I Microarray:I Microarray:

Una nuova tecnologiaUna nuova tecnologia

Sara Loddo

13.10.2008

Background

Elevata risoluzione, Elevata risoluzione, ma l’analisi diventa ma l’analisi diventa

locus-specificalocus-specifica

Visione d’insieme Visione d’insieme dell’intero genoma,dell’intero genoma,

ma bassa risoluzionema bassa risoluzione

~3-10Mb~3-10Mb

Anni ‘70Anni ‘70

~40-100kb~40-100kb

Anni ‘90Anni ‘90

XXI secoloXXI secolo

““cariotipo molecolare”cariotipo molecolare”

Tecniche diagnostiche

MICROSCOPIA OTTICA: osservazione diretta dei cromosomi bandeggiati con colorazione Giemsa. Limite di risoluzione di 5-10 Mb.

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization): sonde sito-specifiche, marcate con fluorescenza. Necessarie informazioni a priori sulla localizzazione del riarrangiamento.

CGH (Comparative Genomic Hybridization): ibridazione competitiva di DNA genomico di un paziente e di un controllo, frammentati e marcati con un fluorocromo diverso, su metafasi di un soggetto sano.

Due DNA (test e controllo) marcati con due fluorocromi diversi vengono messi in competizione per il legame con le metafasi di un soggetto “normale”

Metafaseindividuo normale

DNA controllo

DNA test

CGH: Comparative Genomic HybridizationCGH: Comparative Genomic Hybridization

1. Normale: si lega tanto DNA “verde”

quanto DNA “rosso”.Il rapporto dell’intensità della fluorescenza nei

2 colori è pari a 1.

2. Duplicazione: si lega più DNA “verde”

del DNA “rosso”.Il rapporto dell’intensità

della fluorescenza verde/rosso è > 1.

3. Delezione: si lega meno DNA “verde” del

DNA “rosso”. Il rapporto dell’intensità

della fluorescenza verde/rosso è < 1.

ARRAYARRAY: : insieme ordinato di sequenze genomiche , la cui mappatura è insieme ordinato di sequenze genomiche , la cui mappatura è nota, fissate ad un substrato solido secondo uno schema ricostruibile.nota, fissate ad un substrato solido secondo uno schema ricostruibile.

•Applicazioni in più campi, quali diagnostica, ricerca, farmacogenomica, etc.

•Utilizzate differenti tipi di sonde: BAC (80-200 Kb), cloni di cDNA (0.5-2.5 Kb), prodotti di PCR (100 bp- 1.5 Kb), oligonucleotidi (25-80 nt), SNPs (25 nt)

•La risoluzione dipende dalla lunghezza delle sequenze e dal numero degli spot

•Vantaggio: analisi di più geni o dell’intero genoma in un singolo esperimento.

DNA microarray: una collezione di microscopiche sonde (probe)OrdinateMiniaturizzateImmobilizzate su una superficie solida

I probe possono essere attaccati al substrato mediante:

-Legame diretto, fisico o chimico

-Legame indiretto, mediante molecole linker

1.1. Microarray spottati roboticamenteMicroarray spottati roboticamente: probe di DNA a : probe di DNA a

singolo filamento pre-sintetizzati sono fissati su vetrini singolo filamento pre-sintetizzati sono fissati su vetrini

mediante apparecchiature automatizzate (Tecnologia Ink-Jet mediante apparecchiature automatizzate (Tecnologia Ink-Jet

Printing)Printing)

2.2. Array di oligonucleotidi ad alta densitàArray di oligonucleotidi ad alta densità: set di : set di

oligonucleotidi sono sintetizzati oligonucleotidi sono sintetizzati in situin situ su un supporto di vetro su un supporto di vetro

mediante un processo di fotolitografia associata alla sintesi mediante un processo di fotolitografia associata alla sintesi

chimica degli oligonucleotidi (Tecnologia Affymetrix).chimica degli oligonucleotidi (Tecnologia Affymetrix).

Due tecniche di produzione di microarrayDue tecniche di produzione di microarray

Microarray a DNA Microarray a DNA spottatospottato

Prima dello spottaggio, il Prima dello spottaggio, il vetrino deve essere vetrino deve essere trattato in modo che trattato in modo che esponga sulla superficie esponga sulla superficie molecole con cariche molecole con cariche positive (Es. polilisina).positive (Es. polilisina).

