I FARMACI ANTIMICROBICI:

C.d.L. in Tecniche di Fisiopatologia

Cardiocircolatoria e Perfusione Cardiovascolare

Università “G. d‟Annunzio” di Chieti-Pescara

Anno Accademico 2011-2012 Dott.ssa Arianna POMPILIO

La storia degli antibiotici ha inizio nel 1928, quando Fleming, studiando varianti dello stafilococco, osservò che una muffa che contaminava una delle sue culture aveva inibito intorno a sé la crescita dello stafilococco.

Inoltre, Fleming potè osservare che il brodo di coltura in cui erano cresciuti i funghi possedeva un potente effetto inibitorio nei confronti di molti microrganismi. Poiché la muffa apparteneva al genere Penicillum, Fleming chiamò questa sostanza antibatterica PENICILLINA

AGENTE ANTIBATTERICO

Composto in grado di interferire con la crescita e la moltiplicazione batterica; contrariamente al disinfettante, è attivo solo verso batteri metabolicamente attivi.

ANTIBIOTICO

Molecola naturale a basso P.M., prodotta dal metabolismo di un microrganismo: Actinomiceti (Streptomyces), Miceti (Penicillium, Cephalosporium), in grado di inibire la crescita di altri microrganismi e/o causarne la distruzione.

CHEMIOTERAPICO Farmaco ad attività antibatterica prodotto per sintesi chimica (analogo strutturale di un antibiotico)

TOSSICITA’ SELETTIVA

SCARSA o NULLA ATTIVITA’ sulla FLORA COMMENSALE e sui MECCANISMI di DIFESA dell’OSPITE

ASSENZA di EFFETTI COLLATERALI e/o SISTEMICI

ASSENZA di RESISTENZE nella POPOLAZIONE MICROBICA

ADEGUATA ATTIVITA’ ANTIMICROBICA

ATTIVO a BASSE CONCENTRAZIONI

STABILE, ECONOMICO, facilmente SOMMINISTRABILE

RAGGIUNGE ADEGUATE CONCENTRAZIONI TISSUTALI

La chemioterapia antibatterica si basa sul principio della TOSSICITÀ SELETTIVA, formulato per la prima volta da Paul Ehrlich, in base al quale una sostanza può essere utilizzata nella terapia di una malattia infettiva solo se è nociva per il microrganismo e relativamente innocua per le cellule dell‟ospite.

Paul Ehrlich

ANTIBIOTICI

SELETTIVI

ANTIBIOTICI non

SELETTIVI

Agiscono solo su strutture e vie metaboliche peculiari dei batteri (es: parete cellulare, DNA girasi e topoisomerasi IV)

Agiscono con meccanismi diversi verso strutture e meccanismi non esclusivi dei batteri

Impossibili gli effetti sulle cellule dell’ospite

Potenziali effetti dannosi

Penicilline, Cefalosporine, Monobattami, Penemici, Carbapenemici. Fosfomicina, Glicopeptidi, Daptomicina.

Aminoglucosidi, Macrolidi, Lincosamidi, Linezolid, Tetracicline, Cloramfenicolo, Metronidazolo, Rifamicine,Sulfamidici,TrimetoprimTigeciclina

Esistono diversi sistemi di classificazione degli antibiotici, in considerazione del notevole numero di molecole utilizzate nella pratica clinica. In particolare, la classificazione può essere fatta:

1. In FAMIGLIE

Molecole che presentano caratteristiche simili (es. PENICILLINE,

CEFALOSPORINE,AMINOGLICOSIDI, TETRACICLINE, ecc)

2. Secondo l‟ORIGINE

ESTRATTIVA: da batteri e funghi (Penicillium, Cephalosporium, Streptomyces)

SEMISINTETICA: partendo da una struttura base, ottenuta per

fermentazione ed aggiungendo catene di sintesi.

SINTESI CHIMICA: molti composti si ottengono per sintesi chimica

(chinoloni, monobattami,cloramfenicolo, ecc)

3. Secondo lo SPETTRO d’AZIONE

Per spettro d‟azione si intende il ventaglio delle specie batteriche nei

riguardi delle quali l‟antibiotico mostra attività

• AMPIO SPETTRO: Gram-positivi e Gram-negativi (es. tetracicline)

• SPETTRO RISTRETTO: attivo soltanto su una limitata varietà di

microrganismi (es. penicillina)

4. Secondo il TIPO d’AZIONE (natura dell‟inibizione)

F. BATTERIOSTATICO: inibisce la crescita del microrganismo,

consentendo lo sviluppo della risposta immunitaria anticorpale

F. BATTERICIDA: provoca la morte dell‟agente infettivo

5. In base al MECCANISMO d’AZIONE

1. INIBIZIONE della SINTESI della PARETE CELLULARE

2. ALTERAZIONE della MEMBRANA CITOPLASMATICA

3. INIBIZIONE della SINTESI PROTEICA

4. INIBIZIONE della SINTESI degli ACIDI NUCLEICI

5. ANTIMETABOLITI

Agiscono bloccando gli enzimi che regolano la sintesi di peptidoglicano con conseguente lisi cellulare. BATTERICIDI, l‟inibizione si può verificare:

• nella 1° FASE di SINTESI (es: FOSFOMICINA inibisce la fosfoenolpiruvato transferasi o CICLOSERINA per mancata utilizzazione della alanina)

• nella 2° FASE di SINTESI (es: BACITACINA agisce mediante trasferimento e polimerizzazione del mucopeptide parietale)

• A LIVELLO TERMINALE (es: VANCOMICINA, PENICILLINE e CEFALOSPORINE agiscono nella fase di transpeptidazione)

1. INIBIZIONE della SINTESI della PARETE CELLULARE

Si tratta di farmaci BATTERICIDI.

