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icrobiología
olecular
X Reunión
Segovia
9-11 de junio de 2014
9-11 de Junio de 2014. Segovia
COLABORAN:
1
BIENVENIDA
Queridos amigos y amigas:
Es para nosotros un gran honor y responsabilidad organizar la X Reunión del Grupo especializado de
Microbiología Molecular de la SEM. Desde sus inicios hace ya 20 años, el grupo ha crecido de
manera muy significativa, quedando lejos aquella primera reunión organizada en la Universidad
Pública de Navarra por Gerardo Pisabarro en la que cabíamos todos en un pequeño salón de actos,
hasta alcanzar en estos últimos años números de asistentes que requieren mayores niveles de
infraestructura.
En esta Reunión hemos pretendido por un lado buscar una sede “distinta” y acogedora como es
Segovia y, además, tratar de primar por encima de todo el que éste sea el foro de expresión y
primeros contactos con un estrado público de los más jóvenes, nuestra cantera. Por ello, animamos
a todos, especialmente a los más jóvenes, a participar sin temores, a divertirse haciendo Ciencia y a
pasarlo bien discutiendo con compañeros de otros equipos compartiendo experiencias. Es éste el
espíritu que nos anima a dedicar todo nuestro esfuerzo a hacer de ésta una reunión memorable
para todos.
¡ Bienvenidos !
Finalmente, queremos agradecer especialmente al Campus en Segovia de la Universidad de
Valladolid por habernos cedido las instalaciones del edificio Vicerrector Santiago Hidalgo Alonso
para la celebración de esta reunión, y a todos nuestros patrocinadores por su generosidad y
esfuerzo en esto tiempos económicamente difíciles.
El comité organizador
2
ORGANIZACIÓN
Comité organizador:
José Berenguer Carlos (UAM)
Bruno González Zorn (UCM)
Cristina Vallés Rapp (UVA)
Daniel Thomas-López (UCM)
Comité científico:
Bruno González Zorn (Universidad Complutense de Madrid),
Junkal Garmendia García (Instituto de Agrobiotecnología, Navarra)
Susana Campoy Sánchez (Universidad Autónoma de Barcelona),
José Berenguer Carlos (Universidad Autónoma de Madrid),
Mª Ángeles de la Torre Ruiz (Universidad de Lleida),
José Antonio Ainsa Claver (Universidad de Zaragoza),
Félix Sangari García (Universidad de Cantabria),
Josep Casadesús (Universidad de Sevilla),
José Antonio Gil Santos (Universidad de León),
Adela González de la Campa (Instituto de Salud Carlos III),
Alejandro Mira Obrador (Centro Superior de Investigación en Salud Pública, Valencia),
Víctor Jiménez Cid (Universidad Complutense de Madrid),
Juan Alfonso Ayala Serrano (Universidad Autónoma de Madrid),
José Antonio Bengoechea Alonso (Queen’s University Belfast, UK),
Diseño web
Gabriel Moyano Ortega (UCM)
Secretaría Técnica
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SEDE
La X Reunión del Grupo de Microbiología Molecular tendrá lugar en el edificio la Escuela
Universitaria de Magisterio, edificio Vicerrector Santiago Hidalgo, de la Universidad de Valladolid,
Campus María Zambrano (SEGOVIA), Dirección: Plaza Colmenares 1, en pleno centro histórico de la
ciudad, a unos 5 minutos a pie del acueducto romano (1).
Las comidas las efectuaremos en el restaurante la Parrilla del Sirenas, calle C/ Juan Bravo 30 (2), y la cena de despedida en el Restaurante La Floresta, Calle de San Agustín 27 (3).
Mapa del sitio:
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PROGRAMA
LUNES 9 de junio
12:30-15:30 Entrega de documentación y colocación de pósters
16:00-16:15 Ceremonia de inauguración
16:15-17:00 Conferencia inaugural: “Why study nitrogenase?”
Luis M. Rubio – Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas, Universidad Politécnica de Madrid
17:00-17:15 EURAXESS: Movilidad Investigadora
Noelia Romero López – Coordinadora de la Red EURAXESS – FECYT
17:15-18:45 Sesión I: Comportamiento Multicelular
Moderador: Alejandro Toledo-Arana
Estudio funcional y estructural de la región B de BAP y su rol en el desarrollo de biofilm
en S. aureus. Agustina Taglialegna
Decoding the DSF-Quorum Sensing System of Stenotrophomonas maltophilia. Pol Huedo
Implicación del mensajero secundario c-di-GMP en la virulencia de Salmonella Enteritidis.
Maite Echeverz
Methyl-hydroxylamine specifically inhibits ribonucleotide reductase activity in pathogenic
bacteria. Eduard Torrents
Srn135, un pequeño RNA no codificante que participa en la regulación de la formación del
pili en Streptococcus pneumoniae. Mónica Amblar
19:00 Cóctel de bienvenida
21:00 Visita nocturna guiada
MARTES 10 de junio
9:00-11:00 Sesión II: Patogénesis
Moderador: Adela G. de la Campa
tmRNA is crucial for oxidative stress adaptation and antibiotic resistance in the human
pathogen Streptococcus pneumoniae. Joana Wilton
SP1992 es una proteína externa dimórfica de Streptococcus pneumoniae implicada en
enfermedad invasiva. María de la Soledad Escolano
5
Protección mediada por hidrolasas de pared celular de neumococo frente a la sepsis
neumocócica. Bruno Corsini
Altos niveles de recombinación homóloga y homeóloga en cepas patógenas Escherichia coli.
Jerónimo Rodríguez-Beltrán
Papel de los factores Gre en la fisiología y patogenicidad de Salmonella: invasión de células
epiteliales. Tania Gaviria
Regulación por Hfq en Brucella abortus. Félix J. Sangari
Characterization of mutants in genes putatively involved in Brucella core lipopolysaccharide
synthesis. Miriam Salvador Bescós
Las islas de patogenicidad de Staphylococcus aureus son capaces de controlar factores de
virulencia cromosómicos. Katerina Guzman
11:00-11:30 Pausa Café
11:30-13:30 Sesión III: Regulación Génica
Moderador: Susana Campoy
La topología del DNA regula la expresión génica global en Streptococcus pneumoniae.
María-José Ferrándiz
Operones solapantes: un nuevo mecanismo de coordinación de la expresión de genes
adyacentes. Sonia Saenz
La proteína Hha: sola o acompañada. Carla Solórzano
A study of the central carbon metabolism pathways of slow and fast growing brucellae.
Amaia Zúñiga-Ripa
TolR, a novel hybrid two-component regulatory system involved in the adaptation to
aromatic hydrocarbons inAzoarcus sp. Zaira Martín-Moldes
Ndr regula transcripcionalmente las tres clases de ribonucleotidil reductasas y de
topoisomerasa I enPseudomonas aeruginosa. Anna Crespo
Building up a high quality genome-based metabolic model to optimize ectoines production
in Chromohalobacter salexigens. Francine Piubeli
Análisis multiómico en respuesta a salinidad y temperatura de la bacteria
halófila Chromohalobacter salexigens. Montserrat Argandoña
La inestabilidad genómica asociada con los defectos en la síntesis de los centros Fe-S en las
células de Saccharomyces cerevisiae. Carlos Maria
14:00-16:00 Comida
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La Parrilla del Sirenas. C/ Juan Bravo, 30.
