ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_______________________

Vũ Đình Quang

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN

VÀ MỐI TƢƠNG QUAN VỚI ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG,

KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN

BÀO THẦN KINH TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62420121

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018

Công trình được hoàn thành tại

trường Đại học khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân

2. TS. BS. Phùng Tuyết Lan

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc

gia chấm luận án tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . .

vào hồi giờ ngày tháng năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

U nguyên bảo thần kinh (UNBTK) là một khối u chủ yếu xảy ra ở

trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ với tỷ lệ khoảng 6% các dạng ung thư nhi. Đây

là dạng ung thư có biểu hiện lâm sàng đa dạng phụ thuộc vào các đặc

điểm sinh học và di truyền. Có một số biến đổi gen và nhiễm sắc thể

đặc (NST) hiệu cho UNBTK như khuếch đại gen MYCN hay các biến

đổi bộ NST. Các thông tin di truyền này được các bác sĩ lâm sàng sử

dụng để phân nhóm bệnh nhân, lựa chọn phác đồ tối ưu (giảm lượng

hóa chất, điều trị đích…), tiên lượng và theo dõi trong và sau điều trị

để đạt được kết quả điều trị tốt nhất cho từng bệnh nhân. Đây chính

là xu hướng cá nhân hóa trong điều trị ung thư hiện đại. Tại Việt

Nam, việc sử dụng các công cụ di truyền để phát hiện các biến đổi ở

mức độ NST và gen cho UNBTK còn rất hạn chế. Do vậy kết quả

điều trị thành công thường không cao so với thế giới. Xuất phát từ

yêu cầu lâm sàng thực tiễn như vậy, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu

một số biến đổi di truyền và mối liên quan với đặc điểm lâm sàng,

kết quả điều trị trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh tại bệnh viện

nhi Trung ương” được tiến hành với hai mục tiêu sau:

1. Phát hiện một số biến đổi di truyền trên bệnh nhân nhi mắc

bệnh u nguyên bào thần kinh.

2. Xác định sự liên quan giữa các biến đổi di truyền với một số

yếu tố tiên lượng và định hướng điều trị UNBTK.

Nội dung nghiên cứu

1. Nghiên cứu một số biến đổi di truyền của bệnh u NBTK

- Phát hiện khuếch đại gen MYCN trên tất cả các bệnh nhân UNBTK

bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ.

2

- Phát hiện biến đổi NST số 2 và NST số 17 trên một số bệnh nhân

UNBTK nguy cơ thấp bằng kỹ thuật MLPA.

- Phát hiện biến đổi bộ NST trên một số bệnh nhân UNBTK nguy

cơ thấp bằng lai so sánh hệ gen.

2. Nghiên cứu sự liên quan giữa khuếch đại gen MYCN với tuổi

chẩn đoán, giới tính, giai đoạn bệnh, nồng độ VMA, HVA, LDH,

trạng thái biệt hóa của tế bào và tiên lượng mô bệnh học.

3. Sử dụng kết quả phân tích biến đổi di truyền trong định hướng

điều trị bệnh UNBTK: phân nhóm nguy cơ theo hướng dẫn của tổ

chức u NBTK quốc tế và định hướng điều trị tối ưu cho bệnh nhân

theo phác đồ SIOPEN.

Tính mới của luận án

- Các biến đổi di truyền có giá trị tiên lượng trên khối UNBTK

được xác định bằng các kỹ thuật di truyền hiện đại. Sự khuếch đại

gen MYCN, được phát hiện bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ.

Một số bệnh nhân không khuếch đại gen MYCN lần đầu tiên được

đánh giá các biến đổi NST bằng kỹ thuật MLPA và kỹ thuật lai so

sánh hệ gen.

- Các đặc điểm về di truyền của khối u NBTK được sử dụng

vào việc định hướng điều trị cho các bệnh nhân u NBTK. Nhóm

bệnh nhân có khuếch đại gen MYCN được điều trị theo phác đồ

nguy cơ trung bình hoặc cao, tùy thuộc vào giai đoạn bệnh. Các

bệnh nhân không có khuếch đại gen MYCN nguy cơ thấp, kết quả

phân tích bộ NST là yếu tố quan trọng trong việc quyết định điều

trị hóa chất hay chỉ cần theo dõi định kỳ.

3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Tổng quan về UNBTK

UNBTK là dạng ung thư phổ biến nhất trong năm đầu tiên của

cuộc đời. Tỷ lệ mắc mới là 10,2 ca trên 1 triệu trẻ em dưới 15 tuổi

với tuổi chẩn đoán trung bình khoảng 18 tháng.

Khoảng 8% các khối UNBTK có tính chất gia đình. Đó thường là

các khối u có tuổi chẩn đoán sớm (9 tháng) và có các đột biến gen

ALK và/hoặc PHOX2B di truyền từ bố mẹ

Các biểu hiện lâm sàng của UNBTK rất đa dạng và kịch tính phụ

thuộc vào vị trí u tiên phát và các biểu hiện di căn. Một mặt, UNBTK

giải thích cho trạng thái bệnh và tỷ lệ tử vong không cân đối giữa các

loại ung thư trẻ em; mặt khác nó biểu hiện sự thoái triển tự phát và

hoàn toàn cao nhất trong tất cả các loại ung thư của con người.

Các khối UNBTK gồm có 2 thành phần tế bào là các NBTK và

các tế bào đệm Schwann, ở đó thành phần mô đệm Schwann chiếm

dưới 50% toàn bộ khối u. Tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của tế

bào, UNBTK được chia làm 3 nhóm là chưa biệt hóa (2-3%), ít biệt

hóa (65-75%) và đang biệt hóa (5%). Ngoài ra có 4-5% UNBTK

không xếp loại được. Căn cứ vào tuổi chẩn đoán, mức độ biệt hóa

của khối u, chỉ số nhân chia/nhân tan, và nốt canxi hóa, Hiệp hội Giải

phẫu bệnh u NBTK Quốc tế chia u NBTK thành 2 nhóm tiên lượng là

mô bệnh học thuận lợi và mô bệnh học không thuận lợi.

2. Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng UNBTK

2.1 Một số đặc điểm lâm sàng

4

UNBTK là dạng khối u có nguồn gốc phôi bào của hệ thần kinh

giao cảm. Chính vì thế, u NBTK thường xảy ra ở trẻ nhỏ, và xuất

hiện ở nhiều vị trí khác nhau như cổ, ngực, bụng và tiểu khung.

Tế bào UNBTK hoặc theo con đường bạch huyết di căn vào hạch

lympho khu vực hay hạch xa, hoặc theo đường máu di căn vào tủy

xương, xương, gan, da. Một số trường hợp tế bào di căn vào hốc

mắt/sọ gây lồi mắt hoặc khối u ở đầu.

Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh cho phép khảo sát khối u

nguyên phát để đánh giá khả năng phẫu thuật cắt bỏ; phát hiện di căn

xa để phân loại giai đoạn bệnh; hướng dẫn cho thủ thuật sinh thiết

khối u bằng kim nhỏ; và là công cụ theo dõi, đánh giá tiến triển bệnh

trong quá trình điều trị.

Một trong những yếu tố tiên lượng đầu tiên của UNBK là tuổi

chẩn đoán. Trong khi bệnh nhân dưới 1 tuổi có tiên lượng tốt, các

bệnh nhân có tuổi chẩn đoán lớn hơn lại có nhiều đặc điểm sinh học

không thuận lợi, làm cho bệnh có tiên lượng xấu.

Các khối UNBTK được chia thành 2 nhóm lớn là giai đoạn khu

trú và giai đoạn di căn. Theo hệ thống phân loại giai đoạn UNBTK

theo nhóm nguy cơ, giai đoạn khu trú là L1 và L2, còn giai đoạn di

căn là M và Ms. Giai đoạn Ms gặp ở các bệnh nhân bệnh nhân nhỏ

hơn 12 tháng, có khối u di căn đến gan, tủy xương và da. Điểm đặc

biệt ở đây là khả năng thoái triển ngẫu nhiên dù khối u tiên phát có

kích thước lớn.

2.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng

Các tế bào UNBTK đều có rối loạn chuyển hóa catecholamine,

làm tăng nồng độ các chất VMA và HVA trong nước tiểu. Chính vì

5

vậy, xét nghiệm VMA, HVA niệu là một xét nghiệm cần thiết cho

chẩn đoán và theo dõi tiến triển bệnh UNBTK.

Phần lớn bệnh nhân nhi có khối UNBTK khu trú có nồng độ LDH

bình thường khi chẩn đoán; trong khi đó nồng độ LDH lại tăng cao ở

các bệnh nhân giai đoạn di căn, phản ánh tế bào u phát triển nhanh và

khối u nhiều tế bào ác tính, là dấu ấn phân loại các bệnh nhân nguy

cơ cao.

3. Các đặc điểm di truyền bệnh UNBTK

Nhiều đặc điểm di truyền của u NBTK như sự khuếch đại gen

MYCN hay các bất thường số lượng, cấu trúc NST, hiện nay đã được

xác định là có sự liên quan với biểu hiện lâm sàng và tiên lượng

bệnh.

3.1. Bất thường số lượng NST

Bất thường số lượng NST là một dấu ấn di truyền có ý nghĩa tiên

lượng ở nhóm bệnh nhân ít hơn 1 tuổi. Ở đó, các khối u có bộ NST

gần lưỡng bội có tiên lượng thuận lợi hơn so với các khối u gần tam

bội. Việc xác định thể bội của khối u hiện nay được xác định gián

tiếp thông qua chỉ số DNA bằng hệ thống đo đạc tế bào theo dòng

chảy.

3.2. Bất thường cấu trúc NST

Các bất thường cấu trúc ở UNBTK có nhiều ý nghĩa hơn và

thường là tiên lượng xấu cho bệnh nhân.

Thêm đoạn NST số 17 là bất thường cấu trúc NST đầu tiên và

nhiều nhất được tìm thấy trên các bệnh nhân UNBTK (70-90% số

ca). Các nghiên cứu cho thấy sự có mặt của một vùng vật chất di

truyền ít nhất là 25Mb được thêm vào cánh dài nhiễm sắc thể 17 tại

6

vị trí 17q21-qter, và đó là kết quả của chuyển đoạn tương hỗ không

cân bằng. Đột biến thêm cánh dài NST số 17 có quan hệ chặt chẽ với

các khối u nguy cơ xấu như giai đoạn bệnh muộn, tuổi chẩn đoán trên

1 tuổi, cùng với mất đoạn 1p, khuếch đại gen MYCN và có kết quả

điều trị kém.

Giống như thêm đoạn 17q, mất đoạn NST số 1, từ vị trí 1p22 đến

1p36, có tỷ lệ cao trong bệnh UNBTK ở các khối u không thể phẫu

thuật và di căn, kết quả điều trị kém. Hơn nữa, mất đoạn cánh ngắn

NST số 1 thường đi kèm với khuếch đại gen MYCN (62%). Trạng

thái vùng 1p36 này có ý nghĩa tiên lượng về tiến triển của bệnh ở

nhóm nguy cơ thấp. Mất đoạn 1p hay gặp ở bệnh nhân tiên lượng xấu

do một vài gen ức chế khối u có thể nằm trên vùng này.

Mất đoạn NST số 11 được tìm thấy ở khoảng 41% khối u NBTK,

tại vị trí 11q23.3. Biến đổi di truyền này luôn xuất hiện cùng các dấu

ấn xấu của bệnh (tuổi chẩn đoán trên 1 tuổi, giai đoạn 4, mô bệnh học

không thuận lợi), và gần như không đi kèm với khuếch đại gen

MYCN. Về ý nghĩa lâm sàng, mất đoạn cánh dài NST số 11 là mất

đoạn phổ biến nhất ở các khối UNBTK tiên phát, và là một dấu ấn

cho tiên lượng xấu của bệnh độc lập với khuếch đại gen MYCN.