Provocano alterazioni della membrana citoplasmatica con perdita della permeabilità con meccanismo d‟azione poco selettivo . Ciò spiega la tossicità di questi farmaci e l‟uso limitato (es: POLIMIXINA, COLISTINA, DAPTOMICINA)

2. ALTERAZIONE della MEMBRANA CITOPLASMATICA

Agiscono a livello ribosomiale e l‟inibizione si può verificare:

• A livello della SUBUNITA’ RIBOSOMIALE 30S (es: AMINOGLICOSIDI, TETRACICLINE)

• A livello della SUBUNITA’ RIBOSOMIALE 50S (es: CLORAMFENICOLO, MACROLIDI)

• Attività BATTERICIDA, azione selettiva dovuta al fatto che i ribosomi delle cellule eucariote sono costituiti da subunità 60S e 40S. Per agire devono penetrare nella cellula.

3. INIBIZIONE della SINTESI PROTEICA

Si tratta di farmaci BATTERICIDI. Agiscono inattivando gli enzimi con un meccanismo d‟azione non selettivo eccetto per i chinoloni:

• INIBIZIONE della RNA-polimerasi (es: RIFAMICINE)

• INIBIZIONE della DNA-girasi o topoisomerasi (es: CHINOLONI)

4. INIBIZIONE della SINTESI degli ACIDI NUCLEICI

Si tratta di farmaci BATTERIOSTATICI.

• Agiscono inibendo la sintesi dell‟ ACIDO FOLICO

• (es: SULFAMIDICI, TRIMETHOPRIM)

5. ANTIMETABOLITI

BATTERICIDI BATTERIOSTATICI NOTE

Penicilline Tetracicline Alcuni batteriostatici possono essere battericidi in vitro ad elevate concentrazioni che sono però irraggiungibili in vivo. COTRIMOSSAZOLO è battericida anche se trimethoprim e sulfametossazolo impiegati separatamente sono batteriostatici

Cefalosporine Cloramfenicolo

Monobattami Macrolidi

Penemici Lincosamidi

Carbapenemici Acido fusidico

Aminoglucosidi Sulfamidici

Chinoloni Trimetoprim

Glicopeptidi Linezolid

Rifamicine Tigeciclina

Fosfomicina

Cotrimossazolo

Colistina

Metronidazolo

Daptomicina

BERSAGLI DEGLI ANTIBIOTICI

PABA

DHF

THF

METABOLISMO ACIDO FOLICO

SULFAMIDICI TRIMETOPRIM

SINTESI PARETE

CICLOSERINE FOSFOMICINA GLICOPEPTIDI BACITRACINA PENICILLINE

CEFALOSPORINE MONOBATTAMI CARBAPENEMI

50 30

50 30

50 30

DNA GIRASI

TOPOISOMERASI CHINOLONI

RNA POLIMERASI RIFAMPICINA

SINTESI PROTEICA Inibitori 30S

TETRACICLINE SPECTINOMICINA STREPTOMICINA

AMINOGLICOSIDI NITROFURANI

SINTESI PROTEICA Inibitori 50S MACROLIDI

CLORAMFENICOLO LINCOSAMIDI

SINTESI PROTEICA tRNA

MUPIROCINA PUROMICINA

mRNA DNA

MEMBRANA POLIMIXINE

DNA POLIMERASI NOVOBIOCINA

Poiché il peptidoglicano della parete cellulare batterica non è presente nelle cellule umane, esso rappresenta un bersaglio ideale per l‟antibiotico terapia.

La sintesi del peptidoglicano può essere suddivisa in 3 tappe:

SINTESI DEI PRECURSORI NEL CITOPLASMA

• D-cicloserina

• Fosfomicina

TRASPORTO DEI PRECURSORI ATTRAVERSO LA MEMBRANA

CITOPLASMATICA

• Bacitracina

INSERIMENTO DEI PRECURSORI NELLA PARETE CELLULARE

• Vancomicina, ristocetina

• Antibiotici β-lattamici

La prima tappa avviene nel citoplasma, dove vengono sintetizzate le unità fondamentali della struttura portante del peptidoglicano NAG e NAM.

La D-CICLOSERINA è un analogo strutturale della D-alanina. Essa inibisce in maniera competitiva due enzimi coinvolti nella formazione del dipeptide D-alanil-D-alanina: la racemasi che converte la L-alanina nel suo stereoisomero D, e la sintetasi che catalizza la formazione del legame peptidico tra le due molecole D-alanina

La FOSFOMICINA è un analogo strutturale del fosfo-enolpiruvato. Impedisce la sintesi dell‟acido N-acetil-muramico, legandosi covalentemente al sito attivo dell‟enzima piruvato-UDP-NAG trasferasi.

fosfomicina

Struttura chimica della D-cicloserina e dell’analogo

D-alanina

La stabile struttura dell‟anello favorisce il legame alla racemasi e alla sintetasi, preferenzialmente rispetto ai substrati naturali. Ciò risulta in una inibizione competitiva di questi enzimi. La cicloserina è neurotossica e non viene usata clinicamente, eccetto per il trattamento delle infezioni da Mycobacterium tuberculosis resistenti agli altri farmaci.