16:00-17:30 Sesión IV: Aplicaciones Biotecnológicas
Moderador: Luis Angel Fernández
Terapia fágica: el caso de la lisozima Cpl-7 y su poder bactericida. Roberto Díez-Martínez
Controlled assembly of functional type III secretion system injectisomes in non-pathogenic
E. coli K-12. David Ruano-Gallego
Study of the effect of the new tuberculosis vaccine candidate MTBVAC on bladder cancer
cells. Samuel Álvarez-Arguedas
HOTDROPS: a new tool for high throughput screening of thermostable enzymes. Ana Luísa
Ribeiro
Efecto del flavonoide de la cerveza Xanthohumol en el microorganismo eucariota
modelo Saccharomyces cerevisiae. Victoria Mascaraque
Rapid analysis of antibiotic resistance pattern of multiresistant Acinetobacter in gel
microspheres with a Cellena® microencapsulator. Alba Muñoz Suano
17:30-18:00 Pausa Café
18:00-19:00 Sesión V: Microbiología Celular
Moderador: Víctor Cid
From Genomes to Nucleotides: Rethinking Virulence Networks in Mycobacterium
tuberculosis. Jesús Gonzalo-Asensio
Explorando el transcriptoma (ciano)bacteriano. RNAs no codificantes. Alicia M. Muro Pastor
Evaluación de 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA reductasa y fosfodiesterasa 4B como dianas
terapéuticas frente a la infección por Haemophilus influenzae. Javier Moleres
19:00-21:00 Beer Poster Session
MIÉRCOLES 11 de junio
9:00-11:00 Sesión VI: Antimicrobianos y Ecología
Moderador: Adela de la Campa
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Un mutante espontáneo de Enterococcus faecalis sensible a cefalosporinas: en el camino de
la identificación de nuevas vías de resistencia. Laura Carrilero
El comportamiento de plásmidos ColE1 durante la cohabitación. Alfonso Santos-Lopez
Mutagénesis inducida mediante el uso de antibióticos en Acinetobacter baumannii. Jesús
Aranda
Búsqueda de nuevos genes de resistencia a radiación UVB y UVC mediante técnicas
metagenómicas en ambientes extremos. José Eduardo González Pastor
Metagenómica de ambientes hipersalinos: nuevos microorganismos abundantes en salinas.
Antonio Ventosa
Explorando de la interacción entre cepas bacterianas cercanas mediante RNAseq. Pedro
González-Torres
Estudio del mecanismo de transporte del DNA extracelular en Bacillus subtilis. Alejandra
López Ibáñez de Aldecoa
11:00-11:30 Pausa Café
11:30-13:30 Sesión VII: Análisis Funcional de Macromoléculas
Moderador: Rafael Giraldo
Vías de toxicidad del prionoide RepA-WH1 en Escherichia coli. Laura Molina-García
The two faces of cyanobacterial FurA: a global regulator and a novel redox sensor. Laura
Botello-Morte
Caracterización de la interacción entre las proteínas RecA y CheW de Salmonella
entérica. Oihane Irazoki
Importancia de los mutantes individuales del sistema de dos componentes AbraA1/A2
de Streptomyces coelicolor en la producción de antibióticos y diferenciación. Margarita Díaz
Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible
plasmids. Álvaro San Millan
Adaptación de Staphylococcus aureus a la infección de la especie ovina. M. Ángeles Tormo-
Mas
Disruption of a phospholipid transporter affects the intrinsic resistance of Pseudomonas
aeruginosa to antimicrobial agents targeting bacterial membranes. Daniel Yero
Mapa funcional de la proteína GreA en Escherichia coli. Llorenç Fernández-Coll
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14:00-16:00 Comida
La Parrilla del Sirenas
C/ Juan Bravo, 30. 40001. Tlf. 921 462 654
16:00-17:00 Sesión de pósters
17:00-17:15 Entrega de premios
17:15-18:00 Presentación y entrega del Premio Biomedal y Clausura
18:00-18:30 Reunión del Grupo de Microbiología Molecular
18:30-19:30 Asamblea general de la SEM
21:00 Cena de clausura
Restaurante Palacio de La Floresta. C/ San Agustín, 27.
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S1-1
Srn135, un pequeño RNA no codificante que participa en la
regulación de la formación del pili en Streptococcus pneumoniae
Paloma Acebo, Cristina Herranz, Alicia Gómez-Sanz, Carmen Terrón, Daniel Luque y
Mónica Amblar.
Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III. Majadahonda, España
Introducción: Streptococcus pneumoniae es el principal agente etiológico de la neumonía adquirida
en la comunidad y una de las mayores causas de morbilidad y mortalidad entre niños y ancianos en
el mundo. Este patógeno humanoexpresa al menos 178 pequeños RNAs no codificantes (sRNAs),
88 de los cuales fueron identificados por nosotros. Aunque la función de la mayoría de estos sRNAs
aún se deconoce, se les atribuye un papel crucial como reguladores de procesos biológicos
íntimamente ligados con su virulencia.
Métodos: La expresión génica se analizó mediante northern blot y qRT-PCR. Los pili se observaron
por microcroscopía electrónica con tinción negativa. Se llevaron a cabo ensayos de adhesión celular
con células epiteliales de adenocarcinoma humano A549.
Resultados: Aproximadamente un 30% de los aislados clínicos neumocócicos presentan estructuras
de tipo pili en su superficie que están involucradas en adhesión y colonización. El pili está codificado
por un operon de 12 Kb que contiene 7 genes (rlrA, rrgA, rrgB, rrgC, srtB, srtC y srtD) y cuya
transcripción está regulada por la proteína RlrA. Uno de los sRNAs identificados en nuestro
laboratorio, el srn135, está localizado en éste operón y corresponde a la región 5’-UTR del mRNA
de rrgA, gen que codifica la adhesina del pili. Ensayos realizados con estirpes deficientes en el
srn135, así como estirpes sobreproductoras, demuestran que el srn135 participa en la regulación de
la formación del pili, afectando la capacidad de adhesión a células epiteliales y los niveles de
mensajero del regulador rlrA.
Conclusiones: El sRNA srn135 parece tener un papel dual en la regulación de la formación del pili,
regulando en cis los niveles de la adhesina RrgA y regulando en trans los niveles del activador
transcripcional RlrA. El srn135 es por tanto, un nuevo elemento regulador de la formación del pili en
Streptococcus pneumoniae.
Referencias:
- Acebo P, Martin-Galiano AJ, Navarro S, Zaballos A and Amblar M. RNA. 2012 Mar; 18(3):530-46
- De Angelis G, et al.. PLoS One. 2011;6(6):e21269
- Barocchi MA, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Feb 21;103(8):2857-62.
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S1-2
Adaptación de Staplylococcus aureus a la infección de la especie
ovina.
María Comos, Rodrigo Bacigalupe, Katerina Guzman, Mercedes Cervera, Ross
Fitzgerald y M. Ángeles Tormo-Mas.
Centro de Investigación y Tecnología Animal – Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias
Introducción: Staphylococcus aureus es una importante bacteria patógena debido a la enorme
variedad de infecciones y cuadros clínicos que es capaz de producir. S. aureus es capaz de infectar
a múltiples hospedadores y posee un elevado grado de especialización de las cepas en cuanto al
rango de hospedadores que pueden infectar. En este trabajo pretendemos determinar qué
características genotípicas permiten a S. aureus adaptarse e infectar la especie ovina, así como la
implicación de elementos genéticos móviles (EGM) en este proceso, tal y como se ha visto trabajos
previos (1).
Métodos: Infección experimental en mama ovina. Extración de DNA (110 cepas) y secuenciación
(Illumina MiSeq, librería Nextera, 200 bp) y análisis de secuencias.
Resultados: Para determinar los cambios necesarios para la adaptación de S. aureus a la especie
ovina, hicimos evolucionar dos cepas humanas tras sucesivos pases en mama de ovejas lactantes,
al mismo tiempo que infectabamos otros animales con cepas ovinas, para sirvieran como posibles
donadoras de EGM que pudieran contribuir en el proceso de adaptación. Tras evolucionar las cepas
se secuenciaron diferentes líneas evolutivas de las infecciones finales, intermedias, así como los
correspondientes controles de cepas evolucinados en el laboratorio. El análisis de las secuencias
mostró que en ningún caso las cepas humanas adquirieron EGM, pero reveló las diferencias
genéticas presentes en las cepas evolucionadas. Por úlitimo realizamos coinfecciones entre
diferentes cepas evolucionadas y las cepas salvajes que mostraron que algunas líneas evolutivas
habían adquirido ventajas que mejoraban su nivel infectivo.
Conclusiones: El análisis de las secuencias mostró los cambios producidos en el proceso de
adaptación de cepas humanas de S. aureus a la infección ovina. Durante el proceso de adaptación
las cepas no adquirieron EGM. Algunas de las líneas evolucionadas mostrarón que los cambios
genéticos sufridos durante la adaptación les aportaban ventajas en el proceso infectivo frente a las
cepas salvajes.
Referencias:
1. Viana D.*, Blanco J.*, Tormo-Más MA.*, Guinane C., Baselga R, Corpa J.M., Lasa I., Fitzgerald
J.R and Penadés J.R. 2010. Adaptation of Staphylococcus aureus to rumiant and equine hosts
involves SaPI-carried variants of von Willebrand factor binding protein. Mol Microbiol 77:1583-1594
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S1-3
Implicación del mensajero secundario c-di-GMP en la virulencia de
Salmonella Enteritidis.
