškai palankia kryptimi

jas sujungiant su kitomis reakcijomis, kurių laisvosios energijos pokytis yra ženkliai neigiamas. Viena iš universaliausių molekulių, kurios panaudojamos kaip energijos šaltinis yra ATP. ATP vaidina specialų vaidmenį surišant katabolizmą su anabolizme. Katabolizmo metu išsiskyrusi chemin÷ energija yra panaudojama ATP sintezei iš ADP ir Pn. Hidrolizuojantis ATP ši energija atsipalaiduoja ir yra panaudojama makromolekulių biosintezei iš mažesnių pirmtakų (baltymų, nukleorūgščių, polisacharidų) , medžiagų pernešimui pro membraną prieš jų koncentracijos gradientą bei mechaniniam jud÷jimui .

ATP didžiaenergis junginys. ATP yra universali energetin÷ valiuta, ji gali hidrolizuotis iki ADP ir Pn arba iki AMP ir PPn.

OCH2

H

OH

H

OH

HH

O P

O

O

O P

O

O

OPO

O

O

NH2

N

N

~ ~αβγ

7.4 pav. ATP struktūra. ~ pažym÷ti didžiaenergiai ryšiai. Hidrolizuojant fosfoanhidridinį ryšį ties β ir γ fosfatu, išsiskiria per 30,5kJ/mol, tuo

tarpu hidrolizuojant gliukoz÷s 6-fosfatą gauname tiktai 16,7kJ/mol. ATP + H2O ? ADP + Pn ∆G0/ = -30,5kJ/mol ADP + H2O ? AMP + PPn ∆G0/ = -45,6kJ/mol Tokie ryšiai, kuriuos hidrolizuojant išsiskiria daugiau nei 25kJ/mol vadinami

didžiaenergiais ryšiais. Kod÷l hidrolizuojant ATP išsiskiria tiek daug energijos? ATP molekul÷je yra trys

neigiamai įkrautos fosforo rūgšties liekanos, pašalinus vieną iš jų, sumaž÷ja atostūmio j÷gos tarp neigiamų krūvių; hidroliz÷s metu susidaro H2PO4

- kuris yra stabilizuojamas d÷ka rezonansinių formų; kitas produktas ADP2- disocijuoja ir protonas patenka į terpę su labai

234

žema [H+]; ATP hidroliz÷s produktai yra labiau solvatuoti ir stabilesni negu pati ATP molekul÷. .

.

O P

O

O

O

O P

O

OH

O

δδ

δ

δ

-

-

-Rezonansin÷stabilizacija

7.5 pav. Fosfato rezonansin÷ stabilizacija. Nors ATP hidroliz÷s energija yra didelę, tačiau ATP esant pH 7 yra stabili, nes ATP

hidroliz÷s aktyvacijos energija yra aukšta. ATP hidrolizę katalizuoja atitinkami fermentai. ADP taip pat turi didžiaenergį ryšį, tačiau ląstel÷je n÷ra fermentų, kurie jį hidrolizuotų.

ATP hidroliz÷s laisvosios energijos pokytis (∆G0/ = -30,5kJ/mol) yra išmatuotas standartin÷se sąlygose, ląstel÷je jo dydis (∆G) gali smarkiai skirtis. Ląstel÷je ATP, ADP, Pn koncentracijos n÷ra lygios 1M. Tikrasis substratas yra ne ATP4- , bet MgATP2- , Mg2+ susiriša su ADP ir ATP, tod÷l jo koncentracija yra skirtinga. Intaktin÷se ląstel÷se ∆G reikšm÷ yra žymiai neigiamesn÷ ir siekia nuo -50 iki -65kJ/mol, jis yra vadinamas fosforilinimo potencialu ir žymimas ∆Gp. Išmatavus ATP, ADP, AMP koncentracijas žmogaus eritrocituose apskaičiuotas ∆Gp = -52kJ/mol.

ATP n÷ra vienintelis didžiaenergis junginys, kurio energija yra panaudojama gyvuose organizmuose. Standartiniai kai kurių junginių hidroliz÷s ∆G0/ duomenys pateikti 7.2 lentel÷je.

I termodinamikos d÷snis nereikalauja, kad entropija did÷tų reakcijos sistemoje. Tvarka kuri did÷ja ląstel÷je, pilnai kompensuojama betvarke už ląstel÷s. Tvarka palaikoma naudojant energiją ir maisto medžiagas.

Ląstel÷s yra izotermin÷s sistemos, šilumos srautas n÷ra panaudojamas ląstel÷s gyvybin÷ms funkcijoms palaikyti

7.2 lentel÷. Standartiniai kai kurių cheminių junginių hidroliz÷s laisvosios energijos pokyčiai (∆G0/)

Reakcijos tipas ∆G/0 (kJ/mol) (kcal/mol) Hidroliz÷s reakcijos Rūgšties anhidridai ATP + H2O → ADP + Pn

ATP + H2O → AMP + PPn

PPn + H2O → 2Pn

1,3-bisfosfogliceratas + H2O → 3-fosfogliceratas + Pn

Esteriai Kreatino fosfatas + H2O → kreatinas + Pn

Fosfoenolpiruvatas + H2O → piruvatas + Pn

Acetil-KoA + H2O → Acetatas + KoA Gliukoz÷s 6-fosfatas +H2O → gliukoz÷ + Pn

Glikozidai Maltoz÷ + H2O → 2 gliukoz÷s

-30,5 -45,6 -19,2 -49,3 -43,0 -61,9 -31,4 -13,8 -15,5

-14,8 -7,3 -10,9 -4,6 -11,8 -10,3 -14,8 -7,5 -3,3 -3,7

235

Oksidacija molekuliniu deguonimi Gliukoz÷ + 6O2 →6CO2 + 6H2O Palmitatas + 23O2 → 16CO2 + 16H2O

-

2840 -

9770

-

686 -

2338 ATP hidroliz÷s metu išsiskyrusi energija panaudojama įvairiems procesams vykdyti.

Kokiu būdu ši energija panaudojama naudingam darbui atlikti? Tiesiogin÷s ATP hidroliz÷s iki ADP irPn metu energija išsiskiria šilumos pavidalu ir n÷ra panaudojama. Dažniausiai reakcija vyksta dviem stadijom ( 7.6 pav.). Pirmoje stadijoje ATP molekul÷s fosforil- arba pirofosforilgrup÷ arba AMP yra pernešamos ir kovalentiškai prijungiamos prie substrato molekul÷s ar prie baltymo aminorūgšties. Šis prijungimas padidina substrato laisvosios energijos kiekį. Antroje stadijoje fosfato grupę turinti dalis yra pakeičiama ir atsipalaiduoja Pn, PPn ar AMP. Pav. parodyta glutamino sintez÷ katalizuojant glutamilsintetazei. Pirmoje stadijoje ATP fosforilina glutamatą ir susidaręs glutamilfosfatas lieka susirišęs su fermentu. Antroje stadijoje amoniakas pakeičia fosfatą ir gauname glutaminą

CH

COO

H3N

CH2

CH2

CO O-

CH

COO

H3N

CH2

CH2

CO NH2

CH

COO

H3N

CH2

CH2

CO O

PO

OO

-+

+ NH3

ATP ADP + Pn-

+

Glutamatas Glutaminas-

+

--

Glutamilfosfatas tarpinis junginyssurištas su fermentu

ATP

ADP NH3

Pn

12

Vienos stadijos reakcija

Dviejų stadijų reakcija

7.6 pav. Glutamino sintez÷s reakcija, vykstant dviejų stadijų reakcijai, susidaro

tarpinis glutamilfosfatas, kuris virsta reakcijos produktu glutaminu. Vykstant kai kuriems procesams ATP hidrolizuojama tiesiogiai. ATP (arba GTP)

nekovalentiškai prisijungia prie baltymo molekul÷s ir hidrolizuojasi. Išsiskyrusi energija cikliškai keičia baltymo konformaciją. Šis procesas vyksta susitraukiant raumenims, judant fermentams išilgai DNR molekul÷s, judant ribosomoms iRNR molekule.

7.2.2 Didžiaenergiai junginiai Junginiai turintys didžiaenergius ryšius, kurių hidroliz÷s energija daugiau nei –25

kJ/mol. Biologin÷se sistemose chemin÷ energija išsiskyrusi oksiduojant maisto medžiagas

236

saugoma ir perduodama didžiaenergiais junginiais. Tai gali būti fosforo rūgšties anhidridai (ATP ir kiti nukleozido trifosfatai UTP,GTP, CTP), enolfosfatai (fosfoenolpiruvatas), fosfoamidai (arginino fosfatas, kreatino fosfatas), tioesteriai (acetil-KoA, sukcinil-KoA). Biologin÷se sistemose išsiskyrusi energija naudojama grupių pernešimo reakcijoms. Didžiaenergio junginio hidroliz÷s laisvoji energija yra grup÷s pernešimo potencialo matas.

Plačiausiai paplitęs didžiaenergis junginys yra ATP, kuri naudojamas chemin÷ms sintez÷ms, medžiagų pernašai per biologines membranas prieš jų koncentracijos gradientą, nervinio impulso perdavimui, raumenų susitraukimui, ląstel÷s organoidų, bakterijų jud÷jimui.

Fosfoenolpiruvatas turi didžiausia fosforilo grup÷s pernešimo potencialą, jo standartin÷ laisvosios energijos hidroliz÷s energija yra –62kJ/mol.

Fosfokreatinas yra fosforilgrup÷s šaltinis reikalingas greitai ATP sintezei. Pernešti fosforilgrupę nuo fosfokreatino ant ADP yra greitesnis procesas nei sintetinti ATP katabolinių procesų metu

Fosfokreatino koncentracija skeletiniuose raumenyse yra per 30mM, tai beveik 10 kartų daugiau nei [ATP]. Kituose audiniuose - lygiuose raumenyse, smegenyse ir inkstuose jo koncentracija siekia 5 – 10mM. Kreatino kinaz÷ katalizuoja grįžtamą reakciją

ATP + Kreatinas DG0/ = -12,5kJ/molADP + FosfokreatinasKreatino kinaz÷

Sumaž÷jus ATP poreikiui ir padid÷jus jo sintezei, kreatinas yra fosforilinamas ir

atstatomas jo fondas. Neorganiniai polifosfatai yra linijiniai polimerai sudaryti iš dešimčių ar šimtų fosfato

liekanų, sujungtų fosfoanhidridiniais ryšiais. Viena iš polifosfatų funkcijų yra fosforilgrup÷s fondas, naudojamas greitam ATP koncentracijos atstatymui. Polifosfatai turi panašų fosforilgrup÷s pernešimo potencialą kaip ir PPn. Pirofosfatas yra energijos šaltinis aktyviam H+ pernešimui augalų vakuol÷se, kai kurie augalai pirofosfatą naudoja fosfofruktokinazin÷je reakcijoje fruktoz÷s 6-fosfato fosforilinimu.

ATP gali būti fosforil-, pirofosforil- adenililgrupių donoras. ATP kiekvienas iš fosfatų

α, β ir γ gali dalyvauti nukleofilin÷je reakcijoje ir atakuoti angliavandenių ar alkoholių hidroksigrupę, kreatino azotą arba arginino ir histidino šonines grandines.

Nukleofilin÷s γ fosfato atakos alkoholio molekul÷s metu susidaro fosfato esteris. Buvo parodyta, kad deguonies atomas dalyvaujantis esterinio ryšio sudaryme yra iš alkoholio. Nuo ATP yra pernešama fosforilgrup ÷ (-PO3

2-), o ne fosfato (-OPO32-).

Atakuojant β fosfatą yra pakeičiamas AMP ir pirofosforilgrup ÷ pernešama ant atakuojamo nukleofilo. Susidarant 5/-fosforibozil-1-pirofosfatui, pagrindiniam nukleotidų biosintez÷s tarpininkui, riboz÷s hidroksigrup÷ atakuoja fosfatą.

Adenilinimo reakcijose yra atakuojamas fosfatas ir adenililgrup÷ prijungiama prie atitinkamo akceptoriaus. α−β fosfoanhidridinio ryšio hidroliz÷s metu išsiskiria daugiau energijos (~46kJ/mol) negu hidrolizuojant β−γ ryšį. Be to susidaręs reakcijos metu PPn yra hidrolizuojamas plačiai sutinkamo fermento neorganin÷s pirofosfataz÷s. Išsiskyrus papildomai 19kJ/mol energijos reakcija pastumiama adenilinimo kryptimi. Termodinamiškai adenilinimo reakcijos yra labai palankios. Riebalų rūgščių aktyvacijos reakcijoje riebalų rūgštys aktyvuojamos jas adenilinant.

237

8 GLIKOLIZö Beveik visi gyvi organizmai vykdo glikolizę, kurios metu suskaidoma gliukoz÷ ir

išsiskiria energija. (gr. Glyk -saldus, lysis - skaidymas). Šis procesas yra centrinis, universalus gliukoz÷s metabolizmo kelias. Glikoliz÷ vyksta citozolyje ir nereikalauja deguonies buvimo. Šio proceso metu buvo apsirūpinama energija pirmais biologin÷s evoliucijos žem÷je metais. Glikoliz ÷ yra fermentinis procesas, kurio metu gliukoz÷ yra suskaidoma iki piruvo rūgšties ir dalis energijos sukaupiama ATP ir NADH formoje. Dar dažnai glikolize yra vadinamas anaerobinis gliukoz÷s skaidymas iki pieno rūgšties. Aerobin÷se sąlygose piruvo rūgštis oksiduojama iki CO2 ir H2O. Anaerobin÷se sąlygose raumenyse piruvo rūgštis redukuojama iki pieno rūgšties, miel÷se paverčiama į etilo alkoholį, mikroorganizmuose galutinis gliukoz÷s oksidacijos produktas yra įvairios organin÷s rūgštys (acto rūgštis, sviesto rūgštis ir kitos), acetonas, butanolis ir kiti produktai.

Gliukoz÷, sacharoz÷, krakmolas, glikogenas

Etilo alkoholis Piruvo rūgštis Pieno rūgštis -O2 -O2

miel÷s raumenys

CO2 + H2O

+O2

Organin÷s rūgštysacetonas ir tt

Mikroorga-nizmai

8.1 pav. Angliavandenių skaidymo schema Glikoliz÷ vyksta citozolyje ir susideda iš dviejų stadijų: 1) gliukoz÷ suskaidoma į dvi glicerolio aldehido 3-fosfato molekules, 2) dvi glicerolio aldehido 3-fosfato molekul÷s suskaidomos iki dviejų piruvo rūgšties

molekulių Pirmoje stadijoje panaudojamos dvi ATP molekul÷s, antroje - susidaro keturios ATP. Taigi galutinis glikoliz÷s rezultatas yra 2 ATP molekul÷s. Bendra glikoliz÷s reakcijų schema pavaizduota 8.2 pav.

238

Gliukoz÷

ATP

ADPHeksokinaz÷

Gliukoz÷s 6-fosfatas

Gliukoz÷s 6-fosfato izomeraz÷

Fruktoz÷s 1-fosfatasATP

ADPFosfofruktokinaz÷ 1

Fruktoz÷s 1,6-bisfosfatas

Glicerolio aldehido 3-fosfatas

Dihidroksiacetono fosfatas

NAD+

PnNADH + H+

1,3-bisfosfogliceratasADP

ATP3-fosfogliceratas

2-fosfogliceratas

FosfoenolpiruvatasADP

ATP

Piruvatas

II stadija

I stadija

Glicerolio aldehido3-fosfato dehidrogenaz÷

1,3-bisfosfogliceratasADP

ATP

Fosfogliceratokinaz÷

3-fosfogliceratas

2-fosfogliceratas

Fosfoglicerato mutaz÷

Enolaz÷

FosfoenolpiruvatasADP

ATP

Piruvatokinaz÷

Piruvatas

Glicerolio aldehido 3-fosfatas

NAD+

PnNADH + H+

Izomeraz÷

8.2 pav. Bendra glikoliz÷s schema

239

8.1 Glikoliz ÷s reakcijos

8.1.1 I glikoliz ÷s stadija 1. Gliukoz÷s skaidymas prasideda nuo jos fosforilinimo. Šią reakciją katalizuoja

fermentas heksokinaz÷ arba gliukokinaz÷.

OCH2OH

HH

OHH

OH

OH

HOH

H OCH2OPO3

HH

OHH

OH

OH

HOH

H + ATP + ADP

∆G0 /

16,7kJ/mol

Gliukoz÷ Gliukoz÷s 6-fosfatas

2-Heksokinaz÷ Mg2+

Heksokinazin÷ reakcija praktiškai negrįžtama. ATP hidroliz÷s energija (∆G0/ = -

30,5kJ/mol) yra didel÷, o gliukoz÷s fosforilinimui reikia tiktai 13,8kJ/mol. Taigi bendra heksokinazin÷s reakcijos ∆G0/ =-16,7kJ/mol, o tai rodo, kad ji nukreipta į gliukoz÷s 6-fosfato susidarymo pusę. ∆G0/ atspindi laisvosios energijos pokytį standartin÷se sąlygose, ląstel÷je ∆G priklausys nuo metabolitų koncentracijos (žr. Lentel÷ Nr. 8.1) ir gali ryškiai skirtis nuo ∆G0/

reikšmių. Ši reakcija yra viena iš trijų pagrindinių glikoliz÷s procesą reguliuojančių stadijų. Dauguma heksokinazių yra nespecifiniai fermentai, jie katalizuoja manoz÷s, fruktoz÷s, galaktoz÷s ir kitų heksozių fosforilinimą. Kinaz÷s yra fermentai, kurie perneša fosforilo grupę nuo ATP ant substrato. Heksokinaz÷s kaip ir daugelio kitų kinazių veikimui reikalingi Mg2+ jonai. Reakcijos tikruoju substratu yra ne ATP4- bet Mg2+- ATP4- kompleksas. Heksokinazei prisijungus gliukozę ir ATP vyksta dideli baltymo konformaciniai pakitimai, du fermento domenai erdv÷je suart÷ja per 0,8nm ir uždaro substrato molekules fermento aktyviame centre. Jud÷dama baltymo molekul÷ suartina ATP ir gliukozę bei pašalina vandenį iš fermento aktyvaus centro. Tod÷l fosforilo grup÷ nuo ATP pernešama ant gliukoz÷s hidroksigrup÷s, o ne ant vandens.

Susidaręs gliukoz÷s 6-fosfatas yra įkrautas neigiamai, tod÷l negali laisvai difunduoti iš ląstel÷s. Be to, kadangi reakcija nukreipta į produkto susidarymo pusę, gliukoz÷s koncentracija ląstel÷je sumaž÷ja ir tai palengvina jos tolimesnę difuziją į ląstelę. Gliukoz÷s 6-fosfatas, bei kiti fosforilinti glikoliz÷s tarpininkai negali išeiti iš ląstel÷s, be to fosfato grup÷s buvimas palengvina fosforilintiems tarpininkams susirišti su fermentu.

Gyvulių audiniuose yra keletas heksokinaz÷s izofermentų. Raumenyse yra heksokinaz÷, kepenyse – gliukokinaz÷ (ji dar vadinama heksokinaz÷ IV), su mitochondrijų išorine membrana susiriša heksokinaz÷ II. Šie izofermentai skiriasi savo kinetin÷mis ir reguliatorin÷mis savyb÷mis jautrumu inhibitoriams, bei giminingumu substratams.

Daugumoje bakterijų gliukoz÷ fosforilinama fosfotransferazin÷s sistemos, pernešant angliavandenį per membraną. Fosforo rūgšties donoras yra fosfoenolpiruvatas. Bakterijose sutinkamos heksokinaz÷s ir gliukokinaz÷s, tačiau jų vaidmuo glikoliz÷je nežymus.

Gliukoz÷s 6-fosfatas labai svarbus gliukoz÷s virsmuose. Gliukoz÷ chemiškai mažai aktyvi. Pirmoje stadijoje ji fosforilinama iki gliukoz÷s 6-fosfato, kuris yra tolimesnių produktų pirmtakas. Aerobin÷se sąlygose gliukoz÷ oksiduojama iki CO2 ir H2O. Anaerobin÷se sąlygose galutiniai skaidymo produktai yra pieno rūgštis (raumenys), etilo alkoholis (miel÷s), įvairios organin÷s rūgštys (mikroorganizmai). Gliukoz÷s 6-fosfatas yra pirmtakas kitų monosacharidų, oligosacharidų ir polisacharidų, jo skilimo produktai panaudojami aminorūgščių, lipidų ir kitų biologiškai svarbių junginių susidaryme. Tiesioginio gliukoz÷s 6-fosfato skaidymo

240

(pentozinio ciklo )metu susidaro NADPH, pentoz÷s, tetroz÷s.

gliukoz÷s-6-fosfatas

piruvatas pieno rūgštisetilo alkoholis

CO2 , H2O

pentozinis ciklas

Gliukoz÷ oligosacharidai

monosacharidaipolisacharidai

organin÷s rūgštys

lipidai

aminorūgštys

8.3 pav. Gliukoz÷s 6-fosfato virsmai. 2. Katalizuojant gliukoz÷s 6-fosfato izomerazei, gliukoz÷s 6-fosfatas

izomerizuojamas į fruktoz÷s 6-fosfatą. Fermentas yra stereospecifiškas. Fermento aktyviame centre gliukoz÷s 6-fosfato α anomeras pereina į linijin ę formą ir iš aldoz÷s susidaro ketoz÷. Susidarant fruktoz÷s 6-fosfatui karboniline grup÷ nuo C-1 pereina ant C-2 tod÷l palengv÷ja hidroksilo fosforilinimas prie C-1 atomo. Be to, karbonilo grup÷, atsiradusi prie C-3 (linijin÷je fruktoz÷s formoje) aktyvuoja C-3 ir ryšys tarp C-3 ir C-4 anglies atomų ketvirtoje glikoliz÷s reakcijoje lengvau suyra.

OCH2OPO3

HH

OHH

OH

OH

HOH

H O

CH2OPO3

H

OH

H

H

OHOH

CH2OH

∆G0/ = 1,7kJ/mol

2- 2-

Gliukoz÷s 6-fosfatas Fruktoz÷s 6-fosfatas

Izomeraz÷

3. Fosfofruktokinaz÷-1 (PFK-1) katalizuoja fruktoz ÷s 6-fosfato fosforilinim ą.

Fosforilo grup÷ pernešama nuo ATP ant fruktoz÷s 6-fosfato C-1 hidroksigrup÷s, susidarant fruktoz÷s 1,6-bisfosfatui. Reakcija negrįžtama, jos ∆G0/ =-14.2kJ/mol. Šios reakcijos d÷ka gliukoz÷ yra toliau suskaidoma ir nepanaudojama kitų angliavandenių biosintezei. PFK-1 yra reguliuojamas fermentas ir ši reakcija yra viena iš pagrindinių glikoliz÷s reguliuojamų stadijų ( skyrius 8.8). Fermentas PFK-1 skiriasi nuo fosfofruktokinaz÷s-2 (PFK-2), kuri katalizuoja fruktoz÷s 2,6-bisfosfato susidarymą iš fruktoz÷s 6-fosfato

,

O

CH2OPO3

H

OH

H

H

OHOH

CH2OH O

CH2OPO3

H

OH

H

H

OHOH

CH2OPO3

+ ATP + ADP

∆G0/ = -14.2kJ/mol

2- 2-

2-

Fruktoz÷s 6-fosfatas Fruktoz÷s 1,6-bisfosfatas

Fosfofruktokinaz÷-1 Mg2+

ATP yra PFK-1 alosterinis slopiklis. Padid÷jus ATP koncentracijai citozolyje, padid÷ja fermento KM fruktoz÷s 6-fosfatui ir reakcijos greitis sumaž÷ja. Fosfofruktokinaz÷s aktyvumas did÷ja, kai ląstel÷s energetiniai resursai (ATP) išsenka.

241

Fosfofruktokinaz÷s-1 alosterinis slopiklis taip pat yra trikarboksirūgščių ciklo tarpininkas citratas, bei fosfoenolpiruvatas. Padid÷jus citrato koncentracijai, glikoliz÷ sul÷t÷ja. Fosfofruktokinaz÷-1 yra aktyvuojama fruktoz÷s 2,6-bisfosfatu.

4. Susidaręs fruktoz ÷s 1,6-bisfosfatas toliau skaidomas į dvi triozes - glicerolio aldehido 3-fosfatą (GAP) ir dihidroksiacetono fosfatą (DAP). Šios reakcijos metu iš substrato, turinčio šešis anglies atomus susidaro dvi molekul÷s po 3 anglies atomus. Dihidroksiacetono fosfatas susidaro iš fruktoz÷s 1,6-bisfosfato C-1, C-2, C-3 anglies atomų, o glicerolio aldehido 3-fosfatas iš C-4, C-5, C-6. Reakciją katalizuoja fruktoz ÷s bisfosfato aldolaz÷ (aldolaz÷).

O

CH2OPO3

H

OH

H

H

OHOH

CH2OPO3

CHOH

CH2OPO3

CHO

O

CH2OPO3

CH2OH

+

∆G0/ = 23,9kJ/mol

Fruktoz÷s 1,6-bisfosfatas Glicerolio aldehido Dihidroksiacetono 3-fosfatas fosfatas

C

2-2-2-

2-

Aldolaz÷

Reakcijos ∆G0/ = 23,9kJ/mol ir reakcija standartin÷se sąlygose nukreipta į fruktoz÷s 1,6-bisfosfato susidarymą. Tačiau fiziologin÷mis sąlygomis, ląstel÷je, esant mažoms glicerolio aldehido 3-fosfato ir dihidroksiacetono fosfato koncentracijoms, reakcija yra beveik pusiausvyrin÷.

5. Iš susidariusių glicerolio aldehido3-fosfato ir dihidroksiacetono fosfato toliau skaidomas tiktai glicerolio aldehido 3-fosfatas. Tod÷l veikiant fermentui trioz÷s fosfato izomerazei, kuri katalizuoja dihidroksiacetono fosfato virtimą į glicerolio aldehido 3-fosfatą, tarp triozių nusistovi pusiausvyra.

CHOH

CH2OPO3

CHO

O

CH2OPO3

CH2OH

C

2-2-

Glicerolio aldehido Dihidroksiacetono3-fosfatas fosfatas

∆G0/ = 7,5 kJ/mol

Trioz÷s fosfato izomeraz÷

Dihidroksiacetono fosfatas gali būti redukuotas iki fosfoglicerolio ir panaudotas lipidų sintezei.

8.1.2 II glikoliz ÷s stadija, 6. Tolimesn÷se reakcijose dalyvauja glicerolio aldehido 3-fosfatas. Glicerolio

aldehido 3-fosfato dehidrogenaz÷ (GAPDH), katalizuoja glikolitin ę oksidacijos redukcijos reakciją. Dalyvaujant NAD+ ir fosforo rūgščiai, glicerolio aldehido 3-fosfatas oksiduojamas iki fosfoglicerolio rūgšties, prijungiama dar viena fosforo rūgšties molekul÷ ir susidaro 1,3-bisfosfogliceratas (1,3-BPG). Aldehidinei grupei oksiduojantis susidaro mišrus fosforo rūgšties ir karboksigrup÷s anhidridas, kuris yra didžiaenergis junginys. Šioje reakcijoje NAD+ redukuojasi iki NADH.

242

CHOH

CH2OPO3

CHO

CH2OPO3

O

O P

O

O

O

2-

Glicerolio aldehido 1,3-bisfosfogliceratas 3-fosfatas

∆G0/ = 6,3 kJ/mol

+ NAD+ + Pn+ NADH + H+

CHOH

2-

C ~

Glicerolio aldehido3-fosfato dehidrogenaz÷

Tiriant fermento veikimo mechanizmą buvo nustatyta: 1. Glicerolio aldehido 3-fosfato dehidrogenaz÷ inaktyvuojama alkilinančio agento

CH2JCOOH, kuris jungiasi su fermento cisteino aminorūgšties SH grupe. Hidrolizavus baltymą išskirtas karboksimetilcisteinas, tai rodo, kad fermento aktyviame centre yra cisteino merkaptogrup÷.

2. GAPDH kiekybiškai perneša 3H nuo glicerolio aldehido 3-fosfato pirmo anglies atomo ant NAD+, reiškia reakcija vyksta tiesiogiai pernešant hidridą.

3. GAPDH katalizuoja 32P pasikeitimą tarp [32Pn] ir reakcijos produkto analogo acetilfosfato. Buvo pasiūlytas fermento veikimo mechanizmas 1. Glicerolio aldehido 3-fosfatas prisijungia prie fermento. 2. Cisteino 149 merkaptogrup÷, veikia kaip nukleofilas ir atakuoja aldehido karbonilo grup÷s

anglies atomą, susidarant tiohemiacetaliui. 3. Tiohemiacetalis oksiduojamas iki aciltioesterio, tiesiogiai pernešant hidridą ant NAD+.

Energija, išsiskyrusi oksiduojantis aldehidui neišsisklaido šilumos pavidalu, bet yra sukaupiama sintetinant didžiaenergį tioesterį ir redukuojant NAD+ iki NADH.

4. NAD+ molekul÷, esanti terp÷je, pakeičia susirišusi su fermento aktyviuoju centru NADH. 5. Tioesterį atakuoja Pn , susidaro 1,3-bisfosfogliceratas ir regeneruojamas laisvas fermentas.

Susidaręs didžiaenergis mišrus anhidridas kitoje stadijoje dalyvauja ATP sintez÷je. Esant terp÷je arsenatui, jis jungiasi vietoje fosfato prie pirmo anglies atomo fosfoglicerato

molekul÷je, tačiau susidaręs junginys yra nestabilus ir labai lengvai hidrolizuojamas ir nesusidaro ATP. Taip yra aiškinamas arsenato toksinis poveikis.

7. Reakcijoje, katalizuojamoje fosfoglicerato kinaz÷s fosforilo liekana pernešama nuo 1,3-bisfosfoglicerato ant ADP, susidarant ATP ir 3-fosfogliceratui (3-PG).

CH2OPO3

COOPO3

CHOH

CH2OPO3

CHOH

COO-

1,3-bisfosfogliceratas 3-fosfogliceratas

∆G0/ = -18.9kJ/mol

+ ADP + ATP

2-

2- 2-Fosfoglicerato kinaz÷

Taigi, oksiduojant glicerolio aldehido 3-fosfatą, išsiskyrusi energija sukaupiama didžiaenergio junginio 1,3-bisfosfoglicerato molekul÷je. Pernešant fosforilo grupę ant ADP, energija sukaupiama ATP molekul÷je. Tai yra pirmoji ATP susidarymo reakcija glikoliz÷je. Šis procesas yra vadinamas substratiniu fosforilinimu . Su oksidaciniu fosforilinimu ir fotosintetiniu fosforilinimu susipažinsime v÷liau (12,13 skyrius).

8. Fosfogliceromutaz÷ katalizuoja 3-fosfoglicerato virtimą į 2-fosfogliceratą, fosforilo liekana pernešama nuo C-3 ant C-2. Raumenų ir mielių fosfoglicerato mutaz÷

243

katalizuoja tarpinio 2,3-bisfosfoglicerato susidarymą. Fermento aktyviame centre yra fosforilintas histidinas. Prisijungus 3-fosfogliceratui, nuo fosfohistidino ant 3-fosfoglicerato pernešama fosforilo liekana, susidarant 2,3-bisfosfogliceratui. Sekančioje stadijoje fosforilo liekana nuo trečio anglies atomo pereina ant fermento aktyviame centre esančio histidino, susidaro 2-fosfogliceratas ir regeneruojamas fermente fosfohistidinas. Fermento veikimui reikalingas kaip kofaktorius 2,3-bisfosfogliceratas, kuris fosforilina histidiną.

CH2OH

CHOPO3

COO -

2-CH2OPO3

CHOH

COO -

2-

∆G0/ = 4,4kJ/mol

Fosfogliceromutaz÷

3-fosfogliceratas 2-fosfogliceratas 9. Kitoje glikoliz÷s reakcijoje 2-fosfogliceratas dehidratuojamas iki

fosfoenolpiruvato (PEP) veikiant enolazei. Fermentas su dvivalenčiais katijonais, tokiais kaip Mg2+ sudaro kompleksą. Fluorido jonai stipriai slopina enolaz÷ aktyvumą, esant fosfato jonams. F- ir Pn tvirtai prisijungia prie fermento aktyviame centre esančio Mg2+ jonų ir blokuoja substrato susijungimą su fermentu.

CH2

CO~PO3

COO

2-CH2OH

CHOPO3

COO-

2-

∆G0/ = 1,8kJ/mol

+ H2O

-

Enolaz÷

2-fosfogliceratas Fosfoenolpiruvatas 10. Antrą substratinio fosforilinimo reakciją katalizuoja piruvato kinaz÷. Fosforilo

grup÷ nuo fosfoenolpiruvato pernešama ant ADP, susidaro ATP ir piruvatas (PVR).

CO

COO

CH3CH2

CO~PO3

COO

2-

--

Fosfoenolpiruvatas Piruvatas

∆G0/ = -31,7kJ/mol

+ + ADP ATPPiruvato kinaz÷

Didelis laisvosios energijos pokytis išsiskiriantis iš fosfoenolpiruvato susidarant

piruvatui sąlygojamas spontaniško, nestabilios enolin÷s piruvo rūgšties formos per÷jimo į žymiai stabilesnę keto formą. Piruvato kinazin÷ reakcija yra trečia glikolizę reguliuojanti stadija. Reakcija reguliuojama alosteriniais moduliatoriais ir kovalentiškai modifikuojant fermentą. Piruvato kinaz÷s geno ekspresiją reguliuoja įvairūs hormonai.

8.2 Piruvato skaidymas anaerobin ÷se sąlygose Piruvato susidarymas iš fosfoenolpiruvato yra galutin÷ glikoliz÷s stadija. Tolimesnis

piruvato metabolizmas vyksta keliais pagrindiniais keliais. Aerobin÷se sąlygose piruvatas pilnai oksiduojamas iki CO2 ir H2O trikarboksirūgščių ciklo ir oksidacinio fosforilinimo metu. Anaerobin÷se sąlygose piruvatas gali virsti įvairiais galutiniais produktais.

Ląstel÷se NAD+ koncentracija yra žema tod÷l glikoliz÷s tęstinumui susidaręs NADH turi b ūti regeneruojamas. Esant deguoniui NADH keliauja į mitochondrijas ir oksidacinio fosforilinimo proceso metu yra oksiduojamas. Anaerobin÷se sąlygose NADH redukuoja piruvatą, susidarant įvairiems produktams: pieno rūgščiai, etanoliui, organin÷ms rūgštims, acetonui, butanoliui ir kitiems produktams. Šis gliukoz÷s skaidymas iki galutinių produktų procesas vadinamas fermentacija arba rūgimu.

244

Pieno rūgštis susidaro raumenyse jiems intensyviai dirbant, kada kraujas nepilnai aprūpina audinius deguonimi ir susidaro anaerobioz÷. Reakciją katalizuoja laktato dehidrogenaz÷ (LDH). Šis procesas vadinamas pienarūgštis rūgimas arba fermentacija.

CO

CH3

COO-

CHOH

CH3

COO-

+ NADH +H+ + NAD+

Piruvatas Laktatas

∆G0/ = -25,1kJ/mol

Laktatodehidrogenaz÷

Kai kurie mikroorganizmai fermentuoja gliukozę ir kitas heksozes į pieno rūgštį. Pieno

produktuose esančios laktobacilos ir streptokokai gamina pieno rūgštį, rūgštis denatūruoja pieno baltymą kazeiną, kuris iškrenta į nuos÷das.

Audiniuose, kurie nepakankamai aprūpinami deguonimi susidaro anaerobioz÷ ir vyksta glikoliz÷. Pavyzdžiui sprinteriai, b÷gantys trumpas distancijas, energiją gauna glikoliz÷s keliu. Aligatoriai ir krokodilai yra l÷ti ir nepaslankūs, tačiau jie sugeba staigiai pulti panaudodami glikolitinį ATP. V÷žin÷se ląstel÷se intensyviai skaidant gliukozę kaupiasi pieno rūgštis.

Laktato dehidrogenaz÷ stereospecifiškai katalizuoja NADH oksidaciją. NADH molekul÷je pro-R vandenilis prie C-4 atomo yra stereospecifiškai pernešamas ant piruvo rūgšties C-2 atomo , susidarant L- arba (S-) laktatui. Toks pat stereospecifiškumas yra stebimas alkoholio dehidrogenazin÷je reakcijoje, pernešant hidrido joną nuo NADH ant acetaldehido.

Žinduoliai turi penkis skirtingus laktato dehidrogenaz÷s izofermentus: M4, M3H, M3H2, MH3, H4. Nors šios hibridin÷s formos sutinkamos įvairiuose audiniuose, tačiau H tipo fermentas daugiausiai paplitęs yra audiniuose gerai aprūpinamuose deguonimu, tokiuose kaip širdis. Tuo tarpu M-tipas plačiausiai sutinkamas skeletiniuose raumenyse. Laktato dehidrogenaz÷ H4 turi aukštą KM piruvatui. M4 izofermentas turi žemesnį KM piruvatui. Matomai laktato dehidrogenaz÷s H-tipas yra geriau prisitaikęs oksiduoti laktatą iki piruvato, o M-tipo redukuoti piruvatą.

Pieno rūgštis yra galutinis anaerobin÷s gliukoz÷s oksidacijos produktas, susidarantis raumenyse. Padid÷jus pieno rūgšties koncentracijai, padid÷ja viduląstelin÷ protonų koncentracija, padid÷ja nuovargis, atsiranda skausmai. Ramyb÷s būsenoje 70-80% pieno rūgšties iš raumenų per kraują pernešama į kepenis. Čia dalis oksiduojama iki CO2 ir H2O, kita dalis panaudojama gliukoz÷s resintezei (gliukoneogenezei) (žr. 15 skyrius). Susintetintą gliukozę kraujas perneša atgal į raumenis. Toks pieno rūgšties - gliukoz÷s kelias vadinamas Kori ciklu (8.4 pav.). Likusi raumenyse pieno rūgštis yra verčiama į piruvo rūgštį ir, esant pakankamai deguonies, oksiduojama į CO2 ir H2O.

245

Gliukoz÷ Gliukoz÷ Gliukoz÷

Pieno Pieno Pienorūgštis rūgštis rūgštis

Raumenys Kraujas Kepenys

Gliukoneogenez÷Glikoliz÷

žemas NAD+/NADH aukštas NAD+/NADH 8.4 pav. Kori ciklo schema. Raumenyse susidariusi pieno rūgštis pernešama į kepenis, kur gliukoneogenez÷s metu iš jos sintetinama gliukoz÷ ir ji jau raumenyse panaudojama kaip energijos šaltinis.

Gliukoz÷s virtimas į etanolį miel÷se yra vadinamas spiritiniu r ūgimu. Šio proceso sumarinę reakciją galima užrašyti taip:

CO

CH3

COO-

CH3

CHO

NADH+H+

Piruvatas Acetaldehidas Etanolis

NAD+

C2H5OH

CO2

Piruvato dekarboksilaz÷ ADH

Pirmoje stadijoje piruvo rūgštis, veikiant piruvato dekarboksilazei, yra

dekarboksilinama, susidarant acetaldehidui ir CO2. Piruvato dekarboksilaz÷s kofermentas yra tiamindifosfatas. Antroje stadijoje acetaldehidas yra redukuojamas NADH iki etanolio, katalizuojant fermentui alkoholio dehidrogenazei (ADH). Piruvato dekarboksilaz÷ sutinkama kepimo, alaus miel÷se bei kituose organizmuose, kuriuose vyksta etanolio fermentacija. Stuburinių audiniai neturi piruvato dekarboksilaz÷s, tod÷l negaminamas etanolis.

8.3 Etanolio metabolizmas

Žmogaus organizme kepenyse etanolis metabolizuojamas veikiant trim fermentin÷m sistemoms:

1. Kepenyse yra per 30 skirtingų citozolinių alkoholio dehidrogenazių, kurios oksiduoja etanolį, susidarant aldehidui ir NADH. Šis fermentinis kelias yra reguliuojamas NAD+.

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+

Etanolis Acetaldehidas

ADH

246

2. Mikrosomose yra etanolį oksiduojanti sistema, kuri lokalizuota lygiajame endoplazminiame tinkle. Šią sistemą sudaro citochromas P450 ir šeima monooksigenazių, detoksikuojančių patekusius į organizmą vaistus ir ksenobiotikus.

C2H5OH + NADPH + H+ + O2 CH3CHO + NADP+ +2H2OEtanolis Acetaldehidas

Monooksigenaz÷

3. Peroksisomose esanti katalaz÷ panaudodama vandenilio peroksidą oksiduoja etanolį ir

metanolį iki atitinkamų aldehidų

C2H5OH + H2O2 CH3CHO +2H2O

Etanolis Acetaldehidas

Katalaz÷

Susidaręs acetaldehidas yra toliau oksiduojamas mitochondrijose, veikiant

acetaldehido dehidrogenazei. D÷l aukšto NADH/NAD+ santykio kepenų mitochondrijose, acetaldehidas n÷ra paverčiamas acetil-KoA ir n÷ra oksiduojamas trikarboksirūgščių cikle.

CH3COO- + NADH +H+ CH3CHO + NAD+ + H2O

Acetaldehidas Acetatas

Acetaldehidodehidrogenaz÷

Acetatas išeina iš kepenų paverčiamas į acetil-KoA ir oksiduojamas kituose audiniuose. Etanolio žalingas poveikis

A. Dauguma žalingo etanolio poveikio susiję su acetaldehido susidarymu, Žmon÷s, kurių organizme acetaldehido dehidrogenaz÷s kiekis mažas ar fermento aktyvumas nedidelis lengvai intoksikuojami etanoliu. Dauguma Japonijos ir Kinijos gyventojų turi genetiškai apspręstą žemą fermento kiekį, tod÷l jie labai jam jautrūs. Acetaldehido koncentracijos padidinimas panaudojamas gydant alkoholizmą. Vaistas disulfiramas inhibuoja acetaldehido dehidrogenazę ir organizme kaupiasi acetaldehidas, kuris sukelia nemalonius pojūčius.

B. Išg÷rus alkoholio citozolin÷ alkoholio dehidrogenaz÷ ir mitochondrin÷ acetaldehido dehidrogenaz÷ jį oksiduoja ir susidaro dideli kiekiai NADH. Sumaž÷jus NAD+ kiekiui žymiai pakinta NADH /NAD+ santykis. Keičiasi ląstel÷s oksidacinis redukcinis potencialas, tai įtakoja metabolizmą.

1. Inhibuojama gliukoneogenez÷. Padid÷jus NADH/NAD+ santykiui, dehidrogenazinių reakcijų pusiausvyra pastumiama redukcijos kryptimi ir piruvatas redukuojamas į laktatą, o oksalacetatas į malatą. Tod÷l šios medžiagos negali būti panaudotos gliukoz÷s sintezei ir vystosi hipoglikemija.

2. Kepenyse inhibuojamas trikarboksirūgščių ciklas. Aukštas NADH/NAD+

santykis mitochondrijų užpilde keičia trikarboksirūgščių ciklo reakcijų kryptį, izocitratas neoksiduojamas į α−ketoglutaratą, α−ketoglutaratas į sukcinil-KoA ir malatas į oksalacetatą. Nors acetatas kepenyse gali būti aktyvuotas į acetil-KoA, jis dažniausiai pašalinamas į kitus audinius.

C. Toksinį poveikį turi ir pats etanolis. Jis padidina membranų pralaidumą įvairiems

jonams, sąveikauja su glutamato receptoriumi smegenyse.

8.4 Fermentacijos energetika Bendrą glikoliz÷s reakciją galima užrašyti sekančiai:

247

Gliukoz÷ + 2ADP + 2Pn + 2NAD+ 2PVR + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O Gliukozę skaidant raumenyse susidaro laktatas, piruvato redukcijai panaudojamas

NADH

Gliukoz÷ + 2ADP + 2Pn 2 Laktatas+ 2ATP šios reakcijos ∆G0/= -196kJ/mol

Spiritinio rūgimo bendra reakcija užrašoma sekančiai: Gliukoz÷ + 2ADP + 2Pn 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP, ∆G0/= -235kJ/mol

Pienarūgščio rūgimo efektyvumas standartin÷se sąlygose yra 31%, tai yra 31% išsiskyrusios laisvosios energijos yra sukaupiama ATP pavidale. Likusi energija išsisklaido šiluma. Spiritinio rūgimo efektyvumas yra 26%. Fiziologin÷se sąlygose, kai reaguojančių medžiagų koncentracijos skiriasi nuo standartinių sąlygų, efektyvumas gali būti didesnis nei 50%.

8.5 Glikogeno skaidymas (Glikogenoliz ÷) Gliukoz÷ yra pagrindinis energijos šaltinis, tačiau laisvos gliukoz÷s koncentracija

organizmuose yra nedidel÷. Gliukoz÷s perteklių aukštesnieji organizmai saugo polisacharido glikogeno pavidalu kepenyse ir raumenyse, o augalai krakmolo. Padid÷jus organizmo energetiniams poreikiams polisacharidai hidrolizuojami iki gliukoz÷s, kuri oksiduojama. Kod÷l metabolin÷ energija saugoma glikogeno molekul÷je o ne triacilglicerolių ar gliukoz÷s molekulių ir kod÷l jis efektyviai skaidomas? 1. Glikogenas yra skaidomas greičiau nei riebalai, nes nuo šakotos glikogeno molekul÷s galų

vienu metu gali būti nuskeliamos kelios gliukoz÷s molekul÷s. 2. Riebalų rūgštys negali būti oksiduojamos anaerobin÷se sąlygose. 3. Gyvūnai negali sintetinti gliukoz÷s iš riebalų rūgščių, tod÷l skaidant vien tiktai riebalų

rūgštis sunkiau palaikyti pastovią gliukoz÷s koncentraciją kraujyje ir aprūpinti smegenis energija.

4. Saugant energiją gliukoz÷s monomerų formoje, padid÷tų osmozinis sl÷gis ir ląstel÷s tūris išaugtų.

Glikogeno skaidymui reikalingi trys fermentai. 1. Glikogeno fosforilaz÷ (dar vadinama fosforilaz÷), katalizuoja glikogeno fosforolizę,

fosforo rūgšties liekana prijungiama prie pirmo gliukoz÷s anglies atomo ir inicijuojamas α−(1→4) glikozidinio ryšio skaidymas.

glikogenas + Pn glikogenas + gliukoz÷s 1-fosfatas(n Glc liekanų) (n-1 Glc liekanų)

Fosforilaz÷

. Glikogeno fosforilaz÷ yra dimeras, sudarytas iš dviejų identiškų subvienetų, turinčių po 842 aminorūgštis. Kiekviename subvienete prie Lys 680 prijungta piridoksalfosfato molekul÷. Į fermento aktyvų centrą gali patekti tiktai 4 ar 5 gliukoz÷s molekul÷s esančios linijin ÷je molekul÷s dalyje. Glikogenas yra fosforilinimas kol lieka 4 gliukoz÷s molekules, prijungtas iki šakojimosi taško. Fermento aktyvumas reguliuojamas alosteriškai ir kovalentin÷s modifikacijos būdu.

2. Gen÷jimo (debranching) fermentas pašalina glikogeno molekul÷je šakotumus, kurie yra glikogeno molekul÷je gliukozei jungiantis α−(1→6) glikozidiniais ryšiais. Gen÷jimo fermentas turi du fermentinius aktyvumus. Oligosacharido transferaz÷ perneša trijų gliukoz÷s molekulių oligosacharidinį fragmentą, likusį iki atsišakojimo vietos ant gretimos polisacharidin÷s grandin÷s, susidarant α−(1→4) glikozidiniam ryšiui, tolimesn÷s reakcijos katalizuojamos fosforilaz÷s. Antras fermentinis aktyvumas - αααα−−−−((((1→6) glikozidaz÷

248

nuskelia likusią iki atsišakojimo gliukoz÷s molekulę, hidrolizuodama α−(1→6) glikozidinį ryšį. Tokiu būdu per 90% glikogene esančių gliukoz÷s molekulių atsipalaiduoja gliukoz÷s 1-fosfato pavidalu. Likusi gliukoz÷s dalis, kuri yra šakojimosi vietose, atsipalaiduoja laisvos gliukoz÷s pavidalu.

3. Iš gliukoz÷s 1-fosfato, katalizuojant fosfogliukomutazei, susidaro, gliukoz÷s 6-fosfatas. Gliukoz÷s 6-fosfatas toliau skaidomas glikoliz÷s metu arba kepenyse verčiamas į gliukozę.

OCH2O

HH

OHH

OH

OH

HOH

HOCH2OH

HH

OHH

OH

OH

H OPO3

H

PO3

2-

2-

Gliukoz÷s-1-fosfatas Gliukoz÷s-6-fosfatas

Fosfogliukomutaz÷

Gliukoz÷s 1-fosfatai

Gliukoz÷

Fosforilaz÷

Gen÷jimo fermentastransferazinis aktyvumas

Gen÷jimo fermentasglikozidazinis aktyvumas

Gliukoz÷s 1-fosfatai

Fosforilaz÷

8.5 pav. Glikogeno skaidymo schema

8.6 Pentoz ÷s fosfato kelias Dauguma organizmų suskaido angliavandenius glikoliz÷s, trikarboksirūgščių ciklo ir oksidacinio fosforilinimo metu iki CO2 ir H2O, tačiau ląstel÷je egzistuoja ir kiti angliavandenių oksidacijos keliai. Vienas iš jų yra pentoz÷s fosfato kelias. Jis dar vadinamas tiesioginis angliavandenių skaidymas arba heksozomonofosfatinis šuntas. Pentoz÷s fosfato kelias prasideda nuo gliukoz÷s 6-fosfato oksidacijos ir susidaro trijų, keturių, penkių, šešių ir septynių anglies atomų sacharidai.

249

Pentoz÷s fosfato kelias yra svarbus tuo, kad a) jo metu susidaro NADPH, kuris dalyvauja anaboliniuose procesuose kaip reduktorius,

kuriuose fermentai specifiški NADPH, (pvz. riebalų rūgščių, cholesterolio, steroidinių hormonų biosintez÷je),

b) eritrocituose NADPH palaiko aukštą oksidacijos-redukcijos potencialą (aukštas GSH/GSSG santykis), tai apsaugo lipidus, baltymus nuo aktyvių deguonies formų žalingo poveikio,

c) tarpiniai pentoz÷s fosfato kelio produktai panaudojami kitose metabolizmo grandyse: pentoz÷s reikalingos nukleotidų, nukleorūgščių, kofaktorių ATP, NADH, FADH2, acetil-KoA biosintez÷je, eritroz÷s 4-fosfatas - aminorūgščių fenilalanino, tirozino ir triptofano biosintez÷je. Augaluose tarpiniai produktai naudojami fotosintez÷s tamsin÷je stadijoje.

Pentoz÷s fosfato kelias dideliais greičiais vyksta kepenyse, riebaliniame audinyje, pieno liaukose, antinksčių žiev÷je, eritrocituose. Eritrocituose pasigaminęs NADPH reikalingas atitinkamai redukuoto glutationo koncentracijai palaikyti, sumažinti aktyvių deguonies formų koncentracijai. Redukuotas glutationas pasižymi redukcin÷m savyb÷mis ir apsaugo baltymų -SH grupes ir membraninius lipidus nuo oksidacijos, tuo pačiu palaiko eritrocitų membranų integralumą. Viena iš aktyvių deguonies formų, kuri pažeidžia biomolekules yra vandenilio peroksidas. Jis, katalizuojant glutationo peroksidazei, suskaidomas iki vandens ir deguonies ir detoksikuojamas.

H2O2 + 2GSH GSSG + H2O + 1/2O2

Glutationo peroksidaz÷

Šio proceso s÷kmingai eigai reikalinga aukšta redukuoto glutationo koncentracija. Oksiduotą glutationą (GSSG) redukuoja pentoz÷s fosfato kelio metu susidaręs NADPH.

GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+

Glutationo reduktaz÷

Pentoz÷s fosfatinio kelio fermentinių reakcijų aktyvumas yra silpnas širdies ir skeleto

raumenyse. Kelio fermentai lokalizuoti citozolyje, kuriame vyksta riebalų rūgščių sintez÷. Pentoz÷s fosfatinio kelio eigoje galima išskirti dvi stadijas: 1) negrįžtama oksidacijos stadija, kurią katalizuoja gliukoz÷s 6-fosfato dehidrogenaz÷, laktonaz÷ ir 6-fosfogliukonato dehidrogenaz÷, 2) grįžtama neoksidacin÷ stadija, katalizuojama likusių fermentų.

Pirmoje pentoz÷s fosfatinio ciklo stadijoje vyksta dvi oksidacijos redukcijos reakcijos. Pradžioje oksiduojamas gliukoz÷s 6-fosfatas ir susidaro 6-fosfogliukono δ-laktonas (8.6 pav.). Reakciją katalizuoja gliukoz÷s 6-fosfato dehidrogenaz÷. Protonai ir elektronai pernešami ant NADP+, reakcija pastumta į NADPH susidarymą. Katalizuojant laktonazei, laktonas hidrolizuojamas iki 6-fosfogliukonato. Antroje oksidacijos redukcijos reakcijoje 6-fosfogliukolaktonas oksiduojamas ir dekarboksilinamas veikiant 6-fosfogliukonato dehidrogenazei, reakcijos metu susidaro pentoz÷ – D-ribulioz÷s 5-fosfatas ir NADPH. Fosfopentoz÷s izomeraz÷ paverčia ribulioz÷s 5-fosfatą į riboz÷s 5-fosfatą, šioje reakcijoje ketoz÷ izomerizuojama į aldozę. Šios oksidacin÷s stadijos bendra lygtis yra ši: Gliukoz÷s 6-fosfatas + 2NADP+ + H2O riboz÷s 5-fosfatas + CO2 + 2NADPH + 2H+

250

C

OHH

C

C

C

C

H

OH H

OHH

OH

H

H

H

O

C

PO3

C

H

C

C

C

C

H

OH H

OHH

OH

H

H

H

O

C

PO3

O

C

C

C

C

C

H

OH H

OHH

OH

H

H

H

O

C

PO3

O O

OH

O O

C

C

C

C

H

H

H

O PO3

OH

O

C

O

H

OH

H

HC

C

C

C

C

OH

OHH

H

H

H

O PO3

OH

H

OH

2- 2- 2-

Gliukoz÷s 6-fosfatas 6-Fosfogliukono-δ-laktonas 6-Fosfogliukonatas

Gliukoz÷s 6-fosfatodehidrogenaz÷

NADP+ NADPH +H+

Laktonaz÷

H2O

2-

2-NADP+ NADPH +H+

CO2

6-Fosfogliukonatodehidrogenaz÷

Fosfopentoz÷sizomeraz÷

D-ribulioz÷s 5-fosfatas D-riboz÷s 5-fosfatas8.6 pav. Pentozinio ciklo oksidacin÷s stadijos reakcijos. Antroje, ne oksidacin÷je stadijoje šešios molekul÷s pentoz÷s 5-fosfato (5C) paverčiamos į keturias fruktoz÷s 6-fosfato (6C) ir dvi glicerolio aldehido 3-fosfato molekules (3C), iš kurių susidaro dar viena heksoz÷ (6C). Tokiu būdu iš šešių pentozių fosfatų susidaro penki heksozių fosfatai (8.7 pav.).

5C 7C 6C

5C 3C 4C 6C

5C 3C5C 3C

5C 3C 4C 6C

5C 7C 6C

6C

251

8.7 pav. Schematin÷ diagrama penkių anglies atomų sacharidų virtimas į šešių anglies atomų sacharidus. 3C, 4C, 5C 6C, 7C atitinkamai trijų, keturių, penkių, šešių septynių anglies atomų sacharidai. Pradžioje ribulioz÷s 5-fosfatas epimerizuojamas į ksilulioz÷s 5-fosfatą. Tolimesn÷se reakcijose pentoz÷s reaguoja tarpusavyje.

C

C

C

C

H

H

H

O PO3

OH

OH

C

O

H

OH

H

H

C

C

C

C

H

H

H

O PO3

OH

H

C

O

OH

OH

H

H

2-

Ribulioz÷s 5-fosfatas Ksilulioz÷s 5-fosfatas

2-

Riboz÷s 5-fosfato epimeraz÷

Pentoziniame cikle dalyvauja du specifiniai fermentai transketolaz÷ ir transaldolaz÷. Transketolaz÷ katalizuoja dviejų anglies atomų fragmento pernešimą nuo ketoz÷s donoro ant akceptoriaus aldoz÷s. Pentozinio ciklo metu yra dvi transketolazin÷s reakcijos. Pirmos reakcijos metu (8.8 pav.) transketolaz÷ perneša C-1 ir C-2 anglies atomus nuo ksilulioz÷s 5-fosfato ant riboz÷s 5-fosfato, susidarant sedoheptulioz÷s 7-fosfatui ir glicerolio aldehido 3-fosfatui. Transketolazin÷s reakcijos kofaktorius yra tiamindifosfatas.

C

C

R

OH

C

O

H

OH

H

H

C

R

OH C

C OH

C

O

H

OH

H

H

R

COH

R

+ +

Ketoz÷ Aldoz÷ donoras akceptorius

Transketolaz÷

+

11

22

C

C

C

C

H

H

H

O PO3

OH

H

C

O

OH

OH

H

H C

C

C

C

C

OH

OHH

H

H

H

O PO3

OH

H

OHC

C H

C

O

OH

OH

H

H

C

C

H

H

H

O PO3

OH

COH

C

C

H

H

H

O PO3

OH

C

C OH

OH

H

H

2- 2-

Ksilulioz÷s 5-fosfatas Riboz÷s 5-fosfatas Sedoheptulioz÷s Glicerolio aldehido 7-fosfatas 3-fosfatas

+

2- 2-

+

Transketolaz÷

8.8 pav. Pirmoji transketolazin÷ reakcija

252

Transaldolaz÷ katalizuoja trijų anglies atomų pa÷mimą nuo sedoheptulioz÷s 7-fosfato ir prijungimą prie glicerolio aldehido 3-fosfato, reakcijoje susidaro fruktoz÷s 6- fosfatas ir tetroz÷ - eritroz÷s 4-fosfatas (8.9 pav.) Transaldolaz÷s aktyviame centre yra Lys ε−aminogrup÷, kuri reakcijos metu sudaro Šifo bazę su ketoz÷s karboniline grupe. Kitoje reakcijoje, katalizuojant transketolazei susijungia eritroz÷s 4-fosfatas su ksilulioz÷s 5-fosfatu, gaunami reakcijos produktai yra fruktoz÷s 6-fosfatas ir glicerolio aldehido 3-fosfatas (8.10 pav.). Iš dviejų glicerolio aldehido 3-fosfato molekulių gliukoneogenez÷s proceso metu susidaro gliukoz÷s 6-fosfatas. Ciklas baigiasi ir iš šešių pentozių susidaro penkios heksoz÷s.

C

C H

C

O

OH

OH

H

H

C

C OHH

OH

C

C H

C

O

OH

OH

H

H

C

C

H

H

H

O PO3

OH

COH

C

C

H

H

H

O PO3

OH

C

C OH

OH

H

H

C

C

H

H

H

O PO3

OHC

C

H

H

H

O PO3

OH

C OHH

2- 2-

Sedoheptulioz÷s Glicerolio aldehido Fruktoz÷s Eritroz÷s 7-fosfatas 3-fosfatas 6-fosfatas 4-fosfatas

+

2- 2-

+Transaldolaz÷

8.9 pav. Transaldolazin÷ reakcija

C

C H

C

O

OH

OH

H

H

C

C OHH

OH

C

C

H

H

H

O PO3

OH

COH

C

C

H

H

H

O PO3

OH C

C

H

H

H

O PO3

OH

C OHH

C

C

H

H

H

O PO3

OH

C

C

H

C

O

OH

OH

H

H

2-2-

Ksilulioz÷s Eritroz÷s Fruktoz÷s Glicerolio aldehido 5-fosfatas 3-fosfatas 6-fosfatas 3-fosfatas

+2-

+Transketolaz÷

2-

8.10 pav. Antra transketolazin÷ reakcija Gliukoz÷s 6-fosfatas yra glikoliz÷s ir pentoz÷s fosfato kelio pradinis produktas. Kokiu keliu bus skaidomas gliukoz÷s 6-fosfatas priklausys nuo ląstel÷s poreikių ir nuo NADP+/NADPH santykio citozolyje. Nesant NADP+ gliukoz÷s 6-fosfato dehidrogenaz÷ yra neaktyvi ir pentoz÷s fosfato kelias ciklas nevyksta. Suintensyv÷jus anaboliniams procesams, padid÷ja NADP+ kiekis, kuris alosteriškai stimuliuoja gliukoz÷s 6-fosfato dehidrogenazę ir pagreit÷ja gliukoz÷s 6-fosfato skaidymas pentoz÷s fosfatinio kelio metu. Bendra pentoz÷s fosfato kelio schema pavaizduota 8.11 pav.

253

6 Glc-6-P 6 PGL 6 PG 6 Ribu-5-P

2 Rib-5-P 2 Ksilu-5-P 2 Ksilu-5-P

Transketolaz÷ (2C)

2 GAP 2 Sed-7-P

2Glc-6-P 2 Fru-6-P 2Eri-4-P

Transaldolaz÷ (3C)

2 GAP

2 Fru-6-P

Glc-6-P

2 Glc-6-P

6 NADP+ 6 NADPH+6H+ 6NADP+ 6NADPH + 6H+

6 CO2

8.11 pav. Bendra pentoz÷s fosfatinio kelio reakcijų schema. Glc-6-P – gliukoz÷s 6-fosfatas, 6 PGL – 6-fosfogliukono-δ-laktonas, 6 PG – 6-fosfogliukonatas, Ribu-5-P – ribulioz÷s 5-fosfatas, Rib-5-P – riboz÷s 5-fosfatas, Ksilu-5-P – ksilulioz÷s 5-fosfatas, GAP – glicerolio aldehido 3-fosfatas, Sed-7-P – sedoheptulioz÷s 7-fosfatas, ERi-4-P – eritroz÷s 4-fosfatas, Fru-6-P – fruktoz÷s 6-fosfatas

Kaip matome, suskaidžius šešias gliukoz÷s 6-fosfato molekules išsiskiria šešios CO2 molekul÷s, susidaro šešios NADPH molekul÷s ir regeneruojamos penkios gliukoz÷s 6-fosfato molekul÷s. Sumarinę šio ciklo lygtį galime užrašyti šiuo būdu 3Glc-6-P + 6NADP+ 2Fru-6-P + 3CO2 + GAP + 6NADPH + 6H+

Fruktoz÷s-6-fosfatas gali izomerizuotis iki gliukoz÷s-6-fosfato. Šiuo atveju

3Glc-6-P + 6NADP+ 2Glc-6-P + 3CO2 + GAP+ 6NADPH + 6H+

arba6Glc-6-P + 12NADP+ 4Glc-6-P + 6CO2 + 2GAP + 12NADPH + 12H+

Iš dviejų glicerolio aldehido 3-fosfato molekulių gali susidaryti viena gliukoz÷s-6-P molekul÷.Taigi bendra pentoz÷s fosfato kelio reakcija užrašoma šia forma:

6Glc-6-P + 12NADP+ 5Glc-6-P + 6CO2 + 12NADPH + 12H+

Gliukoz÷s 6-fosfato dehidrogenaz÷s trūkumas yra plačiai paplitusi (per 200mln.

sergančių žmonių) paveldima liga pasireiškianti hemolizine anemija. Sumaž÷jus šio fermento, ląstel÷s nesintetina pakankamai NADPH, reikalingo palaikyti pakankamam redukuoto glutationo kiekiui. Hemolizinę anemiją gali sukelti įvairūs vaistai (antibiotikai,

254

antimaliariniai, antipiretiniai vaistai), fava pupos, kai kurios infekcijos, kadangi nesant NADPH sumaž÷ja organizmo antioksidacinis paj÷gumas.

8.7 Kitų angliavandeni ų skaidymas Organizmas su maistu gauna arba metabolizmo metu susidaro įvairūs sacharidai: krakmolas, glikogenas, sacharoz÷, laktoz÷, trehalioz÷, fruktoz÷, manoz÷, galaktoz÷ ir kiti. Jie medžiagų apykaitos procesuose paverčiami į gliukozę arba į glikoliz÷s tarpinius produktus. Patekęs su maistu krakmolas pradedamas skaidyti burnoje seilių fermento α−amilaz÷s. Šis fermentas yra endoglikozidaz÷, hidrolizuoja vidinius glikozidinius ryšius. Susidaro dekstrinai ir oligosacharidų fragmentai. Plonosiose žarnose veikiant kasos fermentui α−amilazei, pagrindinai susidaro maltoz÷ ir dekstrinai. Dekstrinai yra amilopektino hidroliz÷s produktai, turintys α−(1→4) glikozidinius ryšius. Maltoz÷ ir dekstrinai suskaidomi žarnyno epitelinių ląstelių išskiriamų fermentų. Su maistu patekęs glikogenas skaidomas taip pat kaip ir krakmolas.

Galaktoz÷

Gal-1-P

UDP-Gal

UDP-Glc

Glc-6-P

Glc-1-P

GlikogenasKrakmolas

Fru-6-P

PGA

Man-6-P

Manoz÷

PDA GA

Fruktoz÷

Sacharoz÷

Gliukoz÷

Laktoz÷

Maltoz÷

Trehalioz÷

8.11 pav. Sacharidų metabolizmas Disacharidų skaidymas. Su maistu daugiausiai gauname sacharozę, laktozę ir maltozę, kuri taip pat gali susidaryti iš krakmolo. Žmogaus organizmuose šie disacharidai yra hidrolizuojami atitinkamų fermentų, esančių plonosiose žarnose. Maltozę skaido maltaz÷, laktozę – laktaz÷, o sacharozę – sacharaz÷.

255

Maltoz÷ + H2O 2 D-gliukoz÷Maltaz÷

Laktoz÷ + H2O D-gliukoz÷ + D-galaktoz÷Laktaz÷

Sacharoz÷ + H2O D-gliukoz÷ + D-fruktoz÷Sacharaz÷

Monoscharidai yra pernešami į žarnyno epitelines ląsteles toliau patenka į kraują ir su juo patenka į įvairius organus ir audinius. Augaluose ir mikroorganizmuose disacharidai metabolizuojami kitais keliais. Bakterijose veikiant sacharoz÷s fosforilazei susidaro gliukoz÷s 1-fosfatas ir fruktoz÷

Sacharoz÷ + Pn D-gliukoz÷s 1-fosfatas + D-fruktoz÷

Sacharoz÷s fosforilaz÷

Monosacharidų skaidymas Fruktoz÷. Laisva fruktoz÷ randama daugumoje vaisių, meduje, taip pat susidaro hidrolizuojant sacharozę. Raumenyse ir inkstuose katalizuojant heksokinazei susidaro fruktoz÷s 6-fosfatas, kuris yra glikoliz÷s tarpininkas.

Fruktoz÷ + ATP Fruktoz÷s 6-fosfatas + ADP

Heksokinaz÷

Stuburinių kepenyse yra fermentas fruktokinaz ÷, kuris fosforiliną fruktozę iki fruktoz÷s 1-fosfato.

Fruktoz÷ + ATP Fruktoz÷s 1-fosfatas + ADP

Fruktokinaz÷

Fruktoz÷s 1-fosfato aldolaz÷ skaido fruktoz÷s 1-fosfatą iki glikoliz÷s tarpininko dihidroksiacetono fosfato ir glicerolio aldehido.

Fruktoz÷s 1-fosfato aldolaz÷ Fruktoz÷s 1-fosfatas Dihidroksiacetono fosfatas + glicerolio aldehidas Glicerolio aldehidas fosforilinamas iki glicerolio aldehido fosfato, kuris oksiduojamas glikoliz÷je.

Manoz÷. Manoz÷ susidaro skaidant kai kuriuos maistinius polisacharidus ar glikoproteinus. Heksokinaz÷ katalizuoja reakciją, kurios metu susidaro manoz÷s 6-fosfatas, kuris izomerizuojasi į fruktoz÷s 6-fosfatą.

Manoz÷ + ATP Manoz÷s 6-fosfatas + ADP Heksokinaz÷

Manoz÷s 6-fosfatas Fruktoz÷s 6-fosfatas Fosfomanoz÷s izomeraz÷

Galaktoz÷s. Galaktoz÷ pagrindinai susidaro iš laktoz÷s, katalizuojant laktazei. Galaktoz÷s metabolizmas prasideda nuo jos fosforilinimo (8.12 pav.). Katalizuojant galaktokinazei ji fosforilinama iki galaktoz÷s 1-fosfato (Gal-1-P). Pradin÷se stadijose galaktoz÷s 1-fosfatas yra aktyvuojamas transferazin÷je reakcijoje prijungiant uridino disfosfato gliukozę (UDP-Glc). Reakcijos metu susidaro naujas susirišęs su uridinu sacharidas - uridino disfosfato galaktoz÷ (UDP-Gal). Fermentas UDP-galaktoz÷s 4-epimeraz÷ paverčia UDP-Gal į UDP-Glc.

256

D-Galaktoz÷ + ATP D-galaktoz÷s 1-fosfatas + ADP UDP-Glc pirofosforilaz÷D-Gliukoz÷s 1-fosfatas + UTP UDP-Glc + PPn UDP-Glc:galaktoz÷s 1-fosfato uridililtransferaz÷D-Galaktoz÷s 1-fosfatas + UDP-Glc UDP-Gal + D-gliukoz÷s 1-fosfatas Fosfogliukomutaz÷D-Gliukoz÷s 1-fosfatas D-gliukoz÷s 6-fosfatas UDP-Gal epimeraz÷UDP-Gal UDP-Glc

Galaktokinaz÷

Gal-1-P UDP-Glc

Glc-1-P UDP-Gal

Gal Glc-1-PATP

ADP

UTP

PPn

Glc-6-P 8.12 pav. Galaktoz÷s skaidymas

8.8 Angliavandeni ų skaidymo reguliacija Gyvieji organizmai yra termodinamiškai atviros sistemos, jos palaiko stacionarų būvį,

o ne pereina į pusiausvyrą (gyviems organizmams tai mirtis). Tai reiškia, kad medžiagų srautai metaboliniuose keliuose yra pastovūs, kiekvieno tarpininko susidarymo ir skylimo greitis yra toks, kad palaikytų jų pastovią koncentraciją.

Bendras proceso greitis sąlygojamas reakcijos greitį limituojančios stadijos. Metabolitų srautas per reakcijos greitį limituojančią stadiją, gali būti keičiamas įvairiais būdais, mechanizmai gali būti įvairūs ir kontrol÷ vykdoma skirtingais keliais: 1. Alosterin÷ kontrol÷. Dauguma fermentų yra alosteriškai reguliuojami. Vieni iš svarbiausių

glikoliz÷s kontrol÷je yra heksokinaz÷, fosfofruktokinaz÷ ir piruvato kinaz÷. 2. Kovalentin÷ modifikacija. Fermentai turi specifines sritis, kurios gali būti fosforilinamos

arba defosforilinamos ir kitaip modifikuojamos. 3. Substratiniai ciklai. Jeigu tiesiogin÷ ir atvirkštin÷ reakcija yra katalizuojama skirtingų

fermentų, tai šie keliai gali būti skirtingai reguliuojami, jie gali tur÷ti skirtingus jautrumus pvz. alosteriniams efektoriams. Fruktoz÷s 1,6-bisfosfato susidarymas veikiant PFK-1 ir skilimas katalizuojant fruktoz÷s 1,6-bisfosfatazei yra ciklinis procesas, kuris vadinamas futilinis ciklas.

4. Genetin÷ kontrol÷. Fermento koncentracija ir fermento aktyvumas gali būti reguliuojamas keičiant fermento sintez÷s greitį.

5. Fermento koncentracija gali būti reguliuojama keičiant baltymo degradacijos greitį.

257

Vienas iš būdų nustatant metabolinio kelio limituojančias stadijas yra išmatuoti in vivo visų reakcijų ∆G ir įvertinti kokios reakcijos yra pusiausvyrin÷s. Tos reakcijos, kurios vyksta toli nuo pusiausvyros dažniausiai yra limituojančios reakcijos. Fermentai, katalizuojantys šias reakcijas gali būti reguliuojami vienu ar kitu aukščiau aprašytu būdu. Panagrin÷kime glikoliz÷s proceso termodinamiką širdies raumenyje. Lentel÷je Nr. 8.1. pateikti kiekvienos glikoliz÷s reakcijos standartinio laisvosios energijos pokyčio (∆G0/) ir realaus, fiziologin÷se sąlygose laisvosios energijos pokyčio (∆G) duomenys. 8.1 lentel÷. Glikoliz÷s reakcijų širdies raumenyje laisvosios energijos pokyčiai Reakcija Fermentas ∆G0/ kJ

mol-1 ∆G kJ mol-1

ATP + gliukoz÷ gliukoz÷s 6-fosfatas + ADP heksokinaz÷ -16,7 -33,9

gliukoz÷s 6-fosfatas fruktoz÷s 6-fosfatas gliukoz÷s 6-fosfato izomeraz÷

+1,67 -2,92

fruktoz÷s 6-fosfatas + ATP fruktoz÷s 1,6-bisfosfatas + ADP

fosfofruktokinaz÷-1

-14,2 -18,8

fruktoz÷s 1,6-bisfosfatas dihidroksiacetono fosfatas + glicerolio aldehido 3-fosfatas

aldolaz÷ +23,9 -0,23

dihidroksiacetono fosfatas glicerolio aldehido 3-fosfatas

trioz÷s fosfato izo-meraz÷

+7,5 +2,41

glicerolio aldehido 3-fosfatas + NAD+ = 1,3-bisfosfogliceratas + NADH + H+

glicerolio aldehido 3-fosfato dehidrogenaz÷

+6,3 -1,29

1,3-bisfosfogliceratas + ADP 3-fosfogliceratas + ATP

fosfoglicerato kinaz÷

-18,9 +0,1

3-fosfogliceratas 2-fosfogliceratas fosfoglicerato mutaz÷

+4,4 +0,83

2-fosfogliceratas fosfoenolpiruvatas + H2O enolaz÷ +1,8 +1,1

fosfoenolpiruvatas + ADP piruvatas + ATP piruvato kinaz÷ -31,7 -23,0

piruvatas + NADH + H+ laktatas + NAD+ laktato dehidrogenaz÷

-25,2 -14,8

Tiktai trijų reakcijų katalizuojamų heksokinaz÷s, fosfofruktokinaz÷s ir piruvato

kinaz÷s ∆G yra stipriai neigiamas. Kinetiniai tyrimai parod÷, kad šie fermentai kontroliuoja limituojančias glikoliz÷s stadijas ir viso proceso greitį.

8.8.1 Pastero efektas Daugiau nei prieš šimtą metų Pasteras (Louis Pasteur) pasteb÷jo, kad miel÷s

metabolizuojančios gliukozę anaerobin÷se sąlygose smarkiai sumažina gliukoz÷s skaidymo greitį jas perk÷lus į aerobines sąlygas. Skeletiniuose raumenyse anaerobin÷se sąlygose susidaro žymiai daugiau pieno rūgšties nei aerobin÷se. Šis glikoliz÷s slopinimo deguonimi reiškinys buvo pavadintas Pastero efektu. Oksiduojant gliukozę aerobin÷se sąlygose iki CO2 ir H2O išsiskiria daugiau ATP, nei glikoliz÷s proceso metu. Kod÷l sul÷t÷ja gliukoz÷s oksidacijos greitis, koks šio reiškinio mechanizmas? Tiriant glikoliz÷s metabolitų koncentracijas, perk÷lus mieles į aerobines sąlygas buvo parodyta, kad fruktoz÷s 1,6-

258

bisfosfato ir iš jo susidarančių metabolitų kiekis sumaž÷jo. Tuo tarpu iki fruktoz÷s 1,6-bisfosfato tarpininkų koncentracijos padid÷jo. Buvo manoma, kad deguonies slopinimo poveikis susijęs su fosfofruktokinaz÷s aktyvumu. Jis pasireiškia ne tiesiogiai, o per ATP koncentracijos padid÷jimą.

8.8.2 Glikoliz ÷s proces ą reguliuojantys fermentai Heksokinaz÷. Įvairiuose audiniuose randami keli heksokinaz÷s izofermentai,

besiskiriantys savo KM ir jautrumu slopiklių poveikiui. Raumenų heksokinaz÷s KM = 0.1mM, fermentas aktyvus, esant gliukoz÷s koncentracijai kraujyje 3-5mM. Šis fermentas alosteriškai inhibuojamas reakcijos produkto gliukoz÷s 6-fosfato.

Gliukoz÷ + ATP Gliukoz÷s 6-fosfatas + ADP

Slopinagliukoz÷s 6-fosfatas

Kepenyse randamas izofermentas vadinamas gliukokinaze. Šio fermento KM ~ 10mM.

Jis efektyviai katalizuoja gliukoz÷s fosforilinimą tiktai tada, kai gliukoz÷s koncentracija kepenyse yra didel÷. Iš gliukoz÷s 6-fosfato yra sintetinamas glikogenas, kuris saugomas kepenyse. Gliukokinaz÷ yra indukuojamas fermentas, jo kiekis kepenyse kontroliuojamas hormono insulino. Žmon÷s, sergantys diabetu, produkuoja nedaug insulino tod÷l, gliukokinaz÷s kiekis kepenyse sumaž÷ja ir jie negali perteklin÷s gliukoz÷s paversti į glikogeną. Be to gliukokinaz÷s aktyvumas neinhibuojamas gliukoz÷s 6-fosfato. Navikin÷se ląstel÷se rasta heksokinaz÷ II, kuri prijungta prie mitochondrijų išorin÷s membranos ir gali efektyviai panaudoti susidariusi oksidacinio fosforilinimo metu ATP.

Fosfofruktokinaz÷-1. Yra pagrindinis glikoliz÷s reguliatorinis fermentas. Jis alosteriškai aktyvuojamas ADP, AMP ir fruktoz÷s 2,6-bisfosfatu, bei slopinamas citratu, fosfoenolpiruvatu ir ATP. Reikia pažym÷ti, kad ATP yra šio fermento ir substratas ir slopiklis.

E.coli fosfofruktokinaz÷-1 yra tetrameras turintis du konformacinius būvius R ir T, kurie yra pusiausvyroje. Kiekvienas subvienetas turi substratinį ir alosterinius surišimo centrus. Fosfoenolpiruvatas yra glikoliz÷s proceso tarpininkas jis alosteriškai slopina fermentą, o ADP yra alosterinis aktyvatorius. Kada santykis fosfoenolpiruvatas/ADP yra aukštas, glikoliz÷s procesas sul÷t÷ja ties fosofofruktokinaze-1. Kada ADP prisijungia prie reguliatorin÷s srities, padid÷ja fosfofruktokinaz÷s-1 kiekis turinčios R konformaciją, kurio giminingumas fruktoz÷s 6-fosfatui yra didelis. Prisijungus fosfoenolpiruvatui prie reguliatorin÷s srities, fermento giminingumas fruktoz÷s 6-fosfatui sumaž÷ja. Labai įdomus yra ATP poveikis šio fermento aktyvumui. Mažos ATP koncentracijos fermentinę reakciją greitina, o didel÷s – slopina. Aktyvus (substratinis) centras suriša ATP bet kokiame būvyje (R ar T), o alosterinis prijungia ATP tiktai T konformacijoje. Substratinio surišimo centro giminingumas ATP yra žymiai didesnis nei alosterinio. Esant žemoms ATP koncentracijoms ATP susiriša su substratiniu, o ne su alosteriniu fermento centru, ir fermentin÷ reakcija vyksta dideliais greičiais. Esant aukštoms ATP koncentracijoms jis prijungiamas prie alosterinio centro ir pusiausvyra pastumiama į T konformacijos pusę, sumaž÷ja fruktoz÷s 6-fosfato surišimas ir reakcijos greitis sul÷t÷ja.

Kitas fosfofruktokinaz÷s-1 substratas fruktoz÷s 6-fosfatas pagrindinai susiriša su R konformacija.

Fosfofruktokinaz÷s-1 reguliacija adenino nukleotidais rodo, nukleotidų energetinio potencialo svarbą metabolizmo palaikyme. Glikoliz÷ yra labai jautri viduląsteliniams ATP/ADP, AMP pokyčiams. Padid÷jus ląstel÷je ATP koncentracijai, inhibuojama glikoliz÷ ir

259

energiją produkuojantis procesas sul÷t÷ja. Glikoliz÷s greitis inhibuojamas citratu. Esant dideliems energetiniams potencialams citratas išeina iš mitochondrijų. Citozolyje jis reaguoja su fosfofruktokinaze ir padidina fermento jautrumą inhibiciniam ATP poveikiui. Tokiu būdu glikoliz÷ ir trikarboksirūgščių ciklas tampriai susijęs bendru reguliatoriniu komponentu.

Fruktoz÷s 6-fosfatas + ATP Fruktoz÷s 1,6-bisfosfatas + ADP

SlopinaATP, citratas,fosfoenolpiruvatas

Aktyvuoja ADP, AMP,fruktoz÷s 2,6-bisfosfatas

Piruvato kinaz÷. Žinduolių audiniuose yra keturi skirtingi piruvato kinaz÷s izofermentai. Fermentas reguliuojamas dviem būdais: alosteriniais efektoriais ir kovalentine modifikacija. Piruvato kinaz÷ alosteriškai inhibuojama ATP. Dideli ATP kiekiai sumažina jos giminingumą fosfoenolpiruvatui. Fermentas alosteriškai aktyvuojamas fruktoz÷s 1,6-bisfosfatu, pagreit÷ja glikoliz÷ ir nesikaupia tarpiniai metabolizmo produktai.

Fosfoenolpiruvatas + ADP Enolpiruvatas + ATP

SlopinaATP, acetil-KoA

Aktyvuoja fruktoz÷s 1,6-bisfosfatas

Fruktoz÷s 1,6-bisfosfato susidarymą katalizuoja PFK-1. Tuo būdu, PFK-1 aktyvacija didina tolimesnę glikoliz÷s stadiją katalizuojančio fermento piruvato kinaz÷s aktyvumą. Piruvato .kinaz÷ inhibuojama acetil-KoA. Dideli acetil-KoA kiekiai susidaro oksiduojant riebalų rūgštis. Ši inhibicija leidžia ląstelei sumažinti gliukoz÷s oksidacijos greitį, kai energija apsirūpinama, skaidant riebalų rūgštis.

Piruvato kinaz÷s izofermentas iš kepenų ir žarnyno ląstelių reguliuojamas kovalentin÷s modifikacijos būdu, jį fosforilinant. Hormonas gliukagonas aktyvuoja nuo cAMP priklausomą baltymo kinazę A, kuri fosforilina ir PFK-2 ir piruvato kinazę. Fosforilintos piruvato kinaz÷s aktyvumas sumaž÷ja, ji stipriau yra inhibuojama ATP ir alaninu. Jos KM fosfoenolpiruvatui tampa aukštesn÷. Esant fiziologin÷ms fosfoenolpiruvato koncentracijoms, fermentas tampa neaktyvus ir fosfoenolpiruvatas gliukoneogenez÷s metu verčiamas į gliukozę.

Piruvato kinaz÷s aktyvumas kepenyse sumaž÷ja badaujant ir padid÷ja vartojant maistą turtinga angliavandeniais. Šiuos pokyčius sąlygoja piruvato kinaz÷s sintez÷s greitis.

8.8.3 Fruktoz ÷s 2,6-bisfosfatas ir gliukoz ÷s apykaitos reguliacija Vienas iš svarbiausių glikoliz÷s ir gliukoneogenez÷s reguliatorių kepenyse yra

fruktoz ÷s 2,6-bisfosfatas (Fru-2,6-BP). Fruktoz÷s 2,6-bisfosfatas yra alosterinis fosfofruktokinaz÷s-1 aktyvatorius. Padid÷jus jo koncentracijai aktyvuojama glikoliz÷ ir inhibuojama gliukoneogenez÷. Jis veikia žemesn÷se koncentracijose negu kiti fiziologiniai reguliatoriai. Pavyzdžiui AMP inhibuoja fruktoz÷s 1,6-bisfosfatazę su Ki = 25µM, tuo tarpu fruktoz÷s 2,6-bisfosfatas inhibuoja šį fermentą su Ki = 2,5µM.

260

Fruktoz÷s 2,6-bisfosfatas susidaro fosforilinant fruktoz÷s 6-fosfatą, reakcijoje, kurią katalizuoja fermentas fosfofruktokinaz÷-2 (PFK-2). PFK-2 aktyvumas stimuliuojamas

O

CH2OPO3

H

OH

H

H

OHOH

CH2OHO

CH2OPO3

H

OH

H

H

OHCH2OH

OPO3

ATP ADP

2-2-

2-

Fosfofruktokinaz÷-2

Pn H2O

Fruktoz÷s2,6-bisfosfataz÷

Fruktoz÷s 6-fosfatas Fruktoz÷s 2,6-bisfosfatas

fosfato ir inhibuojamas citrato.

Žinduolių kepenyse, to paties baltymo skirtingi aktyvūs centrai katalizuoja ir fosforilinim ą, ir fruktoz ÷s 2,6-bisfosfato hidrolitinį defosforilinimą. Šis antras fermentinis aktyvumas vadinamas fruktoz ÷s 2,6-bisfosfataz÷ (Fru-2,6-BPaz÷). Šie du fermento aktyvumai reguliuoja fruktoz÷s 2,6-bisfosfato koncentraciją ląstel÷je. Kepenyse PFK-2 aktyvumas reguliuojamas hormono gliukagono, kuris didina gliukoz÷s koncentraciją kraujyje. Gliukagono poveikyje kepenyse padid÷ja adenilato ciklaz÷s aktyvumas ir cAMP koncentracija išauga. cAMP aktyvuoja baltymo kinazę A ir yra fosforilinamas PFK-2 aktyviame centre esantis serinas. Fosforilinimas mažina dvifunkcinio fermento kinazinį aktyvumą ir didina fosfatazinį. Fruktoz÷s 2,6-bisfofato koncentracija sumaž÷ja, sumaž÷ja ir PFK-1 aktyvumas, sul÷t÷ja glikoliz÷ ir gliukoz÷s koncentracija išauga. Fruktoz÷s 6-fosfatas yra PFK-1 substratas ir stiprus fruktoz÷s 2,6-bisfosfataz÷s inhibitorius.