La cicloserina è una molecola ciclica

Struttura chimica della fosfomicina

La reazione di condensazione tra UDP-N-acetilglucosamina e fosfoenolpiruvato negli stadi iniziali della sintesi del peptidoglicano rappresenta il target d‟azione della fosfomicina. La rapida insorgenza di resistenza la rendono praticamente inutile in clinica.

La seconda tappa della sintesi del peptidoglicano avviene sulla superficie interna della membrana citoplasmatica dove l‟ N-acetilmuramilpeptide viene legato da un trasportatore lipidico che trasloca la subunità completa all‟esterno della membrana citoplasmatica

La BACITRACINA inibisce la defosforilazione del trasportatore lipidico legandosi al bactoprenolo-difosfato e bloccando la rigenerazione del bactoprenolo-monofosfato. E‟ un polipeptide ciclico tossico per l‟uso clinico umano. Viene usato per trattamenti topici e come additivo alimentare per ruminanti al fine di ridurre la produzione di metanolo nel rumine.

La terza tappa avviene nel contesto del peptidoglicano e nello spazio periplasmico (Gram-), dove l‟unità basale, liberata dal legame del trasportatore lipidico, si unisce all‟ estremità in accrescimento di una catena di peptidoglicano (transpeptidazione). Molti antibiotici agiscono su questa tappa.

La VANCOMICINA e la RISTOCETINA sono glicopeptidi che si legano all‟estremità D-alanina-D-alanina del pentapeptide legato al bactoprenolo ed impediscono l‟azione della transpeptidasi sequestrandone il substrato.

PENICILLINE

CEFALOSPORINE

ALTRI -LATTAMICI:

• Acido clavulanico, tienamicina, sulbactam

• Moxalactam

• Monobattamici (aztreonam)

Gli antibiotici β-lattamici sono analoghi strutturali del dipeptide D-alanina-D-alanina che devono la loro azione antibatterica proprio alla capacità di legarsi ad una serie di enzimi che catalizzano le operazioni terminali di polimerizzazione, transpeptidazione ed inserimento delle unità peptidoglicaniche nella parete cellulare, inibendo quindi la sintesi del peptidoglicano stesso.

Gli antimicrobici più comuni sono i -lattamici, accomunati dalla presenza di un anello tetratomico azetidinico -lattamico:

L‟evento finale dell‟azione degli antibiotici β-lattamici è la lisi della cellula batterica.

Target principale: PARETE CELLULARE BATTERICA (tox selettiva)

ATTIVITÀ BATTERICIDA SU CELLULE IN ATTIVA DIVISIONE

INIBISCONO LA FASE FINALE DI POLIMERIZZAZIONE

• Arresto della crescita

FORMAZIONE dello SFEROPLASTO e LISI CELLULARE:

• Produzione di peptidoglicano “lasso”

• Induzione di enzimi endogeni batterici (mureina-idrolasi)

Spazio Periplasmico

PBP

GRAM +

PORINA

GRAM -

LPS

Interazione con proteine enzimatiche responsabili del processamento terminale

del peptidoglicano (transpeptidasi, endopeptidasi e carbossipeptidasi) dette

“PENICILLIN BINDING PROTEINS” PBP a livello della m. citoplasmatica

Possono essere classificate in:

Prodotte da Penicillium chrysogenum

Nucleo fondamentale: acido 6-amino-penicillanico

•Benzil-penicillina (penicillina G) • attiva verso cocchi Gram+ e Gram-

NATURALI

•Meticillina/oxacillina • resistenti a β-lattamasi

• Ampicillina/amoxicillina (ad ampio spettro)

• Carbenicillina/ticarcillina/piperacillina (attive su specie resistenti alle altre penicilline)

SEMI-SINTETICHE

Possono essere classificate in:

Si differenziano dalle penicilline per uno spettro d‟azione esteso ai Gram-negativi (capacità di penetrare la m. esterna) e per la resistenza nei confronti di alcune -lattamasi

• Cefalosporina C (prodotta dal fungo marino Cephalosporium achremonium)

NATURALI

•I GENERAZIONE (cefazolina): attive vs Gram+ •II GENERAZIONE (cefuroxime): attive vs Gram- •III GENERAZIONE (cefotaxime): ampio spettro (Gram+ e Gram-) •IV GENERAZIONE (cefepime): ampio spettro

SEMI-SINTETICHE

CEFAMICINE Naturali: prodotte da streptomiceti, esteso spettro d‟azione (soprattutto vs anaerobi)

PENICILLINE

• Generalmente attive su Gram + aerobi ed anaerobi:

• Batteriemia, setticemia, faringite, otite media (S. aureus ed epidermidis)

• Meningite, polmonite (S. pneumoniae)

• Attive su alcuni Gram -:

• UTI ( Proteus, E. coli)

• Gastroenteriti (Salmonella, Shigella)

CEFALOSPORINE

• Spettro esteso anche ai Gram -:

• Meningiti (Haemophilus influenzae tipo B, S. pneumoniae, Neisseria meningitidis)

• Resistenza alle β-lattamasi attive sulle penicilline

• Maggiore penetrazione attraverso la membrana esterna

H2N

N

S

COOH O

CH3

CH3

a. 6-aminopenicillanico

H2N

O

S

COOH

CH2O CO CH3

a. 7-aminocefalosporanico

Le β-lattamasi sono enzimi in grado di DEGRADARE gli antibiotici β-lattamici

C

HC CH

N O

anello -lattamico

La loro produzione, ampiamente diffusa nel mondo microbico, rappresenta il principale meccanismo con cui i batteri si difendono da questi antibiotici.

L‟inattivazione dei -lattamici da parte delle -lattamasi è dovuta all’idrolisi dell’anello -lattamico (il legame CO=N è spezzato dall‟enzima con conseguente produzione di A. penicilloico inattivo).

Le -lattamasi sono enzimi secreti che svolgono la loro funzione all‟esterno della membrana plasmatica.

La specificità di substrato di alcuni di questi enzimi è relativamente ristretta, per questo motivo alcuni di questi enzimi sono spesso definiti penicillinasi o cefalosporinasi.

La produzione di -lattamasi è in alcuni casi costitutiva mentre in altri risulta indotta in presenza di certi substrati -lattamici.

ACIDO CLAVULANICO, SULBACTAM

• Derivato strutturale dell‟acido 6-amino-penicillanico (sostituzione dello S con O).

• Modesta azione antibatterica ma notevole potere inibente su numerose -lattamasi

• Azione protettiva nei confronti delle -lattamasi (in combinazione con penicilline)

MONOBATTAMICI (aztreonam)

• Antibiotici monociclici prodotti da Chromobacterium violaceum.

• Rilevante attività vs Gram-negativi (anaerobi esclusi), spiccata resistenza alle -lattamasi.

R-CO-NH

N O

SO2H

R2

MONOBATTAMI (solo Gram-)

sulbactam

Alcune molecole sono in grado di legarsi alle β-lattamasi inattivandole e prevenendo, così la distruzione degli antibiotici β-lattamici.

• Gruppo di antibiotici formati da polipeptidi ciclici , legati ad un polipeptide

lineare terminante con un acido grasso. Prodotti da Bacillus polymyxa. • Attivi solo nei confronti dei Gram- alla cui m. esterna si legano

specificamente (fosfolipidi) distruggendone le proprietà osmotiche , alterandone la permeabilità e provocando la fuoriuscita di metaboliti intracellulari.

MECCANISMO D’AZIONE: • Sono detergenti cationici, agiscono in maniera analoga ai disinfettanti,

rimpiazzando competitivamente gli ioni Mg2+ e Ca2+ dei gruppi fosfato delle m. lipidiche provocando la distruzione delle membrane.

• Sono attive anche nei confronti di batteri non metabolizzanti. • Sono tossiche anche per le cellule eucariotiche (trattamenti topici).

POLIMIXINE (Polimixina B, Colistina)

La selettività dell‟azione di questi antibiotici risiede nelle sostanziali differenze esistenti tra i ribosomi procariotici ed eucariotici e nel processo di sintesi proteica

Poiché i ribosomi batterici sono significativamente diversi dai ribosomi delle cellule eucariotiche, tutti gli antibiotici che interagiscono con le subunità ribosomiali sono abbastanza selettivi per poter essere impiegati nella terapia antibatterica.

Possono essere classificate in:

Prodotte da Streptomyces, Micromonospora

Streptomicina, Neomicina, Kanamicina, Gentamicina, Tobramicina, Sisomicina

NATURALI

•Amikacina, netilmicina

SEMI-SINTETICI

SPETTRO d’AZIONE ESTESO: • Inattivi nei confronti degli anaerobi Gram+ e Gram- (infezioni gravi da P. aeruginosa, Enterobacter spp) TOSSICITA’: • Nefrotossicità • Ototossicità • Blocco neuromuscolare

Streptomicina

mRNA AAA AAA

PROTEINE ALTERATE NELLA MEMBRANA CAUSANO AUMENTATO AFFLUSSO DELL’ANTIBIOTICO

50 30

50 30

50 30

UNA PICCOLA %

ENTRA NELLA CELLULA

BLOCCO DELLA SINTESI PROTEICA E BATTERICIDIA

1. Penetrazione dell’ANTIBIOTICO nella cellula dove si lega irreversibilmente alla subunità 30S, con formazione di un prodotto proteico “anomalo” (non funzionale)

2. Parte della proteina “anomala” viene inserita a membrana generando dei pori che favoriscono l’ingresso di ulteriori quantità di antibiotico

3. Elevate concentrazioni dell’antibiotico impediscono il legame all’m-RNA di tutti i ribosomi, causando il blocco di sintesi proteica

4. Induzione di errori nella lettura dei codoni di RNA-m

Gruppo di antibiotici prodotti da Streptomyces spp, caratterizzati da una struttura molecolare tetraciclica.