Maite Echeverz, Begoña García, Iñigo Lasa, Cristina Solano
Instituto de Agrobiotecnología. Universidad Pública de Navarra-Consejo Superior de Investigaciones
Científicas. Pamplona-31006, SPAIN
El sistema de transducción de señal mediado por el nucleótido cíclico c-di-GMP controla, en un gran
número de bacterias, importantes funciones celulares tales como la movilidad, el desarrollo, la
síntesis de exopolisacáridos, la formación de biofilm y la virulencia. El c-di-GMP es producido por
proteínas con actividad diguanilato ciclasa que poseen el dominio GGDEF y es degradado por
aquéllas con actividad fosfodiesterasa que presentan el dominio PDE o HD-GYP. Con el objetivo de
determinar la implicación del c-di-GMP en la virulencia de Salmonella Enteritidis, se ha comparado
la virulencia de una cepa salvaje con la de una cepa mutante en los doce genes que codifican
proteínas con dominio GGDEF en Salmonella (mutante ΔXII) (Solano et al 2009) (Zorraquino et al
2013). Ensayos de colonización de ratones C57/BL6J tras coinfección de ambas cepas vía
intraperitoneal, vía oral e invasión de asa intestinal han mostrado que la cepa mutante ΔXII presenta
una atenuación moderada. En consecuencia, ratones infectados con la cepa ΔXII muestran una
mayor supervivencia que los infectados con la cepa salvaje. Dicha atenuación también se observa
en un modelo de colitis murina. Estos resultados demuestran que la ausencia de c-di-GMP causa
una atenuación parcial de la virulencia de la bacteria, y que por tanto esta vía de transducción de
señal no es esencial para la supervivencia de Salmonella en el huésped. Para poder identificar cual
es la proteína GGDEF responsable de la síntesis de c-di-GMP in vivo y consecuentemente de la
atenuación de la cepa ΔXII, estamos utilizando una colección de doce cepas, cada una de las
cuales contiene la copia cromosómica de uno de los doce genes que codifican proteínas GGDEF.
Esta colección se está analizando en un modelo de coinfección vía oral con cada una de las doce
cepas restauradas y las cepas salvaje y ΔXII. Los resultados de estos estudios nos permitirán
identificar la proteína GGDEF responsable de la síntesis de c-di-GMP durante el proceso de
infección.
Referencias:
1. Solano C., García B., Latasa C., Toledo-Arana A., Zorraquino V., Valle J., Casals J.,
Pedroso E. and Lasa I. 2009. Genetic reductionist approach for dissecting individual roles of
GGDEF proteins within the c-di-GMP signaling network in Salmonella. Proc Natl Acad Sci U
S A 106:7997–8002.
2. Zorraquino V., García B., Latasa C., Echeverz M., Toledo-Arana A., Valle J., Lasa I. and
Solano C. 2013. Coordinated cyclic-di-GMP repression of Salmonella motility through YcgR
and cellulose. J Bacteriol 195:417–428.
13
S1-4
Decoding the DSF-Quorum Sensing System of Stenotrophomonas
maltophilia
Pol Huedo, Daniel Yero, Iratxe Estibariz, Sònia Martinez-Servat, Àngels Ruyra, Nerea
Roher, Xavier Daura and Isidre Gibert
Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IBB), Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 08193
Bellaterra, Cerdanyola del Vallès (Barcelona). Departament de Genètica i de Microbiologia,
Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 08193 Bellaterra, Cerdanyola del Vallès (Barcelona).
Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), E-08010 Barcelona.
[email protected]; [email protected]
Introduction: Stenotrophomonas maltophilia is an emerging nosocomial pathogen that shares the
DSF-Quorum Sensing (QS) system with the members of Xanthomonadales. However, little is known
about the implication of the DSF-QS in the regulation of virulence factors in this bacterium.
Methods: rpfF gene was amplified and sequenced in a panel of 78 S. maltophilia clinical isolates.
DSF production was tested on Xanthomonas campestris pv campestris 8523 bioassay. Mutants
∆rpfF and ∆rpfC were obtained by allelic exchange recombination using antibiotic resistance
cassette for erythromycin. Biofilm formation was tested in glass and polystyrene surfaces and
revealed using crystal violet staining. Swarming motility was performed on modified M9 0.5% agar
medium and virulence ability was evaluated in Caenorhabditis elegans and adult Zebrafish infection
models.
Results: We have observed that two rpf clusters (named rpf-1 and rpf-2) with main differences in the
N-terminus of RpfF (DSF Synthase) and RpfC (DSF sensor) are distributed among the S. maltophilia
population. RpfF variant encoded by rpf-1 was found in the 60% of strains always associated with
the same RpfC variant (RpfF-1/RpfC-1), meanwhile rpf-2 was found in the remaining 40% of strains
harboring the RpfF-2/RpfC-2 variant association. We have observed that the RpfC-2 variant lacks
five trans membrane regions in its N-terminal region. Taking E77 (RpfF/C-1) and M30 (RpfF/C-2) as
representative strains, we have observed, using several approaches, that only strains harboring
RpfF/C-1 combination showed DSF production under wild type conditions. We have showed that the
DSF-deficient phenotype observed in RpfF/C-2 variant strains is due to the permanent repression
that RpfC-2 exerts on RpfF-2. In addition, we showed that only in the RpfF/C-1 background, DSF-QS
regulates biofilm formation, swarming motility and virulence.
Conclusions: Only strains harboring the RpfF/C-1 combination display DSF production and regulate
biofilm formation, swarming motility and virulence. RpfF-2 is however functional on DSF production
but it is permanently repressed by RpfC-2. The missing of five trans membrane domains in the RpfC-
2 makes this component incompetent on DSF detection acting only as RpfF-2 repressor.
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S1-5
Methyl-hydroxylamine specifically inhibits ribonucleotide
reductase activity in pathogenic bacteria
Esther Julián, Aida Baelo and Eduard Torrents
Dept. de Genètica i de Microbiologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona,
08193, Bellaterra. Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), Bacterial infections and
antimicrobial therapies group. Baldiri Reixac 15-21, 08028, Barcelona.
Infectious diseases constitute a tenacious and major public-health problem all over the world. For
many years, antibiotic-resistant pathogens have been recognized as one of the main threats to
human survival, and some experts predict a return to the pre-antibiotic era. The emergence and
increasing prevalence of bacterial strains that are resistant to available antibiotics demand the
discovery of new therapeutic approaches. Meanwhile, an equally alarming decline has occurred in
the research and development of new antibiotics to deal with the threat. Certain virulence factors
have been shown to be potential targets for drug design and therapeutic intervention, whereas new
insights are crucial for exploiting others (1).
Bacterial DNA synthesis opens new horizons in the discovery of new antibacterial targets due to
remarkable differences to the eukaryotic system (2). During the course of infection, a great number
of bacteria need to multiply inside the body and for that require active DNA synthesis with balanced
deoxyribonucleotides (dNTPs) concentration. The key enzyme that provides the nucleotide
precursors for DNA replication and repair is RiboNucleotide Reductase (RNR). This enzyme is a
suitable target candidate for inhibition of bacterial growth. Three major classes of this enzyme are
known (class I, II and III). Class I RNRs (with subclasses Ia (nrdAB) and Ib (nrdEF)) carry a stable
tyrosyl radical and are oxygen dependent thus only work during aerobic conditions, class II RNRs
(nrdJ) require the vitamin B12 cofactor 5’-deoxyadenosylcobalamin and are oxygen-independent, and
class III RNRs (nrdD, with their cognate nrdG activase) carry a stable glycyl radical and are oxygen-
sensitive and only work under strict anaerobic conditions (3).
In this work we have firstly identify the radical scavenger methyl-hydroxylamine (M-HA) as an
efficacious antimicrobial agent that inhibit gram-negative and gram-positive pathogenic bacteria,
targeting the RNR enzyme. Later, we have focus our work studying the ability of M-HA to inhibit the
intracellular growth of Mycobacteria on macrophages, and the formation of Pseudomonas
aeruginosa biofilms.
References:
Davis, J. (2008). EMBO Rep. 9 Suppl 1:S18-21
1. Torrents, E., et al. (2005). Proc Natl Acad Sci USA 102:17946-51
2. Torrents, E. (2014). Ribonucleotide reductases: essential enzymes for bacterial life. Front.
Cell. Infect. Microbiol. 4:52
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S1-6
Estudio funcional y estructural de la región B de Bap y su rol en el
desarrollo de biofilms en S. aureus.