Mất đoạn cánh dài NST số 14 cũng là một bất thường hay gặp

trong các khối UNBTK. Khoảng 22% số ca có mất đoạn tại vị trí

14q23-qter. Mất đoạn 14q cho thấy sự liên hệ chặt chẽ với mất đoạn

11q trên các ca bệnh không có khuếch đại gen MYCN ở tất cả các

nhóm nguy cơ.

7

3.3. Khuếch đại gen MYCN

Một số khối UNBTK có đặc trưng về mặt di truyền tế bào là xuất

hiện sự khuếch đại gen MYCN dưới dạng nhiều đoạn kép ngắn chất

nhiễm sắc (DM) nằm ngoài bộ NST hoặc vùng bắt màu đồng nhất

(HSR) trên 1 NST nào đó. Trạng thái biểu hiện của MYCN là một đặc

điểm ổn định trong hệ gen UNBTK, và số lượng bản sao gen này là

không thay đổi trong quá trình phát triển của khối u, giữa các vùng

khác nhau của khối u, cũng như giữa khối u tiên phát và các khối di

căn.

MYCN là một gen tiền ung thư nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể

số 2, ở vị trí 2p24. Gen MYCN được biểu hiện ở giai đoạn tiền làm tổ

và giữ vai trò thiết yếu trong sự phát triển hoàn toàn của hệ thống

thần kinh.

Trong bệnh UNBTK, khuếch đại gen MYCN thường đi kèm với

các khối u ở giai đoạn muộn, ác tính cao. Trong môi trường nuôi cấy,

các tế bào ung thư mang khuếch đại gen có khả năng phát triển

không kiểm soát và di căn cao, thông qua sự tăng cường tổng hợp

DNA và ngăn chặn sự thoát ra khỏi chu trình tế bào cũng như sự biệt

hóa tế bào thần kinh.

Chỉ 5% bệnh nhân UNBTK có khuếch đại gen MYCN có thời

gian sống không bệnh hơn 18 tháng, trong khi con số này ở các bệnh

nhân không khuếch đại gen là 70%. Mặt khác, khuếch đại gen cho

thấy khả năng điều trị không thành công ngay cả ở giai đoạn sớm.

Có ít nhất 6 vùng trong hệ gen cũng được khuếch đại ở các ca

UNBTK có khuếch đại MYCN như MDM2 trên nhiễm sắc thể 12q13

8

và MYCL trên nhiễm sắc thể 1p32. Sự khuếch đại các gen này không

xảy ra độc lập, và góp phần vào sự ác tính của khối u.

3.4. UNBTK di truyền

Một nhóm nhỏ bệnh nhân UNBTK có khuynh hướng hình thành

khối u này trong gia đình. Con cái trong các gia đình này thường có

tuổi chẩn đoán sớm (khoảng 9 tháng) và khối u nguyên phát ở cả 2

bên tuyến thượng thận hoặc nhiều vị trí khác nhau. Phần lớn các ca

UNBTK di truyền là do đột biến gen ALK, chiếm tỷ lệ khoảng 7% số

ca. Người mang đột biến gen ALK có khoảng 50-60% nguy cơ hình

thành khối u [68]. Đột biến PHOX2B gặp ít hơn và thường xuất hiện

trên các bệnh nhân có rối loạn phát triển mào thần kinh.

3.5. Mô hình biến đổi di truyền bệnh UNBTK

Sự khởi tạo khối u được bắt đầu từ một NBTK riêng lẻ, thường

liên quan đến sự bất hoạt một gen ức chế khối u. Mức độ biệt hóa khi

các NBTK biến đổi quyết định sự biểu hiện của thụ thể neutrophin.

Các khối u nhóm 1 chiếm khoảng 1/3 khối u có đặc điểm biểu hiện

9

TkrA cao. Các khối u này đặc trưng bởi rối loạn phân bào dẫn đến bộ

nhiễm sắc thể đa bội hoặc gần tam bội, có xu hướng biệt hóa hoặc tế

bào chết theo chu trình phụ thuộc vào sự có mặt hay không của NGF.

Các bệnh nhân thường ít hơn 1 tuổi, khối u khu trú, tiên lượng rất tốt

và điều trị chỉ bằng phẫu thuật và hóa trị triệu chứng.

Khối u nhóm 2 đặc trưng bởi các bất thường nhiễm sắc thể lớn và

có bộ nhiễm sắc thể gần lưỡng bội. Không có biến đổi nào cố định,

nhưng thêm đoạn 17q hay gặp nhất, TrkA ít biểu hiện còn TrkB biểu

hiện trội hơn. Trong nhóm này, các khối u lại được chia thành 2

nhóm nhỏ hơn. Một nhóm (nhóm 2A) không có khuếch đại gen

MYCN và mất đoạn 1p, nhưng lại có mất đoạn 11q và 14q. Các bệnh

nhân ở nhóm này thường có tuổi chẩn đoán lớn hơn, giai đoạn muộn

hơn, nhưng tiến triển chậm và thường đe dọa đến tính mạng. Nhóm

còn lại (nhóm 2B) là nhóm ác tính nhất, đặc trưng bởi khuếch đại gen

MYCN đi kèm mất đoạn 1p. Nhóm này gồm các bệnh nhân từ 1 đến 5

tuổi, giai đoạn muộn, bệnh tiến triển nhanh dẫn đến phần lớn là tử

vong (trên 75% số bệnh nhân).

Như vậy, dù mỗi khối UNBTK có biểu hiện lâm sàng khác biệt,

tính chất sinh học của khối u vẫn có thể dự đoán được dựa vào các

đặc điểm bất thường về di truyền cũng như biểu hiện gen. Các thông

tin như vậy được sử dụng để tiên lượng kết quả điều trị cũng như lựa

chọn liều lượng liệu pháp thích hợp nhất từng bệnh nhân.