Le molecole di DNA che Le molecole di DNA che vengono depositate sul vengono depositate sul vetrino durante lo vetrino durante lo spottaggio, vengono spottaggio, vengono successivamente UV-successivamente UV-crosslinkate alle cariche crosslinkate alle cariche positive del vetrino.positive del vetrino.

Microarray di oligonucleotidi ad alta Microarray di oligonucleotidi ad alta densitàdensità

FotolitografiaFotolitografia

Processo di sintesi di luce-Processo di sintesi di luce-diretta in cui linker sintetici diretta in cui linker sintetici modificati con gruppi modificati con gruppi protettivi, rimuovibili protettivi, rimuovibili mediante la luce, sono mediante la luce, sono attaccati alla superficie del attaccati alla superficie del vetrino.vetrino.

La luce viene diretta La luce viene diretta attraverso una maschera attraverso una maschera per deproteggere e attivare per deproteggere e attivare i gruppi selezionati. i gruppi selezionati. Nucleotidi protetti possono Nucleotidi protetti possono così accoppiarsi ai siti così accoppiarsi ai siti attivati.attivati.

E’ possibile avere 500,000 probe in uno spazio di 1.28 cm2

Ogni singolo probe è costituito da milioni di oligonucleotidi identici

Per ogni oligo che presenta un match perfetto (PM) è presente un oligo identico con mismatch per una sola base in posizione centrale (MM) La presenza di un MM consente di stimare legami aspecifici e background locale e di sottrarli dal segnale di PM

Ibridazione basata sul principio di Ibridazione basata sul principio di complementarietà delle basicomplementarietà delle basi

•Ibridazione competitiva: il DNA di un campione e di un controllo vengono marcati con due fluorocromi differenti (Cy3 e Cy5) ed uniti in una miscela ibridata poi sull’array. La fluorescenza è rilevata da uno scanner e il rapporto dei due segnali analizzato mediante un software.

•Ibridazione assoluta: su ogni array è ibridato un singolo campione marcato in maniera indiretta (biotina legata al composto fluorescente streptavidina-ficoeritrina). La fluorescenza è rilevata da uno scanner e un software analizza l’intensità del segnale rosso assoluto.

Principali applicazioni dei microarray

cDNA microarray: per misurare i livelli di espressione di determinati geni microarray SNP (“Single Nucleotide Polymorphism”) e array di mutazione: per la genotipizzazione e identificazione di polimorfismi (SNPs) in una popolazione.

microarray CGH (“Comparative Genomic Hybridization”): per osservare perdite o guadagni di materiale genomico o un cambiamento nel numero di copie di un gene particolare coinvolto in una malattia.

Microarray Genomici basati su:

•Sonde BAC (Bacterial Artificial Chromosome)- lunghezza di 80-200 Kb, copertura omogenea del genoma, ma risoluzione bassa con difficoltà di individuazione delle piccole aberrazioni sotto le 50 Kb

•Cloni di cDNA- utilizzati soprattutto per lo studio dell’espressione genica, offrono una più alta risoluzione ma che risulta ineguale lungo il genoma (i geni non sono distribuiti in maniera omogenea)

•Prodotti di PCR- offrono una maggiore risoluzione ed una più omogenea copertura, ma il segnale è basso e i costi di produzione molto alti

Microarray di nuova generazione

(Tecnologia Ink-Jet) (Tecnologia Affymetrix)

•Sonde oligonucleotidiche lunghe fino a 60 nt a singolo filamento

•Risoluzione fino a 10-15 Kb

•Ibridazione competitiva con un unico DNA di controllo

•Copertura omogenea dell’intero genoma

•20 sonde per ogni SNP, lunghe 25 nt, diverse per la posizione del nucleotide polimorfico

•Risoluzione fino a 5 Kb

•Ibridazione del solo DNA da testare e successivo confronto con DNA di riferimento (HapMap Project)

•Copertura non omogenea dell’intero genoma

In campo diagnostico è necessaria una conferma mediante altre tecniche (FISH o Real Time PCR)

ARRAY BASATI SU OLIGONUCLEOTIDI

International HapMap Project

•Progetto iniziato nel 2002

•Si propone di “catalogare” le varianti comuni del DNA umano in una Mappa degli Aplotipi

•Analizzati 270 soggetti provenienti da differenti gruppi etnici

1- Sono stati identificati polimorfismi di un singolo nucleotide (SNPs) in diversi individui

2- SNPs vicini lungo il DNA vengono ereditati insieme e formano un APLOTIPO

3- Gli SNPs identificati in un aplotipo sono caratteristici unicamente per quell’aplotipo, perciò mediante genotipizzazione di 3 SNPs si può risalire all’aplotipo del’individuo