Agustina Taglialegna, Alejandro Toledo-Arana, Cristina Solano, Iñigo Lasa y Jaione
Valle
Laboratorio de Biofilms Microbianos. Idab-Universidad Pública de Navarra-CSIC. Pamplona
Introducción: La familia de proteínas BAP (Biofilms-Associated Protein) constituye uno de los
elementos comunes al proceso de formación de la matriz del biofilm en diversas especies
bacterianas. Los miembros de esta familia presentan varias características comunes: (i) alto peso
molecular; (ii) número elevado y variable de repeticiones; (iii) pueden estar contenidas en islas de
patogenicidad. La proteína Bap de S. aureus fue el primer miembro de la familia BAP identificado.
Bap es una proteína de 2,276 aminoácidos que promueve el desarrollo de biofilms sobre superficies
abióticas así como la adhesión intercelular, siendo ambos procesos inhibidos en presencia de Ca+2
.
Se ha observado además, que esta proteína contiene dos motivos coiled-coil que podrían permitir la
interacción entre proteínas Bap, y varios motivos EF-hand involucrados en la interacción con Ca+2
(Cucarella et al. 2001; Arrizubiet et al., 2004).
Métodos: Se construyeron proteínas quiméricas conteniendo diferentes regiones de Bap fusionadas
con el dominio R del Clumping Factor A para determinar cual es la mínima región de la proteína
necesaria para mediar la formación de biofilm. Además, se realizó un estudio estructural de la región
B de Bap mediante el uso de diversas técnicas biofísicas (velocidad de sedimentación, SEC-
MALLS, 1D-NMR, dicroísmo circular y filtración en gel) para poder determinar su estado
conformacional y oligomerico en ausencia y presencia de Ca+2
.
Resultados: El análisis fenotípico de las complementaciones con las proteínas quiméricas
conteniendo diferentes regiones de Bap muestra que la mínima región de Bap capaz de inducir la
formación del biofilm es la región B. Cepas de S. aureus biofilm-negativas complementadas con la
región B son capaces de formar biofilm. Mediante técnicas biofísicas se observa que la región B de
Bap forma dímeros en ausencia de calcio, encontrándose en forma monomérica cuando el catión
esta presente en el medio. La espectroscopia de dicroísmo circular sugiere que el calcio genera un
leve cambio conformacional en la estructura de Bap, aumentando su estabilidad
Conclusiones: El calcio juega un papel clave en la regulación del proceso de formación del biofilm
proteico mediado por Bap: (i) su ausencia en el medio permitiría que dos proteínas Bap
provenientes de células diferentes interaccionen entre sí a través de la región B formando dímeros
anti-paralelos que conducirían a la formación del biofilm; (ii) el calcio interaccionaría con los motivos
EF-hand, evitando la formación de dímeros e irrumpiendo la formación del biofilm.
Referencias:
Cucarella C, Solano C, Valle J, et al. (2001) Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved
in biofilm formation. Journal of bacteriology, 183, 2888-2896.
Arrizubieta, M. J., Toledo-Arana, A., Amorena, B., Penadés, J. R., & Lasa, I. (2004). Calcium inhibits
bap-dependent multicellular behavior in S. aureus. Journal of Bacteriology, 186(22), 7490–7498
16
S2-1
Characterization of mutants in genes putatively involved in
Brucella core lipopolysaccharide synthesis.
Miriam Salvador Bescós, Raquel Conde Álvarez, Ignacio Moriyón Uría, Maite Iriarte
Cilveti.
Universidad de Navarra – Departamento de Microbiología y Parasitología, Instituto de Salud
Tropical.
Introducción: Brucella es el agente causal de la brucelosis, una de las zoonosis más importantes
según la OMS. El lipopolisacárido (LPS) de esta bacteria juega un papel activo en la virulencia y es
difícilmente reconocido por el sistema inmune (Moriyón and Berman, 1982). Se conocen algunas
glicosiltransferasas implicadas en la transferencia de azúcares al núcleo del LPS de Brucella.
Mutantes en una de ellas (WadC) están atenuados, inducen una mayor respuesta inmune y
protegen mejor que las vacunas actuales frente a la infección por Brucella (Conde-Álvarez et al.,
2012). La estructura del núcleo del LPS de Brucella ha sido recientemente elucidada y sugiere que
debe de haber otras glicosiltransferasas implicadas en su síntesis. Una búsqueda bioinformática
realizada sugiere varios genes candidatos, entre los que se encuentran BAB2_0133 (hipotética
glicosiltransferasa) y BAB2_0134 (hipotética deshidrogenasa).
Métodos: Se construyeron mutantes en los genes BAB2_0133 y BAB2_0134; se analizaron sus LPS
mediante geles de poliacrilamida y su reactividad frente a diferentes anticuerpos que reconocen la
cadena O y el núcleo. Además se estudiaron sus características de crecimiento y su interacción con
distintos componentes del sistema inmune.
Resultados: Los mutantes en BAB2_0133 y BAB2_0134 mantienen la reactividad de sus LPSs
frente a anticuerpos que reconocen el núcleo y la cadena-O. Al comparar las tasas de crecimiento
de los mutantes con la cepa parental no se observan diferencias. Los mutantes son igualmente
sensibles a la acción del suero no inmune y a los péptidos catiónicos que la cepa parental.
Conclusiones: Estos Resultados sugieren que los mutantes en BAB2_0133 y BAB2_0134 no
presentan alterados sus LPS ni su interacción con los componentes del sistema inmune analizados.
Por ello, el estudio del resto de posibles glicosiltransferasas identificadas podría ayudar a conocer la
síntesis del núcleo del LPS de Brucella y mejorar las vacunas existentes frente a la brucelosis.
Referencias:
- Conde-Álvarez,R.; Arce-Gorvel,V.; Iriarte,M.; Mancek-Keber,M.; Barquero-Calvo,E.; Palacios-
Chaves,L.; Chacon-Diaz,C.; Chaves-Olarte,E.; Martirosyan,A.; von Bargen,K.; Grillo,M.J.; Jerala,R.;
Brandenburg,K.; Llobet,E.; Bengoechea,J.A.; Moreno,E.; Moriyón,I.; Gorvel,J.P. (2012). The
lipopolysaccharide core of Brucella abortus acts as a shield against innate immunity recognition. PLoS
Pathog., 8, 5, e1002675.
- Moriyón, I., Berman, D. T. (1982). Effects of nonionic, ionic, and dipolar ionic detergents and EDTA
on the Brucella cell envelope. J Bacteriol 152: 822-828.
17
S2-2
Protección mediada por hidrolasas de pared celular de
neumococo frente a la sepsis neumocócica
Bruno Corsini, Sandra Martín, Susana Ruiz, Leire Aguinagalde, Irene Mata, Marisol
Escolano, Pedro García, Ernesto García, Jose Yuste.
Laboratorio de Neumococos. Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Madrid.
Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid.
CIBER de Enfermedades Respiratorias. CIBERES.
Introducción: Las vacunas antineumocócicas que existen actualmente están basadas en
polisacáridos capsulares y aunque han mostrado ser eficaces para reducir la incidencia de
enfermedad neumocócica invasiva, tienen como principal limitación que protegen frente a un
número limitado de serotipos. Es por ello por lo que se hace necesaria la búsqueda de proteínas
conservadas de neumococo que puedan utilizarse como candidatas a una vacuna universal
proteica. En este estudio se ha caracterizado la capacidad protectora de las hidrolasas de pared
celular de neumococo LytA, LytB, LytC y Pce.
Métodos: Se inmunizaron diferentes grupos de ratones BALB/C con las proteínas LytA, LytB, LytC y
Pce en presencia de Alhydrogel como adyuvante, a lo largo de tres semanas. Se obtuvo suero que
contenía anticuerpos específicos frente a estas proteínas y se analizó mediante citometría de flujo la
capacidad de estos anticuerpos para inducir la activación de la inmunidad mediada por el sistema
del complemento y la opsonofagocitosis frente a diferentes aislados clínicos invasivos. Además, se
evaluó la actividad protectora de estas proteínas utilizando un modelo murino de sepsis
neumonócica estudiando su capacidad para reducir los niveles de bacteria en sangre e incrementar
la supervivencia.