4. Các kỹ thuật di truyền đƣợc sử dụng trong bệnh UNBTK

4.1. Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

10

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ là một phương pháp nhằm định

vị, phát hiện các trình tự nhất định bằng cách lai một đầu dò có gắn

huỳnh quang với trình tự nghiên cứu theo nguyên tắc bổ sung.

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trải qua 5 bước gồm (1) gắn

huỳnh quang vào đầu dò, (2) biến tính đầu dò và DNA đích, (3) phản

ứng lai, (4) rửa sau lai và (5) quan sát.

Hiện nay, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ là một trong những kỹ

thuật di truyền được sử dụng rộng rãi để đánh giá trạng thái gen

MYCN trên các bệnh nhân UNBTK.

4.2. Kỹ thuật MLPA

Phương pháp MLPA là phương pháp sử dụng nhiều phản ứng

PCR cho phép khuếch đại nhiều đoạn gen khác nhau với chỉ một cặp

mồi duy nhất.

Phản ứng MLPA có thể chia thành năm bước: (1) biến tính sợi

DNA và lai đầu dò; (2) ghép nối; (3) khuếch đại; (4) phân tích dữ

liệu.

Do có khả năng phát hiện được các thay đổi về số lượng bản sao

của một gen hay một đoạn nhiễm sắc thể, kỹ thuật MLPA là một kỹ

thuật phù hợp để phát hiện các mất đoạn hay thêm đoạn trên các khối

u NBTK

4.3. Kỹ thuật lai so sánh hệ gen

Kỹ thuật lai so sánh hệ gen là một kỹ thuật di truyền dựa trên việc

so sánh 2 hệ gen, nghiên cứu và đối chứng, để phát hiện các CNV.

Mỗi một hệ gen được lai với 1 màu huỳnh quang khác nhau (thường

là xanh và đỏ), và tín hiệu tổng hợp của 2 màu huỳnh quang cho biết

vùng gen/NST đó là mất hay thêm vật chất di truyền.

11

Kỹ thuật lai so sánh hệ gen có năm bước chính gồm (1) tách

DNA, (2) khuếch đại và gắn huỳnh quang vào hệ gen, (3) lai với

DNA chip, (4) rửa sau lai và (5) quét và phân tích kết quả.

Phương pháp lai so sánh hệ gen được coi là kỹ thuật “đầu bảng”

trong việc xác định các thay đổi về số lượng bản sao trên các bệnh

nhân u NBTK với khả năng phát hiện các biến đổi nhỏ trên toàn bộ

hệ gen chỉ với 1 lần chạy.

5. Tình hình nghiên cứu bệnh UNBTK ở Việt Nam

Do thường xảy ra ở trẻ nhỏ, phần lớn các bệnh nhân UNBTK

được khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương (ở miền Bắc),

bệnh viện U bướu thành phố Hồ Chí Minh (ở miền Nam).

U nguyên bào thần kinh đã bắt đầu được nghiên cứu tại bệnh viện

Nhi Trung uơng từ giữa những năm 1990. Năm 2005 và 2007, tác giả

Phùng Tuyết Lan lần lượt công bố kết quả nghiên cứu đặc điểm lâm

sàng và cận lâm sàng cũng như kết quả điều trị bệnh nhân UNBTK

tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Năm 2016, tác giả Nguyễn Xuân Huy

công bố kết quả nghiên cứu khuếch đại gen MYCN trên 54 bệnh nhân

UNBTK bằng kỹ thuật FISH.

Các nghiên cứu của Trần Chánh Khương và Nguyễn Thị Khen mở

đầu cho hướng nghiên cứu UNBTK tại phía Nam. Năm 2015, nhóm

nghiên cứu của Trương Đinh Kiều Diễm đã đánh giá khuếch đại gen

MYCN bằng kỹ thuật Realtime PCR trên 60 bệnh nhân UNBTK.

12

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tƣợng nghiên cứu

141 bệnh nhân UNBTK sau khi khám và điều trị tại Bệnh viện

Nhi Trung ương từ tháng 01 năm 2015 đến tháng 06 năm 2017.

1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

- Các bệnh nhân đến khám và được chẩn đoán xác định mắc u

nguyên bào thần kinh bằng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

- Có mẫu bệnh phẩm đủ tiêu chuẩn cho xét nghiệm di truyền.

- Gia đình đồng ý tham gia vào nghiên cứu.

1.2. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân

- Không có mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu bệnh phẩm không đủ tiêu

chuẩn cho xét nghiệm di truyền.

- Gia đình từ chối tham gia vào nghiên cứu.

1.3. Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu cắt ngang và mô tả

Nghiên cứu trạng thái gen MYCN và một số biến đổi di truyền

trên bệnh nhân UNBTK.

Nghiên cứu sự liên quan giữa một số biến đổi di truyền này với

một số yếu tố lâm sàng có ý nghĩa tiên lượng.

- Nghiên cứu tiến cứu

Các bệnh nhân nghi ngờ UNBTK được thu thập mẫu bệnh phẩm.

Sau khi có kết quả chẩn đoán xác định bằng mô bệnh học, tiến hành

nghiên cứu biến đổi di truyền trên các khối UNBTK.

2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.1. Thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm

13

- Mẫu u tươi: được thu thập ngay sau cuộc mổ hay sinh thiết. Bảo

quản ở -80oC trước khi làm tiêu bản cắt lạnh.

- Mẫu u nến: được thu thập sau khi khối u cố định trong nển. Bảo

quản ở nhiệt độ phòng trước khi làm tiêu bản u nến.

2.2. Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

Đầu dò huỳnh quang sử dụng là là “LSI N-MYC (2p24)

SpectrumGreen/CEP 2 SpectrumOrange Probe” của hãng Vysis

(Abbott), đánh dấu màu xanh đánh dấu vào vùng gen MYCN; màu đỏ

đánh dấu vào tâm động nhiễm sắc thể số 2.