SPETTRO d’AZIONE ESTESO: • Gram+ (acne), Gram- (infezioni vie aeree) • Ricketsie (trattamento di elezione) • Clamidie (trattamento di elezione) • Spirochete ed alcuni protozoi

TOSSICITA’: • Superinfezioni (eliminazione flora commensale) • Colorazione dei denti in via di sviluppo Struttura base delle Tetracicline

MECCANISMO d’AZIONE

Attività batteriostatica • Blocco della sintesi proteica in una fase molto iniziale: si legano reversibilmente alla subunità 30S inibendo l‟attacco dell‟aminoacil-tRNA a livello del codone di inizio e bloccando la formazione del polisoma.

=

=

OH

OH OH OH

O O

CONH2

N(CH3)2 R1 R4 R3 R2

• Gruppo di antibiotici caratterizzati da un nucleo lattonico macrociclico,

prodotti da Streptomyces.

MECCANISMO D’AZIONE: attività batteriostatica • Inibiscono la sintesi proteica legandosi reversibilmente alla subunità 50S

ed inibendo la traslocazione SPETTRO d’AZIONE: • Poco più ampio di quello delle penicilline

(include anche alcuni gram-) • Infezioni da patogeni intracellulari:

• Chlamydia • Campylobacter • Mycobacterium spp.

• Polmonite da Mycoplasma pneumoniae • Legionellosi

MACROLIDI (Eritromicina, Claritromicina, roxitromicina, azitomicina..)

Eritomicina

Cloramfenicolo

• Prodotto da Streptomyces venezuelae.

MECCANISMO D’AZIONE: attività batteriostatica • Blocca la reazione di transpeptidazione e di allungamento

della catena polipeptidica (impedisce il legame tra l‟aminoacil-tRNA e il ribosoma). Conseguentemente, si assiste al blocco della sintesi proteica.

SPETTRO d’AZIONE ESTESO: • Gram+ e Gram- (da utilizzare solo in infezioni gravi) TOSSICITA’ • Effetti secondari negativi a livello del sistema ematopoietico

CLORAMFENICOLO

LINCOSAMIDI • clindamicina • lincomicina

Antibiotici batteriostatici con un meccanismo e spettro d‟azione simile ai macrolidi, pur avendo una struttura chimica diversa. Clindamicina è particolarmente attiva vs gli anaerobi obbligati.

• Composti di sintesi aventi come struttura base la 4-oxo-1,4 diidrochinolina

MECCANISMO D’AZIONE: attività battericida • Agiscono bloccando la subunità A della DNA-girasi (enzima responsabile

della despiralizzazione del DNA, necessaria per la sua replicazione e trascrizione). L‟inattivazione dell‟enzima è seguita dal blocco della neosintesi del DNA e morte del batterio.

SPETTRO d’AZIONE ESTESO: • Cocchi Gram+ ed infezioni delle vie urinarie TOSSICITA’ SELETTIVA • Differente struttura enzimatica tra procarioti ed eucarioti

CHINOLONI (a. nalidixico, ofloxacina, ciprofloxacina, levofloxacina, a. pipemidico…)

Il gruppo più importante di antibiotici che agiscono bloccando la sintesi del DNA è quello dei chinoloni.

Chinoloni

• Derivato semi-sintetico

MECCANISMO D’AZIONE: • Agisce legandosi direttamente alla subunità β dell‟RNA polimerasi batterica

che rende non funzionale. SPETTRO d’AZIONE: attività battericida • Gram+ e Gram- ed in particolare nei confronti del micobatterio tubercolare

per le cui infezioni rappresenta uno dei farmaci di elezione. TOSSICITA’ SELETTIVA • differenze nella struttura della RNA-polimerasi batterica rispetto a quella

eucariotica

RIFAMPICINA

Le rifamicine sono un gruppo di antibiotici isolati in Italia, dalle colture di Nocardia mediterranea

Rifampicina

Prodotti chimici di sintesi strutturalmente simili a metaboliti essenziali dei batteri : una volta assorbiti bloccano importanti processi biosintetici.

MECCANISMO D’AZIONE: • Agiscono come analoghi strutturali dell‟acido p-aminobenzoico (PABA).

Competono con il PABA legandosi al sito attivo dell‟enzima DHPS (diidropteroatosintetasi) bloccando la sintesi dell‟acido folico (coenzima essenziale per la moltiplicazione batterica), precursore degli a. nucleici.

SPETTRO d’AZIONE ESTESO: attività batteriostatica • Gram+ e Gram-; usati primariamente nelle UTI e nelle infezioni da Nocardia TOSSICITA’ SELETTIVA • via biosintetica dei folati presente nei soli batteri che sono in grado di

sintetizzare acido folico, ma non contro gli organismi superiori, che devono procurarselo con la dieta.

SULFAMIDICI

I sulfamidici sono stati i primi chemioterapici usati per inibire la crescita batterica. Il sulfamidico più semplice è la sulfanilamide ma vi sono numerosi derivati sintetici ottenuti mediante sostituzioni

Sulfanilamide

• Analogo dell‟ acido diidrofolico MECCANISMO D’AZIONE: • Agisce legandosi all‟enzima diidrofolato riduttasi (DHFR), catalizzante la

reazione che trasforma il diidrofolato in tetraidrofolato, cofattore richiesto per la sintesi delle purine, della timina, e di alcuni aminoacidi.