Resultados: Los Resultados de este estudio confirman que la inmunización frente a las cuatro
proteínas estimula el reconocimiento de neumococo por la inmunidad mediada por el sistema del
complemento al activar la vía clásica a través del primer componente C1q. También se observó que
los anticuerpos generados frente a estas proteínas incrementan la fagocitosis de la bacteria
mediada por neutrófilos polimorfonucleares. La vacunación de ratones con la combinación de estas
proteínas incrementó la supervivencia de los mismos aunque no se alcanzaron niveles totalmente
protectores.
Conclusiones: La inmunización con las proteínas del estudio, origina anticuerpos específicos que
inducen la activación de la inmunidad del complemento permitiendo un mayor reconocimiento por el
componente clave C3b y como consecuencia una mayor fagocitosis. En los experimentos de sepsis
neumocócica se observó protección parcial cuando se inmunizaron los ratones con proteínas de
forma independiente y se obtuvieron niveles superiores de protección cuando se inmunizaron con la
combinación de las 4 proteínas de forma simultánea.
18
S2-3
Los perfiles de proteínas de superficie de Streptococcus
pneumoniae se correlacionan con tipo de patología
Arnau Domenech, Carmen Ardanuy, Josefina Liñares, Adela G. de la Campa, Antonio
Javier Martín Galiano
Servicio de Microbiología, Hospital Universitari de Bellvitge, Univ. Barcelona, IDIBELL, Barcelona.
Instituto de Salud Carlos III, Centro Nacional de Microbiología. Majadahonda. Madrid. CIBER de
Enfermedades Respiratorias (CIBERES). Presidencia. Consejo Superior de Investigaciones
Científicas, Madrid.
Introducción: Streptococcus pneumoniae causa distintas patologías con epidemiologías ligadas a
diferentes tipos de cápsula polisacarídica y linaje genético. La variabilidad clínica observada entre
cepas de distintos, e incluso dentro de los mismos, complejos clonales se basa en la adquisición de
material genético relacionado con factores de patogenicidad. Las proteínas externas son, junto a la
cápsula, los principales factores de virulencia debido a su interacción con moléculas del paciente
durante el proceso infectivo.
Métodos: Se han diseñado oligonucleótidos específicos para determinar la presencia y tipo de alelo
de genes de proteínas externas en aislados clínicos del Hospital Universitario de Bellvitge. Se ha
desarrollado un algoritmo para calcular las distancias entre los perfiles de proteínas externas
observados y se han agrupado mediante árboles jerárquicos utilizando el software R. La correlación
entre los factores de virulencia se cuantificó por Chi-cuadrado y test exacto de Fisher.
Resultados: Se seleccionaron nueve proteínas externas, de las 54 estudiadas, por presentar
suficiente variabilidad alélica entre 25 cepas con genoma completo secuenciado. Se ha explorado
esta variabilidad en 95 aislados clínicos que presentaban distintas combinaciones serotipo-genotipo.
Sólo dos de estas proteínas mostraron, por separado, una correlación significativa con el fenotipo
clínico. Alternativamente, se analizaron las combinaciones de las 9 proteínas, que dieron lugar a 59
perfiles no redundantes. Estos perfiles se agrupaban en 16 surfogrupos, no necesariamente ligados
clonalmente, cuyos miembros compartían al menos 5 alelos. Los surfogrupos estaban ligados a un
único comportamiento patogénico, salvo en cuatro sufogrupos cuyas diferencias entre sus miembros
recaían en uno o dos genes, particularmente en el alelo de pppA. Siete de los factores de virulencia
considerados tendían a co-localizar en los distintos aislados, sugiriendo la existencia de redes
proteicas de patogenicidad.
Conclusiones: El surfotipado constituye una prometedora herramienta postgenómica de clasificación
neumocócica, alternativa al sistema MLST. El conjunto de proteínas de superficie de un aislado
presenta una relación compleja con su comportamiento epidemiológico, siendo las combinaciones
alélicas de los diferentes genes más determinantes que las de cada gen independientemente. El
mapeado exhaustivo de esta relación podría utilizarse en la predicción de la patogenicidad de
clones emergentes.
19
S2-4
Deciphering the involvement of ribonucleotide reductase in
adherent-invasive Escherichia coli LF82 infection
Nicolas Dreux, Maria del Mar Cendra, Arlette Darfeuille-Michaud, Nicolas Barnich,
Eduard Torrents
Clermont Université, M2iSH « Microbe intestin inflammation et Susceptibilité de l’Hôte », UMR 1071
Inserm/Université d’Auvergne; Unité Sous Contrat Institut National de la Recherche Agronomique
2018, Clermont-Ferrand F-63001, France; Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), Bacterial
infections and antimicrobial therapies group. Baldiri Reixac 15-21, 08028, Barcelona, Spain. Institut
Universitaire de Technologie, Génie Biologique, Aubière F-63172, France.
A critical step in the life cycle of all organisms is the duplication of the genetic material during cell
division. Ribonucleotide reductases (RNRs) are essential enzymes for this step because they control
the de novo production of the deoxyribonucleotides required for DNA synthesis and repair.
Enterobacteriaceae have three functional classes of RNRs (Ia, Ib and III), which are transcribed from
separate operons and encoded, respectively by the genes nrdAB, nrdHIEF and nrdDG. Here, we
investigated the role of RNRs in the virulence of adherent-invasive E. coli (AIEC) isolated from
Crohn’s disease (CD) patients. Interestingly, the LF82 strain of AIEC harbors four different RNRs
(two class Ia, one class Ib and one class III). Although the E. coli RNR enzymes have been
extensively characterized both biochemically and enzymatically, little is known about their roles
during bacterial infection. We found that RNR expression was modified in AIEC LF82 bacteria during
cell infection, suggesting that RNRs play a crucial role in AIEC virulence. Knockout of the nrdR gene,
which encodes a transcriptional regulator of RNRs, decreased AIEC LF82’s ability to adhere to
intestinal epithelial T-84 cells, to interact with the ileal mucosa using ileal loop modeling and to
colonize the gut mucosa of transgenic mice that express human CEACAM6. Microarray experiments
demonstrated that NrdR plays a crucial role in AIEC virulence by interfering with bacterial motility
and chemotaxis. Thus, the development of drugs targeting RNR classes could be a promising new
strategy to control gut colonization by AIEC bacteria in CD patients.
20
S2-5
SP1992 es una proteína externa dimórfica de Streptococcus
pneumoniae implicada en enfermedad invasiva
María de la Soledad Escolano, Arnau Domenech, Jose Yuste, María I.
Cercenado, Carmen Ardanuy, Josefina Liñares, Adela G. de la Campa y Antonio J.
Martin-Galiano.
Instituto de Salud Carlos III, Centro Nacional de Microbiología, Majadahonda, Madrid. Servicio de
Microbiología, Hospital Universitari de Bellvitge, Universitat de Barcelona, Barcelona. CIBER de
Enfermedades Respiratorias (CIBERES). Presidencia. Consejo Superior de Investigaciones
Científicas, Madrid, España
Introducción: Las proteínas de superficie juegan un papel crucial en patogénesis bacteriana. Estas
proteínas pueden mostrar variantes alélicas con diferente número de repeticiones, lo que repercute
en su función e inmunogenicidad. La proteína SP1992 de Streptococcus pneumoniae está
codificada por un gen que presenta dos variantes alélicas de distinto tamaño debido a la presencia
de una o dos repeticiones de un motivo de 45 residuos.
Métodos: Se construyeron los mutantes de delección D39-Δspd1789 (alelo corto) y TIGR4-Δsp1992
(alelo largo) mediante substitución de los genes por un casette de resistencia a cloranfenicol. De
estos mutantes se estudió in vitro: adhesión e invasión utilizando la línea celular A549 (epitelio
pulmonar); opsonofagocitosis en la línea celular HL-60 (neutrófilos); y capacidad de evadir la
inmunidad mediada por el complemento midiendo por citometría de flujo la interacción con C3b. Se
realizaron ensayos in vivo para simular las condiciones de sepsis y neumonía, respectivamente, co-
infectando modelos murinos con el mutante y su cepa silvestre respectiva (1:1) y se calculó del
índice de competitividad (CI) en virulencia.