PFK-1 aktyvumas taip pat reguliuojamas viduląstelinio pH. Sunkiai dirbant, raumenyse anaerobin÷se sąlygose susidaro pieno rūgštis. Jeigu ji n÷ra greitai pašalinama iš ląstel÷s, jos vidinis pH sumaž÷ja ir PFK-1 aktyvumas nukrinta.

8.8.4 Heksoz ÷s transporteri ų reguliacija Glikoliz÷s apykaitoje svarbus etapas yra heksozių patekimo į ląstelę reguliacija.

Daugumos žinduolių organizmų, gliukoz÷s koncentracija ląstel÷se yra žemesn÷ nei kraujuje, tod÷l gliukoz÷ pernešama pasyviai pagal koncentracijos gradientą. Be to patekusi į ląstelę gliukoz÷ yra fosforilinama ir negiamą krūvį turintis gliukoz÷s fosfatas negali išeiti iš ląstel÷s. Visų ląstelių plazmin÷je membranoje rasti transporteriai pernešantys gliukozę, jie yra vadinami GLUT. Žmogaus smegenų, embrionin÷se, endotelin÷se ląstel÷se ir eritrocituose randamas GLUT1, Kepenyse, inkstuose, plonosiose žarnose, kasos β ląstel÷se yra GLUT2. Šis transporteris kasos β ląstel÷se atlieka jutiklio vaidmenį, padid÷jus gliukoz÷s koncentracijai kraujuje, gliukoz÷ prisijungia prie transporterio, jis veikia kaip receptorius ir greitina insulino per÷jimą iš kasos į kraują. Skeleto ir širdies raumenų, riebalinio audinio plazmin÷je membranoje yra GLUT4.

Tačiau dažnai reikia pernešti gliukozę prieš jos koncentracijos gardientą. Iš žarnyno visą gliukozę reikia pernešti į karują, taip pat inkstuose gliukoz÷ turi būti rezorbuojama. Šiam prešimui yra panaudojamas Na+ jonų gradientas sukurtas Na+/K+ ATPaz÷s. Šiose ląstel÷se yra nuo Na+ priklausoma gliukoz÷s pernašos sistema SGLT1, kuri 2 Na+ jonus perneša pagal koncentracijos gradientą ir vieną gliukoz÷s molekul÷ patenka į ląstelę prieš jos koncentracijos gradientą. Gliukoz÷ pernešama antrin÷s aktyvios pernašos būdu.

261

Kepenų, smegenų ląstelių plazmin÷je membranoje GLUT transporterių kiekis pastovus. Raumeninio ir riebalinio audinio, kurie yra pagrindiniai gliukoz÷s naudotojai, transporterio GLUT4 kiekis ląstelių plazmin÷je membranoje yra reguliuojamas insulino. Šiose ląstel÷se, pagrindinis baltymo GLUT4 kiekis yra citozolyje, viduląstelinių pūslelių membranoje. Insulino poveikyje šios pūslel÷s susilieja su plazmine membrana, did÷ja transporterio kiekis membranoje ir gliukoz÷s pernešimas suintensyv÷ja. Insulino koncentracijai nukritus, GLUT4 v÷l įsijungia į citozolyje esančias pūsleles.

8.13 pav. Insulinas ir gliukoz÷s transporterių reguliacija

8.8.5 Glikogeno fosforilaz ÷s reguliacija. Skeleto raumenyse glikogeno fosforilaz÷ (fosforilaz÷) yra dimeras, sudarytas iš dviejų

identiškų monomerų (mol. mas÷ 97400 Da). 1938m. Kori (K. ir G.Cori) pasteb÷jo, kad glikogeno fosforilaz÷ yra dviejose formose: mažiau aktyvi b forma, aktyvuojama AMP, ir a forma, kurios aktyvumui AMP n÷ra būtinas. 1969m. Krebsas (E.Krebs) ir Fišeris (E.Fisher) parod÷, kad fosforilaz÷ a yra fosforilintas baltymas, o fosforilaz÷ b - defosforilintas.

Glikogenas + H3PO4 Glikogenas (n-1) + Gliukoz÷s 1-fosfatas

SlopinaATP, gliukoz÷gliukoz÷s 6-fosfatas

Aktyvuoja AMP

Glikogeno fosforilaz÷ buvo pirmas fermentas kuriam parodytas aktyvumo reguliavimas dviem būdais: alosterine reguliacija ir kovalentine modifikacija. Fermentas gali būti dviejuose būviuose – aktyviame R ir mažiau aktyviame T būvyje. AMP aktyvuoja fermentą, o ATP, gliukoz÷s 6-fosfatas ir gliukoz÷ inhibuoja. AMP jungiasi prie fermento ir skatina jo per÷jimą į aktyvų R būvį. AMP adenino žiedas, riboz÷ ir fosforo rūgšties liekana jungiasi prie skirtingų polipeptidin÷s grandin÷s vietų ir sukelia didelius baltymo konformacinius pasikeitimus, pavyzdžiui aminorūgštis Ser14 pajuda per 3,6nm. T būvyje neigiama Asp283 aminorūgštis yra netoli fermento aktyvaus centro, tod÷l substrato anijono fosfato prisijungimas yra apsunkintas. Pereinant iš T būvio į R, nuo aktyvaus centro nutolsta Asp283 ir priart÷ja Arg569. Atsiradęs teigiamas krūvis palengvina fosfato sąveiką su fermentu ir fermentin÷ reakcija pagreit÷ja.

262

Glikogeno fosforilaz÷s aktyvumas reguliuojamas taip pat kovalentin÷s modifikacijos būdu. Fosforilinus glikogeno fosforilazę b ji pereina į aktyvią glikogeno fosforilaz÷s a formą.Fermento reguliacijoje dalyvauja trys fermentai:

1. Fosforilaz÷s kinaz÷, kuri specifiškai fosforilina fosforilaz÷s b Ser14 hidroksigrupę. 2. Nuo cAMP priklausoma baltymo kinaz÷, kuri fosforilina ir aktyvuoja fosforilaz÷s

kinazę. 3. Fosfoproteino fosfataz÷-1, kuri defosforilina ir inaktyvuoja glikogeno fosforilazę a

ir baltymo kinazę. Fosforilaz÷s kinaz÷. Fermentas, kurio molekulin÷ mas÷ 1200 kDa sudarytas iš keturių skirtingų subvienetų αβγδ. Jis aktyvuojamas kovalentin÷s modifikacijos būdu jį fosforilinant ir nedidel÷mis Ca2+ koncentracijomis. Izoliuotas γ subvienetas turi katalizinį aktyvumą. δ subvienetas yra žinomas kaip kalmodulinas, suteikia kompleksui jautrumą Ca2+. Kai Ca2+ prisijungia prie Ca2+ surišančių sričių, smarkia keičiasi kalmodulino konformacija ir fosforilaz÷s kinaz÷ aktyvuojama. Glikogeno fosforilaz÷ yra fosforilinama. Šios aktyvuojamos Ca2+ jonais reakcijos fiziologin÷ prasm÷ yra ta, kad raumenų susitraukimo procesas yra paleidžiamas Ca2+ iš÷jus iš endoplazminio tinklo. Padid÷jus Ca2+ koncentracijai, pagreit÷ja glikogeno skaidymas, padid÷ja gliukoz÷s koncentracija ir jos skaidymo greitis. Susidaro ATP, kuris reikalingas raumenų susitraukimui.

Fosforilaz÷s kinaz÷je yra fosforilinami α ir β subvienetai. Juos fosforilinus, fermentas aktyvuojamas mažesn÷mis Ca2+ koncentracijomis. Fosforilaz÷s kinaz÷s fosforilinimą aktyvuoja kai kurie hormonai, o Ca2+ išsiskyrimas iš endoplazminio tinklo ir raumenų susitraukimas inicijuojamas nervinio impulso. Taigi šie du signalai raumenų ląstel÷se veikia sinergistiškai ir stimuliuoja glikogenolizę.

Kalmodulinas. Kalmodulinas yra Ca2+ surišantis baltymas, jis plačiai paplitęs eukariotuose ir dalyvauja įvairiuose reguliaciniuose procesuose. Rentgenostruktūrin÷, šio konservatyvaus baltymo, turinčio 148 aminorūgštis, struktūra parod÷, kad baltymas sudarytas iš dviejų globulinių domenų, sujungtų 7 vijas turinčia α spiraline grandine. Kiekvienas domenas turi Ca2+ surišimo sritis (KD=10-6M). Kalmoduline, kaip ir daugelyje baltymų Ca2+ surišimo sritį sudaro H-L-H motivas, vadinamas EF ranka. Ca2+ jonai per O atomus koordinuoti su polipeptidin÷s grandin÷s karkasu ir šoniniais radikalais bei su vandens molekule. Prisijungiant Ca2+ keičiasi domenų konformacija ir metioninu turtinga hidrofobin÷ sritis yra eksponuojama į molekul÷s išorę. Ši sritis su dideliu giminingumu susijungia su fosforilaz÷s kinaz÷s γ subvieneto CaM surišančia sritimi, o taip pat su kitais CaM surišančiais reguliatoriniais baltymais. (www.fkem2.lth.se

263

8.13 pav. Kalmodulinas . Rutuliukais pažym÷ti Ca2+ jonai. B Kalmodulinas susirišęs su lygiųjų raumenų miozino lengvosios grandin÷s kinaze

cAMP priklausoma baltymo kinaz÷ arba baltymo kinaz÷ A (PKA). cAMP aktyvuojama baltymo kinaz÷ A katalizuoja įvairių baltymų fosforilinimą. Baltymo A gali būti dviejose formose – aktyvi ir neaktyvi. Neaktyvi fermento forma yra tetrameras, sudarytas iš dviejų reguliatorinių (R) ir dviejų katalizinių (C) subvienetų. Tetrametras R2C2 yra neaktyvus, nes reguliatoriniai subvienetai uždengia katalizinių subvienetų aktyvius centrus. Keturios molekul÷s cAMP prisijungia prie reguliatorinių subvienetų, tetrameras disocijuoja į reguliatorinį dimerą ir du katalizinius subvienetus. Aktyvūs kataliziniai subvienetai fosforilina fosforilaz÷s kinazę ir aktyvuoja fermentą. Aktyvi fosforilaz÷s kinaz÷ fosforilina glikogeno fosforilazę b, kuri pereina į aktyvią fosforilaz÷s a. formą

C C

R RR R C C+

4cAMP ( )

Fosforilaz÷s kinaz÷s pilnam aktyvumui reikalingi Ca2+ jonai. II tipo PKA sudaryta taip pat kaip ir I tipo, tačiau II tipo PKA reguliatoriniai subvienetai tarpininkauja baltymo susijungimui su membranoje esančiais baltymais pvz. MAP-2 kinaze ir kitais. cAMP priklausomos baltymo kinaz÷s fosforilina įvairių baltymų specifines Ser ir/ar Thr aminorūgštis.

Fosfoproteino fosfataz÷-1. Pastovią fosforilintų baltymų koncentraciją palaiko dviejų fermentų - kinazių ir fosfatazių suderintas veikimas. Fosfoproteino fosfataz÷-1 atskelia fosforo rūgšties liekanas nuo glikogeno fosforilaz÷s a, nuo fosforilaz÷s kinaz÷s α ir β subvienetų bei nuo kitų fosforilintų fermentų, dalyvaujančių glikogeno metabolizme. Insulino stimuliuojama baltymo kinaz÷ fosforilina fosfoproteino fosfatazę 1 ir ją aktyvuoja. Fosfoproteino fosfataz÷ 1 gali būti inhibuojama prijungiant fosfoproteino fosfataz÷s inhibitori ų 1.

264

fosforilaz÷s kinaz÷

fosfoproteino fosfataz÷-1

P

P

fosforilaz÷ b neaktyvi ( T būvis )

fosforilaz÷ a aktyvi (T būvis )

P

P

fosforilaz÷ a aktyvi (R būvis )

fosforilaz÷ b aktyvi ( R būvis )

ATPglc-6-P

AMP

nekovalentin÷

kovalentin÷ kontrol÷

kontrol÷

8.14 pav. Glikogeno fosforilaz÷s alosterin÷ ir kovalentin÷ reguliacija.

8.9 Gliukoz ÷s apykaitos hormonin ÷ reguliacija Labai svarbi angliavandenių apykaitos reguliacija yra hormonin÷. Pagrindiniai hormonai, kurie reguliuoja gliukoz÷s metabolizmą yra insulinas, gliukagonas ir adrenalinas.

8.9.1 Insulinas Insulinas yra 5,8 kDa baltymas sintetinamas kasoje proinsulino pavidale. Jis mažina gliukoz÷s koncentraciją kraujyje, pagreitindamas gliukoz÷s per÷jim ą iš kraujo į raumenų ir riebalinio audinio ląsteles. Insulinas reguliuoja genų ekspresiją ir fermentų atsakingų už gliukoz÷s ir lipidų metabolizmą aktyvumą. Kepenyse insulinas aktyvuoja glikogeno sintazę, gliukokinazę ir inaktyvuoja glikogeno fosforilazę. Jis taip pat stimuliuoja perteklinių medžiagų virtim ą į riebalus. Insulino poveikyje padid÷ja aktyvumas ir kiekis tų fermentų, kurie katalizuoja procesus mažinančius gliukoz÷s koncentraciją ląstel÷je (padid÷ja glikogeno sintez÷ kepenyse ir raumenyse, pagreit÷ja riebalų rūgščių ir triacilglicerolių biosintez÷ kepenyse ir riebaliniame audinyje, baltymų biosintez÷, kepenyse aktyvuojama glikoliz÷). Tuo pat metu yra inhibuojami procesai skatinantys gliukoz÷s koncentracijos padid÷jimą (sul÷t÷ja

265

glikogeno skaidymas slopinama gliukoneogenez÷ kepenyse, padid÷ja aminorūgščių pernaša į raumenis ir tuo pačiu pagreit÷ja baltymų biosintez÷, inhibuojama baltymų degradacija, lipidų skaidymas).

Insulinas yra plataus poveikio hormonas, jis ne tiktai reguliuoja metabolizmą, bet ir įtakoja kalio homeostazę, ląstel÷s tūrio palaikymą, ląstelių augimą ir diferenciaciją.

Organizmui nesintetinat insulino ar sutrikus insulino signalo perdavimui (neaktyvūs receptoriai, mutavę signalo perdavimo tarpininkai) susergama cukralige (diabetes mellitus).

Hormonas patekęs į kraują jungiasi prie plazmin÷je membranoje esančio insulino receptoriaus ir per įvairius signalinius kelius pasireiškia jo pleiotropinis poveikis. Insulino veikimo mechanizmas n÷ra pilnai išaiškintas, tačiau pagrindinis jo poveikis nukreiptas į gliukoz÷s pernešimą iš kraujo į audinius ir glikogeno sintez÷s stimuliaciją.

Insulino receptorius yra heterotetrameras sudarytas iš dviejų 165 kDa α−subvienetų ir dviejų 95 kDa β−subvienetų, kurie surišti disulfidiniu tilteliu.

Receptorius išsid÷sto plazmin÷je membranoje taip, kad

8. pav. Insulino receptoriaus struktūra.

α subvienetai yra plazmin÷s membranos išorin÷je pus÷je ir prie baltymo C galo jungiasi insulinas. β subvieneto polipeptidin÷s grandin÷s α spiralinis segmentas pereina skersai membranos ir vidin÷je pus÷je yra polipeptidin÷s grandin÷s C galas. Abu subvienetai yra glikoproteinai. Prisijungus prie ląstel÷s paviršiaus insulinui, keičiasi receptoriaus konformacija ir signalas perduodamas iš išorin÷s membranos pus÷s į vidinę. β subvieneto C galin÷je dalis turi tirozino kinazinį aktyvumą. Prisijungus insulinui prie receptoriaus α−subvieneto, autofosforilinasi β−subvienetas - fosforo rūgšties liekana nuo ATP pernešama ant tirozino hidroksigrup÷s. Aktyvuotas receptorius toliau fosforilina insulino receptoriaus substratus (IRS). Plačiausiai paplitęs yra IRS-1. Fosforilint ą tiroziną atpažįsta baltymai turintys SH2 domeną

Fosforilintas IRS-1 per baltymą p85 aktyvuoja fosfatidilinozitolio(inozitido)-3 kinazę, kuri fosforilina fosfatidilinozitolio 4,5-bisfosfatą. Susidaręs fosfatidilinozitolio 3,4,5-trisfosfatas (PIP3) aktyvuoja baltymo kinazę B (PKB) (ji taip pat vadinama Akt), kai kurias baltymo kinaz÷s C (PKC) formas. Baltymo kinaz÷ B fosforilina įvairių ląstel÷s baltymų serino ir treonino aminorūgštis.

266

PKB fosforilina ir inaktyvuoja glikogeno sintaz÷s kinazę 3 (GSK3), kuri yra pagrindin÷ glikogeno homeostazę reguliuojanti kinaz÷. Glikogeno sintezę katalizuojanti glikogeno sintaz÷, priešingai nei fosforilaz÷ yra aktyvi defosforilinta. Neaktyvi glikogeno sintaz÷s kinaz÷ 3 nefosforilina glikogeno sintaz÷s, tod÷l insulino poveikyje stimuliuojama glikogeno sintez÷ ir mažinama laisvos gliukoz÷s koncentracija. Insulinas taip aktyvuoja fosfoproteino fosfatazę-1, kuri defosforilina ir aktyvuoja glikogeno sintazę bei defosforilina ir inaktyvuoja glikogeno fosforilazę.

Insulino poveikyje aktyvuojama fosfodiesteraz÷, sumaž÷ja cAMP koncentracija ir inhibuojama PKA. Esant neaktyviai PKA n÷ra fosforilinama piruvato kinaz÷ ir fosfofruktokinaz÷-2. Defosforilinus piruvato kinazę jos aktyvumas išauga ir glikoliz÷ intensyv÷ja. Defosforilinta PFK-2 lieka aktyvi kaip kinaz÷ ir padid÷jusi fruktoz÷s 2,6-bisfosfato koncentracija aktyvuoja fosfofruktokinazę-1 ir gliukoz÷s skaidymo greitis išauga. Insulinas taip pat inhibuoja lipolizę defosforilindamas lipazę ir aktyvuodamas fosfodiesterazę. Insulinas aktyvuodamas desaturazes ∆9 ∆6 ∆5 reguliuoja nesočių riebalų rūgščių sintezę.

Kitas insulino receptoriaus substratas yra IRS-2, kuris per Grb2 aktyvuoja MAP kinazinę kaskadą. Fosforilintas MAPK (mitogen activated protein kinase) difunduoja į branduolį, aktyvuoja transkripcijos faktorių Elk1 ir reguliuoja genų raiška bei baltymų biosintezę. Insulino poveikyje padid÷ja gliukokinaz÷s sintez÷ kepenyse, sumaž÷ja fosfoenolpiruvato karboksikinaz÷s geno transkripcija.

Gliukoz÷s pernešimo per membraną greitis gali did÷ti kintant transporterio GLUT aktyvumui arba padid÷jus jo koncentracijai membranoje. Transporterio kiekį membranoje galima didinti skatindami GLUT4 sintezę arba įjungiant baltymą iš viduje ląstel÷s esančių atsargų. Šis kelias yra efektyvesnis ir greičiau sureaguoja į pakitusias sąlygas. Gliukoz÷s pernešimo greitis paveikus insulinu padid÷ja tiktai į raumenų ir riebalinio audinio ląsteles.

8. pav. Membraninių pūslelių su GLUT4 jud÷jimo ciklas. Insulino poveikyje aktyvuota PKB fosforilina baltymus, reikalingus pūslelių su

GLUT4 susiliejimui su plazmine membrana. Nesant insulino apie 90% GLUT4 yra susijungęs su vidulastelin÷mis pūslel÷mis, kurių membranoje yra tokie baltymai kaip sinaptobrevinas (v-SNARE baltymas, reikalingas membranų susiliejimui) taip pat nedidelis, GTP surišantis baltymas Rab-4. Paveikus insulinu, pūslel÷s juda prie plazmin÷s membranos ir prisijungia, sudarydamos kompleksus su t-SNARE baltymais. Pūslel÷ms susiliejus su plazmine membrana, joje padid÷ja transporterio GLUT4 kiekis ir pagreit÷ja gliukoz÷s pernaša. Pašalinus insuliną, GLUT4 įjungiamas į klatrinu dengtas plazmin÷s membranos pūsleles, jos pereina į citozolį ir jose saugomas GLUT4.

Insulino veikimo taškai parodyti 8.17 pav.

267

baltymų fosforilinimas antrinių tarpininkų modifikacija

gliukoz÷spernaša

glikoliz÷gliukokinaz÷PFK-1PDH

glikogenosintez÷ glikogeno sintaz÷

lipidų sintez÷

lipidųskaidymas

baltymųsintez÷

gliukoneo genez÷

glikogenoskaidymasfosforilaz÷

Insulinas

Insulino receptorius

+

+

+

+ +

-

-

-

lipoproteino lipaz÷acetil-KoAkarboksilaz÷

GLUT4

-

8.17 pav. Bendra insulino veikimo schema.

8.9.2 Adrenalinas

Adrenalinas (epinefrinas) ir noradrenalinas (norepinefrinas) yra katecholaminai, sekretuojami antinksčių žiev÷s veilai kaip hormonai, jų poveikyje sintetinamos antrin÷s signalin÷s molekul÷s ir keičiasi medžiagų apykaita, vienas iš pagrindinių atsakų yra gliukoz÷s padid÷jimas. Kada adrenalinas ir noradrenalinas sekretuojami presinaptinių nervų galūn÷lių, jie veikia kaip neurosiuntikliai .

C CH2

NH

CH3

OH

H

OH

OH

C CH2

NH2

OH

H

OH

OH

Adrenalinas Noradrenalinas

At÷jęs signalas iš centrin÷s nervų sistemos iššaukia adrenalino iš÷jimą iš antinksčių žiev÷s į kraują. Adrenalinas veikia kepenis ir raumenys, kadangi receptoriai yra šių organų plazmin÷je membranoje. Adrenalinas yra sekretuojamas kaips atsakas į pykčio ar baim÷s

268

pasireiškimą, kai organizmas gauna pavojaus signalą ir jo poveikis yra trumpalaikis. Šio hormono poveikyje organizmas pasiruošia mobilizuoti didelius energijos kiekius.Atsaką į stresą sąlygoja dviejų tipų adrenalino receptoriai - β−adrenerginiai receptoriai ir α −adrenerginiai receptoriai. Prisijungus hormonui prie raumenų ląstelių ββββ-adrenerginio receptoriaus aktyvuojama adenilato ciklaz÷ ir padid÷ja ląstel÷je cAMP kiekis, kuris per eilę tarpinių reakcijų aktyvuoja atitinkamus fermentus. Adrenalino poveikyje pasireiškia daug efektų. Vienas iš jų yra paleisti fermentinių reakcijų kaskadą, kurių metu pagreit÷ja ATP sintez÷. (8.18 pav.). Tod÷l išauga glikogenoliz÷ (aktyvuojama glikogeno fosforilaz÷) ir sul÷t÷ja glikogeno sintez÷ (slopinama glikogeno sintaz÷). Organizme stebimas gliukoz÷s iš÷jimas iš kepenų, jos koncentracijos padid÷jimas kraujuje ir gliukoz÷s panaudojimo sumaž÷jimas raumenyse.

α−α−α−α−adrenerginiai receptoriai aktyvuoja fosfolipazę C, kuri katalizuoja kitų antrinių signalinių molekulių inozitolio 1,4,5-trisfosfato, diacilglicerolio ir Ca2+ išsiskyrimą. Fosforilaz÷s kinaz÷s pilnam aktyvumui reikalingi Ca2+ jonai. Glikogeno sintaz÷ taip inaktyvuojama nuo Ca2+ priklausomos baltymo kinaz÷s C.

Riebaliniame audinyje adrenalinas aktyvuoja triacilglicerolių skaidymą Adrenalinas inhibuoja insulino išsiskyrimą ir aktyvuoja glutationo susidarymą.

P

P

P

Adrenalinas

G baltymas

ATP cAMP

Baltymo Baltymokinaz÷ A kinaz÷ A /neaktyvi/ /aktyvi/

Fosforilaz÷s Fosforilaz÷s kinaz÷ kinaz÷/neaktyvi/ ATP ADP /aktyvi/

Fosforilaz÷ b Fosforilaz÷ a /neaktyvi/ /aktyvi/

Glikogeno Glikogenosintaz÷ sintaz÷/aktyvi/ /neaktyvi/

Adenilatociklaz÷/neaktyvi/

Adenilatociklaz÷/aktyvi/

ATP ADP

ATP ADP

Glikogeno skaidymas

Fosfodiesteraz÷

AMP

269

8.18 pav. Adrenalino veikimo schema

8.9.3 Gliukagonas Gliukagonas yra polipeptidinis hormonas sintetinamas kasos Langerhanso α salel÷se. Gliukagonas kaip ir adrenalinas, kortizolis ir augimo hormonas veikia priešingai nei insulinas, jis didina gliukoz÷s koncentraciją kraujuje. Gliukagonas gliukoz÷s koncentraciją kraujuje palaiko ilgesnį ir pastovesnį laiką. Polipeptidas sudarytas iš iš 29 aminorūgščių, jo aminorūgščių seka pateikta 8.19 pav. His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr 8.19 pav. Gliukagono aminorūgščių seka.

Sumaž÷jus kraujo plazmoje gliukoz÷s padid÷ja gliukagono sekrecija, aminorūgštys

taip pat stimuliuoja gliukagono išsiskyrimą. Gliukagono išsiskyrimas aktyvuojamas adrenalino. Gliukagonas yra vienas iš daugelio hormonų, kurio poveikyje aktyvuojama adenilato ciklaz÷ ir taikinio ląstel÷je padid÷ja cAMP kiekis. Gliukagono receptoriai nustatyti riebalinio audinio ląstel÷se (hormonas stimuliuoja lipolizę ir riebalų rūgščių išsiskyrimą), kepenų ląstel÷se (gliukagonas aktyvuoja glikogenolizę ir gliukoneogenezę). Skeletiniuose raumenyse gliukagono receptorių n÷ra. Sumaž÷jus gliukoz÷s koncentracijai kraujyje gliukagonas iš kasos išeina į kraują ir skatina procesus didinančius gliukoz÷s koncentraciją kraujyje. Gliukagonas pagrindinai veikia kepenis. Vienas iš gliukoz÷s šaltinių yra kepenyse saugomas glikogenas, kitas šaltinis yra gliukoz÷s sintez÷ iš piruvato, pieno rūgšties ar aminorūgščių gliukoneogenez÷s metu. Gliukagonas susijungęs su atitinkamu receptoriumi aktyvuoja G baltymus, aktyvuoja cAMP sintezę. Gliukagono veikimo schema pateikta 8.19 pav

.

Gliukagonas

Baltymo kinaz÷ A Baltymo kinaz÷ A /neaktyvi/ /aktyvi/

Fermentas Fermentasnefosforilintas fosforilintas

ATP ADP

ATP cAMP

8.19 pav.Gliukagono veikimo schema

Padid÷jus cAMP koncentracijai yra aktyvuojamos baltymų kinaz÷s ir fosforilinami atitinkami fermentai – fosforilaz÷ b, glikogeno sintaz÷, fosfofruktokinaz÷-2 (PFK-2), fruktoz÷s 2,6-bisfosfataz÷ (Fru-2,6-BPaz÷), piruvato kinaz÷. Fosforilinus ir aktyvavus fosforilazę, padid÷ja glikogeno skaidymas ir gliukoz÷ atsipalaiduoja į kraują. Fosforilinus glikogeno sintazę jos aktyvumas sumaž÷ja ir glikogenas n÷ra sintetinamas. Gliukagonas inhibuoja gliukoz÷s skaidymą glikoliz÷s keliu ir stimuliuoja gliukoz÷s sintezę gliukogenez÷s

270

metu. Šie efektai susiję su fruktoz÷s 2,6-bisfosfato koncentracijos sumaž÷jimu, fosforilinus fosfofruktokinazę-2, sumaž÷ja jos kinazinis aktyvumas ir didin÷ja fruktoz÷s 2,6-bisfosfatazinis aktyvumas. Tod÷l sumaž÷jus fruktoz÷s 2,6-bisfosfato kiekiui n÷ra aktyvuojama fosfofruktokinaz÷-1.

Gliukagono poveikyje fosforilinama ir inhibuojama piruvato kinaz÷, tod÷l kepenyse kaupiasi fosfoenolpiruvatas, kuris įtraukiamas į gliukoneogenezę.

Gliukagonas taip pat padidina cAMP koncentraciją riebaliniame audinyje. Nuo cAMP priklausomu keliu yra fosforilinima ir aktyvuojama lipaz÷, kuri katalizuoja neutralių riebalų hidrolizę. Susidariusios riebalų rūgštys pernešamos į kepenis ir kitus organus, kur panaudojamos vietoje gliukoz÷s kaip energetin÷ medžiaga. Gliukagono poveikis pasireiškia genų ekspresijos lygyje. Jis represuoja piruvato kinaz÷s sintezę, aktyvuoja gliukoneogeninio fermento fosfoenolpiruvato karboksikinaz÷s sintezę.

Gliukagono sekrecija

cAMP

Fermentų fosforilinimas

Fosforilaz÷ Glikogeno PFK-2 Fru-2,6-BPaz÷ Piruvato kinaz÷ sintaz÷

Glikogenoliz÷ Glikogeno Fru-2,6-BP PEP sintez÷ PVR

PFK-1

Fru-1,6-BPaz÷

Gliukoz÷ kraujyje

Glikoliz÷Gliukoneogenez÷

Proceso greitis ar fermento aktyvumas did÷ja

Proceso greitis ar fermento aktyvumas maž÷ja

8.20 pav. Gliukagono poveikis į skirtingus medžiagų apykaitos procesus. PFK-2 - fosfofruktokinaz÷-2, PFK-1 – fosfofruktokinaz÷-1, Fru-2,6-BP – fruktoz÷s-2,6-bisfosfataz÷, Fru-1,6-BP – fruktoz÷s-1,6-bisfosfataz÷, PEP – fosfoenolpiruvatas, PVR - piruvatas.

271

9 TRIKARBOKSIR ŪGŠČIŲ CIKLAS (Krebso ciklas) Angliavandenių, triacilglicerolių, aminorūgščių skaidymo metu susidaręs piruvatas ir

acetil-KoA toliau yra skaidomas trikarboksir ūgščių cikle. Šis ciklas dar yra vadinamas Krebso ar citrinų rūgšties ciklu. Suminę trikarboksirūgščių ciklo reakciją galime užrašyti sekančiai:

CH3COOH + 2H2O 2CO2 + 8[H]

CH3COSKoA + 3H2O 2CO2 + KoASH + 8[H]

arba

Trikarboksirūgščių ciklas yra uždaras procesas, susidedantis iš 8 atskirų reakcijų vyksta mitochondrijų užpilde. Jo metu acetilo grup÷ suskaidoma iki dviejų CO2 molekulių ir susidaro trys NADH , vienas FADH 2 ir GTP(ATP). Redukuoti nukleotidai oksiduojami mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷je ir atsipalaidavusi energija sukaupiama didžiaenergiuose ATP molekul÷s ryšiuose.

Oksalacto rūgštis yra pradinis ciklo substratas, taipogi ji yra galutinis produktas. Tarpiniai trikarboksirūgščių ciklo produktai yra identiški įvairių metabolinių procesų junginiams. Trikarboksirūgščių ciklas vaidina labai svarbų vaidmenį tiek ląstel÷s katabolizme, tiek anabolizme. Metabolizuojant angliavandenius, triacilglicerolius, aminorūgštis anglies atomų skeletas yra suskaidomas trikarboksirūgščių cikle. Tarpiniai trikarboksirūgščių ciklo junginiai dalyvauja gliukoneogenez÷je, riebalų rūgščių, amino rūgščių, purinų, pirimidinų, porfirinų, izoprenoidų sintez÷je. Trikarboksirūgščių ciklas yra amfibolinis, jis atlieka ir katabolines ir anabolines funkcijas.

9.1 Piruvato oksidacija iki acetil-KoA ir CO 2 Glikoliz÷s metu citozolyje susidaręs piruvatas kartu su protonu specialios transportin÷s

sistemos pernešamas per vidinę mitochondrijų membraną į užpildą. Čia jis paverčiamas į acetil-KoA. Piruvato oksidaciją iki acetil-KoA ir CO2 katalizuoja fermentinis kompleksas piruvato dehidrogenaz÷ (PDH). Tai yra labai sud÷tingas procesas, vykstantis eukariotų mitochondrijų užpilde arba prokariotų citoplazmoje.

CH3COCOOH + KoASH + NAD+ CH3COSKoA + CO2 + NADH + H+

∆G0/ = - 33kJ/mol

PDH

9.1.1 Piruvato dehidrogenazinio komplekso strukt ūra Piruvato dehidrinimą ir dekarboksilinimą vykdo trys skirtingi fermentai ir 5

kofermentai ar prostetin÷s grup÷s: tiamindifosfatas (TDP), lipo rūgštis, kofermentas A (KoA), NAD ir FAD (skyrius 2.5). Šių kofermentų sud÷tyje yra penki gyvybiškai svarbūs vitaminai - vitaminas B1 (TDP), vitaminas B2 (FAD), pantoteno rūgštis (KoA), vitaminas PP (NAD) bei pati lipo rūgštis.

Į piruvato dehidrogenazinį kompleksą įeina trys fermentai: piruvato dehidrogenaz÷ (E1), dihidrolipo transacetilaz÷ (E2) ir dihidrolipo dehidrogenaz÷ (E3). Skirtinguose organizmuose, komplekso molekulin÷ mas÷ ir fermentų kopijų skaičius yra įvairus. Piruvato

272

dehidrogenazinio komplekso, išskirto iš E.coli molekulin÷ mas÷ yra lygi 4,5 106 Da. Komplekso šerdį sudaro dihidrolipo transacetilaz÷, kuri susijungia su kitais komplekso fermentais. E.coli yra 24 šio fermento molekul÷s, prie kurių kovalentiniu ryšiu yra prijungtos lipo rūgštys. Lipo rūgštis sujungta su baltymo lizino aminorūgšties ε-amino grupe. Lipo rūgštis gali būti oksiduotoje ir redukuotoje formose, bei gali prisijungti acetilo liekaną. (8.21 pav.) Lipoatas yra elektronų ir acilo grup÷s nešiklis. Kadangi lipoil-lizino grup÷ yra ilga (1,4nm) ir lanksti, tai ši “ranka” perneša acetilo liekaną piruvato dehidrogenaziniame komplekse nuo vieno fermento aktyvaus centro ant kito. Prie šerdies yra prijungtos 12 piruvato dehidrogenaz÷s (E1) molekul÷s, sudarytos iš dviejų subvienetų. Su šiuo baltymu tvirtu, bet ne kovalentiniu ryšiu yra sujungtas TDP. Šešios molekul÷s dihidrolipo dehidrogenaz÷s molekul÷s, kurių kiekviena taip sudaryta iš dviejų subvienetų, turi prijungtą FAD.

8.28.21 pav. Lipo rūgštis susijungusi su baltymo dihidrolipo transacetilaz÷s lizino aminorūgštimi.

Žinduolių (bet ne prokariotų) piruvato dehidrogenazin÷s kompleksas yra reguliuojamas kovalentin÷s modifikacijos keliu jį fosforilinant ir defosforilinant, šiame procese dalyvauja du papildomi fermentai – piruvato dehidrogenaz÷s kinaz÷ ir piruvato dehidrogenaz÷s fosfataz÷.

9.1.2 Piruvato dehidrogenazinio komplekso veikimo m echanizmas Piruvato oksidacija iki acetil-KoA vyksta keliomis stadijomis. 1.Stadija. Pirmoje stadijoje piruvatas reaguoja su prijungtu prie fermento piruvato

dehidrogenaz÷s TDP, dekarboksilinamas piruvatas ir susidaro hidroksietil-TDP E1 bei atsipalaiduoja CO2. Ši reakcija yra identiška reakcijai, kurią katalizuoja mielių piruvato dekarboksilaz÷.

CH2

CH2

S

S

CH2

CH2

CH2

CH2

CO

NH

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

SH

SH

CH2

CH2

CH2

CH2

CO

NH

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH3-CO-S

SH

CH2

CH2

CH2

CH2

CO

NH

CH2

CH2

CH2

CH2

NH

CH CO NH

CH CONH

CH CO

Liporūgštis

BaltymoLys liekana

oksiduota forma

redukuota forma

acetilinta forma

273

N

CS

CH3

_

O C C CH3

O O

N

CS

CH3

O C C CH3

O OH

N

CS

CH3

H O C CH3_

N

CS

CH3

H

+

Piruvatas

TDP E1

R2

R1

+

R2

R1

+

R2

R1

Hidroksietil-TDP-E1

H+

CO2

+

R2

R1

H+

TDP karbanijonas-E1--

2. Stadija. Piruvato dehidrogenaz÷ nepaverčia hidroksietil-TDP į acetaldehidą ir TDP,

o perneša hidroksietilo grupę ant dihidrolipo transacetilaz÷s (E2) liporūgšties. Karbanijono hidroksietilo grup÷ atakuoja lipoamidodisulfidą. Hidroksietilo karbanijonas oksiduojasi iki acetilo grup÷s. Atsipalaidavę du elektronai redukuoja lipo rūgšties -S-S- tiltelį, susidarant dviem merkaptogrup÷m (-SH), vieną iš jų yra acetilinama.

N

CS

CH3

H O C CH3_

S

S

N

CS

CH3

H O C CH3

S

SH

N

CHS

CH3

S

SH

CO CH3

+

R2

R1

E2

Lipoamidas-E2

+

R2

R1

E2

H+

+

R2

R1

E2

Acetil-dihidrolipoamidas-E2

+

3. Stadija. Dihidrolipo transacetilaz÷ katalizuoja acetilo grup÷s pernešimą ant KoA,

susidarant acetil-KoA ir dihidrolipoamido-E2. Hidroksietil-TDP oksidacijos metu išsiskyrusi energija yra sukaupiama didžiaenergime tioesteriniame ryšyje ir v÷liau naudojama citrato sintezei, sujungiant acetil-KoA su oksalacetatu. Lipoillizino „ranka“, kurios ilgis yra 1.4nm,

274

perkelia redukuojančius ekvivalentus ir acetilo grupę nuo piruvato ant KoA.

S

SH

CO CH3

C CH3

OSH

SHS

E2

Acetil-dihidrolipoamidas-E2

KoA-SHKoA

E2

Dihidrolipoamidas-E2

+

Acetil-KoA

~

4. Stadija. Dihidrolipo dehidrogenaz÷ (ji dar vadinama lipoamido dehidrogenaz÷)

reoksiduoja dihidrolipoamidą . Oksiduotas E3 turi aktyvią disulfido grupę ir stipriai su baltymu surištą FAD. Oksiduojantis dihidrolipoamidui redukuojamas baltymo disulfidas, susidarant dviem merkaptogrup÷m ir jos redukuoja FAD. Arsenas nuo senov÷s yra žinomas kaip stiprus nuodas. As(III) junginiai tokie kaip arsenitas (AsO3

3-) bei organiniai arseno junginiai kovalentiniu ryšiu susijungia su junginiais, turinčiais merkapto grupę. Arsenitui prisijungus prie redukuoto lipoamido, inhibuojama lipoamidą turintys fermentai – piruvato dehidrogenaz÷ ir α ketoglutarato dehidrogenaz÷ ir sutrinka medžiagų apykaita.

5 Stadija. Redukuotas FAD (FADH2) reoksiduojamas NAD+ ir redukuotas NAD (NADH) oksiduojamas kv÷pavimo grandin÷je.

SH

SH

S

S

FAD

S

S E2

+

FAD

SH

SH E2

+

E3 oksiduotas E3 redukuotas

FAD

SH

SH

FADH2

S

S

FAD

S

S

NAD+ NADH + H+

Bendra piruvato dehidrogenazin÷ reakcija pateikta 8.22 pav.

275

2. E1-TDP-CHOH-CH3 + E2

S S SH S

E2 + E1-TPP

1. CH3-CO-COO- + E1-TDP E1-TDP-CHOH -CH3 + CO2

4. E2 + E3-FAD + E3-FADH2

SH SH S S

E2

~CO-CH3

SH S

3. E2 + KoASH + CH3-CO ~ SKoA~CO-CH3 SH SH

E2

5. E3-FADH2 + NAD+ E3- FAD + NADH + H+

8.22 pav. Bendra piruvato dehidrogenazininio komplekso reakcija.

9.2 Trikarboksir ūgščių ciklo chemin ÷s reakcijos Trikarboksirūgščių cikle acetil-KoA reaguoja su oksalacto rūgštimi, susidarant citratui.

Citratas per eilę reakcijų virsta oksalacetatu ir ciklas kartojasi (8.23, 8.24 pav.).

citratas

izocitratas

α-ketoglutaratas

sukcinil-KoA

sukcinatas

fumaratas

malatas

oksalacetatas

NAD+

NAD+

NAD+

NADH+ H+

NADH+ H+

NADH+ H+

CH3CO-SKoA KoASH

GDP + Pn

(ADP +Pn)

GTP (ATP)

FAD

FADH2

H2O

H2O

H2O

8.23 pav. Trikarboksirūgščių cilas.

1. Pirma trikarboksirūgščių ciklo reakcija yra acetil-KoA kondensacija su oksalacetatu. Reakciją katalizuoja citrato sintaz÷. Acetilo grup÷s metilo anglies atomas

276

prisijungia prie oksalacetato C-2 atomo. Aktyviame fermento centre susidaro pereinamojo būvio tarpininkas citroil-KoA, kuris greitai hidrolizuojamas iki KoA ir citrato. Šios reakcijos ∆G0/ = -32.2kJ/mol, tai rodo, kad reakcija yra nukreipta į citrato susidarymo pusę. Paprastai oksalacetato koncentracija ląstel÷je yra nedidel÷, tod÷l esant dideliam neigiamam ∆G0/ acetatas labai efektyviai panaudojamas. Atsilaisvinęs KoA v÷l dalyvauja piruvato oksidaciniame dekarboksilinime.

COO-

CO

CH2

COO-

CH2

C COOOH

CH2

COO

COO

CH2

CH COO

CH

COO-

COO-OH

COO-

CH2

CH2

CO

COO-

COO-

CH2

CH2

CO

COO-

CH2

CH2

COO-

Izocitratas

Sukcinatas

NAD+ NADH+H+

CO2

NAD+ NADH+H+

CO2

GDP+Pn GTP(ADP+Pn ATP)

FAD FADH2 COO-

CH

HC

COO-

COO-

CHOH

CH2

COO-

H2ONAD+ NADH+H+ COO-

CO

CH2

COO-

Oksalacetatas

CH3COSKoA KoASH

Citratasα-Ketoglutaratas

Sukcinil-KoA Fumaratas

Malatas Oksalacetatas

1 2 3

4 56

7 8

H2O

-

- -

~SKoAKoASH

-

8.24 pav. Trikarboksirūgščių ciklo reakcijos. Fermentai: 1-citrato sintaz÷, 2-akonitaz÷, 3-izocitrato dehidrogenaz÷, 4-α-ketoglutarato dehidrogenaz÷, 5-sukcinato tiokinaz÷, 6- sukcinato dehidrogenaz÷, 7- fumaraz÷, 8- malato dehidrogenaz÷.

2. Katalizuojant akonitazei, citratas yra izomerizuojamas į izocitratą. Procesas vyksta per tarpininką cis-akonitatą, kuris nedisocijuoja nuo fermento aktyvaus centro. Akonitaz÷ turi Fe-S centrą, prie kurio jungiasi substratas dviem karboksi- ir viena hidroksigrupe. Reakcijos metu citratas dehidratuotasi ir tarpininkas cis-akonitatas hidratuojasi. Reakcijos ∆G0/ = 6,3kJ/mol.

277

COO

CH2

C COOOH

CH2

COO

COO

CH

C COO

CH2

COO

COO

CH

C COO

CH2

COO

OH

H

Citratas cis-akonitatas Izocitratas

-

-

-

-

-

-

-

-

-

H2OH2O

Akonitaz÷ yra slopinama augalų toksino fluoracetato (žr. skyrių 2.4).

3. Izocitrato dehidrogenaz÷ katalizuoja izocitrato oksidacinį dekarboksilinimą, susidarant α-ketoglutaratui. Reakcijos metu susidaro pereinamojo būvio tarpininkas oksalo sukcinatas. Yra du izocitrato dehidrogenaz÷s izofermentai, vienas turi kofermentą NAD’ ą randamas mitochondrijų užpilde. Kitas - nuo NADP priklausoma izocitrato dehidrogenaz÷ sutinkama ir užpilde ir citozolyje, katalizuoja redukcinių ekvivalentų pernešimą ant NADP+. Šioje reakcijoje susidaręs NADPH tarnauja redukciniams anaboliniams procesams.

4. Ketvirtoje stadijoje α−ketoglutaratas oksidacinio dekarboksilinimo metu verčiamas sukcinil-KoA ir CO2. Reakciją katalizuoja fermentinis kompleksas α−α−α−α−ketoglutarato dehidrogenaz÷. Ši reakcija yra panaši į piruvato dehidrogenaz÷s komplekso katalizuojamą reakciją. α-ketoglutarato dehidrogenaz÷s komplekso sud÷tyje yra trys fermentai analogiški piruvato dehidrogenaz÷s E1, E2 ir E3 .Prie baltymų yra prijungti TDP, lipo rūgštis, NAD, FAD, KoA. Oksiduojantis α−ketoglutaratui atsipalaiduoja CO2, o išsiskyrusi energija yra sukaupiama didžiaenergiame sukcinil~KoA ryšyje. Reakcijos metu redukuojamas NAD+.

5. Sukcinil~KoA tioesterinio ryšio hidroliz÷s energija kaip ir acetil~KoA yra labai neigiama (∆G0/ = -36,4kJ/mol). Kitoje stadijoje šio ryšio energija yra panaudojama fosfoanhidridinio ryšio susidarymui ATP ar GTP molekul÷je. Reakcijoje, katalizuojamoje sukcinato tiokinaz÷s arba vadinamos sukcinil-KoA sintetaz÷s susidaro sukcinatas ir GTP ar ATP. Yra nustatyta, kad kai kurios gyvūnų organizmo ląstel÷s turi du izofermentus, vieną specifišką GDP kitą - ADP. Reakcijos metu fosforilinamas fermento aktyviame centre esantis histidinas ir susidaro fosfohistidino tarpininkas. Fosfato grup÷, turinti didelį grup÷s pernešimo potencialą pernešama ant ADP ar GDP. Tuo būdu, energija išsiskyrusi oksidacinio α−ketoglutarato dekarboksilinimo metu yra sukaupiama didžiaenergiuose ATP ar GTP ryšiuose. Kaip ir glikoliz÷je, oksiduojant glicerolio aldehido 3-fosfatą, trikarboksirūgščių cikle susidaro tarpinis cheminis didžiaenergis ryšys. Didžiaenergio ryšio energija pernešama ant ATP. Toks procesas vadinamas substratiniu fosforilinimu , skiriant jį nuo oksidacinio fosforilinimo. Susidaręs GTP gali būti tiesiogiai panaudojamas kaip energijos šaltinis (baltymų biosintez÷je) arba perduoti savo fosfato grupę ADP, grįžtamoje reakcijoje, katalizuojamoje nukleozido difosfato kinaz÷s. GTP + ADP GDP + ATP

6. Sukcinatas, atsipalaidavęs iš sukcinil-KoA yra oksiduojamas iki fumarato, veikiant sukcinato dehidrogenazei. Du vandenilio atomai nuo gintaro rūgšties perduodami ant FAD. Eukariotuose sukcinato dehidrogenaz÷ stipriai susirišusi su mitochondrijų vidine membrana, o prokariotuose su plazmine membrana. Fermentas išskirtas iš jaučio širdies savo sud÷tyje turi vieną kovalentiškai prijungtą FAD ir tris skirtingus Fe-S klasterius. Elektronai nuo sukcinato per šiuos nešiklius patenka į

278

mitochondrijų kv÷pavimo grandinę. Sukcinato dehidrogenaz÷ konkurentiškai inhibuojama malonato.

CH2

COO

CH2

COO

CH2

COO

COO C

C

H

H

COO

COO

C

C

H

COO

COO

H- - -

-

-

Sukcinatas Malonatas Fumaratas Maleatas 7. Fumaraz÷ katalizuoja grįžtamą fumarato hidrataciją iki L-malato. Fermentas

yra labai stereospecifiškas, jis hidratuoja fumaratą, bet ne jo cis izomerą maleatą. 8. Paskutin÷ trikarboksirūgščių ciklo reakcija yra L-malato oksidacija iki

oksalacetato. Reakciją katalizuoja L-malato dehidrogenaz÷ ir susidaro NADH. Šios reakcijos pusiausvyra yra nukreipta į malato susidarymo pusę (∆G0/ = 29,7 kJ/mol). Oksalacetato koncentracija ląstel÷se yra labai žema (<10-6 M), tačiau jis paverčiamas į citrinų rūgštį katalizuojant citrato sintezei ir reakcija yra pastumta į oksalacetato susidarymą.

Pra÷jus pilnam trikarboksirūgščių ciklui, dviejų anglies atomų acetilo grup÷ susijungia su oksalatu ir suskaidoma. Dvi CO2 molekul÷s išsiskiria oksiduojant a) izocitratą ir b) α-ketoglutaratą. Trikarboksirūgščių cikle oksidacijos reakcijose išsiskyrusi energija panaudojama redukuoti tris NAD+ ir vieną FAD molekulę, bei sintetinti ATP arba GTP. Ciklo pabaigoje regeneruojama oksalacto rūgšties molekul÷. Reikia pasteb÷ti, kad susidariusios dvi CO2 molekul÷s n÷ra gautos tiesiogiai iš CH3CO- , ciklas turi apsisukti kelis kartus, kad ši anglis išsiskirtų CO2 pavidalu. Nors trikarboksirūgščių cikle išsiskiria tiktai viena ATP molekul÷, tačiau susidaro redukuoti nukleotidai, kurie patenka į mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistema ir sintetinamas didelis kiekis ATP.

Bendrą trikarboksirūgščių ciklo reakciją galima užrašyti šia reakcija:

acetil-KoA + 3NAD+ + FAD + GDP(ADP) + Pn + 3H2O 2CO2 + 3NADH + 3H+ + FADH2 + GTP(ATP) + KoASH

8.1 lentel÷. Trikarboksirūgščių ciklo reakcijos ir ∆G0/ pokyčiai. Reakcija Fermentas ∆G0/

(kJ/mol) 1. Acetil-KoA + oksalacetatas + H2O→citratas + KoASH

Citrato sintaz÷ -32,2

2a. Citratas ↔ cis-akonitatas + H2O 2b. cis-akonitatas + H2O↔izocitratas

Akonitaz÷ Akonitaz÷

+6,3

3. Izocitratas + NAD+↔α-ketoglutaratas + NADH + H+ + CO2

Izocitrato dehidrogenaz÷

-20,9

4. α-ketoglutaratas + NAD+ + KoASH↔sukcinil-KoA + NADH + H+ CO2

α-ketoglutarato dehidrogenazinis kompleksas

-33,5

5. Sukcinil-KoA + Pn + GDP(ADP) ↔ sukcinatas + GTP + KoASH

Sukcinato tiokinaz÷

-2,9

6. Sukcinatas + FAD ↔ fumaratas + FADH2 Sukcinato dehidrogenaz÷

0

7. Fumaratas + H2O ↔ L-malatas Fumaraz÷ -3,8

279

8. L-malatas + NAD+ ↔ Oksalacetatas + NADH + H+ Malato dehidrogenaz÷

29,7

9.3 Trikarboksir ūgščių ciklo reguliacija. Trikarboksirūgščių ciklas yra jungiamoji grandis tarp angliavandenių, riebalų ir

aminorūgščių skaidymo bei sintez÷s reakcijų. Šio ciklo fermentų aktyvumai turi jautriai reaguoti į pasikeitusias sąlygas, fermentinių reakcijų greitis turi būti griežtai kontroliuojamas. Reguliacija yra vykdoma alosteriniais reguliatoriais arba kovalentiškai modifikuojant trikarboksirūgščių ciklo fermentus. Atsiradus energetinių medžiagų pertekliui trikarboksirūgščių ciklas turi sul÷t÷ti, o padid÷jus energijos poreikiams, jo aktyvumas turi did÷ti. Trikarboksirūgščių ciklas pagrindinai reguliuojamas acetil-KoA, ATP, NAD+, NADH koncentracijų pokyčiais. Trikarboksirūgščių ciklas įjungiamas, kai ląstel÷je ADP/ATP ir NAD+/NADH santykis yra didelis ir ląstel÷je padid÷ja ATP ir NADH poreikis

Medžiagų srautai per ciklą kontroliuojami acetil-KoA pristatymo greičiu. Kaip jau buvo min÷ta anksčiau, acetil-KoA susidaro, skaidant angliavandenius, riebalus ir aminorūgštis.

Kaip ir glikoliz÷je, trikarboksirūgščių ciklo greitis priklauso nuo reakcijos greitį limituojančių fermentų aktyvumo. Srauto greitis efektyviausiai bus reguliuojamos tose stadijose, kuriose ∆G yra neigiamiausias. Nustačius metabolitų koncentracijas mitochondrijose, trys reakcijos - katalizuojamos citrato sintaz÷s, izocitrato dehidrogenaz÷s ir α−ketoglutarato dehidrogenaz÷s, turi didžiausius ∆G pokyčius atitinkamai –53,9kJ/mol, -17,5kJ/mol ir -43,9kJ/mol, jų aktyvumai ir reguliuoja viso trikarboksirūgščių ciklo greitį. Piruvato dehidrogenazin÷s kompleksas

Piruvato dehidrogenazin÷s kompleksas yra vienas iš svarbiausių reguliuojamų fermentų. Gyvūnai nesintetina gliukoz÷s iš acetil-KoA, acetil KoA panaudojamas arba riebalų rūgščių sintezei arba oksiduojamas trikarboksirūgščių cikle. Piruvato dehidrogenaz÷s kompleksas alosteriškai inhibuojamas ATP, acetil-KoA, NADH ir riebalų rūgštimis. Acetil-KoA ir NADH specifiškai inhibuoja piruvato dehidrogenaz÷s komplekso dihidrolipo transacetilazę. AMP, NAD+ ir KoA, kurių koncentracija padid÷ja sumaž÷jus acetato srautui, aktyvuoja piruvato dehidrogenazę.

Žinduolių piruvato dehidrogenazinis kompleksas taip pat reguliuojamas kovalentin÷s modifikacijos keliu. Fosforilinimas sumažina piruvato dehidrogenaz÷s aktyvumą. Fermentiniame komplekse yra du papildomi fermentai piruvato dehidrogenaz÷s kinaz÷ ir piruvato dehidrogenaz÷s fosfataz÷. Kinaz÷ fosforilina Ser hidroksigrupę viename iš piruvato dehidrogenaz÷s (E1) subvienetų ir l÷tina piruvato dekarboksilinimą. Inhibavus fermentą sumaž÷ja acetil-KoA ir NADH koncentracija mitochondrijų užpilde. Kinaz÷ alosteriškai aktyvuojama ATP, acetil-KoA ir NADH. Sumaž÷jus ATP koncentracijai, sul÷t÷ja kinazinis aktyvumas ir padid÷ja fosfatazinis. Piruvato dehidrogenaz÷s fosfataz÷ aktyvuojama Ca2+ ir insulino. Citrato sintaz÷. Fermento aktyvumas priklauso nuo substratų acetil-KoA ir oksalacetato kiekio, jų koncentracijai sumaž÷jus, fermento veikla sul÷t÷ja. Fermentas inhibuojamas ATP, NADH ir sukcinil-KoA, aktyvuojamas ADP. Izocitrato dehidrogenaz÷. Žinduolių izocitrato dehidrogenaz÷ aktyvuojama Ca+ ir ADP ir inhibuojama NADH. Fermentas n÷ra reguliuojamas kovalentin÷s modifikacijos būdu. Bakterijose Escherichia coli fermentas reguliuojamas kovalentin÷s modifikacijos keliu. Fosforilinant serino hidroksigrupę aktyvumas maž÷ja, nes atsiranda elektrostatin÷s atostūmio j÷gos tarp izocitrato ir fosforilinto

280

fermento. Defosforilinus fermentą, serino hidroksigrup÷ gali susirišti su izocitrato karboksigrupe ir aktyvumas atsistato. Kinazinis ir fosfatazinis aktyvumas yra to paties baltymo skirtinguose domenuose. Izocitratas, oksaloacetatas, piruvatas, 3-fosfogliceratas ir fosfoenolpiruvatas alosteriškai aktyvuoja fosfatazę ir inhibuoja kinazę. α−α−α−α−ketoglutarato dehidrogenaz÷

Nors šis fermentinis kompleksas yra panašus į piruvato dehidrogenaz÷, jis reguliuojamas kitais keliais. Fermentas n÷ra reguliuojamas jį fosforilinant ar defosforilinant. Fermentas aktyvuojamas Ca2+ , kuris prisijungęs prie fermento sumažina KM α-ketoglutaratui tod÷l padid÷ja sukcinil-KoA susidarymo greitis. Fermentas inhibuojamas sukcinil-KoA ir NADH.

9.4 Trikarboksir ūgščių ciklas dalyvauja biosintez ÷s procesuose. Aerobiniuose organizmuose trikarboksirūgščių ciklas dalyvauja ir kataboliniuose ir

anaboliniuose procesuose. Jis užima centrinę vietą netiktai angliavandenių, riebalų rūgščių, aminorūgščių oksidacijoje, bet trikarboksirūgščių ciklo tarpininkai dalyvauja daugelyje biosintezių. Oksalacetatas, α-ketoglutaratas, fumaratas yra aminorūgščių, purino biosintez÷s pirmtakai. Iš oksalacetato gliukoneogenez÷s metu yra sintetinama gliukoz÷. Sukcinil-KoA yra pagrindinis porfirino žiedo sintez÷s tarpininkas. Porfirino žiedas yra hemoglobine, citochromuose. Iš acetil-KoA sintetinamos riebalų rūgštys, terpenoidai, steroidai ir kitos medžiagos turinčios izopreno žiedą.

281

citratas

izocitratas

a-ketoglutaratas

sukcinil-KoA

sukcinatas

fumaratas

malatas

oksalacetatas

CH3CO-SKoA

piruvatas

izopentenilpirofosfatas

terpenoidaisteroidai

glutamatas

glutaminas

purinųnukleotidai

prolinasornitinascitrulinasargininasporfirinai

aspartatas

pirimidinonukleotidai

treoninaslizinasizoleucinasmetioninasasparaginas

fosfoenolpiruvatas

angliavandeniai

fenilalaninastriptofanastirozinas

riebalų rūgštys

glicinas serinasvalinas alaninasleucinas cisteinas

8.25 pav. Biosintetin÷s trikarboksirūgščių ciklo reakcijos

9.5 Anaplerotin ÷s reakcijos. Kai trikarboksirūgščių tarpiniai produktai yra panaudojami įvairiems biosintetiniams

procesams, tada sumaž÷ja oksalacto, α-ketoglutaro rūgščių bei kitų tarpininkų koncentracijos ir ciklas sul÷t÷ja ar visai sustoja. Panaudoti ciklo tarpininkai gali būti papildomi taip vadinamu anaplerotinių reakcijų metu. Fiziologin÷mis sąlygomis trikarboksirūgščių ciklo tarpininkai yra dinamin÷je pusiausvyroje ir jų koncentracijos yra pastovios tačiau jei intensyv÷ja biosintetiniai procesai, tai ciklo tarpininkų gali prad÷ti trūkti.

Gyvūnų organizmuose svarbiausia anaplerotin÷ reakcija yra piruvato karboksilinimo reakcija, katalizuojama piruvato karboksilaz÷s. Ši reakcija vyksta kepenyse, inkstuose.

piruvatas + HCO3- + ATP

piruvato karboksilaz÷oksalacetatas + ADP + Pn

Gyvūnų širdyje, skeletiniuose raumenyse katalizuojant fosfoenolpiruvato

karboksikinazei yra karboksilinamas fosfoenolpiruvatas (PEP)

282

fosfoenolpiruvatas + CO2 + GDP

PEP karboksikinaz÷oksalacetatas + GTP

Aukštesniuosiuose augaluose, miel÷se, bakterijose PEP yra karboksilinamas

fosfoenolpiruvato karboksilaz÷s

fosfoenolpiruvatas + HCO3-

PEP karboksilaz÷oksalacetatas + Pn

Eukariotuose ir prokariotuose yra labai plačiai paplitęs malik fermentas,

katalizuojantis piruvato redukcinį karboksilinimą

piruvatas + HCO3- + NADPH +H+ malatas + NADP+

malik fermentas

Piruvato karboksilaz÷ yra reguliuojamas fermentas. Acetil-KoA yra teigiamas

alosterinis reguliatorius, nesant acetil-KoA fermentas faktiškai neaktyvus. Fermento piruvato karboksilaz÷s kofermentas yra biotinas, kuris perneša CO2 ant substrato.

Nors peramininimo reakcijos n÷ra vadinamos anaplerotin÷mis reakcijomis, bet peramininimo ar oksidacinio deamininimo reakcijų metu susidariusios α-ketoglutaro ir oksalacto rūgštys taip pat papildo trikarboksirūgščių ciklą. Trikarboksir ūgščių fermentai yra organizuoti į fermentinius kompleksus

Nors skaitoma, kad trikarboksirūgščių ciklo fermentai (išskyrus sukcinato dehidrogenaz÷, kuri susirišusi su vidine mitochondrijų membrana) laisvai pasiskirstę mitochondrijų užpilde, tačiau vis daugiau eksperimentinių duomenų, paremtų fermentų kinetiniais ir struktūriniais matavimais rodo, kad ląstel÷je susidaro dideli fermentiniai kompleksai. Baltymai šiuose kompleksuose tarpusavyje sujungti silpnais ryšiais arba susirišę su membranomis.

Trikarboksirūgščių fermentai sudaro kompleksus metabolonus, tod÷l padid÷ja proceso efektyvumas, šio ciklinio proceso vieno fermento produktas yra kito fermento substratas ir gali tiesiogiai pereiti į jo aktyvų centrą. Kai kurie ciklo fermentai buvo išskirti dideliuose fermentiniuose kompleksuose ir buvo pasteb÷tas tunelinis efektas.

9.6 Glioksilatinis kelias, trikarboksir ūgščių ciklo modifikacija. Stuburiniai nesintetina angliavandenių nei iš riebalų rūgščių, nei iš acetato. Gliukoz÷s

sintezei reikalingas piruvatas arba oksalacetatas. Stuburiniai negali iš acetil-KoA sintetinti nei piruvato, nei oksalacetato, tod÷l acetil-KoA n÷ra anglies atomų šaltinis gliukoz÷s sintezei. Augaluose, bakterijose ir miel÷se acetil-KoA acetilo grup÷ yra ne tiktai energetin÷ medžiaga, bet iš jos gali susidaryti angliavandeniai. Juose randamas glioksilatinis ciklas, kurios metu papildoma acetil-KoA molekul÷ įjungiama į oksaloacetatą. Miel÷s auga ant etanolio, kadangi oksiduoja alkoholį ir susidaręs acetil-KoA metabolizuojamas glioksilatiniame cikle. Kai kurie mikroorganizmai anglies šaltiniu naudoja acetatą, kuris įjungiamas į acetil-KoA, katalizuojant acetato tiokinazei.

CH3 COO CH3 C S-KoA

O

+ HS-KoA

ATP AMP,PPn

Acetato tiokinaz÷Acetatas Acetil-KoA

-

283

Glioksilatinis ciklas ypač aktyvus aliejinių augalų s÷klose. S÷klose sukaupiami dideli kiekiai triacilglicerolių, kurie paverčiami į angliavandenius reikalingus dygimui. Gliukoz÷ yra sintetinami iš oksalacto rūgšties. Jeigu oksalacto rūgštis iš trikarboksirūgščių ciklobus panaudota gliukoz÷s sintezei, tai trikarboksirūgščių ciklas tur÷tų sustoti ir acetil-KoA nebūtų oksiduojamas. Glioksilatinis ciklas yra trikarboksirūgščių ciklo alternatyva, jo metu suskaidomas acetil-KoA ir oksalacto rūgštis yra regeneruojama, panaudojant antrą acetil-KoA molekulę. Pagrindiniai ciklo fermentai yra izocitrato liaz÷ ir malato sintaz÷.

Sumarin÷ glioksilatinio kelio reakcija:

2 acetil-KoA + NAD+ + 2H2O sukcinatas + 2 KoASH + NADH + H+

Trikarboksirūgščių ciklo tarpiniai junginiai yra glioksilatinio ciklo pradin÷s medžiagos. Reaguojant acetil-KoA su oksalacto rūgštimi susidaro citratas, kuris virsta į izocitratą. Reakcijas katalizuoja citrato sintaz÷ ir akonitaz÷. Šios dvi reakcijos yra analogiškos trikarboksirūgščių ciklo reakcijoms. Toliau veikiant fermentui izocitrato liazei izocitratas skyla į sukcinatą ir glioksilatą. Glioksilatas, katalizuojant malato sintazei, reaguoja su dar viena acetil-KoA molekule ir susidaro malatas, kuris oksiduojamas į oksalacetatą. Izocitrato skilimo antras produktas keturių anglies atomų junginys sukcinatas trikarboksirūgščių cikle paverčiamas į oksalacetatą.

citratas

izocitratas

oksalacetatas

malatas

glioksilatassukcinatas

acetil-KoA KoA

acetil-KoA

KoA

NADH + H+

12

NAD+

8.26 pav. Glioksilatinis ciklas. Fermentai - 1-izocitrato liaz÷, 2 – malato sintaz÷.

COO-

CHOH

CH-COO-

CH2

COO-

COO-

CH2

CH2

COO-

+CHO

COO-

izocitratas sukcinatas glioksilatas

izocitrato liaz÷

284

COO-

CHOH

CH2

COO-

+CHO

COO-

glioksilatas malatas

CH3CO-SKoA

malato sintaz÷

+ KoASH

Glioksilatinio ciklo pagalba dygstančios s÷klos panaudoja sukauptus triacilglicerolius

angliavandenių biosintezei, o mikroorganizmai gali augti ant riebalų rūgščių ar acetato, kaip vienintelio anglies šaltinio. Gyvūliai ir žmogus neturi glioksilatinio ciklo, tod÷l negali sintetinti angliavandenių iš riebalų rūgščių.

Fermentai izocitrato liaz÷ ir malat sintataz÷ yra glioksisomose. Dygstančiose s÷klose dikarboksi- ir trikarboksirūgštys yra metabolizuojamos trijuose

ląstel÷s kompartmentuose – glioksisomose, mitochondrijose ir citozolyje. Oksalacetatas iš mitochondrijų į glioksisomas pernešamas aspartato pavidalu. Mitochondrijose oksalacetas paverčiamas į aspartatą, kuris praeina per mitochondrijų ir glioksisomų membranas. Glioksisomose peraminimo keliu iš jo susidaro oksalacetatas, kuris kondensuojasi su acetil-KoA. Acetil-KoA yra riebalų rūgščių skaidymo glioksisomose produktas. Kondensacijos produktas citratas, katalizuojant akonitazei, virsta izocitratu. Izocitratas veikiant izocitrato liazei suskaidomas į glioksilatą ir sukcinatą. Sukcinatas grįžta į mitochondrijas ir trikarboksirūgščių ciklo metu iš jo susidaro malatas. Malatas išeina į citozolį ir citozolin÷s malato dehidrogenaz÷s oksiduojamas į oksalacetatą. Oksalacetatas gliukoneogenez÷s metu paverčiamas į heksozes ir sacharozę. Šiame acetato virtime į angliavandenius dalyvauja keturi metaboliniai procesai – riebalų rūgščių skaidymas į acetil-KoA (glioksisomos), glioksilatinis ciklas (glioksisomos), trikarboksirūgščių ciklas (mitochondrijos) ir gliukoneogenez÷ (citozolis).

285

Aspartatas

Citratas

Izocitratas

Oksalacetatas

Malatas

Glioksilatas

Acetil-KoA

Sukcinatas

Sukcinatas

Citratas

Oksalacetatas

Malatas

Fumaratas

Malatas

Oksalacetatas

Gliukoz÷

Gliukoneogenez÷

Triacilgliceroliai

Riebalų rūgštys

Riebalų rūgštys

Mitochondrijos

Glioksisomos

Acetil-KoA

8.27 pav. Ryšys tarp glioksilatinio (glioksisomose) ir trikarboksirūgščių (mitochondrijose) ciklų

9.7 Trikarboksir ūgščių ciklo inhibicija fluoracetatu. Gyvūliai, kurie valgo nuodingo pietų Afrikos augalo - Dichapetalum cymosum lapus

dažnai miršta. 10 val laikotarpiu jų organizme citrato koncentracija padid÷ja 10 kartų. Prasideda m÷šlungis ir gyvūliai miršta. Buvo nustatyta, kad šiuose augaluose yra monofluoracto rūgšties, kuri yra toksiška. Pati monofloractorūgštis neveikia in vitro išskirtų trikarboksirūgščių ciklo fermentų. In vivo monofluoracto rūgštis reaguoja su KoA ir susidaręs monofluoracetil-KoA reaguoja su oksalacto rūgštimi sudarydamas fluorcitratą.

286

CH2FCOOH + KoASH CH2FCO-SKoA + CO2

COO-

CO

CH2

COO-

CH2FCOSKoA KoASH COO-

CHF

HO-C-COO-

CH2

COO-

oksalacetatas fluorcitratas Fluorcitratas stipriai prisijungia prie fermento akonitaz÷s aktyviame centre esančio

Fe2+ ir inhibuoja fermento veikimą. Čia yra akivaizdus pavyzdys, kada veikia ne pati medžiaga, bet jos metabolizmo produktas. Tokie inhibitoriai yra vadinami savižudžiai inhibitoriai (suicide).

SANTRAUKA

Piruvatas oksidacinio dekarboksilinimo metu, katalizuojant piruvato dehidrogenazei verčiamas acetil-KoA, kuris yra pagrindinis trikarboksirūgščių ciklo substratas. Piruvato dehidrogenazinis kompleksas susideda iš trijų fermentų ir penkių kofermentų: tiamino difosfato, NAD, FAD, KoA, ir lipo rūgšties. Citratas sintetinamas iš oksalacto rūgšties ir acetil-KoA, katalizuojant citrato sintezei. Citratas akonitaz÷s poveikyje izomerizuojasi į izocitratą. Izocitratas oksiduojamas ir dekarboksilinamas izocitrato dehidrogenaz÷s susidarant α-ketoglutaratui, CO2 ir NADH. α-ketodehidrogenaz÷ oksiduoja α-ketoglutaratą ir susidaro CO2, NADH ir sukcinil-KoA. α-ketodehidrogenazinis kompleksas į piruvato dehidrogenazę. Sukcinil-KoA suskaido sukcinato tiokinz÷, susidaro sukcinatas ir GTP (ATP). Šis procesas ATP susidarymo procesas vadinamas substratiniu fosforilinimu. Sukcinatas yra oksiduojamas iki fumarato sukcinato dehidrogenaz÷s, reakcijos metu gauname FADH2. Fumaraz÷ katalizuoja fumarato hidrinimą iki malato, kuris malato dehidrogenaz÷s oksiduojamas į oksalacetatą ir susidaro NADH. Pilno ciklo metu oksiduojamas acetatas, susidaro dvi molekul÷s CO2 , trys NADH, vienas FADH2 ir viena molekul÷ GTP ar ATP. Trikarboksirūgščių ciklas svarbus biosintetiniams procesas, jo tarpininkai panaudojami angliavandenių, riebalų rūgščių, aminorūgščių, purino nukleotidų, porfirinų, steroidų, terpenoidų sintez÷ms. Įjungus glioksilatinį ciklą iš reibalų rūgščių gali būti sintetinami angliavandeniai.

287

10 LIPIDŲ SKAIDYMAS .

Žmogus su maistu per parą gauna 60-150 g lipidų. Iš jų per 90 % sudaro triacilgliceroliai (riebalai), kurie panaudojami kaip energijos šaltinis, jų pavidalu organizme sukaupiama rezervin÷ metabolin÷ energija. Likusią dalį sudaro cholesterolis, cholesterolio esteriai, fosfolipidai ir neesterifikuotos riebalų rūgštys. Oksiduojant riebalus išsiskiria beveik du kartus daugiau energijos nei skaidant angliavandenius ar baltymus. Oksidavus 1g riebalų gauname 38kJ/g energijos, angliavandenių ir baltymų energetin÷ vert÷ yra mažesn÷ - 17kJ/g. Riebalų rūgštyse (C16H32O2 palmitino rūgštis) anglis labiau redukuota nei angliavandeniuose (C6H12O6 gliukoz÷). Riebalai n÷ra hidratuoti, tuo tarpu angliavandenių hidroksigrup÷s yra hidratuotos, tod÷l to paties svorio glikogeno ar gliukoz÷s energetin÷ vert÷ yra mažesn÷. Kaip matome iš lentel÷s Nr. 10.1 duomenų, žmogaus organizme energijos dalis saugomos riebalų pavidale yra žymiai didesn÷ nei baltymų ir angliavandenių kartu pa÷mus. Gyvūnuose riebalai pagrindinai saugomi triacilglicerolių pavidale adipocituose (riebalinio audinio ląstel÷se).

10.1 lentel÷ 70kg žmogaus sukauptas energijos kiekis

Energijos šaltinis Energetin÷ vert÷

(kJ/g sauso svorio)

Kiekis

(g)

Energija

(kJ)

Riebalai (riebalinis audinys) 37 15000 555000

Baltymai (raumenys) 17 6000 102000

Glikogenas (raumenys) 17 120 2040

Glikogenas (kepenys) 17 70 1190

Gliukoz÷ (viduląsteliniai skysčiai) 17 20 340

Bendras 660570

Mes plačiau panagrin÷sime neutralių riebalų skaidymą. Yra trys pagrindiniai riebalų šaltiniai, kuriuos organizmas gali panaudoti: 1) gaunami su maistu; 2) sintetinami kepenyse de novo: 3) atsarginiai riebalai adipocituose.

10.1 Neutrali ų riebal ų virškinimas Patekusių su maistu riebalų virškinimas prasideda skrandyje, kur rūgščiai atspari

lipaz÷, išskiriama liežuvio liaukų ir skrandžio epitelinių ląstelių, hidrolizuoja triacilglicerolius. Šios „rūgštin÷s lipaz÷s“ vaidina svarbų vaidmenį hidrolizuojant riebalus kūdikių skrandyje, kur pienas yra pagrindinis energijos šaltinis. Didžioji riebalų dalis suskaidoma plonosiose žarnose, veikiant kasoje sintetinamam fermentui lipazei. Triacilgliceroliai netirpsta vandenyje, jų skaidymas vyksta vandens ir lipido fazių sąlyčio riboje, reakcijos greitis padid÷ja išaugus sąlyčio paviršiui. Labai svarbų vaidmenį riebalų skaidyme vaidina tulžies rūgštys (žr.psl) ir jų dariniai su taurinu ir glicinu - taurocholio ir glikocholio rūgštys. Tulžies rūgštys sintetinamos kepenyse ir saugomos tulžyje. Šie junginiai yra paviršiaus aktyvios medžiagos (detergentai),

288

jie emulguoja riebalus, padidina jų paviršiaus plotą ir aktyvuoja fermentą lipazę.

OH OH

CH3

OHCH3

NH

SO3

O

CH3

OH OH

CH3

OHCH3

NH

COO

O

CH3

H2N-CH2-COOH

H2N-CH2-CH2-SO3H

OH OH

CH3

OHCH3

COOHCH3

Taurocholio rūgštis

-

Glikocholio rūgštis

-

Glicinas

Taurinas

Cholio rūgštis

Pankreatin÷ lipaz÷ katalizuoja triacilglicerolių hidrolizę, atskeldama riebalų rūgštis

esančias prie C-2 ir C-3 anglies atomų. Susidaro 2-monoacilglicerolis, kuris hidrolizuojamas

žarnyno lipaz÷s.

CH2OCOR1

CHOCOR2

CH2OCOR3

CH2OH

CHOCOR2

CH2OH

+ H2O + 2RCOOHLipaz÷

Triacilglicerolis 2-Monoacilglicerolis Riebalų rūgštis

Fosfolipidai hidrolizuojami kasos fosfolipazių. Fosfolipaz÷ A2 pašalina riebalų rūgštį prijungtą prie glicerolio antro anglies atomo. Susidaręs lizofosfolipidas yra skaidomas lizofosfolipaz÷s.

Dauguma su maistu gaunamo cholesterolio yra laisvas cholesterolis, tiktai 10-15% yra esterifikuoto. Kasos cholesterolio esteraz÷ atskelia riebalų rūgštį ir susidaro laisvas cholesterolis.

Comment [JK1]: Patikrinti taurino formule

289

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

R C O

O

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

Cholesterolio esterisCholesterolis

+ RCOOH

Riebalųrūgštis

10.2 Lipid ų pernaša organizme Lipazių poveikyje susidarę glicerolis, riebalų rūgštys, monoacilglicerolis absorbuojami

žarnyno epitelinių ląstelių (enterocitų). Riebalų rūgštys žarnyno ląstel÷se aktyvuojamos acil-KoA sintetaz÷s ir prijungiamos prie monoacilglicerolio, katalizuojant monoacilglicerolio aciltransferazei ir diacilglicerolio aciltransferazei. Naujai sintetinti triacilgliceroliai yra labai hidrofobin÷s medžiagos, jos netirpsta vandenyje. Jie yra supakuojami į lipoproteinines daleles - chilomikronus, kuriose riebalai yra apsupti fosfolipidų ir cholesterolio monosluoksniu, su įterptu vieninteliu baltymu apolipoproteinu B-48 (apo B-48). Šio fosfolipidinio monosluoksnio polin÷s galvut÷s nukreiptos į micel÷s paviršių, o jos viduje yra triacilgliceroliai, cholesterolis, riebaluose tirpūs vitaminai ir cholesterolio esteris. Chilomikronai endocitoz÷s keliu išeina iš enterocitų į limfą, iš jos pereina į kraują ir pernešami į kepenis, širdį, skeletinius raumenis, inkstus, plaučius. Plazmoje chilomikronai yra modifikuojami, prie jų prijungiamas baltymas apo E (jį atpažįsta kepenų ląstelių receptoriai) ir apolipoproteinas C-II (apo C-II), kuris būtinas lipoproteino lipaz÷s aktyvacijai. Šie baltymai pereina į chilomikronus iš didelio tankio lipoproteino dalelių (DTL).

Chilomikronų triacilgliceroliai yra hidrolizuojami daugumos audinių (išskyrus kepenis) ant kraujagyslių paviršiaus esančių lipoproteino lipazių. Šios lipaz÷s aktyvuojamos apo C-II yra užląsteliniai fermentai prijungti prie ląstel÷s per lipidinį inkarą. Raumenyse ir kituose audiniuose riebalų rūgštys pernešamos per plazminę membraną ir tarnauja kaip energijos šaltinis, riebaliniame audinyje resintetinami riebalai. Glicerolis kepenyse gali būti panaudotas triacilglicerolių sintezei, glikolizei ar gliukoneogenezei. Tokiu keliu patenka per 60-70% absorbuotų riebalų.

Lipoproteino lipazių sintez÷ ir pernešimas į kapiliarų liumeną yra stimuliuojamas insulino. Lipoproteino lipaz÷s izofermentai turi skirtingus KM. Adipocitų fermentų KM yra aukštas, į adipocitus riebalų rūgštys patenka tiktai tada, kai triacilglicerolių koncentracija kraujyje yra didel÷. Tuo tarpu širdies raumens lipoproteino lipaz÷s KM yra žema ir širdies raumuo aprūpinamas riebalų rūgštimis ir esant mažai triacilglicerolių koncentracijai plazmoje.

Triacilglicerolių koncentracijai chilomikronuose sumaž÷jus per 90%, dalel÷s dydis sumaž÷ja ir padid÷ja jos tankis. Apo C-II pereina į didelio tankio lipoproteinus. Likusios chilomikronų dalel÷s vadinamos remnantais , yra pašalinamos iš kraujo. Remnantų paviršiuje esantis apo E prisijungia prie kepenų ląstelių lipoproteinų receptorių, endocitoz÷s būdu pereina į hepatocitus ir susijungia su lizosomomis. Apolipoproteinai, cholesterolio esteriai, likę triacilgliceroliai yra suskaidomi iki riebalų rūgščių, cholesterolio, aminorūgščių. Receptorius yra reciklinamas ir pereina į plazminę membraną.

Triacilgliceroliai, susintetinti kepenyse, įjungiami į mažo tankio lipoproteinines daleles (MTL) ir su krauju pernešami į audinius.

290

10.3 Vidul ąstelini ų riebal ų skaidymas Riebaliniame audinyje riebalai saugomi lipidinių ląšelių pavidalų, jų šerdį sudaro

triacilgliceroliai ir sterolių esteriai apsupti fosfolipidų monosluoksnio. Šių ląšelių paviršių dengia baltymai perilipinai. Riebaliniame audinyje esančius triacilglicerolius skaido nuo hormonų priklausoma lipaz÷. Šios lipaz÷s aktyvumas reguliuojamas hormonų. Priklausomai nuo fiziologinio stovio adrenalinas, gliukagonas, adrenokortikotropinis hormonas jungiasi prie adipocitų membranos receptorių ir aktyvuoja adenilato ciklazę. cAMP stimuliuoja baltymo kinazę A, kuri fosforilina perilipiną, nuo hormonų priklausoma lipaz÷ susijungia su ląšeliais, patenka į jų vidų ir hidrolizuoja triacilglicerolius. Baltymo kinaz÷ A taip pat fosforilina ir aktyvuoja lipazę, tačiau pagrindinis triacilglicerolių hidroliz÷s pagreit÷jimas susijęs su perilipino fosforilinimu. Ląstel÷s su pažeistu perilipino genu neatsako į padid÷jusią cAMP koncentraciją, jų nuo hormonų priklausoma lipaz÷ nesusijungia su lipidų ląšeliais.

Susidariusios laisvos riebalų rūgštys išeina į kraują, kur susiriša su serumo albuminu. Žmogaus serumo albuminas sudaro pusę kraujo serumo baltymų. Viena albumino molekul÷ gali prisijungti iki 10 riebalų rūgščių molekulių. Laisvų riebalų rūgščių tirpumas yra ~10-6 M, didesn÷s koncentracijos veikia kaip detergentas ir yra toksin÷s. Susidarius albumino ir riebalų rūgščių kompleksui jų tirpumas padid÷ja iki 2mM ir tokiu keliu riebalų rūgštys pernešamos į skeleto raumenis, širdį ir kitus audinius. Hormonas insulinas aktyvuoja lipaz÷s defosforilinimą ir inhibuoja lipolizę.

Susidaręs adipocituose glicerolis n÷ra metabolizuojamas, kadangi riebalinio audinio ląstel÷s neturi glicerolio kinaz÷s. Kraujas glicerolį perneša į kepenis, kur yra fosforilinamas. Veikiant glicerolio kinazei, susidaro glicerolio 3-fosfatas, kuris katalizuojant glicerolio 3-fosfato dehidrogenazei oksiduojamas iki dihidroksiacetono fosfato, Dihidroksiacetono fosfatas gali dalyvauti glikoliz÷je arba gliukoneogenez÷je.

CH2OH

CHOH

CH2OH

CH2OH

CH2OPO3

CHOH O

CH2OH

CH2OPO3

CGlicerolio kinaz÷

ATP ADP

Glicerolio3-fosfatodehidrogenaz÷

Glicerolis Glicerolio 3-fosfatas Dihidroksiacetono fosfatas

2- 2-

NAD+ NADH + H+

10.4 Riebalų rūgščių oksidacija. 1904m Knopas (F.Knoop) pasiūl÷ riebalų rūgščių ββββ oksidacijos mechanizmą, kurio

metu oksiduojamas anglies atomas esantis β pad÷tyje ir atskeliamas dviejų anglies atomų fragmentas. 1949m Kenedi (E.Kenedy) ir Lenindžeris (A.Lehninger) parod÷, kad riebalų rūgštys oksiduojamos mitochondrijų užpilde. V÷liau buvo rasta riebalų rūgščių oksidacijos sistema peroksisomose. Peroksisomose oksiduojamos labai ilgų grandinių, dikarboksi riebalų rūgštys, prostaglandinai, ksenobiotin÷s riebalų rūgštys.

10.4.1Riebalų rūgščių aktyvacija Apie 1950m buvo atrastas KoA ir nustatyti fermentai, katalizuojantys riebalų rūgščių

oksidaciją. Riebalų rūgštys pernešamos per plazminę membraną, citozolyje susiriša su riebalų

291

rūgštis sujungiančiu baltymu (RRSB) ir pereina prie išorin÷s mitochondrijų membranos, kur jos aktyvuojamos.

O P O P O P O

O O O

O O O

Adenozinas

R CO

O

AdenozinasO P O P O

O O

O O

R CO

O P O

O

O

R CO

O S KoA

Acil-KoAsintetaz÷

KoA-SH

..

..

AMP

2Pn

Acil-KoAsintetaz÷

Pirofosfataz÷

Riebalų rūgštis

Aciladenilatas

Riebalų rūgščiųacil-KoA

1 etapas

2 etapas

∆G0/ = - 19 kJ/mol ∆G0/ = - 15 kJ/mol

Pirofosfatas

+

10.1 pav. Riebalų rūgščių aktyvacija. Riebalų rūgščių β oksidacija prasideda jas aktyvuojant ir paverčiant KoA tioesteriais.