Mảnh u tươi được cắt lát 4 M và cố định lên tiêu bản bằng dung

dịch Carnoy. Mảnh u nến cũng được cắt lát 4 M và trải qua quá

trình tẩy nến bằng bộ kit SPOT-Light Tissue Pretreatment Kit (Life

Sciences). Tiêu bản u được lai qua đêm ở 37oC sau khi biến tính ở

75oC trong 2 phút (u tươi) và 80

oC trong 5 phút (u nến). Sau khi rửa

với SSC 2X, tiêu bản được nhuộm với DAPI và phân tích dưới kính

hiển vi huỳnh quang.

2.3. Kỹ thuật MLPA

Bộ kit MLPA dùng cho nghiên cứu này là P252-B1 gồm các đầu

dò cho nhiễm sắc thể số 2 và 17. DNA được biến tính ở 98oC và lai

với đầu dò trong 16 tiếng ở 60oC. Hỗn hợp được tiến hành ghép nối ở

54oC, và tiến hành phản ứng PCR. Tiếp đến, mẫu được chạy trên

máy giải trình tự 3130 Genetic Analyser (ABI) và phân tích bằng

phần mềm Coffalyser.

2.4. Kỹ thuật lai so sánh hệ gen (CGH)

DNA chip sử dụng là SurePrint G3 Human CGH Microarray Kit,

2x400K (Agilent) với độ phân giải 400000 đoạn oligo nucleotide phủ

14

toàn bộ hệ gen. 2 bộ DNA được lai với thuốc nhuộm huỳnh quang

(Cy5 cho DNA nghiên cứu, Cy3 cho DNA chứng), nhỏ lên DNA

chip và lai ở 67oC trong 40 giờ. Kết quả được phân tích bằng phần

mềm CytoGenomics (Agilent). Kỹ thuật này được thực hiện trên hệ

thống của hãng Agilent tại phòng Công nghệ gen – Protein, Bệnh

viện đa khoa quốc tế Vinmec.

2.5. Xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS 23.0.

Mối liên quan giữa một số biến đổi di truyền với yếu tố tiên lượng

khác được xác định bằng kiểm định 2, Fisher.

3. Đạo đức trong nghiên cứu

- Lợi ích đối với người bệnh: bệnh nhân có phác đồ điều trị phù

hợp nhất, giảm tối đa đau đớn và tốn kém cho bệnh nhân, có tiên

lượng điều trị và tái phát tốt.

- Lợi ích đối với khoa học: là bước đầu trong việc xác định biến

đổi di truyền cho từng bệnh nhân nhi mắc UNBTK.

- Lợi ích đối với lâm sàng: các bác sĩ lâm sàng có thể phân giai

đoạn bệnh chính xác, lựa chọn được phác đồ điều trị thích hợp, làm

tăng tỷ lệ điều trị thành công cho bệnh nhân.

- Sự chấp thuận:

Nghiên cứu được thông qua Hội đồng Y đức và Hội đồng

Khoa học của Bệnh viện Nhi Trung ương.

Bệnh nhân, hoặc gia đình hay người bảo trợ cho bệnh nhân

được giải thích trước khi đưa vào nghiên cứu. Trong trường hợp đồng

ý, đối tượng được thu thập thông tin cần thiết, thu thập mẫu bệnh

15

phẩm và ký vào bản cam kết thực hiện xét nghiệm với các điều khoản

đã soạn thảo.

Đảm bảo tính bí mật cho các đối tượng nghiên cứu.

4. Sơ đồ nghiên cứu

16

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1. Phát hiện một số bất thƣờng di truyền trên các bệnh nhân nhi

mắc UNBTK

1.1. Xác định trạng thái khuếch gen MYCN bằng kỹ thuật FISH

Trong số 141 bệnh nhân UNBTK ở nghiên cứu này, có 21 trường

hợp phát hiện khuếch đại gen MYCN, chiếm tỷ lệ 14,89%. Tỷ lệ này

thấp hơn tỷ lệ chung của thế giới do nhiều bệnh nhân giai đoạn

muộn, có tiên lượng xấu tại Bệnh viện Nhi Trung ương thường từ

chối điều trị, không tiếp tục làm xét nghiệm chẩn đoán sau khi khám

lâm sàng ban đầu.

Có 92 mẫu bệnh phẩm u tươi và 49 mẫu bệnh phẩm u nến. Ở đó,

mẫu bệnh phẩm u tươi cho thấy một số ưu điểm hơn so với u nến như

dễ dàng tiến hành xét nghiệm, tín hiệu rõ ràng và có thể sử dụng cho

các xét nghiệm chuyên sâu hơn.

1.2. Xác định biến đổi NST bằng kỹ thuật MLPA và CGH

Một số bệnh nhân u nguyên bảo thần kinh nguy cơ thấp được chỉ

định làm thêm xét nghiệm di truyền để đánh giá biến đổi bộ nhiễm

sắc thể để lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp.

1.2.1. Phát hiện biến đổi NST bằng kỹ thuật MLPA

Có 10 bệnh nhân u NBTK được tiến hành đánh giá NST số 2 và

17 bằng kỹ thuật MLPA. Kết quả cho thấy có 8 bệnh nhân không

phát hiện bất thường NST, 1 bệnh nhân phát hiện thêm đoạn cánh dài

NST số 17 và 1 bệnh nhân phát hiện mất đoạn cánh ngắn NST số 17.

Đây đều là những dạng bất thường NST thường gặp trên bệnh nhân u

NBTK.

17

Mặt khác, kỹ thuật MLPA cũng cho thấy hạn chế khi không thể

đánh giá được toàn bộ các NST trong một lần chạy. Điều này sẽ gây

ra khó khăn trong việc phân định bệnh nhân thuộc nhóm biến đổi về

số lượng NST (NCA) hay nhóm biến đổi về cấu trúc NST (SCA).