Resultados: En términos de adhesión pulmonar, no se observaron diferencias significativas en
ninguna de las cepas estudiadas. Sin embargo, en la invasión, sí que se observaron diferencias
significativas (p=0.0300) entre la cepa TIGR4 y su mutante. No ocurrió así con la cepa D39 y su
mutante sugiriendo que las cepas con el alelo largo invaden mejor el epitelio pulmonar. El
reconocimiento por el componente C3b fue similar entre las diferentes cepas del estudio. Los
estudios con neutrófilos demostraron que el mutante Δsp1992 fue reconocido de modo más eficaz
por estas células en comparación a la cepa silvestre (p<0.0001) lo que sugiere que las cepas con el
alelo largo evaden mejor la fagocitosis del huésped. El mutante Δspd1789 presentó una atenuación
leve en neumonía (CI: 0.35), mientras que Δsp1992 mostró una pérdida acentuada de invasividad
(CI: 0.12).
Conclusiones: El alelo con dos repeticiones tiene más relevancia en el proceso de invasión que el
alelo que posee una única repetición. Este efecto justifica, al menos en parte, los comportamientos
patógenos primarios y oportunistas respectivamente, de los aislados clínicos que los poseen.
21
S2-6
Papel de los factores Gre en la fisiología y patogenicidad de
Salmonella: invasión de células epiteliales
Tania Gaviria, Llorenç Fernàndez-Coll & Carlos Balsalobre
Universidad de Barcelona
Introducción: El estudio estructural de la ARN polimerasa (ARNpol) bacteriana ha permitido definir
un espacio entre las subunidades denominado canal secundario, que conecta el medio exterior con
el centro catalítico, actuando como una entrada para el paso de los nucleótidos. Además, se ha
demostrado que diferentes moléculas reguladoras, entre las cuales se encuentran los factores Gre,
interaccionan con este canal secundario, modulando diversas actividades de la ARNpol. En
Escherichia coli se han descrito 3 principales funciones de los factores Gre: 1) facilitar el escape de
la ARNpol del promotor, reduciendo el número de fenómenos de transcripción abortiva; 2) suprimir
los estados de pausa de la ARNpol que pueden tener lugar durante el proceso de la elongación de
la transcripción; 3) promover la actividad correctora de la ARNpol (1, 2).
El objetivo de este trabajo es entender el papel de los factores Gre en la regulación de la expresión
génica en Salmonella entérica serovar typhimurium.
Métodos: Estudios transcripcionales mediante microarrays se realizaron con cultivos crecidos a
37ºC hasta inicio de fase estacionaria de la cepa SV5015 (WT) y las mutantes derivadas greA, greB
y greAgreB. Análisis de proteínas secretadas y ensayos de invasión de células HT-29 se llevaron a
cabo en las mismas cepas.
Resultados: Los ensayos transcripcionales de la cepa deficiente de GreA y GreB (mutante doble)
muestran una importante reducción de la expresión de 36 de los 39 genes de la isla de
patogenicidad 1 (SPI-1) que codifican un sistema de secreción tipo 3 y varias proteínas efectoras
que median la invasión de células epiteliales. En el caso de las mutantes simples, no hubo una
reducción significativa en la expresión de estos genes. Estudios del secretoma y ensayos de
invasión de células epiteliales confirman los anteriores resultados.
Conclusiones: Los factores Gre juegan un importante papel en la patogenicidad de Salmonella,
como se evidencia por la ausencia de invasión en cepas deficientes para ambos factores.
Referencias:
1. Aberg et al., (2009) Similar and divergent affects of ppGpp and DksA deficiencies on
transcription in Escherichia coli. Journal of Bacteriology vol.191, p. 3226-36
2. Potrykus et al., (2006) Antagonistic regulation of Escherichia coli ribosomal RNA rrnB P1
promoter activity by GreA and DksA. J Biol chem 281: 15238 – 15248
22
S2-7
Las islas de patogenicidad de Staphylococcus aureus son
capaces de controlar factores de virulencia cromosómicos.
Katerina Guzman, Mercedes Cervera, Alejandro Toledo-Arana, Iñigo Lasa y M.
Ángeles Tormo-Mas
Centro de Investigación y Tecnología Animal – Instituto Valenciano de Investigaciones Agraria
Introducción: Staphylococcus aureus es una importante bacteria patógena, debido a la enorme
variedad de infecciones que es capaz de producir. La enorme versatilidad de S. aureus se debe a su
habilidad para persistir y multiplicarse en diferentes ambientes junto con su capacidad para producir
una gran variedad de factores de virulencia, algunos de las cuales están codificadas en elementos
genéticos móviles (EGMs), como bacteriófagos e islas de patogenicidad (SaPI) (1). Sobre el 90% de
las cepas de S. aureus aisladas de infecciones humanas están pigmentadas. Staphyloxanthin (STX)
es un carotenoide considerado como factor de virulencia, ya que contribuye a la evasión del sistema
inmune. Por otro lado, la N-acetiltransferasa (GNAT) está implicada en resistencia a antibióticos. En
este trabajo describimos como las SaPIs son capaces de regular la producción de factores de
virulencia como son STX y GNAT.
Métodos: Tiling array. qPCR. Obtención de mutantes por delección. Clonación. Extracción y
purificación del carotenoide. Western blot.
Resultados: Tras el análisis del tiling array realizado en distintas cepas de S. aureus, en el que
estudiabamos las diferencias de expresión en presencia o ausencia de la SaPI, observamos que en
presencia SaPI inducida, se producía un aumento de expresión del operón crtOPQMN (responsable
de la producción de STX) y del locus SAOUHSC_02886 responsable de la producción de GNAT.
Una vez confirmados estos resultados mediante qPCR, decidimos estudiar que Orfs de la SaPIbov1
se encontraban implicadas en el proceso. Nos centramos en el opeón I ya que este aumenta su
expresión cuando se induce la respuesta SOS y analizamos la producción de STX en los mutantes
de las distintas Orfs de dicho operon. Así observamos que la Orf7 y la Orf6 de SaPIbov1 están
implicadas en este proceso. Al complementar con las distintas Orfs y combinaciones de las mismas,
demostramos que la Orf7 era la principal responsable del aumento de expresión de STX y que la
Orf6 contribuía a dicho aumento. El análisis de la complementación con proteínas similares
presentes en otras SaPIs nos indicó que este proceso se encontraba ampliamente distribuido. El
análisis por western-blot demostró que la Orf6 aumentaba la expresión de la Orf7. Por último el
análisis mediante qPCR indicó que la complementación con las Orf6-7 aumentaba
considerablemente tanto la expresión del operón crtOPQMN como del locus SAOUHSC_02886.
Conclusiones: En este trabajo describimos un nuevo proceso por el cual las SaPIs contribuyen a la
virulencia de las cepas de S. aureus ya que son capaces de controlar factores de virulencia
presentes en el cromosoma de las mismas.
Referencias:
1. Novick RP, Christie GE, Penadés JR. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat Rev Microbiol. 2010 Aug;8(8):541-51.
23
S2-8
Altos niveles de recombinación homóloga y homeóloga en cepas
patógenas Escherichia coli.
Jerónimo Rodríguez-Beltrán, Jérome Tourret, Olivier Tenaillon, Elena López, Coloma
Costas Ivan Matic, Erick Denamur, Jesús Blázquez.
Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), Centro Nacional de Biotecnología, Faculté de Médecine
Xavier Bichat, Paris, Hospital Universitario La Paz, Faculté de Médecine Paris Descartes.
[email protected]; [email protected]
Introducción: La mutación y la recombinación son los motores del cambio genético y, por tanto, de la
adaptación a nuevos nichos y situaciones de estrés. Es claro que una alta tasa de mutación y/o
recombinación supondría una gran ventaja frente a un cambio medioambiental. En los últimos años
se han producido grandes avances en el conocimiento de las tasas de mutación en aislados
naturales bacterianos.
Sin embargo, poco se conoce sobre el otro gran mecanismo de generación de novedad genética, la
recombinación, en poblaciones naturales.
Escherichia coli es un microorganismo comensal en los vertebrados pero que puede producir
diferentes tipos de infección. Esta aparente dicotomía en su estilo de vida se ha asociado, entre
otros factores, a la adquisición de islas de patogenicidad. Por lo tanto, E. coli es un buen candidato
para estudiar las bases genéticas de la transición entre comensalismo y patogenicidad.
Que existe una relación directa entre virulencia y recombinación no es una novedad. Se sabe,
desde hace años, que las cepas patógenas de E. coli han sufrido un número mayor de eventos de
recombinación que las cepas comensales. Sin embargo, las técnicas empleadas, principalmente
“Multilocus Sequence Typing” (MLST), para establecer esta relación presentan algunos
inconvenientes: tienen poca resolución y no pueden separar los eventos genéticos del proceso de
selección, ya que se estudian eventos producidos en el pasado.