Šią reakciją katalizuoja acil-KoA sintetaz÷s (arba acil-KoA ligaz÷s), besiskiriančios substratiniu specifiškumu. Sintetaz÷s specifin÷s ilgų grandinių (C10 - C20 ) riebalų rūgštims yra išorin÷je mitochondrijų ar endoplazminio tinklo membranose. Fermentai, prijungiantys vidutinio ilgio (C4 - C12 ) ir trumpas riebalų rūgštis pagrindinai sutinkami mitochondrijų užpilde. Riebalų rūgščių aktyvacija vyksta dviem etapais: pirmame etape susidaro aciladenilatas, antrame etape acilo liekana prijungiama prie KoASH. Procesas yra negrįžtamas, kadangi susidaręs pirofosfatas (PPn) hidrolizuojamas ir reakcijos ∆G0/ yra stipriai neigiamas. Šios reakcijos metu vienas ATP didžiaenergis ryšys panaudojamas naujo didžiaenerginio junginio acil~KoA susidarymui, o hidrolizuojantis kitam didžiaenergiui ryšiui (PPn), reakcijos pusiausvyra pastumiama į produkto susidarymo pusę.

RCOOH + HS-KoA + ATP RCO-SKoA + AMP + 2Pn ∆G0/ = -34 kJ/mol

10.4.2Acil-KoA pernešimas į mitochondrij ų užpild ą. Vidutinio ilgio (C12 ) ir trumpos riebalų rūgštys lengvai praeina pro abi mitochondrijų

membranas ir aktyvuojamos užpilde. Ilgų grandinių riebalų rūgštys aktyvuojamos citozolin÷je

292

mitochondrijų išorin÷s membranos pus÷je, prijungiant KoA. Jos gali būti naudojamos citozolyje membraninių lipidų biosintezei arba oksiduojamos mitochondrijų užpilde. Ilgų grandinių riebalų rūgštis pro mitochondrijų membranas praeina susijungusios su karnitinu. Karnitinas yra gaunamas su maistu arba sintetinamas kepenyse ir inkstuose iš lizino ir metionino. Acil-KoA reaguoja su karnitinu, acilo liekana prisijungia prie karnitino hidroksigrup÷s ir susidaro acilkarnitinas, reakciją katalizuoja karnitino aciltransferaz÷ I (KAT I), kuri lokalizuota mitochondrijų išorin÷s membranos citozolin÷je pus÷je.

(CH3)3N+_CH2

_CH_CH2_COO- + R_CO_ SKoA

OH

(CH3)3N+_CH2

_CH_CH2_COO- + KoASH

OR_CO_KAT I

Karnitinas Acilkarnitinas Acil-KoA būdamas hidrofobin÷ medžiagą praeina pro išorinę membraną, tačiau

pernešimui per vidinę mitochondrijų membraną rekalingas specialus transporteris. Karnitino-acilkarnitino translokaz ÷ perneša acilkarnitiną į pro vidinę mitochondrijų membraną į užpildą, o tuo pačiu metu atgal į tarpmembraninę ertmę išneša karnitiną.Užpilde acilo liekana nuo acilkarnitino perkeliama ant KoASH, veikiant fermentui karnitino aciltransferazei II (KAT II ). KAT II yra susirišusi su mitochondrijų vidine membrana. Malonil-KoA inhibuoja KAT I, tod÷l susintetintos citozolyje riebalų rūgštys nepatenka į mitochondrijas ir n÷ra suskaidomos. Ląstel÷ palaiko skirtingus KoASH fondus užpilde ir citozolyje. Citozolyje esantis KoASH panaudojamas riebalų rūgščių sintezei, o užpilde - riebalų rūgščių oksidacijai, aminorūgščių ir ketorūgščių degradacijai.

293

R-CH2-CH2-COOH

R-CH2-CH2-COOH

R-CH2-CH2-CO-karnitinas

R-CH2-CH2-CO-karnitinas

R-CH2-CH2-COSKoA KoASH

R-CH2-CH2-CO-karnitinas

Vidin÷ mitochondrijų membrana

Išorin÷ mitochondrijų membrana

Ląstel÷s plazmin÷ membrana

AcilKoA sintetaz÷

Karnitino aciltransferaz÷ I

Karnitino aciltransferaz÷ II

Translokaz÷

Karnitinas

Karnitinas

Karnitinas

R-CH2-CH2COSKoA KoASH

Tarpmembranin÷ erdv÷

10.2 pav. Riebalų rūgščių pernešimas per mitochondrijų membranas.

10.4.3Riebalų rūgščių ββββ-oksidacija Riebalų rūgščių oksidacija mitochondrijose vyksta trimis etapais. Pirmame etape

oksiduojantis riebalų rūgščiai dviejų anglies atomų fragmentas pašalinamas acetil-KoA pavidalu o keturi vandenilio atomai prijungiami prie NAD ir FAD. Pavyzdžiui oksiduojant palmitoil-KoA įvyksta septyni oksidacijos ciklai ir susidaro aštuonios acetil-KoA molekul÷s. Antrame etape acetil-KoA suskaidomas trikarboksirūgščių cikle, kuriame jis pilnai oksiduojamas iki CO2 ir redukuojami nukleotidai NAD ir FAD. Trečiame etape NADH ir FADH2 oksiduojami oksidacinio fosforilinimo metu ir išsiskyrusi energija sukaupiama ATP molekul÷se.

Riebalų rūgštys oksiduojamos atskeliant nuo angliavandenilin÷s grandin÷s dviejų anglies atomų fragmentą acetil-KoA. Susidaręs dviem anglies atomais trumpesnis acil-KoA yra v÷l oksiduojamaas. Kiekvienas oksidacijos ciklas (10.3 pav.) susideda iš keturių reakcijų:

294

1) dehidrinimo reakcijos, susidarant enoilo darinui; 2) dvigubo ryšio hidratacijos, hidroksilinant β anglies atomą ir susidarant hidroksiacilui; 3) hidroksigrup÷s dehidrinimo ir ketoacilo susidarymui; 4) kovalentinio ryšio tarp dviejų anglies atomų suardymas, prisijungiant naujai KoA molekulei.

1. Veikiant acil-KoA dehidrogenazei, susidaro trans−∆2−enoil-KoA. Fermentin÷s reakcijos metu susidaro trans dvigubas ryšys tarp Cα ir Cβ anglies atomų. (Gamtin÷se riebalų rūgštyse dažniausiai yra cis izomeras). Oksiduojantis acilui, elektronai ir protonai pernešami ant prijungto prie fermento FAD. Yra keli acil-KoA dehidrogenaz÷s izofermentai, oksiduojantys skirtingo ilgio riebalų rūgštis. FADH2 yra oksiduojamas elektronus pernešančio flavoproteino (EPF), kuris perduoda elektronų porą ant flavo-geležies-sieros baltymo - EPF : ubichinono oksidoreduktaz÷s (EPF:UO), EPF:UO redukuoja KoQ, kuris yra mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷s komponentas.

2. Dvigubas ryšys yra hidratuojamas veikiant enoil-KoA hidratazei, susidarant L−β−hidroksiacil-KoA.

3. L−β−hidroksiacil-KoA oksiduojamas L −β−−β−−β−−β−hidroksiacil-KoA dehidrogenaz÷s, susidarant NADH ir atitinkamam β−ketoacil-KoA. Fermentas specifiškas tiktai L stereoizomerui. NADH oksiduojamas mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷je.

4. Cα−Cβ ryšys yra skaidomas tioliz÷s reakcijoje su KoASH, katalizuojant β−β−β−β−ketoacil-KoA tiolazei. Susidaro acetil-KoA ir naujas acil-KoA, turintis dviem anglies atomais mažiau. Acetil-KoA oksiduojamas trikarboksirūgščių cikle, o acil-KoA pakartotinai oksiduojamas β-oksidacijos metu kol pilnai suskaidoma iki acetil-KoA. Acetil-KoA yra teigiamas alosterinis piruvato karboksilaz÷s efektorius, padid÷jus riebalų rūgščių oksidacijai pagreit÷ja oksalacto rūgšties sintez÷. Taip acetil-KoA suriša riebalų rūgščių skaidymą su gliukoneogeneze (skyrius).

Viengubas ryšys tarp dviejų metileno –CH2- grupių riebalų rūgščių molekul÷je yra stabilus. β−oksidacijos metu trijų pirmųjų reakcijų metu susidaro mažiau stabilus ir lengviau suskaidomas C-C ryšys, nes C-2 (Cα) anglies atomas surištas su dviem CO grup÷mis. Cβ anglies atomas tampa geru taikiniu KoA-SH nukleofilinei atakai. Galin÷ –CH2- CO-SKoA grup÷ yra gera nueinanti grup÷ palengvinanti -Cα–Cβ− ryšio skylimą.

Riebalų rūgščių oksidacija yra egzergonin÷ reakcija, kurios metu susidaro acetil-KoA ir redukuoti nukleotidai. Bendra riebalų rūgščių oksidacijos reakcija yra ši:

palmitoil-KoA + 7KoASH + 7FAD + 7NAD+ + 7H2O 8 CH3CO-KoA + 7FADH2 + 7NADH + 7H+

Acetil-KoA yra oksiduojamas trikarboksirūgščių cikle. Tiek oksiduojant acetil-KoA trikarboksirūgščių cikle, tiek β−oksidacijos metu susidarę redukuoti nukleotidai yra oksiduojami oksidacinio fosforilinimo metu, susidarant ATP.

Palmitino(C16H32O2) rūgšties oksidacijos suminę reakciją galime užrašyti šia lygtimi: palmitoil-KoA + 23O2 + 108ADP + 108Pn KoASH +108ATP + 16CO2 + 130H2O

Palyginkime susidariusio ATP kiekį, skaidant vienodą kiekį riebalų rūgščių ir gliukoz÷s.

Palmitino rūgšties molekulin÷ mas÷ lygi 260, oksidavus vieną molį rūgšties gauname 106 molius ATP. (Įvertiname, kad acil-KoA biosintez÷s metu panaudojami abu ATP molekul÷s didžiaenergiai ryšiai). Gliukoz÷s (C6H12O6) molekulin÷ mas÷ lygi 180, oksidavus šį gliukoz÷s kiekį susidaro 32 moliai ATP.

295

ATP kiekio apskaičiavimui skaitoma, kad oksiduojantis 1mol NADH susidaro 2,5mol ATP, o oksiduojantis 1mol FADH2 – 1,5mol ATP.

Jeigu paimtume vienodus kiekius palmitino rūgšties (260g) ir gliukoz÷s ( 270g ) tai gautume atitinkamai 106 ir 48 molius ATP. Energetiškai naudingiau yra skaidyti riebalus negu angliavandenius, tačiau angliavandeniai greičiau įsisavinami, jų metabolizmo greitis yra didesnis.

CH3 (CH2)n Cβ Cα C

O

SKoA

H H

H Hacil-KoA (Cn)

FAD

FADH2

EPFred

EPFoks

EPF UOoks

EPF UOred KoQ

KoQH2

CH3 (CH2)n C C C

O

SKoA

H

Htrans-∆2-enoil-KoA

CH3 (CH2)n C CH2 C

O

SKoA

H

OH

H2O

L-β-hidroksiacil-KoA

NAD+

NADH + H+

CH3 (CH2)n C CH2 C

O

SKoA

O

β-ketoacil-KoA

KoASH

CH3 (CH2)n C CH3 C

O

SKoA

O

SKoA +

acil-KoA (Cn-2)

Acil-KoAdehidrogenaz÷

Enoil-KoAhidrataz÷

L-β-hidroksiacil-KoAdehidrogenaz÷

β-ketoacil-KoAtiolaz÷

10.3 pav. Riebalų rūgščių acil-KoA β−oksidacijos kelias.

296

10.5 Nesočių riebal ų rūgščių oksidacija Gana daug riebalų rūgščių, sutinkamų acilgliceroliuose, membraniniuose lipiduose yra

nesočios ir turi vieną ar kelis dvigubus ryšius. Oksiduojant nesočias riebalų rūgštis susiduriame su dviem pagrindin÷mis problemomis:

1) gamtoje esančiose nesočiose riebalų rūgštyse vandenilio atomai prie dvigubų ryšių išsid÷stę cis konfigūracijoje , o enoil-KoA hidrataz÷ prijungia vandenį tiktai prie dvigubo ryšio trans konfigūracijoje.

2) enoil-KoA hidrataz÷ prijungia vandenį prie dvigubo ryšio esančio tarp C-2 ir C-3 anglies atomų, nesočiose riebalų rūgštyse dvigubas ryšys yra ir tarp C-3 ir C-4 anglies atomų.

Nesočių riebalų rūgščių oksidacijoje dalyvauja du papildomi fermentai – izomeraz÷ ir reduktaz÷.

Oleino rūgštis (C18:1∆9), gausiai sutinkama riebalų rūgštis turi 18 anglies atomų, vieną cis dvigubą ryšį tarp C-9 ir C-10. Pradiniuose etapuose oksidacija vyksta kaip ir sočių riebalų rūgščių β oksidacija. Nuo oleil-KoA β oksidacijos keliu pašalinamos trys acetil-KoA molekul÷s ir susidaro 12 anglies atomų nesočios riebalų rūgšties, kurioje dvigubas ryšys yra cis-∆3, ir KoA esteris (10.4 pav.). Šis produktas n÷ra enoil-KoA hidrataz÷s substratas, nes dvigubas ryšys yra cis konfigūracijos. Papildomas fermentas enoil-KoA izomeraz÷ izomerizuoja cis-∆3-enoil-KoA į trans-∆2-enoil-KoA, kuris enoil-KoA hidrataz÷s hidratuojamas iki atitinkamo L-β-hidroksiacil-KoA. Šis tarpininkas β oksidacijos keliu oksiduojamas iki acetil-KoA.

H H

H

H

SKoA

OTrys β-oksidacijosciklai

SKoA

O

Enoil-KoA izomeraz÷

10 9

SKoA

O3

Šeši β-oksidacijosciklai

4 3

2

6 Acetil-KoA

3 Acetil-KoA

cis−∆3-enoil-KoA

trans−∆2-enoil-KoA

10.4 pav. Mononesočių riebalų rūgščių oksidacija.

Polinesočių riebalų rūgščių oksidacijoje dalyvauja dar vienas papildomas fermentas 2,4 dienoil-KoA-reduktaz÷, kuri redukuoja nesočią riebalų rūgštį.

297

SKoA

OTrys β-oksidacijosciklai

SKoA

O

Enoil-KoA izomeraz÷

7 6 4 3

13 12 10 9

SKoA

O

7 6 2

3

Vienas β-oksidacijosciklas

SKoA

O

Acil-KoA dehidrogenaz÷

SKoA

O

5 4 2

3

5 4

2,4-dienoil-KoA reduktaz÷H+ + NADPH

SKoA

O3

4

Enoil-KoA izomeraz÷

SKoA

O3

2

Keturi β-oksidacijosciklai

5 CH3-CO-SKoA

NADP+

Acetil-KoA

3 Acetil-KoA

10.5 pav. Polinesočios riebalų rūgšties linolo (C18:2∆9,12) oksidacija.

10.5 pav. parodyta linolo rūgšties (C18:2 ∆9,12) oksidacijos kelias. Pradžioje įvyksta trys β−oksidacijos ciklai, kurių metu susidaro 3 acetil-KoA, 3 NADH ir 3 FADH2. Lieka cis−∆3-dodekanoil-KoA, kuriame dvigubas ryšys tarp 3 ir 4 anglies atomų yra cis konfigūracijoje. Enoil-KoA hidrataz÷ hidratuoja dvigubą ryšį tiktai trans konfigūracijoje. Enoil-KoA izomeraz÷s poveikyje cis ∆3 dvigubas ryšys pereina į trans ∆2 dvigubą ryšį. Dar po vieno β−oksidacijos ciklo ir acil-KoA dehidrogenaz÷s poveikio susidaręs junginys turi trans ∆2 ir cis ∆4 ryšius. Šio junginio neredukuoja enoil-KoA reduktaz÷. Katalizuojant 2,4-dienoil-KoA reduktazei, susidaro trans ∆3 enoil produktas, kuris enoil-KoA izomeraz÷s paverčiamas į trans ∆2−enoil−ΚοΑ. Galutinis nesočių riebalų su lyginiu anglies atomų skaičiumi skaidymo produktai yra acetil-KoA ir redukuoti nukleotidai.

298

10.6 Riebalų rūgščių, turin čių nelygin į anglies atom ų skai čių, oksidacija

Daugumos gyvūnų organizme esančios riebalų rūgštys turi lyginį anglies atomų skaičių, tačiau augaluose, jūros gyvūnuose sutinkamos riebalų rūgštys su nelyginiu anglies atomų skaičiumi. Pradžioje šios rūgštys oksiduojamos pagal β−oksidacijos mechanizmą, susidaro kelios molekul÷s acetil-KoA ir galutinis produktas yra propionil-KoA. Propionil-KoA taip pat susidaro metabolizuojant valiną, izoleuciną. Propionil-KoA oksiduojamas trijų reakcijų metu (10.6 pav.).

CH3-CH2-CO-SKoA

SKoA

C

C

O

H

H

C

H

H

COOH

C

C

HCH3

O

S KoA

COOH

C

C

CH3H

O

S KoA

COOH

Propionil-KoAATP

ADP + Pn

Propionil-KoA karboksilaz÷HCO3

-

D-metilmalonil-KoA

Metilmalonil-KoA epimeraz÷

L-metilmalonil-KoA

Metilmalonil-KoA mutaz÷kofermentas B12

Sukcinil-KoA 10.6 pav. Propionil-KoA oksidacija Propionil-KoA yra karboksilinamas iki D-metilmalonil-KoA. Fermento propionil-

KoA karboksilaz÷s aktyvumui, kaip ir kitų karboksilazių būtinas biotinas. Antroje reakcijoje metilmalonil-KoA epimeraz÷ katalizuoja D-izomero virtimą į L-izomerą. Metilmalonil-KoA mutaz÷ katalizuoja reakciją, kurios metu vyksta vidumolekulinis persigrupavimas, -CO-S-KoA grup÷ nuo C-2 anglies atomo L-metilmalonil-KoA molekul÷je pernešama ant C-3

299

atomo susidarant sukcinil-KoA. Šio fermento kofermentas vitaminas B12 (deoksiadenozil kobalaminas).

Sukcinil-KoA patenka į trikarboksirūgščių ciklą ir yra suskaidomas. Oksalacetatas susidaręs iš sukcinil-KoA gali tarnauti gliukoz÷s sintezei. Tokiu būdu gyvūnai panaudoja nelyginio anglies atomų skaičiaus riebalų rūgščių fragmentus gliukoneogenezei.

10.7 ω ω ω ω riebal ų rūgščių oksidacija Kai kurie organizmai, jų tarpe ir stuburiniai, oksiduoja ω anglies atomą, (ω atomas yra

anglies atomas labiausiai nutolęs nuo karboksigrup÷s). Fermentai, katalizuojantys ωωωω-oksidaciją, yra kepenų ir inkstų endoplazminiame tinkle ir jie oksiduoja 10-12 anglies atomų riebalų rūgštis. Šis procesas yra neefektyvus, tačiau sutrikus riebalų β-oksidacijai, jis tampa svarbus.

Pirmoje stadijoje hidroksigrup÷ katalizuojant mišrios funkcijos oksidazei, prijungiama prie ω anglies atomo (10.7 pav.). Šioje reakcijoje dalyvauja NADPH ir citochromas P450 ir deguonis. Hidroksigrupę iki aldehido- ir karboksigrup÷s oksiduoja alkoholio dehidrogenaz÷ ir aldehido dehidrogenaz÷. Susidariusi dikarboksirūgštis yra aktyvuojama prijungiant prie bet kurio galo KoA. Aktyvuota riebalų rūgštis patenka į mitochondrijas ir oksiduojama β oksidacijos keliu. Galutiniai dikarboksirūgšties oksidacijos produktai gali būti sukcinatas arba adipatas (adipino rūgštis)

CH3-(CH2)10-COO-

HO-CH2-(CH2)10-COO-

OHC-(CH2)10-COO-

-OOC-(CH2)10-COO-

-OOC-(CH2)2-COO- -OOC-(CH2)4-COO-

NADPH, O2

NADP+

NAD+

NADH

NADH

Sukcinatas Adipatas

Mišrios funkcijos oksidaz÷

Alkoholiodehidrogenaz÷

Aldehidodehidrogenaz÷

β-oksidacija

ω

10.7. ω-riebalų rūgščių oksidacija.

300

10.8 Šakotos grandin ÷s riebal ų rūgščių oksidacija

COOH

CO- S-KoA

CO- S-KoA

OH

COOH

CO-SKoA

CH3 CH

CH3

C

O

SKoA CH3 C

O

SKoA CH3 CH2

C

O

SKoA

ATP, KoASH

AMP, PPn

Fitano rūgštis

Fitanoil-KoAsintetaz÷

Fitanoil-KoA

CO2

Fitanoil-KoAα-hidroksilaz÷

α-hidroksifitanoil-KoA

α-hidroksifitanoil-KoA oksidaz÷

Pristano rūgštis

β-oksidacija

Acil-KoAsintetaz÷

ATP, KoASH

AMP, PPn

Izobutiril-KoA 3Acetil-KoA 3Propionil-KoA

10.8 pav. Šakotos grandin÷s riebalų rūgščių oksidacija.

Riebalų rūgščių β-oksidacijos mechanizmas yra labai svarbus oksiduojant riebalų rūgštis, tačiau šakotos riebalų rūgštys, kur alkilo radikalas prijungtas prie nelyginioanglies atomo yra netinkamas substratas. Tokios riebalų rūgštys oksiduojamos α oksidacijos būdu. Fitlis yra chlorofilo skaidymo produktas, jis yra atrajojančių gyvūlių avių,

301

karvių riebaluose. Šie gyvūnai oksiduoja fitoli iki titano rūgšties, kuri panaudojama kaip žmonių maistas. Metilo grup÷ prie C-3 blokuoja β oksidaciją, tod÷l fitanoil-KoA yra hidroksilinamas ir fitanoil-KoA α-oksidaz÷ dekarboksilina susidarant pristato rūgščiai. Šio metabolito KoA esteriai oksiduojami β oksidacijos keliu, susidarę propionil-KoA, izobutiril-KoA (jis paverčiamas į sukcinil-KoA) ir acetil-KoA oksiduojami trikarboksirūgščių cikle.

10.9 Riebalų rūgščių oksidacija peroksisomose Riebalų rūgščių β-oksidacijos kelias vyksta ne tiktai mitochondrijose. Žinduolių

peroksisomose vykstanti riebalų rūgščių β-oksidacija buvo patvirtinta 1976m Lazarovo (Lazarov) ir de Diuvo (de Duve). Peroksisomin÷ β-oksidacija vyksta kepenyse ir inkstuose.

C C

H

H

C

O

SKoA

CH3(CH2)20-CH2-CH2-C-SKoA

O

C CH2OH

C

O

SKoA

H

C CH2

C

O

SKoA

O

CH3COSKoA

CH3(CH2)18-CH2-CH2-C-SKoA

O

Acil-KoAoksidaz÷

FAD

FADH2

H2O2 H2O + 1/2O2

Katalaz÷

CH3(CH2)20

CH3(CH2)20

CH3(CH2)20

Enoil-KoAhidrataz÷

L-β-hidroksiacil-KoA dehidrogenaz÷

Tiolaz÷

NAD+

NADH + H+

H2O

Langoceroil-KoA

Behenoil-KoA 10.9 pav. Riebalų rūgščių oksidacija peroksisomose. Peroksisomose oksiduojamos

ilgos grandin÷s (C22 ir ilgesn÷s) riebalų rūgštis, kurios po to skaidomos mitochondrijose. Peroksisomos taip pat oksiduoja dikarboksirūgštis, prostaglandinus. Nors riebalų rūgščių oksidacijos mitochondrijose ir peroksisomose metabolizmo tarpininkai yra chemiškai vienodi, tačiau katalizuojantys fermentai yra skirtingi. Oksidacija peroksisomose yra universalesn÷ nei mitochondrijose. Labai ilgos grandin÷s riebalų rūgštys negali patekti į mitochondrijas.

302

Riebalų rūgščių β-oksidacija išnagrin÷sime labai ilgos langocero riebalų rūgšties, turinčios 24 anglies atomus pavyzdžiu. Langocero rūgštį aktyvuoja labai ilgų grandinių acil-KoA sintetaz÷, kuri yra citozolin÷je peroksisomų membranos pus÷je. Langoceroil-KoA pernešamas per peroksisomų membraną specialios pernašos sistemos, kuri pasyvios pernašos būdu perneša langoceroil-KoA ir palengvina β-oksidacijos produktų difuziją iš peroksisomų. Riebalų rūgščių pirmą oksidacijos stadiją katalizuoja FAD turintis fermentas acil-KoA oksidaz÷. Elektronai nuo riebalų rūgščių pereina tiesiogiai ant deguonies, susidarant vandenilio peroksidui. Vandenilio peroksidas suskaidomas katalaz÷s. Šioje reakcijoje, skirtingai nei mitochondrijose, energija nepanaudojama ATP sintezei, o išsiskiria šilumos pavidalu. Sekančias dvi stadijas katalizuoja dvifunkcinis fermentas, turintis enoil-KoA hidrataz÷s ir L-ββββ-hidroksiacil-KoA dehidrogenaz÷s aktyvumus. Peroksisomose vykstančios riebalų rūgščių β-oksidacijos galutinis produktas yra acetil-KoA ir acil-KoA, sutrump÷jęs dviem anglies atomais. Riebalų rūgštis suskaidoma iki palmitoil-KoA, kuris pereina į mitochondrijas ir oksiduojamas β oksidacijos keliu.

10.10 Ketonini ų jungini ų susidarymas ir j ų oksidacija Badaujant kepenyse padaug÷ja riebalų rūgščių, kurios mobilizuojamos iš riebalinio

audinio. Oksiduojant riebalų rūgštis gauname acetil-KoA, kuris inhibuoja piruvato dehidrogenazę (psl) ir aktyvuoja piruvato karboksilazę (psl) Badaujant ar sergant diabetu oksalacto rūgštis yra panaudojama gliukoz÷s sintezei ir negali kondensuotis su acetil-KoA, tod÷l trikarboksirūgščių ciklas sustoja ir kaupiasi acetil-KoA. Iš acetil-KoA pertekliaus sintetinamas acetoacetatas, β−β−β−β−hidroksibutiratas (jis taip pat vadinamas 3-hidroksibutiratas) ir acetonas. Šios medžiagos yra vadinamos ketoniniais junginiais. Ketoniniai junginiai susidaro kepenyse, tačiau jie tenai n÷ra metabolizuojami, o per kraują pernešami į smegenis, širdį, skeletinius raumenis. Padid÷jusi kraujuje β-hidroksibutirato ir acetoacetato koncentracija pažemina kraujo pH ir susidaro acidoz÷. Žmonių, sergančių diabetu kraujyje ir šlapime ketoninių junginių koncentracija gali padid÷ti keliasdešimt kartų. Šis būvis vadinamas ketoz÷. Sergant diabetu acetono koncentracija organizme tiek padid÷ja, kad jis iškvepiamas per burną. Ketoniniai junginiai sintetinami (10.10 pav.) mitochondrijų užpilde. Acetil-KoA virsmai iki ketoninių junginių vyksta sekančiai:

1. Veikiant acetoacetil-KoA tiolazei, dvi molekul÷s acetil-KoA kondensuojasi ir susidaro acetoacetil-KoA.

2. Prisijungiant prie acetoacetil-KoA trečiai acetil-KoA molekulei susidaro β−β−β−β−hidroksi −β−−β−−β−−β−metilglutaril-KoA (HMG-KoA ). Šią reakciją katalizuoja mitochondrijose esanti HMG-KoA sintaz ÷. Dvi pirmos reakcijos yra analogiškos pradin÷m cholesterolio biosintez÷s reakcijoms, tačiau cholesterolio biosintez÷ vyksta citozolyje.

3. HMG-KoA skaidomas HMG-KoA liaz ÷s, susidarant acetoacetatui.

4. NADH redukuoja acetoacetatą iki D−β−−β−−β−−β−hidroksibutirato , veikiant β−β−β−β−hidroksibutirato dehidrogenazei.

5. Paskutin÷je reakcijoje acetoacetato dekarboksilaz÷ dekarboksilina acetoacetatą ir susidaro acetonas ir CO2

Comment [JK2]: pažiūr÷ti

303

CH3CO-S-KoA

C-S-KoA

CH2

C

CH3

O

O

CH2

HO-C-CH3

CH2

C O

S-KoA

CH2

C O

CH3

C O

CH3

CH2

CHOH

CH3

CH3

2

acetil-KoA KoASHCOOH

acetil-KoA

COOH

COOH

Acetoacetil-KoAβ-hidroksi-β-metil- -glutaril-KoA

Acetoacetatas

Acetonas

β-hidroksibutiratas

1 2 3

5

4

NADH+H+ NAD+

CO2

KoASH

10.10 pav. Ketoninių junginių susidarymas. Fermentai: 1 - tiolaz÷, 2 - HMG-KoA sintaz÷, 3 - HMG-KoA liaz÷, 4 - β−hidroksibutirato dehidrogenaz÷, 5 – acetoacetato dekarboksilaz÷.

Tam tikros aminorūgštys gali būti pilnai ar dalinai panaudojamos ketoninių junginių sintezei. Izoleucino skilimo produktas yra acetil-KoA, fenilalanino ir tirozino – acetoacetatas, lizino ir triptofano – acetoacetil-KoA, o leucino HMG-KoA.

Kraujas, kepenyse susidariusius acetoacetatą ir β−hidroksibutiratą perneša į periferinius audinius, kur jie panaudojami kaip alternatyvūs energijos šaltiniai. Acetoacetatas ir β−hidroksibutiratas yra labai svarbūs aprūpinant energija širdies raumenis, inkstų žievę ir ypatingai smegenis.

Smegenų ląstel÷s per parą sunaudoja per 140 g gliukoz÷s. (Smegenys nepanaudoja riebalų kaip energijos šaltinio). Dideli susidariusio ATP kiekiai reikalingi Na+ ir K+ jonų pernešimui per membraną ir membraninio potencialo sukūrimui ir nervinio impulso pernešimui. Badaujant, kai gliukoz÷s ir glikogeno atsargos išsenka, pagreit÷ja riebalų rūgščių oksidacija kepenyse ir ketoninių junginių sintez÷. Subalansuotos žmonių mitybos atveju pagrindinis smegenų maistas yra gliukoz÷. Tačiau badaujant ar sergant diabetu smegenys gali net 75% energijos patenkinti oksiduojant acetoacetato ar β-hidroksibutiratą. Ketoniniai junginiai yra tirpūs vandenyje riebalų rūgščių ekvivalentai, galintys praeiti hematoencefalinį barjerą.

Ketoniniai junginiai paverčiami į acetil-KoA, kuris skaidomas trikarboksirūgščių cikle. β-hidroksibutiratas yra oksiduojamas ββββ-hidroksibutirato dehidrogenaz÷s, kuri yra prisijungusi prie mitochondrijų vidin÷s membranos, į acetoacetatą ir NADH. Aceto acetatas aktyvuojamas prijungiant KoA, kurį ββββ-ketoacil-KoA transferaz÷ perneša nuo sukcinil-KoA ant acetoacetato. Acetoacetil-KoA suskaidomas į dvi acetil-KoA molekules veikiant acetoacetil-KoA tiolazei.

304

CH2

C O

CH3

CH2

CHOH

CH3

CH2

C O

CH3CH3

CO S-KoA

COOCOO

β-hidroksibutiratas Acetoacetatas Acetoacetil-KoA Acetil-KoA

CO-S-KoA- -

β-hidroksibutiratodehidrogenaz÷

NAD NADH+H + +

β-ketoacil-KoA transferaz÷

Sukcinil-KoA

Sukcinatas

acetoacetil-KoA tiolaz÷

2

KoASH

10.11 pav. Ketoninių junginių virtimas acetil-KoA .

SANTRAUKA Adipocitų hormonam jautri lipaz÷ (aktyvuoja adrenalinas ir gliukagonas , inhibuoja

insulinas) inicijuoja sukauptų triacilglicerolių skaidymą. Riebalų rūgštys susijungusios su serumo albuminu pernešamos iš adipocitų į kepenis ir periferinius audinius, kur panaudojamos kaip energijos šaltinis. Glicerolis kraujo pernešamas į kepenis, kur panaudojamas gliukoneogenez÷je arba oksiduojamas. Riebalų rūgščių skaidymas (β-oksidacija) vyksta mitochondrijose. Riebalų rūgštys į mitochondrijų užpildą per vidinę membraną pernešamos karnitino. Riebalų rūgštys susikaidomos iki acetil-KoA ir redukuotų nukleotidų NADH ir FADH2.

Nelyginio anglies atomų riebalų rūgštys skaidomos atskeliant po du anglies atomus turintį fragmentą (acetil-KoA) kol lieka trijų anglies atomų junginys (propionil-KoA).

Badaujant, sergant diabetu acetil-KoA kepenų mitochondrijose paverčiamas į ketoninius junginius (acetoną, acetoacetato, ββββ-hidroksibutirat ą). Acetoacetatas ir β-hidroksibutiratas periferiniuose audiniuose oksiduojamas ir ląstel÷s aprūpinamos energija. Ketoninius junginius oksiduoja ir smegenys, tod÷l jie yra svrbus nergijos šaltinis badaujant. Cholesterolio skaidymas

10.11 Fosfolipid ų skaidymas Fosfolipidų skaidymą katalizuoja fosfolipaz÷s, kurios randamos visuose audiniuose ir

kasos sultyse. Dauguma toksinų ir gyvat÷s nuodų turi fosfolipazinį aktyvumą, kai kurios patogenin÷s bakterijos išskiria fosfolipazes, kurios suardo ląstel÷s membraną ir palengvina infekcijos patekimą.

Glicerofosfolipidų skaidymas. Fosfolipaz÷s specifiškai hidrolizuoja esterinius ryšius

glicerofosfolipiduose.

CH

CH2O

O

OP

O

CH2-CH2-N-CH3

CH2O

O

CH3

CH3

O C

CR2

R1

O+

Fosfolipaz÷ A1

Fosfolipaz÷ A2

Fosfolipaz÷ C

Fosfolipaz÷ D

305

Fosfolipaz÷ A1 randama daugelyje žinduolių audinių ir atskelia riebalų rūgštį, prijungtą prie pirmo glicerolio anglies atomo. Fosfolipaz÷ A2 sutinkama žinduolių audiniuose, kasos sultyse, gyvačių ir bičių nuoduose. Ji hidrolizuoja esterinį ryšį ties 2 anglies atomu. Pašalinus riebalų rūgštį nuo 1 ar 2 anglies atomo susidaro lizofosfolipidai, kurie yra detergentai. Lizofosfolipidus skaido lizofosfolipaz÷s.

Fosfolipaz÷ D randama pirmiausiai augaluose, ji atskelia prie fosfatidin÷s rūgšties prijungtą „galvą“. Fosfolipaz÷ C randama kepenų lizosomose ir klostridijų ir kitų bacilų α-toksine. Surišta su membranomis fosfolipaz÷ C aktyvuojama PIP2 ir vaidina svarbų vaidmenį signalo perdavime.

Sfingomielino skaidymas. Sfingomielinas skaidomas sfingomielinaz÷s, lizosominio fermento, kuris atskelia fosforilcholiną ir susidaro ceramidas. Ceramido hidrolizę katalizuoja ceramidaz÷, kuri atskelia laisvą riebalų rūgštį ir gauname sfingoziną. Skaidant sfingomieliną ceramidas ir sfingozinas yra antriniai informacijos nešikliai. Sfingozinas inhibuoja baltymo kinazę C, ceramidas dalyvauja atsakyme į stresą.

Glikosfingolipid ų skaidymas. Glikosfingolipidai patenka į ląstelę endocitoz÷s keliu, endosomos susilieja su lizosomomis, ir lizosominiai fermentai specifiškai hidrolizuoja atitinkamus glikosfingolipidų ryšius.

Comment [JK3]: ar pats toksinas

306

11 AMINORŪGŠČIŲ KATABOLIZMAS

Per parą, žmogaus sveriančio 70kg apie 400g baltymų suyra iki aminorūgščių ir v÷l sintetinama iš naujo. Per100g baltymų pilnai suskyla ir turi būti papildoma iš egzogeninių šaltinių. Suskaidžius baltymus, aminorūgštys pagrindinai panaudojamos naujų baltymų sintezei, o taip pat angliavandenių, lipidų, nebaltyminių azotinių medžiagų, įvairių biologiškai aktyvių medžiagų sintezei, bei energijos poreikiams tenkinti. Taigi dienos aminorūgščių fondas yra 500g – 100g patenka su maistu o 400g išsiskiria skaidant organizmo baltymus. Žmogaus organizmas sintetina ne visas aminorūgštis, tod÷l turi maitintis pilnaverčiais baltymais, kurių sud÷tyje privalo būti nepakeičiamos aminorūgštys. Suaugusiems žmon÷ms rekomenduojama baltymų suvartojimo norma yra 0,75g vienam kilogramui kūno mas÷s per parą. Rekomenduojama, kad baltymai tur÷tų sudaryti 10-15%, angliavandeniai 55-62% o riebalai 28-32% paros maisto davinio energetin÷s vert÷s.

Aminorūgštys skaidomos pašalinant nuo aminorūgšties αααα-aminogrupę ir oksiduojant susidariusį anglies skeletą. Aminogrup÷ gali būti pašalinama amoniako, šlapimo rūgšties ar karbamido pavidalu. Likęs anglies skeletas suskaidomas iki glikoliz÷s ir trikarboksirūgščių ciklo tarpininkų. Šie tarpininkai panaudojami organizmui reikalingų medžiagų sintezei, arba oksiduojami iki CO2 ir H2O ir gaunama energija.

11.1 Baltym ų virškinimas. Patekę į žmogaus organizmą baltymai negali praeiti pro skrandžio ar žarnyno

epitelinių ląstelių membranas, tod÷l jie turi būti suskaidomi iki aminorūgščių. Išimtį sudaro naujagimiai, kurie iš motinos pieno pasisavina antikūnus. Baltymai virškinami skrandyje ir plonosiose žarnose. Proteolitinius fermentus sintetina trys skirtingi organai: skrandis, kasa ir plonosios žarnos.

Baltymus skaidyti pradedama skrandyje. Patekę į skrandį baltymai stimuliuoja hormono gastrino išsiskyrimą iš skrandžio gleivin÷s gastric mucosa ląstelių. Gastrinas padidina pepsinogeno sekreciją iš pagrindinių skrandžio ląstelių ir HCl sekreciją iš parietalinių ląstelių. Skrandžio sulčių pH yra rūgštinis (pH=1,0-2,5), jos veikia kaip antiseptikas - užmuša daugumą bakterijų, denatūruoja baltymus ir palengvina proteolitinių fermentų veikimą. Pepsinogenas yra neaktyvus profermentas arba zimogenas (psl), jį aktyvuoja HCl ir autokataliziškai kitos pepsino molekul÷s. Pepsinas hidrolizuoja baltymus ties aromatinių aminorūgščių Tyr, Phe ir Trp aminogrupe, susidarant trumpesniem polipeptidams. Skrandyje baltymus taip pat skaido ir gastriksinas.

Kai rūgštus skrandžio turinys patenka į plonąsias žarnas, žemas pH stimuliuoja nedidelio peptidinio hormono sekretino išsiskyrimą iš žarnų ląstelių į kraują. Sekretinas stimuliuoja kasą ir į plonąsias žarnas sekretuojamas HCO3

- , kuris neutralizuoja rūgštinį skrandžio turinį. Žarnyno proteolitiniai fermentai yra aktyvūs neutralioje terp÷je. Patekę į žarnyną lipidai ir dalinai suvirškinti baltymai žarnų epitelio ląstel÷se stimuliuoja nedidelio peptidinio hormono cholecistokinino (anksčiau jis buvo vadinamas pankreoziminas) sintezę. Cholecistokininas, patekęs į kraują greitina zimogenų tripsinogeno, chimotripsinogeno, prokarboksipeptidaz÷s A ir B išsiskyrimą iš kasos bei skatina tulžies rūgščių išsiskyrimą iš tulžies. Tripsinogeno virtimą į aktyvų tripsiną katalizuoja žarnyno epitelinių ląstelių sintetinama enteropeptidaz÷. Enteropeptidaz÷ paleidžia kaskadą fermentinių reakcijų, kurių metu aktyvuojami zimogenai. Tripsinas aktyvuoja tripsinogeno, chimotripsinogeno ir kitų

307

profermentų virtimą į aktyvias formas – tripsin ą, chimotripsiną, karboksipeptidazes. Proteolitiniai fermentai turi skirtingą specifiškumą (žr. skyrių 1.3.4), jie efektyviai suskaido baltymus iki aminorūgščių ir nedidelių oligopeptidų.

Trumpų oligopeptidų skaidymą plonosiose žarnose baigia žarnyno peptidaz÷s. Plonųjų žarnų epitelin÷s ląstel÷s sintetina karboksipeptidazes ir aminopeptidazes, kurios atskelia nuo oligopeptidų atitinkamai C galines ir N galines aminorūgštis. Laisvos aminorūgštys pernešamos į epitelin÷s ląsteles, iš kurių patenka į kraują ir išnešiojamos po visą organizmą.

Aminorūgštys pro ląstel÷s membraną yra pernešamos specifinių pernešimo sistemų, dalyvaujant Na+ jonams. Nustatytos minimum septynios aminorūgščių pernešimo sistemos, kurios su skirtingu specifiškumu perneša amino rūgštis pro membranas.

Sergant aštriu pankreatitu, zimogenai yra aktyvuojami ne žarnyne bet kasoje. Aktyvūs proteolitiniai fermentai pradeda skaidyti kasos audinius, tai dažnai pasibaigia mirtimi. Aminorūgščių katabolizmo bendra apžvalga

Laisvos aminorūgštys žmogaus organizme nekaupiamos ir nesaugomos. Aminorūgščių fondas (apie 500g) susidaro virškinant su maistu gautus baltymus, skaidant audinių baltymus, bei sintetinant pakeičiamas aminorūgštis. Tai yra labai nedidelis kiekis palyginus su bendru baltymų kiekiu (70kg sveriantis vyras turi per 12kg baltymų) esančių žmogaus organizme. Apie 10-15% aminorūgščių oksiduojamos iki CO2 ir H2O išsiskiriant energijai. Iš aminorūgščių skilimo produktų organizmas gali sintetinti gliukozę, glikogeną, lipidus, purinus, pirimidinus, porfirinus ir kitas azotą turinčias medžiagas. Labai nedideli aminorūgščių kiekiai (~1g per dieną) yra pašalinami su šlapimu (pav. 11.1).

Dauguma organizmo baltymų pastoviai yra skaidomi ir v÷l resintetinami. Taip yra pašalinami pažeisti ar nereikalingi organizmui baltymai. Yra dvi pagrindin÷s sistemos, kurios skaido organizmo baltymus – ubikvitino-proteosomos sistema ir lizosomos (žr. skyrių 1.7)

Karbamidas

Maisto Pakeičiamų Audiniųbaltymai aminorūgščių sintez÷ baltymai

Aminorūgščių fondas

Aminorūgščių perteklius pašalinamas per inkstus

Nebaltyminių azotinių medžiagų sintez÷(purinai, pirimidinai, porfirinai, kreatinas, neurosiuntikliai ir kitijunginiai)

Ketonorūgštys

Amoniakas

Ketoniniai junginiai, riebalų rūgštys, steroidai

Gliukoz÷, glikogenasCO2 , H2O

(apie 500 g)

Apie 400gbaltymų per dieną

Apie 100gbaltymų per dieną

Apie 30gbaltymų per dieną

11.1 pav. Aminorūgščių pagrindinio katabolizmo schema Aminorūgščių pradiniai metabolizmo etapai yra peramininimas, oksidacinis

deamininimas ir dekarboksilinimas.

308

11.2 Aminogrup ÷s pašalinimas nuo aminor ūgščių α-Aminogrup÷s pašalinimas nuo aminorūgščių (deamininimas) yra būtina

aminorūgščių skaidymo sąlyga. Aminogrup÷s azotas pašalinamas iš organizmo arba įjungiamas į kitų biomolekulių sud÷tį. Aminorūgščių deamininimas gali vykti dviem būdais: peramininimo ir oksidacinio deamininimo reakcijų metu. Žinduolių organizme aminorūgštys pagrindinai skaidomos kepenyse. Patekusios iš virškinimo trakto aminorūgštys peramininimo reakcijos keliu perduoda savo aminogrupę ketonorūgščiai, dažniausiai α-ketoglutaro (11.2 pav.). Oksidacinio deaminimo metu atsipalaiduoja amoniakas ir laisva α-ketoglutaro rūgštis. Karbamido cikle iš amoniako sintetinamas karbamidas, kuris pašalinamas iš organizmo.

Raumenyse aminogrup÷ pernešama ant piruvo rūgšties ir susidaręs alaninas patenka į kraują ir keliauja į kepenis.

Azotas į kepenis taip pat yra patenka glutamino formoje. Glutaminas sintetinamas iš glutamato ir amoniako, katalizuojant glutamino sintetazei. Glutaminas lengvai praeina pro ląstelių, organelių membranas ir tokiu keliu amoniakas pernešamas iš periferinių organų į kepenis, kur yra nukenksminamas. Amoniakas kepenyse iš glutamino išsiskiria veikiant glutaminazei. Šis kelias yra labai svarbus pašalinant amoniaką iš smegenų.

H3N C H

R

H3N C H

R

C O

R

C O

CH2

CH2

C H

CH2

CH2

H3N

NH4 C H

CH2

CH2

H3N

C H

CH3

H3NC H

CH3

H3N

CO

NH2 C NH2

O

COO-+

COO-

+

-

COO-

COO-

COO-

COO-

+

+COO-

+

COO-+

COO-+

Aminorūgštysiš baltymų

α-ketorūgštis

Glutaminasiš smegenų ir kitų organų

Alaninasiš raumenų

Glutaminas

gluα-ketoglutaratas

COO KEPENYS1

23

4

Glutamatas

Karbamidas

NH2

309

11.2 pav. Aminogrup÷s metabolizmas žinduolių kepenyse. 1. Peramininimo reakcija. 2. Oksidacinio deamininimo reakcija. 3. Glutamino deamininimas. 4. Karbamido ciklas.

11.2.1Aminor ūgščių peramininimas Aminogrup÷s pernešimas nuo aminorūgšties ant ketonorūgšties yra vadinamas

peramininimu (transamininimu) (11.3 pav.). Fermentai, kurie katalizuoja peramininimo reakcijas vadinami aminotransferaz÷mis (anksčiau buvo vadinamos transaminaz÷mis). Visos aminorūgštys, išskyrus liziną ir treoniną skaidomos pradin÷se stadijose jas peramininant. Aminogrup÷s akceptoriais gali būti oksalacto, piruvo ir α-ketoglutaro rūgštys.

R

C O

COO

R

C NH3H

COO

R

C NH3H

COO

R

C O

COO

2

-

1+

-

2+

-

1

-

α-aminorūgštis

α-ketonorūgštis α-aminorūgštis

α-ketonorūgštis

Aminotransferaz÷

1

11.3 pav. Peramininimo reakcija. Daugumos aminorūgščių pirmoji katabolizmo stadija yra jų α-aminogrup÷s

pernešimas ant α-ketoglutaro rūgšties (11.4 pav.). Susidaro nauja ketonorūgštis ir glutamatas. α-ketoglutaratas vaidina ypatingą vaidmenį surenkant įvairių aminorūgščių aminogrup÷s į glutamo rūgštį.

COO

C

CH2

CH2

COO

OCOO

C

R

HH3N

COO

C

CH2

CH2

COO

HH3NCOO

C

R

O

-

-+

-

-

+ +

Aminorūgštis α-ketoglutaratas Glutamatas α-ketonorūgštis

+

- -

Aminotransferaz÷

11.4 pav. Aminogrup÷s pernešimas nuo aminorūgšties ant α-ketoglutaro rūgšties Glutamatas oksidacinio deamininimo keliu deamininamas arba yra aminogrup÷s

donoras aminorūgščių, ir kitų junginių sintez÷je. Kiekviena aminotransferaz÷ yra specifin÷ vienai ar keletai aminorūgščių. Aminotransferaz÷s vadinamos pagal aminorūgšties donoro

310

vardą. Svarbiausios aminotransferazin÷s reakcijos yra katalizuojamos alanino aminotransferaz÷s ir aspartato aminotransferaz÷s (11.5 pav.).

Alaninas

Piruvatas Glutamatas

Alanino aminotransferaz÷

Oksaloacetatas

Aspartatas

GlutamatasAspartato aminotransferaz÷

α-ketoglutaratas

α-ketoglutaratas

11.5 pav. Aminotransferazių katalizuojamos reakcijos. Alanino aminotransferaz÷ perneša aminogrupę nuo alanino ant α-ketoglutarato.

Reakcijos metu susidaro piruvatas ir glutamatas. Ši reakcija yra grįžtama, tačiau skaidant aminorūgštis jos pusiausvyra nukreipta glutamato sintezei. Taigi glutamatas surenka alanino amino grupes. Aspartato aminotransferaz÷ yra išimtis aminotransferazių tarpe, kurios paprastai tuneliuoja aminogrupę ant α-ketoglutarato. Aminorūgščių katabolizme aspartato aminotransferaz÷ perneša aminogrupę nuo glutamato ant oksalacetato, susidaręs aspartatas yra azoto šaltinis karbamido cikle.

Normoje aminotransferaz÷s yra viduląsteliniai fermentai. Padid÷jęs šių fermentų kiekis kraujo plazmoje rodo, kad yra pažeistos atitinkamų organų ar audinių ląstel÷s. Aspartato aminotransferaz÷s ir alanino aminotransferaz÷s kiekio padid÷jimas plazmoje susijęs su kepenų pažaidomis – virusiniu hepatitu, toksin÷m pažaidomis. Aminotransferaz÷s gali išeiti iš ląstelių miokardo infarkto ar raumenų sutrikimų metu.

11.2.2Aminotransferazi ų veikimo mechanizmas. Visos aminotransferaz÷s, katalizuojančios peraminimo reakcijas, turi kofermentą

piridoksalfosfatą. Piridoksalfosfatas fermento aktyviame centre yra kovalentiškai susijungęs aldimino ryšiu (Šifo baz÷) su lizino ε-aminogrupe. Piridoksalfosfatas veikia kaip aminogrup÷s nešiklis fermento aktyviame centre. Piridoksalfosfato aldehidogrup÷ prisijungia aminorūgšties aminogrupę ir virsta piridoksamino fosfatu, kuris perduoda aminogrupę naujai α-ketonorūgščiai.

NH

COH

OH

CH3

CH2

O P O

O

O

NH

CH2

OH

CH3

CH2

O P O

O

NH3

O

NH

CHOH

CH3

CH2

O P O

O

NH

O

-

-

-

-

+

-

-

Lys

Fermentas

+

Šifo baz÷

Piridoksalfosfatas

Piridoksamino fosfatas Piridoksalfosfatas Šifo baze sujungtas su lizino liekana

+

++

311

11.6 pav. Piridoksalfosfatas, piridoksamino fosfatas ir piridoksalfosfatas susijungęs su baltymo lizino ε-aminogrupe.

Peramininimo reakcija vyksta dviem etapais (pav.11.7). I etapas. Aminorūgšties pavertimas ketonorūgštimi:

1. Aminorūgšties nukleofilin÷ amino grup÷ atakuoja fermento-piridoksalfosfato Šifo baz÷s anglies atomą, susidarant aminorūgšties-piridoksalfosfato Šifo bazei (aldiminui). Kartu atsipalaiduoja fermento laisva lizino amino grup÷, kuri veikia kaip bendroji baz÷.

2. Aminorūgšties-piridoksalfosfato Šifo baz÷ per chinonoidinį tarpininką tautomerizuojasi į α−ketonorūgšties-piridoksamino (ketiminas) Šifo bazę. Šifo baz÷ susidariusi tarp aminorūgšties ir piridoksalfosfato yra konjuguota su piridino žiedu. Vykstant elektronų delokalizacijai susidaro nestabilus karbanijonas, kuris yra pusiausvyroje su chinonoidiniu tarpininku (pav. 11.8).

3. Prisijungus vandens molekulei ketonorūgšties-piridoksamino Šifo baz÷ hidrolizuojama ir susidaro piridoksamino fosfatas bei α−ketonorūgštis.

II etapas. α−ketonorūgšties pavertimas aminorūgštimi. Reakcijos vyksta priešinga kryptimi.

1/. Piridoksamino fosfatas reaguoja su nauja α−ketonorūgštimi susidarant Šifo bazei (ketiminas).

2/. Κetonorūgšties-piridoksamino Šifo baz÷ tautomerizuojasi susidarant aminorūgšties-piridoksalfosfato Šifo bazei (aldiminas).

3/. Aktyvaus centro lizino nukleofilin÷ ε−amino grup÷ atakuoja aldiminą, atskyla aminorūgštis ir regeneruojama fermento-piridoksalfosfato Šifo baz÷.

NH

CHOH

CH3

NH

R

NH

CHOH

CH3

NH

C

H

COOR'

R

H C COO

R'

NH3

NH

CHOH

CH3

NH

C COOR'

R

NH

CH2

OH

CH3

NH

C COOR'

R

NH

CH2

OH

CH3

NH3

R

R' C COO

OB

Lys

Fermentas

+ +

+

-

+

- -

H+

+

-

+

-

+ + + +

-

..

..

H2O

Fermento-piridok- Aminorūgšties-piri- Chinonoidinis Ketonorūgšties-piridoks- Piridoksaminosalfosfato Šifo baz÷ doksalfosfato Šifo baz÷ tarpininkas amino Šifo baz÷ fosfatas (aldiminas) (ketiminas)

1 2 2 3

2/ 1/2/3/

11.7 pav. Piridoksalfosfato vaidmuo aminotransferazin÷je reakcijoje. R/ = aminorūgšties radikalas, R = -CH2OPO3

2-

Susidaręs aldimino tarpininkas gali dalyvauti trijose reakcijose - peramininimo,

racemizacijos ir dekarboksilinimo, tai priklauso su kokiu apofermentu jis yra susijungęs Suskaidžius aminorūgšties-piridoksalfosfato Šifo baz÷je bet kurį iš trijų ryšių

312

NH

OH R

CH3

CH

NH

C

H

COOR

NH

OH R

CH3

CH

NH

C

H

R

NH

OH R

CH3

CH

NH

CR COO

Aminorūgšties-piridoksal-fosfato Šifo baz÷ (aldiminas)

+

+

a

bc

Karbanijonas Chinonoidinis tarpininkas

+

+

: -

+

..

11.8 pav. Aminorūgšties-piridokslafosfato Šifo baz÷, a,b,c – nurodyti ryšiai, kurie gali

skilti.

a, b, c (11.8 pav.), esančių prie amino rūgšties Cα atomo, susidaro rezonansiškai stabilizuotas Cα karbanijonas, kuris dalyvauja keliose reakcijose. Skylant a ryšiui vyksta peramininimas, dekarboksilinimo metu skyla ryšys b, o tautomerizacijos reakcijos metu susilpninamas c ryšys.

11.2.3Oksidacinis deamininimas Aminorūgščių oksidacinis deamininimas yra katalizuojamas nuo NAD priklausomų

dehidrogenazių arba nuo flavino priklausomų oksidazių. Kaip jau buvo min÷ta, daugumos aminorūgščių aminogrup÷ yra tuneliuojama ant α-

ketoglutarato, susidarant glutamo rūgščiai. Glutamo rūgštis yra ta aminorūgštis, nuo kurios, oksidacinio deamininimo keliu, yra pašalinama amino grup÷ susidarant amoniakui. Šią reakciją katalizuoja glutamato dehidrogenaz÷ (11.9 pav.) ir pagrindinai vyksta kepenyse ir inkstuose. Hepatocituose glutamo rūgštis iš citozolio pereina į mitochondrijų užpildą kur vyksta oksidacinis deamininimas.

COO

C

CH2

CH2

COO

O

COO

C

CH2

CH2

COO

HNH2

-

-

-

-

Glutamato dehidrogenaz÷

H2O NAD+ NADH + H+ NH3

Glutamatas H2O NADP+ NADPH + H+ NH3 α-ketoglutaratas

11.9 pav. Glutamato dehidrogenazin÷ reakcija. Ši reakcija grįžtama, reakcijos kryptis priklauso nuo glutamato, α-ketoglutarato,

amoniako koncentracijų, nuo oksiduotų ir redukuotų kofermentų santykio. Susidaręs amoniakas gali būti panaudojamas kitų medžiagų (Asn, Gln) sintezei, bet daugiausiai amoniakas pašalinamas iš organizmo karbamido pavidalu. Glutamato didrogenaz÷ kaip kofermentą gali panaudoti ir NAD ir NADP . NAD+ yra naudojamas oksidacinio deamininimo metu, o NADPH tarnauja reduktoriumi redukcinio amininimo reakcijose. Fermento aktyvumas alosteriškai reguliuojamas. Stuburinių gyvūnų fermentas yra mitochondrijų užpilde ir sudarytas iš 6 subvienetų, ADP ir GDP yra alosteriniai aktyvatoriai, o

313

ATP ir GTP alosteriniai fermento slopikliai . Aminorūgščių oksidacija pagreit÷ja, kai ląstel÷je sumaž÷ja energetinių medžiagų ištekliai.

Procesas, kurio metu kartu veikia aminotransferaz÷s ir glutamato dehidrogenaz÷ yra vadinamas transdeamininimas.

Amoniakas gali būti pašalinamas katalizuojant oksidaz÷ms. Yra du tipai nespecifinių aminorūgščių oksidazių - D-aminorūgščių oksidaz÷s ir L-aminorūgščių oksidaz÷s, kurios oksiduoja atitinkamai D- ir L- aminorūgštis. Jų aktyvumas žmogaus organizme yra žemas. D-aminorūgštys randamos augaluose ir mikroorganizmų ląstelių sienel÷se. Žinduoliai nenaudoja D-aminorūgščių baltymų biosintezei. Patekusios su maistu D-aminorūgštys yra metabolizuojamos kepenyse. D-aminorūgščių oksidazių kofermentas yra FAD. Susidaręs FADH2 yra oksiduojamas deguonimi ir susidaro vandenilio peroksidas, kuris suskaidomas katalaz÷s.

α-ketonorūgštis + NH4 + FADH2 D-Aminorūgštis + FAD + H2O

FADH2 + O2 FAD + H2O2

+

Kepenyse ir inkstuose yra L-aminorūgščių oksidaz÷s, kurių kofermentas yra FMN.

11.3 Aminor ūgščių dekarboksilinimas, Dekarboksilinant aminorūgštis gaunami pirminiai aminai. Dekarboksilinamos yra

visos aminorūgštys. Reakciją katalizuoja atitinkamos aminorūgšties dekarboksilaz÷, kurios kofermentas taip pat yra piridoksalfosfatas.

Žinduolių organizme aminai atlieka svarbias biologines funkcijas. Dekarboksilinant glutamo rūgštį susidaro γ−γ−γ−γ−aminobutiratas (GABA), kuris yra neuromediatorius ir dalyvauja nervinio impulso perdavime sinaps÷se. γ−aminobutirato analogai naudojami epilepsijai ir hipertenzijai gydyti.

Dekarboksilinant histidiną gauname histaminą. Histaminas yra stiprus vazodilatorius, praplečiantis kraujagysles. Histaminas yra cheminis informacijos nešiklis, kuris dalyvauja įvairiuose procesuose – alergin÷se ir uždegimin÷se reakcijose ir manoma neurotransmisijoje. Alerginių reakcijų ar traumos metu jis yra sekretuojamas mast ląstelių. Histaminas stimuliuoja skrandžio sulčių sekreciją. Histamino receptorių antagonistas cimetidinas yra histamino

struktūrinis analogas.

CH2

S CH2

CH2

NH

C NH

CH3

N C N

Cimetidinas Jis blokuoja HCl išsiskyrimą ir naudojamas opalig÷s gydimui.

OOC CH2

CH2

CH

COO

NH3

OOC CH2

CH2

CH2

NH3

+

--

+

-

Glutamatodekarboksilaz÷

Glutamatas CO2 γ-aminobutiratas (GABA)

314

N

NH

CH2

CH

COO

NH3

N

NH

CH2

CH2

NH3

+

CO2

+

Histidinas Histaminas

- Histaminodekarboksilaz÷

NH

CH2

CH

COO

NH3

NH

CH2

CH

COO

NH3OH

NH

CH2

CH2

NH3OH

+

+

Triptofanas 5-hidroksitriptofanas

-

+

-

Dekarboksilaz÷

Triptofanohidroksilaz÷

Tetrahidro- Dihidro-biopterinas biopterinas

O2 H2O

Serotoninas11.10 pav. Aminorūgščių dekarboksilinamas.

Dekarboksilinant 5-hidroksitriptofaną susidaro serotoninas. Serotoninas atlieka

įvairias fiziologines funkcijas - jis reguliuoja kraujo spaudimą, temperatūrą, miegą, atsakingas už emocinius sutrikimus, skausmo suvokimą.

Poliamidai sperminas ir spermidinas dalyvauja DNR molekul÷s susipakavime, jie yra sintetinami iš metionino ir ornitino. Dekarboksilinant ornitiną gauname putresciną, o lizino dekarboksilinimo produktas vadinamas kadaverinu. Šios medžiagos susidaro degraduojantis

baltymams.

H3N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH3 H3N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH3

H3N-(CH2)4-NH3 H3N-(CH2)3-NH3

++ ++

Spermidinas Sperminas

++ ++

Putrescinas Kadaverinas

Adrenalinas, noradrenalinas ir dopaminas yra biologiškai aktyvūs aminai, jie yra

vadinami katecholaminais. Dopaminas ir noradrenalinas veikia kaip neurosiuntikliai smegenyse ir autonomin÷je nervų sistemoje. Adrenalinas ir noradrenalinas sintetinami antinksčių žiev÷je yra sekretuojami į kraują ir veikia kaip hormonai. Išsigandus, po sunkių fizinių pratimų, sušalus, sumaž÷jus gliukoz÷s koncentracijai kraujyje, adrenalinas ir noradrenalinas atsipalaiduoja iš saugojimo pūslelių, esančių antinksčių žiev÷je ir patenka į kraują. Šie hormonai greitina glikogeno ir triacilglicerolių skaidymą, didina kraujo spaudimą ir skatina širdies veiklą.

315

Katecholaminai sintetinami iš aminorūgšties tirozino. Tirozinas yra hidroksilinamas veikiant tirozino hidroksilazei ir susidaro 3,4-dihidroksifenilalaninas (DOPA) (11.12 pav.). DOPA dekarboksilaz÷ (šio fermento kofermentas yra piridoksal-fosfatas) dekarboksilina 3,4-dihidroksifenilalaniną iki dopamino, kuris katalizuojant varį turinčiai dopamino β-hidroksilazei virsta į noradrenaliną. Adrenalinas susidaro iš noradrenalino jų metilinant reakcijoje, kur metilo donoras yra S-adenozilmetioninas.

OH CH2

CH

NH3

COO OH CH2

CH

NH3

COO

OH

OH CH2

CH2

OH

NH3 OH CH

CH2

OH

NH3

OH

OH CH

CH2

OH

NH

OH

CH3

Dopaminas Askorbatas Dehidro- Noradrenalinas +O2 askorbatas +H2O

Adrenalinas

Tirozino hidroksilaz÷

Tetrahidro-biopterinas + O2

Dihidro-biopterinas +H2O

Tirozinas Dihidroksifenilalaninas (DOPA)

DOPAdekarboksilaz÷

CO2

Dopaminoβ-hidroksilaz÷

Transferaz÷

S-adenozil- S-adenozil-metioninas homocisteinas

++

+ +

+

2

- -

11.12 pav. Katecholaminų sintez÷.

11.4 Amoniako surišimas ir išskyrimas. Karbamido c iklas

11.4.1Amoniako šaltiniai. Žmogaus organizme amoniakas gali susidaryti:

1. Iš aminorūgščių. Patekusių su maistu arba skaidant organizmo baltymus aminorūgščių aminogrup÷s azotas peramininimo ir oksidacinio deamininimo keliu virsta amoniaku.

2. Iš glutamino. Katalizuojant glutaminazei inkstuose, kepenyse, žarnyne iš glutamino atsipalaiduoja amoniakas.

3. Iš purin ų ir pirimidin ų. Skaidant purinus ir pirimidinas aminogrup÷s azotas pašalinamas amoniako pavidalu.

4. Iš aminų. Veikiant monoamino oksidaz÷ms, skaidant katecholaminus ir kitus aminus, azotas išsiskiria amoniako pavidalu.

Padid÷jusi amoniako koncentracija nuodinga, nes amoniakas suriša H+ ir stipriai keičia organizmo vidinių terpių pH, be to jis reaguoja su α−ketoglutaro rūgštimi, sumažina jos kiekį ir tod÷l gali sutrikti trikarboksirūgščių ciklas. Smegenyse amonio jonai susijungia su glutamatu, ir sumaž÷ja neuromediatoriaus glutamo rūgšties koncentracija.

316

Organizme amoniakas į kepenis ir inkstus pernešamas netoksinių junginių - glutamino ir alanino pavidalu. Susidaręs audiniuose laisvas amoniakas, katalizuojant glutamino sintetazei, reaguoja su glutamatu ir susidaro glutaminas (11.13 pav.). Reakcija vyksta dviem etapais. Pirmame etape glutamatas reaguoja su ATP ir susidaro tarpininkas γ-glutamilfosfatas, kurio reakcijos su amoniaku produktas yra glutaminas.

OOC CH2

CH2

CH

COO

NH3

C CH2

CH2

CH

COO

NH3

P

O

O

O

O

C CH2

CH2

CH

COO

NH3O

NH2

OOC CH2

CH2

CH

COO

NH3

+

--

+

-

+

--

ATP

ADP

NH4

Pn

H2O

NH4

Glutamatas

γ-glutamilfosfatas

Glutaminas

Glutamatas

+

+

+

Glutaminosintetaz÷

Glutaminosintetaz÷

Glutaminaz÷

Karbamidas

11.13 pav. Amoniako pernešimas glutamino formoje. Glutaminas yra netoksiškas, jis lengvai praeina pro ląstelių membranas, jo

koncentracija kraujyje yra didesn÷ negu kitų aminorūgščių. Glutaminas taip pat yra aminogrup÷s šaltinis įvairiuose biosintetiniuose procesuose. Kepenyse, inkstuose, žarnyno ląstel÷se glutaminas veikiant glutaminazei suskaidomas į glutamatą ir amoniaką. Amoniakas iš žarnyno ir inkstų krauju pernešamas į kepenis, kur sintetinamas karbamidas.

Raumenyse ir kituose audiniuose, kuriuose skaidomos aminorūgštys, atsipalaidavusi aminogrup÷ pernešama į kepenis alanino-gliukoz÷s ciklo keliu (11.14 pav.). Aminogrup÷ peramininimo metu surenkama glutamato molekul÷je. Katalizuojant alanino aminotransferazei aminogrup÷ nuo glutamato pernešama ant piruvato ir susidaręs alaninas pereina į kraują ir transportuojamas į kepenis. Hepatocitų citozolyje alanino aminotransferaz÷ perneša aminogrupę ant α-ketoglutarato ir susidaro piruvatas ir glutamatas. Glutamatas pereina į mitochondrijas ir glutamato dehidrogenazin÷s reakcijos metu susidaręs amoniakas patenka į karbamido ciklą. Iš piruvato gliukoneogenez÷s metu susidaro gliukoz÷, kuri pernešama į raumenis ir tenai oksiduojama.

317

Gliukoz÷

Gliukoz÷

Piruvatas

Piruvatas

Alaninas

Alaninas

Glutamatas

Glutamatas

α-ketoglutaratas

α-ketoglutaratas

NH4+

Karbamidas

Raumenųbaltymai

Aminorūgštys

NH4+

RAUMENYS

KEPENYS

KRAUJAS

Alanino aminotransferaz÷

Glikoliz÷

Gliukoneogenez÷ Alanino aminotransferaz÷

11.14 pav. Alanino - gliukoz÷s ciklas. Organizmai azoto perteklių pašalina trim keliais. Dauguma stuburinių NH3 paverčia į

karbamidą ir pašalina iš organizmo. Paukščiai, reptilijos, kurie naudoja nedaug H2O, amoniaką suriša į šlapimo rūgštį, tuo tarpu vandenyje gyvenančios žuvys tiesiogiai į terpę pašalina NH3. Šie organizmai atitinkamai vadinami: uroteliniais, urikoteliniais ir amonioteliniais organizmais.

Yra trys pagrindiniai amoniako surišimo keliai 1) Veikiant glutamato dehidrogenazei amoniakas reaguoja su α−ketoglutaro rūgštimi

ir susidaro glutamatas. 2) Amoniako įjungimas į karbomoilfosfato molekulę. Karbamoilfosfato sintezę

katalizuoja mitochondrijų užpilde esantis fermentas karbamoilfosfato sintetaz÷ I (KFS I). 3) Kepenyse ir smegenyse amoniakas surišamas glutamino molekul÷je, veikiant

glutamino sintetazei.

11.4.2Karbamido ciklas

Karbamidas sintetinamas karbamido ciklo metu, kurį 1932 m. atrado Krebsas (H.Krebs) ir Henseleitas (K.Hanseleit). Bendrą karbamido sintez÷s reakciją galima užrašyti taip:

2NH4 + HCO3 + 3ATP + 2H2O H2N-CO-NH2 + 2ADP + 4Pn + AMP

Karbamidas

-+

318

Karbamido ciklas prasideda mitochondrijose, kitos trys reakcijos vyksta citozolyje. Pirma karbamido sintez÷s reakcija yra karbamoilfosfato susidarymas. Eukariotuose yra

dvi karbamoilfosfato sintetaz÷s (KFS) formos 1. Mitochondrin÷ KFS I karbamido sintezei panaudoja amoniaką

2ATP + HCO3 + NH4 H2N C

O

OPO32- + 2ADP + Pn

Karbamoilfosfatas

KFS I+-

2. Citozolyje esanti KFS II karbamoilfosfato sintezei panaudoja glutaminą, o ne

amoniaką ir dalyvauja pirimidinų biosintez÷je (psžr skyriusl) Bikarbonatas susidaro trikarboksirūgščių ciklo metu, o amoniakas – deamininant

glutamatą. Sintezei reikalingos dvi ATP molekul÷s - viena aktyvuoja bikarbonatą, kita duoda fosfato liekaną karbamoilfosfatui. Reakcija yra negrįžtama, ji limituoja visą karbamido sintez÷s proceso greitį. Ornitino transkarbamoilaz÷, esanti mitochondrijų užpilde, perneša karbamoilo grupę nuo karbamoilfosfato ant ornitino, susidarant citrulinui. Citrulinas išeina iš mitochondrijų ir tolimesn÷s karbamido ciklo reakcijos vyksta citozolyje.

CO

NHNH3

COO-

H2N C

O

OPO32- (CH2)3

HC NH3

NH2

COO-

(CH2)3

HC NH3

+

+ + Pn

Karbamoilfosfatas Ornitinas Citrulinas

Ornitino transkarbamoilaz÷

+ +

Antras azoto atomas į karbamido molekulę įjungiamas iš asparto rūgšties amino

grup÷s. Asparto rūgšties prijungimą prie citrulino katalizuoja arginino sukcinato sintetaz÷ (ASS). Reakcija vyksta per citrulil-AMP tarpininką.

CO

NH

CO

NH

CH2

H

C

NH

NH CH2

H

H3N

COO-

(CH2)3

HC NH3

NH2

+ ATP

COO-

(CH2)3

HC NH3

NH2AMP

+

+

C COO-

COO-

COO-

(CH2)3

HC NH3

NH2 C COO

COO-

PPnAMP

-

Citrulinas Citrulil-AMP Arginino sukcinatas

Asp

+

+ +

+

ASS ASS

+

Reakcijos metu ATP hidrolizuojama iki AMP ir pirofosfato. Pirofosfatas skaidomas

iki dviejų neorganinio fosfato molekulių ir reakcijos pusiausvyra pastumiama į arginino sukcinato susidarymo pusę.

Arginino sukcinato liaz÷ katalizuoja arginino sukcinato skaidymą iki arginino ir fumarato.

319

C

NH2

NH

NH

CH

CH2

COO

COO

CH2)3

CH

COO

NH3

C

NH2

NH

NH2

CH2)3

CH

COO

NH3

((

NH3

CH2)3

CH

COO

NH3

(NH2 C NH2

O

+ -

-

+

Fumaratas

Arginino sukcinato liaz÷

+

-

+

+ +

Arginaz÷

Ornitinas Karbamidas

H2O

Arginino sukcinatas Argininas

-

-

+

Paskutin÷ karbamido ciklo reakcija yra katalizuojama arginaz÷s, kuri skaido argininą į

karbamidą ir ornitiną. Ornitinas pernešamas atgal į mitochondrijas, jungiasi su karbamoilfosfatu ir ciklas kartojasi. Vidin÷je mitochondrijų membranoje yra citrulino/ornitino main ų transporteris.

Tokiu būdu karbamido ciklo metu dvi amino grup÷s viena tiesiogiai iš amoniako, kita iš asparto rūgšties ir anglies atomas iš bikarbonato susijungę sudaro netoksišką produktą karbamidą, kuris yra pašalinamas iš organizmo. Šiai sintezei yra panaudojami keturi didžiaenergiai fosfatiniai ryšiai (trys ATP hidrolizuojamos iki dviejų ADP viena iki AMP ir PPn. Pirofosfatas, kuris taip pat turi didžiaenergį ryšį hidrolizuojamas.

320

NH4HCO3

ATP

Glutamatas

Karbamoilfosfatas

Ornitinas Citrulinas

Glutaminas

Oksaloacetatas

Aspartatas α-keto-glutaratas

GlutaminasGlutamatas

α-ketonorūgštis

Aminorūgštys

Alaninas/iš raumenų/

α-ketoglutaro rūgštis

Ornitinas Citrulinas

Argininas Argininosukcinatas

AspartatasKARBAMIDAS Karbamido ciklas

+

-

2

3

45

1

Mitochondrijų užpildas

Citozolis

11.15 pav. Karbamido sintez÷ ir aminogrup÷s įjungimas į ciklą. Fermentai - 1-

aminotransferaz÷s, 2 – glutamato dehidrogenaz÷, 3 – karbamoilfosfato sintetaz÷ I, 4 – aspartato aminotransferaz÷, 5 – glutaminaz÷.

Karbamido ciklas yra tampriai susijęs su trikarboksirūgščių ciklu. Karbamido cikle susidaręs fumaratas yra trikarboksirūgščių ciklo tarpininkas. Kai kurios trikarboksirūgščių ciklo fermentų fumaraz÷s, malato dehidrogenaz÷s izoformos yra citozolyje ir fumaratas gali būti paverčiamas į malatą arba oksalacetatą ir metabolizuojamas mitochondrijose arba citozolyje. Citozolyje iš oksalacetato gali būti sintetinamos aminorūgštys ar gliukoz÷. Malatas, aspartato-malato šunto pagalba yra pernešamas į mitochondrijų užpildą ir oksiduojamas trikarboksirūgščių cikle.

321

11.5 Aminor ūgščių anglies skeleto skaidymas Pagrindin÷ su maistu gaunamų aminorūgščių dalis yra panaudojama organizmo naujų

baltymų sintezei. Likusios aminorūgštys skaidomos, pašalinant aminorūgšties αααα-aminogrupę ir oksiduojant susidariusį anglies skeletą. Anglies skeletas suskaidomas iki septynių tarpinių produktų, tai gali būti trikarboksirūgščių tarpininkai - oksalacetatas, αααα-ketoglutaratas, fumaratas, sukcinil-KoA ir glikoliz÷s produktai – piruvatas, acetil-KoA ir acetoacetil-KoA. Šie tarpininkai, oksiduojant juos iki CO2 ir H2O panaudojami energijai gauti, arba iš jų sintetinami gliukoz÷, lipidai ar kiti junginiai.

Septynių aminorūgščių visas ar dalis anglies skeleto yra suskaidomas iki acetil-KoA . Penkios aminorūgštys paverčiamos į αααα-ketoglutaratą, keturios į sukcinil-KoA , dvi į fumaratą ir dvi į oksalacetatą. Bendra aminorūgščių anglies skeleto metabolizmo schema pateikta 11.16 pav.

Aminorūgštys skirstomos į glikogenines ir ketogenines priklausomai nuo to kokie susidaro metabolizmo tarpininkai

Glikogenin÷s aminorūgštys. Skaidant šias aminorūgštis susidaro piruvatas arba vienas iš trikarboksirūgščių tarpininkų. Šios medžiagos yra gliukoneogenez÷s proceso substratai ir iš jų kepenyse sintetinama gliukoz÷ ar glikogenas , o raumenyse –glikogenas.

Ketogenin÷s aminorūgštys. Šios aminorūgštys suskaidomos iki acetoacetato arba vieno iš jų pirmtakų (acetil-KoA arba acetoacetil-KoA). Sergant diabetu kepenyse iš riebalų rūgščių ir ketogeninių aminorūgščių sintetinami dideli ketoninių junginių – acetoacetato, β-hidroksibutirato ir acetono kiekiai. Lizinas ir leucinas yra tiktai ketogenin÷s aminorūgštys, iš jų skaidymo produktų nesusidaro nei gliukoz÷ nei glikogenas.

Reikia pasteb÷ti, kad skaidant aminorūgštis skirtingos anglies skeleto dalys skaidomos įvairiais keliais, tod÷l ta pati aminorūgštis gali būti ir glikogenin÷ ir ketogenin÷. Aminorūgštys - fenilalaninas, izoleucinas, treoninas , tirozinas ir triptofanas yra ir ketogenin÷s ir glikogenin÷s aminorūgštys.

Lentel÷ 11.1. Ketogenin÷s ir glikogenin÷s aminorūgštys

Glikogenin÷s Aminorūgštys

Ketogenin÷s aminorūgštys

Ala Arg Asp Asn Cis Glu Gln Gly His Met Pro Ser Val

Leu Lys

Ile Phe Trp Tyr Thr

322

citratas

izocitratas

a-ketoglutaratas

sukcinil-KoA

sukcinatas

fumaratas

malatas

oksalacetatas

CH3CO-SKoA

glutamatas

ArgininasGlutaminasHistidinasProlinas

IzoleucinasMetioninasTreoninasValinas

FenilalaninasTirozinas

AsparaginasAspartatas

Piruvatas

AlaninasCisteinasGlicinasSerinasTreoninasTriptofanas

IzoleucinasLeucinasTreoninasTriptofanas

Acetoacetil-KoA

LeucinasLizinasFenilalaninasTriptofanasTirozinas

Gliukoz÷

Ketoniniai junginiai

11.16 pav. Bendra aminorūgščių anglies skeleto katabolizmo schema.

11.5.1Aminor ūgštys, kurios skaidomos iki piruvato Šešių aminorūgščių visas anglies skeletas ar jo dalis yra paverčiamas į piruvatą. Iš

piruvato gali susidaryti oksalacetatas (jis dalyvauja gliukoneogenez÷je) arba acetil-KoA (ketoninių junginių pirmtakas). Taigi, aminorūgštys, kurios katabolizuojamos iki piruvato yra ir glikogenin÷s ir ketogenin÷s.

Alaninas peramininimo metu praranda savo aminogrupę ir susidaro piruvatas. Atskeliant triptofano šoninę grandinę taip pat gauname alaniną, kita triptofano molekul÷s dalis suskaidoma iki acetil-KoA ir acetoacetilo-KoA.

323

NH

CH2

CH

COO

NH3

CH3 CH

COO

NH3

CH3 C COO

O

CH2

CH

COO

NH3

SH

-

+

Triptofanas Cisteinas

+

-

Alaninas Piruvatas

-

α-ketoglutaratas Glutamatas

Alanino aminotransferaz÷

+

-

11.17 pav. Triptofano, alanino ir cisteino skaidymas. Cisteinas skaidomas dviem etapais; pradžioje pašalinamas sieros atomas ir gautas

produktas peramininamas. Cistinas redukuojamas iki cisteino redukcijai naudojant NADH. Serinas gali būti paverčiamas glicinu ir N5,N10-metilentetrahidrofolatu. Serinas taip

pat tiesiogiai deamininamas iki piruvato, veikiant serino dehidratazei. Šio fermento kofermentas yra piridoksalfosfatas.

OH CH2

CH

COO

NH3 H3N CH2

COO

CH3 C COO

O

Serinas GlicinasTetrahidro-

folatasN5,N10-metilen-tetrahidrofolatas

HCO3 + NH4

NH4 H2O

Serinohidroksimetil- transferaz÷

Serinodehidrataz÷

- +

+

+

-

+ -

-

NAD+

Glicinosintaz÷

Tetrahidro-folatas

N5,N10-metilen-tetrahidrofolatas

Piruvatas

NADH + H+

11.18 pav. Serino ir glicino skaidymas. Glicinas skaidomas trimis keliais. Katalizuojant glicino sintazei glicinas oksiduojamas

iki HCO3- ir NH4

+ , o metileno grup÷ prijungiama prie tetrahidrofolato. Ši grįžtama reakcija taip pat yra naudojama glicino biosintezei. Glicinas prisijungęs hidroksimetilo grupę virsta serinu. Šios reakcijos, kurią katalizuoja serino hidroksimetiltransferaz÷, kofaktoriais yra piridoksalfosfatas ir tetrahidrofolatas. Glicinas yra achiralin÷ molekul÷, jis gali būti oksiduojama D-aminorūgščių oksidazių. Glicinas oksiduojamas iki glioksilato, iš kurio susidaro oksalatas.

324

NH3 CH2

COOC

O

COO

H COO

COOO2 H2O NH3

D-aminorūgščių oksidaz÷

NAD+ NADH

-

-

-

-+

Glicinas Glioksilatas Oksalatas 11.19 pav. Glicino oksidacija D-aminorūgščių oksidaz÷mis.

Treoninas paverčiamas į piruvatą ar α-ketoglutaratą. Katalizuojant treonino dehidrogenazei, jis oksiduojamas į 2-amino-3-ketobutiratą, iš kurio susidaro glicinas ir acetil-KoA. Žmogaus organizme treoninas pagrindinai skaidomas iki sukcinil-KoA.

CH3 CH

OH

CH

COO

NH3

CH3 C

O

CH

COO

NH3

CH2

COONH3

+

-

Treoninodehidrogenaz÷

+

- + -

NAD+ NADH KoA Acetil-KoA

2-amino-3-ketobutirato KoA ligaz÷

Treoninas 2-amino-3-ketobutiratas Glicinas

11.20 pav. Treonino skaidymas. Kitas žinduoliuose vykstantis kelias yra treonino deamininimas veikiant serino

dehidratazei iki α-ketobutirato, kuris dekarboksilinamas ir susidaro propionil-KoA, kuris yra sukcinil-KoA pirmtakas.

11.5.2Aminor ūgščių skaidymas iki acetil-KoA Septynios aminorūgštys triptofanas, lizinas, fenilalaninas, tirozinas, leucinas,

izoleucinas ir treoninas skaidomos iki acetil-KoA ir/arba acetoacetil-KoA, kuris paverčiamas į acetil-KoA.

Gyvūnų organizmuose katabolizuojant triptofan ą susidaro alaninas ir acetoacetil-KoA. Tuo būdu triptofanas yra ir ketogenin÷ ir glikogenin÷ aminorūgštis. Leucinas yra išimtinai ketogenin÷ aminorūgštis, jai skylant susidaro acetil-KoA ir acetoacetatas (pav).

Izoleucinas yra kartu ketogenin÷ ir glikogenin÷ aminorūgštis, jos metabolizmo produktai yra acetil-KoA ir propionil-KoA. Pirmos trys izoleucino katabolizmo stadijos yra tos pačios kaip ir leucino bei valino, turinčių šakotus radikalus (pav11.21.

Lizinas yra išimtinai ketogenin÷ aminorūgštis, jis paverčiamas į acetoacetil-KoA.

Triptofanas

Alaninas Acetoacetil-KoA

Piruvatas Acetil-KoA

Fenilalaninas Tirozinas

Fumaratas

Leucinas

Izoleucinas

Lizinas

Propionil-KoA

11.21 pav. Triptofano, lizino, fenilalanino, tirozino, leucino ir izoleucino katabolizmo schema.

325

11.5.3Aminor ūgštys, kurios skaidomos iki αααα-ketoglutarato Penkių aminorūgščių (prolino, glutamato, glutamino, arginino, ir histidino) anglies

skeletas patenka į trikarboksirūgščių ciklą kaip α-ketoglutaratas. Katalizuojant glutaminazei, glutaminas paverčiamas į amoniaką ir glutamatą.

Peramininimo ar oksidacinio deaminimo keliu iš glutamato susidaro α-ketoglutaratas Žr.psl. Prolinas yra oksiduojamas į glutamatą, iš kurios susidaro α-

ketoglutaratas.

NH

COON

COO

COO

CH NH3

CH2)2

C

H

O

- -Glutamatas

∆1-pirolino5-karboksilatas

Prolinooksidaz÷

O2 H2O

+

-

Glutamatoγ-semialdehidas

H2O

H2O

NAD+ + H2O

NADH + 2H+

α-ketoglutaratas

Prolinas

11.22 pav. Prolino katabolizmas

Argininas veikiant arginazei suskaidomas iki ornitino, kuris per eilę reakcijų paverčiamas α-ketoglutaratu.

C

NH2

NH

NH2

CH2)3

CH

COO

NH3

(

NH3

CH2)3

CH

COO

NH3

(

C

CH2)2

CH

COO

NH3

H

O

(

+

-+

+

H2O

Karbamidas

+

+

-

-

Argininas Citrulinas Glutamato γ-semialdehidas

Glutamatas

α-ketoglutaratas

11.23 pav. Arginino katabolizmas

Histidinas oksidacinio deamininimo keliu veikiant histidazei paverčiamas į urokano rūgštį, kuri per N-formiminoglutamatą paverčiama į glutamatą ir α-ketoglutaratą.

NHN

CH2

CH

COO

NH3

NHN

CH2

CH2

COOOOC

+

- --

Histidinas N-formiminoglutamatas

Glutamatas α-ketoglutaratas

Tetrahidro-folatas 5-formimino

tetrahidrofolatas 11.24 pav. Histidino skaidymas.