SPETTRO d’AZIONE ESTESO: attività batteriostatica • Gram+ e Gram-; usati primariamente nelle UTI e nelle infezioni da Nocardia TOSSICITA’ SELETTIVA • Via metabolica comune sia ai procarioti che eucarioti, tuttavia l‟enzima

batterico mostra maggiore affinità per il trimethoprim. TERAPIA COMBINATORIA (Trimethoprim-sulfametossazolo) • Usato in combinazione con il sulfametossazolo inibisce due fasi metaboliche

sequenziali della sintesi di acido tetraidrofolico: il sulfametossazolo si sostituisce al PABA nell‟acido folico, il trimethoprim impedisce la formazione di acido tetraidrofolico, prevenendo l‟emergenza di ceppi resistenti.

TRIMETHOPRIM Trimethoprim

LA VALUTAZIONE DELL’ANTIBIOTICO-RESISTENZA:

C.d.L. in Tecniche di Fisiopatologia

Cardiocircolatoria e Perfusione Cardiovascolare

Università “G. d‟Annunzio” di Chieti-Pescara

Anno Accademico 2011-2012 Dott.ssa Arianna POMPILIO

Uno stipite batterico è resistente ad un farmaco quando:

è in grado di moltiplicarsi in presenza di concentrazioni di farmaco che risultano inibitorie per la massima parte degli stipiti della stessa specie

è in grado di moltiplicarsi in presenza di concentrazioni del farmaco pari a quelle massime raggiungibili nel corso dell‟impiego terapeutico.

L‟antibiotico resistenza è una proprietà geneticamente trasmissibile del microrganismo. Essa può essere:

NATURALE o INTRINSECA

ACQUISITA

Condizione di generale insensibilità ad un farmaco che si estende a tutti gli stipiti di una data specie. Al microrganismo può mancare la

struttura su cui agisce l‟antibiotico (es: Gram – vs penicilline; Clamidie e Micoplasmi sono privi della parete cellulare e quindi insensibili ai β-lattamici)

La struttura della parete cellulare o la membrana citoplasmatica di un microrganismo possono essere impermeabili ad un antibiotico.

Generalmente selezionata da una precedente esposizione del patogeno all'antibiotico. Si attua secondo diversi meccanismi di cui i principali sono: modifica del target batterico produzione da parte del

batterio di enzimi inattivanti l’antibiotico

ridotta permeabilità all'antibiotico

efflusso dell'antibiotico dalla cellula grazie ad un sistema di pompe attive (che richiedono E).

Significato “clinico” della resistenza I ceppi resistenti sopravvivono in presenza di concentrazioni

raggiunte in vivo a livello sierico dall‟antibiotico in seguito a somministrazione di normali dosi terapeutiche. La resistenza predice il possibile fallimento della terapia antibiotica.

Antibiotico-resistenza: il “problema” medico Meticillino-resistenza negli stafilococchi (100.000 decessi/anno

negli USA)

Circa il 50% delle infezioni nosocomiali è resistente ad almeno 1 antibiotico

Esito infausto per il 90% dei pazienti affetti da tubercolosi multi-resistente

L‟abuso (uso non corretto) ha aumentato l‟incidenza e la selezione delle mutazioni inducenti resistenza:

Profilassi in chirurgia

Uso empirico (agente eziologico ignoto)

Aumentato uso di antibiotici a spettro esteso

Antibiotici (probiotici) nei mangimi animali

Uso pediatrico per infezioni virali

Scarsa compliance del paziente

Ogni antibiotico o chemioterapico possiede uno spettro d‟azione antibatterico in base al quale è possibile prevedere in quali infezioni il suo impiego può essere efficace. Questa previsione, naturalmente, è possibile

automaticamente solo nel caso di infezioni sostenute da batteri uniformemente e costantemente sensibili a determinati antibiotici (Haemophilus influenzae, Salmonella, spirochete…)

L‟esame batteriologico consente l‟identificazione dell‟agente etiologico, così permettendo la scelta del

farmaco antibatterico adatto.

Quando invece l‟esame batteriologico mette in evidenza la presenza di: specie batteriche che sappiamo costituite da

stipiti diversamente sensibili ai vari medicamenti (Pseudomonas, streptococchi viridanti, enterococchi, enterobatteri del gruppo dei coliformi o dei Proteus)

specie che facilmente danno luogo alla comparsa di MUTANTI antibiotico-resistenti (stafilococchi, micobatteri)

è necessario completare l‟identificazione dei batteri presenti in un dato materiale con lo studio della loro SENSIBILITA’ ai diversi antibiotici.

L’ANTIBIOGRAMMA è il test impiegato per determinare l’efficacia antimicrobica di un farmaco nei confronti di specifici patogeni.

E‟ uno dei test più importanti che viene comunemente eseguito nel laboratorio di microbiologia clinica a causa delle sue implicazioni terapeutiche immediate.

Nella pratica clinica questo tipo di test, essenziale

per una corretta terapia, permette di:

1) evidenziare quali siano i farmaci più efficaci nei

confronti di un certo microrganismo patogeno

2) fornisce una stima della dose terapeutica più

opportuna per la cura della malattia infettiva.

• Vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un microrganismo isolato nei confronti di uno o più antibiotici.

• Sono eseguiti in condizioni standardizzate (la realizzazione tecnica deve rispondere a criteri perfettamente standardizzati periodicamente aggiornati da diversi comitati Nazionali, CLSI ecc.) per garantirne la riproducibilità dei risultati.

• I risultati di questi tests debbono essere usati per guidare la scelta dell‟antibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e l‟esperienza professionale.

Obiettivo dei tests per la determinazione della antibiotico-S è: predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica.

ISOLARE il MICRORGANISMO RESPONSABILE dell’INFEZIONE

IDENTIFICARE IL MICRORGANISMO a LIVELLO di SPECIE

SELEZIONARE un’APPROPRIATA

BATTERIA di ANTIBIOTICI da

SAGGIARE

ESPRIMERE la SENSIBILITA’

BATTERICA secondo i CRITERI ORIENTATI

alla TERAPIA

Un antibiogramma è INUTILE

• Quando il microrganismo isolato non può essere ragionevolmente considerato responsabile di una infezione nel sito in cui il campione è stato prelevato (FLORA COMMENSALE o CONTAMINANTE: Streptococchi orali o H. parainfluenzae isolati da

secrezioni bronchiali) o quando il n° di CFU/ml è inferiore alla soglia significativa (nelle urine o nelle secrezioni bronchiali).

• Quando il patogeno isolato appartiene ad una specie che è costantemente SENSIBILE ad un trattamento standard, o per la quale non esiste una correlazione fra l‟attività in vitro ed in vivo.

• In quelle infezioni cutanee dove è indicato un trattamento topico o chirurgico.

Un antibiogramma è UTILE

• EMOCOLTURA: l‟antibiogramma deve essere eseguito tempestivamente nei campioni positivi

• LIQUOR

• TRATTO RESPIRATORIO SUPERIORE ed INFERIORE: espettorato, lavaggio bronco-alveolare (BAL)

• CAMPIONI da OSSA o ARTICOLAZIONI, URINA da CATETERE, FLUIDI da PUNTURA: quando si sospetti un‟eziologia batterica

• INFEZIONI OSPEDALIERE ACCERTATE: anche per obiettivi epidemiologici

Il metodo più corretto per determinare l‟efficacia di un antibiotico nei confronti di un microrganismo consiste nello stabilire, per ogni farmaco antibatterico:

la concentrazione minima inibente (MIC)

la concentrazione minima battericida (MBC).

Questo metodo permette di stabilire una scala di attività dell’antibiotico per

diverse specie batteriche.

MIC

(Minimal Inhibitory Concentration): è una misura quantitativa dell‟attività di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile.

MBC

(Minimal Bactericidal Concentration): è definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica di almeno il 99,9% (1 germe su 1.000 elude

l‟azione antibiotica) della popolazione iniziale.

(Clinical and Laboratory Standard Institute): pubblica i criteri per l‟interpretazione dei risultati dei tests di sensibilità (categorie interpretative).

CLSI

Le categorie interpretative (Sensibilità, Sensibilità Intermedia e Resistenza) sono individuate da valori

di MIC detti BREAKPOINTS (soglia, limite).

I valori standard di sensibilità variano per ciascun microrganismo e sono basati sulla concentrazione plasmatica di farmaco che può essere raggiunta

senza la comparsa di effetti tossici.

I BREAKPOINTS consentono di classificare il microrganismo in:

“S”

• quando l„infezione causata da quel ceppo può essere adeguatamente trattata con il dosaggio di un agente antimicrobico comunemente raccomandato per quel tipo di infezione.

“I”

• quando la crescita batterica è inibita solo al dosaggio massimo raccomandato; gli isolati batterici mostrano MIC corrispondenti a livelli sierici e tessutali di antibiotico per i quali l‟efficacia potrebbe essere più bassa di quella registrata per gli isolati sensibili.

“R”

• questa categoria predice il possibile fallimento dell‟antibiotico testato. L'antibiotico dovrebbe essere utilizzato a dosaggi che risulterebbero tossici nell'organismo in quanto i ceppi non sono inibiti alle concentrazioni sistemiche di antimicrobico raggiungibili di solito con i normali dosaggi.

I breakpoints per la categorizzazione (S, I, R) vengono individuati dalla CLSI

(già NCCLS) e determinati sulla base della:

• FARMACOCINETICA e FARMACODINAMICA degli ANTIBIOTICI (livelli raggiunti in vivo nel sangue e tessuti dall‟antibiotico)

• ATTIVITA’ CLINICA mediante correlazione tra risultati in vitro (MIC) e risultati in vivo (risoluzione del caso clinico).

1.BRODO DILUIZIONE (micro- e macrometodo)

2.DIFFUSIONE IN AGAR (Kirby-Bauer)

Chl Amp

Ery

Str

Tet

Metodi per diffusione

Antibiogramma

MIC = MINIMA CONCENTRAZIONE INIBENTE

8 4 k 2 1

Metodi per diluizione

Determinazione della MIC

Nei test di antibiotico-sensibilità mediante diluizione la sensibilità del microrganismo viene valutata in base alla sua crescita o meno in un terreno di coltura (solido o liquido) contenente diverse concentrazioni dell'antibiotico.