Métodos: Se han construido sistemas genéticos para cuantificar el número de eventos de
recombinación que suceden en una población bacteriana. Se han determinado las tasas de
recombinación homóloga y homeóloga de una colección de más de 200 cepas naturales de E. coli.
Además, se han caracterizado diferentes parámetros relevantes para cada una de las cepas como
la tasa de mutación, el grado de virulencia, patogenicidad y la familia filogenética.
Resultados: El principal resultado de nuestra investigación es que la recombinación en E. coli está
ligada a la virulencia, ya que las cepas patógenas poseen tasas de recombinación, tanto homóloga
cómo homeóloga, significativamente mayores.
Conclusiones: La medida de las tasas de recombinación mediante el uso de sistemas genéticos
directos construidos “ad hoc” permite una aproximación directa al problema, sin los inconvenientes
de las medidas indirectas (distinción entre mutación y recombinación y separación entre eventos
genéticos y procesos de selección, entre otros). El mayor potencial de recombinación en las cepas
patógenas puede estar relacionado con una mayor capacidad para adquirir elementos de
patogenicidad o con un mayorrequerimiento para mantener un alto potencial evolutivo con el fin de
adaptarse a las defensas del huésped siempre cambiantes.
24
S2-9
Regulación por Hfq en Brucella abortus.
Félix J. Sangari, Candela González-Riancho, Iñigo Pariza, Asunción Seoane, y Juan
M. García-Lobo.
Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria, e Instituto de Biomedicina y
Biotecnología de Cantabria (IBBTEC), UC/CSIC/SODERCAN, Albert Einstein 22, 39011 Santander.
Brucella spp es un patógeno intracelular capaz de establecerse y permanecer por largo tiempo en el
medio hostil del fagosoma de los macrófagos, y el agente etiológico de la brucelosis, una de las
zoonosis más importantes a nivel mundial. Aunque cada vez es mayor nuestro conocimiento de los
factores de virulencia presentes en este género, sabemos todavía muy poco de la regulación post-
transcripcional de los mismos a nivel de RNA, más allá del hecho de que la mutación de hfq en B.
abortus afecta profundamente tanto a la virulencia como a diversas respuestas ante el estrés. Salvo
unos pocos casos descritos en la literatura, se desconocen las dianas de Hfq, tanto de mRNAs
como de RNAs pequeños no codificantes (sRNAs), y si su acción se ejerce a través de algún
regulador intermedio (factores de transcripción, factores sigma alternativos), o directamente, y en
qué casos se usa cada mecanismo. Para avanzar en el conocimiento de los factores de virulencia
de Brucella y su regulación hemos determinado el transcriptoma de una cepa silvestre de B. abortus
y su correspondiente mutante isogénico ∆hfq. A partir de resultados obtenidos por RNA-seq hemos
generado una lista de 140 posibles sRNAs cuyo nivel de transcripción, junto con los de CDS y
tRNAs, ha sido evaluado en los dos fondos genéticos. Algunos sRNAs seleccionados han sido
comprobados por Northern blot, y sus extremos 3’ y 5’ determinados. Se han identificado un total de
158 CDS con expresión diferencial (21 incrementada y 137 disminuída), así como 42 tRNAs con
expresión disminuída, y 87 sRNAs (22 con expresión aumentada y 65 con expresión disminuída)
dependientes de Hfq. Entre los genes afectados abundan los transportadores de diferentes tipos,
así como diversos reguladores transcripcionales y genes de virulencia que pueden contribuir a
elucidar los circuitos reguladores de la virulencia en este género.
25
S2-10
tmRNA is crucial for oxidative stress adaptation and antibiotic
resistance in the human pathogen Streptococcus pneumoniae
Joana Wilton, Alicia Gómez-Sanz, María José Ferrandíz, Cristina Herranz, Paloma
Acebo, Adela G de la Campa, Mónica Amblar
Instituto de Salud Carlos III
Introduction: The human pathogen Streptococcus pneumoniae (Spn) is the major cause of
pneumonia worldwide. Recently we have found Spn expresses at least 88 small non-coding RNAs
(sRNA), yet role in regulating gene expression and hence its virulence mechanisms are
understudied.
Methods: The MIC was determined through the standard assay. Cell survival after exposure to
antibiotics was assayed by plating and counting CFU grown overnight. Sensitivity to external and
internal oxidative stress was measured by CFU counting after exposure to H2O2 and paraquate,
respectively. Expression of important oxidative stress genes was assayed through qRT-PCR.
Results: Several sRNA are important for pneumococcus biology and virulence processes. We have
demonstrated that, inactivating the tmRNA impairs growth and influences resistance to oxidative
stress, which may consequently triggers attenuation of virulence. Importantly, we have exposed the
tmRNA- mutant to different antibiotics and have found alterations in sensitivity to certain types of
antibiotics, thus demonstrating a correlation between the tmRNA and resistance to several
antibiotics.
Conclusions:
1. Small tmRNA is crucial for resistance to oxidative stress in pneumococcus, presumably connected
to its role in the trans-translation system.
2. Absence of tmRNA in Spn highly increases resistance to levofloxacin and moxifloxacin but not to
other antibiotics, apparently connected with its role in resistance to oxidation.
References:
Acebo P, Martin-Galiano AJ, Navarro S, Zaballos Á; Amblar M, RNA 2012,18:530-546.
Ferrándiz M, and de la Campa A G Antimicrob. Agents Chemother. 2014;58:247-257.
Cornick E, Bentley SD, Microbes and Infection 2012,12:573-583.
Shpanchenko OV, Golovin AV, Bugaeva EY, Isaksson LA, Dontsova OA, Life 2012, 62(2):
120-124
26
S3-1
Análisis multiómico en respuesta a salinidad y temperatura de la
bacteria halófila Chromohalobacter salexigens
Montserrat Argandoña, Manuel Salvador, Francine Piubeli, Joaquín J. Nieto y
Carmen Vargas
Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla
Introducción: La bacteria halófila Chromohalobacter salexigens es un productor natural de ectoinas,
solutos compatibles que acumula en respuesta al estrés osmótico y térmico. Estas moléculas tienen
la capacidad de estabilizar a las proteínas celulares, lo que les confiere un enorme potencial
biotecnológico en campos como la dermofarmacia, la biología molecular o biomedicina. Con vistas a
generar un amplio conocimiento sobre su metabolismo, especialmente en relación a la síntesis de
ectoínas, para así optimizar su ingeniería metabólica y mejorar la producción de las mismas, se ha
desarrollado una estrategia basada en la Biología de Sistemas. Mediante la integración de datos
experimentales globales obtenidos mediante diferentes técnicas “ómicas” con técnicas
bioinformáticas de modelado se podrán realizarán simulaciones y predicciones “in silico” para la
obtención de los fenotipos más favorables para la producción ectoinas.
Métodos: Se realizó un análisis diferencial del transcriptoma (RNA-seq por SOLID), proteoma (2D-
DIGE) y metaboloma (HPLC-MS y GC-MS) en respuesta a la sal (0,6 M vs 2,5 M NaCl y 37ºC) y a la
temperatura (37ºC vs 45ºC a 2.5 M NaCl). Se seleccionaron los datos globales relacionados con el
metabolismo y se integraron y analizaronmediante la plataforma Pathway Projector y el software
Cytoscape.
Resultados: Se describen los resultados más relevantes relacionados con el metabolismo,
concretamente con la asimilación de glucosa vía Entner Dourodoff y pentosas fosfato, la síntesis y
degradación de ectoínas y la fosforilación oxidativa, entre otros. Se observa una relación directa de
la síntesis de ectoínas con el metabolismo central del C y N, destacando un aumento de la actividad
de las rutas anapleróticas o un metabolismo overflow a baja salinidad confirmando resultados
anteriores. Además se confirma la ausencia de glicolisis y la importancia de la ruta de Entner-
Doudoroff y de las pentosas fosfato, entre otras.
Conclusiones: Se observan claras adaptaciones metabólicas en función de las condiciones de
cultivo que servirán como referencia para el diseño racional de nuevas estrategias de ingeniería
metabólica destinadas a la optimización de cepas productoras de ectoínas. Además estos
resultados aportarán un mayor conocimiento de la adaptación a diferentes tipos de estrés en
bacterias halófilas.