11.5.4Aminor ūgštys skaidomos iki sukcinil-KoA Metionino, izoleucino, treonino ir valino skaidymo metu susidaro sukcinil-KoA. Metioninas per S-adenozilmetionino tarpininką atiduoda savo metilo grupę

akceptoriui ir per keletą reakcijų virsta propionil-KoA, kuris yra sukcinil-KoA pirmtakas. Izoleucinas po peramininimo ir oksidacinio deamininimo reakcijų virsta α-

ketonorūgštimi. Susidaręs penkių anglies atomų fragmentas skyla į dviejų (acetilo-KoA) ir trijų (propionil-KoA) fragmentus.

326

Iš valino ir treonino po peramininimo ir dekarboksilinimo reakcijų taip pat susidaro propionil-KoA.

Propionil-KoA karboksilinamas iki metilmalonil-KoA, kuris, katalizuojant priklausomai nuo vitamino B12 metilmalonil-KoA mutazei, epimerizuojasi į sukcinil-KoA.

CH3 S CH2

CH2

CH

COO

NH3

SH CH2

CH2

CH

COO

NH3

CH3 CH2

C S KoA

O

OOC CH

C S KoA

OCH3

CH2

CH2

C S KoA

O

OOC

CH3 CH

CH

COO

NH3CH3

CH3 CH

CH

COO

NH3OH

CH2

CH

CH

COO

NH3CH3

CH3

-

Metioninas

+

-

+

Homocisteinas

Propionil-KoA

-

-

Metilmalonil-KoA

Sukcinil-KoA

-

+

-

+

Treoninas

Valinas

-

+

Izoleucinas

11.25 pav. Metionino, treonino, valino ir izoleucino skaidymo keliai. kelias stadijas atiduoda savo metilo grupę.

11.5.5Aminor ūgščių skaidymas iki oksalacetato Asparagino ir aspartato anglies skeletas skaidomas iki oksalacetato, kuris įjungiamas į

trikarboksirūgščių ciklą. Asparaginaz÷ katalizuoja asparagino hidrolizę į aspartatą ir amoniaką. Aspartatas netenka aminogrup÷s peramininimo reakcijos su α-ketoglutaratu metu.

327

C

CH2

HH3N

COO

CONH2

C

CH2

HH3N

COO

COO

C

CH2

O

COO

COO-

- -

Asparaginaz÷

H2O NH4

-

-

Aminotransferaz÷

α-ketoglutaratas

Glutamatas

Asparaginas Aspartatas Oksaloacetatas

+ +

+

11.26 pav. Arginino ir aspartatoskaidymas.

11.5.6 Aminor ūgščių, turin čių šakotus radikalus katabolizmas. Šakotų šoninių radikalų aminorūgštys - izoleucinas, leucinas ir valinas yra

nepakeičiamos aminorūgštys. Jų metabolizmas skirtingai nuo kitų aminorūgščių prasideda ne kepenyse o periferiniuose organuose (raumenyse). Pirmi šių aminorūgščių skaidymo etapai vyksta panašiai.

1. Peramininimas. Aminogrup÷s pašalinimą nuo visų trijų aminorūgščių katalizuoja tas pats fermentas – šakotų grandinių α-aminorūgščių aminotransferaz÷.

2. Oksidacinis dekarboksilinamas. Karboksigrup÷s nuo atitinkamų α-ketonorūgščių pašalinimą katalizuoja vienas fermentinis kompleksas – šakotų grandinių α-ketonorūgščių dehidrogenaz÷s kompleksas. Į šio komplekso sud÷tį įeina kofaktoriai - tiamindifosfatas, lipo rūgštis, FAD, NAD ir kofermentas A. Fermento veikimo mechanizmas panašus į piruvato dehidrogenazinio ir α-ketoglutarato dehidrogenazinių kompleksų veikimą.

3. Dehidrinimas. Šakotų grandinių acil-KoA molekul÷s yra oksiduojamos acil-KoA dehidrogenaz÷s, turinčios FAD. Ši reakcija yra analogiška pirmąjai riebalų rūgščių oksidacijos reakcijai. Elektronai nuo acil-KoA per elektronus pernešantį flavoproteiną (EPF) perduodami kofermentui Q.

Tolesn÷s aminorūgščių skaidymo reakcijos išsiskiria. Leucino anglies atomai pereina į acetil-KoA, valinas suskaidomas iki propionil-KoA, o izoleucino galutiniai skaidymo produktai yra acetil-KoA ir propionil-KoA.. Acetil-KoA ir susidaręs iš propionil-KoA sukcinil-KoA oksiduojami trikarboksirūgščių cikle. Matome, kad leucinas yra tiktai ketogenin÷ aminorūgštis, valinas – tiktai glikogenin÷, o leucinas ir glikogenin÷ ir ketogenin÷ aminorūgštis.

Gana retai sutinkamas genetinis sutrikimas, sąlygojamas šakotų grandinių α-ketonorūgščių dehidrogenaz÷s defektų, vadinamas klevo sirupo Šlapime pradeda kauptis šakotų grandinių α-ketonorūgštys ir šlapimas įgauna specifinį kvapą.

328

CH

CH2

CH3

CH3

CH

COO

NH3

CH

CH

COO

NH3CH3

CH3

CH

CH

COO

NH3CH2

CH3

CH3

R C COO

O

R C S-KoA

O

CH3 C CH

CH3

C S-KoA

O

CH2 C C S-KoA

O

CH3

CH

C C S-KoA

O

CH3

CH3

+

-

+

-

+

-

Šakotų radikalų aminorūgščiųaminotransferaz÷

Leucinas Valinas Izoleucinas

α-ketoglutaratas

Glutamatas

-

α-ketonorūgštis

Šakotų radikalų α-ketonorūgščiųdehidrogenaz÷

NAD+ + KoASH

NADH + H+ + CO2

Acil-KoA

Acil-KoAdehidrogenaz÷

EPF; FAD

EPF; FADH2 KoQ

KoQH2

Acetil-KoA Acetoacetatas Propionil-KoA Acetil-KoA Propionil-KoA

Acetil-KoA Sukcinil-KoA Sukcinil-KoA

11.27 pav. Aminorūgščių su šakota šonine grandine skaidymas.

329

11.5.7Aminor ūgščių katabolizmo genetiniai sutrikimai Pažiūr÷ti pas medikus Lentel÷ Aminorūgščių genetiniai sutrikimai

Sutrikęs procesas Pažeistas fermentas Simptomai Albinizmas Melanino sintez÷ iš

tirozino Tirozino 3-monooksigenaz÷

Depigmentacija: balti plaukai,

Alkaptonurija Tirozino skaidymas Homogentizinato dioksigenaz÷

Juodas pigmentas šlapime

Argininemija Karbamido sintez÷ Arginaz÷ Protinis atsilikimas Homocistinurija Metionino

skaidymas Cistationino β-sintaz÷

Protinis atsilikimas, kaulų vystymosi sutrikimai

Klevo sirupo šlapimo liga

Izoleucino, leucino ir valino skaidymas

Šakotų grandinių α-ketonorūgščių dehidrogenaz÷

Protinis atsilikimas, konvulsijos, v÷mimas, ankstyva mirtis

Fenilketonurija Fenilalanino virtimas į tiroziną

Fenilalanino hidroksilaz÷

Protinis atsilikimas

Žmogaus organizme yra nustatyta daug ligų, susijusių su aminorūgščių metabolizmo genetiniais sutrikimais. Šie metabolizmo pakitimai sutrikdo nervų sistemos išsivystymą, sukelia protinį atsilikimą, mirtį. Sutrikus katabolizmui pradeda kauptis pašaliniai produktai, arba pradeda trūkti biologiškai svarbių metabolizmo tarpininkų.

Vienas iš labiausiai ištirtų yra fenilalanino ir tirozino katabolizmo procesų.

330

CH2

CH

COO

NH3

CH2

CH

COO

NH3

OH

CH2

OH

CH2

COO

OH

OH

CH2

OH

OH

H+

+

-

O2

NADH+H+

NAD+

H2O

tetrahidrobiopterinasFenilalaninohidroksilaz÷

+

-

Tirozinas

α-ketoglutaratas

Glutamatas

Fenilalaninas

Tirozinoaminotransferaz÷

-C

O

COO

p-hidroksifenilpiruvatasO2

CO2

p-hidroksifenilpiruvatodioksigenaz÷

-

Homogentizinatas

-COO

Homogentizinatas

O2Homogentizinato1,2 dioksigenaz÷

Maleilo acetoacetatas

Maleilo acetoacetato izomeraz÷

OOC-C=C-COO

H

H

OOC-C=C-CO-CH2-CO-CH2-COO

H

H

- -

OOC-C=C-CO-CH2-CO-CH2-COO

H H

- -

Fumarilacetatas

+ CH3-CO-CH2-COO -- -

CH3-CO-CH2-CO-S-KoA

FumaratasAcetoacetatas

Acetoacetil-KoA

Acetoacetil-KoAtransferaz÷

Fumarilacetoacetaz÷H2O

Sukcinil-KoA

Sukcinatas

11.28 pav. Fenilalanino skaidymas Pirmoje stadijoje fenilalaninas hidroksilinamas susidarant tirozinui. Šią reakciją

katalizuoja fenilalanino hidroksilaz÷. Fenilalanino hidroksilaz÷ (ji dar vadinama fenilalanino 4-monooksigenaz÷) yra vadinami mišrios funkcijos (mixed-function) oksidaz÷, ji katalizuoja reakcijas, kurių metu prie substrato prisijungia vienas deguonies ir vandenilio atomas ir substratas yra hidroksilinamas. Kitas deguonies atomas redukuojamas iki vandens.

Fenilalanino hidroksilaz÷s kofermentas yra tetrahidrobiopterinas, kuris perneša elektronus nuo NADH ant O2 ir oksiduojasi iki dihidrobiopterino (11.29 pav.)

331

NH

N

NH

NH

NH2 HH

CH

HO

CH

CH3

OH OH

NH

N

N

NH

NH HH

CH

HO

CH

CH3

OH OH

H CH2

CH

COO

NH3

OH CH2

CH

COO

NH3

56

78

56

78

5,6,7,8-tetrahidrobiopterinas

7,8-dihidrobiopterinas

NADH + H+

NAD+

Dihidrobiopterino reduktaz÷

-

-

Fenilalaninas

Tirozinas

Fenilalanino hidroksilaz÷

O2

H2O

11.29 pav. Terahidrobiopterino vaidmuo fenilalanino hidroksilazin÷je reakcijoje. Dihidrobiopterinas greitai redukuojamas katalizuojant dihidrobiopterino reduktazei. Fenilalanino hidroksilaz÷s genetinis defektas atsakingas už ligos, žinomos

fenilketonurija pavadinimu, atsiradimo. Nesant šio fermento arba kai jis yra neveiklus, organizme pradeda kauptis fenilalaninas. Žmonių, sergančių fenilketonurija fenilalanino metabolizmas vyksta kitu keliu. Fenilalaninas peramininimo reakcijos metu virsta į fenilpiruvatą. Fenilalaninas ir fenilpiruvatas kaupiasi kraujuje, audiniuose ir šalinami su šlapimu. Fenilpiruvatas gali būti dekarboksilinamas iki fenilacetato arba redukuojamas į fenillaktatą. Fenilacetatas suteikia šlapimui specifinį kvapą. Fenilalanino ir jo metabolizmo produktų padid÷jimas smegenyse ankstyvoje vaikyst÷je, pažeidžia smegenys ir vystosi protinis atsilikimas.

CH2

CH

COO

NH3

CH2

CH

COO

NH3

CH3 CH

COO

NH3

CH3 C COO

O

CH2

COO CH2

CH

COO

OH

-

Fenilalaninas

+

-

Fenilalaninas

+

-

-

Piruvatas

Alaninas

Aminotransferaz÷

- -

Fenilacetatas Fenillaktatas

CO2

H2O

+

11.30 pav. Fenilalanino katabolizmas, esant fenilalanino hidroksilaz÷s trūkumui.

332

Fenilketonurija buvo vienas iš anksčiausiai žmogaus organizme nustatytų genetinių sutrikimų. Jeigu fenilketonurija nustatoma naujagimiams, protinio atsilikimo galima išvengti reguliuojant dietą. Su maistu organizmas turi gauti tiktai minimalų fenilalanino kiekį, kuris būtinas baltymų sintezei.

Pirmoji nustatyta paveldima liga yra alkaptonurija , reta liga, kurios metu kaupiasi vienas iš fenilalanino ir tirozino apykatos produktų – homogentizino rūgštis. Šiuo atveju yra nustatytas fermento homogentizinato dioksigenaz÷s defektas. Homogentizinatas yra neskaidomas, jis kaupiasi ir pašalinamas su šlapimu. Šlapime sąveikaudamas su deguonimi homogentizinatas oksiduojasi ir susidaro juodos spalvos produktas, kuris nudažo šlapimą.

333

12 OKSIDACINIS FOSFORILINIMAS Oksidacinis fosforilinimas yra galutinis angliavandenių, riebalų rūgščių skaidymo

etapas, kurio metu sintetinamas pagrindinis ATP kiekis ląstel÷je. Šio proceso metu, energija išsiskyrusi oksidacijos metu yra sukaupiama didžiaenergio junginio ATP molekul÷je, kuri panaudojama ląstelių augimui, dauginimuisi, atsakui į aplinkos poveikius. Oksidacinio fosforilinimo metu yra redukuojamas deguonis ir susidaro vanduo.

Oksidacinis fosforilinimas yra procesas, kurio metu energija, išsiskyrusi oksiduojantis redukuotiems nukleotidams NADH ir FADH2, panaudojama ATP sintezei iš ADP ir Pn. Oksidacinis fosforilinimas vyksta mitochondrijų vidin÷je membranoje, chloroplastų membranoje, bakterijų plazmin÷je membranoje. Oksidacinį fosforilinimą vykdo dvi fermentin÷s sistemos - kv÷pavimo (arba elektronų pernešimo) grandin÷ ir ATP sintaz÷ (arba ATPaz÷).

Kv÷pavimo grandin÷ yra seka oksidacinių redukcinių fermentų ir kofermentų, kurie perneša elektronus ir protonus nuo redukuotų nukleotidų ant molekulinio deguonies. ATP sintaz÷ yra fermentin÷ sistema, kuri panaudodama kv÷pavimo grandin÷je išsiskyrusią energiją, katalizuoja ATP sintezę iš ADP ir Pn.

Oksidacinio fosforilinimo mechanizmas geriausiai ištirtas mitochondrijose ir bakterijose Escherichia coli .

12.1 Mitochondrij ų strukt ūra Mitochondrijos yra organel÷s turinčios dvi membranas – išorinę ir vidinę. Vidin÷

membrana sudaro įlinkimus, kurie vadinami kristomis. Išorin÷je membranoje yra specialūs baltymai porinai , kurie praleidžia nedidel÷s molekulin÷s mas÷s (iki 600 Da) medžiagas. Vidin÷ membrana yra nepralaidi H+, Na+, K+, Cl- , ATP, ADP, piruvatui, trikarboksirūgščių ciklo substratams ir kitoms mitochondrijų funkcionavimui būtinoms medžiagoms.

12.1 pav. Mitochondrijų struktūra. A Mitochondrijų elektronin÷s mikroskopijos

nuotrauka, B mitochondrijos modelis. Specializuotos pernašos sistemos yra vidin÷je membranoje, jos perneša reikalingas

medžiagas. Vidin÷je mitochondrijų membranoje yra kv÷pavimo grandin÷ ir ATP sintaz÷, jų baltymai sudaro pusę vidin÷s membranos baltymų. Vidin÷ membrana gaubia užpildą (užpildą), kuriame išsid÷sto trikarboksirūgščių ciklo fermentai, vyksta riebalų rūgščių oksidacija, kai kurios aminorūgščių oksidacijos, ureos ciklo reakcijos. Mitochondrijose yra savas genomas, dvigrand÷, žiedin÷ DNR. Žmogaus mitochondrin÷ DNR turi 37 genus (16569 bp), 13 genų koduoja kv÷pavimo grandin÷s baltymų atskirus subvienetus, likę genai koduoja tRNR ir rRNR, kurios reikalingos mitochondrijų baltymų biosintezei. Per 900 skirtingų baltymų koduoja branduolio chromosomin÷ DNR, jie sintetinami citozolyje ir pernešami į mitochondrijas, baltymus pernešančios sistemos.

334

Mitochondrijos vaidina labai svarbų programuotoje ląstel÷s žūtyje – apoptoz÷je. Apoptoz÷ gali būti paleidžiama signalo reaguojančio su išoriniu plazmin÷s membranos receptoriumi ar vidinio stimulo, pavyzdžiui aktyvių deguonies formų koncentracijos išaugimo. Kada ląstel÷ gauna signalą apoptozei, padid÷ja mitochondrijų išorin÷s membranos pralaidumas ir citochromas c ir kiti apoptozę indukuojantys baltymai (AIF apoptozę indukuojantis baltymas ), esantys tarpmembranin÷je ertm÷je išeina į citozolį ir aktyvuoja kaspazę 9.

12.2 Oksidacija ir energijos išsiskyrimas Išnagrin÷kime oksidacinio fosforilinimo procesą , mitochondrijose. Mitochondrijų užpilde vyksta trikarboksirūgščių ciklas, jo metu susidarę redukuoti

nukleotidai NADH ir FADH2 oksiduojami molekulinio deguonies. Deguonis tiesiogiai nesąveikauja su redukuotais nukleotidais, o elektronai ir protonai ant deguonies keliauja kv÷pavimo grandine, energija išsiskiria nedidel÷mis porcijomis ir sukaupiama ATP pavidale. Laisvoji energija išsiskiria pernešant elektronus kv÷pavimo grandine nuo elektronų donoro ant elektronų akceptoriaus. Elektronai gali būti perduodami laisvi (citochromams), susijungę su protonu (kaip vandenilio atomas perduodamas FMN) ir susijungęs su vandenilio atomu (hidrido jonas perduodamas nuo substrato ant NAD+ ). Vienos medžiagos oksidacija (elektrono netekimas) visada susijęs su kitos medžiagos redukcija (elektrono prijungimu). NADH oksidacija iki NAD+ susijusi su FAD redukcija į FADH2. NAD+ ir NADH kaip ir FAD ir FADH2 sudaro redokso porą. Redokso poros skiriasi savo paj÷gumu atiduoti ar prijungti elektronus, ji charakterizuojama specifine konstanta standartiniu redukciniu potencialu (E0/). Įvairių medžiagų standartiniai redukciniai potencialai parodyti lentel÷je Nr. 12.1.

12.1 lentel÷. Kv÷pavimo grandin÷s komponentų standartiniai redukciniai potencialai

Redokso reakcija E0/ (V) 2H+ + 2e- → H2 -0,414 NAD+ + H+ + 2e- → NADH -0,32 NADP+ + H+ + 2e- → NADPH -0,324 NADH + FMN + 2H+ + 2e- → NAD+ + FMNH2 -0,30 KoQ + 2H+ + 2e- → KoQH2 0,045 Citochromas b (Fe3+) + e- → citochromas b (Fe2+) 0,077 Citochromas c1 (Fe3+) + e- → citochromas c1 (Fe2+) 0,22 Citochromas c (Fe3+) + e- → citochromas c (Fe2+) 0,254 Citochromas a (Fe3+) + e- → citochromas a (Fe2+) 0,29 Citochromas a3 (Fe3+) + e- → citochromas a3 (Fe2+) 0,35 1/2O2 + 2H+ → H2O 0,82

Medžiaga turinti neigiamesnį redukcinį potencialą atiduoda elektronus ir redukuoja teigiamesnį potencialą turinčią medžiagą. Tod÷l elektronai keliauja nuo redokso poros su neigiamu potencialu ant poros su teigiamu potencialu.

Oksidacijos redukcijos reakcijos metu išsiskyrusios energijos kiekis (∆G0/) tiesiogiai priklauso nuo redukcinio potencialo pokyčio.

∆G0/ = -nF∆E0/, kur n - pernešamų elektronų skaičius (du NADH, FADH2 ir KoQH2 bei vienas

citocromams) F - Farad÷jaus konstanta (96,5 kJ/V mol)

335

∆E0/ - elektronų akceptoriaus ir elektronų donoro standartinių redukcinių potencialų skirtumas

∆G0/ - standartin÷s laisvosios (Gibso) energijos pokytis. Oksidacinio fosforilinimo metu du elektronai ir du protonai keliauja nuo NADH ant

molekulinio deguonies NADH + H+ + O2 NAD+ + H2O Poros NAD+/NADH standartinis redukcinis potencialas E0/= -0.32V, o poros O2/H2O

E0/= +0.82V. Oksiduojantis NADH ∆E0/= +1.14V ir standartinis laisvosios energijos pokytis ∆G0/ yra lygus

∆G0/ = -nF ∆E0/= (-2) (96.5 kJ/V mol) (1.14V) = -220kJ/mol Oksiduojantis sukcinatui, laisvosios energijos pokytis yra ∆G0/ = -152kJ/mol. Žinant,

kad ATP hidroliz÷s energija yra apie -30kJ/mol, aišku, kad oksiduojantis NADH ar FADH2 gali susidaryti kelios ATP molekul÷s.

12.3 Mitochondrij ų kv÷pavimo grandin ÷

12.3.1Kv÷pavimo grandin ÷s kompleksai Mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷ sudaryta iš elektronų ir protonų nešiklių, dauguma

iš jų yra integralieji baltymai, kurių kofaktoriai gali prijungti ir atiduoti vieną ar du elektronus bei protonus. Oksiduojantis substratui, dažniausiai tai yra trikarboksirūgščių ciklo produktai, elektronai ir protonai perduodami NAD+ arba FAD. Kiekvienas grandin÷s komponentas paima redukcinius ekvivalentus iš prieš jį esančio ir atiduoda paskesniam. NADH redukuoja FMN, toliau elektronai per KoQ ir citochromų sistemą patenka ant deguonies, kuris prisijungia protonus ir virsta vandeniu.

Substratas (redukuotas)

Substratas(oksiduotas)

NAD+

NADH +H+

FMNH2

FMN KoQ

KoQH2Fumaratas

Sukcinatas

FADH2

FAD

Fe2+

Fe3+

Fe3+ Fe2+

Fe2+ Fe3+

1/2 O2

H2O

I Kompleksas

II Kompleksas

III Kompleksas IV Kompleksas

Cit b Cit c Cit aa3

12.2 pav. Mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷s komponentų išsid÷stymas. Švelniai veikiant mitochondrijų vidinę membraną detergentais, galima išskirti keturis

kv÷pavimo grandin÷s kompleksus. (ATP sintaz÷ dar yra vadinama V kompleksas). Kiekvienas iš kompleksų turi savo apibr÷žtą baltymų ir kofaktorių sąstatą. I ir II kompleksai perneša elektronus nuo NADH (kompleksas I) ir sukcinato (kompleksas II) ant KoQ. III kompleksas perneša elektronus nuo KoQH2 ant citochromo c, o kompleksas IV katalizuoja elektronų pernešimą nuo redukuoto citochromo c ant molekulinio deguonies. Kompleksus jungia judrūs vandenilio (KoQ) ar elektronų nešikliai (citochromas c).

336

Paveiksle (12.3 pav.) pateiktas kv÷pavimo grandin÷s komponentų oksidaciniai redukciniai potencialai ir pagrindinių inhibitorių veikimo taškai.

NADH NAD+ (-0.32 V)

2e- 2H+

Kompleksas I ∆E0/ = 0.365V ∆G0/ = -70,4 kJ mol-1

ADP + Pn

ATP

Rotenonas ar amitalas

KoQ

Kompleksas III∆E0/ = 0.209V∆G0/ = -40,3 kJ mol-1

ADP + Pn

ATP

Antimicinas Amiksotiazolas

sukcinatas komplek-sas II

fumaratas

2e- 2H+

Citochromas c (+0.254 V)

Kompleksas IV∆E0/ = 0.566V∆G0/ = -109,2 kJ mol-1

ADP + Pn

ATP

CN-

CO, N3-

2e-

2H+ + 1/2 O2 H2O (+0.82V)

(+0.030V)( 0.045V)

12.3 pav. Mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷s komponentų oksidaciniai redukciniai potencialai ir inhibitorių veikimo taškai.

Kompleksas I. NADH – ubichinono oksidoreduktaz÷, ji vadinama NADH

dehidrogenaz÷, katalizuoja redukuoto NAD oksidaciją NADH + H+ + KoQ NAD+ + KoQH2

∆E0/ 0.365 V ∆G0/ -70,4 kJ mol-1 Fermentinio komplekso sud÷tyje yra kofaktoriai FMN ir Fe-S, per kuriuos elektronai

pernešami ant KoQ. : NADH+H+ FMN

NAD+ FMNH2

Fe2+-S

Fe3+-S

KoQ

KoQH2

Kompleksas I yra flavoproteinas sudarytas daugiau nei iš 40 polipeptidinių grandinių. Į

komplekso sud÷tį įeina viena molekul÷ FMN, šeši-septyni Fe-S centrai ir per 26 geležies atomus. Kompleksas išsid÷stęs vidin÷je mitochondrijų membranoje taip, kad NADH prijungiamas iš užpildo pus÷s. Pradžioje du redukuojantys ekvivalentai nuo NADH pernešami ant prostetin÷s grup÷s FMN. Toliau elektronai pernešami ant Fe-S centrų ir ant KoQ.

337

Susidaręs ubichinolas (KoQH2) difunduoja nuo komplekso I prie komplekso III ir oksiduojamas. Elektronų pernešimas nuo NADH ant KoQ yra susijęs su vektoriniu protonų pernešimu - 4 protonai keliauja iš mitochondrijų užpildo į citozolį. Šis kompleksas veikia kaip protonin÷ pompa.

Amitalas, rotenonas, piericidinas A slopina elektronų pernešimą nuo Fe-S centrų ant ubichinono ir blokuoja oksidacinio fosforilinimo procesą.

Fe-S baltymai Yra žinomi keli Fe-S centrai, kurie kaip kofaktoriai perneša elektronus. Šiuose geležį turinčiuose baltymuose geležis yra sujungta ne su hemu, o su neorganine siera ir/ar su cisteino -SH grupe. Tokie baltymai vadinami geležies sieros (Fe-S) baltymais, Fe-S klasteriais.

Cys

Cys

Cys

Cys

S

S S

SFe

Cys

Cys

Cys

Cys

S

S S

SFe Fe

S

S

S

Fe

Fe

S

SFe

S

Fe

S-Cys

S-Cys

Cys-S

Cys-S

(a)

(b)

(c) 12.4 pav. Geležies-sieros baltymai. Šie Fe-S centrai gali būti įvairių struktūrų: - nuo paprastų, kur vienas geležies atomas

koordinuotas su keturiais cisteino sieros atomais (Fe-S centras 12.4 pav. a) iki sud÷tingesnių, kur Fe sujungta su keliais neorganin÷s sieros atomais ir su cisteino -SH grup÷mis (2Fe-2S 12.4 pav. b) ir (4Fe-4S 12.4 pav. c). Šie kompleksai dalyvauja vieno elektrono pernešimo reakcijose. Geležies atomai kiekviename centre sudaro konjuguotas sistemas ir turi oksidacijos laipsnius tarp +2 ir +3. Tokie Fe-S baltymai plačiai paplitę kv÷pavimo grandin÷je, fotosintetin÷je elektronų pernešimo grandin÷je, kai kuriuose fermentuose, jie perneša elektronus gyvūnuose, augaluose, bakterijose.

Ubichinonas (taip pat vadinamas kofermentas Q, KoQ) yra lipiduose tirpus benzochinonas su ilga izoprenoidine grandine ( žinduolių organizmuose uodega susideda iš 10 C5 izoprenoidinių vienetų. Kituose organizmuose gali būti 6 ar 8 izoprenoidiniai vienetai). Plastochinonas (chloroplastuose) ir menachinonas (bakterijose) yra panašios struktūros ir taip pat dalyvauja elektronų ir protonų pernešime.

338

CH3

(CH2-CH=C-CH2)nH

CH3O

CH3O

O

O

CH3

Ubichinonas (KoQ)

CH3

(CH2-CH=C-CH2)8H

O

O

CH3

Menachinonas

H

(CH2-CH=C-CH2)nH

CH3

CH3

O

O

CH3

Plastochinonas Ubichinonas gali prisijungti protoną ir vieną elektroną tapdamas semichinono radikalu

KoQH* arba du redukcinius ekvivalentus, susidarant ubichinoliui KoQH2. Būdamas tirpus lipiduose jis membranoje perneša elektronus ir protonus ir sujungia I ir II kompleksus su III kompleksu.

CH3

R

CH3O

CH3O

O

O

CH3O

CH3O

O

OH

CH3

R

OH

OHCH3O

CH3O

CH3

R

KoQ

*

KoQH*

H++e-H++e-

KoQH2

Ubichinonas Semichinonas Ubichinolis 12.5 pav. Ubichinono redukcija iki semichinono ir ubichinolio.

II kompleksas Sukcinato-ubichinono oksidoreduktaz÷. Jis dar vadinamas sukcinato

dehidrogenaze, yra vienintelis trikarboksirūgščių ciklo fermentas surištas su membrana. . Perneša elektronus ir protonus nuo sukcinato ant KoQ

Kompleksas II katalizuoja sukcinato oksidaciją ir KoQ redukciją. sukcinatas + KoQ fumaratas + KoQH2

∆E0/ 0.015 V ∆G0/ -2.9 kJ mol-1

339

Oksiduojantis sukcinatui pradžioje elektronai pernešami ant FAD, nuo jo ant Fe-S centrų, kurie redukuoja KoQ. Šioje stadijoje laisvosios energijos pokytis ∆G0/ ir šios energijos nepakanka ATP sintezei.

sukcinatas FAD

fumaratas FADH2

Fe2+-S

Fe3+-S

KoQ

KoQH2

12.6 pav. Sukcinato dehidrogenaz÷s (II kompleksas) tretin÷ struktūra. PDB failas Sukcinato dehidrogenaz÷s išskirtos iš E.coli tretin÷ struktūra nustatyta 2003m.

Eukariotų kaip ir bakterijų II kompleksas sudarytas iš keturių baltymų ir penkių prostetinių grupių, prie baltymo yra tvirtai prijungtas fosfolipidas kardiolipinas. Subvienetai A ir B yra hidrofiliniai, išsid÷sto membranos paviršiuje ir nukreipti į užpildą, jie turi sukcinato surišimo centrą, prie histidino kovalentiškai prijungtą FAD ir tris Fe-S centrus. E.coli prie B subvieneto prijungti 3Fe-4S, 4Fe-4S ir 2Fe-2S. Šie hidrofiliniai baltymai sujungti su membranoje esančiais subvienetais C ir D. Jie yra integralieji baltymai turintys po 3 transmembraninius segmentus, prie kurių prijungtas hemas b, ir yra sritis sąveikaujanti su ubichinonu. Elektronai nukeliauja 4nm nuo sukcinato oksidacijos vietos FAD molekul÷je, per tris Fe-S centrus iki pasiekia KoQ. Hemas b tiesiogiai nedalyvauja pernešant elektronus, jis kontroliuoja aktyvių deguonies formų susidarymą.

Ubichinoną tiesiogiai gali redukuoti ir kiti substratai. Flavoproteinas acil-KoA dehidrogenaz÷, katalizuojantis pirmą riebalų rūgščių oksidacijos etapą, perneša elektronus nuo riebalų rūgščių per FAD ir elektronus pernešantį flavoproteiną ant KoQ. Glicerolio 3-fosfatas oksiduojamas glicerolio 3-fosfato dehidrogenaz÷s, tiesiogiai atiduoda elektronus KoQ. Fermentas išsid÷stęs ant mitochondrijų vidin÷s membranos išorin÷s pus÷s ir tuneliuoja elektronus KoQ. Glicerolio 3-fosfato dehidrogenaz÷ yra labai svarbi pernešant redukuojančius ekvivalentus nuo citozolinio NADH ant kv÷pavimo grandin÷s komponentų.

.

340

III kompleksas Ubichinono-citochromo c oksidoreduktaz÷ dar vadinamas citochromo bc1 kompleksu .

Kompleksas III katalizuoja KoQH2 oksidaciją citochromu c KoQH2 + 2cit c(oks.) 2cit c (red.) + KoQ + 2H+

∆E0/ 0.č09 V ∆G0/ -40,3 kJ mol-1 Elektronai nuo KoQH2 per citochromą b, Fe-S baltymus ir citochromą c1 keliauja ant

citochromo c. KoQH2 cit boks

KoQ cit bred

Fe2+-S

Fe3+-S

cit c1 oks

cit c1 redcit c oks

cit c red

III kompleksas katalizuoja KoQH2 oksidaciją iki KoQ ir citochromo c redukciją. Šios

reakcijos metu per membraną yra pernešami protonai. Kompleksas veikia kaip protonin÷ pompa per membraną pernešami 4 protonai. Protonų ir elektronų pernešimo kelias vadinamas Q ciklu jis bus išnagrin÷tas psl .

Mitochondrijų citochromo bc1 komplekso tretin÷ struktūra nustatyta 1998m. Ivatos (So Iwata) ir kolegų. Citochromo bc1 kompleksas yra dimeras, kiekvienas monomeras sudarytas iš 11 subvienetų, vieni yra integralieji baltymai, kiti paviršiaus.

341

. 12.7 pav. Citochromo bc1 komplekso (IIIkompleksas) monomeras. Sudarytas iš 11 skirtingų subvienetų. Citochromas b (žalias) prisijungęs du hemus bH ir bL

(raudoni), citochromas c1.(m÷lynas).

Kompleksas III membranoje išsid÷stęs asimetriškai. Citochromas c1 ir nehemin÷s geležies baltymas (dar vadinamas Riske geležies-sieros baltymas) yra membranos išorin÷je pus÷je nukreiptoje į tarpmembraninę ertmę, o citochromas b yra transmembraninis baltymas.

Komplekso funkcionuojančią šerdį sudaro trys baltymai: citochromas b, su dviem prijungtais hemais (bH ir bL), Riske geležies-sieros baltymas su 2Fe-2S centru ir citochromas c1. Citochrome b abu hemai bH ir bL yra surišti su ta pačia polipeptidine grandine, tačiau išsid÷sto skirtingose membranos pus÷se. Hemas bH yra membranoje arčiau užpildo, o hemas bL vidin÷je membranoje arčiau tarpmembranin÷s ertm÷s, jie turi skirtingus oksidacinius redukcinius potencialus ir skirtingus sugerties maksimumus. Hemo bH oksidacinis redukcinis potencialas aukštas ir jo sugerties maksimumas yra 562nm, o hemo bL oksidacinis –redukcinis potencialas žemas ir sugerties maksimumas yra 566nm, jie išskiriami kaip du citochromai -– citochromas b562 ir citochromas b566. Kompleksas III turi dvi skirtingas kofermentą Q surišančias sritis (QN ir QP). Antimicinas blokuoja elektronų pernešimą nuo hemo bH ant KoQ ir jungiasi QN sritimi, kuri yra arčiau vidin÷s membranos pus÷s. Miksotiazolas inhibuoja elektronų pernešimą nuo KoQH2 ant Riske geležies-sieros baltymo, jungiasi su QP centru, kuris yra arti 2Fe-2S centro ir hemo bL. Dimerin÷ komplekso struktūra yra būtina fermento veikimui dimero transmembraniniai α spiraliniai segmentai sudaro urvą, pro kurį nuo vieno surišimo centro prie kito. difunduoja ubichinonas

Citochromai yra baltymai, pernešantys elektronus ir savo sud÷tyje, turintys prijungtą hemą. Jie randami vidin÷je mitochondrijų, chloroplastų tilakoidų, bakterijų plazmin÷je

342

membranose. Yra trys pagrindin÷s citochromų klas÷s, besiskiriančios struktūra, sugerties spektrais, oksidaciniais-redukciniais potencialais, jie yra vadinami citochromas a (cit a), citochromas b (cit b) ir citochromas c (cit c). Citochromuose hemas a ir b yra tvirtai, bet nekovalentiškai prijungtas prie baltymo, c-tipo citochromuose, hemas c kovalentiniu ryšiu sujungtas su baltymo cisteino aminorūgštimi.

Citochromai a ir b tipo , bei kai kurie c tipo yra integralieji vidin÷s membranos baltymai. Mitochondrijose citochromas c yra paviršinis baltymas, elektrostatiniais ryšiais prijungtas prie vidin÷s membranos išorin÷s pus÷s.

Kiekvienoje citochromų grup÷je, skirtinga baltymin÷ hemo apsuptis sąlygoja sugerties spektro ir oksidacinio-redukcinio potencialo pokyčius.

N

N

N

N CH2CH2COOH

H3C

CH3

H3C

H3C

Fe

CH2CH2COOH

CH CH2

CH2 CH

Geležies protoporfirinas IX(b-tipo citochromuose)

N

N

N

N CH2CH2COOH

H3C

CH3

H3C

H3C

Fe

CH2CH2COOH

CHCH3

S-Cys

CH3CH

S-Cys

Hemas c(citochrome c)

N

N

N

N CH2CH2COOH

H3C

CH3

CHO

H3C

Fe

CH2CH2COOH

CH CH2

CHCH3

CH3 CH3CH3

OH

Hemas a(a-tipo citochromuose)

12.8 pav. Hemų b, c ir a struktūros. Kiekviena citochromų grup÷ turi porfirino žiedus su skirtingais pakaitalais. b-tipo

citochromų pagrindą sudaro protoporfirinas IX, kuris sutinkamas ir hemoglobine. Hemas a turi ilgą hidrofobinę uodegą sudarytą iš izopreno molekulių, taip pat viena metilo grup÷ pakeista formilo grupe. c-tipo citochromuose hemas yra kovalentiškai prijungtas prie baltymo. Baltymo cisteino merkaptogrup÷s sudaro tioesterinius ryšius su protoporfirino IX vinilo grup÷mis. Citochromuose a ir b hemo geležis yra susijungusi su dviem histidino liekanomis, tuo tarpu citochromo c geležis surišta su histidinu ir metioninu.

Citochromas c Yra periferinis membranos baltymas kuris silpnai prisijungęs prie mitochondrijų vidin÷s membranos išorin÷s pus÷s. Jis gali prisijungti arba prie komplekso III citochromo c1 arba prie citochromo c oksidaz÷s. Ir perneša elektronus tarp šių kompleksų.

343

IV kompleksas jis dar vadinamas citochromo c oksidaz÷. Šis fermentinis kompleksas yra galutinis kv÷pavimo grandin÷s komponentas, tai yra pagrindin÷ deguonies redukcijos vieta ląstel÷je.

Kompleksas IV katalizuoja molekulinio deguonies redukciją citochromu c, ant deguonies molekul÷s yra pernešami keturi elektronai ir keturi protonai, ir susidaro vanduo. Šios redukcijos metu nesusidaro laisvieji radikalai, tokie kaip superoksido anijono radikalas, vandenilio peroksidas ir kiti.

4cit c (red.) + 4H+ + O2 4cit c (oks.) + 2H2O

∆E0/ 0.566 V ∆G0/ -109,2 kJ mol-1

Žinduolių IV kompleksas yra didelis fermentinis kompleksas ( Mm = 204000 Da)

sudarytas iš 13 subvienetų. Jo struktūra nustatyta 1995m. Subvienetai I, II ir III yra koduojami mitochondrijų DNR. Šie subvienetai yra integralieji baltymai, kartu turi 18 transmembraninių segmentų. Membranoje IV kompleksas funkcionuoja kaip dimeras. Komplekso sud÷tyje yra citochromai a ir a3 bei du vario jonai CuA ir CuB. Hemas a, hemas a3 ir CuB yra susirišę su I subvienetu o CuA yra sujungtas su II subvienetu per dvi Cis ir dvi His liekanas

. 12.9 pav. Citochromo c struktūra. Citochromo oksidaz÷s veikimo mechanizmas šiuo metu yra vienas iš labiausiai

diskutuotinų. Elektronų pernešimas prasideda redukuotam citochromui c prisijungus prie išorin÷je membranos pus÷je esančio CuA centro ir redukavus jį. Elektronai nuo CuA pernešami ant hemo a ir ant hemo a3-CuB centro. Prijungta hemo a3 deguonies molekul÷ redukuojama keturiais elektronais ir keturiais protonais iki dviejų molekulių vandens. Tuo būdu, kiekvienai deguonies molekul÷s redukcijai iš užpildo yra paimami keturi protonai. Citochromo c oksidaz÷ taip pat veikia kaip protonin÷ pompa – pereinant keturiems elektronams nuo

cit aoks

cit ared

cit a3 red

cit a3 okscit c oks

cit c red O2

2 H2O

344

citochromo c keturi protonai keliauja iš užpildo į citozolį ir ant membranos sukuriamas protonų gradientas.

12.10 pav. Protonų pernešimas IV komplekse. Pernešant keturis elektronus, 8 protonai

paimami iš užpildo, 4 prijungiami prie deguonies ir 4 išnešami į tarpmembraninę erdvę. Citochromo c oksidaz÷ turi du protonus pernešančius kanalus. Vienu (K kelias)

protonai pernešami į deguonies redukcijos vietą, kitu (D kelias) vyksta transmembraninis protonų pernešimas. K-keliu protonai keliauja iki dvibranduolinio citochromo a3 -CuB centro, kur redukuojamas deguonis. Protonų pernešime dalyvauja aminorūgštys Lys 362, Tyr 288, esančios I subvieneto VI ir VIII tansmembranin÷se α spiral÷se. Tokių aminorūgščių liekanų, sujungtų vandeniliniai ryšiais, seka veikia kaip “protonų laidas”. D-keliu protonai pernešami per Asp132, Glu286 iš užpildo į citozolį.

12.3.2Oksidacinio fosforilinimo inhibitoriai Tiriant oksidacinio fosforilinimo mechanizmą, labai svarbų vaidmenį atliko inhibitorių

panaudojimas ir tyrimas. Inhibitoriais buvo nustatyta kv÷pvimo grandin÷s komponentų išsid÷stymas fermentiniuose kompleksuose, membraninio potencialo svarba ATP sintez÷je. Yra trys rūšys oksidacinio fosforilinimo inhibitorių:

1. Elektronų pernešimo inhibitoriai. 2. Oksidacinio fosforilinimo skyrikliai. 3. Fosforilinimo inhibitoriai.

Elektronų pernešimo inhibitoriai Tai yra įvairios struktūros medžiagos, kurios prisijungusios prie kv÷pavimo grandin÷s

komponentų inhibuoja elektronų pernešimą. Esant inhibitoriams substratų oksidacija nevyksta, deguonis neredukuojamas ir ATP n÷ra sintetinamas. Pirmą kv÷pavimo grandin÷s kompleksą inhibuoja amitalas (barbituratinis vaistas), rotenonas

OO

O

CH3OO

C

OCH3

CH3

CH2

rotenonas

NH

NH

OO

OCH2-CH2-CH(CH3)

CH2-CH3

amitalas(sint

etinamas augaluose, dažnai naudojamas kaip isekticidas), piericidinas A, kurie inhibuoja

345

elektronų pernašą nuo Fe-S ant ubichinono. Antimicinas A ir miksotiazolas blokuoja elektronų pernašą III komplekse tarp citochromo b ir citochromo c1. Citochromo c oksidazę inhibuoja cianidas, anglies monoksidas (CO), azidas.

O

OO

O

(CH2)5-CH3

O-CO-CH2-CH(CH3)2

CH3

CH3OH

NH-CHO

C NH

O

antimicinas A Skyrikliai . Elektronų pernaša ir ATP sintez÷ yra tampriai susiję. Nustatytos medžiagos, kurios

atskiria oksidaciją nuo fosforilinimo ir jos pavadintos skyrikliais. Elektronai pernešami kv÷pavimo grandine ant deguonies, tačiau ATP sintez÷ nevyksta. Skyrikliai yra silpnos, lipiduose tirpstančios rūgštys, padidinančios membranos pralaidumą protonams. Šiuo metu žinoma labai daug skyriklių, plačiausiai naudojami yra dinitrofenolis (DNF), karbonilcianido-p-trifluormetoksifenilhidrazonas (FCCP) ir kiti.

OH

NO2

NO2

DNF

CCC

NCF3

FCCP

NNH

NO

Chemiosmozin÷ oksidacinio fosforilinimo teorija paaiškina skyriklių veikimo

mechanizmą. Skyrikliai padidina vidin÷s mitochondrijų membranos pralaidumą protonams, sumažina elektrocheminį vandenilio jonų gradientą ir atskiria oksidaciją nuo fosforilinimo. Energija, sukaupta elektrocheminio vandenilio jonų gradiento formoje išsklaidoma šilumos pavidalu. DNF ir FCCP yra lipofilin÷s silpnos rūgštys, kurios lengvai pereina membraną protonizuotoje ir disocijuotoje formose. Jos prisijungia protonus toje membranos pus÷je kur vandenilio jonų koncentracija didel÷, difunduoja per membraną ir atiduoda protonus kitoje membranos pus÷je. Laisvas anijonas, būdamas tirpus lipiduose, grįžta per membraną atgal. Membranos elektrinis potencialas pagreitina šį procesą. Skyrikliai veikia labai mažose koncentracijose. Skyrikliai yra protonus transportuojantys jonoforai (protonoforai).

AH AH

membrana

A- A-

H+H+

12.9 pav. Skyriklių veikimo schema

346

Skyriklių tyrimas ir veikimo mechanizmo nustatymas daug prisid÷jo prie oksidacinio fosforilinimo mechanizmo įrodymo Fosforilinimo inhibitoriai

Fosforilinimo inhibitoriai blokuoja fermentą ATP sintazę. Jų poveikyje ATP sintez÷ nevyksta, o susidaręs elektrocheminis vandenilio jonų gradientas gali būti panaudojamas kitoms mitochondrijų funkcijoms vykdyti - jonų pernešimui, transhidrogenazinei reakcijai, atgaliniam elektronų pernešimui. Vienas iš plačiausiai naudojamų mitochondrijose oksidacinio fosforilinimo inhibitorių yra oligomicinas. Šis antibiotikas išskirtas iš Streptomyces inhibuoja ATP sintazę ir protonų pernešimą per membraną prisijungdamas prie F0 ir F1 jų sąlyčio riboje.

O

O

OO

CH3

CH2

O

O

O

CH3

CH3 CH3 CH3CH3

CH3CH3

OH OH

OH

OH

OCH3

CH2-CH3

CH3

N C N

C

Oligomicinas

Dicikloheksilkarbodiimidas

Dicikloheksilkarbodiimidas (DCK) inhibuoja protonų pernešimą per F0 reaguodamas su Glu aminorūgšties, esančios ATPsintaz÷s c subvienete, karboksigrupe.

12.3.3Rudųjų riebal ų mitochondrij ų pagrindin ÷ funkcija generuoti šilum ą Rudųjų riebalų fiziologin÷ funkcija yra gaminti šilumą. Rudųjų riebalų daug turi

gyvūnai, miegantys žiemos miegu. Šiame riebaliniame audinyje yra daug mitochondrijų, kurios d÷l esančių jose citochromų yra rausvai rudos spalvos. Žinduolių naujagimiai, ruduosius riebalus turi kaklo ir nugaros srityje, jie reikalingi nedrebulinei termogenezei. Energija, išsiskyrusi oksiduojantis substratams kv÷pavimo grandin÷je, n÷ra sukaupiama ATP pavidale, bet išsiskiria šilumos pavidalu.

Rudųjų riebalų mitochondrijų vidin÷je membranoje yra baltymas UCP 1 (uncoupling protein), jis dar vadinamas termogeninu, kuris palengvina protonų pernešimą per vidinę membraną. Šalčiui adaptuotose mitochondrijose, šis baltymas sudaro iki 15% vidin÷s membranos baltymų ir yra protonų kanalas. Protonų pernešimas per šį baltymą yra inhibuojamas purino nukleotidais (ADP, ATP, GDP, GTP). Kanalo atidarymą stimuliuoja laisvos riebalų rūgštys. Riebalų rūgščių koncentracija riebaliniame audinyje kontroliuojama adrenalino, kuris aktyvuoja lipazę. Žmogaus organizme rudųjų riebalų yra nedaug (išskyrus naujagimius), tačiau neseniai įvairių audinių mitochondrijose rasti baltymai UCP2, UCP3, kurie panašūs į rudųjų riebalų mitochondrijose esantį baltymą UCP1. Galvojama, kad šie baltymai gali tur÷ti įtakos angliavandenių, riebalų rūgščių oksidacijos greičiui audiniuose, o tai gali būti perspektyvu aiškinant nutukimo priežastis ir kovojant su juo.

347

12.4 ATP sintaz ÷ ATP sintaz÷ (F0F1-ATPaz÷) yra fermentinis kompleksas randamas vidin÷je

mitochondrijų, chloroplastų tilakoidų ir bakterijų plazmin÷je membranose. Jis katalizuoja grįžtamą fermentinę reakciją.

ADP + Pn + Hišor. ATP + Hvid.+ +

Pagrindin÷ fermento funkcija yra panaudojant elektrocheminį vandenilio jonų

gradientą, o kai kuriuose mikroorganizmuose Na+ jonų gradientą, sintetinti ATP iš ADP ir Pn. Reakcija yra grįžtama, yra bakterijų, kurios hidrolizuoja ATP ir sukurtą protonų gradientą naudoja medžiagų pernešimui per membraną.

ATP sintaz÷s yra išskirtos iš įvairių šaltinių, nustatytos jos struktūros kurios tarpusavyje panašios. Elektronin÷s mikroskopijos nuotraukose ant vidin÷s mitochondrijų membranos matomos grybo formos struktūros, kurios yra ATP sintaz÷. ATP sintaz÷ sudaryta iš dviejų dalių - membraninio F0 komplekso ir F1 esančio virš membranos nukreipto į mitochondrijų užpildą, bakterijų citoplazmą, tilakoidų išorę. Paveikus karbamidu, EDTA ir kitais reagentais F1 lengvai pašalinamas nuo membranos. Išskirtas F1 katalizuoja tik ATP hidroliz÷s, bet ne sintez÷s, reakciją. F0 yra protoninis kanalas, jis padaro vidinę mitochondrijų membraną laidžią protonams.

12.10 pav. Mitochondrijų (A) ir bakterijų (B) ATP sintaz÷s struktūra. F1 kompleksas sudarytas iš 5 skirtingų subvienetų α, β, γ, ε ir δ kurie yra susijungę į

kompleksą turintį tris α, tris β ir po vieną γ, δ ir ε subvienetus (α3β3γδε). Nukleotidai susiriša su β subvienetu ir fermento aktyvus centras yra sąlyčio riboje tarp α ir β subvienetų. Yra nežymūs skirtumai tarp bakterijų ir mitochondrijų ATP sintaz÷s. Mitochondrijose ATP sintaz÷ turi papildomus minorinius subvienetus. 1994 Volkeris (J.Walker) nustat÷ jaučio širdies mitochondrijų ATP sintaz÷s F1 komplekso, kurio molekulin÷ mas÷ 371 kDa tretinę struktūrą. Molekul÷s kurios diametras yra 10nm, o aukštis 8nm, forma yra sferin÷. F1 komplekse esantys 3α ir 3β subvienetai išsid÷sto vienas po kito kaip mandarino skiltel÷s. Centre yra 9nm ilgio γ subvieneto polipeptidin÷s grandin÷s α spiral÷. ε subvienetas prisijungęs prie γ subvieneto apatin÷s dalies. Mitochondrijose δ subvienetas prijungtas prie γ polipeptidin÷s grandin÷s, o bakterijų E.coli ATP sintaz÷je, δ subvienetas susirišęs su β subvienetu.

348

12.11 pav. Mitochondrijų ATP sintaz÷s α, β ir γ subvienetų struktūra ir nukleotidų

surišimo centrai. F0 sudarytas iš trijų subvienetų a, b ir c, kurie susijungę atitinkamai santykiu 1:2:9-12.

Kiekvienas c subvienetas turi 2 transmembraninius α spiralinius segmentus. Vieno iš membraninių segmentų viduryje yra dikarboksiaminorūgštis Glu (E.coli ) ar Asp (Saccharomyces cerevisiae). Kai baltymo karboksigrup÷ nukreipta į hidrofobinę membranos dalį ji yra nedisocijavusi (-COOH), o kada ji jungiasi su baltyminiu subvienetu a ji disocijuoja (–COO- ). Subvienetas a yra 5 transmembraninių segmentų integralusis baltymas. Dalis subvieneto b yra membranoje, kita hidrofilin÷ sritis jungiasi su β subvienetu.

12.5 Oksidacidacinio fosforilinimo hipotez ÷s Kaip energija išsiskyrusi oksiduojantis substratams kv÷pavimo grandin÷je yra

panaudojama ATP sintezei iš ADP ir Pn?. Pirmieji mokslininkai tyrę oksidacinio fosforilinimo mechanizmą pasiūl÷ cheminę oksidacinio fosforilinimo hipotezę. Glikoliz÷s procese, oksiduojantis glicerolio aldehido 3-fosfatui susidaro 1,3-bisfosfogliceratas, kuris yra didžiaenergis cheminis tarpininkas. Tariamas panašumas tarp 1,3-bisfosfoglicerato rūgšties sintez÷s ir oksidacinio fosforilinimo metu susidariusios ATP leido pasiūlyti cheminę oksidacinio fosforilinimo hipotezę, kuri teig÷, kad tarpin÷ energijos forma tarp oksidacijos ir fosforilinimo yra cheminis didžiaenergis junginys. Šis tarpinis didžiaenergis junginys yra toliau panaudojamas ATP sintezei iš ADP ir Pn. 1961m. Mitčelas (P.Mitchell) pasiūl÷ chemiosmozinę oksidacinio fosforilinimo hipotezę. (1978m. Nobelio premija ). Jis postulavo, kad elektronų pernešimas kv÷pavimo grandine yra susijęs su protonų išpumpavimu iš užpildo į tarpmembraninę erdvę, į citozolį. Ant vidin÷s mitochondrijų membranos sukuriamas elektrocheminis vandenilio jonų gradientas, kuris yra ATP sintez÷s varomoji j÷ga.

Oksiduojantis kv÷pavimo grandin÷je substratui AH2 redukuojamas substratas B. Šios oksidacijos redukcijos reakcijos metu per membraną yra pernešami protonai. Per membraną yra pernešamas protonas, kaip rūgšties ekvivalentas, tod÷l išorin÷ membranos pus÷ parūgšt÷ja, o vidin÷ pašarm÷ja, ant membranos sukuriamas pH gradientas (∆pH).

349

AH2

H+

H+

A

B BH2

ADP+Pn ATP

+ -H+ OH-

vidusišor÷

12.12 pav. Elektrocheminio vandenilio jonų gradiento susidarymo ant membranos

schema. Kadangi protonas turi teigiamą krūvį, tai išor÷je kaupiasi teigiamas, o viduje

neigiamas krūvis ir ant membranos sukuriamas elektrinių potencialų skirtumas (∆ψ). Tokiu būdu pernešant protoną, ant membranos sukuriamas elektrocheminis vandenilio jonų

gradientas (∆µΗ+-), jis dar vadinamas protoninis potencialas.

Laisvosios energijos pokytis (∆G), pernešant protonus per membraną prieš jų elektrocheminį gradientą, išreiškiama formule:

∆G = RTln (Cišor./Cvid.) + ZF∆ψ = 2.3RT [pH(vid.) -pH(išor.)] + ZF∆ψ = 2.3RT ∆pH + F∆ψ

kur Z yra pernešamo krūvio dydis, F - Farad÷jaus konstanta ir ∆ψ - membraninis potencialas. Kadangi pH(vid.) yra mažesnis nei pH(išor.) tai elektronų pernešimas iš užpildo yra reikalaujantis energijos procesas. Be to protonų pernešimas padaro vidinę membranos pusę neigiamesnę nei išorin÷ pus÷.

Mitčelas įved÷ protonovaros j÷gos (PVJ) sąvoką kuri yra oksidacinio fosforilinimo efektyvumo matas

-PVJ = ∆µH /F = [ ∆µH (vid.) - ∆µΗ (išor.) ] / F =

= (Ψ vid. - Ψ išor.) + RT/F ln([H+]vid./[H+] išor.) =

= ∆Ψ - (2.3RT/F)∆pH = ∆Ψ - Z∆pH

+ ++- -

PVJ = ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ - Z∆∆∆∆pH Taigi protonovaros j÷ga susideda iš dviejų komponenčių elektrin÷s (∆ψ) ir chemin÷s

(∆pH). Yra paskaičiuota, kad ATP sintezei reikalingos PVJ dydis turi būti apie 200mV.

Matuojant membraninį potencialą ant vidin÷s mitochondrijų membranos gauta apie 170mV (minus ženklas viduje). Užpildo pH yra apie 0.75 aukštesnis negu tarpmembranin÷je erdv÷je. Mitochondrijose pagrindin÷ PVJ sudedamoji dalis yra ∆ψ, o pavyzdžiui chloroplastuose ∆pH.

12.5.1Proton ų gradiento susidarymas Pernešant elektronus kv÷pavimo grandine, kompleksai I, III ir IV perneša atitinkamai

4, 4 ir 2 protonus iš užpildo per vidinę mitochondrijų membraną į tarpmembraninę erdvę. Protonų pernešimo mechanizmas, net tikslus pernešamų protonų skaičius n÷ra pilnai

350

išaiškintas. Yra pasiūlyta, kad protonų pernešimas vyksta dviem mechanizmais - redokso kilpos būdu ir veikiant protoninei pompai mechanizmas. Redokso kilpos mechanizmas pasiūlytas Mitčelo reikalauja, kad kv÷pavimo grandin÷s redokso centrai (FMN, KoQ, citochromai) turi membranoje būti išsid÷stę taip, kad elektronai ir protonai prijungiami užpildo pus÷je, o atiduodami priešingoje membranos pus÷je. Per membraną turi būti pernešami protonai ir elektronai. Sunku paaiškinti elektronų ir protonų pernešimą per membraną nes membranoje yra 15 tikrų elektronų nešiklių (8 Fe-S baltymai, 5 citochromai ir 2 Cu atomai), ir tiktai du H+ ir elektronų nešikliai (FMN ir KoQ).

Protonin÷ pompos mechanizmas aiškina, kad kv÷pavimo grandin÷s baltymai ir kofaktoriai, panaudodami energiją, išsiskyrusią pernešant elektronus perneša ir protonus Manoma, kad kompleksai I III ir IV veikia kaip protonin÷s pompos. Vienas iš geriausiai paaiškintų yra protonų pernešimas per III kompleksą.

Ubichinolo oksidacijos mechanizmas Yra parodyta, kad elektronų pernešimas nuo KoQH2 ant citochromo c yra susijęs su protonų pernešimu per membraną. Mitčelas pasiūl÷ šio pernešimo mechanizmą kuris buvo pavadintas Q-ciklas. Centrin÷ Q-ciklo reakcija yra elektronų kelio išsišakojimas - oksiduojantis KoQH2, vienas elektronas yra pernešamas “aukšto potencialo grandine” per Riske geležies sieros (2Fe-2S) baltymą ir citochromą c1 ant citochromo c. Susidaro semichinonas (KoQH*) ir nuo jo antras elektronas perduodamas hemui bL . bL yra oksiduojamas kitoje membranos pus÷je esančio hemo bH. Tuo būdu, elektronas pernešamas skersai membranos. Oksiduojantis KoQH2 protonai atsipalaiduoja į tarpmembraninę erdvę. Hemas bH yra ubichinolo redukcijos srities (QN) dalis. Šioje srityje hemas bH redukuoja ubichinolą iki ubichinono. Inhibitorius antimicinas jungiasi QN srityje ir blokuoja elektrono pernešimą ant KoQ. KoQ yra redukuojamas prijungiant vieną elektroną nuo bH, o kitas elektronas ateina iš komplekso I. Protonai prie KoQ prijungiami iš užpildo pus÷s, KoQH2 difunduoja per membraną ir perneša protonus.

citc1bL

bH

KoQH2

KoQH2

KoQH*

KoQ

KoQ2Fe-2S

citc

Fe-S e

e

2e

e

ee e

ee

H+

H+

Užpildas

Tarpmembranin÷erdv÷

12.13 Q – ciklas. Protonų gradiento susidarymas pernešant elektronus bc1 kompleksu.,

12.6 ATP sintez ÷s mechanizmas 1. Bojeris pasiūl÷ surišimo mainų ATP sintez÷s mechanizmą. Jis postulavo, kad

ATP sintez÷s metu cikliškai keičiasi ATP sintaz÷s konformacija, kintant konformacijai prie fermento jungiasi ADP, Pn ir sintetinama ATP..

Tiriant izotopų mainų reakciją tarp žym÷to vandens ir ATP buvo parodyta, kad

reakcija ADP + H3PO4 ATP + H2O su išvalytu F1 yra grįžtama. Reakcijos ∆G0/ yra artimas nuliui.

351

Hidrolizuojant surištą su F1 ATP žym÷tu deguonies izotopu (O18 ) vandeniu, deguonies izotopas įsijungia į fosfato molekulę. Išmatavus O18 kiekį, pasirod÷, kad fosfato molekul÷je yra ne vienas, o trys ir net keturi O18 atomai. Tai rodo, kad hidroliz÷s reakcija yra grįžtama, galinis fosfoesterinis ryšys tarp β ir γ fosfatų ATP molekul÷je, surištoje su F1 hidrolizuojasi ir v÷l sintetinamas. Kiekvieno iš šio ciklo metu O18 atsitiktinai įsijungia į vieną iš keturių deguonies pozicijų.

PO

O

O

O18

18

18

18

Ši mainų reakcija vyksta ir su neenergizuotu F0F1 kompleksu. Surišto su fermentu ATP hidroliz÷s reakcijos greičio konstanta k+1 lygi 10s-1, ADP susijungimo su Pn sintez÷s reakcijos k-1 lygi 24s-1.

Fermentas -ATP Fermentas - (ADP + Pn) k+1

k-1 Reakcijos greičio pusiausvyros konstanta yra 2,4 ir apskaičiuotas ∆G0/ yra artimas

nuliui. ATP hidroliz÷s vandenyje pusiausvyros konstanta yra 105 . Šis didelis skirtumas

susidaro d÷l to, kad ATP sintaz÷ (F1 subvienetas) prijungia ir labai stipriai stabilizuoja ATP molekulę. ATP surišimo su F0F1 konstanta Kd ≤ 10-12 M, tuo tarpu ADP surišimo su F0F1 konstanta tiktai Kd ≤ 10-5 M. Šis pusiausvyros konstantų skirtumas atitinka 40kJ/mol surišimo energijos. Ši surišimo energija yra ATP sintez÷s varomoji j÷ga, ji nukreipia pusiausvyrą į ATP sintez÷s, o ne į hidroliz÷s pusę.

ATP susidarymo surišimo mainų hipotezę pasiūl÷ Bojeris (P.Boyer). Bojeris ir bendradarbiai parod÷, kad priešingai nusistov÷jusiai nuomonei, ATP sintezei iš ADP ir Pn energija nereikalinga, energija panaudojama pašalinti ATP iš baltymo molekul÷s.

Bojeris pasiūl÷, kad F1 kompleksas turi tris sąveikaujančius tarpusavyje katalizinius protomerus, esančius skirtingose konformacijose. Vienas jų silpnai suriša ADP ir Pn ( būvis L - loose), kitas stipriai suriša ATP (būvis T - tight) ir trečias, kuris nesuriša nei substratų, nei produktų (būvis O - open). Energija, išsiskyrusi pernešant protonus per membraną, yra panaudojama vieną konformacinį būvį paversti kitu. Fosfoanhidridinis ryšys susidaro ir ATP sintez÷ vyksta tiktai T būvyje, o susintetinta ATP atsipalaiduoja iš O būvio. Reakcija susideda iš trijų etapų:

1. ADP ir Pn prisijungia prie F1 esančio L būvyje. 2. Protonų gradiento energija pakeičia baltymo subvienetų konformaciją - L būvis

pereina į T, T būvis, prie kurio tvirtai buvo prijungta ATP, pereina į O būvį, ir O būvis pereina į L būvį. Šių būvių konformacijų kitimai vyksta sinchroniškai.

3. ATP iš O būvio disocijuoja nuo fermento aktyvaus centro. Susirišęs su T būviu ADP ir Pn reaguoja tarpusavyje susidarant ATP. Protoninio gradiento energija panaudojama konformaciniams pasikeitimams ir palengvina naujai sintezuotos ATP molekul÷s pasišalinimą iš baltymo.

352

12.14 pav. ATP sintez÷s surišimo mainų hipotez÷. L būvis silpnai suriša ADP ir Pn, T – būvis stipriai suriša ATP, ir O – būvis nesuriša nei nukleotidų nei fosfato.

. F1-ATPazei būdinga asimetrin÷ struktūra, kiekvienas katalizinis β subvienetas gali įgauti tris skirtingas konformacijas. Volkeris (J.Walker ) nustat÷ buliaus širdies mitochondrijų F1 tretinę struktūrą ir parod÷, kad β subvieneto konformacijos skiriasi prijungus prie baltymo nehidrolizuojamą ATP analogą (AMP-PNP), ADP ar palikus β subvieneto aktyvų centrą tuščią. Tai atitinka Bojerio pasiūlytus O, L ir T būvius.

Kaip vyksta šis konformacijų pasikeitimas. Buvo atlikti eksperimentai, kurie parod÷, kad molekul÷s viduryje esantis γ subvienetas sukasi α ir β subvienetų atžvilgiu. α3β3γc kompleksas savo F1 srimi buvo imobilizuotas ant stiklo plokštel÷s. Prie c subvieneto kovalentiniu ryšiu buvo prijungtas fluorescuojančiu dažu pažym÷tas aktino filamentas. Vykstant ATP hidrolizei, keit÷si α ir β subvienetų konformacija, ir pasuko γ subvienetą. Kadangi γ subvienetas susijungęs su c subvienetais, tai ir aktinas prad÷jo suktis. Sukimasis vyksta kvantuotai, hidrolizuojantis vienai ATP molekulei aktinas pasisuka per 1200.

12.15 pav. ATP hidroliz÷s panaudojimas γ ir c subvienetų sukimui. Šiais eksperimentais parodyta kad ATP hidroliz÷s energija naudojama γ subvieneto

sukimuisi. Natyvioje sistemoje reakcija turi vykti priešinga kryptimi, sukantis γ subvienetui vyksta ATP sintez÷. Šis teiginys buvo patvirtintas ir parodyta, kad γ subvieneto sukimasis susijęs su ATP sinteze. Ant stiklo plokštel÷s per β subvienetą buvo pritvirtintas α3β3γ subvienetas. Prie γ subvieneto buvo prijungta magnetin÷ dalel÷, ir ji magneto pagalba buvo sukama.. Sukdamasis γ subvienetas sąveikauja su β subvienetais ir kečia jų konformaciją ir buvo užregistruota ATP sintez÷. Šis eksperimentas vienareikšmiškai parod÷, kad ATP sintetinama sukant γ subvienetą.

353

12.16 pav. ATP sintez÷, kuri sukeliama sukant γ subvienetą. Prie γ subvieneto prijungta magnetin÷ dalel÷, kuri magneto pagalba buvo sukama.

Kaip mitochondrijose sintetinama ATP? Oksiduojantis substratams kv÷pavimo grandin÷je ant vidin÷s mitochondrijų membranos sukuriamas protonų gradientas. Protonams grįžtant per ATP sintazę sintetinama ATP. Kiekviena c molekul÷ membraną perveria du kartus sudarydama porą antilygiagrečių transembraninių α spiralių. Dvylika baltymo c molekulių sudaro žiedą, kurio dalis yra apsupta baltymo a, o kita dalis sąveikauja su hidrofobiniu membranos dvisluoksniu. Karboksigrup÷s (aminorūgšties Asp) žiedo viduje nukreiptos į fosfolipidinę šerdį yra protonizuotos. Tos karboksigrup÷s, kurios kontaktuoja su baltymu (šiuo atveju su a) yra disocijavusios ir turi neigiamą krūvį. Subvienete a yra du puskanaliai, nukreipti į priešingas membranos puses, per kuriuos keliauja protonai. Protonai iš vidin÷s membranos pus÷s, kur jų koncentracija didel÷, per puskanalį prieina prie c subvieneto karboksigrup÷s ir ją protonizuoja. Prisijungus protonui, žiedas pasukamas ir prie antro puskanalio ateina kito c subvieneto karboksigrup÷. Ji disocijuoja ir protonai per kanalą išeina į kitą membranos pusę. Šis protonų srautas suka žiedą, sudarytą iš c subvienetų.

12. 17 pav. Protonų gradiento panaudojimas c subvieneto sukimui ir ATP sintezei.

Protonai pereidami per c subvienetą jį suka, kartu sukasi ir γ subvienetas. Šis žiedas yra rotorius, kuris sukasi membranoje. a subvienetas yra kaip statorius,

kurio 5 transmembraniniai segmentai membranoje sudaro du puskanalius - vienu protonai ateina iki c subvieneto karboksigrup÷s iš vienos membranos pus÷s, kitu protonai nuo karboksigrup÷s išeina į kitą membranos pusę. Šis protonų srautas suka c subvienetus membranoje. γ subvienetas susijungęs su c subvienetais ir sukantis c subvienetui sukasi ir γ subvienetas. b subvienetas turi vieną transmembraninį segmentą ir ilgą hidrofilinę “ranką” kuri prisijungia prie α irβ subvienetų.

Statoriaus vaidmenį atlieka α3 ir β3 subvienetai, kurie surišti su membranoje esančiais a ir b baltymais. Rotorius yra c subvienetai susijungę su γ ir ε subvienetais. Tokiu būdu ATP sintaz÷ veikia kaip mašina protonų srautas suka baltyminius subvienetus, keičiasi konformacija ir atsipalaiduoja ATP.

12.7 Membranin ÷s pernešimo sistemos Protonovaros j÷ga panaudojama aktyviam medžiagų pernešimui per membraną

Pagrindin÷ oksidacinio fosforilinimo metu susidariusio elektrocheminio vandenilio jonų gradiento funkcija yra sintetinti ATP. Tačiau ji gali būti panaudojama ir įvairių medžiagų pernešimui per vidinę mitochondrijų membraną. Kaip jau buvo min÷ta, membrana yra nepralaidi hidrofilin÷ms medžiagoms, tokioms kaip H+, OH-, fosfato jonams, karbonin÷ms rūgštims, ATP, ADP ir eilei kitų medžiagų.

354

12.7.1ATP-ADP pernešimas ATP sintetinamas užpilde jis panaudojamas citozolyje, tod÷l turi būti išnešamas iš

mitochondrijų. Vidin÷je membranoje yra adeninnukleotidų translokaz÷, kuri išorin÷je vidin÷s membranos pus÷je prisijungia ADP3- ir perneša į vidų mainais į vidumitochondrinę ATP4-. Kadangi antiporteris keičia keturis krūvius į tris, tai šį procesą greitina membraninis potencialas. Teigiamas krūvis esantis membranos išor÷je yra ATP transporto varomoji j÷ga.

Adeninnukleotidų translokaz÷ yra specifiškai inhibuojama toksinio glikozido atraktilozido ir bongkrekin÷s rūgšties.

Kita transportin÷ sistema būtina ATP sintezei yra fosfato nešiklis, kuris perneša vieną H+ ir vieną H2PO4

- į užpildą pagal pH gradientą.

ATP4-

ADP3-

ATP4-

ADP3-

H+ H+

H2PO4-H2PO4

-

H+H+

MatriksasTarpmembranin÷erdv÷

Adenin-nukleotidųtranslokaz÷

ATP sintaz÷

Fosfato translokaz÷

vidin÷mitochondrijų membrana

12.16. pav. Vidin÷s mitochondrijų membranos pernešimo sistemos perneša ADP, ATP, fosfatą.

12.7.2 Citozolinio NADH pernešimo sistemos Vidin÷ mitochondrijų membrana yra nepralaidi NADH. Daugiausiai kv÷pavimo

grandin÷je oksiduojamas NADH susidaręs užpilde trikarboksirūgščių ciklo metu. Kaip panaudoti glikoliz÷s metu susidariusi NADH ir kaip jį regeneruoti? Vidin÷je mitochondrijų membranoje yra specialios “šaudyklin÷s” sistemos, kurios perneša citozolinį NADH į užpildą. Viena iš aktyviausias yra malato-aspartato šaudykl÷, veikianti kepenyse, inkstuose ir širdies raumenyse. Redukuojantys ekvivalentai nuo NADH citozolyje yra perduodami ant oksalacetato ir susidaro malatas. Reakciją katalizuoja citozolin÷ malato dehidrogenaz÷. Malatas pernešamas per membraną malato−α−ketoglutarato pernešimo sistemos. Užpilde elektronai ir protonai nuo malato pernešami ant NAD+ susidarant NADH, kuris jau oksiduojamas kv÷pavimo grandin÷je. Oksaloacetatas regeneruojamas peramininimo reakcijos metu, peramininimo reakcijos metu iš oksalacetato susidaręs aspartatas pernešamas glutamato-aspartato transporterio atgal į citozolį. Citozolyje iš aspartato regeneruojamas oksalacetatas.

355

malatas malatas

oksaloacetatas oksaloacetatas

aspartatas aspartatas

glutamatasglutamatas

α-ketoglutaratasα-ketoglutaratas

NAD+

NADH +H+NADH + H+

NAD+

aspartatoaminotransferaz÷

aspartatoaminotransferaz÷

malatodehidrogenaz÷

malatodehidrogenaz÷

glutamatoaspartatonešiklis

matriksascitozolis

12.17 pav. Redukuojančių ekvivalentų pernešimas nuo NADH malato-aspartato šuntu Skeleto raumenyse ir smegenyse, vabzdžių mitochondrijose yra kito tipo NADH

šaudykl÷ - glicerolio 3-fosfato šaudykl÷. Ji skiriasi nuo aspartato-malato šaudykl÷s tuo, kad NADH tiesiai atiduoda redukuojančius ekvivalentus FAD esančiame III komplekse esančiame išorin÷je mitochondrijų vidin÷s membranos pus÷je, tod÷l elektronai pernešami ant KoQ ir sintetinamos tiktai 1,5 ATP molekul÷s.

NADH + H+

NAD+

Dihidroksiacetonofosfatas

Glicerolio3-fosfatas

FADH2

FAD

KoQ MatriksasCitozolis

Vidin÷ membrana

Citozolin÷ glicerolio 3-fosfatodehidrogenaz÷

Mitochondrin÷ glicerolio 3-fosfatodehidrogenaz÷

12.18 pav. Redukuojančių ekvivalentų pernešimas glicerolio 3-fosfato šuntu.

12.8 ATP sintez ÷s stechiometrija. Vienos ATP molekul÷s sintezei ATP sintaz÷ sunaudoja 3 protonus. Dar vienas

protonas reikalingas adeninnukleotidų translokazei pernešant ATP iš užpildo į citozolį. Tradiciškai susidariusių ATP molekulių skaičius, redukuojant vieną deguonies

molekulę, išreiškiamas sveikais skaičiais. Buvo skaitoma, kad oksiduojant vieną molį NADH gauname 3,0 molius ATP, o oksiduojantis vienai gintaro rūgšties molekulei sintetinamos 2,0 molekul÷s ATP.

356

Apskaičiuota, kad pernešant du elektronus nuo NADH ant KoQ ir nuo KoQH2 ant citochromo c iš užpildo į citozolį pernešami po 4 protonai. Kompleksas IV pumpuoja tiktai 2 protonus. Viso oksiduojantis NADH per membraną pernešami 10 protonų, o oksiduojant sukcinatą – šeši. Kadangi vienos ATP molekul÷s sintezei reikia 4 protonų, tai oksiduojantis NADH susidaro 2,5 ATP , o sukcinatui – 1,5 ATP.

Kiek molių fosforilinama ADP redukuojant vieną molį deguonies atspindi P/O santykis (P/O = 2,5 arba 1,5 oksiduojant atitinkamai NADH ar sukcinatą).

Trikarboksirūgščių ciklo metu susidaro 3NADH, 1 FADH2, 1GTP (ATP). Piruvato dehidrogenazin÷s reakcijos metu išsiskiria 1 NADH. Glikoliz÷s metu susidaro 2 NADH ir 2 ATP.

12.2 lentel÷. Susidariusio ATP (mol) kiekis oksiduojantis 1mol gliukoz÷s Procesas Susidaręs produktas Susidariusio ATP kiekis Glikoliz÷ 2 NADH (citozolyje)

2 ATP 3 arba 5* 2

Piruvato oksidacija (2 molekul÷s)

2 NADH 5

Acetil-KoA oksidacija trikarboksirūgščių cikle (2 molekul÷s)

6 NADH 2 FADH2 2 ATP ar 2 GTP

15 3 2

Bendras ATP kiekis 30 ar 32* * Skaičius priklauso kokiu keliu redukciniai ekvivalentai pernešami į mitochondrijų

užpildą (malato-aspartato ar glicerolio 3-fosfato šaudykle). Aerobinio gliukoz÷s metabolizmo metu oksiduojantis vienam moliui gliukoz÷s

susidaro 30 arba 32 moliai ATP. C6H12O6 + 30(32)ADP + 30(32)Pn + 6O2

6CO2 + 44H2O + 30(32)ATP

12.9 Oksidacinio fosforilinimo reguliacija Oksidacinio fosforilinimo greitis priklauso nuo substratų buvimo ir nuo energijos

poreikio. Pagrindiniai substratai yra redukuoti nukleotidai NADH ir FADH2 , oksidatorius, O2 ir fosforilo grup÷s akceptorius ADP (fosfatas n÷ra limituojanti medžiaga). Esant nepakankamam ADP kiekiui, elektronų ir protonų pernešimo greitis sul÷t÷ja ir kai substratų oksidacijos energijos neužtenka pernešti protonus prieš jų koncentracijos gradientą, visai sustoja. Atsiradus ADP jis fosforilinamas, protonai grįžta į užpildą ir substratų oksidacijos greitis išauga. Deguonies sunaudojimo greičio santykis, esant ir nesant ADP yra vadinamas kv÷pavimo kontrol÷s koeficientu ir yra oksidacinio fosforilinimo efektyvumo matas.

Viduląstelin÷ ADP koncentracija yra vienas iš ląstel÷s energetinio būvio rodiklių. Kitas yra [ATP]/[ADP][Pn] santykis. Paprastai jis yra aukštas, tai rodo, kad ADP yra pilnai fosforilina. Jeigu ATP sąnaudos padid÷ja (suaktyv÷ja sintez÷s, pagreit÷ja medžiagų pernešimas per membranas), ATP koncentracija sumaž÷ja ir padid÷ja ADP ir Pn. Kadangi ADP yra oksidacinio fosforilinimo substratas, pagreit÷ja kv÷pavimas ir santykis atsistato. Substratų oksidacijos ir oksidacinio fosforilinimo greitis yra taip reguliuojamas, kad įvairiuose audiniuose santykis [ATP]/[ADP][Pn] nežymiai kinta net drastiškai varijuojant energijos sąnaudoms.

ATP/ADP santykis įtakoja netiktai oksidacinio fosforilinimo procesą, bet ir trikarboksirūgščių ciklą, glikolizę, piruvato oksidacinį dekarboksilinimo. ADP aktyvuoja fosfofruktokinazę I, piruvato kinazę, citrato sintazę, izocitrato dehidrogenazę. ATP yra alosterinis fosfofruktokinaz÷s 1 ir piruvato dehidrogenaz÷s inhibitorius.

357

12.10 Aktyvios deguonies formos/ skyrius pildomas i r taisomas/ Mitochondrijos yra labai svarbios organizmui atsakant į oksidacinį stresą. Deguonis

yra redukuojamas citochromo c oksidaz÷s pernešant keturis elektronus ant deguonies ir susidarant vandeniui. Tačiau yra keli etapai, kuriuose gali susidaryti laisvieji radikalai. Pernešant elektronus nuo III komplekse KoQH2 ant citochromo bL , I komplekse redukuojant KoQ, bei atgalinio elektronų pernešimo metu susidaro KoQ semichinonas, galintys pernešti tiktai vieną elektroną ant deguonies ir gauname chemiškai aktyvų superoksido radikalą. Iki 4% nuo panaudoto deguonies gali sudaryti superoksidas.

Ląstel÷se yra efektyvi apsauga nuo aktyvių deguonies formų. Superoksido dismutaz÷ katalizuoja dviejų superoksido anijonų susijungimą į deguonies molekulę.

2 O2 + 2H+

- H2O2 + O2

.

Reaktyvus vandenilio peroksidas veikiant katalazei suskaidomas iki vandens arba katalizuojant glutationo peroksidazei panaudojamas glutationo oksidazei. Glutationo peroksidaz÷je cisteino aminorūgštyje sieros atomas merkaptogrup÷je yra pakeistas Se. Trūkstant organizmui seleno, susilpn÷ja jo antioksidacin÷s sistemos, padid÷ja aktyvių deguonies formų kiekis.

358

13 FOTOSINTEZö Gyvyb÷ žem÷je priklauso nuo saul÷s šviesos energijos. Augalai, dumbliai, kai kurios

bakterijos transformuoja saul÷s šviesos energiją į cheminių ryšių energiją. Šis procesas vadinamas fotosintez÷. Tiktai apie 1% iš į žemę patenkančios energijos yra paverčiamas į cheminių ryšių energiją, yra sintetinamos organin÷s medžiagos. Augalai, melsvabakter÷s, panaudodamos saul÷s šviesos energiją iš CO2 ir H2O sintetina angliavandenius, kuriuos heterotrofai panaudoja kaip energijos šaltinį.

6CO2 + 6H2O C6H12O6 + 6O2

šviesa

Fotosintez÷s metu susidarę angliavandeniai yra energijos šaltinis heterotrofiniams

organizmams. Yra nustatyta, kad per metus fotosintez÷s metu fiksuojama per 1011 t anglies, tokiu būdu sukaupiama 1018 kJ energijos. Fotosintez÷ yra pagrindinis deguonies šaltinis žem÷s atmosferoje.

13.1 Chloroplast ų strukt ūra Fotosintez÷ eukariotuose vyksta chloroplastuose. Ląstel÷se chloroplastų yra nuo 1 iki

1000, jų forma artima elipsoidui.

13.1 pav. Chloroplastų struktūra. Chloroplastai apgaubti dviem membranomis, kuri pralaidi CO2 ir O2. Panašiai kaip

mitochondrijose, chloroplastų išorin÷ membrana yra pralaidi nedidel÷s molekulin÷s mas÷s junginiams, o vidin÷s membranos laidumas yra labai mažas. Vidin÷ membrana gaubia stromą, kurioje yra angliavandenių biosintez÷s fermentai, DNR, RNR, ribosomos, sintetinami kai kurie chloroplastų baltymai. Stromoje yra trečia membranin÷ struktūra - tilakoidai . Tilakoidų vidin÷ ertm÷ vadinama liumenu. Per tilakoidų membraną į liumeną yra pernešami protonai, sukurtas protonų gradientas naudojamas ATP sintezei. Tilakoidai yra viena labai smarkiai sulankstyta pūslel÷, sudaranti struktūras panašias į sukrautus vieną ant kito suplotus maišus, kurios vadinamos granomis, granas jungia plokščios membranin÷s struktūros vadinamos lamelomis. Fotosintetin÷s bakterijos neturi chloroplastų, jose fotosintez÷ vyksta plazmin÷je membranoje arba chromatoforuose - pūslel÷se susidariusiose išlinkus plazminei membranai. Augaluose vykstančioje fotosintez÷je gali išskirti dvi fazes

1. Šviesin÷ stadija, kurios metu panaudojant saul÷s šviesos energiją susidaro NADPH, ATP ir O2.

2. Tamsin÷ stadija - panaudojant šviesin÷s stadijos metu susidariusius NADPH ir ATP, CO2 yra redukuojamas iki angliavandenių.

Šviesin÷ stadija vyksta tilakoidų membranoje ir procesas panašus į mitochondrijose vykstantį elektronų pernešimą ir į oksidacinį fosforilinimą. Tamsin÷ stadija vyksta stromoje.

359

13.2 Šviesin ÷ fotosintez ÷s stadija 1931 Cornelis van Niel parod÷, kad anaerobin÷s žaliosios fotosintetin÷s bakterijos H2S

naudoja kaip elektronų ir protonų donorą ir išskiria sierą

CO2 + 2H2S (CH2O) + 2S +H2Ošviesa

Panašumas tarp H2O ir H2S leido van Niel suformuluoti bendrą fotosintez÷s reakciją

CO2 + 2H2A (CH2O) + 2A + H2O šviesa

vandenilioakceptorius

vandeniliodonoras

redukuotasakceptorius

oksiduotas donoras

Augaluose ir melsvabaktar÷s vandenilio donoras yra H2O, o fotosintetin÷se bakterijose H2S, izopropanolis, sukcinatas ir kiti oksiduojami substratai. Buvo pasiūlyta, kad fotosintez÷ yra dviejų stadijų procesas, pirmame etape saul÷s energija panaudojama H2A oksidacijai, o susidarę aktyvuoti vandeniliai [H] antrame etape redukuoja CO2.

1937m. Hilas (R.Hill) parod÷, kad apšvietus chloroplastus nesant CO2 ir redukuojant dirbtinį elektronų akceptorių fericianidą [Fe(CN)6

3-], išsiskiria O2. Ši taip vadinama Hilo reakcija rodo, kad deguonies susidarymui CO2 nereikalingas. Naudojant deguonies izotopą 18O galutinai buvo parodyta, kad deguonis susidaro iš vandens. Anglies dioksido redukcija ir angliavandenių biosintez÷ gali vykti ir tamsoje, šį procesą katalizuoja daug fermentų ir susidaro eil÷ tarpinių junginių. Naudojant žym÷tą anglies izotopą 14C Kalvinas (M.Calvin) nustat÷ šį sud÷tingą angliavandenių biosintez÷s kelią, kuris buvo pavadintas Kalvino ciklu.

1954m. Arnonas (D.Arnon) su bendradarbiais atrado, kad augalai sintetina ATP saul÷s energijos d÷ka, šis procesas pavadintas fotofosforilinimu.

13.2.1Šviesos sugertis. Fotosintez÷s procesas prasideda nuo saul÷s šviesos sugerties. Šiame šviesos energijos

transformacijos į cheminę energiją etape dalyvauja įvairūs pigmentai - chlorofilai, karotinoidai, fikoeritrobilinai, fikocianobilinai. Pagrindinis šviesos akceptorius yra pigmentas chlorofilas. Jis sugeria 400-500nm (violetin÷, m÷lyna) ir 650-700nm (oranžin÷, raudona) elektromagnetines bangas.