VANTAGGI

Metodo quantitativo (consente di determinare accuratamente oltre alla MIC anche la MBC).

Metodo valido e preciso (RIPRODUCIBILE)

SVANTAGGI

Costoso Laborioso (allestimento pannelli

antibiotizzati), per cui l'impiego è limitato a pochi casi: trattamenti di affezioni molto serie in cui sia necessario valutare la MBC (endocarditi batteriche o osteomieliti); valutazione sensibilità di microrganismi a lenta crescita (micobatteri e actinomiceti)

Preparare una serie di provette

contenenti terreno con diverse

concentrazioni di antibiotico, ed

inocularle con quantità convenzionali

(5 x 105 cfu/ml) dell‟organismo da

testare.

Incubare le provette (37°C, 16-20h)

La MIC è data dalla concentrazione più

bassa di antibiotico che porta ad assenza

di crescita dopo 16-20 ore di

incubazione.

e, quindi, viene valutata

E‟ invece possibile calcolare la

MBC se le provette che non

presentano crescita sono

sottoposte a subcultura in

terreno fresco privo di

antibiotico: la concentrazione

più bassa di antibiotico alla

quale il microrganismo non è in

grado di crescere quando viene

trasferito in terreno fresco

equivale alla MBC.

Le MIC vengono determinate in microtiter 96/wells

fondo ad “U” valutando l‟intorbidimento del brodo o la

formazione di sedimento sul fondo dei pozzetti.

Il micrometodo in pozzetti

è sostanzialmente identico

al metodo delle diluizioni in

provetta.

ANTIBIOTICO S I R

PIPERACILLINA ≤ 16 32-64 ≥ 128

CEFAZOLINA ≤ 8 16 ≥ 32

CEFOTAXIME ≤ 8 16-32 ≥ 64

CEFPODOXIME ≤ 2 4 ≥ 8

IMIPENEM ≤ 4 8 ≥ 16

VANCOMICINA ≤ 4 8-16 ≥ 32

GENTAMICINA ≤ 4 8-16 ≥ 32

S = Sensibilità, I = Sensibilità Intermedia, R = Resistenza

VANTAGGI

Tecnica standardizzata (CLSI) Flessibilità nella scelta degli

antibiotici Facilità di esecuzione Economicità Correlazione tra risultati in vitro

(antibiogramma) e risoluzione clinica (risultati in vivo)

SVANTAGGI

Impossibilità di totale automatizzazione

Produce risultati qualitativi

(categorie di sensibilità)

È un metodo quali-quantitativo, semplice, rapido ed economico, valido per microrganismi aerobi a crescita rapida.

Attualmente il test di diffusione su dischetto più utilizzato è il metodo di Kirby-Bauer, sviluppato agli inizi degli anni ‟60.

Si effettua applicando sulla

superficie della piastra in cui è

stata precedentemente seminata

una brodocoltura batterica dei

dischetti di carta da filtro sterili

perfettamente aderenti contenenti

una concentrazione nota e standard

di antibiotico. L‟ antibiotico

presente sul disco diffonde in

rapporto alla diffusibilità in terreno

di coltura 5. Misurazione diametro

alone di inibizione

1. Allestimento brodocoltura da coltura pura

2. Semina brodocoltura

3. Apposizione dischetti

antibiotizzati

4. Incubazione

(37°C, 18-24h)

1. Allestire piastre con idoneo terreno solido le quali vengono successivamente inoculate con una quantità di batteri sufficiente a dare uno sviluppo confluente generando una patina uniforme sul terreno

2. Deporre sulla superficie della piastra, con l‟aiuto di una pinzetta sterile, una serie di dischetti di carta assorbente imbevuti con adatte concentrazioni degli antibiotici che si desidera testare.

3. Incubare le piastre a 37°C per 18-24 ore.

4. Misurare il diametro degli aloni di inibizione formatisi per ogni antibiotico.

Secondo i criteri stabiliti dalla CLSI (Clinical and Laboratory Clinical Institute) il diametro dell‟alone di inibizione deve rispondere a determinati valori al di sotto dei quali il microrganismo viene considerato Resistente, ed al di sopra dei quali viene considerato Sensibile.

Esiste inoltre una zona definita Intermedia in cui si deve stabilire se il microrganismo è sensibile o resistente.

MICRORGANISMO SENSIBILE MICRORGANISMO con RESISTENZA

L'E-test o epsilon test dalla forma dell'alone di inibizione, è un metodo quantitativo per la determinazione della MIC.

E-test è costituito da strisce di plastica di 5 x 50 mm contenenti un gradiente corrispondente a 15 concentrazioni a raddoppio di antibiotico (in mg/ml).

Queste sono variabili a seconda dei diversi antibiotici utilizzati: 0.00025 – 4 0.002 – 32 0.016 – 256 0.032 – 512 0.064 – 1024

La tecnica di semina a tutta piastra è analoga a quella dell‟antibiogramma per diffusione secondo Kirby-Bauer.

Deposizione delle strisce antibiotizzate sulla superficie della piastra inoculata

Incubazione a 37°C per 18-24 ore.

La lettura della MIC si effettua dove la crescita batterica interseca la striscia.