1.2.2. Phát hiện biến đổi di truyền bằng kỹ thuật CGH

Có 6 bệnh nhân UNBTK được tiến hành đánh giá bộ NST bằng

kỹ thuật CGH. Kết quả cho thấy có 4 bệnh nhân thuộc nhóm NCA và

2 bệnh nhân thuộc nhóm SCA. Các dạng thay đổi về số lượng hay

cấu trúc NST phát hiện được đều là những dạng hay gặp trên các

khối UNBTK. Đó là thêm đoạn 17q, mất đoạn 1p, mất đoạn 11q,

thêm NST số 3, thêm NST số 4, mất NST số 21…

Có 2 bệnh nhân được làm cả kỹ thuật MLPA và CGH. Kết quả

cho thấy kỹ thuật CGH có độ nhạy và độ chính xác cao hơn so với kỹ

thuật MLPA, và trở thành kỹ thuật đầu bảng trong việc đánh giá biến

đổi NST trên bệnh nhân UNBTK.

2. Xác định sự liên quan giữa các biến đổi di truyền với một số

yếu tố tiên lƣợng và định hƣớng điều trị UNBTK.

2.1. Sự liên quan giữa trạng thái gen MYCN với tuổi chẩn đoán

Tuổi chẩn đoán là một trong các yếu tố tiên lượng có ý nghĩa. Các

bệnh nhân nhỏ hơn 12 tháng có tiên lượng tốt hơn so với các nhóm

tuổi khác. 48,2% bệnh nhân trong nghiên cứu này ít hơn 1 tuổi.

Khuếch đại gen MYCN chỉ gặp ở các bệnh nhân nhỏ hơn 48 tháng và

tập trung ở nhóm từ 12 đến 24 tháng (9/21 bệnh nhân). Điều này cho

thấy khuếch đại gen MYCN thúc đẩy các tế bào phát triển nhanh và

ác tính nên thường gặp ở các bệnh nhân nhỏ tuổi. Các khối UNBTK

18

ác tính ở trẻ lớn sẽ ít phát hiện khuếch đại gen MYCN hơn. Kiểm

định χ2 cho thấy 2 yếu tố này không có sự liên quan với nhau (với

mức độ tin cậy là 95%).

2.2. Sự liên quan giữa trạng thái gen MYCN với giới tính

Khối UNBTK gặp ở trẻ trai nhiều hơn trẻ gái. Trong nghiên cứu

này tỷ lệ trẻ trai/gái = 1,56. Khuếch đại gen MYCN cũng gặp ở trẻ trai

nhiều hơn trẻ trai. Tuy nhiên, sự khác biệt này nhiều khả năng đến từ

chênh lệch giới tính nói chung ở bệnh u NBTK. Kiểm định Fisher

cũng củng cố giả thuyết này khi cho thấy trạng thái gen MYCN và

tuổi chẩn đoán không có sự liên quan với nhau (với mức độ tin cậy là

95%).

2.3. Sự liên quan giữa trạng thái gen MYCN với giai đoạn

Khối UNBTK được phân loại theo hệ thống INRG, ở đó khối u

khu trú được phân loại thành giai đoạn L1 và L2 được phân biệt bởi

sự xâm lấn vào các cơ quan khác; khối u di căn gồm giai đoạn M và

Ms phân biệt bởi tuổi và vị trí di căn. Trong nghiên cứu này, 19,86%

bệnh nhân ở giai đoạn L1, 66,67% giai đoạn L2, 8,51% giai đoạn M

và 4,96% giai đoạn Ms.

Do là các khối u có độ ác tính cao, tỷ lệ khuếch đại gen MYCN

trội hơn ở các bệnh nhân giai đoạn di căn, 66,67% bệnh nhân giai

đoạn M và 28,57% bệnh nhân giai đoạn Ms. Ngược lại, các bệnh

nhân ở giai đoạn khu trú có tỷ lệ khuếch đại gen này thấp, 3,57% và

10,64% lần lượt ở giai đoạn L1 và L2. Kiểm định χ2 cho thấy 2 yếu

tố này độc lập với nhau (với mức độ tin cậy là 95%).

2.3. Sự liên quan giữa trạng thái gen MYCN với chỉ số VMA/HVA

19

Phần lớn bệnh nhân UNBTK có rối loạn chuyển hoá

catecholamie, dẫn đến nồng độ các chất VMA và HVA tăng cao (trên

2,5 lần so với mức bình thường), đặc biệt trong nước tiểu. Theo

nghiên cứu của Strenger V. (2006), có 91,2% bệnh nhân có tăng ít

nhất 1 trong 2 chất nói trên. 50,4% bệnh nhân tăng HVA và 61,5%

bệnh nhân tăng VMA trong nghiên cứu này. Sự khác biệt này do các

bệnh nhân thu thập được phần lớn ở giai đoạn khu trú và có tiên

lượng tốt.

Giá trị sử dụng độc lập của từng chỉ số này vẫn còn đang tranh

cãi. Thay vào đó, tỷ lệ VMA/HVA được sử dụng trong tiên lượng

bệnh nhân, ở đó tỷ lệ VMA/HVA<1 gặp nhiều ở các bệnh nhân giai

đoạn muộn, có các đặc điểm sinh học không thuận lợi. Mười ba (13)

bệnh nhân khuếch đại gen MYCN có tỷ lệ VMA/HVA<1. Tuy nhiên

hai yếu tố này không có quan hệ với nhau (với mức độ tin cậy là

95%) qua kiểm định χ2.

2.4. Sự liên quan giữa trạng thái gen MYCN với chỉ số LDH

Ở UNBTK, nồng độ LDH trong máu cao (lớn hơn 1260 U/L)

phản ánh quá trình thay thế tế bào u diễn ra nhanh hoặc kích thước

khối u lớn. Do vậy, nồng độ LDH cao hay gặp ở các khối u có tiên

lượng xấu.