Chlorofilo sugerties spektras atitinka fotosintez÷s veikimo spektrą, tai dar kartą įrodo, kad chlorofilas yra pagrindinis fotosintez÷s pigmentas. Yra kelios chlorofilo formos, kurios skiriasi savo struktūra, sugerties spektrais.

Chlorofilas yra ciklinis tetrapirolas sintetinamas iš protoporfirino IX, yra panašus į hemą esantį hemoglobine ir citochromuose. Tačiau chlorofilas skiriasi nuo hemo keliais aspektais:

1. Centrinis metalo jonas yra Mg2+ o ne geležis. 2. Jis turi ciklopentanono žiedą (V), kuris sulietas su pirolo III žiedu. 3. IV pirolo žiedas chlorofilo a (Chl a) ir chlorofilo b (Chl b) molekul÷je yra dalinai

redukuotas. Bakteriochlorofilo a (BChl a) ir bakteriochlorofilo b (BChl b) molekul÷se dalinai redukuoti yra II ir IV žiedai.

4. IV žiedo propionilo šonin÷ grup÷ yra esterifikuota tetraizoprenoidiniu alkoholiu. Chl a, b ir BChl b tai yra fitolis, o BChl a priklausomai nuo bakterijų rūšies gali būti fitolis arba geranilgeranilas.

Chl a ir Chl b yra pagrindiniai augalų ir melsvabakterių pigmentai, o bakteriochlorofilai randami bakterijose.

360

CH3

H3C

H3C

MgR1

II

I III

R2 R3

C O

O

CH3

CH2

N

N

N

N

O

HCH2

CO

O R4

IVV

Chlorofilas a -CH=CH2 -CH3 -CH2-CH3 FChlorofilas b -CH=CH2 -CHO -CH2 -CH3 FBakteriochlorofilas a -CO-CH3 -CH3

a -CH2-CH3a F ar G

Bakteriochlorofilas b -CO-CH3 -CH3a =CH - CH3a F

a neturi dvigubos jungties tarp 3 ir 4 anglies atomų

F -CH2

3 4

Fitilo šonin÷ grandin÷

G -CH2

Geranilgeranilo šonin÷ grandin÷

R1 R2 R3 R4

13.2 pav. Chlorofilų molekulių formul÷s.

13.2.2Chlorofilo vaidmuo fotocheminiame akte Chlorofilo molekul÷ sugeria šviesą ir elektronas iš pagrindinio lygio pereina į

aukštesnį į sužadintą. Kadangi pigmento molekul÷ yra stipriai konjuguota, chlorofilas sugeria šviesą matomoje spektro dalyje. Chlorofilų molin÷s ekstinkcijos koeficientas yra apie 105 M-1 cm-1, tai yra vienas didžiausių organinių molekulių tarpe.

Sužadinta molekul÷ išsklaido sužadinimo energiją įvairiais būdais: a) vidin÷ konversija, energija pereina į molekul÷s jud÷jimo kinetinę

energiją ir išsiklaido šilumos pavidalu. Šis procesas yra labai greitas ir trunka <10-11

s. b) fluorescencija, sužadinta molekul÷ grįžta į pagrindinį būvį iš žemesnio

lygmens išlaisvindama fotoną. Chlorofilo molekul÷ išspinduliuoja ilgesnių bangų šviesą jo tirpalas fluorescuoja raudona šviesa. Procesas vyksta per ~10-8 s

361

c) eksitono pernešimas (rezonansin÷s energijos pernešimas). Sužadinta molekul÷ tiesiogiai perneša energiją eksitono pavidalu greta esančiai chlorofilo molekulei. Energija pereina betarpiškai sąveikaujant molekulių orbital÷ms. Eksitonų pernešimas labai svarbus pernešant fotonų energiją tarp atskirų pigmento molekulių antenos komplekse ir ant reakcinio centro chlorofilo molekul÷s..

d) fotooksidacija, sužadinta donoro molekul÷ oksiduojasi ir elektronas pernešamas ant akceptoriaus. Fotosintez÷je sužadintas chlorofilas (Chl*) yra elektronų donoras.

Chlorofilo pagalba šviesos energija panaudojama atskirti oksidacinius ir redukcinius ekvivalentus. Schematiškai šį procesą galima pavaizduoti sekančiai:

A0

Chl

B0

A0

Chl*

B0

A-

Chl+

B0

A-

Chl

B+

hν

A0 - potencialus elektronų akceptorius, B0 - potencialus elektronų donorius, A-

- redukuota forma B+ - oksiduota forma Chl* - sužadintas chlorofilas Chl+ - chlorofilo radikalas Chlorofilas sugeria atitinkamą šviesos kvantą ir yra sužadinamas (Chl*). Elektronas

nuo Chl* perduodamas elektronų akceptoriui A0 , susidaro chlorofilo radikalas (Chl+) ir redukuotas akceptorius. Chlorofilo radikalas oksiduoja potencialų elektronų donorą B0 ir prisijungia elektroną virsdamas neutralia molekule. Šios reakcijos metu elektronus nuo B0 ant A0 perneša chlorofilas, panaudodamas sugerto kvanto energiją. Tokiu būdu pirminis fotocheminis aktas yra elektronų pernešimas akceptoriui, kurio padid÷ja redukcinis potencialas. Toliau elektronai nuo B pernešami pagal jų redukcinį potencialą elektronų pernešimo grandin÷s komponentams. Pirmin÷ fotochemin÷ reakcija vyksta fotosintetiniame reakcijos centre.

13.2.3 Švies ą sugaudanti antena Chloroplastai ir chromatoforai turi žymiai daugiau chlorofilo molekulių nei reakcinių

centrų. Dauguma chlorofilo molekulių susiriša su specifiniais baltymais ir kitais pigmentais ir sudaro šviesą sugaudančia anteną (ŠSA) arba antenos kompleksą. Šių pigmentų funkcija yra sugerti šviesos kvantus ir perduoti energiją chlorofilo molekulei esančiai reakcijos centre. Pigmento molekul÷ esanti bet kuriame antenos taške sugeria šviesos kvantą ir eksitonų pavidalu perneša sugerto fotono energiją nuo vienos molekul÷s ant kitos, kol sužadinimo energija pasiekia reakcijos centrą. Reakcijos centre kur energija yra transformuojama.

Energijos pernešimas per antenos chlorofilo molekules ant reakcijos centro chlorofilo vyksta labai greitai per <10-10s ir proceso efektyvumas siekia daugiau nei 90%. Šis didelis efektyvumas priklauso nuo tikslaus chlorofilo molekulių išsid÷stymo šviesą sugaudančioje antenoje.

362

13.3 pav. Šviesos energijos pernešimas į reakcijos centrą antenos komplekse. Antenos baltymo tretin÷ struktūra yra nustatyta žaliosiose fotosintetinačiose

bakterijose Prosthecochloris aestuarii. Antena sudaryta iš trijų identiškų po 357 aminorūgštis turinčių subvienetų. 7 BChl a molekul÷s yra apsuptos baltymo kurį sudaro 15 β-juostų. Šviesą sugaudanti antena II, kuris randamas chloroplastų membranose yra 232 aminorūgščių transmembraninis baltymas kuris prijungia ir išd÷sto atitinkamai membranoje 9 Chl a, 6 Chl b ir dvi karotinoidų molekules.

Dauguma šviesą sugaudančių antenų turi papildomus pigmentus, kurie

CH3 CH3

CH3 CH3CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3 CH3

CH3 CH3CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

OH

NNH

NH

O

CH3

CH3

CH3CH3

NH

CH3

CH2

O

COO

β -karotinas

Liuteinas (ksantofilas)

OOC --

Fikoeritrobilinas

Fikocianobiline nesotus ryšys

Fikocianobilineetilgrup÷

13.4 pav. Papildomi fotosintez÷s pigmentai karotinas, liuteinas, fikoeritrinas. sugeria šviesą skirtingose spektro dalyse. Vieni iš svarbiausių yra karotinoidai,

363

kurie gali būti geltoni, raudoni, purpuriniai. Pagrindiniai atstovai yra raudonai oranžinis β-karotinas ir geltonas karotinoidas liuteinas.

Karotinoidai ne tik sugeria šviesą bet atlieka dar vieną svarbią funkciją: jie apsaugo ląstelę nuo žalingų aktyvių deguonies formų poveikio.

13.5 pav. Chlorofilo ir kitų pigmentų sugerties spektrai Vandenyje gyvenantys fotosintetiniai organizmai turi papildomus pigmentus, kurie

sugeria ilgesnių bangos ilgių (500-600nm) šviesą. Raudonuosiuose dumbliuose ir melsvabakter÷se pagrindiniai antenos pigmentai yra ne Chl a bet fikobilinai tai raudonas fikoeritrobilinas ir m÷lynas fikocianobilinas, sudaryti iš atviros grandin÷s 4 pirolo žiedų. Fikobilinai sugeria 520-630nm bangas. Sugertą energiją jie perduoda chlorofilui reakciniame centre. Fikoeritrobilinas ir fikocianobilinas kovalentiniais ryšiais prijungti prie baltymų (fikobiliproteinai) sudaro didel÷s molekulin÷s mas÷s daleles vadinamas fikobilisomomis.

13.3 Fotosintetini ų bakterij ų reakcinio centro strukt ūra ir elektron ų perenešimas.

Fotosintez÷s metu elektromagnetinių bangų energija transformuojama į cheminę energiją. Koks šio proceso mechanizmas? Pradžioje mes išnagrin÷sime reakcijos mechanizmą fotosintetin÷se bakterijose.

1984m. Deizenhoferis, Hiuberis ir Michelis (J.Deisenhofer, R.Huber, H.Michel) (1987m Nobelio premija) nustat÷ fotosintetinių bakterijų Rhodopseudomonas viridis reakcijos centro tretinę struktūrą. Tai buvo pirmas membraninis baltymas, kurio nustatyta trijų dimensijų (3D) struktūra. Vokiečių mokslininkai gavo 0.5mm diametro reakcinio centro kristalus ir atliko jų rentgeno struktūrinę analizę. Buvo gauta trimat÷ membraninio baltymo struktūra su 0.3 nm skiriamąja galia. Reakcinio centro kompleksas yra 4.5nm ilgio hidrofobiniu paviršiumi cilindras, kuris perveria membraną. Centras sudarytas iš keturių baltymų. Trys subvienetai L, M ir H išsid÷stę membranoje, ketvirtas baltymas citochromas c prisijungęs prie membranos paviršiaus. Rentgeno struktūrin÷s analiz÷s duomenys rodo, kad L ir M subvienetų α spiraliniai segmentai po 5 kartus perveria membranos fosfolipidinį dvisluoksnį. Šios spiralin÷s kolonos išsid÷sto simetriškai komplekso išilgin÷s ašies atžvilgiu. H subvieneto tik vienas α spiralinis segmentas lokalizuotas membranoje ir laiko citoplazmoje likusią hidrofilinę baltymo molekul÷s dalį. c-tipo citochromas, turi 4 hemus ir yra prijungtas prie išorin÷s plazmin÷s membranos pus÷s.

364

13.6 pav. Fotosintetinančių bakterijų reakcijos centras (A) ir pigmentų išsid÷stymas reakciniame centre (B).

Prie L ir M subvienetų yra prijungtos 4 molekul÷s bakteriochlorofilo b (kurio sugerties maksimumas 870nm (P870), 2 molekul÷s bakteriofoefitino (BFeo b), 1 molekul÷ ubicinono (QA) ir viena – menachinono (QB) (menachinonas yra vitaminas K2 būtinas kraujo kreš÷jimo komponentas) ir nehemin÷ geležis. Kai kurios purpurin÷s fotosintetinančios bakterijos turi BChl sugerianti 960nm bangoje (P960).

13.3.1 Ciklin ÷ elektron ų pernešimo grandin ÷ fosintetinan čiose bakterijose Purpurin÷se fosintetinančiose bakterijose Rhodospirillum rubrum ,

Rhodopseudomonas viridis stebimas ciklinis, nuo šviesos priklausomas elektronų pernešimas, kurio metu ant membranos yra sukuriamas elektrocheminis vandenilio jonų gradientas. Šis procesas yra citoplazmin÷je membranoje arba chromatoforuose, mažose sferin÷se citoplazmin÷s membranos pūslel÷se. Pirmame etape šviesą sugeria bakteriochlorofilas arba karotinoidai, esantys šviesą sugaudančioje antenoje (ŠSA). Energija eksitonų pavidalu perduodama bakteriochlorofilo dimerui, esančiam reakciniame centre.

O

O

Menachinonas

(CH2-CH=C-CH2)8-H

CH3CH3

Reakciniame centre dvi bakteriochlorofilo b molekul÷s sudaro dimerą “specialią

porą” jų žiedų plokštumos išsid÷sto beveik lygiagrečiai, atstumas Mg-Mg yra apie 0.7 nm. Ši “speciali pora” yra hidrofobin÷je apsuptyje ir kiekvienas Mg2+ sudaro ryšį su His. Kiekviena dimero BChl molekul÷ kontaktuoja su kita BChl monomero molekule, kuri savo keliu jungiasi su BFeo molekule. Menachinonas (QA) yra arti BFeo esančio L subvienete, o silpnai prisijungęs prie baltymo ubichinonas (QB) yra netoli M subvieneto BFeo. Fe2+ surišta su baltymu per His ir Glu yra tarp menachinono ir ubichinono. Nors chromoforų grup÷s yra simetriškai išsid÷sčiusios L ir M subvienetuose, jos funkcionuoja skirtingai, elektronai yra pernešami tiktai per pigmentus surištus su L subvienetu.

Fotocheminių reakcijų ciklas įvyksta per kelias ms. Šie fotocheminiai virsmai vyksta šia tvarka

a) pirminis fotochemin÷s reakcijos etapas yra fotono sugertis. Fotoną sugeria speciali pora P870. Šis labai greitas procesas trunka ~3 fs (fs; 10-15s).

365

b) sužadinta P870* forma per ~3 ps (ps; 10-12s) perneša elektroną ant BFeo a ir susidaro P870+ ir BFeo a-. Pernešant elektronus BChl a monomeras n÷ra redukuojamas, tod÷l jis yra vadinamas papildomas chlorofilas.

c) per 200ps elektronas migruoja ant menachinono, susidarant anijoniniam semichinono radikalui

Šios visos reakcijos pateiktos pav.

P870

BFeo a

QA QB

cit bL

cit bH

[2Fe-2S]

cit c1

cit c2 cit c2

QH2

Q

hemas 4hemas 3hemas 2hemas 1

Citochromas bc1Fotosintetinisreakcijos centras

c-tipo citochromas

Q ciklas

2H+ 2H+

4H+

citoplazma

išor÷

13.7 pav. Fotosintetin÷ elektronų pernešimo grandin÷ purpurin÷se bakterijose. Tolimesni fotosintetiniai elektronų pernešimo procesai vyksta žymiai l÷čiau. Susidaręs

QA semichinono radikalas per ~100ms perneša elektroną ant QB susidarant QB-. QA niekada

n÷ra pilnai redukuojamas jis yra arba oksiduotas arba semichinonin÷je formoje. Kai reakcijos centras yra dar kartą sužadinamas, antras elektronas prisijungia prie QB

- ir susidaro QB2-

Šis anijoninis chinolas prisijungia du protonus iš citoplazmin÷s pus÷s ir susidaro QBH2. QBH2 lengvai disocijuoja nuo baltymo molekul÷s į membraną. Jo vieta užima oksiduotas Q iš membranoje esančio chinonų fondo.

Elektronai, kurie redukavo ubichinoną, v÷liau yra pernešami per elektronų pernešimo grandinę ant P870+. Šiame procese dalyvauja citochromų bc1 kompleksas ir citochromas c2. Citochromų bc1 kompleksas susideda iš turinčio c-hemą citochromo c1 , citochromo b, kurio sud÷tyje yra du hemai bL ir bH bei 2Fe-2S baltymo. Kaip matome cit bc1 kompleksas yra labai panašus į mitochondrijų analogišką kompleksą. Elektronai yra pernešami nuo QBH2 esančio citoplazmin÷je membranos pus÷je ant cit bc1, toliau ant cit c2 išorin÷je membranos pus÷je. Redukuotas cit c2 difunduoja membranos paviršiumi ir redukuoja P870+. Kaip matome elektronas keliauja ciklu, toks elektronų pernešimas vadinamas cikliniu elektron ų pernešimu. Elektronų ir protonų pernešimas grandine ant citoplazmin÷s membranos sukuria elektrocheminį protonų gradientą.

Ciklinio elektronų transporto metu protonai iš citoplazmos pernešami į išorę, ląstel÷s vidus pašarm÷ja išor÷s atžvilgiu. Sug÷rus du fotonus keturi protonai pernešami per membraną. Šis protonų gradientas panaudojamas ATP sintezei iš ADP ir fosforo rūgšties. Toks procesas vadinamas fotofosforilinimu .

366

Fotosintetin÷s bakterijos panaudodamos saul÷s energiją sintetina ATP ir patenkina savo energetinius poreikius, tačiau jos turi gauti iš aplinkos redukuojančius ekvivalentus. Įvairios medžiagos H2S, S, S2O3

2- daugelis organinių medžiagų gali būti panaudojami kaip reduktoriai.

13.4 Fotosintez ÷ augaluose ir melsvabakter ÷se. Augalai, dumbliai ir melsvabakter÷s, panaudodami saul÷s energiją oksiduoja H2O,

išskiria deguonį ir, sintetina angliavandenius. Mitochondrijose, oksidacinio fosforilinimo metu elektronai ir protonai keliauja nuo

redukuotų nukleotidų ant molekulinio deguonies, susidaro vanduo ir išsiskiria energija. Fotosintez÷s metu saul÷s šviesos energija reikalinga pernešti elektronus nuo vandens, kurio redukcinis potencialas E0/ = +0,82 V ant NADP+, kurio E0/ = -0,320V, tai yra prieš redukcinį potencialą, šiam procesui būtinos energijos sąnaudos.

O2 + 4e- + 4H+ 2H2O E0/ = +0.82 V ir NADP+ + H+ + 2e- NADPH E0/ = -0.32 V

Bendra reakcija ir jos standartinis redukcijos potencialas yra 2NADP+ + 2H2O 2NADPH + O2 + 2H+ ∆E0/ = -1.14 V

Šios reakcijos standartinis laisvosios energijos pokytis yra ∆G0/ = +220kJ/mol-1. Net jeigu fotosintez÷s efektyvumas būtų 100% vienos O2 molekul÷s susidarymui neužtenka vieno fotono. Eksperimentai parod÷, kad dumbliuose, vienos O2 molekul÷s susidarymui reikia 8-10 fotonų.

Deguonin÷ fotosintez÷ priklauso nuo dviejų baltyminių-pigmentinių kompleksų - fotosistemos I (PSI) ir fotosistemos II (PSII), kurias sujungia citochromo b6f kompleksas bei nedideli, judrūs elektronų nešikliai - chinonai ir plastocianinas.

1. Fotosistema I sukuria stiprų reduktorių sugebantį redukuoti NADP+ ir kartu silpną oksidatorių, kuris oksiduoja plastocianiną.

2. Fotosistema II sukuria stiprų oksidatorių sugebantį oksiduoti H2O ir reduktorių, redukuojantį plastochinoną.

367

QA

Feo

P680

QB4QH2

4Q

FeS

A0

P700

cit b6

FeS

cit f

PC PC

Fd FAD

2H2O 4H+ + O2

8H+

8H+

2H+ + NADP+

2NADPHšviesa

šviesa

ADP + Pn ATP3H+

3H+

FS IIkompleksas

FS Ikompleksascitochromai

b6f

CF1

CF0

DSK

Q ciklas

A1

13.8 pav. Deguoninę fotosintezę vykdo dvi fotosistemos – fotosistema II ir fotosistema I. Fotosistemas jungia elektronų pernešimo grandin÷. Fotosistemos II sud÷tyje yra deguonį išlaisvinanti sistema.

PSI ir PSII yra sudarytos iš reakcinių centrų , kuriuose vyksta fotochemin÷ reakcija ir chlorofilus, karotinoidus ir kitus papildomus pigmentus turinčių antenų kompleksų. Antena sugeria saul÷s šviesos energiją plačiame spektro intervale ir tuneliuoja ją pirminiam elektronų donorui reakcijos centre.

Apšvietus chloroplastus, energiją sugeria vienas iš antenos pigmentų ir perduoda PSII reakciniame centre esančiai chlorofilo a molekulei. Kadangi ji sugeria 680 nm bangos ilgio šviesą, ji dar vadinama pigmentu P ir žymima P680. Sužadintas pirminis elektronų donoras P680 perduoda elektroną akceptoriui ir susidaro stiprus oksidatorius P680+, kuris oksiduoja vandenį iki O2 ir H

+ Elektronas nuo redukuoto akceptoriaus per citochromo b6/f kompleksą pernešamas plastocianinui. Kitu šviesos kvantu sužadinus chlorofilą P700 esantį fotosistemoje I elektronai nuo P700 perduodami feredoksinui ir galutiniam elektronų akceptoriui NADP+. Susidariusį P700+ radikalą neutralizuoja elektronas gautas iš plastocianino. Tuo būdu, saul÷s energija panaudojama elektronams nuo vandens pernešiti ant NADP+. Vektorinis elektronų pernešimas citochromų b6f kompleksu nuo PSII ant PSI, sukuria ant tilakoidų membranos elektrocheminį vandenilio jonų gradientą, kuris yra ATP sintez÷s varomoji j÷ga.

Tilakoidų membranoje yra išsid÷sčiusi ATP sintaz÷, kuri savo struktūra ir veikimo mechanizmu panaši į mitochondrinę ATP sintazę.

368

13.4.1Fotosistema I. Fotosistema I (FSI) yra didelis baltyminis kompleksas lokalizuotas fotosintetinačiose

membranose. Nors PSI baltymo kristalai gauti iš įvairių organizmų, tačiau geriausiai PSI struktūra nustatyta termofilinių melsvabakterių Synechococcus elongatus . PSI baltymai kristale sudaro homotrimerą. Monomero molekulin÷ mas÷ yra 340 kDa ir jis sudarytas iš 11 polipeptidų, pavadintų pagal juos koduojančių genų vardus - nuo PsaA iki PsaM, (13.9 pav.) kurie susijungę su 127 kofaktoriais - 96 Chla molekul÷mis, 22 karotinoidais, keturiais lipidais, trim 4Fe-4S klasteriais ir dviem filochinonais. Pagrindinis komplekso struktūrinis elementas, fotosistemos I šerdis, yra dviejų polipeptidų PsaA (83 kDa) ir PsaB (83 kDa) heterodimeras, su kuriuo susijungusios šešios Chla molekul÷s, dvi filochinono molekul÷s ir Fe-S centras. PsaC baltymas prijungia du Fe-S centrus (FA ir FB).

13.9 pav. Baltymų išsid÷stymas fotosistemoje I /ESL/

Elektronų nešikliai išsid÷sto skersai membranos ir sudaro dvi transmembranines šakas.

Pav.)

O

O

CH3

CH2

C CH3

CH2-(CH-CH2-CH-CH2)3-H

CH3

Filochinonas P700 yra pirminis FSI elektronų donoras. Sugerta antenos komplekse energija

perduodama chlorofilo P700 (Chl)2 dimerui, kurį sužadinus jis oksiduojasi (P700+) ir elektronas pereina ant monomerinio chlorofilo a (A0). Prisijungęs elektroną A0 yra stiprus reduktorius (E0

/ = -1.11V) jis redukuoja A1, (tai yra vitaminas K1 arba filochinonas, QK ). Nuo A1 elektronas pereina ant 4Fe-4S komplekso, kuris suriša PsaA ir PsaB baltymus ir yra žymimas Fx. Toliau elektronas per du 4Fe-4S centrus FA ir FB surištus su PsaC pernešamas ant esan2io stromoje geležį turinčio baltymo feredoksino. Galutinę elektronų pernešimo stadiją katalizuoja NADP reduktaz÷ redukuojanti NADP+. 2 Feredoksinai (red) + 2H+ + NADP+ 2 Feredoksinai (oks) + NADPH + H+

369

13.9 pav. Fotosistemos I kompleksas ir elektronų pernešimo seka. /Lenindžeris /

13.4.2Fotosistema II. Fotosistema II šviesos energiją naudoja dviem chemin÷m reakcijoms – vandens

oksidacijai ir plastochinono redukcijai. Keturių fotocheminių reakcijų metu, sugeriami keturi fotonai, keturi elektronai paimami iš vandens, redukuojamos dvi plastochinono (PQ) molekul÷s ir susidaro viena molekul÷ deguonies.

2H2O + 2PQ + 4hν O2 + 2PQH2 Fotosistema II įterpta į tilakoidų membraną taip, kad deguonį išlaisvinanti sistema yra

prie vidin÷s tilakoidų membranos pus÷s, o plastochinoną redukuojanti sritis yra nukreipta į stromos pusę.

Prie šerdies yra vidin÷s šviesą sugaudančios antenos baltymai (CP43 ir CP47) su prijungtom 45 molekul÷mis chlorofilo a, ir 5-7 molekul÷mis karotinoidų. Paprastai vieną reakcijos centrą aptarnauja apie 200-250 chlorofilo molekulių ir 40-60 karotinoidų. Aukštesniuosiuose augaluose ir melsvabakter÷se yra papildoma šviesą sugaudanti antena II (LHCII), kurioje BChl a ir BChl b yra surišti su atitinkamais baltymais. Šviesą sugaudanti antena II sudaro trimerą.

Cit b559 sudarytas iš hemą b surišančių baltymų PsbE ir PsbF ir lokalizuotas arti D1 ir D2 baltymų. Jo funkcija n÷ra elektronų pernaša, jis matomai apsaugo reakcijos centrą nuo aktyvių deguonies junginių inhibicinio poveikio.

13.10 pav. Fotosistemos II reakcijos centras ir antenų kompleksas.

Fotosistemos II išskirtos iš melsvabakterių Thermosynechococcus elongatus tretin÷ struktūra nustatyta 2004m. Kompleksas yra dimeras, kiekvieną monomerų sudaro 19 baltymų, įeina 36 chlorofilo a molekul÷s, ir 7 β-karotino molekul÷s. Į kiekvieno monomerų sud÷tį įeina viena deguonį išlaisvinanti sistema (DIS), vienas hemas b, vienas hemas c, du plastochinonai, du feofitinai, viena nehemin÷ geležis ir du bikarbonato jonai.

370

Fotosistemoje II yra mažiausiai devyni skirtingi redoks komponentai (chlorofilai, feofitinas, plastochinonas, tirozinas, manganas, geležis, citochromas b559, karotinoidai ir histidinas), kurie dalyvauja pernešant elektronus. Tačiau tiktai penki betarpiškai perneša elektronus nuo vandens ant plastochinono (vandenį oksiduojantis (Mn)4 klasteris, aminorūgštis tirozinas (YZ), reakcijos centro chlorofilas (P680), feofitinas (chlorofilo molekul÷ neturinti Mg) ir dvi plastochinono molekul÷s QA ir QB).

O

OPlastochinonas

(CH2-CH=C-CH2)n-H

HCH3

CH3

CH3

Šio multifermentinio komplekso šerdis yra FSII reakcinis centras, sudarytas iš dviejų

baltymų D1 ir D2 (juos koduoja atitinkamai genai psbA ir psbD). Kiekvienas subvienetas turi po penkis transmembraninius segmentus ir yra panašus į fotosintezuojančių bakterijų reakcijos centro L ir M subvienetus. Su D1 ir D2 subvienetais yra susijungę vidin÷s antenos baltymai CP43 (PsbC) ir CP47 (PsbB).Šie baltymai suriša įvairius kofaktorius dalyvaujančius nuo šviesos priklausančiuose elektronų pernešimo procesuose.

13.11 pav. Fotosistemos II struktūra, (vaizdas iš šono A ir vaizdas iš viršaus B).

Subvieneto D1 transmembraniniai α spiraliniai segmentai geltoni, subvieneto D2 – oranžiniai, CP47 – raudoni, CP43 – žali. Science 2004)

Apšvietus FSII specialus chlorofilas a (P680) sugeriantis 680nm bangos ilgyje yra sužadinamas ir perduoda elektroną feofitino molekulei. Susidaro radikalų pora - P680+ -Feo- . Elektronas per 200ps nuo Feo- pereina ant surišto plastochinono (QA), kuris kelias ms QA

- redukuoja greta esantį plastochinoną QB. Lik3s chlorofilo radikalas P680+

per kelias nanosekundes redukuojamas amino rūgšties Tyr161 (YZ) kuri yra baltymo D1 polipeptidin÷je grandin÷je. Elektronai ant YZ

- pereina nuo vandens per (Mn)4 klasterį, priklausantį deguonį išlaisvinančiam kompleksui. Šie elektronų nešikliai išsid÷stę skersai membranos ir apšvietus

371

FSII elektronai pernešami skersai membranos. Elektronų donorai P680,YZ ir (Mn)4 yra tilakoidų membranos lumeno (vidinis) paviršiuje, o elektronų akceptoriai (Feo, QA ir QB ) membranos nukreiptoje į stromą (išorinis) paviršiuje.

Prisijungęs du elektronus iš QA ir du protonus iš stromos QB redukuojasi ir QBH2 disocijuoja nuo D1 baltymo, o jo vietą užima laisvas oksiduotas plastochinonas esantis membranoje. Tuo būdu PSII veikia kaip nuo šviesos priklausoma H2O/plastochinono oksidoreduktaz÷.

13.12 pav. Kofaktorių, dalyvaujančių elektronų pernešime FSII išsid÷stymas.

(Science2004).

13.4.3Deguon į išlaisvinanti sistema (DIS). Vanduo yra labai stabilus junginys, jo oksidacijai reikalingas oksidacinis redukcinis

potencialas apie 1200 mV. Deguonies oksidaciją katalizuoja sistema išsid÷sčiusi nukreiptoje į lumeną fotosistemo II pus÷je.

2H2O O2 + 4e + 4H+

4hν

FSII yra su baltymu surišti Mn ir Ca2+ jonai, kurie sudaro katalitiškai aktyvų deguonies

išskyrimo kompleksą. Jis prijungia dvi molekules vandens ir išlaisvina vieną molekulę deguonies ir keturis elektronus atiduoda reakciniam centrui. Sistemos aktyviame centre yra penki metalo jonai; keturi mangano ir vienas kalcio. Trys mangano jonai ir kalcio jonas yra iškreipto kubo keturiuose kampuose, likusius kubo kampus užima deguonies atomai. Ketvirtas mangano jonas yra nutolęs nuo kubo ir susijungęs koordinaciniais ryšiais su vienu iš kubo galuose esančiu deguonies atomu. Mangano jonai yra prijungti prie baltymų D1 ir CP43 atitinkamų aminorūgščių šoninių radikalų.

Oksiduojant vandenį vienu metu išsiskiria keturi elektronai, tuo tarpu P680 gali priimti tiktai po vieną elektroną, tod÷l turi būti buferin÷ sistema, kuri iš karto prijungia keturis elektronus ir palaipsniui po vieną juos atiduoda. Buvo tiriamas deguonies išsiskyrimas apšvietus adaptuotus tamsoje chloroplastus trumpais blyksniais. Pirmi du blyksniai neiššauk÷ deguonies susidarymo, maksimalus deguonies kiekis susidar÷ trečio blyksnio metu. Toliau O2 susidarymo pikas cikliškai kartojosi kas keturi blyksniai. Šis periodiškumas rodo, kad deguonį išlaisvinantis centras praeina 5 tarpinius būvius S0 - S4. EPR signalai rodo, kad Mn jonai pereina įvairaus oksidacijos redukcijos laipsnio būvius.

372

Buvo pasiūlyta, kad kiekvienas per÷jimas tarp S būvių yra oksidacijos redukcijos reakcijos ir per÷jimas tarp S4 ir S0 susijęs su O2 išlaisvinimu. Penkių etapų metu į tilakoidų vidų pereina keturi protonai.

S0S1

S4 S2

S3

2H+ H+

H+

e-

e-

e-

e-

O2

2H2O

hν

hν

hν

hν 13.13 pav. Deguonies susidarymo chloroplastuose schema Yra pasiūlyta, kad viena vandens molekul÷ prisijungia prie Mn jono, kita – prie Ca2+.

Mangano jonai turi įvairius oksidacijos laipsnius Mn2+, Mn3+, Mn4+ ir Mn5+. Mangano jonų valentingumas išauga pereinant iš būvio S0 iki S4. Oksiduojantis vandens molekulei, deguonis prisijungia prie Mn5+ ir susidaro elektrofilin÷ oksogrup÷. Ji yra atakuojama nukleofilin÷s antros vandens molekul÷s susidarant O=O ryšiui. Elektronai nuo vandens molekul÷s prisijungia prie Mn jonų.

13.14 pav. Vandens fotoliz÷s mechanizmas. Chloroplastuose PSI ir PSII išsid÷sto skirtingose tilakoidų membranos vietose.

Dauguma fotosistemos II kompleksų lokalizuota sukrautose į rietuvę tilakoidų membranose (granose), tuo tarpu fotosistema I yra stromos membranose. Viename kvadratiniame lapo centimetre yra per 30 trilijonų (1012) fotosistemos II kompleksų. Prokariotuose tilakoidų membranos nesudaro granų ir fotosistemos I ir II yra susimaišiusios.

13.15 pav. Fotosistema I ir II išsid÷stymas tilakoidų membranose.

13.4.4Fotosintez ÷s kvantin ÷ išeiga Fotosintez÷s kvantin÷ išeiga išreiškiama kaip santykis fiksuoto CO2 ar išsiskyrusio O2

panaudotam kvantų skaičiui. Keturi fotonai yra sugeriami dviejų reakcinių centrų ir du elektronai iš vandens pernešami ant NADP+. Panaudojus 8 šviesos kvantus, per abi fotosistemas pernešami keturi elektronai, susidaro viena deguonies ir 2 NADPH molekul÷s. Ciklinis elektronų pernešimas fotosintetin÷je sistemoje

373

Padid÷jus NADPH/NADP+ santykiui elektronai yra pernešami nuo fotosistemos I ant citochromų b6f komplekso ir per plastocianiną redukuoja P700. Šis ciklinis elektronų pernešimas nepriklauso nuo FS II veikimo ir jo rezultate ant tilakoidų membranossukuriamas elektrochemininis vandenilio jonų gradientas reikalingas ATP sintezei.

13.5 Nuo šviesos priklausoma ATP sintez ÷ - fotofosforilinimas. Fotofosforilinimas yra nuo šviesos priklausoma ATP sintez÷. Elektronų pernešimas

per fotosintetinę elektronus pernešančią grandinę yra susijęs su protonų pernešimu tilakoidų vidų. Tilakoidų vidus parūgšt÷ta ir gali susidaryti 3-4pH vient7 ∆pH. Susidaręs elektrocheminis vandenilio jonų gradientas yra ATP sintez÷s varomoji j÷ga. Protonų gradientas gali susidaryti įvairių reakcijų metu. Protonai atsipalaiduoja vandens fotoliz÷s reakcijoje. Oksiduojantis plastochinonui elektronai ir protonai pernešami fotosintetin÷s elektronų pernešimo grandin÷s ir analogiškai mitochondrijose vykstančiam Q ciklui, protonai keliauja į lumeną. Redukuojantis NADP+ protonai paimami iš stromos ir prijungiami prie NADP. Tiksli protonų pernešimo stechiometrija n÷ra žinoma

Tilakoidų membranoje išsid÷sčiusi CF0F1 ATP sintaz÷, kurios struktūra ir veikimo mechanizmas panašus į mitochondrijų ATP sintazę.

13.6 Fotosintez ÷s tamsin ÷ stadija. Kalvino ciklas Antra fotosintez÷s stadija yra CO2 redukcija iki angliavandenių, panaudojant

šviesin÷je stadijoje susidariusius ATP ir reduktorių NADPH. Angliavandenių sintez÷ vyksta chloroplastų stromoje katalizuojant fermentams ir susidarant dideliam skičiui tarpiniu produktų. (13.16 pav.). Šių visų biocheminių reakcijų seka buvo nustatyta Kalvino (M.Calvin) ir ciklas vadinamas Kalvino ciklu.

Pirmoje stadijoje CO2 kondensuojasi su turinčiu penkis anglies atomus ribulioz ÷s 1,5-bisfosfatu, susidarant dviem molekul÷ms 3-fosfoglicerato. Ši negrįžtama reakcija yra katalizuojama ribulioz ÷s 1,5-bisfosfato karboksilaz÷s. Šis fermentas sutrumpintai vadinamas Rubisco fermentas. Kadangi fermentas turi ir karboksilazinį ir oksigenazinį aktyvumus jis dar vadinamas ribulioz÷s 1,5-bisfosfato karboksilaz÷-oksigenaz÷.

Kalvino ciklas turi tris stadijas a) karboksilinimo stadija, katalizuojama Rubisco, b) redukcin÷ stadija, kurioje 3-fosfogliceratas redukuojamas į glicerolio aldehido 3-fosfatą ir c) regeneracijos stadija, joje dauguma glicerolio aldehido 3-fosfato molekulių panaudojama ribulioz÷s 1,5-bisfosfato resintezei.

Ribulioz÷s 1,5-bisfosfatas prisijungia vieną molekulę CO2 ir susidaręs šešių anglies atomų tarpininkas skyla į dvi 3-fosfoglicerato molekules. Pilnam ciklo apsisukimui reikalingos šešios molekul÷s ribulioz÷s 1,5-bisfosfato, ir šešios molekul÷s CO2.

Redukcin÷je Kalvino ciklo stadijoje fosfoglicerato kinaz÷ katalizuoja nuo ATP priklausomą 3-fosfoglicerato virtimą į 1,3-bisfosfogliceratą. Toliau 1,3-bisfosfogliceratą redukuoja NADPH ( ne NADH kaip gliukoneogenez÷je) reakcijoje katalizuojamoje glicerolio aldehido 3-fosfato dehidrogenaz÷s. Trioz÷s fosfato izomeraz÷ palaiko pusiausvyrą tarp glicerolio aldehido 3-fosfato ir dihidroksiacetono fosfato. Dvi glicerolio aldehido 3-fosfato molekul÷s panaudojamos heksoz÷s sintezei, iš likusių regeneruojamas ribulioz÷s 1,5-

374

bisfosfatas.

C

C

C

CH2OPO3

H OH

O

CH2OPO3

O

H

COO

C

CH2OPO3

H OH

COOPO3

C

CH2OPO3

H OH

C

CH2OPO3

H OH

CHO

2-

2-3H2O 6H+

3CO2 -

2- 2-

2-6ATP 6ADP

2-

6NADPH + 6H+ 6NADP+ 6Pn

Ribulioz÷s 1,5-bisfosfatas 3-fosfogliceratas 1,3-bisfosfogliceratas

Glicerolio aldehido 3-fosfatas

Rubisco Fosfoglicerato kinaz÷

Glicerolio aldehido 3-fosfato dehidrogenaz÷

C

CH2OPO3

H OH

CHO

C

CH2OPO3

O

CH2OH

2-

Glicerolio aldehido Dihidroksiacetono 3-fosfatas fosfatas

2-

Trioz÷s fosfato izomeraz÷

Dauguma Kalvino ciklo reakcijų reikalingos regeneruoti ribulioz÷s 1,5-bisfosfatui. Glicerolio aldehido 3-fosfatas yra paverčiamas į trijų, keturių, penkių, šešių ir septynių anglies atomų fosforilintus sacharidus. Paskutin÷je ciklo stadijoje yra fosforilinamas ribulioz÷s 5-fosfatas ir susidaro ribulioz÷s 1,5-bisfosfatas.

C

C

C

C

CH2OPO3

OH H

OHH

O

H

CH2OH

OH

C

CH2OPO3

H OH

CHO CH2OH

C

CH2OPO3

O

C

C

C

C

CH2OPO3

OH H

OHH

O

H

CH2OPO3

OH

2-

2- 2-

+

2-

2-

Aldolaz÷ Fruktoz÷s 1,6-bisfofataz÷

H2O Pn

Glicerolio aldehido Dihidroksiacetono Fruktoz÷s Fruktoz÷s 3-fosfatas fosfatas 1,6-bisfosfatas 6-fosfatas

C

C

C

C

CH2OPO3

H OH

OHH

H

C

OH

HOH

CH2OPO3

O

CH2OH

C

CH2OPO3

O

C

C

CH2OPO3

OHH

H OH

CHOC

C

C

C

CH2OPO3

H OH

OHH

H

C

OH

HOH

CH2OH

O

2-

2- 2-

2-

2-

+

Aldolaz÷

H2O Pn

Sedoheptulioz÷s1,7-bisfosfataz÷

Dihidroksiacetono Eritroz÷s Sedoheptulioz÷s Sedoheptulioz÷s fosfatas 4-fosfatas 1,7-bisfosfatas 7-fosfatas

375

3-fosfogliceratas(12 molekulių)

Ribulioz÷s1,5-bisfosfatas

2 2 3 5Dihidroksiacetono fosfatas (5)

23

1,3- bisfogliceratas

Glicerolio aldehido 3-fosfatas

Fruktoz÷s 1,6-bisfosfatasH2O

PnFruktoz÷s 6-fosfatas (3)

2

Eritroz÷s 4-fosfatas

(2) (2)

Sedoheptulioz÷s1,7-bisfosfatas (1)

Sedoheptulioz÷s7-fosfatas (1)

Ribulioz÷s5-fosfatas

(6)

(2)

(2)

(6)

(12)

(12)

6CO2 + 6H2O

Fruktoz÷s 6-fosfatas (1)

Ksilulioz÷s5-fosfatas

Ksilulioz÷s5-fosfatas

Ribulioz÷s5-fosfatas

13.16 pav. Kalvino ciklas. Skliaustuose nurodyta dalyvaujančių molekulių skaičius.

376

C

C

C

C

CH2OPO3

OH H

OHH

O

H

CH2OH

OH

C

CH2OPO3

H OH

CHO

C

C

CH2OPO3

OHH

H OH

CHOCH2OH

C

C

C

CH2OPO3

O

HOH

H OH2-

2-

+

2-

Aldolaz÷

Glicerolio aldehido Fruktoz÷s Eritroz÷s Ksilulioz÷s 3-fosfatas 6-fosfatas 4-fosfatas 5-fosfatas

2-

+

C

CH2OPO3

HOH

CHO C

C

C

C

CH2OPO3

H OH

OHH

H

C

OH

HOH

CH2OH

OC

C

C

CH2OPO3

H OH

OHH

H OH

CHO

C

C

C

CH2OPO3

HOH

H OH

CH2OH

O

2-

2-

+

Glicerolio aldehido Sedoheptulioz÷s Riboz÷s Ksilulioz÷s 3-fosfatas 7-fosfatas 5-fosfatas 5-fosfatas

2- 2-

+

C

C

C

CH2OPO3

H OH

OHH

H OH

CHO

C

C

C

CH2OPO3

HOH

H OH

CH2OH

O

C

C

C

CH2OPO3

OHH

H OH

CH2OH

O C

C

C

CH2OPO3

OHH

H OH

CH2OPO3

O2-

2-

2- 2-

2-Ribulioz÷s5-fosfato kinaz÷

ATP ADP

Riboz÷s 5-fosfatoizomeraz÷

Riboz÷s 5-fosfatoepimeraz÷

Ribulioz÷s Ribulioz÷s5-fosfatas 1,5-bisfosfatas

Kalvino ciklo reguliacija Angliavandenių biosintez÷ yra reguliuojama tose stadijose, kur ∆G0/ yra

neigiamiausias, kur reakcijos yra negrįžtamos: bisfosfatazin÷se reakcijose, stadijose kur panaudojamas ATP ir NADPH ir CO2 fiksacijos reakcijoje. Šios reakcijos yra katalizuojamos fruktoz÷s 1,6-bisfosfataz÷s, sedoheptulioz÷s 1,7-bisfosfataz÷s, ribulioz÷s 5-fosfato kinaz÷s, glicerolio aldehido 3-fosfato dehidrogenaz÷s, fosfoglicerato kinaz÷s ir rubisco fermento.

Rubisco fermentas yra pirmas reguliacijos taikinys. Esant didel÷ms CO2 koncentracijoms baltymas ne fermentiniu keliu yra karbamilinamas, CO2 prisijungia prie lizino aminorūgšties ir aktyvuoja fermentą.

Pirmų keturių fermentų aktyvumą reguliuoja šviesa. Baltymo molekul÷s paviršiuje yra disulfidiniai tilteliai, kurių oksidacijos redukcijos laipsnis priklauso nuo šviesos. Naktį merkaptogrup÷s oksiduojamos, fermentai inaktyvuojasi ir nevyksta CO2 fiksacija. Disulfidai yra redukuojami šviesoje, elektronai nuo fotosistemos I per nedidel÷s molekulin÷s mas÷s, baltymą tioredoksiną pernešami ant disulfidų, juos redukuoja ir fermentai aktyvuojami.

Stromos pH ir Mg2+ jonų koncentracija reguliuoja fruktoz÷s 1,6-bisfosfatz÷s ir sedoheptulioz÷s 1,7-bisfosfatz÷s aktyvumus. Fermentų aktyvumas didžiausias esant šarminiam stromos pH ir aukštai Mg2+ koncentracijai.

377

13.7 Fotokv ÷pavimas Rubisco fermentas yra ypatingas fermentas, priklausomai nuo sąlygu jis veikia kaip

oksigenaz÷, o ne karboksilaz÷. Savo aktyviame centre jis gali prisijungti ne tiktai CO2 , bet ir O2. Ši rekcija vyksta kai deguonies koncentracija yra aukšta, o CO2 – žema, deguoniui KM yra beveik 10 kart7 didesn4 negu CO2. Kada oksigenazin÷s reakcijos greitis yracdidesnis nei karboksilazin÷s, įsijungia medžiagų apykaitos kelias, kuris vadinamas fotokv÷pavimu. Prisijungus deguoniui chloroplastuose vyksta reakcija, kurios metu ribulioz÷s 1,5-bisfofatas reaguoja su O2 ir susidaro 3-fosfogliceratas ir fosfoglikolatas ( pav.).

C

C

C

CH2OPO3

OHH

H OH

CH2OPO3

O C

C

C

CH2OPO3

OH

H OH

CH2OPO3

OH C

C

C

CH2OPO3

O

H OH

CH2OPO3

OHOOH

C

CH2OPO3

OO

C

C

CH2OPO3

H OH

OO2-

2-

Ribulioz÷s Enediolin÷ Surištas su fermentu1,5-bisfosfatas forma tarpininkas

2-

2-

2-

2-

2-

2-

Fosfoglikolatas

3-fosfogliceratas

O2

12. pav. Rubisco fermento oksigenazin÷ reakcija. Fosfoglikolatas chloroplastuose yra defosforilinamas ir pereina į peroksisomas ( pav.).

Čia jis toliau oksiduojamas, susidarant glioksilatui ir H2O2. Vandenilio peroksidas suskaidomas katalaz÷s, o iš glioksilato sintetinamas glicinas. Tolimesnis glicino metabolizmas vyksta mitochondrijose. Iš dviejų glicino molekulių gauname vieną molekulę serino ir po vieną molekulę CO2 ir NH3. Serinas paverčiamas į gliceratą, kuris chloroplastuose

378

fosforilinamas ir 3-fosfoglicertatas patenka į Kalvino ciklą.

Ribulioz÷s 1,5-bisfosfatas

Fosfoglikolatas

Glikolatas

Glioksilatas

Glicinas

Glicinas Serinas

Serinas

Gliceratas

3-fosfogliceratas

O2

O2

H2O

CO2

Kalvinociklas

ATP

ADP

CHLOROPLASTAI

PEROKSISOMOS

MITOCHONDRIJOS

Pn

CO2 + NH3

Pav. Fotokv÷pavimas. Ribulioz÷s 1,5-bisfosfato oksigenazinis aktyvumas suskaido ribulioz÷s 1,5-bisfosfatą iki fosfoglikolato ir 3-fosfoglicerato. Fosfoglikolatas ir jo metabolitai keliauja per peroksisomas, mitochondrija į chloroplastus. Šių reakcijų metu panaudojamas deguonis, ATP, išsiskiria CO2

Fotokv÷pavimo metu: a) ribulioz÷s 1,5-bisfosfatas yra paimamas iš Klavino ciklo, b) panaudojamas O2 ir išsiskiria CO2, c) tiktai dalis anglies grįžta į chloroplastus, d) netenkama ATP. Fotokv÷pavimo nauda gali pasireikšti mažinant aktyvių deguonies formų kiekį. Fotokv÷pavimas vyksta kai deguonies koncentracija yra aukšta o CO2 - žema. Padid÷ja galimyb÷ susidaryti aktyviom deguonies formoms, kurios pažeidžia ląstelę. Fotkv÷pavimas, panaudodamas deguonį, mažina aktyvių deguonies formų koncentraciją.

13.7.1C4 augalai Tokie augalai kaip cukranendr÷s, kukurūzai turi metabolinį ciklą, kurio metu

fotosintezuojančiose ląstel÷se yra koncentruojamas CO2 , tod÷l beveik nevyksta fotokv÷pavimas. Augalų lapai, kurie turi taip vadinama C4 ciklą turi charakteringą anatomiją.

379

Lapo gyslel÷s yra apsuptos vienu ląsteliniu sluosniu taip vadinamų bundie-sheath cells, kurias dengia mezofilin÷s ląstel÷s.

C4 ciklas buvo nustatytas 1960m Hetčo (M.Hatch) ir Sleko (R.Slack). Į mezofilines ląsteles iš oro patenka CO2, karboanhidraz÷s poveikyje virsta į HCO3

- ir reaguoja su fosfoenolpiruvatu. Fosfoenolpiruvato karboksilaz÷, fiksuojanti CO2 neturi oksigenazinio aktyvumo, tod÷l esant aukštai temperatūrai ir žemai CO2 koncentracijai jis įjungimas keturis anglies atomus turinčius junginius (oksalacetatas) Susidaręs oksalacetatas redukuojamas NADPH ir malatas (turi 4 anglies atomus iš čia pavadinimas C4 augalai, nes CO2 įjungiamas ne į trijų, bet keturių anglies atomų junginį) išeina į bundie sheet ląsteles. Šiose ląstel÷se malatas dekarboksilinamas, susidarant CO2, NADPH ir piruvatui. Šio proceso metu CO2 yra koncentruojamas bundie ir nevyksta fotokv÷pavimas. ir patenka į Kalvino ciklą. Piruvatas yra grąžinamas į mezofilio ląsteles ir fosforilinamas. Fermentas piruvato fosfato dikinaz÷, katalizuojantis šią reakciją aktyvuoja fosfato grupę hidrolizuodamas ATPiki AMP ir PPn. PPn hidrolizuojamas iki dviejų Pn , tai lygiavertis panaudojimui dar vienos ATP. Vienos CO2 molekul÷s koncentravimui bundle ląstel÷se panaudojamos dvi ATP molekul÷s.

C4 augalai auga tropikų rajonuose, kadangi jų augimo greitis karštose ir saul÷tose sąlygose yra didesnis. C3 augalai (jie pirmose stadijose įjungia CO2 į trijų anglies atomų rūgštis)geriau prisitaikę v÷sesniam orui, kur fotokv÷pavimas l÷tesnis ir CO2 fiksacijai reikalinga mažiau energijos.

CO2

PEP (C3) Oksaloacetatas (C4)

Piruvatas Malatas

Piruvatas (C3) Malatas(C4)

Ribulioz÷s 3-fosfogliceratas1,5-bisfosfatas

Trioz÷sfosfatai

CO2

CO2

NADPH + H+

MEZOFILINöSLĄSTELöS

NADP+

BUNDLE sheathcell

Kalvino ciklas

HCO3-

NADP+

NADPH + H+

1

2

3

4

5Pn + ATP

AMP + PPn

ORAS

C4

C3

Angliavandeniai

12. pav. C4 ciklo reakcijos. CO2 pernešamos per mezofilio ląsteles į dengiamąsias

ląsteles, kuriose sintetinami angliavandeniai. Fermentai: 1 – karboanhidraz÷, 2 – fosfoenolpiruvato karboksilaz÷, 3 – malato dehidrogenaz÷, 4 malik fermentas, 5 – piruvato fosfato dikinaz÷.

380

. Fotokv÷pavimo metu 1)ribulioz÷s 1,5-bisfosfatas nepatenka į Kalvino ciklą, 2)

deguonis yra panaudojamas, o anglies dvideginis pašalinamas, 3) tiktai dalis anglies atomų grįžta į chloroplastus, 4) panaudojami dideli kiekiai ATP.

Fotokv÷pavimas vyksta kai CO2 koncentracija yra žema, esant intensyviai fotosintezei, gali padid÷ti aktyvių deguonies formų ( tokių kaip O2

-) koncentracija, o tai yra žalinga ląstel÷s gyvybingumui. Tuo atveju fotokv÷pavimas sumažina deguonies koncentraciją ir slopina šviesos reakcijas

13.7.2CAM augalai. Fotosintez÷sefektyvumas gali būti didinamas padidinant efektyvią CO2 koncentraciją

ne erdv÷je o laike. Sukulentinaiai augalai augantys dykumose keičia CO2 uždarydami lapų žoteles. Dienos metų jų žiotel÷s yra uždarytos ir jie neišgarina vandens. Naktį, nukritus temperatūrai, jie atidaro žioteles, sugeria CO2 ir sintetina malatą tai pat kaip ir C4 augalai. Šis procesas vadinamas CAM (Crassulacean acid metabolism, jis pirmą kartą buvo nustatytas Crassulaceae šeimos augaluose). Dideli kiekiai fosfoenolpiruvato, reikalingi surišti CO2 susidaro skaidant krakmolą. Dienos metu malatas yra suskaidomas iki CO2 ir piruvato. CO2

381

patenka į Kalvino ciklą, o iš piruvato resintetinamas krakmolas. CAM augalai vykdo

fotosintezę ir minimaliai išgarina vandenį.

382

14 LIPIDŲ BIOSINTEZö Lipidai vaidina labai svarbų vaidmenį įvairiuose procesuose. Dauguma organizmų

riebalų molekul÷se saugo metabolinę energiją, lipidai yra membranų sudedamoji dalis. Specializuoti lipidai yra pigmentai (retinalis, karotinas), kofaktoriai (vitaminas K) detergentai (tulžies rūgštys), nešikliai (dolicholis), hormonai (lytiniai hormonai, vitamino D dariniai), viduląsteliniai ir antrin÷s signalin÷s molekul÷s (inozitolio fosfatai, ceramidas, diacilglicerolis, eikozanoidai), membraninių baltymų inkarai (fosfatidilinozitolio fosfatas, riebalų rūgščių liekanos, prenilo grup÷s). Dauguma lipidų žmogaus organizmas sintetina, kai kurias riebalų rūgštis turi gauti su maistu. Kaip ir kitos biosintetin÷s reakcijos lipidų biosintez÷ reikalauja ATP kaip energijos šaltinio ir reduktoriaus NADPH.

14.1 Riebalų rūgščių sintez ÷ ,

Riebalų rūgštys yra pagrindinis triacilglicerolių, fosfolipidų, glikolipidų komponentas. Riebalų rūgštys yra sintetinamos iš CH3COSKoA. Tokiu būdu, bet kuri į organizmą su maistu patenkanti medžiaga, iš kurios susidaro CH3COSKoA yra potencialus riebalų rūgščių šaltinis. Glikoliz÷s metu iš gliukoz÷s gaunamas piruvatas, kuris paverčiamas į CH3COSKoA. Aminorūgščių degradacijos produktai gali būti acetil-KoA. Riebalų rūgščių sintez÷ vyksta riebaliniame audinyje, kepenyse, pieno liaukose. Lipogenez÷ pagrindinai vyksta citozolyje, kai kurios stadijos yra endoplazminiame tinkle, mitochondrijose.

Nors visos riebalų rūgščių skaidymo reakcijos yra grįžtamos, tačiau riebalų rūgščių sintez÷ vyksta kitokiu keliu (14.1 pav.). Riebalų rūgščių sintezę katalizuoja skirtingi fermentai, riebalų rūgštys sintetinamos citozolyje, o oksiduojamos mitochondrijose, sintezei vandenilio donoru yra NADPH, o skaidymo metu vandenilis pernešamas ant NAD, sintezei dviejų anglies atomų donoras yra malonil-KoA, skaidymo metu dviejų anglies atomų fragmentas yra acetil-KoA.

383

.

β-oksidacija

Acil-KoA (Cn+2)FAD

FADH2

Enoil-KoA

L-β-hidroksiacil-KoA

β-ketoacil-KoA

Acil-KoA (Cn)

Acil-APB(Cn+2)

Enoil-APB

D-β-hidroksiacil-APB

β-ketoacil-APB

Acil-APB(Cn )

NAD+

NADH+H+

H2O

KoA

Acetil-KoA

NADP+

NADPH + H+

H2O

NADP+

NADPH + H+

KoA + CO2

Malonil-KoA

Biosintez÷

Vyksta mitochonrijose Vyksta citozolyje

Acilo grup÷snešiklis KoA

FAD elektronųakceptorius

NAD+ elektronųakceptorius

C2 produktasacetil-KoA

Acilo grup÷snešiklis APB

NADPH elektronųdonoras

NADPH elektronųdonoras

C2 donoras yramalonil-KoA

14.1 pav. Skirtumai tarp riebalų rūgščių β oksidacijos ir ribalų rūgščių biosintez÷s. Skiriasi proceso vieta, acilo grup÷s nešikliu, elektronų akceptoriu/donoru, forma, kuria C2 vienetas susidaro ar yra donoras.

Citozolyje sintetinama palmitino rūgštis (C16) , endoplazminiame tinkle sočios riebalų rūgštys paverčiamos nesočiomis, bei yra ilginama angliavandenilin÷ grandin÷. Angliavandenilin÷ grandin÷ yra ilginama ir mitochondrijose. Eukariotuose riebalų rūgščių sintezę galime suskirstyti į tris etapus Pirmame etape susidaręs mitochondrijose acetil-KoA pernešamas į citozolį. Antrame etape acetil-KoA yra karboksilinamas iki malonil-KoA, kuris yra grandin÷s ilginimo reakcijos substratas. Galutiniame etape, katalizuojant riebalų rūgščių sintazei, sujungiamos acetilo ir malonilo liekanos.

14.1.1Acetil-KoA pernešimas iš mitochondrij ų į citozol į. Riebalų rūgščių sinteze vyksta citozolyje, o substratas acetil-KoA susidaro

mitochondrijų užpilde oksidacinio piruvato dekarboksilinimo metu. Vidin÷ mitochondrijų membrana yra nelaidi acetil-KoA, tod÷l ląstel÷ acetilo liekanos pernešimui panaudoja gana

384

sud÷tingą

citratas citratas

oksalacetatas

oksalacetatas

piruvatas piruvatas

malatas

ATP + HSKoA

ADP + Pn + CH3-CO-SKoACitrato liaz÷

NADH + H+

NAD+

NADP+

NADPH + CO2

Malato dehidrogenaz÷

Malik fermentas

KoASH

CH3-CO-SKoA

ADP + Pn

HCO3- + ATP

Piruvato karboksilaz÷

Citrato sintaz÷

UŽPILDAS CITOZOLIS

trikarboksilatųtransporteris

vidin÷ mitochondrijųmembrana

malatas

Malato DHNAD+

NADH+H+

H+

PVR

14.2 pav. Acetilo liekanos pernešimas pro mitochondrijų vidinę membraną. mechanizmą, kurio metu pro membraną dviejų anglies atomų fragmentas pernešamas citrato formoje (14.2 pav.). Pernešime dalyvauja trikarboksilatų transporteris, kuris keičia citratą į anijonus (malatą, piruvatą ar fosfatą). Citozolyje, veikiant citrato liazei susidaro acetil-KoA ir oksalacetatas. Reakcija panaši į citrato sintaz÷s katalizuojamą reakciją, tačiau liazin÷je reakcijoje naudojama ATP hidroliz÷s energija. Oksalacetatas turi būti grąžintas į mitochondrijų užpildą. Vidin÷ membrana nelaidi oksalacetatui. Oksalacetatas redukuojamas iki malato ir citrato išnešamas iš mitochondrijų gali būti kompensuojamas tiesioginiu malato grįžimu į mitochondrijų užpildą. Tačiau yra kitas anijono pernešimo kelias. Veikiant malikfermentui malatas dekarboksilinamas ir piruvatas per jo pernešimo sistemą grįžta į užpildą. Malikfermento kofermentas yra NADP+, o susidaręs NADPH panaudojamas riebalų rūgščių biosintezei.

14.1.2Acetil-KoA karboksilinimas Citozolyje acetil-KoA yra karboksilinamas iki malonil-KoA, reakciją katalizuoja

acetil-KoA karboksilaz÷. Šio fermento kofermentas yra biotinas. CH3COSKoA + HCO3

- + ATP -OOCCH2COSKoA + ADP + Pn Reakcija vyksta keliais etapais – 1) aktyvuojamas HCO3

-. 2) aktyvuotas CO2 pernešamas ant biotino, esančios biotiną pernešančio baltymo sud÷tyje (BPB), 3) karboksigrup÷ prisijungia prie acetil-KoA ir susidaro malonil-KoA.

-

`HCO3 + ATP BPB Malonil-KoA

ADP + Pn BPB- COO Acetil-KoA

-

Biotinokarboksilaz÷ Transkarboksilaz÷

385

Gyvūnuose ir miel÷se reakciją katalizuoja bifunkcinis fermentas, kuriame fermentiniai aktyvumai lokalizuoti vienoje polipeptidin÷je grandin÷je. Bakterijose E.coli acetil-KoA karboksilaz÷ sudaryta iš trijų skirtingų baltymų. Vienas baltymas yra biotino karboksilaz÷ ir katalizuoja biotino karboksilinimą. Biotino prostetin÷ grup÷ prijungta prie biotiną pernešančio baltymo lizino ε-amino grup÷s. Trečis baltymas – transkarboksilaz÷ perneša karboksilą nuo BPB-COO- ant acetilo-KoA.

NHNH

SNH

C

O

O

CO

NH

H

NHN

SNH

C

O

O

CO

NH

H

OH

O

Biotinas Lizino liekana

HCO3-

14.3 pav. Biotinas ir karboksibiotinas surištas su baltymu. Biotino karboksilaz÷ aktyvuoja HCO3

- prijungdama jį prie biotino žiedo azoto. Šiai reakcijai panaudojama ATP hidroliz÷s energija. Veikiant transkarboksilazei CO2 nuo karboksibiotino pernešamas ant acetil-KoA. Ilga ir lanksti biotino “ranka” perneša aktyvuotą CO2 nuo vieno fermento aktyvaus centro prie kito.

Acetil-KoA karboksilazin÷ reakcija yra reguliuojama ir ji limituoja visą riebalų rūgščių sintez÷s greitį. Tiriant fermentą išskirta iš viščiuko kepenų buvo nustatyta, kad jis yra 2 formose; neaktyvus protomeras ir aktyvus oligomeras. Protomero molekul÷s asocijuojasi sudarydamos ilgus filamentus, kurių molekulin÷ mas÷ svyruoja tarp 4000 - 8000 kDa. Citozolinis citratas, kurio koncentracija padid÷ja pakilus acetil-KoA koncentracijai mitochondrijose, aktyvuoja polimerizacijos procesą ir riebalų rūgščių biosintezę, tuo tarpu palmitoil-KoA inhibuoja procesą. Acetil-KoA karboksilaz÷s aktyvumas taip reguliuojamas hormonais. Gliukagonas kaip ir adrenalinas stimuliuoja nuo cAMP priklausomą fermento fosforilinimą ir pusiausvyra pastumiama į neaktyvaus protomero susidarymo pusę. Insulinas pagreitina defosforilinimą ir aktyvaus polimero susidarymą.

14.1.3Riebalų rūgščių sintaz ÷ Palmitino rūgšties biosintezę katalizuoja riebalų rūgščių sintaz÷. Bakterijose E.coli fermentinis kompleksas sudarytas iš septynių fermentų ir acilą pernešančio baltymo (APB). Viena acetilo-KoA molekul÷ sujungiama su septyniomis malonil-KoA molekul÷mis. Susidaręs palmitoil-APB hidrolizuojamas ir išlaisvinama laisva palmitino rūgštis (C16H32O2)CH3COSKoA + 7 HOOCCH2COSKoA + 14NADPH + 14H+ C16H32O2 + 7CO2 + 8KoASH + 14NADP+ + 6CO2

386

APB perneša acetilo ar acilo liekanas sintaz÷s komplekse nuo vieno fermento ant kito.

HS-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-C-C-CH2-O-P-O-CH2-ser-APB

CH3

CH3 O

O

-

OH

H

HS-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-C-C-CH2-O-P-O-P-O-CH2

CH3

CH3 O

O

-

OH

H

APB fosfopanteteino prostetin÷ grup÷

KoA fosfopanteteino grup÷

O

HH

H

HH

Adeninas

O

O-

O3PO-2

14.4 pav. Acilą pernešantis baltymas ir KoASH

APB yra nedidel÷s molekulin÷s mas÷s 77 aminorūgščių termostabilus baltymas. Prie jo prisijungia tarpiniai riebalų rūgščių sintez÷s produktai. Acilo liekana, kuri pernešama nuo vieno fermento ant kito prijungta prie prostetin÷s 4-fosfopanteteino SH grup÷s, kuri kovalentiškai sujungta su baltymo APB serino OH grupe. Panaši struktūra yra KoASH, kuris perneša acilo liekaną riebalų rūgščių, angliavandenių skilimo reakcijose. (14.4 pav.).

14.1.4Riebalų rūgščių biosintez ÷s etapai Prieš kondensacijos reakciją acilo ir malonino grup÷s prijungiamos prie riebalų

rūgščių sintaz÷s. Acetilo grup÷, katalizuojant acetil-KoA-APB transacetilazei, pernešama nuo acetil-KoA ant β-ketoacil-sintaz÷s (kondensuojančio fermento) cisteino SH grup÷s. Kitoje reakcijoje malonilo grup÷ nuo malonil-KoA, katalizuojant malonil-KoA-APB transferazei, pernešama ant APB baltymo panteteino SH grup÷s. Kondensacijos reakcijoje (fermentas ββββ-ketoacil-sintaz÷) malonil-APB yra dekarboksilinamas, susidaręs karbanijonas atakuoja acetilo tiesterį ir susidaro β−ketoacil-APB. Kaip matome CO2, prisijungdamas prie acetil-KoA, tarnauja tiktai reakcijos inicijacijai. Kondensacijos reakcija yra pastumta į acetoacetilo susidarymą. Naujai sintetintų riebalų rūgščių visi anglies atomai yra kilę iš acetil-KoA. Tolimesn÷s riebalų rūgščių sintez÷s reakcijos yra analogiškos riebalų rūgščių β oksidacijos reakcijoms, tačiau vyksta priešinga kryptimi. Karbonilin÷ grup÷ redukuojama katalizuojant ββββ-ketoacil-APB reduktazei ir reduktoriumi tarnauja NADPH. Reikia pažym÷ti, kad susidaro D-β-hidroksibutiril-APB, riebalų rūgščių skaidymo metu turime L-izomerą. Sekančiame etape nuo β-hidroksibutiril-APB yra pašalinamas vanduo, susidarant trans-∆2-butenoil-APB. Reakciją katalizuoja ββββ-hidroksiacil-APB dehidrataz÷. Dvigubo ryšio redukciją katalizuoja enoil-APB reduktaz÷ ir elektronų donoras yra NADPH. Šių reakcijų metu iš dviejų, po du anglies atomus turinčių fragmentų yra sintetinamas keturių atomų fragmentas . Sekančiame etape butiril-APB pernešamas nuo APB SH grup÷s ant β-ketoacil-sintaz÷s cisteino SH grup÷s. Nauja molekul÷ malonil-KoA prisijungia prie APB ir reaguoja su butirilo grupe. Ciklas kartojasi šešis kartus kol susidaro palmitoil-KoA. Tioesterinis ryšys hidrolizuojamas katalizuojant palmitoilo tioesterazei, ir atsipalaiduoja galutinis produktas palmitino rūgštis.

387

CH3-CO-SKoA + APBSH OOC-CH2-CO-SKoA + APBSH

acetil-KoA-APBtransacetilaz÷

malonil-KoA-APBtransferaz÷HS-KoA HS-KoA

-

acetil-KoA malonil-KoA

OOC-CH2-CO-SAPB-

malonil-APB

CH3-CO-CH2-CO-SAPBβ-ketoacil-APB

HS-E

CH3-CO-S-E

β-ketoacil-sintaz÷ (HS-E)

CO2 +HS-E

H+ + NADPH

NADP+β-ketoacil-APB reduktaz÷

CH3-CHOH-CH2-CO-SAPB

D-β-hidroksibutiril-APB

H2O β-hidroksiacil-APB dehidrataz÷

CH3-C=C-CO-SAPB

H

H

trans-∆2−butenoil-APBH+ + NADPH

NADP+enoil-APB reduktaz÷

CH3-CH2-CH2-CO-SAPBbutiril-APB

ciklas kartojamas6 kartus

CH3-(CH2)14-SAPBpalmitoil-APB

CH3-(CH2)14-COO-

palmitatas

palmitoilo tioesteraz÷H2O

APB

14.5 pav. Riebalų rūgščių biosintez÷s reakcijos. Vyksta septyni kondensacijos ir redukcijos ciklai ir reakcija sustoja susidarant prijungtai prie APB palmitoilo grupei. Fermentas turi hidrolitinį aktyvumą (palmitoilo tiolaz÷) ir laisva

388

palmitino rūgštis atsipalaiduoja nuo APB. Kai kuriuose augaluose ( pavyzdžiui kokoso palm÷se) reakcija sustoja anksčiau ir sintetinamos riebalų rūgštys, turinčios 8-14 anglies atomų. Pirmoje riebalų rūgščių biosintez÷s dalyje sintetinamos septynios malonil-KoA molekul÷s. 7 Acetil-KoA + 7CO2 + 7ATP 7 malonil-KoA + 7ADP + 7Pn Sekančiame etape vyksta septyni kondensacijos ir redukcijos ciklai Acetil-KoA + 7 malonil-KoA + 14NADPH + 14H+

palmitatas + 7CO2 + 8 KoA + 14NADP+ + 6H2O Bendrą proceso lygtį galime užrašyti sekančiai 8 Acetil-KoA + 7 ATP + 14NADPH + 14H+

palmitatas + 8 KoA + 7ADP + 7Pn + + 14NADP+ + 6H2O

14.1.5Riebalų rūgščių sintez ÷ eukariotuose Riebalų rūgščių sintaz÷s struktūra eukariotuose skiriasi nuo fermento E.coli ląstel÷se. Fermentas, išskirtas iš mielių, sudarytas iš dviejų tipų polipeptidinių grandinių α ir β, kurios susijungusios santykiu α6β6. Fermento molekulin÷ mas÷ siekia 2500 kDa. Žinduoliuose riebalų rūgščių sintaz÷ sudaryta iš dviejų vienodų polipeptidinių grandinių, Kiekvienoje polipeptidin÷je grandin÷je yra po tris domenus, kurie sujungti judria polipeptidine grandine. Pirmame domene yra substratų prijungimo ir kondensacijos vieta. Čia randama acetil- ir malonil-KoA-APB transacilaz÷s ir β-ketoacil-APB sintaz÷. Antras - redukcinis domenas. Jam priklauso APB, β−ketoacil-APB reduktaz÷, β-hidroksiacil-APB reduktaz÷ ir enoil-APB reduktaz÷. Trečiame domene yra tioesteraz÷, kuri katalizuoja palmitato atsipalaidavimą nuo APB. Yra pasiūlyta, kad du subvienetai kontaktuoja “galva-uodega”, kur judri vieno subvieneto APB fosfopanteteino grandin÷ perneša reakcijos produktus nuo vieno fermento aktyvaus centro ant kito, esančių kitame subvienete.

14.1.6Angliavandenilin ÷s grandin ÷s ilginimas ir neso čių riebal ų rūgščių sintez ÷ Riebalų rūgščių sintez÷s metu sintetinama palmitino rūgštis (C16:0), tačiau

organizmui reikalingos įvairaus ilgio ir skirtingo sotumo laipsnio riebalų rūgštys. Grandin÷s ilginimas vyksta mitochondrijose ir endoplazminio tinklo paviršiuje. Riebalų rūgščių elongacija prasideda tiolazine reakcija, prijungiant dviejų anglies atomų fragmentą prie palmitoil-KoA. Reakcijos vyksta analogiškai riebalų rūgščių oksidacijos reakcijoms, tačiau priešinga kryptimi ir redukcijai panaudojamas NADPH.

389

R-CH2-CO-SKoA -

Acil-KoA

CH3-CO-SKoA

KoASH

R-CH2-C=C-CO-SAPB

H

H

α,β-trans-enoil-KoA

Tiolaz÷

R-CH2-CO-CH2-CO-SKoA

β-ketoacil-KoA

H+ + NADPH

NADP+

enoil-APB reduktaz÷

R-CH2-CHOH-CH2-CO-SKoA

β-hidroksiacil-KoA

H2OEnoil-KoA hidrataz÷

β-hidroksiacil-KoA dehidrogenaz÷

H+ + NADPH

NADP+

R-CH2-CH2-CH2-CO-SKoA Acil-KoA (2 anglies atomais ilgesnis)

14.6 pav. Riebalų rūgščių grandin÷s ilginimas. Eukariotų ląstelių mikrosomose yra fermentin÷ sistema - riebalų rūgščių desaturaz÷,

kuri atskelia vandenilį nuo riebalų rūgščių grandin÷s (C16 ar C18), susidarant nesočioms riebalų rūgštims. Žinduoliai turi keletą skirtingo specifiškumo terminalinių desaturazių - ∆9-, ∆6-, ∆5-, ∆4.

CH3-(CH2)x-CH2-CH2-(CH2)y-CO-SKoA + NADH + H+ + O2

CH3-(CH2)x-C=C-(CH2)y-CO-SKoA + NAD+ + 2H2O

H H

Desaturaz÷

Šią reakciją katalizuoja neheminę geležį turintys fermentai (x yra minimum penki ir grandin÷je gali būti dvigubi ryšiai, (CH2)y dalis neturi dvigubų ryšių). Žinduolių terminalin÷s desaturaz÷s yra daugiakomponentin÷ sistema, į kurią įeina desaturaz÷, citochromas b5 ir NADH-citochromo b5 reduktaz÷. Fermentai, katalizuojantys šią reakciją išsid÷stę ant vidin÷s endoplazminio tinklo membranos pus÷s.

Reakciją katalizuoja stearil-KoA desaturaz÷ (53kDa molekulin÷ mas÷), į kurios sud÷tį įeina nehemin÷ geležis. Reakcijoje dalyvauja NADH ir deguonis, bei du kiti baltymai citochromo b5 reduktaz÷ (43kDa flavoproteinas) ir citochromas b5 (16,7kDa). Visi trys baltymai susijungę su endoplazminiu tinklu. Citochromo b5 reduktaz÷ perneša du elektronus

390

nuo NADH per FAD ant citochromo b5. Redukuoto citochromo oksidacija susijusi su nehemin÷s Fe3+ redukcija iki Fe2+ desaturaz÷je. Fe3+ prisijungia du elektronus nuo cit b5 ir susidaro dvigubas ryšys tarp 9,10 anglies atomų. Riebalų rūgščių desaturacijos reakcijoje O2 yra galutinis elektronų akceptorius. Susidaro dvi vandens molekul÷s, tai rodo, kad du elektronai at÷jo iš NADH ir du iš riebalų rūgščių molekul÷s, kuri yra dehidrinama. Stearil-KoA+O2+2H+

(18:0)

Oleil-KoA+2H2O

(18:1∆9)

desaturaz÷red

2Fe2+

desaturaz÷oks

2Fe3+

2cit b5(oks)

2cit b5(red)

E-FADH2

E-FAD

NAD+

NADH+H+

NADH-citochromo b5 reduktaz÷

Pav. 14.6 pav. Elektronų pernešimas riebalų rūgščių desaturaz÷s reakcijoje. Po desaturacijos reakcijos, angliavandenilin÷s grandin÷ gali būti ilginama.

Žinduolių desaturaz÷s negali įvesti dvigubo ryšio į ∆12 ir ∆15pad÷tis, tod÷l jie nesintetina linolo ir linoleno rūgščių. Šias riebalų rūgštis sintetina augalai ir žmogus jas gauna su maistu. Linolo ir linoleno rūgštys yra būtinas maisto komponentas ir vadinamos nepakeičiamomis riebalų rūgštimis. Patekusios su maistu šios rūgtys tliau gali būti metabolizuojamos. Ypatingai svarbi yra arachidono rūgšties (C20:4∆5,8,11,14) sintez÷ iš linolo rūgšties. Šis sintez÷s kelias pateiktas 14.8 pav. Arachidono rūgštis yra labai svarbių biologiškai aktyvių junginių eikozanoidai pirmtakas (skyrius). Bendra riebalų rūgščių grandin÷s ilginimo ir desaturacijos schema pateikta 14.9 pav.

391

Linolo rūgštis

KoASH, ATP

AMP, PPn

Linoeil-KoA18:2 ∆9,12 S-KoA

18:3 ∆6,9,12 S-KoA

20:3 ∆8,11,14 S-KoA

Arachidonil-SKoA20:4 ∆5,8,11,14 S-KoA

Arachidono rūgštis20:4 ∆5,8,11,14 S-KoA

Desaturacija

Elongacija

Desaturacija

KoASH

Eikozanoidai

Palmitatas 16:0

Stearatas 18:0

ElongacijaPalmitiloleatas 16:1∆9

Desaturacija

Desaturacija

Oleatas 18:1∆9

Elongacija

Ilgos grandin÷ssočios riebalų rūgštys

Desaturacijatiktai augaluose

Linolatas 18:2∆9,12

Desaturacija

γ-linoleatas18:3∆6,9,12

Desaturacijatiktai augaluose

α-linoleatas18:3∆9,12,15 Elongacija

Eikozotrienoatas20:3∆8,11,14

Arachidonatas20:4∆5,8,11,14

Kitos pilnesočiosriebalų rūgštys Desaturacija

14.8 pav. Arachidono rūgšties 14.9 Bedra riebalų rūgščių grandin÷s ilginimo ir desaturacijos biosintez÷ iš linolo rūgties schema. žinduolių organizme.

14.2 Triacilgliceroli ų biosintez ÷ Patekusios su maistu ar naujai sintetintos riebalų rūgštys gali būti a) panaudojamos triacilglicerolių biosintezei ir taip saugoma metabolin÷ energija b) gali būti įjungiamos į membraninius lipidus

392

glicerol-3-P

CH2OH

CHOH

CH2OPO32-

2 R-CO-SKoA

CH2O-CO-R

CHO-CO-R

CH2OPO32-

fosfatidin÷ rūgštis

acil-transferaz÷

fosfataz÷

CH2O-CO-R

CHO-CO-R

CH2OHdiacilglicerolis

acil-transferaz÷

R-CO-SKoA

CH2O-CO-R

CHO-CO-R

CH2O-CO-Rtriacilglicerolis

glicerofosfolipidai

gliukoz÷

Fosfodihidroksi-acetonas

NADH+H+

NAD+

glicerolio 3-fosfatodehidrogenaz÷

CH2OH

CHOH

CH2OHglicerolis

ATP

ADP

glicerolio kinaz÷

14.10 pav. Triacilglicerolių biosintez÷s reakcijos.

Triacilglicerolių sintez÷ prasideda nuo riebalų rūgščių liekanų (R-CO-KoA) prijungimo prie glicerolio 3-fosfato. Glicerolio fosfatas gali susidaryti redukuojant fosfodihidroksiacetoną arba fosforilinant glicerolį. Katalizuojant aciltransferaz÷ms acilo liekana nuo acil-KoA pernešama ant glicerolio 3-fosfato, susidarant fosfatidinei rūgščiai. Veikiant fosfatazei fosforo rūgšties liekana pašalinama ir prie diacilglicerolio prijungiama dar viena acilo liekana. Tokiu keliu sintetinami triacilgliceroliai. Fosfatidin÷ rūgštis yra ir fosfoacilglicerolių sintez÷s pirmtakas.

14.3 Fosfoacilgliceroli ų biosintez ÷ Fosfoacilglicerolių biosintez÷je prie fosfatidin÷s rūgšties yra prijungiama “galva”, kuria

gali būti cholinas, etanolaminas, serinas ar kita hidrofilin÷ medžiaga.

393

Eukariotų ląstel÷se fosfolipidų sintez÷ vyksta ant lygiojo endoplazminio tinklo membranos. Vieni naujai sintetinti fosfolipidai lieka ET membranoje, kiti pernešami į kitas ląstel÷s membranas.

Glicerofosfolipiduose “galva” prie diacilglicerolio prijungiama fosfoesteriniu ryšiu per fosforo rūgšties molekulę. Diacilglicerolio ar “galvos” hidroksigrup÷ sudaro esterinį ryšį su fosforo rūgštimi. Hidroksilo grup÷ aktyvuojama prijungiant citidintrifosfatą (CTP). Yra dvi “galvos” prijungimo strategijos galima aktyvuoti diacilglicerolio hidroksigrupę arba aktyvuoti „galvos“ hidroksigrupę. CTP gali būti prijungtas: a) prie diacilglicerolio, susidarant aktyviam CDP-diacilgliceroliui (kelias I) b) prie “galvos” hidroksigrup÷s, susidarant aktyvuotai CDP-„galvai“ (kelias II) Nukleofilin÷s atakos metu CMP yra pakeičiama kitu hidroksilu.

CH2O-CO-R

CHO-CO-R

CH2O P O

O

O P O

O

O

rib

citozinas

CDP-diacilglicerolis

HO "galva"

CH2O-CO-R

CHO-CO-R

CH2OH POO

O P O

O

O

rib

citozinas

1,2-diacilglicerolis

"galva"

-

-O

-

-

CH2O-CO-R

CHO-CO-R

CH2O P O

O

O

"galva"-

glicerofosfolipidas

CMPCMP

kelias IIkelias I

Diacilglicerolisaktyvuotas CDP

"Galva"aktyvuota CDP

+ +

14.11 pav. Fosfoglicerolių sintez÷s pagrindiniai keliai

Įvairiuose organizmuose fosfoacilgliceroliai sintetinami skirtingais keliais. Bakterijose citidino difosfoacilglicerolis (CDP-diacilglicerolis) sintetinamas iš fosfatidato ir CTP. Pakeitus CMP molekulę cholinu ar glicerolio-3-P susidaro fosfatidilserinas arba fosfatidilglicerolfosfatas, kurį defosforilinus gauname fosfatidilglicerolį. Dekarboksilinant fosfatidilseriną susidaro fosfatidiletanolaminas. Šio fosfolipido amino grup÷ yra tris kartus metilinama, susidarant fosfatidilcholinui. Metilinimui naudojamas S-adenozilmetioninas (SAM).

Fosfoacilgliceroliai žinduoliuose gali būti sintetinami panaudojant gaunamą su maistu choliną ar etanolaminą. Cholinas fosforilinamas panaudojant ATP iki fosforilcholino, kuris reaguodamas su CTP sudaro CDP-choliną . Reaguojant CDP-cholinui su diacilgliceroliu,

394

susidaro fosfatidilcholinas. Analogiškai yra sintetinamas ir fosfatidiletanolaminas. Bakterijose fosfatidiletanolaminas gali susidaryti iš fosfatidilserino vykstant etanolamino ir serino liekanų mainams.

Fosfatidiletanolaminas

Fosfatidilcholinas

Fosfatidilserinas

CDP-etanolaminas

CDP-cholinas

Etanolaminas Cholinas

Diacilglicerolis

CMP CMP

CO2

Serinas

Etanolaminas

3 SAM

CDP-diacil-glicerolis

CMP

SerinasBakterijosMiel÷s

Žinduoliai

14.12 pav. Fosfoacilglicerolių biosintez÷ ir tarpusavio ryšys.

14.4 Cholesterolio sintez ÷ Cholesterolis yra būtinas gyvųjų ląstelių komponentas. Cholesterolis į organizmą

patenka su maistu be to jis yra sintetinamas organizme. Jis sintetinamas visose žmogaus organizmo ląstel÷se, tačiau daugiausiai kepenyse, žarnyne, antinksčių žiev÷je. Suaugusio žmogaus organizme jo būna apie 150g. Didžiausia jo koncentracija yra smegenyse, inkstuose, kepenyse. Jis įeina į biologinių membranų sud÷tį, yra įvairių steroidinių hormonų, tulžies rūgščių pirmtakas, iš cholesterolio, veikiant šviesai sintetinamas vitaminas D. Kraujo plazmoje cholesterolio koncentracija yra gana pastovi ir lygi 50-200mg/100ml tirpalo. Cholesterolio koncentracijai padid÷jus iki 200-300mg/100ml cholesterolis atsideda ant kraujagyslių sienelių, sumaž÷ja kraujagyslių skersmuo, pradeda vystytis ateroskleroz÷. Normali cholesterolio koncentracija kraujyje palaikoma esant nesutrikusiai cholesterolio apykaitai bei laikantis tinkamo mitybos r÷žimo.

395

Cholesterolis (C27) sintetinamas iš acetil-KoA molekulių. Sintez÷ vyksat citozolyje ir endoplazminio tinklo membranoje. Sintezuotoje cholesterolio molekul÷je dalis anglies atomų yra kilę iš acetato metilo -CH3 grup÷s (pažym÷ti raide m), kita dalis iš karbonilinio anglies atomo.

Cm

m

m m

m

m

m

m

m

m

m

mm

m

14.13 pav. Acetil-KoA molekul÷s anglies atomų išsid÷styma cholesterolio molekul÷je

( m-pažym÷ti anglies atomai kilę iš acetato metilo grup÷s) Cholesterolio biosintez÷je galima išskirti 4 stadijas:

1. Trys molekul÷s acetil-KoA (C2) kondensuojasi, susidarant mevalonatui (C6). 2. Mevalonatas yra paverčiamas į aktyvuotą izopreno liekaną 3. Polimerizuojantis šešioms izopreno liekanoms susidaro turinti 30 anglies atomų

linijin ÷ skvaleno molekul÷. 4. Ciklizacijos, oksidacijos, metilo grup÷s migracijos ar pašalinimo metu susidaro

galutinis produktas cholesterolis, turintis 27 anglies atomus.