Oligonucleotide-Array (Agilent)

Gain

Loss

Nochange

•Fino a 244,000 sonde oligonucleotidiche•Risoluzione di 10-15 Kb

Intensita’ di fluorescenza è rilevata dallo scanner

Dati elaborati da un software

SNPs-array (Affymetrix GeneChip 250K)

•250,000 SNPs•Risoluzione di 5 Kb

Intensità di segnale rilevata da uno scanner e i dati elaborati da un software

•Risoluzione di 0.7 Kb•1.8 milioni SNPs e oligonucleotidi che coprono regioni povere di SNPs combinati insieme

Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0

Maggiore copertura del genoma

Copy Number Variations (CNVs)

Segmenti di DNA con estensione maggiore di 1 Kb presenti nel genoma con un numero variabile di copie.

Contribuiscono:

• alle differenze fenotipiche tra gli individui

• alla patogenesi di malattie, sia mendeliane che multigeniche

La frequenza delle CNVs nella popolazione è di 1/800 bp

Contribuiscono:•Alle differenze nell’espressione genica coinvolgendo sequenze vicine a geni •Alla predisposizione di alcune malattie

CNVs polimorfiche

Frank et al., 2007PosizionaleMTUS1

(esone4)SiNoComuni

Cancro al seno familiare

Sebat et al., 2007b; Szatmari et al., 2007

Sconosciuto

MultipliVariNon

applicabileComuniAutismo

Le Maréchal et al., 2006DosaggioPRSS1PochiSiRarePancreatiteereditaria

Rovelet-Lecrux et al., 2006; Cabrejo et al., 2006

DosaggioAPPSiNoRareMorbo di Alzheimer

Ibáñez et al., 2004; Chartier-Harlin et al.,

2004; Singleton et al., 2003

DosaggioSNCASiNoRareMorbo di Parkinsonprecoce

Lachman et al., 2007PosizionaleGSK3BPochiNoComuniDisturbo bipolare

Fellermann et al., 2006DosaggioDEFB4NoSiComuniMalattia di

Crohn

Yang et al., 2004DosaggioC4A/C4BNoSiComuniSLE

Aitman et al., 2006; Fanciulli et al., 2007

DosaggioFCGR3BNoSiComuni

SLE, Poliangite

microscopica e

Granulomatosi Wegener

McKinney et al., 2007DosaggioCCL3L1NoSiComuni

Atritereumatoide e

Diabete di tipo 1

Gonzalez et al., 2005DosaggioCCL3L1NoSiComuniHIV-1/ AI DS susceptibility

ReferenzaEffettoGeniSNPsDuplicazionisegmentali

CNVSindrome

Frank et al., 2007PosizionaleMTUS1

(esone4)SiNoComuni

Cancro al seno familiare

Sebat et al., 2007b; Szatmari et al., 2007

Sconosciuto

MultipliVariNon

applicabileComuniAutismo

Le Maréchal et al., 2006DosaggioPRSS1PochiSiRarePancreatiteereditaria

Rovelet-Lecrux et al., 2006; Cabrejo et al., 2006

DosaggioAPPSiNoRareMorbo di Alzheimer

Ibáñez et al., 2004; Chartier-Harlin et al.,

2004; Singleton et al., 2003

DosaggioSNCASiNoRareMorbo di Parkinsonprecoce

Lachman et al., 2007PosizionaleGSK3BPochiNoComuniDisturbo bipolare

Fellermann et al., 2006DosaggioDEFB4NoSiComuniMalattia di

Crohn

Yang et al., 2004DosaggioC4A/C4BNoSiComuniSLE

Aitman et al., 2006; Fanciulli et al., 2007

DosaggioFCGR3BNoSiComuni

SLE, Poliangite

microscopica e

Granulomatosi Wegener

McKinney et al., 2007DosaggioCCL3L1NoSiComuni

Atritereumatoide e

Diabete di tipo 1

Gonzalez et al., 2005DosaggioCCL3L1NoSiComuniHIV-1/ AI DS susceptibility

ReferenzaEffettoGeniSNPsDuplicazionisegmentali

CNVSindrome

Beck et al., 1992

Delezione/Inversione

IDSXq28X-linkedSindrome di Hunter

Small et Warren, 1998Delezione/Duplicazion

e

Emery/FLN1

Xq28X-linkedDistrofia muscolareEmery-Dreifuss

International IP Consortium, 2000

DelezioneNEMOXq28X-linkedI ncontinenza

pigmenti

Stankiewicz et Lupski, 2002

DelezioneRCP/GC

PXq28X-linkedDaltonismo

Bonifas et al., 1987; Conary et al., 1987; Ballabio et Andria, 1992

DelezioneSTSXp22.32X-linkedI ttiosi

Edelmann et al., 1999a; Edelmann et al., 1999b; Shaikh et al., 2000

DelezioneTBX122q11.2Autosomica dominante

Di George/ Sindrome

velocardiofacciale(DGS/ VCFS)