Trong nghiên cứu này, hơn 75% bệnh nhân khuếch đại gen MYCN

có tăng nồng độ LDH trên 3 lần so với mức bình thường. Ngược lại

chỉ có 5% bệnh nhân không khuếch đại gen có tăng LDH. Chỉ số

LDH ở các bệnh nhân giai đoạn di căn được coi là yếu tố tiên lượng

có giá trị ở các bệnh nhân không mang khuếch đại gen. Kiểm định χ2

20

cho thấy trạng thái gen MYCN và nồng độ LDH và có liên quan với

nhau (với mức độ tin cậy là 95%).

2.5. Sự liên quan giữa trạng thái gen MYCN với trạng thái biệt hóa

tế bào

Các tế bào UNBTK được phân biệt các trạng thái biệt hóa khác

nhau trên tiêu bản nhuộm HE. Đây là một trong các yếu tố để xác

định tiên lượng mô bệnh học. Trong nghiên cứu này, hơn 90% khối u

thu thập được thuộc nhóm ít biệt hóa, còn lại là các khối u không biệt

hóa và đang biệt hóa.

Khuếch đại gen MYCN sẽ ngăn chặn sự biệt hóa tế bào, đồng thới

kích thích sự tăng sinh của tế bào. Vì vậy khuếch đại gen thường gặp

ở nhóm UNBTK chưa biệt hóa hoặc ít biệt hóa. Trong nghiên cứu

này, 94,02% bệnh nhân có khuếch đại gen MYCN thuộc 1 trong 2

nhóm này, ở đó nhóm ít biệt hóa là 91,45%. Như vậy, kết quả nghiên

cứu này đã khẳng định thêm giả thuyết về sự hoạt động của gen

MYCN tác động tới sự biệt hóa của tế bào UNBTK. Kiểm định χ2 cho

thấy trạng thái gen MYCN và mức độ biệt hóa tế bào và có quan hệ

với nhau (với mức độ tin cậy là 95%). Cụ thể, nhóm UNBTK đang

biệt hóa rất hiếm gặp khuếch đại gen MYCN.

2.6. Sự liên quan giữa trạng thái gen MYCN với tiên lượng mô

bệnh học

Hiệp hội Giải phẫu bệnh u NBTK Quốc tế phân biệt 2 nhóm tiên

lượng mô bệnh học trên khối u NBTK là mô bệnh học thuận lợi và

mô bệnh học không thuận lợi. Ở đó, nhóm mô bệnh học thuận lợi là

nhóm bệnh nhân ít tuổi, giai đoạn khu trú, có kết quả điều trị tốt. Phù

hợp với đặc điểm bệnh nhân thu thập trong nghiên cứu này (gần 50%

21

bệnh nhân dưới 1 tuổi và hơn 85% bệnh nhân ở giai đoạn khu trú), đa

số khối UNBTK được xếp vào nhóm tiên lượng mô bệnh học thuận

lợi (64,7%).

Cũng phù hợp với ý nghĩa lâm sàng của từng nhóm tiên lượng,

khuếch đại gen MYCN tập trung phần lớn ở nhóm tiên lượng mô bệnh

học không thuận lợi (15/20 bệnh nhân). Tuy nhiên, kiểm định χ2

cho

thấy trạng thái gen MYCN và tiên lượng mô bệnh học không có quan hệ

với nhau (với mức độ tin cậy là 95%).

2.7. Ý nghĩa các biến đổi di truyền với điều trị

Việc phân loại chính xác bệnh nhân UNBTK có ý nghĩa rất lớn

đến cách thức và kết quả điều trị. Trạng thái gen MYCN là đặc điểm

di truyền được xác định đầu tiên trên các khối UNBTK do các bệnh

nhân khuếch đại gen đều đều có tiên lượng xấu. Trong 21 bệnh nhân

khuếch đại gen MYCN, 1 bệnh nhân giai đoạn L1 phải thay đổi phác

đồ từ nguy cơ thấp sang trung bình, Hiện nay, bệnh nhân này đã dừng

theo dõi định kỳ với kết quả điều trị tốt. 12 bệnh nhân giai đoạn L2

và Ms phải thay đổi phác đồ sang nguy cơ cao.

Các bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ thấp cần thêm thông tin về sự

thay đổi bộ NST để quyết định điều trị, ở đó bệnh nhân nhóm NCA

có thể chỉ cần theo dõi còn bệnh nhân nhóm SCA phải điều trị đủ hóa

chất theo phác đồ. Trong 4 bệnh nhân nhóm NCA, 1 bệnh nhân mới

không cần điều trị, 2 bệnh nhân tiếp tục theo dõi định kỳ, bệnh nhân

còn lại không cần tiếp tục điều trị hóa chất. Trong 2 bệnh nhân nhóm

SCA, 1 bệnh nhân cần tiếp tục điều trị hóa chất và 1 bệnh nhân giai

đoạn di căn tiếp tục điều trị giảm nhẹ (dù có 50% khả năng thành

công với phác đồ điều trị nguy cơ cao).

22

Việc xác định biến đổi di truyền bằng kỹ thuật CGH đóng vai trò

quan trọng trong việc phân nhóm nguy cơ và lựa chọn phác đồ điều

trị phù hợp. Từ đó các nhà lâm sàng có thể phát triển phương pháp

điều trị cá thể hóa để giảm tối đa các biến chứng điều trị, tăng tỷ lệ

điều trị thành công trên các bệnh nhân nhi mắc UNBTK.

23

KẾT LUẬN

1. Đã phát hiện đƣợc một số biến đổi di truyền trên bệnh nhân u

NBTK, bao gồm:

21/141 bệnh nhân u NBTK mang khuếch đại gen MYCN được xác

định bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ. Tỷ lệ khuếch đại gen

MYCN trong nghiên cứu này là 14,89%.

Bằng kỹ thuật MLPA, 10 bệnh nhân u NBTK nguy cơ thấp được

xác định bất thường nhiễm sắc thể số 2 và 17. 2 bệnh nhân được phát

hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể số 17, 8 bệnh nhân không

phát hiện bất thường.