396

acetatasCH3-COO-

OOC-CH2-C-CH2-CH2OH

CH3

OH

-

mevalonatas

CH2=C-CH2-CH2-O-P-O-P-

O

O-

O-O

-O

aktyvuotas izoprenas

skvalenas

OHcholesterolis

1

2

3

4

CH3

14.14 pav. Cholesterolio biosintez÷s etapai

14.4.1 Mevalonato sintez ÷ iš acetato Pirmame cholesterolio sintez÷s etape dvi acetil-KoA molekul÷s kondensuojasi

susidarant acetoacetil-KoA, kuris jungiasi su dar viena acetil-KoA ir gauname β-hidroksi-β-metilglutaril-KoA (HMG-KoA). Šias reakcija katalizuoja atitinkamai tiolaz÷ ir HMG-sintaz÷. Šie du fermentai yra citozoliniai izofermentai, mitochondrijose esantys izofermentai acetil-KoA panaudoja ketoninių junginių sintezei. Trečią reakciją katalizuoja HMG-reduktaz÷, kuri yra endoplazminio tinklo integralusis baltymas. Jis yra pagrindinis cholesterolio sintezę reguliuojantis baltymas.

397

acetil-KoA2CH3-CO-SKoA

CH3-CO-CH2-CO-SKoAacetoacetil-KoA

KoA-SHtiolaz÷

KoA-SH

CH3-CO-SKoAHMG-KoAsintaz÷

OOC-CH2-C-CH2-CO-SKoA

CH3

OH

-

β-hidroksi-β-metil-glutaril-KoA (HMG-KoA)

2NADPH + 2H+

KoA-SH

2NADP+

OOC-CH2-C-CH2-CH2OH

CH3

OH

-

mevalonatas

HMG-KoAreduktaz÷

14.15 pav. Mevalonato susidarymas iš acetil-KoA Aktyvuotos izopreno liekanos sintez÷ Mevalonatas yra paverčiamas į penkių anglies atomų (C5) junginį izopentenilpirofosfatą jį du kartus fosforilinant ir dekarboksilinant. Isopenetenilpirofosfatas yra labai svarbus izopentenilo donoras, panaudojamas daugelyje sintezių.

398

P O

O

O

P O

O

O

P O

O

O

P O

O

O

P O

O

O

C

CH2

CH3

OOC-CH2-C-CH2-CH2OH

CH3

OH

-

Mevalonatas

Fosfomevalonatas

ATP

ADP

Mevalonato kinaz÷

ATP

ADP

Fosfomevalonato kinaz÷

OOC-CH2-C-CH2-CH2-O-

CH3

OH

- --

OOC-CH2-C-CH2-CH2-O-

CH3

OH

-

--

-

Pirofosfomevalonatas

ATP

ADP + Pn

Pirofosfomevalonato dekarboksilaz÷

CH2-C-CH2-CH2-O-

CH3

OH --

-

Izopentenilpirofosfatas

HCO3-

14.16 pav. Izopentenilpirofosfato sintez÷ iš mevalonato Skvaleno susidarymas iš izopentenilpirofosfato

Izopentenilpirofosfato izomerizaciją į dimetilalanilpirofosfatą katalizuoja izomeraz÷. Susidariusios dvi aktyvuotos izopreno liekanos, sujungiamos „galva-uodega“ į C10 geranilpirofosfatą, katalizuojant preniltransferazei. Šio tipo reakcija yra pakartojama, geranilpirofostatas kondensuojasi „galva-uodega“ būdu su trečia izopentenilpirofosfato molekule ir susidaro 15 anglies atomų junginys farnezilpirofosfatas. Dvi molekul÷s farnezilpirofosfato toliau jungiasi „galva-uodega“ susidarant C30 skvalenui. Pirofosfato hidroliz÷ pastumia reakcijos pusiausvyrą skvaleno susidarymo kryptimi.

399

O P

O

O

O P

O

O

O

O P

O

O

O P

O

O

O

O P

O

O

O P

O

O

O

O P

O

O

O P

O

O

O

O P

O

O

O P

O

O

O

-

--

Izopentenilpirofosfatas

-

--

Dimetilalilpirofosfatas

Izomeraz÷

-

--

Geranilpirofosfatas

-

--

IzopentenilpirofosfatasPPn

-

--

Farnezilpirofosfatas

Farnezilpirofosfatas

Skvalenas

NADPH + H+

NADP+

PPn

Preniltransferaz÷

Preniltransferaz÷

Skvaleno sintaz÷

14.17 pav. Skvaleno biosintez÷ iš aktyvuotų izoprenų. Cholesterolio sintez÷ iš skvaleno. Skvalenas yra linijin÷ molekul÷, steroliai yra ciklin÷s struktūros turinčios keturius

sujungtus žiedus. Steroliai yra alkoholiai su hidroksigrupe prie C-3. Deguonies atomas

400

įjungiamas veikiant skvaleno monooksigenazei. Šis fermentas yra mišrios funkcijos oksidaz÷, prijungianti vieną deguonies atomą prie skvaleno, kitas įeina į vandens molekulę. Iš skvaleno 2,3-epoksido gali susidaryti stigmasterolis (augaluose), ergosterolis (grybuose) ir cholesterolis (gyvūnuose). Cholesterolio sintez÷ iš lanosterolio yra daugiastadijinis procesas susidedantis daugiau nei iš 20 reakcijų. Pradžioje vyksat anglies grandin÷s sutrump÷jimas nuo 30 iki 27 anglies atomų ir dvigubo ryšio migracija nuo C-8 iki C-5, bei dvigubo ryšio tarp C-24 ir C-25 redukcija.

401

OH

O

OH

OH

OH

C2H5

Skvalenas

cholesterolis

Skvaleno 2,3-epoksidas

Lanosterolis

Ergosterolis

Stigmasterolis

Skvalenomonooksigenaz÷

NADPH + H+

NADP+

O2

H2O

Ciklaz÷

Augalai

Grybai

14.18 pav. Cholesterolio biosintez÷ iš skvaleno

14.4.2Cholesterolio transporto ir biosintez ÷s reguliacija. Cholesterolio molekul÷s žiedas žmogaus organizme n÷ra metabolizuojamas iki CO2 ir

H2O. Cholesterolis yra paverčiamas į tulžies rūgštis ir tokiu būdu pašalinamas iš organizmo.

402

Dalis cholesterolio žarnyne yra modifikuojama žarnyno mikroorganizmų ir susidarę koprostanolis, cholestanolis yra pašalinami.

Labai svarbi problema yra cholesterolio apykaitos reguliacija, kadangi jos sutrikimai sukelia aterosklerozę. Organizmas cholesterolis gaunamas su maistu, taip pat jis yra sintetinamas ląstel÷je. Žinduolių organizme per 90% cholesterolio sintetinama kepenyse ir dauguma sintetinto cholesterolio ( 75% ) panaudojama tulžies rūgščių sintezei. Pagrindinai sintezuojama cholin÷ rūgštis ir jos junginiai su taurinu ir glicinu - taurocholin÷ ir glikocholin÷ rūgštys, kurios labai svarbios riebalų skaidyme. ,

Cholesterolio biosintez÷s reguliacija 1. Nuo sterolių priklausoma genų ekspresija. HMG KoA reduktaz÷s genas yra

kontroliuojamas transkripcijos faktoriaus (SREBP sterol regulatory element binding protein), kuris jungiasi prie DNR sterolių reguliuojančio elemento (SRE sterol regulatory element) esančio upstream reduktaz÷s geno. Pradžioje SREBP prisijungia prie endoplazminio tinklo, pop peptidazių poveikio atsipalaiduoja aktyvus polipeptidas, kuris keliauja į branduolį. Prisijungus SREBP padid÷ja reduktazinio geno raiška. Esant žemai cholesterolio koncentracijai SREBP aktyvuojmas ir padid÷jus HMG KoA reduktaz÷s aktyvumui, išauga cholesterolio sintez÷. Atvirkščiai, padid÷jus cholesterolio koncentracijai transkripcijos faktorius n÷ra aktyvuojamas. Cholesterolis taip pat veikia HMG KoA reduktaz÷s baltymo ir jo iRNR stabilumą. Padid÷jus cholesterolio kiekiui stabilumas sumaž÷ja ir degradacija išauga.

2. Kovalentin÷ modifikacija . HMG KoA reduktaz÷s aktyvumas sumaž÷ja baltymą fosforilinus. Fosforilinimo lygį sąlygoja baltymo kinaz÷s ir fosfoproteino fosfataz÷s aktyvumai. Baltymo kinazę aktyvuoja AMP, cholesterolio sintez÷ sul÷t÷ja, sumaž÷jus ATP koncentracijai.

3. Hormonin÷ reguliacija. HMG KoA reduktaz÷s aktyvumą ir kiekį reguliuoja hormonai. Adrenalinas ir gliukagonas mažina cholesterolio sintezę palaikydami MHG KoA reduktazę fosforilintoje formoje. Insulinas aktyvuoja reduktaz÷s defosforilinimą ir didina jos aktyvumą.

4. Cholesterolio esterifikacija. Didel÷s viduląstelin÷s cholesterolio koncentracijos aktyvuoja ACAT ir padid÷ja cholesterolio esterifikacija

5. Cholesterolio sintez÷s slopinimas vaistais. Statino vaistai – lovastatinas, mevastainas yra HMG KoA analogai ir yra grįžtami HMG KoA reduktaz÷s inhibitoriai.

Cholesterolio pernešimo organizme reguliacija. Cholesterolis kraujyje iš kepenų į organus pernešamas susijungęs su mažo tankio lipoproteinais (MTL). MTL apvalkalo baltymas susijungia su ant ląstelių paviršiaus esančiais specifiniais receptoriais ir kompleksas endocitoz÷s būdu patenka į ląstel÷s vidų. Lizosomin÷s proteaz÷s hidrolizuoja MTL baltymus, o cholesterolio esteris hidrolizuojamas rūgštin÷s lipaz÷s. Pats MTL receptorius nepakitęs v÷l įsijungia į plazminę membraną, o laisvas cholesterolis gali įsijungti į membranų sud÷tį arba esterifikuotas pasilikti ląstel÷s viduje. Didel÷ cholesterolio koncentracija ląstel÷s viduje mažina MTL receptoriaus sintezę ir cholesterolio transportas iš kraujo į ląsteles blokuojamas

403

15 ANGLIAVANDENI Ų BIOSINTEZö Angliavandenių biosintez÷ intensyviausiai vyksta augaluose ir mikroorganizmuose

fotosintez÷s proceso metu. Juose yra fiksuojamaas anglies dvideginis ir Kalvino ciklo metu sintetinam monosacharidai. Augalai sintetina sacharozę, krakmolą, įvairius oligo- ir polisacharidus. Gyvūnuose gliukoz÷ gali susidaryti iš įvairių pirmtakų gliukoneogenez÷s metu, be to yra sintetinamas glikogenas, glikoproteinai, disacharidai. (15.1 pav.).

Kraujogliukoz÷

Monosacharidai Disacharidai Glikogenas Glikoproteinai

Krakmolas

Sacharoz÷

Triacilgliceroliai Glicerolis

Gliukoz÷s 6-fosfatas

Fosfoenolpiruvatas

Piruvatas

Trikarboksirūgščių ciklas

Glikogenin÷s aminorūgštys

Laktatas

3-fosfogliceratas CO2 fiksacija

Glikogenin÷s aminorūgštys

15.1. Bendra angliavandenių biosintez÷s schema iš paprastų pirmtakų. Gliukoz÷s 6-fosfatas yra pirmtakas monosacharidų, oligosacharidų, polisacharidų sintezei.

15.1 Gliukoneogenez ÷ Organizmas gliukozę pagrindinai gauna su maistu, laisvos gliukoz÷s yra tiktai per 20g.

Žinduoliai, negaunantys maisto 16-24 val pilnai išnaudoja organizmo gliukoz÷s ir glikogeno atsargas. Žinduoliams gliukoz÷ yra būtina, nes smegenys, nervų sistema, taip pat eritrocitai, s÷klid÷s, inkstai kaip energijos šaltinį naudoja tiktai šį angliavandenį. Žmogaus smegenys per parą metabolizuoja per 120g gliukoz÷s. Žinduolių organizmuose gliukoz÷ gali būti sintetinama iš glikogeninių aminorūgščių, pieno rūgšties, piruvo rūgšties, glicerolio ir kitų medžiagų. Šis procesas yra vadinamas gliukoneogenez÷. Aukštesnieji gyvūnai gliukozę pagrindinai sintetina kepenyse. Gliukoz÷ iš kepenų patenka į kraują ir pernešama į įvairius

404

organus, kur metabolizuojama. Dauguma mikroorganizmų gali augti naudodamos paprastus anglies šaltinius kaip acetatą, laktatą, propionatą, kurie gliukoneogenez÷s metu paverčiami į gliukozę.

Gliukoz÷s sintez÷s iš piruvo rūgšties reakcijos yra panašios į glikoliz÷s reakcijas, sutampa dauguma fermentų, reakcijų tarpininkai, dauguma reakcijų vyksta citozolyje. Trys glikoliz÷s reakcijos yra negrįžtamos ir negali būti tiesiogiai panaudojamos gliukoneogenezei. Negrįžtamos reakcijos yra šios - gliukoz÷s virtimas į gliukoz÷s 6-fosfatą, katalizuojamos heksokinaz÷s, fruktoz÷s 6-fosfato fosforilinimo reakcija veikiant fosfofruktokinazei I ir piruvato susidarymas iš fosfoenolpiruvato dalyvaujant piruvato kinazei. Ląstel÷je šių reakcijų ∆G yra labai neigiamas. Gliukoneogenez÷je šios trys stadijos vyksta kitu keliu, katalizuojant skirtingiems fermentams. Glikoliz÷s ir glikogenoliz÷s reguliacija taip yra skirtinga.

Fermentai, katalizuojantys gliukoneogenezę yra citozolyje, išskyrus gliukoz÷s 6-fosfatazę (endoplazminio tinklo fermentas), piruvato karboksilazę (esančią tiktai mitochondrijose) ir PEP karboksikinazę (esančia skirtinguose kompartmentuose). Žiurk÷s kepenyse PEP karboksikinaz÷ yra citozolyje, tačiau paukščių kepenyse ji yra mitochondrijose. Žmogaus ir daugumos žinduolių organizme ji sutinkama lygiais kiekiais citozolyje ir mitochondrijose. Piruvato karboksilaz÷s yra tiktai mitochondrijose, tod÷l piruvatas turi būti pernešamas iš citozolio į mitochondrijas.

Mes prad÷sime nagrin÷ti gliukoneogenezę nuo pagrindinio etapo, kuriuo apeinama piruvato kinazin÷ reakcija. Tiesioginis piruvato fosforilinimas iki fosfoenolpiruvato nevyksta, tačiau dalyvaujant keliems papildomiems fermentams, esantiems mitochondrijose ir citozolyje, piruvatas per tarpininkus paverčiamas į fosfoenolpiruvatą (PEP). Piruvatas į mitochondrijas pernešamas iš citozolio arba sintetinamas mitochondrijų užpilde iš alanino peramininimo reakcijos metu. Mitochondrin÷ piruvato karboksilaz÷ katalizuoja piruvo rūgšties karboksilinimą į oksalacto rūgštį

COO

CO

CH3

HCO3

COO

CO

CH2

COO-

+

-

-Piruvato karboksilaz÷

-

Piruvatas Oksalacetatas

ATP ADP+Pn

Piruvato karboksilaz÷ sudaryta iš keturių identiškų subvienetų, jos molekulin÷ mas÷

520 kDa. Prie kiekvieno subvieneto lizino ε aminogrup÷s kovalentiškai prijungtas biotinas. Biotinas dalyvauja karboksigrup÷s pernešime. Karboksilaz÷ katalizuoja negrįžtamą reakciją, kuri alosteriškai aktyvuojama acetil-KoA. Ši reakcija yra anaplerotin÷ reakcija, jos pagalba galima padidinti trikarboksirūgščių ciklo tarpininkų koncentraciją. Oksalacetatas nepraeina pro mitochondrijų vidinę membraną, keturių anglies atomų fragmentas pernešamas malato arba aspartato pavidalu, kuris išeina iš mitochondrijų per malato-α-ketoglutarato nešiklį, esantį vidin÷je mitochondrijų membranoje (15.2 pav.). Oksalacetatas mitochondrijose redukuojamas malato dehidrogenaz÷s panaudojant NADH.

Oksalacetatas + NADH + H+ malatas + NAD+ Citozolyje malatas oksiduojamas citozolin÷s malato dehidrogenaz÷s. Kitoje reakcijoje,

katalizuojant fosfoenolpiruvato karboksikinazei (PEP karboksikinaz÷), oksalacetatas yra paverčiamas fosfoenolpiruvatu.

405

COO

C

CH2

COO

CO

CH2

COO- CO2

PO32O -

- PEP karboksikinaz÷

-

Oksalacetatas Fosfoenolpiruvatas

GTP GDP+Pn

~

Šioje dekarboksilinimo reakcijoje didžiaenergio fosfato donoru tarnauja GTP.

Reakcija fiziologin÷se sąlygose yra grįžtama. Bendrą fosfoenolpiruvato susidarymo iš piruvo rūgšties reakciją galime užrašyti šia

lygtimi:

PVR + ATP + GTP + HCO3 PEP + ADP + GDP + Pn + CO2

∆G0/ = 0,9kJ/mol

-

Du didžiaenergiai junginiai ATP ir GTP panaudojami PEP sintezei, kurio hidroliz÷s

energija lygi –61,9 kJ/mol. CO2 molekul÷ prisijungusi prie piruvato, atsipalaiduoja PEP karboksikinazin÷je reakcijoje. Analogiškas CO2 aktyvuojantis poveikis yra riebalų rūgščių sintez÷s metu, karboksilinant acetil-KoA.

Ląstel÷s citozolyje NADH/NAD+ santykis yra labai žemas (8x10-4) tai yra apie 105 žemesnis nei mitochondrijose. NADH reikalingas gliukoneogenez÷je redukuoti 1,3-bisfosfogliceratą į glicerolio aldehido-3-fosfatą. Pernešant malatą į citozolį ir paverčiant jį oksalacetatu padid÷ja redukuojančių ekvivalentų (NADH) koncentracija citozolyje.

PVR

PVR

OAR

Malatas

Malatas

OAR

PEP

Laktatas

PVR

PVR

OAR

PEP

PEP

NAD+

NADH+H+

NAD+

NADH+H+

NADH+H+

NAD+

Piruvatokarboksilaz÷

Piruvatokarboksilaz÷

Mitochondrin÷PEP karboksikinaz÷

Citozolin÷PEP karboksikinaz÷

Citozolin÷malatodehidrogenaz÷

Mitochondrin÷malatodehidrogenaz÷

15.2 pav. Fosfoenolpiruvato alternatyvūs susidarymo keliai Sintetinat gliukozę iš laktato hepatocituose fosfoenolpiruvatas gaminamas trumpesniu

keliu. Laktato dehidrogenazin÷s reakcijos metu citozolyje susidaro piruvatas ir NADH. Piruvatas pernešamas į mitochondrijas ir paverčiamas oksalacetatu, kur mitochondrin÷ PEP karboksikinaz÷ katalizuoja PEP susidarymą. Fosfoenolpiruvatas išeina į citozolį ir dalyvauja

406

gliukoneogenez÷je. Tokiu būdu NADH susidaro citozolyje ir redukcinių ekvivalentų pernešimas iš mitochondrijų nebereikalingas.

Antra stadija, apeinant tiesiogines glikoliz÷s reakcijas yra fruktoz÷s 1,6-bisfosfato virtimas fruktoz÷s 6-fosfatu. Fruktoz÷s 1,6-bisfosfato susidarymas veikiant fosfofruktokinazei I yra negrįžtama egzergonin÷ reakcija. Fruktoz÷s 1,6-bisfosfato hidrolizę katalizuoja fruktoz ÷s 1,6-bisfosfataz÷ ir susidaręs fruktoz÷s 6-fosfatas izomerizuojasi į gliukoz÷s 6-fosfatą.

O

H

OH

H

H

OH

CH2OPO3

-O3POCH2

2-

HOO

H

OH

H

H

OH

CH2OHO3POCH22-

HO

2H O

2

Fruktoz÷s 1,6-bisfosfatas Fruktoz÷s 6-fosfatas

Fruktoz÷s 1,6-bisfosfataz÷

Pn

Galutin÷ gliukoneogenez÷s reakcija yra gliukoz÷s 6-fosfato defosforilinimas.

Tiesioginis pernešimas fosforilo grup÷s nuo gliukoz÷s 6-fosfato ant ADP energetiškai yra negalimas, tod÷l fosfoesterinio ryšio hidrolizę katalizuoja gliukoz÷s 6-fosfataz÷. Šis fermentas nerandamas smegenyse bei raumenyse, tod÷l šiuose organuose gliukoneogenez÷ nevyksta.

2-

2H O

OCH2OPO3

HH

OHH

OH

OH

HOH

H OCH2OH

HH

OHH

OH

OH

HOH

HGliukoz÷s6-fosfataz÷

PnGliukoz÷s 6-fosfatas Gliukoz÷ Gliukoz÷s sintez÷ yra labai brangus procesas. Vienos gliukoz÷s molekul÷s susidarymui

iš dviejų piruvo rūgšties molekulių reikia keturių ATP ir dviejų GTP molekulių, o taip pat dviejų molekulių NADH.

Bendra gliukoneogenez÷s reakcija yra ši: 2Piruvatai + 2NADH + 2H+ + 4ATP + 2GTP + 6H2O Gliukoz÷ + 2NAD+

+ 4ADP + 2GDP + 6Pn Gliukoneogenez÷s reguliacija. Gliukoneogenez÷ reguliuojama substratų patekimu ir

hormonais. Gliukagonas stimuliuoja gliukoneogenezę trimis mechanizmais 1. Sumažina fruktoz÷s 2,6-bisfosfato kiekį, tod÷l aktyvuojama fruktoz÷s 1,6-

bisfosfataz÷ ir inhibuojama fosfofruktokinazę 2. Gliukagonas padidina cAMP kiekį ir aktyvuoja nuo cAMP priklausomą

baltymo kinazę A, kuri fosforilina ir inaktyvuoja piruvato kinazę. Fosfoenolpiruvatas nepaverčiamas piruvatu ir yra panaudojamas gliukoz÷s sintezei

3. Gliukagonas skatina PEP karboksikinaz÷s geno transkripciją. Insulinas slopina šio geno iRNR sintezę

Padid÷jus gliukoneogenez÷s substratų kiekiu ypač glikogeninių aminorūgščių, stimuliuoja gliukoz÷s sintezę. Kepenų piruvato karboksilaz÷ yra aktyvuojama acetil-KoA ,ypatingai badavimo metu. Padid÷jus lipolizei adipocituose, riebalų rūgštys pereina į kepenis, β oksidacijos metu

407

padid÷ja acetil-KoA koncentracija, kuri aktyvuoja piruvato karboksilaz÷ ir greit÷ja gliukoneogenez÷.

15.2 Glikogeno biosintez ÷, Glikogeno sintez÷ ir skaidymas yra atskiri procesai, katalizuojami skirtingų fermentų,

vyksta skirtingais keliais ir kitais būdais reguliuojami. Stuburiniai organizmai apie 2/3 su maistu gautos gliukoz÷s paverčia glikogenu. Pavalgius, gliukoz÷ yra absorbuojama žarnyne ir krauju išnešiojama į audinius. Gyvulių organizme glikogenas sintetinamas beveik visuose audiniuose, tačiau aktyviausiai šis procesas vyksta kepenyse ir skeleto raumenyse. Ląstel÷se gliukoz÷, katalizuojant heksokinazei yra fosforilinama iki gliukoz÷s 6-fosfato.

gliukoz÷ + ATP gliukoz÷s 6-fosfatas + ADPheksokinaz÷

Toliau fosfogliukomutaz÷ katalizuoja gliukoz÷s 6-fosfato izomerizaciją į gliukoz÷s 1-fosfatą.

Gliukoz÷s 6-fosfatas

Gliukoz÷s 1-fosfatas

UDP-gliukoz÷

Glikogenas(n+1 liekanų)

Fosfogliukomutaz÷

UDP-gliukoz÷spirofosforilaz÷

Glikogenosintaz÷

UTP

PPn

Glikogenas(n liekanų)

UDP

2Pn

15.3 pav. Glikogeno susidarymas iš gliukoz÷s 6-fosfato

Glikogeno skaidymo pirmą etapą katalizuoja fosforilaz÷. Nors ši reakcija yra grįžtama, tačiau gliukoz÷s 1-fosfatas dalyvauja glikogenoliz÷je ir jo koncentracija yra maža ir sintez÷ vyksta kitu keliu. Gliukoz÷ turi būti aktyvuojama prijungiant nukleotido trifosfatą. UDP-gliukoz÷s pirofosforilaz÷, katalizuoja gliukoz÷s liekanos pernešimą nuo gliukoz÷s 1-fosfato ant UTP. Susidariusi UDP-gliukoz÷ yra substratas glikogeno sintezei. Šios reakcijos pusiausvyra nukreipta į UDP-gliukoz÷s susidarymo pusę, kadangi pirofosfatas lengvai hidrolizuojamas iki dviejų neorganinio fosfato molekulių.

Sintetinant glikogeną, glikozilinę grupę nuo UDP-gliukoz÷s, ant polisacharidin÷s grandin÷s galin÷s gliukoz÷s molekul÷s perneša glikogeno sintaz÷. Sacharidas prijungiamas prie neredukuojančio grandin÷s galo, susidarant naujam α−(1→4)- glikozidiniam ryšiui. Glikogeno sintaz÷ perneša gliukoz÷s molekules tiktai prie esančio pradmens ji negali prad÷ti sintez÷s. Sintez÷je dalyvauja specialus baltymas glikogenines, kuris yra gliukoz÷s molekulių akceptorius ir turi fermentinį aktyvumą. Sintez÷ prasideda prijungiant pirmą monosacharido molekulę nuo UDP-gliukoz÷s prie glikogenino aminorūgšties tirozino hidroksigrup÷s. Reakciją katalizuoja glikogenino gliukoziltransferazinis aktyvumas. Glikogeninas katalizuoja prijungimą iki aštuonių gliukoz÷s molekulių. Šis kovalentiškai prijungtas oligosacharidas tampa glikogeno sintaz÷s substratu. Tolimesnis grandin÷s ilginimas

408

katalizuojamas glikogeno sintaz÷s. Ilga polimerin÷ glikogeno molekul÷ (joje gali būti per 50000 gliukoz÷s molekulių) formuojama ant baltymo ir lieka susijungusi su juo.

Gliukogeno sintaz÷ nekatalizuoja gliukoz÷s prijungimo prie C-6 atomo ir α−(1→6) glikozidinių ryšių susidarymo. Šią stadiją greitina fermentas glikozil-(4→6)-transferaz÷, kuris pernešą galinį oligosacharidą, turintį 6 ar 7 gliukoz÷s likučius, nuo polisacharidin÷s grandin÷s, turinčios minimum 11 gliukoz÷s liekanų, galo ant gliukoz÷s šešto anglies atomo. Pernešimas gali vykti ant gliukoz÷s esančios toje pačioje ar gretimoje polisacharidin÷je grandin÷je. Pijungus gliukozę prie C-6 atomo, glikogeno sintaz÷ gali prijungti naujas gliukoz÷s molekules ir ilginti grandinę.

15.4 pav.Glikogeno biosintez÷

Krakmolas yra sintetinamas augaluose, jo sintez÷s mechanizmas yra panašus į glikogeno biosintezę. Gliukoz÷ yra aktyvuojama prijungiant ATP prie gliukoz÷s 1-fosfato. Susidariusi ADP-gliukoz÷, katalizuojant krakmolo sintazei, reaguoja su oligosacharidin÷s grandin÷s galu ir yra ilginama grandin÷. Sintetinant amilopektiną, specialus fermentas prijungia sacharidus prie C-6 anglies atomo. Bakterijose angliavandeniai kaupiami glikogeno formoje, sintez÷ vyksta analogiškai kaip gyvūnų organizmuose, tiktai kaip aktyvuota gliukoz÷s forma naudojama ADP-gliukoz÷. Fotosintez÷s metu augaluose susidarę triozių fosfatai paverčiami į sacharozę. Sacharoz÷je gliukoz÷s ir fruktoz÷s molekul÷s sujungtos β−(1→2) glikozidinių ryšiu. Sacharoz÷s sintez÷ prasideda nuo fosfotriozių kondensacijos iki fruktoz÷s 1,6-bisfosfato. Fruktoz÷s 1,6-bisfosfatas defosforilinamas ir gautas fruktoz÷s 6-fosfatas, katalizuojant sacharoz÷s 6-fosfato sintazei jungiasi su ADP-gliukoze. Fosforo rūgšties liekana pašalinama veikiant sacharoz÷s 6-fosfato fosfatazei, laisva sacharoz÷ pernešama į kitas augalo dalis.

Sacharoz÷s 6-fosfato sintaz÷ ADP-gliukoz÷ + fruktoz÷s 6-fosfatas sacharoz÷s 6-fosfatas + ADP

Sacharoz÷s 6-fosfato fosfataz÷ Sacharoz÷s 6-fosfatas + H2O sacharoz÷ + Pn

Laktoz÷ sintetinama žinduolių pieno liaukose, katalizuojant fermentui laktoz÷s sintazei. Laktoz÷s sintaz÷ sudaryta iš dviejų polipeptidų – galaktoziltransferaz÷s, kuri perneša galaktoz÷s liekaną ant N-acetil-gliukozamino ar kitų angliavandenių ir baltymo αααα-laktalbumino . Prisijungęs α-laktalbuminas keičia transferaz÷s specifiškumą, naujas fermentas perneša galaktozę ant gliukoz÷s

409

Laktoz÷s sintaz÷ UDP-galaktoz÷ + gliukoz÷ laktoz÷ + UDP

15.2.1Glikogeno sintez ÷s reguliacija, `Glikogeno sintaz÷ išskirta iš stuburinių audinių yra tetrameras (Mm 350kDa) sudaryta iš keturių vienodų subvienetų. Glikogeno sintaz÷, kaip ir glikogeno fosforilaz÷, sutinkama dviejose formose - fosforilintoje ir nefosforilintoje. Aktyvi forma yra nefosforilinta glikogeno sintaz÷ I (nepriklausoma nuo gliukoz÷s 6-fosfato) ir neaktyvi fosforilinta glikogeno sintaz÷ D (priklausoma nuo gliukoz÷s 6-fosfato). Fermento sud÷tyje yra kelios serino hidroksigrup÷s, kurių fosforilinimas keičia aktyvumą. Defosforilinimą glikogeno sintaz÷s ir fosforilaz÷s a katalizuoja fosfoproteino fosfataz÷ I. Fosfoproteino fosfataz÷ I aktyvuoja glikogeno sintazę ir inaktyvuoja glikogeno fosforilazę. Fosforilinus glikogeno sintazę I padid÷ja fermento KM UDP-gliukozei, tačiau tiktai tada, kai reakcija vyksta nesant gliukoz÷s 6-fosfato. Gliukoz÷s 6-fosfatas yra alosterinis efektorius, kai jo koncentracija yra pakankama (>1mM). Praktiškai glikogeno sintaz÷s D aktyvumas priklauso nuo gliukoz÷s 6-fosfato. Ramyb÷s būkl÷je, raumenyse daugiau I fermento formos, susitraukimo metu padid÷ja D formos kiekis, kuris aktyvus tiktaiesant didel÷ms gliukoz÷s 6-fosfato koncentracijoms. Baltymo kinaz÷Glikogeno sintaz÷ I + ATP Glikogeno sintaz÷ D (fosforilinta) + ADP /aktyvi/ Fosfoproteino fosfataz÷ I /neaktyvi/

Santykis tarp glikogeno sintez÷s ir skylimo yra reguliuojamas hormonų: adrenalino (antinksčių žiev÷s hormono), gliukagono ir insulino (kasos hormonai). Šie hormonai veikia keisdami fermento fosforilinimo laipsnį ir glikogeno fosforilaz÷s ir glikogeno sintaz÷s aktyvios ir neaktyvios formos santykį. Šie fermentai reguliuoja fruktoz÷s-2,6-bisfosfato koncentraciją ir balansą tarp glikoliz÷s ir gliukoneogenez÷s. Bendrą glikoliz÷s ir gliukoneogenez÷s schemą galime atvaizduoti sekančiai

410

Gliukoz÷

ATP

ADPHeksokinaz÷

Gliukoz÷s 6-fosfatas

Fruktoz÷s 1-fosfatas

Fosfofruktokinaz÷ 1

Fruktoz÷s 1,6-bisfosfatas

Glicerolio aldehido 3-fosfatas

Dihidroksiacetono fosfatas

NAD+ + Pn

NADH + H+

1,3-bisfosfogliceratasADP

ATP3-fosfogliceratas

2-fosfogliceratas

Fosfoenolpiruvatas

ADP

ATP

Piruvatas

Gliukoz÷s6-fosfato fosfataz÷

Pn

ATP

ADP

Fruktoz÷s1,6-bisfosfataz÷

Pn

NAD+ + Pn

NADH + H+

ATP

ADP

Oksaloacetatas

GDP

GTP

ATP

ADPPiruvato karboksilaz÷

Fosfoenolpiruvato karboksikinaz÷

1

2

3

15.5 pav. Bendra glikoliz÷s ir gliukoneogenez÷s schema. Sintetinant gliukozę iš piruvato trijose stadijose 1, 2 ir 3 reakcijos vyksta kitu keliu nei glikoliz÷je.

411

16 NUKLEOTIDŲ APYKAITA

16.1 Nukleor ūgščių skaidymas Patekę su maistu nukleoproteinai skrandyje suyra iki baltymų ir polinukleotidų, kurie

dvylikapiršt÷je žarnoje hidrolizuojami į mononukleotidus. Kasos sulčių endonukleaz÷s deoksiribonukleaz÷ (DNRaz÷) ir ribonukleaz÷ (RNRaz÷) skaido nukleorūgštis į oligonukleotidus.

Mononukleotidai

Nukleozidai

Baz÷s

5/-mononukleotidai Skaidymo produktai

Nukleaz÷s,

Nukleotidaz÷s, fosfataz÷s

Nukleozidaz÷s,nukleozidų fosforilaz÷s

KatabolizmasAnabolizmas

Nukleorūgštys

Oligonukleotidai

Fosfodiesteraz÷s

16.1 pav. Nukleorūgščių skaidymo schema Jie, katalizuojant fosfodiesteraz÷ms, suskyla iki 3/-, 5/-mononukleozidų fosfatų

mišinio. Nukleotidaz÷s ir nespecifin÷s fosfataz÷s atskelia fosforo rūgšties liekaną ir nukleozidai pereina per plonųjų žarnų epitelines ląsteles į kraują arba suskaidomi nukleozidazių arba nukleozidų fosforilazių į purino ir pirimidino bazes bei riboz÷s ar deoksiriboz÷s 1-fosfatą.. Su maistu gautos baz÷s retai naudojamos audinių nukleorūgščių sintezei. Purino baz÷s suskaidomos iki šlapimo rūgšties ir ekskretuojamos.

NMP + H2O

Nukleotidaz÷s,nespecifin÷s fosfataz÷s

Nukleozidas + H2O Baz÷ + Riboz÷Nukleozidaz÷

Nukleozidas + Pn Baz÷ + Riboz÷s 1-fosfatas

Nukleozidofosforilaz÷

Nukleozidas + Pn

412

Analogiškai metabolizuojamos nukleorūgštys, esančios ląstel÷se. Susidariusios purinų ir pirimidinų baz÷s gali būti degraduojamos (purinai suskaidomi iki šlapimo rūgšties ir kitų ekskretuojamų produktų, pirimidinai iki acetil-KoA ar sukcinil-KoA), tačiau dalis bazių yra išsaugomos ir panaudojamos nukleotidų resintezei. Adenino fosforiboziltransferaz÷ katalizuoja AMP ir PPn susidarymą iš adenino ir fosforibozilpirofosfato (PRPP). Pirofosfatą hidrolizuoja pirofosfataz÷, tod÷l AMP susidarymo reakciją yra praktiškai negrįžtama. Hipoksantino-guanino fosforiboziltransferaz÷ katalizuoja panašią reakciją - hipoksantinas paverčiamas IMP, o guaninas į GMP.

Pirimidinų baz÷s yra išsaugomos nuo skaidymo ir panaudojamos nukleotidų resintezei. Viduląstelinių metabolizmo reakcijų metu susidarę purinai ir pirimidinai sintez÷ms panaudojami dažniau nei atsiplaidavę virškinimo proceso metu.

16.2 . Purin ų katabolizmas, Dalis laisvų purino ir pirimidino bazių yra panaudojama nukleotidų biosintezei, kita

dalis yra katabolizuojamos. Laisvos baz÷s susidaro metabolizuojant organizme nukleorūgštis arba patenka iš virškinimo trakto. Primatai (jų tarpe žmogus), paukščiai, kai kurie ropliai, purino nukleotidus skaido iki šlapimo rūgšties, kuri pašalinama su šlapimu.

Nuo purino nukleotidų (AMP, IMP, KMP ir GMP) veikiant nukleotidaz÷ms atskyla fosforo rūgštis ir susidaro atitinkami nukleozidai (adenozinas, inozinas, ksantozinas ir guanozinas. (16.2 pav.) Adenozinas , katalizuojant adenozino deaminazei deamininamas iki inozino. AMP taip pat gali būti deamininimas veikiant AMP deaminazei iki inozino monofosfato (IMP), kuris hidrolizuojamas iki inozino. Katalizuojant purino nukleozidų fosforilaz÷ms vyksta nukleozidų fosforoliz÷ ir susidaro laisva baz÷ bei riboz÷s 1-fosfatas. Nukleozidaz÷s gali nukleozidus suskaidyti iki baz÷s ir pentoz÷s. Adenozinas n÷ra purino nukleozidų fosforilaz÷s substratas. Hipoksantinas, susidaręs iš inozino yra oksiduojamas iki ksantino, ksantino oksidacijos produktas yra šlapimo rūgštis. Arba ksantino oksidaz÷ arba ksantino dehidrogenaz÷ katalizuoja šias abi reakcijas. Reakcijoje, katalizuojamoje ksantino oksidaz÷s, elektronai pernešami ant O2 , susidarant vandenilio peroksidui (katalaz÷s poveikyje H2O2 paverčiamas į H2O ir O2). Žinduoliuose ksantino oksidaz÷ yra užląstelinis fermentas. Manoma, kad tai yra viduląstelinio fermento ksantino dehidrogenaz÷s, pernešančios elektronus ir protonus ant NAD+, forma. Šių fermentų elektronų pernešimo sistema sudaryta iš geležies-sieros klasterio, kofermento pterino surišto su molibdenu ir FAD.

413

N

N

N

N

NH2

NH

N

N

N

O

N

N

N

N

NH2

N

N

N

N

NH2

NH

NH

NH

NH

O

O

O

Riboz÷

Fosfatas

H2O

Pn

H2O NH4+

Riboz÷

FosfatasAMP IMP KMP GMP

Riboz÷

Fosfatas

Riboz÷

Fosfatas

H2O

Pn

H2O

Pn

H2O

Pn

Adenozinas Inozinas Ksantozinas Guanozinas

H2O NH4+

Pn

Riboz÷s1-fosfatas

Pn

Riboz÷s1-fosfatas

Pn

Riboz÷s1-fosfatas

Hipoksantinas Ksantinas Guaninas

O2+H2O H2O2 NH4+ H2O

O2 + H2O

H2O2

Šlapimo rūgštis

1

2 3 4 5

7 8 9

12

6

10 11

16.2 pav. Purinų katabolizmo gyvūnuose pagrindiniai keliai. Fermentai - 1- AMP deaminaz÷, 2,3,4,5 - nukleotidaz÷s, 6 - adenozino deaminaz÷, 7,8,9 - purino nukleozidų fosforilaz÷, 10- ksantino oksidaz÷, 11 - guanino deaminaz÷, 12 - ksantino oksidaz÷

,

414

NH

N

N

NH

O

NH

NH

N

NH

O

O

NH

NH

NH

NH

O

O

O

NH

NH

N

NH

O

O

Hipoksantinas Ksantinas

Šlapimo rūgštis

Ksantino oksidaz÷

arba

Ksantinodehidrogenaz÷

H2O + O2 H2O2

H2O +NAD+ NADH + H+

Guanino deaminaz÷

NH3 H2O

Ksantinodehidrogenaz÷Ksantino

oksidaz÷

H2O + O2

H2O2

H2O +NAD+

NADH + H+

Guaninas

16.3 pav. Hipoksantino ir guanino skaidymas iki šlapimo rūgšties Daugumoje ląstelių guaninas deamininamas iki ksantino veikiant fermentui guanino

deaminazei arba guanazei. Gyvūnai, kurie neturi šio fermento ekskretuoja guaniną. Kiaul÷s, ekskretuoja guaniną, bet metabolizuoja adenino darinius iki alantoino, galutinio daugumos žinduolių purinų katabolizmo produkto. Guaninas yra vorų galutinis purinų skaidymo produktas.

16.2.1Šlapimo r ūgšties skaidymas Žmogus, paukščiai ir kiti primatai neturi urato oksidaz÷s, tod÷l šlapimo rūgštis jų

organizmuose yra galutinis purinų apykaitos produktas. Šlapimo rūgštis yra silpna rūgštis. Žmogaus kraujo plazmoje jos yra nuo 0,15-

0,47mmol/l. Padid÷jus šlapimo rūgštis sintezei arba sutrikus sekrecijai, padid÷ja šlapimo rūgšties koncentracija kraujyje, šlapime ir susergama podagra. Podagros atveju dideli kiekiai netirpios šlapimo rūgšties natrio druskos kristalų pavidale susikaupia inkstuose, sąnariuose. Leukocitai fagocituoja uratų kristalus, jie suardo lizosomų membranas. Lizosominiai fermentai išeina į citozolį ir susidarę katabolizmo produktai sukelia uždegimą.

Podagra gydoma alopurinoliu, sintetiniu hipoksantino izomeru. Alopurinolis organizme, veikiant ksantino dehidrogenazei, paverčiamas oksopurinoliu, kuris yra stiprus ksantino oksidacijos inhibitorius. Hipoksantino ir ksantino druskų tirpumas yra didesnis nei šlapimo rūgšties, ir jos yra ekskretuojamos.

NH

N

N

NH

O

NH

N NH

N

O

NH

N NH

N

O

OH2O +NAD+ NADH + H+

Hipoksantinas Alopurinolis Oksopurinolis

415

NH

NH

NH

NH

O

O

O

NH2

NH

NH

NH

O

O

O

H2N-CO-NH-CH-NH-CO-NH2

COO

CH

O

COO

O

NH2NH2

Šlapimo rūgštis

Urato oksidaz÷2H2O + O2

H2O2 + CO2

Alantoinas

H2OAlantoinaz÷

-

Alantoatas

2H2O-

GlioksilatasH2O

C2

Karbamidas

Ureaz÷

Alantoikaz÷

2 CO2 + 4 NH3

Primatai; paukščiai;kai kurie ropliai

Dauguma žinduolių; v÷žliai; kai kurie vabzdžiai; pilvakojaimoliuskai

Kai kurios kaulin÷s žuvys

Dauguma žuvų; varliagyviai;g÷lavandeniai moliuskai

Augalai; v÷žiagyviai; jūrų bestuburiai

16.4 pav. Šlapimo rūgšties katabolizmas. Dešin÷je pažym÷ti organizmai, ekskretuojantys atitinkamus junginius Podagra yra genetiškai determinuota. Ją dažniausiai sukelia fosforibozilpirofosfato

sintetaz÷s ir purinų bei pirimidinų išsaugojimo fermentų pažaidos. PRPP sintetaz÷s geno mutacijos sukelia fermento hiperaktyvaciją ir fermentas n÷ra reguliuojamas riboz÷s 5-fosfatu bei purinų nukleotidais. Purino nukleotidų sintez÷ nepriklauso nuo ląstel÷s poreikių , padid÷jus sintezei, pagreit÷ja katabolizmas ir šlapimo rūgšties susidarymas.

Kai kuriais atvejais šlapimo rūgšties koncentracijos padid÷jimą lemia purino bazių išsaugojimo (resintez÷s) fermentų pažaidos. Hipoksantino-guanino fosforiboziltransferaz÷ katalizuoja guanino ir hipoksantino virtimą į atitinkamus nukleotidus. Sergant Leš-Nihano

416

(Lesch-Nyhan) sindromu, šis fermentas n÷ra sintetinamas, šlapimo rūgšties koncentracija kraujyje padid÷ja 2-3 kartus, per parą su šlapimu gali išssikirti per 600mg šlapimo rūgšties. Šis genetinis susirgimas susijęs su X chromosoma, ir vaikai, turintys šį sutrikimą, yra protiškai atsilikę, agresyvaus elgesio, jiems būdingas savęs kankinimas, jie kenčia nuo inkstų nepakankamumo.

Dauguma organizmų toliau oksiduoja šlapimo rūgštį. Urato oksidaz÷ katalizuoja šlapimo rūgšties oksidaciją iki alantoino, H2O2 ir CO2. Šios reakcijos metu atidaromas purino žiedas. Alantoinas yra daugumos žinduolių (bet ne žmogaus, kuris sekretuoja šlapimo rūgštį) purinų katabolizmo galutinis produktas. Jį taip pat sekretuoja v÷žliai, kai kurie vabzdžiai, pilvakojai moliuskai.

Fermentas alantoinaz÷ katalizuoja imidazolo žiedo hidrolitinį skaidymą, susidarant alantoatui, kuris yra kaulinių žuvų galutinis purinų degradacijos produktas.

Dauguma žuvų, varliagyvių, g÷lavandenių moliuskų toliau skaido alantoatą. Jie turi alantoikazę, kuri katalizuoja alantoato hidrolizę iki glioksilato ir dviejų molekulių karbamido.

Pagaliau augalai, v÷žiagyviai, jūrų bestuburiai hidrolizuoja karbamidą, katalizuojant ureazei. Šios reakcijos galutiniai produktai yra anglies dvideginis ir amoniakas. Ureaz÷ randama tiktai tokiose ląstel÷se ir organizmuose, kurioms amoniakas netoksiškumas. Augaluose jis asimiliuojamas, veikiant glutamino sintetazei. Vandenyje gyvenantys organizmai amoniaką pašalina į vandenį.

16.3 Pirimidin ų katabolizmas,

Primidino nukleotidų katabolizmas prasideda juos hidrolizuojant iki nukleozidų ir fosfato, veikiant 5/-nukleotidazei. Nukleozidai gali būti tiesiogiai skaidomi iki baz÷s ir riboz÷s arba paverčiami kitais nukleozidais. Citidino deaminaz÷ katalizuoja citidino deamininimą iki uridino. Uridino ir timidino glikozidinis ryšys skaidomas atitinkamai veikiant uridino fosforilazei ar timidino fosforilazei. Fosforoliz÷s reakcijos produktai yra α−D-riboz÷s 1-fosfatas, uracilas ir timinas.

Pirimidino bazių galutiniai skilimo produktai yra acetil-KoA ir sukcinil-KoA. (16.5 pav.) Uracilo ir timino degradacijos keliai yra panašūs. Pradžioje pirimidino žiedas redukuojamas į 5,6-dihidropirimidiną, reakcijoje, katalizuojamoje dihidrouracilo dehidrogenaz÷s. Redukuotas žiedas katalizuojant dihidropirimidinazei atidaromas hidrolitiškai

417

skaidant ryšį tarp N-3 ir C-4. Susidarę ureidopropionatas ir

NH

NHO

O

CH3

H

NH

NHO

O

CH3

HH

H

CH3O

NH

NHO

O

H

H

NH

NHO

OHH

HH

O

CH3

H2N-C-NH-CH2-CH2-COOH2N-C-NH-CH2-CH-COO

H3N-CH2-CH2-COOH3N-CH2-CH-COO

NADP+

NADPH + H+

Timinas

Dihidrotiminas

H2O

β-UreidoizobutiratasH2O

NH4+ + HCO3

-

+

β-Aminoizobutiratas

NADP+

NADPH + H+Uracilas

Dihidrouracilas

Dihidrouracilodehidrogenaz÷

H2O

β-UreidopropionatasH2O

NH4+ + HCO3

-

β-Ureidopropionaz÷

+

β-Alaninas

Dihidropirimidinaz÷

- -

-

Sukcinil-KoA Acetil-KoA

16.5 pav. Timino ir uracilo metabolizmas ureidoizobutiratas hidrolizuojami iki amoniako, bikarbonato ir β−aminorūgšties. β−alaninas (iš uracilo) ir β−aminoizobutiratas (iš timino) paverčiami atitinkamai į acetil-KoA ir sukcinil-KoA, jie patenka į trikarboksirūgščių ciklą ir metabolizuojami. β−alaninas randamas kraujo plazmoje ir daugumoje audinių. Raumenyse jis panaudojamas dipeptidų anzerino (β−alanil-N-metilhistidinas) ir karnozino (β−alanilhistidinas) sintezei. Žarnyno bakterijos β−alaniną įjungia į pantotenatą, kuris rezorbuojamas ir dalyvauja KoA sintez÷je.

418

16.4 Purino ir pirimidino nukleotid ų sintez ÷ Purino ir pirimidino nukleotidai gali būti sintetinami iš esamų purino ir pirimidino

bazių arba de novo (iš aminorūgščių, CO2 ir NH3 ). Priklausomai nuo organizmo vieno ar kito kelio reikšm÷ gali būti skirtinga.

16.4.1Purino nukleotid ų biosintez ÷, Pagrindiniai purino žiedo biosintez÷s pirmtakai buvo nustatyti maitinant balandžius ir

žiurkes žym÷tais junginiais tokiais kaip 13CO2, H13COO-

(formiatas) ir +H3N-CH2-13COO-

(glicinas) ir tiriant, kokie ir į kurias susidariusios šlapimo rūgšties žiedo pad÷tis yra įjungiami atomai. Buvo nustatyta, kad anglies izotopas iš CO2 įjungiamas į purino žiedo C-6, o anglis iš formiato į C-2 ir C-8. Purino žiedo atomų kilm÷ yra ši: N-1 yra iš aspartato; C-2 ir C-8 iš formiato (10-formiltetrahidrofolatas); N-3 ir N-9 yra iš glutamino amidin÷s grup÷s; C-4, C-5 ir N-7 iš glicino ir C-6 iš anglies dvideginio.

C

C

C

CC

N

NN

N

1

23 4

56 78

9

Glutaminas

10-formiltetrahidrofolatas

GlicinasCO2

Aspartatas

16.6 pav. Purino žiede esančių atomų kilm÷ Pagrindiniai purinai

N

N

N

NH

NH2

1

23

45

6 78

9

Adeninas Guaninas(6-aminopurinas) (2-amino-6-ketopurinas)

NH

N

N

NH

O

NH2

16.4.2Inozino monofosfato biosintez ÷ Purino žiedas n÷ra sintetinamas kaip laisva baz÷, žiedas yra suformuojamas ant

riboz÷s, paeiliui prijungiant atitinkamus anglies ir azoto atomus. Purinų biosintezei aktyvuota riboz÷ gaunama iš 5-fosforibozil-1-pirofosfato (PRPP). PRPP susidarymo reakciją iš riboz÷s 5-fosfato ir ATP katalizuoja PRPP sintetaz÷. (16.7 pav.) Riboz÷s 5-fosfatas susidaro tiesioginio angliavandenių skaidymo (pentozinio ciklo) metu arba katabolizuojant nukleozidus. Riboz÷s 5-fosfatas yra karkasas, ant kurio suformuojamas purino žiedas. PRPP - „aktyvuota pentoz÷“ dalyvauja purino ir pirimidino nukleotidų biosintez÷je iš esančių ląstel÷je heterociklinių bazių bei dalyvauja histidino biosintez÷je.

419

N

N

N

N

NH2

OCH2

H

OH

H

OH

HH

OPOPOPO

O O O

O O OO

H

OH

H

OH

H

H

O

H

O

H

OH

H

OH

H

H

O P O P O

O O

O O

-

- - -

-

- -

AMP

PRPP sintetaz÷ ATPRiboz÷s 5-fosfatas

5-Fosfo-α-D-ribozil-1-pirofosfatas (PRPP)

2-O3POCH2

2-O3POCH2

+

16.7 pav. 5-fosforibozil-1-pirofosfato sintez÷

Pirmas purinų nukleotidų biosintez÷s produktas yra inozino 5/-monofosfatas (IMP), mononukleotidas, turintis hipoksantino bazę. IMP sintez÷ de novo prasideda pakeičiant pirofosforilo grupę PRPP molekul÷je glutamino amido azotu (pav.) . Reakciją katalizuoja glutamino-PRPP amidotransferaz÷. šis fermentas inibuojamas purino 5/-nukleotidais AMP,GMP ir IMP – galutiniais produktais. Reakcijos greitis kontroliuojamas viduląstelin÷mis glutamino ir PRPP koncentracijomis. Anomerinio anglies atomo konfigūraciją pereina iš α į β pad÷tį, kuri būdinga purino nukleotidams. Susidaręs fosforibozilaminas yra acilinams glicinu ir susidaro glicinamido ribonukleotidas.

420

O

H

OH

H

OH

H

H

O P O P O

O O

O O

O

H

OH

H

OH

H

NH2

H

CH2

NH3

O O

CH2

NH2

O NH

CH2

NH

O NH

O

H

CH2

NH

NH NH

O

H

CHN

CH

NH2NH

N

CH

NH2NH

O

O

-

- -

5-Fosfo-α-D-ribozil-1-pirofosfatas (PRPP)

2-

H2O

PPn 2Pn

Glutaminas

Glutamatas

Glutamino-PRPPamidotransferaz÷

O3POCH2

2-

O3POCH2

2-

5-Fosfo-β-D-ribozilaminas+

C -

Glicinas

ATP

ADP + Pn

GAR sintetaz÷

C

R5/ PGlicinamido ribonukleotidas (GAR)

10-Formil-tetrahidrofolatas

Tetrahidrofolatas

GAR transformilaz÷

C

R5/ P

C

Formilglicinamidorinbonukleotidas (FGAR)

3

2

1

4

ATP

ADP + Pn

Glutaminas

Glutamatas

FGAM sintetaz÷4

C

R5/ P

C

Formilglicinamidinoribonukleotidas (FGAM)

C

R5/ P

ADP + Pn

ATP

AIR sintetaz÷

Aminoimidazoloribonukleotidas (AIR)

ATP

ADP + Pn

AIR karboksilaz÷6

5

HCO3-

2H+

C

R5/ P

C-

Karboksiaminoimidazoloribonukleotidas (KAIR)

7

421

16.8 pav. Inozino 5/-monofosfato biosintez÷. R5/ P – riboz÷s 5/-fosfatas Sekančiame etape formilo grup÷ (-CH=O) nuo 10-formiltetrahidrofolato pernešama ant aminogrup÷s. 4 etape amidas paverčiamas į amidiną (RHN-C=NH) nuo ATP priklausomoje reakcijoje, kurioje azoto donoras yra glutaminas. 5 etape dalyvaujant ATP uždaromas žiedas ir susidaro imidazolo darinys. Tolesn÷je stadijoje prijungiamas CO2 , ši reakcija reakcija

N

CH

NH2N

O

COO

CH

CH2

COO

NH3

COO

CH

CH2

COO

NH

N

CH

NH2N

O

NH2

N

CH

NH

N

O

NH2

O

H

NH

N

N

N

O

C

R5/ P

C

-

-

+

Aspartatas

ATP

ADP + Pn

SAIKAR sintetaz÷

-

-

Aminoimidazolo sukcinilokarboksamidoribonukleotidas(SAIKAR)

Fumaratas

C

R5/ P

C

Adenilosukcinato liaz÷

Aminoimidazolo karboksamidoribonukleotidas (AIKAR)

10-Formil-tetrahidrofolatas

Tetrahidrofolatas

C

R5/ P

C

7

8

9

C

AIKAR transformilaz÷

Formamidoimidazolo karboksamido ribonukleotidas (FAIKAR)

H2O

IMP ciklohidrolaz÷

R5/ P

Inozino 5/-monofosfatas (IMP)

10

422

nereikalauja biotino. 7 ir 8 etapuose aspartato aminogrup÷ įjungiama į augantį purino žiedą. Pradžioje aspartatas kondensuojasi su karboksilatu, susidarant sukcinilkarboksamidui. Tada adenilosukcinato liaz÷ katalizuoja fumarato atsk÷limą. Šių dviejų reakcijų metu įjungiamas azoto atomas.

9 etape formilo grup÷ nuo 10-formiltetrahidrofolato prijungiama prie aminoimidazolo karboksamido ribonukleotido. Amidinis azotas kondensuojasi su formilo grupe, užsidaro žiedas ir purino žiedo sintez÷ baigiasi. Susidaro inozino 5/-fosfatas (IMP). De novo IMP sintez÷ panaudoja daug energijos. ATP paverčiama į AMP sintetinant PRPP, ATP taip pat hidrolizuojama 2,4,5,6 ir 7 etapuose. Prokariotuose, kiekvieną šio proceso stadiją katalizuoja individualus fermentas. Eukariotuose susiliejus genams susidar÷ polifunkcionalūs fermentai, kurie katalizuoja po kelias reakcijas.

16.4.3Adenozino monofosfato (AMP) ir guanozino mono fosfato (GMP) biosintez ÷ AMP ir GMP sintetinama iš IMP, v÷liau jie gali būti fosforilinama iki nukleozido

difosfatų ir nukleozido trifosfatų. AMP sintez÷s iš IMP dvi stadijos panašios į 7 ir 8 IMP biosintez÷s etapus. Pirmoje

stadijoje aspartato amino grup÷ kondensuojasi su IMP ketogrupe. Reakciją katalizuoja nuo GTP priklausoma adenilosukcinato sintetaz÷. Fumarato pašalinimą nuo adenilosukcinato katalizuoja adenilosukcinato liaz÷. NAD+ priklausoma IMP dehidrogenaz÷ katalizuoja oksidaciją C-2 atomo, ji yra pirma IMP virtimo į GMP reakcija. Susidaręs ksantozino monofosfatas (KMP) reaguoja su glutaminu ir glutamino amidinis azotas pakeičia deguonį ties C-2 KMP. Reakcija yra katalizuojama ATP priklausomos GMP sintetaz÷s. Sintetinant AMP iš IMP energijos šaltinis yra GTP, o sintetinant GMP dalyvauja ATP.

423

N

NH

N

N

O

O

H

OH

H

OH

HH

NH

NH

N

N

O

OO

H

OH

H

OH

HH

O

H

OH

H

OH

HH

NH

N

NH

N

N

N

NH

N

N

O

NH2O

H

OH

H

OH

HH

N

N

N

N

NH2

O

H

OH

H

OH

HH

2-O3POCH2

IMP

Aspartatas H2O

GTP

GDP + +Pn

NAD+

NADH + H+

IMP dehidrogenaz÷Adenilosukcinatosintetaz÷

2-O3POCH22-O3POCH2

OOC-CH2-CH-COO--

Adenilosukcinatas Ksantozino monofosfatas (KMP)

Glutaminas

Glutamatas

H2O + ATP

AMP + PPn

GMP sintetaz÷Adenilosukcinatoliaz÷

Fumaratas

2-O3POCH2

2-O3POCH2

AMP GMP16.9 pav. AMP ir GMP sintez÷ iš IMP

16.4.4 Nukleozid ų di- ir nukleozid ų trifosfat ų sintez ÷ Nukleorūgščių, kai kurių kofermentų sintezei reikalingi nukleozido di- ir nukleozido trifosfatai. Jų sintezę katalizuoja transferazių klasių fermentai. Atitinkamos nukleozido monofosfato kinaz÷s panaudodamos ATP katalizuoja AMP ir GMP fosforilinimą. Adenilato kinaz÷ katalizuoja reakciją

o guanilato kinaz÷ AMP + ATP 2ADP

Adenilato kinaz÷

424

Adenilato kinaz÷ labai aktyvi kepenyse, jos funkcija yra palaikyti pusiausvyrinį adenino nukleotidų AMP, ADP ir ATP fondą. Nukleozido difosfatų (NDP) virtimą nukleozido trifosfatais (NTP) katalizuoja nukleozido difosfato kinaz÷s. Jų specifiškumas nedidelis ir katalizuoja fosforilinimą įvairių nukleozido difosfatų

16.4.5Purino nukleotid ų biosintez ÷ iš azotini ų bazių Purino nukleotidų sintez÷ iš laisvų purino bazių vyksta katalizuojant adenino fosforiboziltransferazei ir hipoksantino-guanino fosforiboziltransferazei. IMP, GMP ir AMP sintetinami prijungiant atitinkamai prie hipoksantino, guanino ir adenino fosforibozilpirofosfatą.(16.10 pav. )

N

NH

N

N

O

O

H

OH

H

OH

HH

N

N

N

N

NH2

O

H

OH

H

OH

HH

N

NH

N

N

O

NH2O

H

OH

H

OH

HH

N

NH

O

N

NH

N

NH

O

N

NHNH2

N

N

NH2

N

NH

2-O3POCH2

2-O3POCH2PRPP PPn

Adeninas AMP

Adenino fosforibozil- transferaz÷

2-O3POCH2

Hipoksantinas

Guaninas

IMP

GMP

Hipoksantino-guaninofosforiboziltransferaz÷

PRPP PPn

16.10 Hipoksantino, guanino ir adenino fosforibozilinimas ir IMP,GMP ir AMP susidarymas

16.4.6Purino nukleotid ų sintez ÷s reguliacija Purinų nukleotidų sintez÷ ląstel÷je reguliuojama grįžtamo ryšio principu. PRPP

sintetaz÷ yra alosterinis fermentas, aktyvuojamas neorganinio fosfato ir inhibuojamas purino

GMP + ATP GDP + ADP

Guanilato kinaz÷

N/DP + NTP N/TP +NDP

425

ribonukleotidais nukleozidų mono-, di- ir trifosfatais. Glutamino-PRPP amidotransferaz÷ alosteriškai inhibuojama galutiniais produktais - IMP, AMP ir GMP. Ši reakcija yra pagrindin÷ purinų biosintez÷s metabolinio kelio reguliuojama stadija. Reakcijų sekos iš IMP į AMP ir iš IMP į GMP taip pat reguliuojamos grįžtamo ryšio principu. AMP inhibuoja adenilosukcinato sintetazę. IMP dehidrogenaz÷ yra stabdoma KMP ir GMP. Purinų biosintez÷s reguliacijos schema pateikta pav.

Riboz÷s 5-fosfatas

PRPP

5-Fosforibozilaminas

IMP

PRPP sintetaz÷

Glutamino-PRPPamidotransferaz÷

AMPGMPIMP

AMPGMPIMP

Adenilosukcinatas KMP

AMP GMP

IMP dehidrogenz÷Adenilosukcinatosintetaz÷

GMPIMP

GMP sintetaz÷Adenilosukcinato liaz÷

16.11 pav. Purino nukleotidų biosintez÷s reguliacija

16.4.7Pirimidino nukleotid ų sintez ÷ Pirimidino nukleotidai gali būti sintetinami iš paprastų pirmtakų de novo ir tiesiogiai iš azotinių bazių ar nukleozidų. Pirimidino nukleotidų sintez÷ de novo yra trumpesn÷ ir paprastesn÷ nei purinų. Pradžioje sintetinamas uridino 5/-monofosfatas, kuris yra kitų pirimidinų pirmtakas. Pirimidino žiedas sintetinamas iš trijų metabolinių pirmtakų: bikarbonato (jis įeina į žiedo C-2), glutamino amidogrup÷s (N-2) ir aspartato, kuris pateikia žiedui likusius atomus. Pirimidinų biosintez÷je dalyvauja ir PRPP.

426

16.12 pav. UMP sintez÷ prokariotuose. Eukariotuose 1-3 etapus katalizuoja daugiafunkcinis fermentas dihidroorotato sintaz÷, 5,6 etapus katalizuoja bifunkcinis fermentas UMP sintaz÷

Pirimidinų biosintez÷ prasideda citozolyje reaguojant bikarbonatui su glutaminu susidarant karbamoilfosfatui. Reakciją katalizuoja karbamoilfosfato sintetaz÷ II, o azoto šaltinis yra glutamino amidinis azotas. (Karbamoilfosfato sintetaz÷ I yra mitochondrijose ir gautas karbamoilfosfatas įjungiamas į karbamidą, azoto šaltinis šiai reakcijai yra amoniakas žr. skyrių). Reakcijoje panaudojamos dvi ATP molekul÷s - viena C-N ryšio sintezei, kita

COO

CHNH2

CH2

CH2

CONH2

NH2 CO OPO3

O NH

H

COO

CH2

OO

O NH

H

COO

CH2

O

O NH COO

CH

O

OCOO

CH

O

O

H

OH

H

OH

HH

N

O

CH

O

O

H

OH

H

OH

HH

N

Glutaminas

2ATP + H2O

2ADP + Pn

HCO3

Glutamatas

Karbamoilfosfatosintetaz÷

Karbamoilfosfatas

AspartatasAspartatotranskarbamoilaz÷

H2N

C C

C

Karbamoilaspartatas

Dihidroorotaz÷ H2O

-

-

HN

C C

C

-

L-Dihidroorotatas Orotatas

HN

C C

C

-

Dihidroorotatodehidrogenaz÷

KoQ KoQH2

HN

C C

C

-O3POCH2

2-

Orotidino 5/-monofosfatas (OMP)

PRPP

2Pn PPn Orotatofosforibozil-transferaz÷

HN

C CH

C

-O3POCH2

2-

Uridino 5/-monofosfatas (UMP)

H2O

HCO3OMPdekarboksilaz÷

-

4

5

3

2

61

427

fosforilinimui. Neciklinis tarpininkas, turintis visus pirimidino žiedo atomus, susidaro reaguojant karbamoilfosfatui su asparto rūgštimi. Šioje reakcijoje aspartato nukleofilinis azotas atakuoja karbamoilfosfato karbonilinę grupę. Katalizuojant dihidroorotazei (3 etapas), karbamoilaspartatas ciklizuojasi ir dihidroorotatas oksiduojamas į orotatą. Dihidroorotato sintez÷ vyksta citozolyje, v÷liau jis praeina pro išorinę mitochondrijų membraną ir tarpmembranin÷je ertm÷je oksiduojamas,susijungusios su mitochondrijų vidine membrana dihidroorotato dehidrogenaz÷s. Fermentas yra flavoproteinas, kuris perduoda elektronus ubichinonui (KoQ) susidarant ubichinoliui (KoQH2). KoQH2 oksiduojamas kv÷pavimo grandin÷je. Prijungus riboz÷s fosfatą iš PRPP gauname orotidino 5/-monofosfatą, kuris dekarboksilinamas, susidarant uridino 5/-monofosfatui. Eukariotuose, mitochondrijose susidaręs orotatas išeina į citozolį, kur paverčiamas į UMP. UMP sintaz÷ yra bifunkcinis fermentas, katalizuoja orotato susijungimą su PRPP ir greitą OMP dekarboksilinimą.

Žinduoliuose susidarę karbamoilfosfatas ir karbamoilaspartatas (1 ir 2 etapai) bei OMP (5 etapas) lieka susijungę su fermentu ir tuneliuojami nuo vieno fermento aktyvaus centro prie kito. Labilių tarpininkų tuneliavimas apsaugo juos nuo degradacijos ir padidina reakcijos efektyvumą.

UMP paverčiamas į UTP trijų reakcijų eigoje. Pradžioje uridilato kinaz÷ katalizuoja γ−fosforilo grup÷s pernešimą nuo ATP ant UMP ir susidaro UDP. Sekančiame etape

nukleozido difosfato kinaz÷ katalizuoja UDP fosforilinimą dar viena ATP molekule. CTP sintetaz÷ katalizuoja glutamino amidinio azoto pernešimą ant UTP C-4 anglies atomo ir susidaro CTP. E.coli CTP sintaz÷ alosteriškai inhibuojama galutiniu produktu CTP ir aktyvuojama GTP. GTP padidina fermento Vmax ir sumažina KM glutaminui.

ATP ADPATP ADP

UMP UDP UTP

428

O

H

OH

H

OH

HH

N

NH

O

O

O

H

OH

H

OH

HH

N

N

NH2

O

4-O9P3OCH2

Glutaminas

Glutamatas

H2O + ATP

ADP + Pn

CTP sintetaz÷

UTP

4-O9P3OCH2

CTP 16.13 pav. CTP sintez÷ iš UTP `

16.5 Ribonukleotid ų redukcija iki deoksiribonukleotid ų 2/-Deoksiribonukleozidai yra sintetinami redukuojant ribonukleotidus. Ribonukleotido reduktaz÷ yra sudaryta iš keturių subvienetų ir redukuoja nukleozido difosfatus ADP, GDP, CDP ir UDP. Reduktoriumi tarnauja NADPH. Elektronai nuo NADPH per flavoproteiną tioredoksino reduktazę ir baltymą tioredoksiną, turintį dvi merkaptogrupes pereina ant ribonukleotido reduktaz÷s ir redukuoja disulfidinį ryšį. Prokariotų ir mielių tioredoksino reduktaz÷ aktyviame centre turi dvi merkaptogrupes, kurios per visą eilę radikalinių reakcijų redukuoja riboz÷s 2/ hidroksigrupę. (16.4 pav.) Žinduolių tioredoksino reduktaz÷ turi po vieną funkciškai aktyvią cisteino ir vieną selenocisteino aminorūgšties liekaną. Susidarę dADP, dGDP, dCDP ir dUDP yra fosforilinami iki deoksinukleozido trifosfatų veikiant nukleozido difosfato kinaz÷ms. Kai kurie mikroorganizmai Lactobacillus, Clostridium ir Rhizobium nukleozido trifosfatus redukuoja, katalizuojant nuo kobalto priklausomu fermentu ribonukleozido trifosfato reduktaze.

429

O

H

OH

H

OH

HH

B

O

H

OH

H

H

HH

B

3-O6P2OCH2

NADPH+H+

NADP+

FAD

FADH2

red.

oks.

HS S(e)H

S S(e)

Tioreoks.

S S

SH SH

HS SH

S S

Tiorered. 3-O6P2OCH2

Ered.

Eoks.

Ribonukleozidodifosfatas

Deoksiribonukleozido difosfatas

Tioredoksino reduktaz÷

16.14 pav. Ribonukleozido difosfato redukcija. E- Fermentas ribonukleotido reduktaz÷, Tiore -tioredoksinas, B-heterociklin÷ baz÷, S(e) cisteino siera arba selenas

Ribonukleotidų reduktaz÷ palaiko ląstel÷je deoksiribonukleotidų balansą. Jos aktyvumas reguliuojamas nukleotidais. dATP jungiasi prie alosterinio centro ir slopina katalizinį veikimą. ATP ir kiti nukleozido trifosfatai prisijungdami prie kito alosterinio centro aktyvuoja fermentą ir padid÷ja deoksiribonukleozidų difosfatų sintez÷.

16.5.1 dTMP susidarymas Deoksitimidilatas (dTMP), reikalingas DNR sintezei susidaro metilinant dUMP. Pirmame etape UMP fosforilinamas iki UDP, kuris redukuojamas iki dUDP, dUDP defosforilinamas ir susidaręs dUMP yra metilinamas.

dUDP virtimas į dUMP gali vykti dviem keliais. Katalizuojant nukleozido monofosfato kinazei dUDP reaguoja su ADP ir susidaro dUMP ir ATP

dUDP gali būti ATP pagalba fosforilinama iki dUTP veikiant nukleozido difosfato kinazei. Deoksiuridino trifosfato difosfohidrolaz÷ katalizuoja greitą dUTP hidrolizę į dUMP ir PPn.

Greita dUTP hidroliz÷ apsaugo DNR nuo atsitiktinio dUTP įjungimo vietoje dTTP. dUMP gali susidaryti iš dCMP, hidroliz÷s reakcijoje, katalizuojamoje dCMP deaminaz÷s.

dCMP deaminaz÷ kepenyse yra alosteriškai reguliuojama - dTTP yra alosterinis inhibitorius, o dCTP yra aktyvatorius.

UMP UDP dUDP dUMP dTMP

dUDP + ADP dUMP + ATP

dUDP + ATP dUTP dUMP + PPn

ADP H2O

dCMP + H2O dUMP + NH4+

430

dUMP virtimą į dTMP katalizuoja fermentas timidilato sintaz÷. Meilinimui vieno anglies atomo grup÷s donoras yra N5,N10-metilentetrahidrofolatas (pav.) . Metileno grup÷ (N-CH2-N) N5,N10-metilentetrahidrofolato molekul÷je yra susirišusi su azotu. Ji yra mažiau redukuota nei surišta su anglimi metilo grup÷ (C-CH3) dTMP .Tod÷l

O

H

OH

H

H

HH

N

NH

O

O

O

H

OH

H

H

HH

N

NH

O

O

CH

H

H

NH

N

N

NH

NH2

CH2

N

CH2

O

H

HH

R

NH

N

N

NH

NH2

CH2O

H

H

NH

R

NH

N

NH

NH

NH2

CH2O

H

H

NH

RH

COO

CHNH3

COO

CH2NH3

2-O3POCH22-O3POCH2

5,10-Metilentetrahidrofolatas 7.8-Dihidrofolatas

Timidilato sintaz÷

NADPH + H+

NADP+

Tetrahidrofolatas

+-

CH2OH

+-

Glicinas

Serinas

Dihidrofolatoreduktaz÷

Serinohidroksimetil-transferaz÷

dUMP dTMP

78

10

8 765

5

78

10

105 6

6

16.16 pav. Timidilato (dTMP) sintez÷ iš dUMP. metilentetrahidrofolatas yra netiktai metilo grup÷s donoras, bet yra ir reduktorius, perduodamas hidrido joną. Metilentetrahidrofolatas oksiduojasi iki 7,8-dihidrofolato, kuris redukuojamas NADPH iki tetrahidrofolato, katalizuojant dihidrofolato reduktazei. Sekančiame etape serino hidroksimetiltransferaz÷ katalizuoja pernešimą -CH2OH grup÷s nuo serino ant tetrahidrofolato ir regeneruojamas N5,N10-metilentetrahidrofolatas.

431

dTMP gali būti sintetintas tiesiogiai fosforilinant timidino (deoksitimidiną), reakcijoje kurią katalizuoja nuo ATP priklausoma timidino kinaz÷

Deoksitimidinas (Timidinas)

dTMP

ATP ADP

Timidino kinaz÷

dTMP yra būtinas DNR biosintezei, tod÷l medžiagos, mažinančios dTMP kiekį,

slopina ląstelių dalijimąsi. Vieni iš efektyviausių prieš v÷žinių agentų yra vaistai blokuojantys timidilato sintaz÷s ir dihidrofolato reduktaz÷s fermentinių aktyvumų. Sumaž÷jus šių fermentų aktyvumui, krinta dTMP kiekis ir sul÷t÷ja DNR biosintez÷. Chemoterapijoje plačiai naudojamas 5-fluoruracilas, metotreksanas, aminopterinas. 5-fluoruracilas organizme paverčiamas į 5-fluordeoksiuridilatą, kuris tvirtai susiriša su timidilato sintaz÷s aktyviuoju centru ir blokuoja dTMP susidarymą. Folato analogas metotreksanas yra ir stiprus ir gana specifiškas dihidrofolato reduktaz÷s inhibitorius. Sumaž÷jus tetrahidrofolato kiekiui, stabdoma dTMP sintez÷.

5,10- Metilen- 7,8-Dihidrofolatas terahidrofolatas

dUMP dTMP

NADPH + H+

NADP+

Serinas

Glicinas

FdUMP

MetotreksanasAminopterinas

Tetrahidrofolatas

NH

NHO

F

O

N

N

N

NH

CH2

NCH3

NH2

NH2

O

NH

CH

CH2

CH2

COO

COO

5-Fluoruracilas

C -

-

Metotreksanas Bendra purino nukleotidų virsmų schema pavaizduota pav. Purino nukleotidų sintez÷ prasideda nuo de novo sintetinto IMP, kuris paverčiamas į AMP ir GMP, bei jų di- ir trifosfatus. Deoksinukleozidų fosfatai sintetinami iš nukleozidų difosfatų.

432

dAMP AMP IMP KMP GMP dGMP

dADP

dATP

dAdenozinas

Adeninas Adeninas Hipoksantinas Guaninas Guaninas

ATP GTP dGTP

ADP GDP dGDP

Adenozinas Inozinas Guanozinas dGuanozinas

PPRP PPRPPPRP

16.17 pav. Bendra purinų virsmų schema Bendra pirimidinų virsmų schema pateikta pav. De novo sintetintas UMP yra paverčiamas į kitus pirimidino darinius.

dCMP CMP UMP

dCDP

dCTP

dCitidinas

CTP dUTP dTTP

CDP dUDP dTDP

Citidinas Uridinas dUridinas dTimidinas

UTP

UDP

dUMP dTMP

Citozinas Citozinas Uracilas Uracilas Timinas

dUMP

16.18 pav. Bendra pirimidinų virsmų schema

433

17 AMINORŪGŠČIŲ BIOSINTEZö

17.1 Azoto fiksacija Į aminorūgščių, nukleotidų sud÷tį įeina azotas, kuris įjungiamas į molekulę jų sintez÷s

metu. Pagrindinis azoto šaltinis gyviems organizmams yra ore esantis molekulinis azotas (N2). Azotas chemiškai yra labai neaktyvus ir tiktai nedaugelis mikroorganizmų paverčia atmosferos azotą į biochemiškai prieinamus junginius. Aukštesnieji organizmai nesugeba redukuoti azoto. Biosferoje funkcionuoja azoto ciklas kuriame fiksuojamas atmosferos azotas ir jis panaudojamas azotą turinčių junginių sintezei.

Pirmas šio ciklo etapas yra azoto fiksacija. Atmosferos azotą fiksuoja (redukuoja) iki NH4

+ kai kurios vandenyje ir dirvožemyje gyvenančios melsvabakter÷s, dirvoje esančios nefotosintetinančios bakterijos Agrobacteria, Azotobacter, Klebsiella Clostridium bei Rhizobium genties gumbelin÷s bakterijos gyvenančios simbioz÷je ant ankštinių augalų šaknų. Mikroorganizmai per metus fiksuoja per 2*1011 kg azoto. Nors dauguma organizmų gali įsisavinti amoniaką, tačiau dirvoje esančių amoniaką oksiduojančių bakterijų aktyvumas yra toks didelis, kad beveik visas amoniakas oksiduojamas iki nitritų (NO2

-) arba nitratų (NO3-).

Šis procesas yra vadinamas nitrifikacija . Augalai ir dauguma bakterijų paima nitritus ir nitratus, veikiant nitritų ar nitratų reduktaz÷ms redukuoja juos iki amoniako. Susidaręs amoniakas įjungiamas į aminorūgščių sud÷tį. Gyvūliai maitinasi augalais ir juos vartoja kaip aminorūgščių šaltinį. Žuvus gyvūnams mikroorganizmai degraduoja baltymus, susidaręs amoniakas oksiduojamas iki nitratų ir nitritų, kurie denitrifikuojami atsipalaiduojant N2. Dirvožemio bakterijos oksidacijai, kaip galutinį elektronų akceptorių, dažnai naudoja ne deguonį, o NO3

- ir išsiskyrusi energija yra panaudojama ATP sintezei.

NO2

NO3 NH4N2

+

-

Azotofiksacija

Denitrifikacija

NitrifikacijaNitrifikacija

Redukcija augaluose bakterijose

-

Sintez÷augaluosemikroorga- nizmuose

Skaidymasaugaluosemikroorga- nizmuose

Aminor ūgštys,nukleotidai, fosfolipidaikiti redukuotiazoto junginiai

Pav17.1 pav. Azoto ciklas. Azoto fiksacija.

434

Pirmas svarbus azoto fiksacijos produktas yra amoniakas, kuris panaudojamas augalų ir kitų mikroorganizmų. Azoto redukcija yra daug energijos reikalaujantis procesas. Trigubas ryšys N≡N yra labai stabilus, jo ryšio energija yra 930kJ/mol. Azoto redukcijos aktyvacijos energija yra didel÷, tod÷l azotas yra labai stabili molekul÷. Pramon÷je amoniakas gaunamas Haberio (F.Haber) reakcijos metu, kuri reikalauja 400-500 0C temperatūros ir kelių šimtų atmosferos sl÷gio.

Biologin÷ azoto fiksacija vyksta esant 0,8 atm N2 sl÷giui ir žemose temperatūrose. Aktyvacijos energija pažeminama prijungiant prie fermento ATP ir ją hidrolizuojant. Bendra azoto fiksacijos reakcija yra užrašoma:

N2 + 10H+ + 8e- + 16ATP 2NH4 + 16ADP + 16Pn + H2+

Azotas yra fiksuojamas fermentinio nitrogenaz÷s komplekso kuris sudarytas iš

dinitrogenaz÷s reduktaz÷s ir dinitrogenaz÷s. Dinitrogenaz÷s reduktaz÷ (ji dar vadinama Fe-baltymas) yra dimeras (Mm 60 kDa)

suadrytas iš dviejų identiškų subvienetų. Tarp šių subvienetų yra išsid÷stęs 4Fe-4S prijungiantis ir atiduodantis po vieną elektroną. Kiekvienas subvienetas turi po vieną ATP/ADP surišimo centrą. Dinitrogenaz÷ (dar vadimas MoFe-baltymas) yra tetrameras (Mm 240kDa) sudarytas iš dviejų porų skirtingų subvienetų, kurie prijungia 2Mo, 32Fe ir 30S atomų. MoFe baltymo sud÷tyje yra P centras surišantis 4Fe-4S ir geležies molibdeno centras. Kai kurios bakterijos savo sud÷tyje vitoje molibdeno turi vanadžio atomus.

Vienos azoto molekul÷s redukcijai reikia dinitrogenaz÷s su aukštu redukciniu potencialu ir aštuonių elektronų. Šeši elektronai redukuoja azotą ir du redukuoja protonus iki H2. Azoto redukcijai elektronai pernešami nuo piruvato ar kitų donorų. Elektronai nuo piruvato pernešami ant feredoksino (arba flavodoksino). Redukuotas feredoksinas perduoda elektroną dinitrogenaz÷s reduktaz÷s 4Fe-4S centrui. Elektronai po vieną keliauja nuo vieno nešiklio ant kito. Redukuota dinitrogenaz÷s reduktaz÷ prisijungia prie dinitrogenaz÷s, oksiduota forma disocijuoja nuo baltymo. Redukuota dinitrogenaz÷s reduktaz÷ prisijungia ATP. Elektronai nuo dinitrogenaz÷s reduktaz÷s palaipsniui pereina ant dinitrogenaz÷s P- centro, ant MoFe centro ir ant azoto. Viso pernešus 8 elektronus sunaudojama 16 ATP molekulių.

Nitrogenaz÷s kompleksas turi tur÷ti aukštą redukcinę potencialą, galinti redukuoti N2. Prisijungus dviem ATP molekul÷ms prie dinitrogenaz÷s reduktaz÷s padidina baltymo redukcinį potencialą E0/ nuo -300 iki -420mV. Šiuo atveju baltymo redukciniam potencialui pakeisti panaudojama ATP surišimo energija, bet ne ATP hidroliz÷s energija.

Esant deguoniui nitrogenazinis kompleksas labai greitai inaktyvuojasi. Kai kurios fiksuojančios azotą bakterijos auga anaerobin÷se sąlygose. Bakterijų, gyvenančios šaknų gumbeliuose aplinkoje, yra baltymas leghemoglobinas, kuris suriša deguonį ir jis neslopina nitrogenaz÷s.

435

4 piruvatai 4 acetilKoA 4KoA

8 feredoksinai 8 feredoksinai redukuoti oksiduoti

8 dinitrogenz÷s 8 dinitrogenaz÷s reduktaz÷ reduktaz÷ redukuota oksiduota

8 dinitrogenz÷s 8 dinitrogenaz÷s reduktaz÷ reduktaz÷ redukuota oksiduota + 16ATP + 16 ATP

Dinitrogenaz÷ Dinitrogenaz÷ oksiduota redukuota

N22NH4

H2 2H+

17.2 pav. Nitrogenazinis kompleksas ir azoto fiksacija.

17.1.1 Amoniako įjungimas į glutamat ą ir glutamin ą Azoto fiksacijos metu susidaręs amoniakas yra panaudojamas aminorūgščių ir kitų

biomolekulių biosintezei. Glutamatas ir glutaminas yra svarbiausios aminorūgštys, į kurias pirmose stadijose įjungiamas azotas.

Redukcinio α-ketoglutarato amininimo metu prisijungia amoniakas ir susidaro glutamatas. Reakciją katalizuoja glutamato dehidrogenaz÷ ir procesas vyksta augaluose, gyvūnuose, mikroorganizmuose.

a-ketoglutaratas + NH4+

Glutamatas + H2OGlutamato dehidrogenaz÷

NAD(P)H + H+

NAD(P)+

436

Glutamato dehidrogenaz÷ vienuose audiniuose specifin÷ NADH, kituose – NADPH. Glutamato dehidrogenaz÷ vaidina skirtingus fiziologinius vaidmenis. E.coli ji sintetina glutamatą , esant aukštom NH3 koncentracijoms. Neurospora crassa fermentas priklauso nuo NADPH ir katalizuoja redukcinį α-ketoglutararo amininimo, grįžtamą reakciją katalizuoja nuo NAD+ priklausomas fermentas. Žinduoliuose ir augaluose glutamato dehidrogenaz÷ yra mitochondrijose ir katalizuoja pusiasuvyrinę reakcija, kuri nukreipta glutamato skaidymo kryptimi.

Susidaręs glutamatas peramininimo metu perduoda aminogrupę kitoms aminorūgštims.