Stankiewicz et Lupski, 2002

DelezioneGH117q23.3Autosomica recessiva

Nanismo pituitario

Dorschner et al., 2000DelezioneNF117q11.2Autosomica dominante

Neurofibromatosi 1 (NF1)

Chance et al., 1994; Lupski, 1998; Boerkoel et al., 1999

DelezionePMP2217p12Autosomica dominante

Neuropatia tomaculare (HNPP)

Chance et al., 1994; Lupski, 1998 ; Boerkoel et al., 1999

Duplicazione

PMP2217p12Autosomicadominante

Charcot-Marie-Tooth 1A(CMT1A)

Potocki et al., 2000Duplicazion

e?17p11.2

Autosomicadominante

Potocky-Lupski(PLS)

Chen et al., 1997; Slageret al., 2003; Bi et al., 2004; Girirajan et al., 2005

DelezioneRAI117p11.2Autosomicadominante

Smith-Magenis(SMS)

Harteveld et al., 2005Delezioneα-

globina16p13.3

Autosomicarecessiva

α-talassemia

Christian et al., 1999; Amos-Landgraf et al., 1999

DelezioneOBE1A15q11.2-q13

Autosomica dominante

Angelman(AS)

Christian et al., 1999; Amos-Landgraf et al., 1999

DelezioneSNRPN15q11.2-q13

Autosomica dominante

Prader-Willi(PWS)

Galanello et al., 2004; Harteveld et al., 2005

Delezioneβ –

globina11p15.5

Autosomica recessiva

β-talassemia

Fardella et al., 2001Duplicazion

eCYP11B

1/28q21

Autosomica dominante

I peraldosteronismo familiare I

Pérez J urado et al., 1998; Peoples et al., 2000

Delezione/Inversione

ELN/GTF21

7q11.23Autosomica dominante

Williams-Beuren(WBS)

Tusié-Luna et White, 1995

DelezioneCYP216p21.3Autosomica recessiva

I perplasia adrenale congenita I I I

Wirth et al., 1997Inversione/Duplicazion

eSMN5q13.2

Autosomica recessiva

Atrofia muscolare spinale

Petrov et al., 2008DelezioneFRG14q35Autosomica dominante

Distrofia muscolare fascio-scapolo

omerale

Saunier et al., 2000; Konrad et al., 1996

DelezioneNPHP12q13Autosomica recessiva

Nefronoftisi giovanile familiare

Tayebi et al., 2003DelezioneGBA1q21Autosomica recessiva

Sindrome di Gaucher

Nozu et al., 2007DelezioneCLCNKA

/B1p36

Autosomica dominante

Sindrome di Bartter

ReferenzeCNVGenePosizion

eEreditarietàSindrome

Beck et al., 1992Delezione/Inversione

IDSXq28X-linkedSindrome di Hunter

Small et Warren, 1998Delezione/Duplicazion

e

Emery/FLN1

Xq28X-linkedDistrofia muscolareEmery-Dreifuss

International IP Consortium, 2000

DelezioneNEMOXq28X-linkedI ncontinenza

pigmenti

Stankiewicz et Lupski, 2002

DelezioneRCP/GC

PXq28X-linkedDaltonismo

Bonifas et al., 1987; Conary et al., 1987; Ballabio et Andria, 1992

DelezioneSTSXp22.32X-linkedI ttiosi

Edelmann et al., 1999a; Edelmann et al., 1999b; Shaikh et al., 2000

DelezioneTBX122q11.2Autosomica dominante

Di George/ Sindrome

velocardiofacciale(DGS/ VCFS)

Stankiewicz et Lupski, 2002

DelezioneGH117q23.3Autosomica recessiva

Nanismo pituitario

Dorschner et al., 2000DelezioneNF117q11.2Autosomica dominante

Neurofibromatosi 1 (NF1)

Chance et al., 1994; Lupski, 1998; Boerkoel et al., 1999

DelezionePMP2217p12Autosomica dominante

Neuropatia tomaculare (HNPP)