6 bệnh nhân u NBTK nguy cơ thấp được sàng lọc 23 nhiễm sắc

thể để xác định bất thường bằng kỹ thuật lai so sánh hệ gen. 2 bệnh

nhân phát hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể, 4 bệnh nhân phát

hiện bất thường số lượng nhiễm sắc thể.

2. Đã xác định đƣợc sự liên quan giữa các biến đổi di truyền với

một số yếu tố tiên lƣợng và góp phần định hƣớng điều trị u

NBTK nhƣ sau:

Khuếch đại gen MYCN không liên quan với tuổi chẩn đoán, giai

đoạn, nồng độ VMA, HVA, tiên lượng mô bệnh học cũng như giới

tính của bệnh nhân trong nghiên cứu này.

Khuếch đại gen MYCN có liên quan với nồng độ LDH cao (trên

1260 U/L) và trạng thái ít biệt hóa của của khối u NBTK dựa trên

kiểm định χ2 ( với mức độ tin cậy 95%).

- Từ kết quả nghiên cứu biến đổi di truyền và mối liên quan với

các yếu tố tiên lượng khác, đã đề xuất và thực hiện phác đồ điều trị

hiệu quả đối với 13/21 bệnh nhân có khuếch đại gen MYCN.. Trong

24

số 6 trường hợp được nghiên cứu các biến đổi di truyền bằng kỹ thuật

lai so sánh hệ gen, có 3 trường hợp giữ nguyên phác đồ hiện tại, 2

trường hợp cần phải thay đổi phác đồ và 1 bệnh nhân mới không cần

điều trị. Cả 6 trường hợp này đều đang ở trạng thái bệnh ổn định,

khối u không còn phát triển.

KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

Ở Việt Nam, cho đến nay, các nghiên cứu di truyền liên quan đến

khối u vẫn rất hạn chế. Chính vì vậy, để tiếp nối đề tài nghiên cứu này,

một số hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất như sau:

1. Tiếp tục triển khai kỹ thuật lai so sánh hệ gen trên các bệnh

nhân UNBTK không có khuếch đại gen MYCN, bao gồm cả nhóm

bệnh nhân nguy cơ thấp, nhóm nguy cơ trung bình và cao để có một

cơ sở dữ liệu đầy đủ hơn về đặc điểm di truyền ở bệnh nhi mắc

UNBTK tại Việt Nam.

2. Phát hiện các đột biến trên một số gen có liên quan đến các

khối UNBTK như gen ALK, gen PHOX2B, gen MDM2… bằng kỹ

thuật giải trình tự gen, hướng đến việc điều trị đích và cá nhân hoá

điều trị cho các bệnh nhân ung thư nhi.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Vũ Đình Quang, Nguyễn Xuân Huy, Phùng Tuyết Lan, Trần Đức

Hậu, Trần Ngọc Sơn, Hoàng Ngọc Thạch, Lê Đình Công, Ngô Diễm

Ngọc (21014), “Đánh giá khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân

UNBTK”, Tạp chí Y Dược Lâm Sàng 108 (9), trang 283-288.

2. Vũ Đình Quang, Nguyễn Thị Hồng Vân, Phùng Tuyết Lan, Trần

Ngọc Sơn, Lê Đình Công, Hoàng Ngọc Thạch, Nguyễn Xuân Huy, Ngô

Diễm Ngọc (2015), “Nghiên cứu mối quan hệ giữa trạng thái gen

MYCN với một số yếu tố tiên lượng khác trên 41 bệnh nhân UNBTK”,

Tạp chí Khoa học ĐHQG: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 31(4S),

trang 288-293.

3. Vu Dinh Quang, Nguyen Thi Hong Van, Phung Tuyet Lan, Tran

Ngoc Son, Le Dinh Cong, Hoang Ngoc Thach, Nguyen Xuan Huy, Ngo

Diem Ngoc (2016),“Study on the Relationship Between MYCN Status

and Certain Prognostic Factors in 131 Patients with Neuroblastoma”,

Journal of Clinical Medicine, No 36, pp 30-36.

4. Vũ Đình Quang, Nguyễn Thị Hồng Vân, Phùng Tuyết Lan, Trần

Ngọc Sơn, Lê Đình Công, Hoàng Ngọc Thạch, Nguyễn Xuân Huy, Ngô

Diễm Ngọc (2016), “Nghiên cứu mối quan hệ giữa trạng thái

gen MYCN với tuổi và kết quả mô bệnh học trên 41 bệnh nhân

UNBTK”, Tạp chí Nhi khoa 9(3), trang 46-50.

5. Q.D. Vu, V.T.H. Nguyen, N.D. Ngo, N.X. Huy, L.T. Phung, C.D.

Le, T.N. Hoang, M.T.C. Tran, H.T. Le (2016), “Association of MYCN

Status with Certain Prognosis Factors of Vietnamese Neuroblastoma

from 2013-2015”, Pediatric Blood and Cancer, No 63, pp S205-S206.

6. Q. Vu, N. Nguyen, L. Bui, H. Pham, C. Le, N. Le, T. Hoang, N. Ngo,

H. Nguyen, L. Phung, V. Nguyen, H. Le (2017), “Treatment of non

high risk neuroblastoma patients following SIOPEL protocol in

Vietnam from 2013 to 2015”, Pediatric Blood and Cancer, No 64, pp

S448-S449.

7. Vũ Đình Quang, Nguyễn Thị Hồng Vân, Phùng Tuyết Lan, Nguyễn

Xuân Huy, Ngô Diễm Ngọc, Bùi Ngọc Lan, Phạm Duy Hiền, Lê Đình

Công, Hoàng Ngọc Thạch, Dương Hồng Quân, Nguyễn Thanh Liêm,

Lê Thanh Hải (2017), “Ứng dụng kỹ thuật lai so sánh hệ gen trong xác

định biến đổi di truyền ở bệnh nhân UNBTK không khuếch đại gen

MYCN”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công

nghệ 33(2S), trang 109-113.