Vienas iš svarbiausių amoniako įsisavinimo kelių yra glutamino sintez÷. Šią reakciją katalizuoja glutamino sintetaz÷. Reakcija vyksta per du etapus. Pirmame susidaro glutamilfosfatas, kuris reaguoja su amoniaku ir sintetinasi glutaminas (skyrius 10.4.1),

Glutaminas + ATP γ-glutamilfosfatas + ADP

γ-glutamilfosfatas + NH4 Glutaminas + Pn + H+

Bendra reakcija: Glutamatas + ATP + NH4 Glutaminas + Pn + H+

+

+

Glutamino sintetaz÷ randama visuose organizmuose. Ji dalyvauja netiktai amoniako

asimiliacijoje mikroorganizmuose, bet vaidina labai svarbų vaidmenį toksiško laisvo amoniako surišime į glutaminą ir pernešime krauju. (skyrius 11).

Bakterijose ir augaluose glutamatas sintetinamas iš α-ketoglutarato ir glutamino, katalizuojant glutamato sintazei. Šioje redukcinio amininimo reakcijoje glutaminas yra azoto donoras.

α-ketoglutaratas + Glutaminas + NADPH + H+ 2 Glutamatas+ NADP+

Glutamino sintez÷s reguliacija

Glutamatas Glutaminas

NAD+

Asparaginas

IMP

GMP

CTPIMP

AMP

Histidinas

Triptofanas

Karbamoilo fosfatas

Gliukoz÷s amino 6-fosfatas

Glicinas

Alaninas

Serinas

Glutamino sinttetaz÷

17.3 pav. Glutamino sintetaz÷s alosterin÷ reguliacija

Glutamino sintetaz÷ vaidina labai svarbų vaidmenį azoto apykaitoje, kadangi glutaminas yra daugelio metabolitų pirmtakas (17.3 pav.). Fermento aktyvumas reguliuojamas grįžtamo ryšio inhibicijos būdu (yra devyni alosteriniai slopikliai), kovalentiškai modifikuojant fermentą ir fermento sintez÷s reguliacija.

Bakterijų E.coli fermentas sudarytas iš 12 vienodų subvienetų, kiekvienas subvienetas turi katalizinį centrą ir alosterinio slopiklio surišimo centrą. Alaninas, glicinas ir serinas yra

437

glutamato metabolizmo produktai, o tokie kaip AMP, CMP, triptofanas, histidinas ir kiti susidaro iš glutamino. Kiekviena iš šių medžiagų alosteriškai dalinai mažina fermento aktyvumą, pilnam fermento slopinimui šios medžiagos būtinos kartu.

Glutaminosintetaz÷(neaktyvi)

Glutaminosintetaz÷(neaktyvi)

PIIAT

PII

PIIAT

ATPPPn

Pn ATP

AMP

UMP

PII

UMP

UTPUMP

H2O PPn

Glutamatas

Glutaminas

α-ketoglutaratas

NH3

ATP

ADPPn

AT

AT

adenilinimas

deadenilinimas

uridilinimas

UT

Gln Pn

ATP

α-ketoglutaratas

17.4 pav. Glutamino sintetaz÷s reguliacija kovalentin÷s modifikacijos būdu. AT – adenililtransferaz÷, UT – uridililtransferaz÷, Gln ir Pn inhibuoja uridilinimą

Alosterin÷ reguliacija moduliuojama fermentą kovalentiškai modifikuojant. Adenilinant glutamino sintetazę, tai yra prijungus AMP prie aminorūgšties tirozino, esančio netoli aktyvaus centro, hidroksigrup÷s, ji inaktyvuojama, fermento jautrumas alosteriniams inhibitoriams padid÷ja. Adenilinimo ir deadenilinimo reakcijas katalizuoja tas pats fermentas adenililtransferaz÷. Adenililtransferaz÷s (AT) aktyvumas priklauso nuo reguliatorinio baltymo PII, kuris savo keliu reguliuojamas jį kovalentiškai modifikuojant, prijungiant uridilo liekaną prie tirozino. Adenililtransferaz÷s kompleksas su uridilintu PII (AT-PII-UMP) stimuliuoja glutamino sintetaz÷s deadenilinimą ir fermentas aktyvuojamas. Tuo tarpu deuridilintas PII stimuliuoja adenililtransferaz÷s adenilinimo aktyvumą. Baltymo PII pridilinimą ir deuridilinimą katalizuoja tas pats fermentas uridililtransferaz ÷. Uridilinimas inhibuojamas prisijungus prie uridililtransferaz÷s galutiniam produktui glutaminui ir neorganiniam fosfatui, Prijungus prie PII α-ketoglutaratą ir ATP uridililtransferaz÷ aktyvuojama.

Glutamino sintez÷ reguliuojama keičiant glutamino sintetaz÷s transkripciją. Uridilintas PII sąveikauja su transkripciją reguliuojančiais baltymais ir padid÷ja baltymo koncentracija ląstel÷je.

Ši sud÷tinga reguliacijos sistema jautriai reaguoja į pasikeitusią glutamino koncentraciją ląstel÷je. Padid÷jus glutamino koncentracijai, sumaž÷ja fermento kiekis ir inhibuojamas jo aktyvumas.

438

17.2 Aminor ūgščių biosintez ÷ Organizmai skiriasi pagal savo sugeb÷jimą sintetinti 20 pagrindinių aminorūgščių.

Augalai ir dauguma bakterijų sintetina visas 20 aminorūgščių, žinduolių organizmas gali sintetinti tiktai pusę jų. Aminorūgštys, kurių organizmas negali sintetinti vadinamos nepakeičiamomis aminorūgštimis ir jas turi gauti su maistu. Kitos, kurias organizmas sintetina iš įvairių tarpininkų yra vadinamos pakeičiamomis. (17.1 lentel÷) Pakeičiamos aminorūgštys yra sintetinamos iš glikoliz÷s, trikarboksirūgščių ir pentozinio ciklų tarpininkų, tirozinas ir cisteinas susidaro iš nepakeičiamų aminorūgščių. Azotas į aminorūgščių sud÷tį įjungiamas per glutamatą arba glutaminą. Kai kurios aminorūgštys sintetinamos viena ar keliomis stadijomis, aromatinių aminorūgščių sintez÷ yra sud÷tinga.

17.1 lentel÷ . Pakeičiamos ir nepakeičiamos aminorūgštys žmogaus organizme Nepakeičiamos

aminorūgštys Pakeičiamos

aminorūgštys Fenilalaninas Alaninas Izoleucinas Argininas* Leucinas Asparaginas Lizinas Aspartatas Metioninas Cisteinas Treoninas Glutamatas Triptofanas Glutaminas Valinas Glicinas Histidinas* Prolinas Serinas * Argininas ir histidinas yra nepakeičiamos tam tikromis sąlygomis. Dvi aminorūgštys – histidinas ir argininas priskiriamos pakeičiamoms aminorūgštims,

tačiau intensyvaus audinių augimo metu (pvz. vaikai) šių aminorūgščių pradeda trūkti ir jas būtina gauti su maistu.

439

α-ketoglutaratas Glutamatas

Glutaminas

Prolinas

Argininas

Oksaloacetatas Aspartatas

Asparaginas

Metioninas*Treoninas

Lizinas*

Izoleucinas*

3-fosfogliceratas

CisteinasSerinasGlicinas

Piruvatas

Alaninas

Valinas*

Leucinas*

Fosfoenolpiruvataseritroz÷s-4-fosfatas

Fenilalaninas*TirozinasTriptofanas*

Riboz÷s-5-fosfatas Histidinas

*

17.5 pav. Aminorūgščių biosintez÷ iš atitinkamų pirmtakų. * - pažym÷tos

nepakeičiamos aminorūgštys. Sintez÷ pakeičiamų aminorūgščių Alaninas, aspartatas ir glutamatas sintetinamos peramininimo reakcijos metu,

pernešant aminogrupę atitinkamai ant piruvato, oksaloacetato ir α−ketoglutarato. (skyrius) Glutamatas gali susidaryti grįžtamos glutamato dehidrogenazin÷s reakcijos metu.

Glutaminas sintetinamas iš glutamato, katalizuojant glutamino sintetazei. (SK). Amonio jonas prijungiamas prie glutamato γ-karboksigrup÷s. Ši reakcija svarbi netiktai glutamino biosintezei, bet ir amoniako detoksikacijai.

Asparaginas sintetinamas iš aspartato, katalizuojant asparagino sintetazei, aminogrup÷s donoras ura glutaminas, reakcijai reikalinga ATP.

Tirozinas sintetinamas iš fenilalanino, katalizuojant fenilalanino hidroksilazei. (pav.) Reakcijoje dalyvauja molekulinis deguonis ir kofermentas tetrahidrobiopterinas.

Serinas susidaro iš 3-fosfoglicerato, kuris pradžioje oksiduojamas iki 3-fosfohidroksipiruvato ir peramininimo su glutamatu reakcijos metu gauname 3-fosfoseriną. Fosfoseriną defosforilinus atsipalaiduoja serinas. Serinas taip pat gali susidaryti iš glicino prijungiant hidroksimetilgrupę.

Glicinas sintetinamas iš serino pašalinant hidroksimetilgrupę. Cisteino sintez÷ žinduoliuose prasideda nuo serino kondensacijos su homocisteino.

Kondensacijos produktas cistationas suskaidomas į α-ketoglutaratą ir cisteiną. Bakterijose ir augaluose acetilgrup÷ nuo acetil-KoA pernešama ant serino ir susidaro O-acilserinas. Sekančiame etape acetato grup÷ pakeičiama sulfidu (S2-) ir susidaro cisteinas.

440

Prolinas ir argininas sintetinami iš glutamato. Iš glutamato per kelias stadijas susidaro glutamato γ-semialdehidas, kuris ciklizuojasi į ∆1-pirolino 5-karboksilatą, jį redukavus susidaro prolinas. Jeigu glutamato γ-semialdehidas dalyvauja peramininimo reakcijoje tai susidaro ornitinas, iš kurio karbamido cikle sintetinamas argininas.

17.3 Aminor ūgštys yra įvairi ų biomolekuli ų pirmtakai Aminorūgštys yra netiktai baltymų statybiniai blokai, iš jų sintetinamos įvairios

biomolekul÷s – hormonai, kofermentai, nukleotidai, porfirinai, antibiotikai, pigmentai, neurosiuntikliai, bakterijų peptidoglikanai.

Porfirino biosintez÷ iš glicino Porfirinai įeina į hemoglobino, citochromų sud÷tį ir vaidina labai svarbų vaidmenį

pernešant ir saugant deguonį bei elektronų pernešimo grandin÷se. Glicinas yra vienas iš pagrindinių porfirinų sintez÷s substratų. Aukštesniuose eukariotuose glicinas reaguoja su sukcinil-KoA ir susidaro δ-aminolevulinatas (ALA).

COO

CH2

CH2

C S KoA

O

CH2

COO

NH3

COO

CH2

CH2

C O

CH

COO

NH3

COO

CH2

CH2

C O

CH2

NH3

+

-

-

-

-

+

+

-

+

δ-aminolevulinato sintaz÷

δ-aminolevulinato sintaz÷

KoASH CO2

Sukcinil-KoA Glicinas α-amino-β- δ-aminolevulinatas ketoadipatas 17.6 pav. Aminolevulinato biosintez÷ Bendra hemo sintez÷ iš δ-aminolevulinato pateikta 17.7pav. 8 δ-aminolevulinato molekul÷s

4 Porfobilinogeno molekul÷s

Hidroksimetilbilanas

Uroporfirinogenas III Koproporfirinogenas III Protoporfirinogenas IX

Protoporfirinas IX HemasFe2+

17.7 pav. Hemo sintez÷s schema. Susijungus dviem δ-aminolevulinato molekul÷ms susidaro porfobilinogenas, kuris per

eilę reakcijų virsta protoporfirinu. Katalizuojant ferochelatazei, į protoporfirino molekulę įjungiamas geležies atomas ir susiformuoja hemas.

441

Kreatino sintez÷.

NH3

CH2

COO

NH2

C

NH

CH2)3

CH

COO

NH3

NH2

NH2

C

NH

CH2

NH2

COO

NH2

C

N

CH2

NH2

COO

CH3

NH

C

N

CH2

NH2

COO

CH3

P O

O

O

++

+-

-

+

-

(

+

-

+

-

-

Amidino-transferaz÷

Metil-transferaz÷

Kreatino kinaz÷

+

SAM SAH ATP ADP

Glicinas Argininas Guanidinoacetatas Kreatinas Fosfokreatinas

Ornitinas

Pa17.8 pav. Kreatino ir fosfokreatino sintez÷ Kreatinas yra sintetinamas iš glicino ir arginino. Fosforilinus kreatiną susidaro

fosfokreatinas, kuris raumenyse yra labai svarbus energetinis buferis. Glutationo sintez÷. Glutationas (GSH) yra tripeptidas sudarytas iš γ-glutamato,

cisteino ir glicino. Jis vaidina labai svarbų vaidmenį palaikant ląstel÷s oksidacinį redukcinį potencialą. ATP aktyvuoja glutamato γ-karboksigrupę, acilfosfato tarpininkas yra atakuojamas cisteino α-aminogrup÷s. Sekančioje kondensacijos reakcijoje glicinas reaguoja su aktyvuotu γ-glutamilcisteinu ir gauname glutationo.

Glutamatas γ-glutamilcisteinas γ-glutamilcisteinilglicinas (glutationas)

ATP ADP+PnATP ADP+PnGlicinas

Glutationosintetaz÷

γ-glutamil- cisteino sintetaz÷

17.9 pav. Glutationo biosintez÷.

Glutationas palaiko baltymuose redukuotas merkaptogrupes, geležį redukuotame (Fe2+) būvyje hemoglobino molekul÷je, vykstant deoksiribonukleotidų sintezei redukuoja glutaredoksiną (skyrius). Katalizuojant glutationo peroksidazei glutationas neutralizuoja toksiškus peroksidus.

2GSSH + R-O-O-H GSSG + H2O + R-OH Glutationo peroksidaz÷s sud÷tyje yra kovalentiškai prijungtas selenas. Dekarboksilinant aminorūgštis susidaro biologiškai aktyvūs aminai – Histaminas,

serotoninas, γ-aminobutiratas, adrenalinas, adrenalinas (skyrius 11) Kai kurie triptofano katabolizmo tarpininkai panaudojami biologiškai svarbių

medžiagų sintez÷ms – gyvūliuose nikotinatas yra NAD ir NADP pirmtakas, serotoninas stuburiniuose gyvūnuose yra neurotransmiteris, augaluose indolilacto rūgštis yra augimo hormonas arba auksinas. (pav.)

442

NH

CH2

CH

COO

NH3

N

COO

NH

CH2

COO

NH

CH2

CH2

NH3

+

--

-+

Triptofanas Nikotinatas(niacinas)

Serotoninas Indolilacetatas 17.10 pav. Triptofanas - biologiškai aktyvių junginių pirmtakas.

Fenilalaninas ir tirozinas gali būti paverčiami į tvirtą polimerą ligniną, jo tiksli

struktūra n÷ra nustatyta, jis plačiai paplitęs augaluose. Tirozino ir fenilalanino metabolizmo produktai gali būti taninai, apsaugantys vyną nuo

oksidacijos, alkaloidas morfinas, cinamono rūgštis – suteikianti kvapą cinamonų aliejui, vanilei, muškatui gvazdik÷liams ir kitiems produktams. Patikrinti ar cinamono alieju

gvazdikam kvapa

CH

CH

COOH

Cinamono rūgštis

17.4 Azoto oksido sintez ÷ iš arginino. Azoto oksidas (NO*) yra aktyvus cheminis radikalas dalyvaujantis įvairiose fiziologin÷se reakcijose – vazorelaksacijoje, neurotransmisijoje, imunin÷s sistemos moduliacijoje. Jis apsaugo nuo trombocitų agregacijos ir vaidina labai svarbų vaidmenį makrofagų funkcionavime. NO gyvenimo trukm÷ yra trumpa (3-10 s) nes reaguoja su deguonimi ir superoksido anijonu ir yra paverčiamas į nitritus ir nitratus. Patologin÷mis sąlygomis sintetinami dideli azoto oksido kiekiai, kurie yra citotoksiški, sukelia audinių pažeidimus. NO sintez÷. NO sintetinamas iš arginino ląstelei atsakant į įvairius fiziologinius ir patologinius stimulus.

NH2

C

NH

CH2)3

CH

COO

NH3

N OH

NH2

C

NH

CH2)3

CH

COO

NH3

NH2

NH2

C

NH

CH2)3

CH

COO

NH3

O+

+

-

(+

-

(+

-

(

Azoto oksido sintaz÷

NADPH, O2

NADP+,H2O

Azoto oksido sintaz÷

NADPH, O2

NADP+,H2O

+ NO*

Argininas Hidroksiargininas Citrulinas 17.11 pav. Azoto oksido sintez÷ iš arginino.

443

17.4.1Azoto oksido sintaz ÷. Yra nustatytos trys azoto oksido sintaz÷s izoformos: neuronin÷ azoto oksido sintaz÷,

indukuojama azoto oksido sintaz÷ ir endotelin÷ azoto oksido sintaz÷. Šie fermentai yra homologiški, panaši domenin÷ struktūra ir analogiškas katalizinis veikimas.

Fermentas sudarytas iš dviejų domenų- N-galinis oksigenazinis domenas sujungtas su C-galine reduktaze per Ca-kalmoduliną surišančią sritį. Reduktaz÷s domenas prijungia NADPH, FMN,FAD ir kalmoduliną. Su oksigenaziniu domenu susijungia hemas, tetrahidrobiopterinas ir argininas. Sintetinant NO elektronai nuo NADPH reduktaziniame domene per lavininius kofermentus pereina ant hemo, kuris prijungia ir aktyvuoja deguonį. Aktyvuotas deguonis susijungia su argininu, susidaro tarpinis junginys hidroksiargininas, kuris oksiduojamas iki citrulino ir NO.

Azoto oksido sintaz÷s izoformos yra sutinkamos skirtinguose organuose , susidaręs NO veikia skirtingus organus ir atlieka specifines fiziologines funkcijas.

Endotelin÷ azoto oksido sintaz÷ konstitutyviai ekspresuojama kraujagyslių ir širdies endotelin÷se ląstel÷se. Tiktai ši izoforma yra susirišusi su membrana. Aktyvavus endotelines ląsteles, padid÷ja viduląstelin÷ Ca2+ koncentracija, jis susiriša su kalmodulinu ir aktyvuoja sintazę.

Neuronin÷ azoto oksido sintaz÷ pagrindinai ekspresuojama centrin÷s ir periferin÷s nervų sistemos ląstel÷se. Šis fermentas yra citozolyje. Aktyvuojamas prisijungus Ca-kalmodulino kompleksui.

Indukuojama azoto oksido sintaz÷ yra plačiai paplitusi įvairiuose audiniuose aktyviausia yra makrofaguose ir neutrofiluose. Fermentas yra citozolinis baltymas, jo kiekis ląstel÷je yra nedidelis ir jis neaktyvuojamas kalmodulino.

NO poveikis kraujagyslių endotelin÷ ląstel÷ms. NO yra svarbus tarpininkas reguliuojantis kraujagyslių lygiųjų raumenų tonusą. NO sintetinamas endotelin÷s NO sintaz÷s ir difunduoja į kraujagyslių lygiuosius raumenis, kur aktyvuoja tirpią citozolinę guanilato ciklazę. Padid÷jus cGMP koncentracijai aktyvuojama baltymo kinaz÷ G, kuri fosforilina miozino lengvosios grandin÷s kinazę ir padaro ją neaktyvią, tod÷l sumaž÷ja lygiųjų raumenų susitraukimas. Azoto oksidas susidaro iš nitroglicerolio, plačiai vartojamo vaisto, pasižyminčio kraujagysles išplečiančiomis savyb÷mis. Nitroglicerolis aktyvuoja guanilato ciklazę ir daugelyje audinių padid÷ja ciklinio guanozino 3/,5/-monofosfato kiekis. Veikiant fermentams nitroglicerolis skyla ir išsiskiria NO, kuris ir aktyvuoja guanilato ciklazę.

NO skirtingai veikia skirtingose taikinio ląstel÷se, šis poveikis yra sąlygojamas tirpios guanilato ciklaz÷s aktyvacijos. NO jungiasi prie fermente esančio hemo ir aktyvuoja. Susidaręs ciklinis guanozino monofosfatas aktyvuoja cGMP-priklausoma baltymo kinazę kuri fosforilina baltymus.

NO skatina makrofagų baktericidin į aktyvumą. Makrofaguose indukuojamos NO

sintaz÷s aktyvumas yra žemas, fermento sintezę pagreitina bakterijų lipopolisacharidai arba išsiskyręs γ-interferonas. Fermento ekspresiją indukuoja įvairūs faktoriai – uždegimą sukeliantys citokinai, endotoksinai (bakterijų sienelių lipopolisacharidai sukeliantys uždegiminius procesus), hipoksija, aktyviosios deguonies formos. Makrofagai ir neutrofilai be NO sintetina ir superoksido anijono radikalą O2

-*, kuris reaguoja su NO ir susidaręs toksiškas peroksonitrilo (OONO*)radikalas skyla į iki labai toksiško OH* radikalo. Veikiant aktyviosios deguonies ir azoto formoms yra sunaikinami mikroorganizmai.

NO* + O2-* OONO-

450

III DALIS

BIOLOGINöS INORMACIJOS SRAUTAI

17 DNR struktūros nustatymas................................................Error! Bookmark not defined. 18 DNR BIOSINTEZö ......................................................................................................... 451

18.1 Pusiau konservatyvaus DNR replikacijos mechanizmo įrodymas .............................. 452 18.2 DNR replikacija........................................................................................................... 453

18.2.1 DNR polimeraz÷s , .............................................................................................. 454 18.2.2 Bakterijų DNR polimeraz÷s................................................................................. 457

18.3 DNR replikacijos etapai............................................................................................... 458 18.3.1 DNR replikacijos iniciacija ................................................................................. 459 18.3.2 DNR replikacijos elongacija................................................................................ 460 18.3.3 DNR replikacijos terminacija .............................................................................. 463

18.4 DNR replikacija eukariotuose ..................................................................................... 464 18.5 Nukleorūgščių hidroliz÷ .............................................................................................. 465

18.5.1 Restrikcijos endonukleaz÷s.................................................................................. 465 19 RNR BIOSINTEZö ......................................................................................................... 466

19.1 RNR biosintez÷ prokariotuose........................................Error! Bookmark not defined. 19.1.1 RNR polimeraz÷ .................................................................................................. 467 19.1.2 Grandin÷s ilginimo reakcija....................................Error! Bookmark not defined. 19.1.3 Transkripcijos iniciacija ...................................................................................... 469 19.1.4 Grandin÷s elongacija ........................................................................................... 473 19.1.5 Transkripcijos terminacija ................................................................................... 474

19.2 Transkripcija eukariotuose .......................................................................................... 475 19.2.1 Eukariotų RNR polimeraz÷s................................................................................ 475 19.2.2 RNR polimeraz÷s inhibicija ................................................................................ 476

19.3 Transkripcijos reguliacija ............................................................................................ 477 19.3.1 Lac operono reguliacija ....................................................................................... 478

19.4 Potranskripcin÷ RNR modifikacija (RNR brendimas ................................................. 481 19.4.1 Ribosominių RNR brendimas.............................................................................. 482 19.4.2 Transportinių RNR brendimas............................................................................. 483 19.4.3 Eukariotų iRNR brendimas ................................................................................. 484

19.5 Nuo RNR priklausoma DNR ir RNR biosintez÷. ........................................................ 488 20 BALTYMŲ BIOSINTEZö.............................................................................................. 490

20.1 Genetinis kodas............................................................................................................ 490 20.2 Ribosomos baltymų biosintez÷s vieta.......................................................................... 491 20.3 Baltymų biosintez÷s eiga ............................................................................................. 493

20.3.1 Aminorūgščių aktyvacija. .................................................................................... 494 20.3.2 Baltymų biosintez÷s iniciacija ............................................................................. 497 20.3.3 Elongacija. Peptidinio ryšio susidarymas ............................................................ 500 20.3.4 Polipeptido sintez÷s terminacija .......................................................................... 503

20.4 Baltymų biosintez÷s inhibitoriai .................................................................................. 505

451

III DALIS BIOLOGIN öS INFORMACIJOS SRAUTAI

17 Gyvuose organizmuose visa informacija apie ląstel÷s sandarą, apie joje vykstančius

biocheminius procesus yra sukaupta genetin÷je medžiagoje arba genome. Eukariotų ir prokariotų ląstel÷se genetin÷ medžiaga saugoma DNR, kai kuriuose virusuose – RNR molekul÷se. DNR kaip genetin÷ medžiaga yra netiktai ląstel÷s branduolyje, bet ir mitochondrijose bei augalų chloroplastuose. Genomas gali būti sudarytas iš vienos DNR molekul÷se, kaip yra bakterijose. Eukariotų branduoliuose gali būti kelios chromosomos. Prokariotai neturi branduolio, jose šalia chromosomin÷s DNR yra nechromosomin÷ DNR plazmidžių pavidale. Informacija, užrašyta DNR molekul÷je yra kopijuojama ir perduodama dukterinei ląstelei replikacijos (DNR biosintez÷s) metu. DNR, esanti apvaisintame kiaušin÷lyje koduoja visą informaciją, kuri lemia organizmo vystymąsi. Vystymesi dalyvauja milijardai ląstelių, kiekviena iš jų yra specializuota atlikti tam tikrai funkcijai. Tod÷l DNR turi netiktai tiksliai replikuotis dalijantis ląstelei, bet turima informacija turi būti selektyviai ekspresuojama. Transkripcija (RNR biosintez÷) yra pirmas genetin÷s informacijos realizavimo etapas. Antrame etape, kodas užrašytas nukleotidų sekoje yra transliuojamas (sintetinami baltymai).

Ši informacijos perdavimo nuo DNR ant RNR kryptis yra vadinama molekulin÷s biologijos dogma (18.1 pav.). Ji buvo pasiūlyta 1958m Kriko. Atgalinio ryšio n÷ra, informacija, užrašyta aminorūgščių sekoje n÷ra perduodama atgal DNR molekulei. Pirmin÷je molekulin÷s biologijos dogmos versijoje nebuvo žinoma apie informacijos perdavimą nuo RNR ant DNR. Šis kelias buvo atrastas žymiai v÷liau, tiriant retrovirusus, ir buvo pavadintas atgaline transkripcija.

.

DNR

RNR

Baltymai

Replikacija

Transkripcija

Transliacija

18.1 pav. Biologin÷s informacijos pagrindinis srautas (molekulin÷s biologijos dogma).

Informacija nuo DNR perduodama RNR ir aminorūgščių sekai polipeptidin÷je grandin÷je.

18 DNR BIOSINTEZö

1953m Votsono ir Kriko pasiūlytas DNR dvigubos spiral÷s modelis paaiškino DNR padvigub÷jimo principą. Kadangi vienoje polinukleotidin÷je grandin÷je baz÷s yra komplementarios kitoje grandin÷je esančioms baz÷ms, tai vykstant DNR biosintezei pradžioje grandin÷s turi atsiskirti viena nuo kitos, o po to ant kiekvienos iš jų kaip matricos bus sintetinama

452

nauja. Tokiu būdu gaunamos dvi dukterin÷s DNR molekul÷s identiškos motininei, kuriose viena polinukleotidin÷ grandin÷ yra naujai sintetinta, o kita yra gauta iš motinin÷s DNR.

A=TG=CC=GT=AC=G

AGCTC

T C G A G

A=TG=CC=GT=AC=G

A=TG=CC=GT=AC=G

18.2 pav. DNR replikacijos modelis pasiūlytas Votsono ir Kriko. „Motinin÷s“ DNR grandin÷s atsiskiria ir prie kiekvienos pagal komplementarumo principą sintetinama nauja „dukterin÷“ grandin÷.

18.1 Pusiau konservatyvaus DNR replikacijos mechani zmo įrodymas Šis DNR replikacijos mechanizmas, kai viena polinukleotidin÷ grandin÷ yra konservatyvi,

o kita sintetinama nauja yra vadinamas pusiau konservatyviu. Šią Votsono ir Kriko pusiau konservatyvios replikacijos hipotezę eksperimentiškai 1957m įrod÷ Mezelsonas (M.Meselson) ir Štalis (F.W.Stahl). Jie bakterijas E.coli augino terp÷je, kur vieninteliu azoto šaltiniu buvo 15NH4Cl. Į naujai sintetintos DNR heterociklinių bazių sud÷tį buvo įjungtas „sunkusis“ 15N azoto izotopas. Iš bakterijų buvo išskirta DNR (turinti sunkųjį 15N izotopą) ir nucentrifuguota CsCl tankio gradiente. Ji buvo 1% sunkesn÷ nei „normali“ DNR (14N) ir centrifuginiame m÷gintuv÷lyje nukeliavo toliau nei DNR (14N) (18.3 pav. a ir c). Bakterijos buvo perkeltos į terpę ir augintos su „lengvuoju“ azoto (14NH4Cl) izotopu. Po pirmo pasidalinimo buvo išskirta DNR ir centrifuguojant CsCl tankio gradiente susidar÷ viena juosta, kuri buvo tarp „lengvos“ ir „sunkios“ DNR molekul÷s. Tai rodo, kad DNR yra hibridas (14N/15N ), sudarytas iš vienos motinin÷s DNR (15N) grandin÷s ir vienos dukterin÷s DNR (14N) (18.3 pav. b). Po antro pasidalijimo stebimos dvi juostel÷s, viena atitinka „lengvą“ DNR (14N), kita- hibridinę DNR (14N/15N).

18.3 pav. DNR pusiau konservatyvaus biosintez÷s mechanizmo eksperimentinis įrodymas.

Mezelsono Štalio eksperimentas. Po pirmo pasidalijimo susidaro hibridin÷ DNR (b), kurios viena

453

polinukleotidin÷ grandin÷ yra motinin÷, kita naujai sintetinta. Po antro pasidalijimo (c) turime dvi rūšis DNR – vien lengva (14N) kita hibridin÷ (14N-15N).

18.2 DNR replikacija DNR biosintez÷, kurią vykdo DNR polimeraz÷ dar yra vadinama replikacija , jos metu iš

vienos DNR susidaro dvi vienodos molekul÷s. Replikacijoje išskiriami trys etapai. Pirmas etapas iniciacija prasideda prisijungus replikacijoje dalyvaujantiems baltymams prie DNR molekul÷s. Elongacijos metu polimeraz÷ katalizuoja naujų nukleotidų įsijungimą į augančią polinukleotidinę grandinę. Terminacijos etape DNR biosintez÷ sustoja, disocijuoja biosintez÷je dalyvaujantys komponentai ir dvi naujos DNR molekul÷s atsiskiria.

Genetin÷ informacija turi būti išsaugota ir nepažeista, tod÷l DNR biosintez÷ turi vykti greitai, tiksliai ir be klaidų. Ląstel÷se yra fermentin÷s sistemos, kurios ištaiso replikacijos klaidas ir pašalina DNR pažaidas, tai yra vykdo reparaciją.

. 18.4 pav. DNR replikacija Escherichia coli. Replikacija prasideda pradžios (ori) taške ir

vyksta vienu metu į abi puses . Replikaciją katalizuoja baltymų kompleksas replisoma. E.coli chromosoma yra didel÷, žiedo formos, dvigrand÷ DNR molekul÷, sudaryta iš

4,6*106 kilobazių porų (kb). DNR replikacija prasideda vieninteliame taške vadinamame ori (angl. origin –pradžia) ir vyksta į abi puses tuo pačiu metu. Replikacija sustoja, kai pasiekiama terminacijos sritis. Baltymų kompleksas, katalizuojantis replikaciją vadinamas replisoma. Replikacijos metu dvi DNR grandin÷s atsiskiria, susidaro V formos struktūra, kuri vadinama replikacin÷ šakut÷, replisoma prisijungia prie kiekvienos iš dviejų replikacinių šakučių.

Replikacija pasibaigia terminacijos taške

.

Replikacin÷ šakut÷

18.5 pav. Replikacin÷ šakut÷s susidarymas. DNR molekul÷s grandin÷s atsiskiria ir ant kiekvienos sintetinama nauja polinukleotidin÷ grandin÷.

Comment [JK1]: paveikslas

454

Išsisukus dvigrandei DNR kiekviena grandin÷ tarnauja kaip matrica naujo polinukleotido sintezei. E.coli replikacijos šakut÷ juda 1000bp per sekundę greičiu. Kadangi E.coli chromosomoje šiuo greičiu į skirtingas puses juda dvi replikacijos šakut÷s, visa chromosoma padvigub÷ja per 38 min.

ori ori ori

18.6 pav. Eukariotų ląstelių replikacijos pradžios taškai. Eukariotuose replikacija

prasideda daugelyje ori taškų ir vyksta į abi puses. Eukariotų chromosomos yra linijin÷s, dvigrand÷s jos yra žymiai didesn÷s nei bakterijų

DNR. Pavyzdžiui drozofilos didžioji chromosoma turi apie 5,0*104 kb, ji yra per 10 kartų didesn÷ nei E.coli. Eukariotuose replikacin÷s šakut÷s jud÷jimo greitis yra mažesnis negu bakterijose, tačiau yra daug replikacijos ori taškų, biosintez÷ vyksta vienu metu abiem kryptim, tod÷l dideli eukariotų genomai kopijuojami pakankamai greitai.

18.2.1DNR polimeraz ÷s. Matricos komplementarų kopijavimą vykdo DNR-polimeraz÷s. Pirmas toks fermentas

išskirtas ir išgrynintas 1956 m. Kornbergo (A.Kornberg) (dabar jis yra vadinamas DNR polimeraz÷ I). Šiuo metu yra žinomos kelios DNR polimeraz÷s. DNR polimerazių detalūs tyrin÷jimai parod÷ bendrus DNR biosintez÷s principus. Polimeraz÷ katalizuoja reakciją, kurios metu prie polinukleotidin÷s grandin÷s 3/-galo yra prijungiamas atitinkamas deoksinukleozido trifosfatas (dNTP), susidaro 3/,5/-fosfodiesterinis ryšys ir grandin÷ pailg÷ja vienu nukleotidu. Reakcijoje atsipalaiduoja pirofosfatas. Reakciją galima užrašyti šiuo būdu

(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPn

DNR Pailg÷jusi DNR kur dNMP ir dNTP yra atitinkamai deoksinukleozido 5/ monofosfatas ir deoksinukleozido 5/ trifosfatas. Reakcijos pusiausvyra yra pastumta polinukleotidin÷s grandin÷s ilg÷jimo kryptimi, kadangi pirofosfataz÷ hidrolizuoja neorganinį pirofosfatą (PPn) iki dviejų fosforo rūgšties molekulių.

DNR polimeraz÷s veikimui būtini visi keturi nukleozido trifosfatai dATP, dGTP, dTTP ir dCTP.

DNR biosintezei būtina DNR matrica, kuri nurodo, kokia tvarka turi išsid÷styti baz÷s naujojoje DNR molekul÷je. Polimerizacijos reakcijoje nukleotidai išsid÷sto pagal komplementarumo principą. Tokiu būdu dukterin÷s DNR polinukleotidin÷s grandin÷s bazių seka yra tokia pati kaip ir motinin÷s.

DNR polimeraz÷s negali prad÷ti sintez÷s, negali sintetinti polinukleotidin÷s grandin÷s iš laisvų nukleozidų trifosfatų, jos tiktai prijungia monomerus prie esančio oligonukleotido. Biosintezei būtinas pradmuo. Fermentas, kurį Kornbergas išskyr÷ iš bakterijų E.coli sintetino naują DNR molekulę nuo viengrand÷s matricos esant pradmeniui. Pradmeniu vadinamas matricai

455

komplementarus augančios DNR viengrandis trumpas oligonukleotidinis fragmentas su laisva 3/-hidroksigrupe. Ląstel÷je pradmeniu tarnauja RNR molekul÷.

DNR polimeraz÷ polinukleotidin ę grandinę ilgina nuo 5/ galo į 3/ galą. Galinio nukleotido riboz÷s 3/-OH grup÷ yra nukleofilas ir atakuoja atitinkamo deoksinukleozido trifosfato α fosforo atomą. Nukleozido monofosfatas 3/,5/-fosfodiesteriniu ryšiu prijungiamas prie pradmens.

456

OCH2

H

O

H

H

HH

Thy

H

OO

H

O

H

H

HH

CH2Ade

O

HH

H

HH

CH2

O

O

P

O

OO

CytOCH2

H

OH

H

H

HH

Gua

OPOPOPO

O O O

O OO

:

OCH2

H

O

H

H

HH

Thy

OO

H

O

H

H

HH

CH2Ade

O

HH

H

HH

CH2

O

O

P

O

OO

CytOCH2

H

OH

H

H

HH

Gua

O

PO ODNR

-

PPn

5/ DNR

5/-DNR

-

---

Deoksiribonukleozido trifosfatas

DNRpradmuo

3/-DNR

Pirofosfataz÷2Pn

H2O

-

5/ DNR

5/-DNR

3/-DNR

-

Grandin÷s ilg÷jimokryptis

3/,5/ fosfodiesterinis ryšys

3/

5/

457

18.7 pav. Nukleozido trifosfato prijungimas prie pradmens. dNTP ateina į fermento aktyvų centrą, ir jeigu jo baz÷ yra komplementari patricin÷s DNR atitinkamai bazei (Gua=Cyt) prisijungia prie matricos. Pradmens 3/ hidroksigrup÷ yra nukleofilas ir atakuoja dNTP α fosforo atomą. Susidarius 3/,5/-fosfodiesteriniam ryšiui, polinukleotidin÷ grandin÷ ilg÷ja.

18.2.2Bakterij ų DNR polimeraz ÷s Daugiau nei 90% polimerazinio aktyvumo nustatyto E.coli ekstraktuose priklauso DNR

polimerazei I. Tačiau buvo parodyta, kad ši polimeraz÷ n÷ra pagrindinis fermentas atsakingas už bakterijų DNR replikaciją. Greitis, kuriuo ji prijungia nukleotidus (600 nukleotidų/min) yra žymiai l÷tesnis, negu juda replikacin÷ šakut÷. DNR polimeraz÷ I turi mažą procesyvumą. Procesyvumas tai yra nukleotidų skaičius prijungtas prie polinukleotido iki polimeraz÷ disocijuoja nuo DNR. Genetiniai tyrimai parod÷, kad replikacijoje dalyvauja daug genų ir tuo pačiu baltymų. Be to buvo izoliuoti bakterijų kamienai, su pažeistu polimeraz÷s I genu, jie nesintetino aktyvios polimeraz÷s, bet buvo gyvi. Bakterijose E.coli rastos mažiausiai penkios DNR polimeraz÷s.

18.1 lentel÷. E.coli DNR polimerazių palyginimas DNR polimeraz÷ I II III Struktūrinis genas polA polB polC(dnaE) Subvienetų skaičius 1 7 ≥10 Molekulin÷ mas÷ Mm (kDa) 103 88 830 3/→5/ egzonukleaz÷ Taip Taip Taip 5/→3/ egzonukleaz÷ Taip Ne Ne Polimerizacijos greitis (nukleotidai/s)

16-20 40 250-1000

Procesyvumas (prijungti nukleotidai prieš polimeraz÷s disociaciją

3-200 1500 ≥500000

DNR polimeraz÷ I sudaryta iš vienos polipeptidin÷s grandin÷s (Mm = 103 kDa). Šis

fermentas turi tris fermentinius aktyvumus - DNR polimerazinį (sintetina polinukleotidą), 5/→3/

egzonukleazinį (atskelia po vieną nukleotidą nuo 5/ galo) ir 3/→5/ egzonukleazinį (atskelia po vieną nukleotidą nuo 3/ galo). Paveikus DNR polimerazę I proteolitiniais fermentais ji suskyla į du fragmentus. Didysis fragmentas (dar jų vadinamas Klenovo fragmentu) turi polimerazinį ir 3/→5/ egzonukleazinį aktyvumus. Tuo tarpu mažasis fragmentas yra 5/→3/ egzonukleaz÷. Klenovo fragmentas plačiai naudojamas DNR sekvenavimo ir kituose molekulin÷s biologijos darbuose, kur nereikalingas 5/→3/ nukleazinis aktyvumas. Ląstel÷se DNR polimeraz÷ I dalyvauja reparacijoje ir pašalina DNR defektus, hidrolizuoja RNR pradmenį bei ilgina Okazaki fragmentą. E.coli ląstel÷je yra keli šimtai DNR polimeraz÷s I molekulių.

DNR polimeraz÷s II molekulin÷ mas÷ apie 88kDa, pasižymi polimeraziniu ir 3/→5/ egzonukleaziniu aktyvumu. Manoma, kad ji dalyvauja DNR reparacijoje.

DNR polimeraz÷ III - pagrindinis fermentas, sintetinantis DNR, tai didelis (molekulin÷. mas÷ per 830 kDa) baltymas, sudarytas iš 10 skirtingų subvienetų (α, ε, θ, τ, γ, δ, δ/, χ, ψ, β) (18.2 lentel÷). Išvalytas holofermentas yra asimetrinis dimeras kurio sud÷tyje yra po Comment [JK2]:

458

dvi kiekvieno baltymo kopijas. Polimeraziniu aktyvumu pasižymi α subvienetas, o klaidas taiso ε subvienetas. θ subvienetas susijungia su α ir ε subvienetais ir sudaro polimeraz÷s šerdį, kuri polimerizuoja DNR, su limituotu procesyvumu. Dvi šerdies polimeraz÷s gali susijungti su γ, τ, χ , ψ subvienetais, susidaręs 14 subvienetų kompleksas yra vadinamas DNR polimeraze III*. Tačiau jos procesyvumas yra žemas. Procesyvumas padid÷ja prijungus β subvienetus. Po du β subvienetai sudaro žiedinę apkabą, kuri replikacijos metu apgaubia kiekvieną DNR molekul÷s grandinę. Apkaba slenka išilgai DNR molekul÷s ir padidina DNR polimeraz÷s holofermento procesyvumą per 500000 kartų, neleisdama DNR polimerazei disocijuoti nuo DNR.

18.2 lentel÷ DNR polimeraz÷s III holofermento subvienetai Subvienetas Mm Genas Funkcija α 130000 polC/dnaE Polimerazinis aktyvumas ε 27500 dnaQ/mutD 3/→5/ egzonukleazinis aktyvumas θ 8600 holE β 40000 dnaN Sudaro apkabą, reikalinga optimaliam

procesyvumui τ 71000 dnaX Spartina šerdies dimerizaciją γ 47000 dnaX* Apkabos pakrov÷jas CLAMP Loader δ 38700 holA Apkabos atidariklis CLAMP OPENER δ/ 36900 holB Apkabos pakrov÷jas CLAMP Loader χ 16600 holC Sąveika su SSB baltymais ψ 15200 holD Sąveika su χ ir γ

Optimaliomis sąlygomis in vitro DNR polimeraz÷ katalizuoja apie 1000 nukleotidų prisijungimą per sek, replikacijos greitis vivo yra mažesnis.

Replikacija vyksta labai dideliu tikslumu. E.coli viena klaida padaroma įjungus 108-109 nukleotidus. Šių bakterijų chromosomoje yra ~4,6*106bp, tai reiškia, kad klaida pasitaiko tiktai kartą per 1000-10000 replikacijų ciklų. Tikslumą užtikrina ne tiktai vandeniliniai ryšiai tarp komplementarių bazių, bet ir standartinių bazių porų geometrijos. DNR polimeraz÷s I aktyvus centras prijungia tiktai bazių A-T ir G-C poras, nes jų erdvin÷ struktūra atitinka fermento aktyvų centrą. Viena polimeraz÷s I molekul÷ įjungia neteisingą bazę kas 104-105 teisingai sujungtų nukleotidų. In vivo klaidų skaičius sumažinamas dalyvaujant papildomiems fermentams. Beveik visos DNR polimeraz÷s turi atskirą 3/→5/ egzonukleazinį aktyvumą, kuris pašalina netinkamai prijungtą nukleotidą. Jeigu polimeraz÷ įjungia klaidingą nukleotidą, fermento translokacija ir naujo nukleotido prijungimas sustoja. Ši pauz÷ leidžia 3/→5/ egzonukleaziniam aktyvumui pašalinti nekomplementarų nukleotidą ir polimeraz÷ tęsia polimerizaciją. Šis aktyvumas vadinamas klaidų taisymas (proofreading) yra negrįžtama polimerizacijos reakcija, nes nedalyvauja pirofosfatas.

18.3 DNR replikacijos etapai DNR biosintezę galima suskirstyti į tris etapus: iniciaciją, elongaciją ir terminacij ą,

kurie skiriasi savo chemin÷mis reakcijomis, susidariusiais produktais, dalyvaujančiais fermentais. Kaip pamatysime v÷liau RNR ir baltymų biosintez÷je taip pat išskiriami šie etapai. Pateikiami eksperimentiniai duomenys gauti tiriant DNR biosintezę E.coli bakterijose.

Comment [JK3]: horton raso kad kiekviena grandine, lenindzeris dviguba spirale.

Comment [JK4]:

Comment [JK5]: Koks greitis

Comment [JK6]:

459

18.3.1DNR replikacijos iniciacija DNR replikacija prasideda specifiniame DNR pradžios (origin) taške. E.coli jis yra

vadinamas oriC ir yra lokalizuotas chromosomos genetiniame žem÷lapyje 10 valandą o‘clock. Iniciacijos pradžios taškas sudarytas iš 245 bazių porų, kurios yra konservatyvios įvairioms bakterijoms. Minimum devyni baltymai dalyvauja pradin÷se DNR replikacijos stadijose (18.3 lentel÷). Susidarant replisomai specifiniai baltymai prisijungia prie oriC ir palengvina vietinį dvigubos spiral÷s atsiskyrimą ir jos išsukimą.

18.3 lentel÷. Baltymai dalyvaujantys E.coli replikacijos pradžioje Baltymas Molekulin÷

mas÷ Mm Da

Subvienetų skaičius

Funkcija

DnaA 52000 1 Atpažįsta ori seką, atskiria DNR dvigubos spiral÷s grandines

DnaB (helikaz÷) 300000 6 Išsuka DNR spiralę DnaC 29000 1 Reikalingas DnaB surišimui su ori

fragmentu HU 19000 2 Į histoną panašus DNR surišantis

baltymas, stimuliuoja iniciaciją DnaG (praimaz÷) 60000 1 Sintetina RNR pradmenis

SSB baltymas 75600 4 Surišą atskirtą vieną DNR grandinę

RNR polimeraz÷ 454000 5 Aktyvuoja DnaA DNR giraz÷ (DNR topoizomeraz÷ II)

400000 4 Relieves torsional strain generated by DNA unwinding

DNR metilaz÷ 32000 1 Metilina (5/)GATC seką oriC fragmente

Genas dnaA koduoja vieną iš pagrindinių replikacijos baltymų DnaA. Jis reguliuoja DNR

replikaciją, kontroliuodamas iniciacijos dažnį,. Nuo 20 iki 50 DnaA baltymo molekulių susiriša su turtinga A-T poromis seka, kuri sudaryta iš trijų 13 bazių porų pasikartojimų ir ją išlydo. Dvi grandin÷s atsiskiria ir susidaro lokalūs viengrand÷s DNR segmentai. Šiam procesui panaudojama ATP energija ir dalyvauja į histonus panašus baltymas HU.

Po šešis fermento helikaz÷s (DnaB) subvienetus prisijungia prie kiekvienos atskirtos DNR grandin÷s ir panaudodami ATP hidroliz÷s energiją išsuka DNR molekulę. Išsukimas vienu metu vyksta į abi puses nuo ori taško. Taip, išilgai DNR molekul÷s juda replikacijos šakut÷.

Prie išsuktos viengrand÷s DNR molekul÷s prisijungia SSB baltymai (single strand binding protein), jie stabilizuoja polinukleotidinę grandinę, apsaugo ją nuo renatūracijos ir nuo nukleazių, hidrolizuojančių viengrandę DNR, poveikio.

DNR molekul÷ yra superspiralizuotoje formoje. Kada dvi grandin÷s yra išsukamos priekyje replikacin÷s šakut÷s, susiduriame su teigiama superspiralizacija (positive supercoils arba supertwists) Teigiama superspiralizacija trukdo tolimesniam DNR molekul÷s išsisukimui. Ši problema išsprendžiama veikiant grupei fermentų vadinamų DNR topoizomeraz÷mis. I tipo DNR topoizomeraz÷s įskelia vieną dvigubos DNR molekul÷s grandinę ir v÷liau jas sujungia. Fermentas turi nukleazinį (hidrolizuoja fosfodiesterinius ryšius) ir ligazinį (sujungia grandines)

Comment [JK7]: o‘clock

Comment [JK8]: Neaišku

460

aktyvumus. Jų veikimui nereikalinga ATP hidroliz÷s energija. Kiekvienu laiko momentu vienoje grandin÷je susidaro trumpalaikis trūkis (nick) ir intaktin÷ DNR molekul÷ persisuka relaksuodama susidariusius įtempimus. I tipo topoizomeraz÷s nuima neigiamas superspiralizacijas E.coli ir kartu neigiamas ir teigiamas superspiralizacijas eukariotin÷se ląstel÷se. II tipo DNR topoizomeraz÷s tvirtai susiriša su DNR dviguba spirale ir padaro trumpalaikį trūkį abiejose grandin÷se ir nuimama teigiama ir neigiama superspiralizacijos (18.8 pav.).

18.8 pav. DNR topoizomeraz÷s I ir DNR topoizomeraz÷s II veikimas./pie6inys DNR giraz÷ yra II tipo topoizomeraz÷ randama E.coli, ji panaudodama ATP energiją

įveda neigiamus superspiralizacijos elementus į relaksuotą, žiedinę DNR. Tai palengvina replikaciją, kadangi neigiama superspiralizacija neutralizuoja teigiamą superspiralizaciją susidariusią išvyniojant DNR.

Replikacijos iniciacijos laikas priklauso nuo DNR metilinimo ir susirišimo su bakterijų membrana. DNR oriC metilina Dam metilaz÷, kuri prijungia metilgrupę prie adenino N6 pad÷ties palindromin÷je GATC sekoje. Tuojau po replikacijos DNR yra hemimetilinama, tai yra metilinama tiktai motinin÷ grandin÷ o naujai susintetinta polinukleotidin÷ grandin÷ n÷ra metilinama. Metilinta oriC sritis yra prijungiama prie plazmin÷s membranos

Replikacijos iniciaciją reguliuoja ir DnaA baltymas, kuris aktyvus prisijungęs ATP. DnaA baltymas turi nedidelį ATPazinį aktyvumą ir l÷tai hidrolizuoja ATP. Prisijungęs ADP DnaA baltymas tampa neaktyvus.

18.3.2DNR replikacijos elongacija DNR polimeraz÷ katalizuoja polinukleotidin÷s grandin÷s ilginimą tiktai 5/→3/ kryptimi, .

Kadangi DNR molekul÷s dvi grandin÷s yra antilygiagret÷s, tai vienos naujos grandin÷s sintez÷

Comment [JK9]: kaip reguliuojama

461

sutaps su replikacin÷s šakut÷s jud÷jimo kryptimi, kitos grandin÷s sintez÷ vyks priešinga kryptimi.

5/

5/

5/

5/

5/

3/

3/

3/

3/

3/

Pirmaujanti grandin÷

RNRpradmuo

Okazaki fragmentas

Replikacin÷sšakut÷s jud÷jimokryptis

V÷luojantigrandin÷

Replikacin÷šakut÷s

18.9 pav. DNR polinukleotidinių grandinių sintez÷. Pirmaujanti grandin÷ (raudona)

sintetinama nepertraukiamai, v÷luojanti grandin÷ sintetinama trumpais Okazaki fragmentais. Polinukleotidin÷s grandin÷s sintez÷ prasideda nuo RNR pradmens.

Dukterin÷ polinukleotidin÷ grandin÷, kurios sintez÷s kryptis sutampa su replikacin÷s šakut÷s jud÷jimo kryptimi sintetinama nepertraukiamai ir yra vadinama pirmaujan čia. Kita – priešinga kryptimi sintetinama grandin÷ vadinama v÷luojančia. Jos sintez÷ vyksta nedideliais, turinčiais per 1000 nukleotidų fragmentais, vadinamais japonų mokslininko Okazaki vardu. (Okazaki fragmento ilgis prokariotuose yra 1000-2000 bp, o eukariotuose 100-200bp)

. 18.10 pav. Okazaki fragmentų sintez÷ DNR polimeraz÷s tiktai ilgina polinukleotidinę grandinę, jos negali prad÷ti sintez÷s.

Polinukleotidin÷s grandin÷s sintez÷ prasideda nuo trumpo (10-60 nukleotidų ilgio) RNR pradmens, kurio sintezę katalizuoja praimaz÷ (DnaG baltymas). Oligoribonukleotidas, kurio baz÷s komplementariai jungiasi su DNR atitinkamom baz÷m (A-U ir G-C)) sudaro hibridinę dvigubą spiralę. Prie šio oligonukleotido yra prijungiami nauji deoksiribonukleotidai.

462

Polinukleotidin÷s grandin÷s ilginimą katalizuoja DNR polimeraz÷ III . Prie pradmens ribonukleotido 3/ galo laisvos hidroksigrup÷s prijungiami deoksiribonukleozidai ir pirmaujanti grandin÷ pastoviai ilg÷ja. V÷luojančios grandin÷s sintez÷ prasideda taip pat nuo RNR pradmens, tačiau vyksta trumpais Okazaki fragmentais ir priešinga kryptimi. Helikaz÷ ir praimaz÷ sudaro replikacijos komplekso funkcinį vienetą vadinama praimosoma. DNR polimeraz÷s monomeras cikliškai sintetina v÷luojančios grandin÷s Okazaki fragmentus (18.10 pav.).

Susidarę Okazaki fragmentai yra sujungiami ir susidaro nepertraukiama polinukleotidin÷ grandin÷. Sujungimas vyksta trimis etapais: 1) pašalinamas RNR pradmuo, 2) vietoje RNR pradmens sintetinama DNR 3) sujungiami greta esantys DNR fragmentai. Šias reakcijas katalizuoja du fermentai DNR polimeraz÷ I ir DNR ligaz÷.

Veikiant DNR polimerazei I iš Okazaki fragmento yra pašalinamas RNR pradmuo (DNR polimeraz÷ I turi egzonukleazinį 5/→3/ aktyvumą). DNR polimeraz÷ I (5/→3/ polimerazinis aktyvumas) pailgina DNR fragmentą ir užpildo pašalintos RNR tarpą (18.11 pav.). Atskirus viengrandžius fragmentus sujungia DNR ligaz÷. Ji katalizuoja fosfodiesterinio ryšio susidarymą tarp vienos grandin÷s 3/ hidroksigrup÷s ir kitos grandin÷s 5/ fosfato. Fosfatas yra aktyvuojamas jį adenilinant. Virusų ir eukariotų DNR ligaz÷s aktyvacijai naudoja ATP, tuo tarpu bakterijų fermentas kaip AMP šaltinį naudoja NAD+ .

DNR polimeraz÷ I/egzonukleazinis aktyvumas/

DNR ligaz÷ATP ar NAD+

AMP + PPn ar NMP

V÷luojanti grandin÷

Okazaki fragmentas

DNR polimeraz÷ I/polimerazinis aktyvumas/

Pirmaujanti grandin÷

18.11 pav. Okazaki fragmentų sujungimas. RNR pradmuo (geltona spalva) pašalinamas

DNR polimeraz÷s I egzonukleazinio aktyvumo ir pakeičiamas DNR (raudona spalva). Du polinukleotidinius fragmentus sujungia DNR ligaz÷.

Abi grandines pirmaujančią ir v÷luojančia sintetina DNR polimeraz÷s dimeras. Vienas fermento monomeras susijungia su pirmaujančia grandine, kitas - su v÷luojančia. V÷luojanti grandin÷ sudaro kilpą, tod÷l DNR polimeraz÷s kompleksui judant 3/→5/ kryptimi, abi polinukleotidin÷s grandin÷s ilg÷ja 5/→3/ kryptimi. RNR praimaz÷ kas sekundę susijungia su matricine DNR ir sintetina RNR pradmenį. Kadangi replikacin÷ šakut÷s jud÷jimo greitis yra apie

463

1000 nukleotidų/s, naujas pradmuo yra sintetinamas kas 1000 nukleotidų. Trumpą pradmenį 5/→3/ kryptimi ilgina DNR polimeraz÷ III. β slenkanti apkaba (sliding clamp) prisijungia prie pradmens ir DNR polimeraz÷s. . Kada Okazaki fragmento sintez÷ pasibaigia, replikacija sustabdoma ir DNR polimeraz÷s III šerdies subvienetai disocijuoja nuo β slenkančios apkabos ir nuo Okazaki fragmento ir asocijuojasi su nauja slenkančia apkaba. Susidaręs kompleksas inicijuoja naujo Okazaki fragmento sintezę (18.12 pav.). Visas fermentinis kompleksas, atsakingas už koordinuotą DNR biosintezę replikacijos šakut÷je vadinamas replisoma. Baltymai, veikiantis replikacijos šakut÷j pateikti 18.3 lentel÷je.

i. 18.12 pav. DNR grandin÷s ilginimas.

18.3.3 DNR replikacijos terminacija E.coli replikacijos terminacija vyksta terminacijos taške Ter (terminus), kuris išsid÷sto

žiedin÷s chromosomos priešingoje ori taškui pus÷je. Šioje srityje DNR molekul÷je yra daugybin÷s 20bp specifinių bazių kopijos, kurios susijungia su baltymu Tus (termination utilization substance). Baltymo molekul÷je yra ryškiai išreikštos β struktūros, kurios susiriša su DNR molekul÷s didžiuoju grioviu ir blokuoja replisomos helikazinį aktyvumą ir tuo pačiu replikacin÷s šakut÷s jud÷jimą. Terminacijos srityje taip pat yra nukleotidų sekos, kurios palengvina dukterin÷s chromosomos atsiskyrimą pasibaigus DNR replikacijai.

464

18.4 DNR replikacija eukariotuose Eukariotuose DNR molekul÷s yra žymiai didesn÷s nei bakterijose ir susijungusios su

baltymais sudaro sud÷tingos struktūros nukleoproteinus. Eukariotuose replikacijos šakut÷ juda nedideliu greičiu (~50 nukleotidų /s), tai yra žymiai l÷čiau negu prokariotuose ir kiekvieno Okazaki fragmento ilgis siekia 100-200 bp. Tokiu greičiu replikuojantis, žmogaus chromosomos sintez÷ truktų per 500 val. Eukariotų chromosomos replikacija prasideda vienu metu daugelyje taškų, kurie nutolę vienas nuo kito per 30000 – 300000 bp ir vyksta į abi puses. Kiekviena eukariotų chromosoma turi daug replikacijos pradžios (ori) taškų. Replikacijos pradžios sritis yra vadinama ARS (autonomiškai replikuojanti seka) arba replikatoriumi. Miel÷se replikatorius sudarytas iš ~150 bazių porų ir turi kelias konservatyvias sekas. Haploidiniame mielių genome yra apie 400 replikatorių, kurie pasiskirsto 17 chromosomų. Replikacijos iniciacijoje taip pat dalyvauja baltymas ORC, kuris susiriša su atitinkamomis replikatoriaus sritimis. Drozofilos Drosophila melanogaster didžioji chromosoma turi apie 6000 replikacijos šakučių, tai yra apie 3000 ori taškų. D÷ka didelio replikacijos pradžios taškų skaičiaus ir DNR biosintez÷s į abi puses, eukariotų chromosomos replikuojasi per 1 valandą.

Pagrindiniai DNR replikacijos principai eukariotuose ir prokariotuose yra vienodi. Eukariotuose kaip ir E.coli pirmaujanti grandin÷ sintetinami nepertraukiamai, o v÷luojančios grandin÷s sintez÷ vyksta fragmentais. Atsiliekančios grandin÷s sintez÷ vyksta atskirais etapais – pradmens sintez÷, Okazaki fragmentų sintez÷, pradmens hidroliz÷, tarpų tarp polinukleotidinių fragmentų užpildymas, atskirų fragmentų sujungimas.

Daugumoje eukariotų ląstelių yra minimum penkios skirtingos DNR polimeraz÷s α, β, γ, δ ir ε. (18.5 lentel÷). DNR polimeraz÷s α, δ ir ε atsakingos už elongacijos stadiją ir dalyvauja reparacijoje. Šios polimeraz÷s dar vadinamos atitinkamai pol α, pol β, pol γ, pol δ ir pol ε. Polimeraz÷ β taiso sintez÷s klaidas ir randama branduolyje. Mitochondrijose DNR replikaciją katalizuoja DNR polimeraz÷ γ. Šeštoji DNR polimeraz÷ randama chloroplastuose.

DNR polimeraz÷ δδδδ katalizuoja pirmaujančios polinukleotidin÷s grandin÷s sintezę. Fermentas sudarytas iš dviejų subvienetų, didysis turi polimeraz÷s aktyvų centrą. Fermentas turi taip pat 3/→5/ egzonukleazinį aktyvumą. Eukariotuose DNR replikacijoje klaidų skaičius yra nedidelis, tai rodo labai efektyvią reparacijos sistemą. Polimeraz÷ δ yra stimuliuojama baltymo PCNA (proliferuojančių ląstelių branduolio antigenas proliferating cell nuclear antigen). PCNA struktūra ir funkcijos yra panašios į E.coli DNR polimeraz÷s III β subvienetą. Jis sudaro žiedinę apkabą ir padidina polimeraz÷s procesyvumą.

DNR polimerz÷ α kartu su δ dalyvauja atsiliekančios grandin÷s sintez÷je. DNR polimeraz÷ αααα sudaryta iš kelių baltymų ir turi polimerazinį bei RNR praimazinį aktyvumus. Fermentas neturi 3/→5/ egzonukleazinio aktyvumo, tod÷l nedalyvauja klaidų taisyme. Skaitoma, kad DNR polimeraz÷ α sintetina pradmenis, sudarytus iš trumpo RNR fragmento, sujungto su DNR. Tokį RNR-DNR pradmenį iki pilno Okazaki fragmento ilgina DNR polimeraz÷ δδδδ.

DNR polimeraz÷ εεεε yra didelis, sudarytas iš kelių subvienetų baltymas. Didysis subvienetas turi polimerazinį ir 3/→5/ egzonukleazinį aktyvumus. Šis fermentas dalyvauja reparacijoje ir matomai pašalina pradmenį ir užpildo tarpus tarp Okazaki fragmentų atsiliekančioje grandin÷je.

18.5 lentel÷ Eukariotų DNR polimeraz÷s DNR polimeraz÷ Aktyvumas Vaidmuo

465

α Polimerazinis Praimazinis 3/→5/ egzonukleazinis

Pradmens sintez÷ Reparacija

β Polimerazinis Reparacija γ Polimerazinis

3/→5/ egzonukleazinis Mitochondrijų DNR replikacija

δ Polimerazinis 3/→5/ egzonukleazinis

Pirmaujančios ir atsiliekančios grandin÷s sintez÷ Reparacija

ε Polimerazinis 3/→5/ egzonukleazinis 5/→3/ egzonukleazinis

Reparacija Tarpų užpildymas tarp atsiliekančių grandinių

Skirtumai tarp eukariotų ir prokariotų replikacijos yra ne vien tiktai DNR dydžiuose.

Eukariotuose DNR susiriša su histoniniais baltymais ir sudaro nukleosomas, tai gali sąlygoti l÷tesnį replikacijos šakut÷s jud÷jimą. DNR replikacija yra susijusi su tuo pat metu vykstančia histonų biosinteze. Nauji histonai jungiasi su dukterin÷mis DNR polinukleotidin÷mis grandin÷mis.

Linijini ų eukariotų chromosomų replikacijos terminacijoje dalyvauja specialios struktūros vadinamos telomeromis, kurios prijungiamos grandin÷s gale.

18.5 Nukleor ūgščių hidroliz ÷ Fermentai, skaidantys nukleorūgštyse esančias fosfodiesterinius ryšius yra vadinami

nukleaz÷mis. Ląstel÷se randamos įvairios nukleaz÷s. Vienos reikalingos DNR skaidymui, sintezei bei reparacijai, kitos naudojamos RNR hidrolizei. Kai kurių nukleazių specifiškumas yra nedidelis, jos katalizuoja ir DNR ir RNR virsmus, tačiau dauguma veikia arba tiktai DNR (jos vadinamos deoksiribonukleaz÷s, DNRaz÷s) arba RNR (ribonukleaz÷s, RNRaz÷s). Nukleaz÷s yra skirstomos pagal fosfodiesterinio ryšio skaidymo vietą. Endonukleaz÷s skaido fosfodiesterinį ryšį polinukleotidin÷s grandin÷s viduje, egzonukleaz÷s atskelia mononukleotidus nuo grandin÷s galo, susidarant 3/-monofosfatui arba 5/-monofosfatui.

Skirtumas tarp riboz÷s ribonukleorūgščių molekul÷je ir 2/-riboz÷s DNR molekul÷je yra nežymus, tačiau turi didelę įtaką nukleorūgščių savyb÷ms. 2/-hidroksigrup÷ gali sudaryti vandenilinius ryšius RNR molekul÷je, dalyvauja tam tikrose chemin÷se ir fermentin÷se reakcijose.

Paveikus RNR 0,1M NaOH tirpalu ji per kelias valandas suskyla į mišinį 2/- ir 3/-nukleozido monofosfatų. Šarmin÷ RNR hidroliz÷ reikalauja 2/- hidroksigrup÷s buvimo. DNR molekul÷s yra stabilios šarmin÷je terp÷je, nes neturi 2/- hidroksigrup÷s, reikalingos transesterifikacijos reakcijai.

18.5.1 Restrikcijos endonukleaz ÷s Restrikcijos endonukleaz÷s (restriktaz÷s) yra svarbi endonukleazių poklas÷, skaidanti

DNR. Pavadinimas restrikcijos endonukleaz÷s atsirado nustačius, kad tam tikros bakterijos blokuoja bakteriofagų infekciją, specifiškai suardydamos patekusią virusinę DNR. Šiuo metu

466

žinoma per 3500 skirtingų (II tipo) restrikcijos endonukleazių atpažįstančių virš 250 skirting ų sekų

Tokios restrikcijos endonukleaz÷s atpažįsta specifines DNR molekul÷s sekas ir suardo fosfodiesterinį ryšį abiejose DNR grandin÷se. Susidarę dideli DNR fragmentai greitai hidrolizuodami egzonukleazių.

Šeimininko ląstel÷s apsaugo savąją DNR nuo restriktazių poveikio kovalentiškai modifikuodamos atitinkamas bazes, kurios yra atpažįstamos restrikcijos endonukleazių. Dažniausiai yra meilinamos adenino ar citozino baz÷s. Metilintų bazių buvimas galimose restriktazių surišimo vietose, inhibuoja fermento veikimą ir šeimininko DNR nesuskaidoma savų restrikcijos nukleazių. Metilinimas yra katalizuojamas specifinių metilazių, kurios atpažįsta ir jungiasi prie tų pačių nukleotidų sekų kaip ir restriktaz÷s.

Paprastai šeimininko visa DNR yra specifiškai metilinta ir apsaugota nuo skaidymo. Kiekviena DNR, patekusi į ląstel÷, kuri yra nemetilinta, arba metilinta kitose vietose yra suskaidoma restriktazių.

Kai kurios restriktaz÷s taip pat metilina šeimininko DNR ir taip ją apsaugo nuo degradacijos.

Yra žinomos trys restrikcijos endonukleazių klas÷s. I ir III klas÷s restriktaz÷s turi restrikcinį ir metilazinį aktyvumą. II klas÷s restriktaz÷s neturi metilazinio aktyvumo. I klas÷s metilaz÷s skelia DNR atsitiktin÷se vietose, kurios yra nutolusios nuo atpažinimo srities per 1000bp, III klas÷s restriktaz÷s tai daro 24-26bp nuo atpažinimo srities. II tipo fermentai skelia DNR atpažinimo srities rajone.

Charakterizuota per 2500 restriktazių su 200 skirtingų atpažinimo sekų. I klas÷s restrikcijos modifikacijos fermentai yra kompleksiniai, daugiafunkciniai

fermentai, kurių veikimui reikalingas ATP, S-adenozilmetioninas kaip metilo grup÷s donoras ir kofaktorius Mg2+

18.6 lentel÷. Tam tikrų restrikcijos endonukleazių specifiškumas Šaltinis Fermentas Specifiškumas Arthrobacter luteus AluI AG↓C*T Bacillus amyloliquefaciens H BamH1 G↓GATC*C Escherichia coli RY13 EcoRI G↓AA*TTC Escherichia coli R245 EcoRII ↓CC*TGG Haemophilus influenzaeRd HindIII A* ↓AGCTT Haemophilus parainfluenzaeRd

HpaIII C↓C*GG

Providencia stuartii 164 PstI CTGCA*↓G Serratia marcescens Sb SmaI CCC↓GGG Thermus aquaticus TagI T↓CGA*

Pažym÷ta: ↓ skilimo vieta; * baz÷s metilinimo vieta

19 RNR BIOSINTEZö Šiame ir sekančiame skyriuje mes nagrin÷sime kaip informacija užkoduota DNR

molekul÷je yra perduodama aminorūgščių sekai baltymo molekul÷je. Genetin÷s informacijos realizacijoje dalyvauja RNR. RNR biosintez÷s metu nuo DNR

matricos nuskaitoma geno nukleotidų seka ir yra sintetinama RNR, kurios bazių seka yra komplementari DNR. Šis procesas vadinamas transkripcija.

RNR yra vienintel÷ molekul÷, kuri kaupia genetinę informaciją, ją perduoda ir dalyvauja kataliz÷je. Visos RNR išskyrus virusų genominę RNR, gauna informaciją nuo DNR.

467

Sintetinamos trys pagrindin÷s RNR rūšys – informacin÷ RNR (iRNR), transportin÷ pernašos RNR (tRNR) ir ribosomin÷ RNR (rRNR).

Replikacijos metu yra kopijuojama visa DNR. Transkripcijos procese transkribuojami tiktai tam tikri genai ar jų grup÷s. Genų ekspresija yra griežtai reguliuojama. Specialios DNR sekos žymi transkripcijos pradžią ir pabaigą, reguliacijoje dalyvauja sud÷tinga baltymų sistema.

Transkripcijos ir replikacijos procesai yra panašūs: 1) abiem procesams reikalinga matrica, 2) sintez÷ vyksta ta pačia 5/→3/ kryptimi, 3) išskiriami trys etapai – iniciacijos, elongacijos ir terminacijos. Tačiau transkripcija skiriasi nuo replikacijos šiais požymiais: 1) nereikalingas pradmuo, 2) transkribuojama ne visa DNR, o tiktai atskiri fragmentai, genai, 3) informacija nuskaitoma tiktai nuo vienos DNR grandin÷s, 4) sintezei panaudojami ribonukleozidų trifosfatai, o ne deoksiribonukleozidų trifosfatai, 5) transkripcijos greitis mažesnis negu replikacijos.

19.1 RNR polimeraz ÷ RNR biosintezę katalizuoja nuo DNR priklausoma RNR polimeraz÷ (dažniausiai ji

vadinama RNR polimeraz÷). Polinukleotido sintezei reikalinga RNR polimeraz÷, visi keturi ribonukleozido 5/-

trifosfatai (ATP, GTP, CTP ir UTP), DNR matrica bei Mg2+ jonai. Fermentas sintetina RNR molekulę, prijungdamas ribonukleotidus prie grandin÷s 3/-hidroksi galo ir RNR molekul÷ ilg÷ja 5/→3/ kryptimi . Bendrą reakciją galima užrašyti:

(NMP)n+1 + PPnPailg÷jusi RNR

(NMP)n + NTP RNR

RNR polimeraz÷

Riboz÷s 3/-hidroksigrup÷ yra nukleofilas ir atakuoja ateinančio nukleozido α-fosfatą. Termodinamiškai ši reakcija vyksta polimerizacijos kryptimi, nes ląstel÷je pirofosfatas

hidrolizuojamas, veikiant pirofosfatazei, ir viso proceso ∆G0/ yra neigiamas ( ~-30kJ/mol).

468

OCH2

H

O

H

OH

HH

Ura

H

OO

H

O

H

H

HH

CH2Ade

O

HH

H

HH

CH2

O

O

P

O

OO

CytOCH2

H

OH

H

OH

HH

Gua

OPOPOPO

O O O

O OO

:

OCH2

H

O

H

OH

HH

UraO O

H

O

H

H

HH

CH2Ade

O

HH

H

HH

CH2

O

O

P

O

OO

CytOCH2

H

OH

H

OH

HH

Gua

O

PO O

-

PPn

5/ RNR

5/-DNR

DNR matrica

-

---

Ribonukleozido trifosfatas

AugantiRNR grandin÷

Pirofosfataz÷2Pn

H2O

-

5/ RNR

5/-DNR

3/-DNR

-

DNR matrica

Nauja RNR grandin÷

RNR grandin÷silg÷jimo kryptis

3/-DNR

469

19.1 pav. RNR polimeraz÷s katalizuojama reakcija. Su RNR polimeraze susijungia nukleozido trifosfatas, kurio baz÷ yra komplementari DNR matricos bazei. Riboz÷s 3/ hidroksigrup÷ yra nukleofilas ir atakuoja ateinančio nukleozido trifosfato α fosforo atomą. Susidaro 3/,5/ - fosfodiesterinis ryšys ir RNR grandin÷ pailg÷ja vienu mononukleotidu

RNR polimeraz÷s veikimui būtina DNR, reakcija greičiausiai vyksta, kai naudojama

dvigrand÷ DNR. Sintez÷s metu DNR molekul÷s dvi grandin÷s yra išsukamos, ir ant vienos iš jų sintetinama RNR. Matricin÷ DNR grandin÷ yra kopijuojama 3/→5/ kryptimi, tuo tarpu RNR sintetinama 5/→3/ kryptimi. Baz÷s įjungiamos pagal komplementarumo principą, prieš adeniną yra uracilas (DNR molekul÷je prieš adeniną yra timinas), o prieš guaniną – citozinas.

Bakterijose visų rūšių RNR sintezę katalizuoja RNR polimeraz÷. Fermentas, išskirtas iš E.coli yra baltyminis kompleksas sudarytas iš 5 skirtingų subvienetų tipų. (19.1 lentel÷). 19.1 lentel÷. E.coli RNR polimeraz÷s holofermento subvienetai Subvienetas Mm

β/ 155600 β 150600 σ 70300 α 36500 ω 11000

Penki subvienetai α2ββ/ω susijungia ir sudaro RNR polimeraz÷s šerdį, baltyminį kompleksą dalyvaujanti daugelyje transkripcijos reakcijų. Prie šerdies baltymo per ω subvienetą yra prijungiamas σσσσ subvienetas, (jis taip pat vadinamas sigma faktoriumi), kuris vaidina labai svarbų vaidmenį transkripcijos iniciacijoje, jis atpažįsta DNR promotoriaus dalį. Bakterijose yra skirtingi σ subvienetai. E.coli holofermentas turi σ70 (Mm 70300). Sigma faktorius susijungęs su polimeraz÷s šęrdimi sudaro holofermentą.

β ir β/ subvienetai sudaro fermento aktyvų centrą. RNR polimeraz÷je iš Thermus aquaticus β ir β/ subvienetai suformuoja didelį griovį, kuriame prisijungia DNR ir vyksta polimerizacija. Griovyje susiriša 16 B-DNR dvigubos spiral÷s bazių porų. α subvienetas yra karkasas ant kurio susirenka kiti subvienetai. Mažojo ω subvieneto vaidmuo pilnai neištirtas.

19.2 RNR biosintez ÷s etapai

19.2.1Transkripcijos iniciacija DNR sritis, prie kurios jungiasi RNR polimeraz÷ ir kuri yra transkripcijos iniciacijos

taškas vadinama promotoriumi . Bakterijose keli genai yra transkribuojami kartu, veikiant vienam promotoriui, šis transkripcijos vienetas vadinamas operonu. Eukariotų ląstel÷se kiekvienas genas turi savo individualų promotorių.

Viengrand÷s DNR molekul÷s nukleotidų seka užrašoma iš kair÷s į dešinę 5/→3/ kryptimi. Kai rodoma dvigrand÷s DNR nukleotidų seka, viršutin÷je grandin÷je kryptis yra 5/→3/ o apatin÷je, antilygiagret÷je grandin÷je 3/→5/. Užrašant nukleotidų seką gene, ji prasideda transkripcijos pradžios taške (žymima +1) ir baigiasi transkripcijos terminacijos taške. Nukleotidas, esantis į kairę nuo transkripcijos pradžios žymimas -1. Geno pradžia vadinama 5/ galu. Keliavimas genu 5/→3/ kryptimi vadinamas pasroviui (downstream), priešinga kryptimi 3/→5/ prieš srovę (upstream).

470

Geno transkripcijos pradžia parodoma kairiajame dvigubos DNR grandin÷s diagramos gale, o terminacija - dešiniajame. Dvi komplementarios DNR grandin÷s vaidina skirtingus vaidmenis transkripcijoje (19.2 pav.). Viršutin÷ grandin÷ vadinama koduojanti grandin ÷, ji koduoja aminorūgščių seką polipeptidin÷je grandin÷je. Apatin÷ grandin÷ vadinama matricin ÷ grandine, ji yra matrica RNR biosintezei. RNR sintez÷ vyksta 5/→3/ kryptimi, o matricin÷s DNR grandin÷s orientacija yra 3/→5/. Susidariusi RNR yra identiška koduojančios grandin÷s DNR sekai, tiktai timinas yra pakeista uracilu.

OH

iRNR

A T G G A T A T T

G A A T G G C C T A A T C C G G T

T T C G A T A C T G

T A C C T A T A A A A G C T A TG A A C

C T T A C C G G A T T A G G C C

G A A T G G C C U A A U C C G G

pppA U A U U U

3/

3/5/

5/

Transkripcijos kryptis

3/

5/

Transkripcijos pradžiostaškas +1

Genas5/ galas

3/ galas

Koduojanti grandin÷

Matricin÷ grandin÷

DNR

19.2 pav. iRNR sintez÷ nuo DNR Eukariotuose ir prokariotuose RNR biosintez÷ prasideda RNR polimerazei ir DNR

surišantiems baltymams prisijungus prie promotoriaus. Bakterijose promotoriaus atpažinimui ir RNR polimeraz÷s surišimui su DNR svarbus σ subvienetas.

Šiuo metu nustatytos įvairių promotorių struktūros. Remiantis sekvenavimo rezultatais buvo pasiūlyta promotoriaus consensus sequence, hipotetin÷ seka, sudaryta iš nukleotidų dažniausiai sutinkamų įvairiuose promotoriuose.

TTGACA

+1Consensussequence

RNR pradžia Jungtukas-35 sritisUP elementas -10 sritis Jungtukas

RNR pradžia N17 TATAAT N6

19.3 pav. Hipotetin÷ promotoriaus nukleotidų seka Promotoriuje yra nustatytos dvi skirtingos sritys, reikalingos atpažinimui. Pirma sritis ( -

10 sritis) yra 10bp prieš srovę nuo transkripcijos starto (+1) ir joje gausu A/T bazių porų. Nukleotidų seka joje yra TATAAT. Antra promotoriaus seka yra apie 35bp nutolusi nuo

Comment [JK10]: kas tai UP elementas

471

transkripcijos starto vietos. Šios srities nukleotidų seka yra TTGACA.. Atstumas tarp abiejų sričių yra apie 17bp ir jas jungia jungtukas. Sritis -10 vadinama TATAAT d ÷žut÷ (Pribnovo d÷žut÷ prokariotuose), o sritis -35 paprastai vadinama -35 sritis. Holofermentas, turintis σ subvienetą specifiškai jungiasi prie šių sekų. Consensus sequences nurodo nukleotidus, kurie dažniausiai sutinkami šiose promotorių srityse.

Tipiškų E.coli promotorių sekos parodytos pav. TGAGCTGTTGACA ATTAAT CATCGAACTAGTTAACT AG TACGCAAGTTCACGTAA trp CCCAGGCTTTACA CTTTAT GCTTCCGGCTCGTATGTT GT GTGGAATGTGAGCGG lac GGCGGTGTTGACA TAAATA CCACTGGCGGTGATACT GA GCACATCAGCAGGACG λPL

GTGCGTGTTGACT ATTTTACCTCCCCCCTGGCGGTGATAAT G GTTGCATGTACTAAGGAλPR

TTTCCTCTTGTCA GGCCGG AATAACTCCCTATAAT GCGCCACCACTGACACGGAArrnA1 -35 sritis -10 sritis Geno pradžia 19.4 pav. E.coli bakteriofagų ir bakterinių genų promotoriai. RNR polimeraz÷s šerdis, neturi σ subvieneto, ji nespecifiškai ir nestipriai prisijungia prie

bet kurios DNR molekul÷s dalies. Holofermentas, turintis σ faktorių, žymiai stipriau susiriša su promotoriaus sritimi ir susidariusio komplekso stabilumas yra tvirtesnis nei polimeraz÷s šerdies. Holofermentas nespecifiškai susiriša ir su kitomis DNR sritimis, tačiau kompleksas nestabilus ir greitai disocijuoja. Tai rodo, kad σσσσ faktorius padidina RNR polimeraz÷s giminingumą promotoriui . Be to σ faktorius sumažina šerdies fermento giminingumą DNR nepromotorin÷ms sritims.

Kaip veikia σ faktorius? Holofermentas gali susijungti su įvairiomis DNR polinukleotidin÷s grandin÷s vietomis ir lengvai disocijuoti. RNR polimeraz÷ slenka išilgai DNR molekul÷s prisijungdama ir disocijuodama nuo polinukleotido. Per trumpą laikotarpį fermentas nespecifiškai prisijungęs prie DNR gali praskanuoti (pereiti per) 2000 bp, kol randa promotorių. Pasiekęs promotorių, holofermentas tvirtai susijungia su DNR ir transkripcija prasideda.

Transkripcijos iniciacijos etapas yra l÷tas. Dažnai tai yra RNR biosintezę limituojanti stadija. Transkripcijos kompleksui prisijungus prie promotoriaus, vyksta DNR išsukimas ir sintetinamas nedidelis RNR fragmentas. DNR replikacijos metu šiuos du etapus katalizuoja du

472

fermentai - helikaz÷ ir praimaz÷. RNR biosintez÷je tai atlieka viena RNR polimeraz÷.

19.5 pav. Transkripcijos iniciacija ir elongaciją, katalizuojant RNR polimerazei.

Prisijungus RNR polimerazei susidaro uždaras kompleksas, kuris pereina į atvirą. Pradžioje susidaro RNR-DNR hibridas, v÷liau RNR išeina iš fermento.

Prisijungus RNR polimerazei prie nukleorūgšties susidaro uždaras kompleksas, kuriame

DNR dar dvigubos spiral÷s formoje. V÷liau kompleksas pereina į atvir ą kompleksą, kuriame DNR molekul÷s 17bp išsisuka ir susiformuoja transkripcijos burbulas.

Comment [JK11]: patikrinti

473

Atvirame komplekse, matricin÷ DNR grandin÷ yra prisijungusi prie polimeraz÷s aktyvaus centro. Į aktyvų centrą pro specialų kanalą difunduoja du ribonukleozido trifosfatai ir komplementariai vandeniliniais ryšiais prisijungia prie +1 ir +2 matricin÷s grandin÷s bazių. Pirmas aktyviame centre dažniausiai prisijungia purino nukleotidas. Tarp nukleotidų susidaro fosfodiesterinis ryšys ir dinukleotidas yra pradmuo, prie kurio jungiasi nauji ribonukleozido trifosfatai. Jei at÷jęs į fermento aktyvų centrą nukleozido trifosfatas yra komplementarus sekančiam (+3) nesuporuotos DNR molekul÷s nukleotidui jis su baze sudaro vandenilinius ryšius ir fermentas katalizuoja naujo fosfodiesterinio ryšio susidarymą. Sintetinantis RNR pradžioje oligoribonukleotidas vandenliniais ryšiais lieka susirišęs su DNR ir susidaro apie 9-12bp ilgio RNR-DNR hibridas. Susidarius hibridui RNR, kinta RNR polimeraz÷s holofermento konformacija ir σσσσ faktorius, kuris buvo stipriai susirišęs su promotoriumi, disocijuoja. RNR biosintez÷s procesas pereina į elongacijos stadiją.

19.2.2Grandin ÷s elongacija Grandin÷s elongaciją katalizuoja RNR polimeraz÷s šerdies kompleksas. RNR polimeraz÷

be σ subvieneto disocijuoja nuo promotoriaus ir juda išilgai DNR molekul÷s. Šioje stadijoje dalyvauja dar keli baltymai. Vienas iš jų NusA baltymas palengvina RNR polimeraz÷s konformacinius pasikeitimus.

Elongacijos faz÷je augantis naujos RNR grandin÷s fragmentas lieka susijungęs su DNR ir susidaro trumpas 9-12bp RNR-DNR hibridas. RNR polimeraz÷ uždengia per DNR molekul÷s 35 bp ir palaiko apie 17bp išsuktą sritį. Keliaujant RNR polimerazei dviguba DNR spirale, DNR molekul÷ turi suktis apie savo ašį. Pradžioje DNR molekul÷ yra išsukama, o v÷liau po RNR sintez÷s v÷l susukama. RNR polimeraz÷ jud÷dama DNR molekule, sukelia prieš save neigiamą superspiralizaciją negatyve supercoil, o po savęs teigiamą superspiralizaciją tegiama supercoil. Ląstel÷je šios topologin÷s problemos išprendžiamos veikiant topoizomeraz÷ms. Sukimasis taip pat yra stabdomas DNR surišančių baltymų.

19.6 pav. RNR polimeraz÷s katalizuojama reakcija. RNR polimeraz÷ prisijungia prie

DNR dvigubos spiral÷s, ją išsuka ir ant vienos polinukleotidin÷s grandin÷s yra sintetinama RNR molekul÷.

RNR polimeraz÷s katalizuojama grandin÷s elongacijos reakcija yra panaši į DNR polimeraz÷s vykdoma replikacijos reakciją. Auganti RNR grandin÷ sudaro vandenilinius ryšius su

474

išsuktos DNR matricos dalimi (DNR-RNR hibridas). Toliau vykstant polimerizacijai, RNR disocijuoja nuo DNR matricos ir išeina iš RNR polimeraz÷s aktyvaus centro. DNR molekul÷, v÷l susisuka į dvigubą spiralę.

E.coli bakterijose polimerizacijos greitis yra 30-85 sujungti nukleotidai per sekundę, tai yra 1/10 DNR replikacijos greičio.