Chance et al., 1994; Lupski, 1998 ; Boerkoel et al., 1999

Duplicazione

PMP2217p12Autosomicadominante

Charcot-Marie-Tooth 1A(CMT1A)

Potocki et al., 2000Duplicazion

e?17p11.2

Autosomicadominante

Potocky-Lupski(PLS)

Chen et al., 1997; Slageret al., 2003; Bi et al., 2004; Girirajan et al., 2005

DelezioneRAI117p11.2Autosomicadominante

Smith-Magenis(SMS)

Harteveld et al., 2005Delezioneα-

globina16p13.3

Autosomicarecessiva

α-talassemia

Christian et al., 1999; Amos-Landgraf et al., 1999

DelezioneOBE1A15q11.2-q13

Autosomica dominante

Angelman(AS)

Christian et al., 1999; Amos-Landgraf et al., 1999

DelezioneSNRPN15q11.2-q13

Autosomica dominante

Prader-Willi(PWS)

Galanello et al., 2004; Harteveld et al., 2005

Delezioneβ –

globina11p15.5

Autosomica recessiva

β-talassemia

Fardella et al., 2001Duplicazion

eCYP11B

1/28q21

Autosomica dominante

I peraldosteronismo familiare I

Pérez J urado et al., 1998; Peoples et al., 2000

Delezione/Inversione

ELN/GTF21

7q11.23Autosomica dominante

Williams-Beuren(WBS)

Tusié-Luna et White, 1995

DelezioneCYP216p21.3Autosomica recessiva

I perplasia adrenale congenita I I I

Wirth et al., 1997Inversione/Duplicazion

eSMN5q13.2

Autosomica recessiva

Atrofia muscolare spinale

Petrov et al., 2008DelezioneFRG14q35Autosomica dominante

Distrofia muscolare fascio-scapolo

omerale

Saunier et al., 2000; Konrad et al., 1996

DelezioneNPHP12q13Autosomica recessiva

Nefronoftisi giovanile familiare

Tayebi et al., 2003DelezioneGBA1q21Autosomica recessiva

Sindrome di Gaucher

Nozu et al., 2007DelezioneCLCNKA

/B1p36

Autosomica dominante

Sindrome di Bartter

ReferenzeCNVGenePosizion

eEreditarietàSindrome

CNVs patologiche

Si devono considerare:

•Posizione sul cromosoma

•Evento de novo o ereditato

•Dimensione

•Contenuto genico

•Tipo di CNV (delezione o duplicazione)

Per CNVs de novo:

La complessità del genoma rende difficile stabilire la natura delle CNVs

Sindromi genomiche mendeliane e da geni contigui associate a CNVs

Vissers et al. (2004) Nat Genet 36: 955-957Vissers et al. (2004) Nat Genet 36: 955-957 Mutations in a new member of the chromodomain gene family Mutations in a new member of the chromodomain gene family cause CHARGE syndrome. cause CHARGE syndrome.

Elevata sensibilita’ nell’identificare geni-malattia:

incidenza: 1/12000incidenza: 1/12000

CColobomaolobomaHHeart anomalyeart anomalyAAtresia (choanal)tresia (choanal)RRetardationetardationGGenitalenitalEEar anomaliesar anomalies

Sequenziamento geni in pazienti non “sbilanciati” Sequenziamento geni in pazienti non “sbilanciati” →→mutazioni in CHD7 (rimodellamento cromatina)mutazioni in CHD7 (rimodellamento cromatina)

Analisi array-Analisi array-CGHCGH: 1 paziente con delezione di 5 Mb in 8q12: 1 paziente con delezione di 5 Mb in 8q12

1 paziente con t(6;8): due delezioni non contigue in 8q121 paziente con t(6;8): due delezioni non contigue in 8q12

Analisi mediante array-CGH su tutto il genoma

Individuazione di una delezione in 8q12 di 5Mb

Analisi del contenuto genico e sequenziamento del gene CHD7 nei pazienti che non presentano sbilanciamenti

Individuazione di una mutazione nel gene CHD7 nel cromodominio della proteina coinvolta nel rimodellamento della cromatina

BIBLIOGRAFIA

•Carter NP (2007) Nat Genet 39:16-21 Methods and strategies for analyzing copy number variation using DNA microarrays.

•International HapMap Consortium (2005) Nature 437:299-320 A haplotype map of the human genome.

•Vissers et al. (2004) Nat Genet 36: 955-957 Mutations in a new member of the chromodomain gene family cause CHARGE syndrome.

•Risorse on-line