19.2.3Transkripcijos terminacija Transkripcijos kompleksas RNR sintez÷s pradžioje susijungia su promotoriumi ir

pabaigoje disocijuoja ties geno 3/ gale esančiomis specifin÷mis nukleotidų sekomis vadinamomis terminacijos sekos. Yra dvi transkripcijos terminacijos formos. Viena iš jų priklauso nuo papildomo baltymo ρρρρ (rho) faktoriaus, kita nepriklauso ir pati RNR polimeraz÷ atpažįsta matricin÷je DNR terminacijos sritis.

Rho faktorius pagreitina transkripcijos komplekso disociaciją. Rho baltymas yra heksameras, turintis ATPazinį aktyvumą ir giminingas viengrandei RNR. Jis susiriša su turtingos citozinu naujai sintetintos RNR grandin÷s 3/ galu ir migruoja užpakalyje RNR polimeraz÷s 5/→3/ kryptimi, kol pasiekiama terminacijos sritis. Rho faktorius turi nuo ATP priklausomą RNR-DNR helikazinį aktyvumą ir panaudoja ATP hidroliz÷s energiją išsukti transkripto 3/ galą nuo matricos. Tai palengvina baltymo jud÷jimą RNR/DNR dviguba spirale. Terminacijos taške ρ faktorius pakeičia matricinę viengrandę DNR ir RNR molekul÷ disocijuoja nuo DNR.

Rho nepriklausomai terminacijai nereikalingi papildomi baltymai, tačiau RNR molekul÷ turi du struktūrinius ypatumus. Pirma, RNR transkriptas sudaro stabilią plaukų segtuko struktūrą (stable hairpin turn), kuri sul÷tina RNR polimeraz÷s veikimą. Ši plaukų segtuko struktūra yra komplementari DNR matricai netoli terminacijos srities ir d÷ka palindromin÷s sekos turi two-fold simetriją. Netoli plaukų segtuko pagrindo nukleotidų seka yra turtinga C ir G, kurios stabilizuoja šią struktūrą. Šalia plaukų segtuko pagrindo, RNR transkripte yra 7-9 uracilo bazių seka, kurios su DNR matrica sąveikauja silpnai, nes sudaro tiktai po du vandenilinius ryšius ir lengvai atsiskiria nuo DNR matricos.

475

5/ XXXXXX AGCCCCGCXXXXXXXX GCGGGGCTXXTTTTTTXXX 3 /

3 /YYYYYY TCGGGGCGYYYYYYYY CGCCCCGAYYAAAAAYYY 5 /

Palindromin÷s sekos Palindromin÷s sekos

Transkripcijos kryptis

UG CC GC GC GC GG CC G

UUUUU 3/

A

5/ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTTTTTTXXX 3 /

3 /YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY YYY 5 /

AAAAA

Naujai sintetinta RNR sudarosegtuko formos struktūrą

A

B

DNR matricin÷ grandin÷

19.7 pav. Nepriklausoma nuo Rho faktoriaus transkripcijos terminacija. A. DNR

palindromin÷s dvigubos DNR spiral÷s fragmentas. B. Transkribuotas DNR palindomas koduoja segtuko formas RNR struktūrą, kuri stabdo transkripciją

RNR sintez÷s tikslumas yra mažesnis nei DNR sintez÷s. Vidutiniškai vienas iš 1 milijono nukleotidų įjungiamas klaidingai. RNR polimeraz÷ neturi egzonukleazinio klaidų taisymo aktyvumo, kurį turi DNR polimeraz÷. Sintetinamos RNR dažniausiai yra mažesn÷s nei 10kb, taigi šios klaidos neturi didel÷s įtakos sintetintų baltymų struktūrai.

19.3 Transkripcija eukariotuose Prokariotuose RNR sintezę katalizuoja viena RNR polimeraz÷. Eukariotuose šis procesas

vykdomas kelių fermentų, be to transkripcijai reikalinga daug papildomų baltymų.

19.3.1Eukariot ų RNR polimeraz ÷s Eukariotų ląstel÷se trys skirtingos polimeraz÷s transkribuoja branduolio DNR genus

ir dar dvi polimeraz÷s rastos mitochondrijose ir chloroplastuose. Kiekvienas branduolio fermentas katalizuoja skirtingų genų sintezę. RNR polimeraz÷ I atsakinga už didelių ribosominių RNR molekulių (I genų klas÷) sintezę. RNR polimeraz÷ II transkribuoja genus, kurie koduoja baltymus ir kelias nedideles RNR molekules (II genų klas÷). RNR polimeraz÷ III transkribuoja tRNR ir 5S rRNR ir kitų mažų RNR genus (III genų klas÷) ( 19.2 lentel÷).

Mitochondrijų ir chloroplastų RNR polimeraz÷ yra monomerinis baltymas, koduojamas branduolio genų.

Branduolio RNR polimeraz÷s sudarytos iš kelių subvienetų. Subvienetų skaičius varijuoja įvairiuose organizmuose, dažniausiai jos turi 2 didelius subvienetas ir 7-12 smulkių. Dviejų didžiųjų eukariotų subvienetų aminorūgščių seka panaši į prokariotų β ir β/ subvienetus, tai rodo jų bendrą pirmtaką.

476

19.2 lentel÷ Eukariotų RNR polimeraz÷s

Polimeraz÷ Lokalizacija Produktas RNR polimeraz÷ I Branduol÷lis 35-45S pre-rRNR RNR polimeraz÷ II Nukleoplazma iRNR pirmtakai U1, U2,U4 ir U5

mbRNR RNR polimeraz÷ III Nukleoplazma 5S rRNR,

tRNR U6 mbRNR 7S RNR kitos mažos RNR molekul÷s

Mitochondrijų RNR polimeraz÷

Mitochondrijos Visi mitochondrinių genų produktai

Chloroplastų RNR polimeraz÷

Chloroplastai Visi chloroplastų genų produktai

RNR transkripcijos principai ir prokariotuose ir eukariotuose yra panašūs, tačiau eukariotuose procesas yra sud÷tingesnis. Eukariotų RNR polimeraz÷s prisijungimui prie promotoriaus reikalingi papildomi transkripcijos faktoriai (TF). Šiose ląstel÷se randami transkripcijos faktoriai TFII, TFIIB, TFIIE, TFIIH ir kiti. Branduolyje susidaro didelis baltyminis kompleksas sudarytas iš RNR polimeraz÷s ir transkripcijos faktorių. Šis kompleksas jungiasi su promotoriumi. Transkripcijos faktoriai atpažįsta specifines DNR sekas, susijungia su promotoriumi, gali būti RNR polimeraz÷s iniciacijos faktoriais bei dalyvauja DNR molekul÷s išsukime, elongacijoje.

RNR polimeraz÷ II transkribuoja visus baltymus koduojančius genus. Ši sintetinta RNR frakcija yra vadinama heterogenin÷ branduolio RNR (hbRNR) arba iRNR pirmtakai (preRNN). preRNR brendimas aprašytas 19.5 skyriuje. Eukariotin÷se ląstel÷se yra per 40000 RNR polimeraz÷s II molekulių.

19.3.2RNR polimeraz ÷s inhibicija RNR biosintezę inhibuoja antibiotikas aktinomicinas D. Antibiotiko molekul÷s dalis,

turinti tris aromatinius žiedus sudaro plokščią struktūrą, kuri įsiterpia (interkaliuoja) tarp dviejų gretimų G-C bazių porų ir deformuoja DNR. Du cikliniai aktinomicino D oligopeptidai susiriša su dvigubos spiral÷s mažuoju grioviu. RNR polimeraz÷ nebegali jud÷ti išilgai matricos ir RNR sintez÷ blokuojama. Analogiškai RNR biosintezę blokuoja ir akridinas.

A B

477

Rifampicinas 19.8 pav. RNR polimeraz÷s inhibitoriai. Aktinomicinas D (A) (Sar sarkolizinas (N-

metilglicinas), meVal – metilvalinas), akridinas (B), rifampicinas, α-amanitinas.. Rifampicinas blokuoja RNR biosintezę bakterijose. Jis prisijungia prie bakterijų RNR

polimeraz÷s β subvieneto. Kadangi eukariotų polimeraz÷ neturi šio subvieneto, rifampicinas naudojamas kaip antibiotikas.

Musmir÷s Amanita phalloides sintetina αααα-amanitiną, kuris jungiasi prie RNR polimeraz÷s II ir III ir stabdo kepenyse iRNR susidarymą. α-amanitinas yra ciklinis neribosominis peptidas sudarytas iš aštuonių aminorūgščių. Nei bakterin÷ RNR polimeraz÷, nei eukariotų polimeraz÷ I nei pačių grybų RNR polimeraz÷ yra jautri α-amanitinui.

19.4 Transkripcijos reguliacija Ląstel÷je vienu metu yra ekspresuojama daug genų, sintetinami įvairūs baltymai. Kai

kurie genai ekspresuojami pastoviai ir yra vadinami konstitutyviniais. Šių genų produktai ląstel÷s funkcionavimui reikalingi visą laiką. Tai yra trikarboksirūgščių ciklo, glikoliz÷s ir kitų ląstelei būtinų medžiagos apykaitos procesų fermentai. Tokie genai turi stiprius promotoriaus ir transkripcija vyksta efektyviai ir nenutrūkstamai. Genai, kurių produktai reikalingi nedideliais kiekiais ir tam tikru momentu, turi silpnus promotoriaus ir jie transkribuojami retai. Ląstel÷je taip pat yra genų, kurie ekspresuojami dideliu greičiu , tam tikru, ląstelei reikalingu momentu. Tokie genai vadinami reguliuojamais.

Genų ekspresija gali būti reguliuojama įvairiose biologin÷s informacijos perdavimo stadijose, tačiau dažniausiai reguliacija pasireiškia transkripcijos lygmenyje.

Reguliuojamų genų transkripcijos iniciaciją kontroliuoja reguliatoriniai baltymai, kurie susiriša su specifin÷mis DNR sekomis. Transkripcijos reguliacija gali būti teigiama ar neigiama. Reguliatoriniai baltymai, kurie stabdo transkripciją vadinami represoriais, tuo tarpu aktyvatoriai yra baltymai, kurie greitiną RNR biosintezę.

α-amanitinas

478

Promotorius Operatorius

Neigiama reguliacija(prisijungęs represorius slopina transkripciją)

Promotorius Operatorius

Teigiama reguliacija(prisijungęs aktyvatoriusskatina transkripciją

a) c)

b) d)

19.9 pav. Transkripcijos iniciacijos reguliacijos schema. a) Represorius (raudonas)

jungiasi prie operatoriaus ir slopina transkripciją (neigiama reguliacija). Signalin÷ molekul÷ (juodas kvadratas) prisijungia prie represoriaus ir represoriaus-signalo kompleksas disocijuoja nuo operatoriaus. b) Represorius yra prisijungęs prie operatoriaus tiktai susijungęs su signaline molekule. c) Aktyvatorius (geltonas) jungiasi su operatoriumi tiktai nesant signalinei molekulei ir aktyvuojama transkripcija. Prisijungus signalinei molekulei (juodas trikampis) aktyvatorius disocijuoja ir transkripcija slopinama. d) aktyvatorius jungiasi prie operatoriaus tiktai esant signalui.

Represoriais ir aktyvatoriai dažnai būna alosteriniai baltymai, modifikuojami ligandais. Ligandai keičia alosterinio baltymo konformaciją ir surišimo su DNR efektyvumą.

Pavyzdžiui, kai kurie represoriai kontroliuoja fermentų, dalyvaujančių medžiagų katabolizme sintezę. Nesant fermento, kuris katalizuoja substrato virsmus, geno ekspresija yra blokuojama. Patekus į ląstelę substratui, jis jungiasi su represoriumi, represoriaus ir substrato kompleksas disocijuoja nuo DNR ir genas yra transkribuojamas. Ligandai, kurie jungiasi su represoriumi ir jį inaktyvuoja yra vadinami induktoriais, nes jie indukuoja transkripciją. Kitu atveju, represoriai, kontroliuojantys fermentų, dalyvaujančių anabolizmo procese, sintezę, jungiasi su DNR tiktai sudarę kompleksą su ligandu. Ligandas dažniausiai yra biosintetinio proceso galutinis produktas. Šio reguliacinio proceso metu, susikaupus pakankamam produkto kiekiui geno veikla išjungiama. Ligandai, kurie jungiasi su represoriais ir juos aktyvuoja, vadinami korepresoriais. Aktyvatoriai jungiasi prie operatoriaus ir aktyvuoja transkripciją.

19.4.1Lac operono reguliacija Klasikinis ir geriausiai išnagrin÷tas pavyzdys yra lac operono, kuris atsakingas už laktoz÷s

katabolizmą, reguliacija. E.coli kaip anglies ir energijos šaltinį augimui gali panaudoti įvairius angliavandenius. Pagrindinis substratas yra gliukoz÷, tačiau jos gali augti ir ant laktoz÷s,

479

disacharido, kuriame galaktoz÷s ir gliukoz÷ sujungta β-glikozidiniu ryšiu. Laktozę skaido fermentas ββββ-galaktozidaz÷, žinduoliuose ji vadinama laktaze. Nesant terp÷je laktoz÷s, fermentai, reikalingi jos pernešimui į ląstelę ir metabolizmui n÷ra sintetinami. Tačiau, kai bakterijos patenka į terpę su laktoze, fermentų sintez÷ indukuojama.

Operoną sudaro struktūriniai genai ir nukleotidų sekos, kurios valdo struktūrinius genus. Laktoz÷s operonas koduoja tris baltymus, kurie dalyvauja laktoz÷s pernešime per plazminę membraną ir jos katabolizme. Geno lacY produktas yra laktoz÷s permeaz÷, pernešanti β-galaktozidus per plazminę membraną į ląstelę. lacZ atsakingas už fermento ββββ-galaktozidaz÷s sintezę. Šis fermentas sudarytas iš keturių identiškų subvienetų, katalizuoja β-galaktozidinio ryšio skaidymą ir laktoz÷s hidrolizę iki gliukoz÷s ir galaktoz÷s. β-Galaktozidai, kurie n÷ra hidrolizuojami yra acetilinami fermento tiogalaktozido transacetilaz÷s, kuri yra geno lacA produktas. Acetilinimo funkcija n÷ra pilnai išaiškinta.

Operono reguliatorin÷ dalis sudaryta iš katabolitų aktyvinančio baltymo CAP (catabolite gene activator protein) ( jis dar vadinamas cAMP reguliuojamas baltymas - CRP) surišimo vietos, promotoriaus (P) prie kurio jungiasi RNR polimeraz÷ ir operatoriaus (O). Genai lacY, lacZ ir lacA yra ekspresuojami tiktai tada, kai O sritis yra laisva, o prie CAP srities yra prijungtas cAMP ir CAP baltymas.

Trys genai lacY, lacZ ir lacA transkribuojami naudojant vieną promotorių, kaip viena didel÷ pre-iRNR.

lacI lacZ lacY lacA

PlacT

O1 O2Pi

CAPsurišanti sritis

19.10 pav. Genai, koduojantys laktoz÷s metabolizmą. lac operone yra 3 genai – lacZ, lacY

ir lacA. Jie transkribuojami nuo vieno promotoriaus Plac . Represoriaus sintezę koduoja genas lacI, kuris jungiasi prie operatorių O1 ir O2. Pi – lacI promotoriaus. T – terminacijos seka.

Lac operono veikimas priklauso nuo to, kokie angliavandeniai yra augimo terp÷je. 1. Terp÷je kaip energijos ir anglies šaltinis yra tiktai gliukoz÷. Šiuo atveju lac operono

genų ekspresiją slopina reguliacinis baltymas vadinamas lac represorius. Šis baltymas yra koduojamas lacI geno ir sudarytas iš keturių vienodų subvienetų. Genas išsid÷stęs prieš struktūrinius genus ir turi atskirą promotorių.

Lac represorius jungiasi prie dviejų lac operono vietų, esančių netoli promotoriaus. Sritis, prie kurios jungiasi represorius yra vadinama operatorius. Vienas operatorius yra greta promotoriaus, kitas viduje lacZ srities (19.10 pav.). Lac represorius sudarytas iš dviejų porų vienodų dimerų. Kiekviena pora susijungia su atskiru operatoriumi (O1 ir O2). Kadangi šie operatoriai yra vienoje DNR grandin÷je, tod÷l prisijungus represoriui prie dviejų DNR sričių 5/ lac operono gale susidaro 535bp stabili kilpa. (19.11 pav.).

Susidarius DNR-represoriaus kompleksui RNR polimeraz÷ negali prisijungti prie promotoriaus arba prisijungus fermentui blokuojama transkripcijos iniciacija, nes nesusidaro atviras kompleksas.

480

. 19.11 pav. Lac represoriaus susirišimas su DNR. Vienas represoriaus galas susijungia su

operatoriumi O1 , kitas su operatoriumi O2.(horton) 2. Terp÷je kaip energijos ir anglies šaltinis yra tiktai laktoz÷. Esant terp÷je

vieninteliam anglies šaltiniui laktozei indukuojamas lac operonas ir sintetinami fermentai, metabolizuojantys laktozę. lac operono induktorius yra ne pati laktoz÷, o jos izomeras alolaktoz÷. Nedidelis laktoz÷s kiekis patekęs į ląstelę per membranoje esančias permeazes, β−galaktozidaz÷s yra paverčiama į alolaktozę. Induktoriaus poveikyje β-galaktozidaz÷s koncentracija ląstel÷je padid÷ja per 1000 kartų.

OCH2OH

HOH

H

OH

OH

HO

OCH2OH

HH

H

OH

OH

H

H

OHH

OCH2OH

HOH

H

OH

OH

H

OCH2

HH

H

OH

OH

H

H

OH OH

O

H

Laktoz÷β-D-galaktopiranozil-(1 4)-β-D-gliukopiranoz÷

Alolaktoz÷β-D-galaktopiranozil-(1 6)-β-D-gliukopiranoz÷

β-Galaktozidaz÷

19.12 pav. Alolaktoz÷s susidarymas iš laktoz÷s. Alolaktoz÷ stipriai prisijungia prie lac represoriaus, pakeičia jo konformaciją ir sumažina

jo giminingumą operatoriui. Induktoriaus-represoriaus kompleksas disocijuoja nuo DNR. Praktikoje lac operono induktoriumi plačiai naudojamas nemetabolizuojamas laktoz÷s

analogas izopropiltiogalaktozidas (IPTG).

481

Plac O1 O2Pi

Z Y AI

iRNRLac represorius

19.13 pav. Lac represoriaus sąveika su lac operonu. 3. Terp÷je kaip energijos ir anglies šaltinis yra ir gliukoz÷ ir laktoz÷. Lac operono transkripcija E.coli priklauso netiktai nuo laktoz÷s, bet ir nuo kitų

angliavandenių koncentracijos išorin÷je terp÷je. Esant tiktai laktozei, lac operono transkripcija vyksta maksimaliu greičiu. Tačiau prid÷jus gliukoz÷s, transkripcija sul÷t÷ja per 50 kartų ir laktoz÷ n÷ra skaidoma. lac operono transkripcijos sul÷t÷jimas, esant gliukozei yra vadinamas kataboline represija.

Katabolin÷ represija yra daugelio operonų, koduojančių įvairių angliavandenių metabolizmo fermentus, savyb÷. Šie operonai paprastai turi silpnus promotoriaus ir transkripcija, esant gliukozei vyksta l÷tai.

E.coli ląstel÷se cAMP koncentracija ląstel÷se priklauso nuo gliukoz÷s kiekio ląstel÷s išor÷je. Gliukoz÷ į ląstelę pernešama ir fosforilinama fosfotransferazin÷s sistemos (PTS). Kada gliukoz÷s koncentracija išor÷je sumaž÷ja, vienas iš PTS fermentų E-III katalizuoja fosforilo grup÷s pernešimą ne ant gliukoz÷s, o ant adenilato ciklaz÷s, ją fosforilina ir aktyvuoja. Aktyvi adenilato ciklaz÷ katalizuoja ATP virtimą cAMP. cAMP jungiasi su CAP. cAMP-CAP kompleksas specifiškai ir stipriai prisijungia prie DNR, sąveikauja su RNR polimeraze ir aktyvuoja transkripciją ir laktoz÷s katabolizmą.

Esant gliukozei, adenilato ciklaz÷ yra slopinama ir nesusidaro cAMP-CAP kompleksas. CAP surišimo sritis lieka laisva ir RNR polimeraz÷ negali prisijungti ir transkribuoti lac operono genų, nors represorius ir n÷ra susirišęs su operatoriumi. .

SANTRAUKA DNR priklausoma RNR polimeraz÷ katalizuoja komplementarios DNR matricai

RNR biosintezę panaudodama nukleozido 5/-trifosfatus. RNR polimeraz÷ prisijungia prie specifin÷s DNR srities vadinamos promotoriumi, toliau vyksta iniciacija, elongaciją ir sintez÷s terminacija.

Eukariotų ląstel÷se yra trys RNR polimerazių tipai. RNR polimeraz÷s II susijungimui su promotoriumi reikalingi baltymai transkripcijos faktoriai. Rnr biosintezei reikalingi baltyminiai transkripcijos faktoriai.

19.5 Potranskripcin ÷ RNR modifikacija (RNR brendimas Dauguma bakterijų RNR ir faktiškai visos eukariotų RNR molekul÷s po sintez÷s yra

modifikuojamos. Įdomu, kad kai kurie fermentai katalizuojantys šias reakcijas yra ne baltymai, o pačios RNR. Šių katalizinių RNR molekulių vadinamų ribozimais atradimas buvo labai svarbus aiškinant gyvyb÷s atsiradimą ir naujas RNR funkcijas.

Comment [JK12]: irašyti polimerazes

482

Daugumoje atveju naujai sintetinta RNR molekul÷ pirminis transkriptas (pre-RNR) žymiai skiriasi nuo funkcionuojančios RNR. Vyksta potranskripcin ÷ RNR modifikacija arba RNR brendimas, kurios metu funkciškai aktyvi RNR. RNR modifikacijos metu gali būti:

1) nuo pirminio RNR transkripto galų pašalinami atitinkami nukleotidai, 2) atitinkami nukleotidai pašalinami polinukleotidin÷s grandin÷s viduryje 3) prie RNR galų prijungiamos nekoduojamos genų nukleotidų sekos 4) baz÷s kovalentiškai modifikuojamos

19.5.1Ribosomini ų RNR brendimas. Ribosomin÷s RNR visuose organizmuose yra sintetinamos didelių pirminių transkriptų

pavidale, kurie yra metilinami ir skaidomi endonukleazių. Prokariotų rRNR molekulių pirminio transkripto dydis yra apie 30S, jo sud÷tyje yra po vieną 16S, 23S ir 5S rRNR molekulę bei tRNR.

19.14 pav. Prokariotų ribosomin÷s pre-RNR brendimas. Pre-rRNR transkripto sud÷tyje

yra po vieną kiekvienos rRNR kopijų ir tRNR pirmtakai. Pre-rRNR transkriptas metilinamas ir suskaidomas RNaz÷s III.

19.15 pav. E.coli pre-RNR karpymas. RNRaz÷ III atskelia nuo pre-RNR 16S rRNR ir 23S

rRNR ties susiporavusių nukleotidų galais. (life science)

483

Pirminiame 30S transkripte esančių 16S ir 23S rRNR 5/ ir 3/ galai susijungia, baz÷s

susiporuoja, sudarydamos dvigubos spiral÷s stiebelius (19.15 pav.). Prokariotuose prie šių sričių prisijungia endonukleaz÷ RNRaz÷ III ir atskelia 16S ir 23S rRNR pirmtakus. Kitose stadijose rRNR galai sutvarkomi specifinių endonukleazių.

Eukariotų rRNR taip pat sintetinamos didelių pirmtakų pavidalu pre-rRNR. Pirminio transkripto dydis yra tarp 35S ir 47S, jame yra trijų eukariotinių 18S, 5,8S ir 28S rRNR kopijos. Ketvirta eukariotų 5S rRNR yra transkribuojama RNR polimeraz÷s III kaip atskiras monomeras ir subrandinama atskirai. Pirminiai transkriptai sintetinami branduol÷lyje, kur ir vyksta brendimas. Kiekvienas rRNR pirmtakas prieš skaidymą turi susirišti bent su vienu ribosomos baltymu.

19.5.2 Transportini ų RNR brendimas tRNR taip pat sintetinamos pre-RNR formoje. Prokariotuose, į pirminio transkripto sud÷tį

dažnai įeina keletas tRNR. Pirminiai transkriptai ribonukleazių sukarpomi ir sutvarkomi iki funkcionuojančių tRNR.

Endonukleaz÷ RNRaz÷ P katalizuoja pradinį, daugelio tRNR transkriptų skaidymą. Fermentas skaido pre-tRNR transkripto kiekvienos tRNR 5/ gale ir susidaro monomeriniai tRNR pirmtakai su subrendusiu 5/ galu. RNRaz÷ P yra ribonukleoproteinas, E.coli ląstel÷se jis sudarytas iš turinčios 377 nukleotidus RNR molekul÷s (Mm 130000) ir nedidelio polipeptido (Mm 18000). Kataliziniu aktyvumu pasižymi RNR, baltyminis komponentas palaiko RNR tretinę struktūrą.

Kitos endonukleaz÷s kerpa RNR pirmtakus netoli 3/ galo. RNRaz÷ D katalizuoja nukleotidų hidrolizę nuo 3/ galo, kol pasiekiamas subrendusios tRNR 3/ galas.

Subrendusių prokariotų ir eukariotų tRNR molekulių 3/ gale yra seka CCA, prie kurios jungiasi aminorūgštis. Šių nukleotidų prijungimą katalizuoja tRNR nukleotidiltransferaz÷ ir yra vienas iš nedaugelio atvejų, kai nukleotidų prijungimas nekoduojamas genų.

19.16 pav. Transportinių RNR brendimas. tRNR brendimo metu vyksta ir kovalentin÷ bazių modifikacija. Iš apytikriai 80

subrendusios tRNR nukleotidų 26-30 yra modifikuoti. Dažniausiai nukleotidai yra metilinami ( N6-metiladeninas, 7-metilguaninas, 3-metilcitidinas, 5-metilcitidinas), gali būti prijungtos kitos grup÷s, redukuojamas žiedas (N6-izopenteniladeninas, inozinas, dihidrouridinas, pseudouridilas) (žr. skyrių 3.1.5). Comment [JK13]:

484

19.5.3Eukariot ų iRNR brendimas Informacin÷s RNR brendimas yra viena iš biocheminių savybių, skiriančių eukariotus nuo

prokariotų. Prokariotuose pirminis iRNR transkriptas transliuojamas tiesiogiai, dažnai transliacija prasideda dar nepasibaigus transkripcijai ir iRNR brendimas nevyksta. Eukariotuose transkripcija vyksta branduolyje, o transliacija – citozolyje. Subrendusios eukariotų iRNR susidaro iš žymiai didesnių iRNR pirmtakų, brendimo metu jos gali būti skaidomos, viename ar kitame polinukleotidin÷s grandin÷s gale prijungiami papildomi nukleotidai, nukleotidai yra kovalentiškai modifikuojami. Svarbi iRNR savyb÷ yra ta, kad iš iRNR vidurio gali būti pašalinami nukleotidai, o susidarę galai sujungiami. Šis procesas vadinamas splaisingu ir būdingas daugumai eukariotų. Splaisingas vyksta taip pat bręstant eukariotų rRNR ir tRNR pirmtakams.

Eukariotų iRNR pirminio transkripto nukleotidų seka apima vieną geną, tačiau seka, koduojanti polipeptidą gali būti ne vientisa, o pertraukiama. Nekoduojančios nukleotidų sekos vadinamos intronais, jos įsiterpia tarp koduojančių sekų egzonų. Splaisingo metu intronai pašalinami iš pirminio transkripto, o egzonai sujungiami.

DNR

Transkripcijakepur÷s prijungimas

Kepur÷ Intronas Egzonas

Pirminis transkriptas5/ 3/

Intronų pašalinimasEgzonų sujungimasPoliadenilinimas

5/ 3/

Poli (A)

Subrendusi iRNR

Genas

19.17 pav. Pirminio transkripto susidarymas ir iRNR brendimas eukariotų ląstel÷se.

Pirminio transkripto sintez÷s metu 5/ gale prijungiama kepur÷ (raudona) , intronai (m÷lyni) pašalinami o egzonai (žali) sujungiami. Prijungiama poli(A) (geltona) uodega.

Visos eukariotų iRNR modifikuojamos norint padidinti jų stabilumą, be to jos tampa geresniais substratais transliacijai. Vienas iš būdu padidinti stabilumą yra modifikuoti molekul÷s galus ir apsaugoti jas nuo ląstelinių egzonukleazių, kurios skaido RNR.

5/ galas modifikuojamas dar nepasibaigus pilnai iRNR pirmtako sintezei. Jo modifikacija prasideda, veikiant fermentui fosfohidrolazei, kuris pašalina galinę fosfato liekaną nuo nukleozido trifosfato. Likęs 5/-nukleozido difosfatas reaguoja su GTP susidarant 5/-5/ trifosfoesteriniam ryšiui. Šią reakciją katalizuoja guanilo transferaz÷ (ar guanililtransferaz÷) ir susidariusi 7-metilguanozino trifosfato struktūra yra vadinama kepur÷. Kepur÷ dažniausiai papildomai modifikuojama metilinant guaniną. Metilo grup÷s donorius yra S-adenozilmetioninas.

485

Pirmuosiuose 5/ galo dviejuose nukleotiduose taip pat gali būti metilintos riboz÷s 2/-hidroksigrup÷s.

O

P

O

P

O

O

O

O

O

P OO

O OCH2

H

O

H

OH

HH

Pu

N

NN

N

O

H

H

H

H

HH

CH2

O

PO

PO

PO

O

O

O

O

O

O

NH2

O

O

P

O

OO

P OO

O OCH2

H

O

H

OH

HH

Pu

O

P

O

P

O

O

O

O

O

N

NN

N

O

H

H

H

H

HH

NH2

O

CH2

P OO

O OCH2

H

O

H

OH

HH

Pu

O

P

O

P

O

O

O

O

O

N

NN

N

O

H

H

H

H

HH

NH2

O

CH2

CH3

P OO

O OCH2

H

O

H

OH

HH

Pu

-

-

- H2O Pn

-

-

-

-

-

-

GTP

-

-

-

PPn

-

-

-

+

5/

5/

5/5/

5/

5/

Fosfohidrolaz÷

Guanililtransferaz÷

Metilaz÷

SAM

iRNR 3/ galas iRNR 3/ galas

5/

7

iRNR 3/ galas iRNR 3/ galas

486

19.18 pav Kepur÷s susidarymas eukariotų iRNR. Šis 5/-5/ trifosfoesterinis ryšys apsaugo iRNR molekules nuo 5/ egzonukleazių poveikio.

Subrendusioje iRNR molekul÷je kepur÷ dalyvauja iRNR susijungime su ribosoma. Fermentai, dalyvaujantis kepur÷s prijungime, sąveikauja tiesiogiai tiktai su RNR polimeraz÷s II kompleksu, tod÷l kepur÷ prijungiama tiktai prie iRNR, o ne prie rRNR ar tRNR.

Eukariotų iRNR modifikuojamos taip pat 3/ gale. Katalizuojant poliadenilato polimerazei, adenilato liekanos nuo ATP yra prijungiamos prie 3/ galo. Šis fermentas katalizuoja reakciją:

RNR + nATP RNR-(AMP)n + nPPn

Poliadenilato polimeraz÷

Šiam procesui nereikalinga DNR matrica, bet reikalingas RNR pradmuo. Poli (A) uodega

prijungiama kelių fermentinių reakcijų metu. Pre-RNR polinukleotidin÷ grandin÷ specifinių endonukleazių suskaidoma. Polinukleotidin÷je grandin÷je yra du sekų elementai nusakantys skaidymo vietą: labai konservatyvi seka (5/)AAUAAA(3 /), kuri per 10 - 30 nukleotidų nutolusi priešsrovę nuo 5/ skaidymo vietos ir sekos turtingos G ir C liekanomis esančios 20-40 nukleotidų žemiau skaidymo vietos. Suskaidžius fosfodiesterinį ryšį, gauname laisvą 3/-hidroksigrupę, prie kurios ir jungiama poli (A) uodega.

Poli (A) uodegos ilgis (n) yra 80 - 250 nukleotidų. Uodegos ilgis priklauso nuo organizmo, nuo iRNR tipo ir nuo ląstel÷s vystymosi stadijos. Ilgis priklauso ir nuo iRNR amžiaus, poli (A) uodega trump÷ja, veikiant 3/ egzonukleazei. Uodegos ilgis sumaž÷ja 50-100 nukleotidais, kol subrendusi iRNR pasiekia branduolio poras. Uodega prailgina laiką, iki egzonukleaz÷ pasiekia koduojančias sritis tuo pačiu prailgina funkcionuojančios molekul÷s gyvavimą.

Prokariotuose splaisingas yra retas reiškinys, tačiau žinduoliuose ir kai kuriuose augaluose jis vyksta visada. Vidin÷s nukleotidų sekos, kurios pašalinamos brendimo metu vadinamos intronais. Sekos, randamos pirminiame transkripte ir subrendusioje iRNR vadinamos egzonais. Intronais ir egzonais taip pat vadinamos DNR sritys, koduojančios iRNR sintezę. Ovalbumino gene yra yra septyni egzonai ir septyni intronai, tai sudaro DNR molekul÷je per 7700 bp. Subrendusios iRNR (kartu su uodega) ilgis yra 1872 nukleotidai. Intronų ilgis gali varijuoti nuo 65 bp iki 10000 bp. Nukleotidų seka skilimo vietose įvairių iRNR yra konservatyvi, kitose

introno srityse ji yra skirtinga.

19.19 pav. Ovalbumino geno intronin÷ ir egzonin÷ sandara

487

Manoma, kad egzonai koduoja baltymo domenus, o intronai yra atspindi geno primityvią organizaciją.

Yra keturios intronų klas÷s. Pirmas dvi grupes I ir II jungia vienas bendras bruožas – vyksta savaiminis splaisingas, šiam procesui nereikalingi baltymai fermentai. Pirmos grup÷s intronai sutinkami kai kuriuose branduolio, mitochondrijų ir chloroplastų genuose, koduojančiuose rRNR, iRNR ir tRNR. Antros grup÷s intronai randami grybų, dumblių ir augalų mitochondrijų ir chloroplastų iRNR pirminiuose transkriptuose. Splaisingo procesui nereikalingas didžiaenergis junginys ATP.

RNR pirmtakų splaisingo metu vyksta dvi transesterifikacijos reakcijos. Riboz÷s 2/ ar 3/ hidroksigrup÷ yra nukleofilai ir atakuoja nukleotido fosfatą, susidarant naujam fosfodiesteriniam ryšiui. Vieno ryšio suyrimas ir naujo susidarymas palaiko energijos balansą.

Pirmos grup÷s splaisingo reakcijoms reikalingas guanino nukleozidas ar nukleotidas kaip kofaktorius. Jis n÷ra energijos šaltinis, guanozino 3/-hidroksigrup÷ yra nukleofilas pirmoje transesterifikacijos reakcijoje. Guanozino 3/-hidroksigrup÷ sudaro 3/,5/ - fosfodiesterinį ryšį su introno 5/ galu (19.20 pav. )

19.20 pav. Spalisingo mechanizmas I grup÷s intronų Atsipalaidavusi laisva egzono 3/-hidroksigrup÷ kaip nukleofilas atakuoja fosfatą introno 3/

gale. Šie du egzonų galai yra sujungiami, o laso (kilpavirv÷s pavidalo intronas yra pašalinamas. Antros grup÷s intronuose reakcijos mechanizmas yra analogiškas, tiktai nukleofilas yra

viduje introno esanti riboz÷s 2/-hidroksigrup÷. Save iškerpantys intronai pirmą kartą buvo nustatyti 1982m. Čechas (T.Cech) su

kolegomis tirdami žiuželinius pirmuonis Tetrahymena thermophila nustat÷, kad rRNR pati viena

488

be baltyminių fermentų vykdo splaisingą. Buvo parodyta kad katalizin÷mis savyb÷mis pasižymi netiktai baltymai bet ir RNR. Tokios RNR buvo pavadintos ribozimais.

Trečia ir didžiausia intronų klas÷ randama branduolio iRNR pirminiuose transkriptuose. Jų pašalinimą katalizuoja ribonukleoproteininis kompleksas vadinamas splaisosoma. Intronų iškirpimas vyksta susidarant laso pavidalo struktūrai. Splaisosoma palaiko tarpinius produktus tokioje pozicijoje, kad egzonai taisyklingai susijungtų.

Splaisosomos sud÷tyje yra per 50 baltymų ir 5 RNR molekul÷s. RNR molekul÷s vadinamos mažosios branduolio RNR (mbRNR) ir susijungusios su baltymais sudaro mažuosius branduolio ribonukleoproteinus (mbRNP). Yra penki tipai mbRNR U1, U2, U4, U5 ir U6 (U parodo, kad šioje RNR dažnai pasitaiko uracilas).

U1 mbRNR turi komplementarias nukleotidų sekas branduolio iRNR introno nukleotidų sekai, esančiai netoli 5/ kirpimo vietos ir U1 mbRNR prisijungia prie pirminio transkripto.. Splaisosoma pradeda formuotis, kai mbRNP U1 prisijungia prie naujai sintetinto RNR pirmtako 5/ kirpimo galo. Vandeniliniai ryšiai susidaro tarp komplementarių bazių 5/ kirpimo srityje ir 5/ galo U1 mbRNP. Prie introno atšakos sekos prisijungia mbRNR U2 ir susidaro stabilus kompleksas, kuris uždengia per 40 nukleotidų. Toliau mbRNR U5 susijungia su 3’ kirpimo sritimi. Paskutin÷se stadijose prisijungia mbRNP U4/U6 ir susiformuoja funkcionuojanti splaisosoma.

Prijungus U1, U2 ir U5 prie consensus sekos ties 5’ kirpimo vieta, atšakos seka ir 3’ kirpimo seka, atitinkamai erdv÷je išd÷sto reaguojančių molekulių aktyvias grupes. Splaisosoma neleidžia 5’ egzono galui išeiti iš komplekso ir sudaro sąlygas susijungti su 3’ galu. Kai splaisosoma susijungia su intronu, susidaręs kompleksas yra pakankamai stabilus ir gali būti išgrynintas. Splaisosoma yra labai didelis nukleoproteininis kompleksas, kuris nepraeina pro branduolio poras, tod÷l iRNR pirmtakai negali išeiti iš branduolio nepasibaigus brendimui. Pašalinus introną, splaisosoma disocijuoja. Po splaisingo intronas lieka branduolyje ir yra suskaidomas.

Splaisosomos susidarymui reikalinga ATP, tačiau RNR skaidymo ir sujungimo procesams ji nereikalinga.

Ketvirtos klas÷s intronai randami kai kuriose tRNR, jų pašalinimui reikalinga ATP ir

endonukleaz÷s. Endonukleaz÷s suardo fosfodiesterinius ryšius abiejuose introno galuose ir du egzonai sujungiami panašiai kaip DNR ligaz÷s katalizuojamoje reakcijoje.

Mutacijos splaisingo vietose sukelia efektyvių baltymų sintezę. Nustatyta, kad per 15% visų genetinių ligų yra d÷l mutacijų, kurios veikia RNR splaisingą. Mutacijos, kurios sukelia neteisingą β−globino RNR splaisingą yra β-talasemijos priežastis.

19.6 Nuo RNR priklausoma DNR ir RNR biosintez ÷. Kalbant apie nukleorūgščių biosintezę, dažniausiai matrica yra DNR ir nuo jos yra

sintetinama RNR. Tačiau kai kurie fermentai naudoja kaip matricą RNR ir nuo jos sintetina RNR ar DNR. Daugumoje virusų genetin÷ informacija yra užrašyta RNR ir jiems dauginantis ji turi būti perduodama DNR ar RNR.

RNR replikacijos buvimas privert÷ peržiūr÷ti molekulin÷s biologijos dogmą. Ji buvo papildyta dviem etapais – RNR replikacija ir atgaline transkripcija.

489

DNR

RNR

Baltymai

DNR replikacija

Transkripcija

Transliacija

Atgalin÷transkripcija

RNR replikacija

19.21 pav. Modifikuota molekulin÷s biologijos dogma Atgalin÷ transkriptaz÷ katalizuoja DNR sintezę nuo RNR. Kai kurie RNR turintys virusai infekuojantys gyvulines ląsteles turi nuo RNR priklausomą

DNR polimerazę, kuri dar vadinama atgalin÷ transkriptaz÷. Virusui infekuojant ląstelę, į ją patenka vienos grandin÷s RNR ir fermentas. Atgalin÷ transkriptaz÷ naudodama patekusią RNR kaip matricą pradžioje sintetina vieną DNR grandinę. Ji lieka susirišusi su RNR ir susidaro RNR-DNR hibridas. Sekančiame etape RNR grandin÷ suskaidoma ir vietoje jos sintetinama DNR grandin÷. Dvigrand÷ DNR įjungiama į ląstel÷s genomą. Aktyvavus šiuos įjungtus viruso genus, yra sintetinama viruso RNR ir viruso baltymai, kurie suformuoja naujus virusus. Tokie virusai, kurie turi atgalinę transkriptazę yra vadinami retrovirusais (retro lotynų kalboje priešd÷lis reiškia atgalinis).

Atgalin÷s restriktaz÷s buvimą nustat÷ Teminas (H.Temin) ir Baltimore (D.Baltimore).

490

20 BALTYM Ų BIOSINTEZö

Genetin÷ informacija yra saugoma chromosomose ir perduodama dukterin÷ms ląstel÷ms replikacijos metu. DNR transkribuojantis informacija perduodama iRNR, kuri transliacijos metu šią informaciją realizuoja sintetinantis atitinkamos aminorūgščių sekos polipeptidinei grandinei. Baltymų biosintez÷s procesas vadinamas transliacija, kadangi nukleotidų sekos „kalba“ yra transliuojama į aminorūgščių kalbą baltymo molekul÷je. Transliacijos procesas reikalauja genetinio kodo, kurio pagalba informacija, užrašyta nukleotidų sekoje perduodama aminorūgščių sekai.

Replikacija ir transkripcija ir potranskripcin÷ modifikacija vyksta eukariotų branduolyje, o transliacija – citozolyje esančiose ribosomose. Po transliacijos polipeptidin÷ grandin÷ susisuka ir susidaro tretin÷ struktūra, baltymas gali būti modifikuojamas, prie jo prijungiamos įvairios molekul÷s.

20.1 pav. Baltymų biosintez÷s schema.

20.1 Genetinis kodas Kada buvo nustatyta, kad nukleorūgštys koduoja aminorūgščių seką baltymo molekul÷je,

iškilo aib÷ klausimų. Kaip vyksta kodavimas? Kiek bazių reikia vienai aminorūgščiai koduoti? Ar genetinis kodas persidengia ar ne? Ar kodas yra ištisinis ar turi trūkius?

Matematiniai skaičiavimai parod÷, kad trys baz÷s yra minimalus kodo žodis, arba kodonas, koduojantis vieną aminorūgštį. Jeigu kodonas būtų sudarytas iš dviejų bazių, tai keturios skirtingos baz÷s koduotų tiktai 16 (42 = 16) iš esančių 20 aminorūgščių. Tripletinis kodas turi 43 = 64 galimus variantus ir jo pilnai užtenka pažym÷ti visas aminorūgštis.

Pilnas genetinis kodas pateiktas 20.1 lentel÷je. Kodonai, kaip ir kitos nukleotidų sekos skaitomos 5/→3/ kryptimi. Genetinis kodas pasižymi šiomis savyb÷mis

Genetinis kodas yra tripletinis , trys baz÷s koduoja vieną aminorūgštį. Visi kodonai turi prasmę. 61 kodonas iš 64 yra specifiškas vienai aminorūgščiai. Likę trys

– UAA, UAG ir UGA nekoduoja nei vienos aminorūgšties ir vadinami beprasmiai kodonai. Beprasmiai kodonai yra terminuojantys kodonai, jie yra „stop“ signalai, nurodantys polipeptidin÷s grandin÷s sintez÷s pabaigą.

Genetinis kodas yra vienareikšmis. Kiekvienas iš 61 kodono koduoja tiktai vieną aminorūgštį.

491

Genetinis kodas yra išsigimęs. Išskyrus Met ir Trp kiekviena aminorūgštis koduojama daugiau nei vienu tripletu. Arg, Leu ir Ser atspindi net 6 skirtingi kodonai. Kodonai atstovaujantys vienai ar chemiškai panašiai aminorūgščiai turi panašią seką. Dažnai trečia baz÷ triplete yra nereikšminga, pavyzdžiui CCX (CCU, CCC, CCA, CCG) koduoja proliną, o GUX (GUU, GUG, GUC, GUA) – valiną. Ši savyb÷ vadinama genetinio kodo išsigimimu. Genetinio kodo išsigimimas yra kaip evoliucinis buferis sumažinantis mutacijų poveikį.

Genetinis kodas yra universalus. Kodonai koduoja tas pačias aminorūgštis archebakterijose, eubakterijose ir eukariotuose. Tai yra aiškus įrodymas, kad visi organizmai naudoja tą patį genetinį kodą ir yra išsivystę iš vieno pirmykščio prot÷vio. Mitochondrijų, kai kurių prokariotų ir žemesniųjų eukariotų genomuose yra išimtys.

Kodas nepersidengia, tripletai nuskaitomi vienas po kito. Bazių seka nuskaitoma nuo fiksuoto pradžios taško be trūkių, tai reiškia kad n÷ra

„kablelių“ atskiriančių tripletus ar jų grupes. Jeigu skaitymo r÷melis yra perstūmiamas per vieną bazę, gaunama beprasm÷ aminorūgščių seka.

20.1 lentel÷ Genetinis kodas. Trys nukleotidai koduoja vieną aminorūgštį.

20.2 Ribosomos baltym ų biosintez ÷s vieta Ribosomos yra nukleoproteininis kompleksas, sudarytas iš rRNR ir baltymų, kuriame

sintetinami baltymai. Kiekvienoje E.coli bakterijoje yra daugiau nei 15000 ribosomų, kurios sudaro per 25% ląstel÷s sauso svorio. Prokariotų ribosomose yra apie 65% rRNR ir apie 35% baltymų, jų diametras yra apie 18nm. Ribosomos charakterizuojamos sedimentacijos konstantos (S) dydžiu. S (Svedbergas) – yra sedimentacijos konstanta, kuri parodo greitį, kuriuo dalel÷ nus÷da ultracentrifuguojant. Prokariotų ribosomos yra 70S, o eukariotų 80S, jos sudarytos iš dviejų nevienodų subvienetų

492

. 20.2 pav. Ribosomos struktūra Prokariotų 70S (Mm = 2,7*106) ribosoma priklausomai nuo sąlygų disocijuoja į didįjį 50S

subvienetą ir mažąjį 30S subvienetą, eukariotų 80S ribosoma sudaryta iš 60S ir 40S subvienetų. E.coli 30S ribosomos subvienete yra viena 16S rRNR, kuri sudaryta iš 1542 nukleotidų ir

21 ribosominis baltymas Nors skirtingų rūšių rRNR yra nevienodos, tačiau didel÷s antrin÷s struktūros sritys visų organizmų ribosomų yra labai konservatyvios. 50S ribosomos subvienete yra dvi rRNR viena - 5S turi 120 nukleotidus, kita 23S rRNR sudaryta iš 2904 nukleotidų. Su šiomis rRNR susiriša 36 baltymai (20.2 lentel÷)

20.2 lentel÷. E.coli ribosomos baltymų ir RNR sud÷tis /Lehn/

Subvienetas, jo molekulin÷ mas÷ (Mm Da)

Skirtingų baltymų skaičius

Bendras baltymų skaičius

Baltymų žym÷jimas

rRNR tipai

30S 1,8*108 21 21 S1-S21 16S rRNR 50S 0,9*106 33 36 L1-L36 5S rRNR

23S rRNR Eukariotų ląstel÷se ribosomos savo forma panašios į bakterijų, tačiau jos yra didesn÷s.

Pilnos ribosomos sedimentacijos koeficientas lygus 80S (Mm = 4,2*106), ji sudaryta iš dviejų subvienetų 60S (Mm = 2,8*106Da) ir 40S (Mm = 1,4*106Da). Didžiajame subvienete yra trys rRNR (5S rRNR, 5,8S rRNR ir 28S rRNR),bei apie 49 baltymus. Į mažojo subvieneto sud÷tį įeina 8S rRNR ir apie 33 baltymus. 5,8S rRNR sudaryta iš 160 nukleotidų ir jos nukleotidų seka panaši į prokariotų 23S rRNR 5/ galą

. 20.3 pav. Prokariotų (70S) ir eukariotų (80S) ribosomų sud÷tis. Du ribosomų subvienetai susijungia ir sudaro plyšį, į kurį patenka iRNR. Ribosominių

baltymų struktūra ir dydis ženkliai skiriasi. Molekulin÷ mas÷ svyruoja nuo 6000 iki 75000.

Comment [JK14]: Editos paklausti kiek baltymu

493

20.4 pav. Ribosomos 50S subvieneto struktūra. tRNR (violetin÷, rausvai violetin÷ ir pilka)

yra atitinkamai prisijungusios prie E, P ir A sričių. tRNR antikodonas yra oranžiniai. Baltynai yra m÷lynos spalvos siūlin÷s struktūros. rRNR baz÷s pažym÷tos baltai, karkasas – žalias. (PDB 1D 1JJ2)

2000m. buvo nustatyta bakterijų Haloarcula marismortui pilna trijų dimensijų didžiojo ir mažojo ribosomų subvieneto struktūra. Struktūra patvirtino, kad rRNR yra karkasas, prie kurio jungiasi baltymai ir suformuojama struktūra, atsakinga už tRNR susijungimą su iRNR ir katalizuojanti peptidinių ryšių susidarymą. Ribosomin÷s RNR susisuka į kompaktiškas, tikslios tretin÷s struktūros molekules, sudaro ribosomos šerdį ir apsprendžia jos formą. Ribosominiai baltymai išsid÷sto ribosomos paviršiuje jie užpildo plyšius ir angas rRNR molekul÷je. Kai kurių baltymų globuliniai domenai išsid÷sto ribosomos paviršiuje į rRNR vidų yra įterptos polipeptidin÷s grandin÷s sritys. Pagrindin÷ ribosominių baltymų funkcija yra stabilizuoti šerdies rRNR, bei leisti kisti rRNR konformacijai baltymų biosintez÷s metu. Ribosomose yra nustatytos trys sritys – viena suriša aminoacil-tRNR (A sritis), kita prijungia peptidil-tRNR (P sritis) ir E (exit) sritis, iš kurios yra deacilinta tRNR palieka ribosomą. 23S rRNR suformuoja katalizinį centrą kuriame vyksta peptidinio ryšio susidarymas. Artimiausias baltymas nuocentro, kur vyksta peptidinio ryšio susidarymas yra per 1,8nm. Šis katalizinis centras yra sudarytas kaip ir daugelio fermentų aktyvus centras. Tai yra tikslios struktūros kišen÷, kuri prijungia ir orientuoja substratus (aminoacil-tRNR ir peptidil-tRNR). Aktyvi funkcin÷ grup÷, dalyvaujanti rūgštin÷je-bazin÷je kataliz÷je yra adenino žiedo azotas. Nors adenino žiedo azoto pK paprastai yra apie 3,5 ir jis n÷ra geras protonų donoras ir akceptorius, tačiau 23S rRNR tretin÷ struktūra suformuoja tokia aplinką, kurioje azoto pK priart÷ja prie neutralaus. Ribosomose 23S rRNR veikia kaip ribozimas ir katalizuoja peptidinio ryšio susidarymą.

Prokariotų ir eukariotų genomai turi daug ribosomin÷s RNR genų kopijų, tai leidžia palaikyti didelį ribosomų sintez÷s greitį. Eukariotų ribosominę RNR transkribuoja RNR polimeraz÷ I. rRNR sintez÷ ir ribosomų susirinkimas vyksta branduol÷lyje.

20.3 Baltym ų biosintez ÷s eiga DNR ir RNR biosintez÷s metu išskiriamos trys stadijos – iniciacija, elongacija ir

terminacija. Baltymų biosintez÷je dar prisideda du papildomi etapai – aminorūgščių aktyvacija ir prijungimas prie specifin÷s tRNR, bei baltymų potransliacinis susisukimas ir modifikacija. Komponentai dalyvaujantys šiose stadijose pateikiami lentel÷je Nr.

20.2 lentel÷. Komponentai dalyvaujantys baltymų biosintez÷s procese E.coli bakterijose Etapas Būtini komponentai 1. Aminorūgščių aktyvacija ir

20 aminorūgščių 20 aminoacil-tRNR sintetazių

Comment [JK15]: kokiu bakterriju

494

prijungimas prie tRNR

20 ir daugiau tRNR ATP Mg2+

2. Iniciacija iRNR N-Formilmetionil-tRNR iRNR iniciacijos kodonas (AUG) 30S ribosomos subvienetas 50S ribosomos subvienetas Iniciacijos faktoriai (IF-1, IF-2, IF-3) GTP Mg2+

3. Elongacija Funkcionuojanti 70S ribosoma Aminoacil-tRNR Elongacijos faktoriai (EF-Tu, EF-Ts, EF-G) GTP Mg2+

4. Terminacija ir polipeptidin÷s grandin÷s atpalaidavimas

iRNR terminacijos kodonas Polipeptido atpalaidavimo faktorius (RF1, RF2, RF3)

5. Susisukimas ir potransliacin÷s modifikacijos

Fermentai, kofaktoriai reikalingi baltymų susisukimui, proteolitiniam procesingui, fosfato, metilo, karboksigrup÷s, angliavandenių, prostetinių grupių prijungimui.

20.3.1Aminor ūgščių aktyvacija. Norint sujungti dvi aminorūgštis ir sudaryti peptidinį ryšį, reikia jas aktyvuoti. Yra

aktyvuojama aminorūgšties karboksigrup÷, prijungiant ATP. Ši aktyvuota aminorūgštis specifiškai yra sujungiama su atitinkama tRNR. Reakciją katalizuoja aminoacil-tRNR sintetaz÷. Kiekvienas fermentas yra specifiškas vienai aminorūgščiai ir vienai ar keliom tRNR. Dauguma organizmų turi po vieną aminoacil-tRNR sintetazę kiekvienai aminorūgščiai. Aminorūgštims, kurios prijungiamos prie kelių tRNR, aminoacilinimą katalizuoja tas pats fermentas. Iš E.coli yra išskirtos ir kristalizuotos beveik visos aminoacil-tRNR sintetaz÷s. Nors katalizuoja panašią fermentinę reakciją, jos skiriasi savo aminorūgščių seka, dydžiu, oligomerine struktūra. E.coli aminoacil-tRNR sintetaz÷je aminorūgščių skaičius kinta nuo 334 iki 951, jos skiriasi subvienetais ir jų skaičiumi − α, α2, α4 ir α2α4. Aukštesniuosiuose eukariotuose, kai kurie fermentai organizuoti į didelius baltyminius kompleksus. Pagal savo struktūrą ir veikimo mechanizmą, aminoacil-tRNR sintetaz÷s yra suskirstytos į dvi klases. I klas÷s fermentai yra monomerai , tuo tarpu II klas÷s aminoacil-tRNR sintetaz÷s daugumoje dimerai. I klas÷s aminoacil-tRNR sintetaz÷s pradžioje aminorūgštį prijungia prie tRNR galinio adenilato riboz÷s 2/ hidroksigrup÷s, v÷liau aminorūgštis perkeliama ant 3/ - OH. II klas÷s fermentai aminorūgštį prijungia prie 3/-OH. Baltymų biosintez÷s substratas yra tiktai 3/-aminoacil-tRNR.

20.3 lentel÷. Aminoacil-tRNR sintetazių klas÷s I klas÷ II klas÷ Arg Ala Cys Asn Gln Asp

Comment [JK16]: terminas

495

Glu Gly Ile His Leu Lys Met Phe Trp Pro Tyr Ser Val Thr

Fermentas aminoacil-tRNR sintetaz÷ katalizuoja aminorūgšties prijungimą prie tRNR

Aminorūgštis + tRNR + ATP

Aminoacil-tRNR sintetaz÷

Aminoacil-tRNR + AMP + PPn Fermentin÷ reakcija vyksta dviem stadijom. Pirmoje stadijoje, reaguojant ATP su

aminorūgštimi, susidaro aminoaciladenilatas, kuris lieka susirišęs su fermento aktyviuoju centru. Aminorūgšties karboksigrup÷ reaguoja su ATP α−fosforilo grupe ir susidaro anhidridinis didžiaenergis ryšys. Antrame etape aminoacilo grup÷ nuo aminoaciladenilato pernešama ant atitinkamos specifin÷s tRNR. Ryšys tarp aminorūgšties ir tRNR yra didžiaenergis, jo hidroliz÷s energija lygi ∆G0/ = -29kJ/mol. Ši energija panaudojama peptidinio ryšio susidarymui. Reakcijos metu susidaręs pirofosfatas (PPn) yra hidrolizuojamas neorganin÷s pirofosfataz÷s ir reakcijos

496

pusiausvyra pastumta į produkto susidarymo pusę (20.1 pav.).

O

H

OH

H

OH

HH

O P O CH2

O

POPO

O O

O O

O

R CH

NH3

O

O

O

H

OH

H

OH

HH

O P O CH2

O

O

R CH

NH3

O

OCH2

H

OH

H

OH

HH

PO

O O

OCH2

H

O

H

OH

HH

PO

O O

O

R

CH

Ade+ C +

PPn

Ade+

C

Aminorūgštis ATP

Aminoaciladenilatas

Ade

tRNR

tRNR

Ade

tRNR

C

H3N

Aminoacil-tRNR

Aminoacil-tRNRsintetaz÷

+

20.5 pav. tRNR aminoacilinimas. Pirmame etape, katalizuojant aminoacil-tRNR

sintetazei, aminorūgštis reaguoja su ATP. Antrame etape aminoacilo grup÷ nuo aminoaciladenilato pernešama ant tRNR.

tRNR aminoacilinimas išsprendžia du uždavinius 1) aktyvuoja aminorūgštis ir energija panaudojama peptidinio ryšio susidarymui, 2) prijungia aminorūgštį prie adaptorin÷s tRNR tai garantuoja taisyklingą aminorūgšties vietą augančioje polipeptidin÷je grandin÷je. Aminorūgšties prijungimo tikslumas n÷ra tikrinamas ribosomoje, tod÷l teisingaas aminorūgšties prijungimas prie tRNR būtina sąlyga baltymų sintez÷s tikslumui.

497

Aminoacil-tRNR specifiškumas buvo ištirtas nagrin÷jant Ile-tRNRIle sintetazę, kuri atskiria valiną ir leuciną, besiskiriančius viena metileno (-CH2-) grupe.

COO

H3N H

H CH3

CH3

COO

H3N H

H CH3

CH2

CH3

C

C

-

+C

C

+

Valinas Izoleucinas

-

Ileu-tRNRIle sintetaz÷ 200 kartų specifiškiau prijungia Ile nei Val prie tRNRIle, metileno

grup÷s buvimas padidina Ile prisijungimą prie fermento. Tačiau valino įsijungimo polipeptidin÷je grandin÷je dažnis vietoje Ile yra 1 su 3000. Ile-tRNR sintetaz÷ turi klaidų taisymo funkciją. Fermentas atrenka specifinį substratą dviem etapais. Pirmame fermentas aktyviame centre specifiškai prisijungia aminorūgštį ir ją aktyvuoja susidarant aminoaciladenilatui. Antrame etape jeigu susidaro neteisingas valiladenilatas, tai jis patenka į skirtingą fermento aktyvų centrą, kuriame valiladenilatas hidrolizuojamas. Izoleuciladenilatas yra didesnis nei valiladenilatas ir negali susirišti su šiuo hidroliz÷s centru. Taigi valil-AMP hidrolizuojama į valiną ir AMP klaidų taisymo centre, tod÷l surišta su fermentu tRNRIle n÷ra aminoacilinama neteisinga aminorūgštimi.

Dauguma aminoacil-tRNR sintetazių hidrolizuoja esterinį ryšį tarp aminorūgšties ir tRNR. Ši hidroliz÷ pagreit÷ja, kai prisijungiama ne ta aminorūgštis ir tuo pačiu sumažina klaidų skaičių.

Klaidų skaičius sintetinant baltymus yra (~1 klaida 104 įjungtų į baltymą aminorūgščių kiekiui) yra mažesnis negu DNR biosintez÷s metu.

Aminoacil-tRNR sintetaz÷ turi būti specifiška netiktai aminorūgščiai, bet ir atitinkamai tRNR. tRNR apie 20% nukleotidų yra konservatyvūs visom tRNR tod÷l jie negali būti atpažinimo taškai aminoacil-tRNR sintetazei. Fermentas ir tRNR sąveikauja nukleotidais, kurie išsid÷sto antikodonin÷je kilpoje (tame tarpe ir nukleotidai įeinantys į antikodono sud÷tį), aminorūgštį surišančioje srityje ir dalinai kitose molekul÷s vietose. 10 ar daugiau nukleotidų dalyvauja specifin÷s aminoacil-tRNR sintetaz÷s atpažinime. Tačiau Ala-tRNR sintetaz÷ atpažįsta tRNRAla tiktai vieną G-U bazių porą, esančią aminorūgšties akceptoriniame gale. Gana paprasta tRNR atpažinimo seka yra reliktas pirminių tRNR dalyvavusių primityvioje baltymų biosintez÷je.

20.3.2Baltym ų biosintez ÷s iniciacija Baltymų biosintez÷ prasideda nuo N galo ir tęsiasi prijungiant po vieną aminorūgštį prie

galin÷s aminorūgšties karboksigrup÷s. AUG kodonas yra inicijuojantis kodonas, prie jo jungiasi aminorūgštis metioninas. Organizmai turi dvi tRNR, kurios perneša Met. Viena prijungia Met tiktai prie inicijuojančio AUG kodono, kita įjungia metioniną polipeptidin÷s grandin÷s viduje.

Bakterijose prie inicijuojančio kodono prisijungia tRNR nešanti formilmetioniną - N-formilmetionil-tRNRfMet (fMet-tRNRfMet). Ji susidaro katalizuojant dviem fermentams. Pradžioje metioninas prisijungia prie tRNRfMet, veikiant Met-tRNR sintetazei.

Comment [JK17]: kaip versti

498

Metioninas + tRNRfMet + ATP Met-tRNRfMet +AMP + PPn

Met-tRNR sintetaz÷

Transformilaz÷ perneša formilo liekaną nuo N10-formiltetrahidrofolato (N10-formil-THF)

ant metionino amino grup÷s.

N10-Formil-THF + Met- tRNRfMet fMet-tRNRfMet + tetrahidrofolatas

Transformilaz÷

Prijungus formilo liekaną prie metionino susidaręs produktas prisijungia tiktai prie

inicijuojančio AUG, bet ne prie AUG esančio geno viduryje. fMet-tRNRfMet prisijungia prie specifin÷s ribosomos srities

.

NH

C H

-

CH2

CH2

S

CH3

COO

N-Formilmetioninas

O

CH

Eukariotų ląstel÷se baltymų, sintetinamų ant laisvų ribosomų susidarymas prasideda nuo

metionino, tačiau yra specifin÷ inicijuojanti tRNR, įjungianti Met polipeptidin÷s grandin÷s pradžioje.

Polipeptido biosintez÷s iniciacija bakterijose prasideda nuo 30S ribosomos subvieneto susijungimo su dviem iniciacijos faktoriais IF-1 ir IF-3. IF-3 apsaugo nuo priešlaikinio 30S ir 50S ribosomos subvienetų susijungimo. Po to iRNR susiriša su 30S subvienetu. IF-3 taip pat padeda fMet-tRNRfMet susijungti su ribosomos P-sritimi. IF-2 prisijungia GTP ir IF-2-GTP kompleksas specifiškai atpažįsta iniciatorinę tRNR. IF-1 faktorius palengvina IF-2 ir IF-3 faktorių veikimą. Taisyklingam inicijuojančio kodono AUG susijungimui su ribosoma prokariotuose labai svarbi iRNR Šaino-Dalgarno (Shine-Dalgarno) seka. Šios baz÷s komplementariai susijungia su 30S ribosomos subvieneto 16S rRNR dalimi, kuri yra turtinga purinais ir lokalizuota netoli 3/ galo. Ši tRNR - rRNR sąveika nukreipia inicijuojanti AUG kodoną į tą 30S ribosomos vietą, kur prasideda baltymo biosintez÷s iniciacija. Prie P-srities ir inicijuojančio kodono AUG prisijungia inicijuojanti fMet-tRNRfMet.

499

20.6 pav. Šaino ir Dalgarno seka. 16S rRNR savo 3/ galu prisijungia prie Šaino ir

Dalgarno sekos (AGGA), esančios netoli iniciacijos kodono (AUG).

20.7 pav. Baltymų biosintez÷s iniciacijos stadija. Susidarius 30S iniciacijos kompleksui, prisijungia 50S subvienetas. Yra hidrolizuojamas

GTP ir kompleksas IF-2-GDP disocijuoja kartu su kompleksais IF-1 ir IF-3. Susidaręs kompleksas, kuris susideda iš 70S ribosomos, iRNR ir inicijuojančios fMet-tRNRfMet yra vadinamas iniciacijos kompleksas..Teisingas fMet-tRNRfMet susijungimas su ribosomos P-sritimi yra garantuotas trimis atpažinimo ir prisijungimo taškais 1) inicijuojančio kodono-antikodono sąveika 2) sąveika Šaino ir Dalgarno sekos su 16S rRNR, 3) surišimas fMet-tRNRfMet su ribosomos P-sritimi.

Eukariotuose yra minimum devyni iniciacijos faktoriai. Vienas iš svarbiausių iniciacijos faktorių yra eIF-4. Jis specifiškai susijungia su iRNR 5/ gale esančia „kepure“. Prisijungus prie 7-metilguanilato formuojasi priešiniciacijos kompleksas, į kurį įeina 40S ribosomin÷ dalel÷,

500

inicijuojanti aminoacil-tRNR ir keletas iniciacijos faktorių. Šis kompleksas skanuoja iRNR 5/→3/ kryptimi kol pasiekiamas iniciacijos kodonas. Pasiekus iniciacijos kodoną met-tRNRmet sąveikauja su P-sritimi ir prisijungia 60S ribosomos subvienetas. Eukariotų iRNR neturi Šaino ir Dalgarno sekos, pirmas AUG kodonas dažniausiai yra iniciacijos kodonas. Dauguma eukariotų iRNR koduoja tiktai vieną polipeptidą.

20.3.3Elongacija. Peptidinio ryšio susidarymas Bakterijų ribosomose yra trys sritys surišančios tRNR: A sritis (aminoacil-tRNR surišanti

sritis), P sritis (peptidil-tRNR surišanti sritis) ir E sritis. Šių sričių susidaryme dalyvauja abu ribosomos subvienetai. fMet-tRNRfMet yra vienintel÷ aminoacil-tRNR, kuri susijungia su P sritimi, kitos aminoacil-tRNR susiriša su A sritimi. E sritis yra ta vieta, iš kurios pasišalina laisva tRNR elongacijos proceso metu.

Trečias baltymų biosintez÷s etapas yra elongacija. Elongacijai reikalingi atitinkami elongacijos faktoriai, aminoacil-tRNR, GTP ir iniciacijos kompleksas.

At÷jusi aminocil-tRNR susiriša su elongacijos faktoriaus EF-Tu-GTP kompleksu. Šis aminoacil-tRNR-EF-Tu-GTP kompleksas prisijungia prie 70S ribosomos A srities. Po GTP hidroliz÷s nuo ribosomos atsipalaiduoja EF-Tu-GDP. Ribosomos P srityje yra fMet-tRNRfMet , o A srityje yra naujai at÷jusi aminoacil-tRNR, kurios antikodonas atitinka kitam, po inicijuojančio kodono esančiam tripletui.

501

20.8 pav. Baltymų biosintez÷s elongacijos stadija.. A. Antra aminoacil-tRNR prisijungia elongacijos faktorius EF-Tu ir EF-Ts ir įeina į A sritį. B. Susidaro peptidinis ryšys. 23S rRNR veikai kaip ribozimas ir katalizuoja peptidinio ryšio susidarymą. N-formilmetionilgrup÷ iš P srities pernešama ant aminoacil-tRNR aminogrup÷s A srityje. Dipeptidil-tRNR lieka A srityje.

Peptidinio ryšio susidarymas. Susidarant peptidiniam ryšiui, N-formilmetionilo grup÷ nuo fMet-tRNRfMet esančios P-srityje, pernešama ant greta A srityje esančios aminoacil-tRNR amino grup÷s. ( pav.). Aminorūgšties amino grup÷ veikia kaip nukleofilas, atakuodama karbonilo anglį P srityje esančios fMet-tRNRfMet . Susidaro dipeptidil-tRNR, kuri yra A srityje, o laisva tRNRfMet lieka P srityje. Fermentinis aktyvumas, kuris katalizuoja peptidinio ryšio susidarymą istoriškai vadinamas peptidiltransferaz÷. Dabar žinoma, kad peptidinio ryšio susidarymą katalizuoja 23S rRNR, ji veikai kaip ribozimas.

502

OCH2

H

O

H

OH

HH

PO

O O

C O

CH

NHCHO

CH2CH2SCH3

OCH2

H

O

H

OH

HH

PO

O O

O

CNH2 R

H

OCH2

H

O

H

OH

HH

PO

O O

C

C

O

RH

NH

C O

C CH2CH2SCH3H

NHCHO

OCH2

HH

OH

HH

PO

O O

OH

Ade

tRNR

P sritis

Ade

tRNR

C

A sritis

..

Aminoacil-tRNR

Ade

tRNR

A sritis

Ade

tRNR

P sritis

Deacilinta tRNR

Peptidil-tRNR

Formilmetionil-tRNR

20.9 pav. Peptidinio ryšio susidarymas. Peptidil-tRNR karbonilgrup÷s anglis yra

atakuojama aminogrup÷s azoto. Aminoacilgrup÷ pernešama ant tRNR esančios A-srityje. Translokacija. Galutinio translokacijos etapo metu ribosoma juda per vieną iRNR

kodoną link polinukleotidin÷s grandin÷s 3/ galo. Peptidil-tRNR, prisijungusi prie A srities pereina į P sritį ir pastumia laisvą deacilintą tRNR iš A srities į E sritį, iš kurios ji išeina į citozolį. Trečias iš eil÷s einantis iRNR kodonas patenka į A sritį. Ribosomos pernešimui per iRNR reikalingas EF-G (dar vadinamas translokaze), panaudojama GTP hidroliz÷s energija.

503

20.10 pav. Baltymų biosintez÷s elongacijos stadija.. Translokacija. Ribosoma pereina

iRNR molekule per vieną kodoną. Dipeptidil-tRNR iš A srities keliauja į P sritį. Trečia aminoacil-tRNR patenka į A sritį. Deacilinta tRNR išeina iš E srities.

Ribosoma su prisijungusia P srityje dipeptidil-tRNR ir iRNR yra pasiruošusi prisijungti trečią aminorūgštį. Procesas vyksta taip pat analogiškai praeitam etapui. At÷jusios į ribosomą aminoacil-tRNR antikodonas sudaro vandenilinius ryšius su iRNR kodonu ir prisijungia prie A-srities. Katalizuojant peptidiltranslokazei susidaro naujas peptidinis ryšys ir procesas kartojamas. Kiekvienos aminorūgšties prisijungimui dvi GTP molekul÷s hidrolizuojamosjudant ribosomai nuo vieno kodono prie kito.

Elongacijos ciklas eukariotuose yra panašus į prokariotų. Dalyvauja trys elongacijos faktoriai (eEF1a, eEF1βγ ir eEF2), kurie yra analogai prokariotų elongacijos faktorių. Eukariotų ribosomose n÷ra E srities, ir laisva tRNR išeina tiesiai iš P srities

Klaid ų taisymas ribosomoje

20.3.4 Polipeptido sintez ÷s terminacija Elongacija tęsiasi, kol paskutin÷ aminorūgštis prisijungia prie polipetidin÷s grandin÷s.

Grandin÷s sintez÷ nutraukiama, kai iRNR sutinkami vienas iš trijų terminacijos kodonų UAA, UAG, UGA, kurie nekoduoja nei vienos aminorūgšties. Bakterijose, terminacijos kodonui patekus į A sritį , dalyvauja papildomi terminacijos ar išlaisvinimo faktoriai RF1, RF2 RF3. Jų poveikyje 1) hidrolizuojamas esterinis ryšys peptidil-tRNR ir atskyla polipeptidas, 2) iš

504

ribosomos atsipalaiduoja polipeptidas ir laisva tRNR, 3) 70S ribosoma disocijuoja į 30S ir 50S subvienetus.

Terminacijos faktoriai atpažįsta terminacijos kodonus. RF-1 atpažįsta UAA ir UAG, RF-2 atpažįsta UAA ir UGA, o RF-3 prisijungia GTP ir padidina RF-1 ir RF-2 veikimą. Terminacijos faktoriai, prisijungę A srityje indukuoja peptidiltransferazę pernešti peptidą ant vandens, o ne ant aminorūgšties.

Baltymų biosintez÷s procesas reikalauja didelių energijos sąnaudų. Kiekvienai aminoacil-tRNR susidaryti panaudojami du didžiaenergiai junginiai. Pirmame elongacijos etape viena molekul÷ GTP hidrolizuojama iki GDP ir Pn kita GTP molekul÷ sunaudojama translokacijos etape. Vidutiniškai keturios NTP molekul÷s yra hidrolizuojamos sintetinant vieną peptidinį ryšį, tai yra apie 122kJ/mol. Peptidinio ryšio hidroliz÷s energija yra tiktai -21kJ/mol.

Norint pasiekti didesnį baltymų biosintez÷s efektyvumą, tiek eukariotų tiek prokariotų ląstel÷se su viena iRNR susijungia nuo 10 iki 100 ribosomų ir susidaro polisoma ir baltymus sintetina kiekviena ribosoma.

Bakterijose transkripcija ir transliacija yra glaudžiai susijusios, ribosomos pradeda transliuoti nuo 5/ iRNR galo dar nepasibaigus transkripcijai. Eukariotuose baltymų biosintez÷ vyksta citozolyje ir naujai sintetinta iRNR turi išeiti iš branduolio.

Susintetintos polipeptidin÷s grandin÷s susisukimas ir potransliacin÷ modifikacija. Polipeptidinei grandinei ilg÷jant ji išeina iš ribosomos ir prasideda antrin÷s ir tretin÷s struktūros formavimasis, vandenilinių, elektrostatinių, hidrofobinių, van der Valso j÷gų susidarymas. Dauguma baltymų po transliacijos yra modifikuojami ir įgauna biologinį aktyvumą

Polipeptidin÷s grandin÷s N ir C galo modifikacija. Bakterijose pirma įjungta aminorūgštis yra N-formilmetioninas, o eukariotuose – metioninas. Susidarant funkcionuojančiam baltymui fermentai pašalina formilo liekaną, N galinį metioniną, kai kuriais atvejai kelias N-galines ar C-galines aminorūgštis. Daugumos eukariotų baltymų N-galin÷ aminorūgštis yra acetilinta.

Signalin÷s sekos pašalinimas. Baltymai, kurie pernešami pro membraną savo N-gale turi 15-30 aminorūgščių signalinę seką, kuri pernešimo metu signalinių peptidazių yra atskeliama.

Aminor ūgščių modifikacija. Serino, tirozino, treonino hidroksigrup÷s gali būti fosforilinamos ATP pagalba, prie glutamo rūgšties gali būti prijungta dar viena karboksigrup÷. Į protrombino sud÷tį įeina γ-karboksiglutamatas, kuris vaidina svarbų vaidmenį kraujo kreš÷jimo procesuose. Prolinas, lizinas gali būti hidroksilinami ( 1.1.2; 2.9.1 skyrius).

Baltymų glikozilinimas. Angliavandeniai kovalentiškai prijungiami prie baltymų jau po polipeptidin÷s grandin÷s sintez÷s. Angliavandeniai yra prijungiami prie Asn (N-ryšys) arba Ser ir Thr (O-ryšys). (4.7 skyrius).

Izopreno grupių prijungimas. Grup÷ eukariotų baltymų yra modifikuojama prijungiant fragmentus sudarytus iš izopreno. Tai gali būti farnezilo ar geranilo liekanos, kurios kovalentiniu ryšiu prijungtos prie baltymo ir tranauja inkaru, palikančiu baltymus šalia membranos (5.5 skyrius).

Prostetinių grupių prijungimas. Kai kuie baltymai funkcionuoja tiktai kovalentiškai sujungti su nedidel÷s molekulin÷s mas÷s organin÷mis medžiagomis. Citochromuose hemas karboksilaz÷s biotinas prijungiami po baltymo biosintez÷s.

Baltymų proteolitinis skaidymas. Yra grup÷ baltymų, kurie sintetinami neaktyvūs (zimogenai, profermentas) ir aktyvuojami pašalinant atitinkamus peptidinius fragmentus (2.9.2 skyrius).

Baltymų splaisingas. Baltymuose kaip ir RNR gali vykti splaisingas. Po transliacijos, viduje polipeptidin÷s grandin÷s esantis segmentas, vadinamas inteinu yra iškerpamas ir

505

pašalinamas, o likusios dalys (eksteinai) yra sujungiami peptidiniu ryšiu. Inteinai yra vadinami baltymų intronais.

20.4 Baltym ų biosintez ÷s inhibitoriai Plačiausiai naudojami baltymų biosintez÷ inhibitoriai yra antibiotikai. Antibiotikai , tai

yra chemin÷s medžiagos sintezuojamos bakterijų ar grybų, kurios stabdo kitų organizmų augimą. Antibiotikai inhibuoja įvairius biocheminius procesus – DNR replikaciją (novobiocinas), transkripciją (rifamicinas), bakterijų sienel÷s sintezę (penicilinas). Tačiau dauguma antibiotikų plačiai naudojamų kaip vaistai, blokuoja transliaciją. Baltymų biosintez÷s mašina yra labai sud÷tinga, tod÷l galima paveikti įvairiuose taškuose. Antibiotikai plačiai panaudojami, tiriant ribosomų veikimo mechanizmą. Lentel÷je 20.4. pateikti antibiotikai dažnai naudojami medicinoje ar tiriant baltymų biosintez÷s mechanizmą.

20.4 lentel÷. Baltymų biosintez÷s inhibitoriai Inhibitorius Veikimas Chloramfenikolis Inhibuoja prokariotų didžiojo ribosomos subvieneto

peptidilo transferazę Cikloheksimidas Inhibuoja eukariotų didžiojo ribosomos subvieneto

peptidilo transferazę Eritromicinas Inhibuoja translokaciją prokariotų didžiajame subvienete Fusido rūgštis Inhibuoja prokariotuose elongaciją susijungdamas su EF-

G*GDP ir neleisdamas jam disocijuoti nuo di=iojo subvieneto

Puromicinas Yra aminoacil-tRNR analogas, prokariotuose ir eukariotuose sukelia priešlaikinę grandin÷s sintez÷s terminaciją

Streptomicinas Inhibuoja prokariotuose grandin÷s iniciaciją ir sukelia iRNR klaidingą skaitymąmisreading

Tetraciklinas Inhibuoja aminoacil-tRNR susirišimą su prokariotų ribosomų mažuoju subvienetu

Difterijos toksinas ADP-ribozilina eEF-2 ir jį katalitiškai inaktyvuoja Ricinas/abrinas Nuodingas augalų baltymas, katalitiškai inhibuoja

eukariotų ribosomų didįjį subvienetą Streptomicinas, atrastas 1944m Vaksmano (S.Waksman) yra vienas iš labai svarbių

aminoglikozidų atstovų, inhibuojantis prokariotų ribosomas. Paveikus mažomis koncentracijomis ribosoma pradeda neteisingai nuskaityti iRNR. Vienas pirimidinas gali būti pakeistas kitu pirmoje ar antroje kodono pozicijoje, ir bet kuris pirimidinas gali būti pakeistas adeninu pirmoje pozicijoje. Jis sumažina jautrių streptomicinui ląstelių augimą, tačiau jos nežūsta. Didesn÷s koncentracijos sustabdo iniciaciją ir ląstel÷s žūna.

Streptomicinui atsparių kamienų ribosomose yra pažeistas baltymas S12. Atsparumą streptomicinui suteikia baz÷s C912 pakeitimas 16S ribosomin÷je RNR.

Chloramfenikolis. Buvo pirmas plataus spektro antibiotikas, inhiuojantis peptidilo transferazinį aktyvumą prokariotų ribosomų didžiajame subvienete. Jo panaudojimas klinikoje yra apsunkintas, d÷l jo toksiško pašalinio poveikio į organizmo mitochondrijų ribosomas. Chloramfenikolis jungiasi su 50S ribosomų subvieneto L16 baltymu. Chloramfenikolį suriša ir 23S rRNR. Chloramfenikolis inhibuoja peptidilo pernešimą konkuruodamas su ribosomose A srityje surišama aminoacil-tRNR.

Comment [JK18]: ka daro

Comment [JK19]:

Comment [JK20]: pasitikslinti

506

Tetraciklinas ir jo dariniai yra plataus spektro antibiotikai, jie susiriša su prokariotų ribosomų A sritimi ir slopina aminoacil-tRNR surišimą.

507

CH3

O

CHOH

CH3

CH2

NH

OOOH O OH O

OHOHCH3

N(CH3)2

OHO

NH2

CH3CH3

CH3

H

OHCH3

H

CH3

OH H

COOH

CH3

O

NH

O2N

O

CHCl2

HH

OH CH2OH

CH3O

O

O

CH3CH3

CH3OH

OHCH3

OH

OCH3

HH

HH

N(CH3)2

OH

HH

O

OH

CH3

OH

HCH3 H

HH

O

OMe OH

CH2OHOH

HOH

H

HH

OH

CH3

H

O

HH

CHO

H

OHNH

HOH

H

H

OH

O

H

NH

NH2

NH2

NH2

NH2

Cikloheksimidas Tetraciklinas

C

OCH3C

Fusido rūgštis

C C C

Chloramfenikolis

Eritromicinas

C

C

+

+

H3CNH

Streptomicinas

20.11 pav. Antibiotikai inhibuojantys tarnsliaciją Tetraciklinas blokuoja stringent, atsaką inhibuodamas ppGpp sintezę. Tai rodo, kad

deacilinta tRNR turi susirišti su A sritimi ir aktyvuoti stringant faktorių. Atsparumas tetraciklinui Comment [JK21]: kas tai

508

yra labai paplitęs ir sukelia rimtas klinikines problemas. Dažniausiai atsparumas tetraciklinui susijęs ne su ribosomu komponentų pažaidomis, bet su sumaž÷jusiu bakterijų membranų pralaidumu tetraciklinui.

Difterijos toksinas. Difteriją sukelia bakterijų Corynebacterium diphtheriae infekcija. Nors bakterin÷ infekcija apsiriboja viršutiniais kv÷pavimo takais, tačiau bakterijos sekretuoja baltymą difterijos toksiną, kuris atsakingas už ligos letalinę pabaigą. Difterijos toksinas specifiškai inaktyvuoja eukariotų elongacijos faktorių eEF-2, ir inhibuoja eukariotų baltymų biosintezę. Difterijos toksinas yra monomerinis 535 aminorūgščių baltymas, kuris tripsino ir trisinui panašių fermentų skaidomas po Arg 190, 192 ir 193 liekanų. Hidroliz÷ vyksta difterijos toksinui susidūrus su taikinio ląstele, susidaro du polipeptidiniai fragmentai A ir B, kurie lieka tarpusavyje susijungę disulfidiniais ryšiais. B fragmentas susiriša taikinio ląstel÷s plazmin÷s membranos specifiniu receptoriumi ir A fragmentas endocitoz÷s būdu pereina į citozolį. Viduje ląstel÷s suyra disulfidinis ryšys tarp A ir B fragmentų.

Citozolyje, A fragmentas katalizuoja eEF-2 ADP-ribozilinim ą ir jo inaktyvaciją.

eEF-2 + NAD+

Difterijostoksinas

ADP-ribozil-eEF-2 + Nikotinamidas + H+

(aktyvus)

(neaktyvus) Toksino A fragmentas veikai katalitiškai, viena baltymo molekul÷ gali ADP-ribozilinti

visus ląstel÷s eEF-2, sustabdyti baltymo biosintezę ir užmušti ląstelę. Kelių g difterijos toksino užtenka užmušti organizmą.

Difterijos toksinas specifiškai ADP-ribozilina eEF-2 faktoriaus modifikuotą histidino – diftamidą.

O

ADP O CH2 O

H

OH

H

OH

HH

CH

NH

CH2

N

N

CH2

CH2

CH

N(CH3)3

O

NH2

C

+

C

ADP-ribozilintas diftamidas

ADP-ribozilo grup÷

Diftamidas randamas tiktai eukariotų elongacijos faktoriuje eEF-2, tai suteikia difterijos

toksinui specifiškumą.

509

SANTRAUKA Nukleorūgštys yra polimerai sudaryti iš mononukleotidų sujungtų 3/,5/-fosfodiesteriniais

ryšiais. Nukleotidai yra nukleozidų fosfatai DNR sudaryta iš dviejų antilygiagrečių polinukleotidinių grandinių susisukusių į dvigubą

spiralę. Heterociklin÷s baz÷s adeninas ir timinas vienoje grandin÷je poruojami atitinkamai su guaninu ir citozinu kitoje grandin÷je.

Dviguba DNR spiral÷ stabilizuojama vandeniliniais ryšiais, hidrofobin÷ sąveika, „stekingo“ sąveika, baltymais, katijonai. Dažniausiai sutinkama B-DNR, alternatyvios konformacijos yra A-DNR ir Z-DNR.

Pagrindin÷s RNR klas÷s yra ribosomin÷ RNR, transportin÷ RNR, informacin÷ RNR. RNR sudaryta iš vienos polinukleotidin÷s grandin÷s, kurios fragmentai susisuka ir susidaro spiraliniai segmentai.