27
S3-2
Búsqueda mutacional del sistema de bombeo de DNA implicado
en conjugación en Thermus thermophilus
Alba Blesa, Carolina E. César, Aurelio Hidalgo, Beate Averhoff, and José Berenguer. Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC). Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma de Madrid. Madrid.
[email protected] La transferencia horizontal de genes (LGT) constituye un elemento central en la evolución de los
procariotas, siendo la principal vía de adquisición de atributos relacionados con la resistencia a
antibióticos o la adaptación eficaz a ambientes cambiantes, entre otros.
En el género Thermus (1) se ha descrito un sistema de competencia altamente eficiente, con tasas
de adquisición de DNA del orden de 16 kb/s por célula (2). El sistema está basado en la expresión
constitutiva de un aparato de competencia natural peculiar pues implica, entre otros, a homólogos
de proteínas comúnmente asociadas a sistemas de conjugación (2). T. thermophilus es también
capaz de transferir DNA entre células de forma similar a la conjugación (3), con tasas de
transferencia del orden de 10-4
, y que permite, además, la transferencia de grandes segmentos de
DNA. Aunque cualquier loci puede ser transferido, el sistema muestra preferencia por genes
asociados al megaplásmido pTT27 frente a las de genes cromosómicos (10x), a pesar de estar en el
mismo número de copias. El sistema es también bidireccional, pudiendo producirse entre células
isogénicas en ambas direcciones.
Mediante mutagénesis hemos comprobado que los componentes del aparato de competencia
natural son necesarios para la conjugación en la célula receptora, pero no en la célula donadora, lo
que indica la existencia de dos mecanismos activos independientes en el proceso, uno de bombeo
de DNA (push) y otro de captura (pull) mediado por el sistema de competencia. El empleo de
mutantes en genes codificantes de posibles ATPasas ha permitido identificar candidatos en el
proceso de bombeo de DNA. Estos mutantes push no pueden actuar como donadores de DNA, pero
sí como receptores, mientras que los mutantes pull, les ocurre lo contrario. Los dobles mutantes
push-pull son completamente refractarios a la transferencia de DNA.
Referencias
1) Cava et al. (2009). Thermus thermophilus as biological model. Extremophiles 13: 213-231.7
2) Averhoff, B. (2009). Shuffling genes around in hot environments: the unique DNA transporter of
Thermus thermophilus. FEMS Microb. Rev. 33.3.611-626
3) César et al (2011). Unconventional lateral gene transfer in extreme thermophilic bacteria. Int.
Microbiol. 14: 187-199.
28
S3-3
Identificación del interactoma de CspA como estrategia para el estudio de la regulación posttranscripcional
en Staphylococcus aureus
Carlos Caballero, Marta Vergara-Irigaray, Igor Ruiz de los Mozos, Iñigo Lasa y Alejandro Toledo-Arana Instituto de Agrobiotecnología. Universidad Pública de Navarra, Consejo Superior de Investigaciones Científicas. 31006-Pamplona, España [email protected]
En los últimos años, se ha puesto en evidencia la importancia de los procesos de regulación
basados en moléculas de RNA. Paralelamente, se ha demostrado que ciertos RNA reguladores
necesitan de la participación de proteínas accesorias, como Hfq, para cumplir su función (1).
Pese a que las proteínas que contienen dominios de unión a RNA (PURs) son muchas y diversas
(proteínas ribosomales, de degradación del RNA, helicasas, chaperonas, etc.), su función
permanece desconocida en la mayoría de ellas. Dados los distintos tipos de moléculas de RNA
descritas hasta ahora, es esperable que muchas de estas PURs participen en la regulación post-
transcripcional. En este estudio nos hemos centrado en la familia Csp (cold shock protein), unas
chaperonas de RNA, que se encuentran conservadas en prácticamente todos los organismos (2).
Como modelo de estudio hemos elegido a Staphylococcus aureus, un patógeno humano de suma
importancia debido a su capacidad para adherirse a los implantes médicos y a su alta resistencia a
la mayoría de los antibióticos utilizados en clínica. S. aureus presenta en su genoma hasta tres
variantes de Csps (A, B y C). Con el fin de determinar el mapa de interacción entre CspA y sus
RNAs diana, se realizó la co-inmunoprecipitación de CspA in vivo. Los RNAs unidos a dicha
proteína fueron identificados mediante tiling-arrays y comparados con el transcriptoma de S. aureus.
El análisis del interactoma reveló que CspA se une a más de 200 transcritos, principalmente en su
región 3’.
Entre las dianas identificadas destaca SigB, el regulador de la respuesta por estrés. Análisis de la
expresión de Asp23 y la síntesis de la staphyloxantina (dos marcadores típicos de la actividad de
SigB) confirmaron que SigB se expresa menos en el mutante cspA. En conclusión, nuestro trabajo
sugiere que CspA regula la expresión de SigB mediante la interacción con su mRNA. Actualmente
estamos trabajando para determinar los mecanismos moleculares de dicha regulación.
Referencias:
1) Waters, L.S., and Storz, G. (2009) Regulatory RNAs in Bacteria. Cell 136: 615–628.
2) Horn, G., Hofweber, R., Kremer, W., and Kalbitzer
29
S3-4
Adaptación de Staphylococcus aureus al crecimiento
microaerofílico.
Mercedes Cervera, Pilar Horcajo, Emily Richardson, Katerina Guzman, M. Ángeles
Tormo-Mas, Ross Fitzgerald y Ricardo de la Fuente.
Centro de Investigación y Tecnología Animal – Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias
Introducción: Staphylococcus aureus subsp. anaerobius es el agente etiológico de la enfermedad de
los absceso, un proceso específico de ovinos y caprinos que se caracteriza por la formación de
lesiones necróticas en los ganglios linfáticos superficiales. Las diferencias fenotípicas más
destacadas entre S. aureus y S. aureus subsp anaerobius son la falta de crecimiento aeróbico y la
carencia de actividad catalasa por esta última (1). Con el fin de conocer como S. aureus se adapta
al crecimiento microaerofílico y causa este tipo de lesiones, decidimos secuenciar cepas de S.
aureus subsp anaerobius y compararlas con cepas clásicas de S. aureus.
Métodos: Extracción de ADN, secuenciación (IIllumina MiSeq, librería Nextera, 200 bp) y análisis de
secuencias de seis cepas de S. aureus subsp anaerobius aisladas de distintos orígenes.
Mutagénesis por deleción de la cepa S. aureus Mu50.
Resultados: El análisis de las secuencias mostró la presencia de numerosos SNPs así como la
Introducción de multiples trasposasas en las cepas Staphylococcus aureus subsp. anaerobius en
comparación con cepas de S. aureus. Con el fin de intentar cambiar el fenotipo la cepa Mu50 y
trasformarla en anaerobia, se seleccionaron una serie de proteínas relacionadas con el estrés
oxidativo para delecionarlas en dicha cepa, cuatro proteínas relacionadas con el trasporte del hierro
y una peroxiredoxina en las que se habian producido SNPs; y dos proteínas interrumpidas por una
trasposasa, una relacionada también con el trasporte del hierro y una oxidoreductasa.
Lamentablemente tras las obtención de la cepa mutante en las siete proteínas no conseguimos
cambiar su fenotipo. Como nueva aproximación estamos secuenciando mutantes aerotolerantes, así
como otras 24 cepas Staphylococcus aureus subsp. anaerobius.
El análisis bioinformático de los genomas secuenciados hasta el momento sugiere que S. aureus
subsp. anaerobius emerge por un mecanismo de pérdida de genes. El análisis de la secuencia de
nuevas cepas así como la de mutantes espontaneos aerotolerantes, nos permitirá conocer con más
detalle los genes implicados en la adaptación de S. aureus al crecimiento microaerofílico.
1. De la Fuente R, Díez RM, Domínguez-Bernal G, Orden JA, Martínez-Pulgarín S. Restoring
catalase activity in Staphylococcus aureus subsp. anaerobius leads to loss of pathogenicity for
lambs. Vet Res. 2010; 41(4):41.
30
S3-5
NrdR regula transcripcionalmente las tres clases de ribonucleotidil
reductasas y de topoisomerasa I en Pseudomonas aeruginosa.
Anna Crespo, Lucas Pedraz y Eduard Torrents
Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), Bacterial infections and antimicrobial therapies
group. Baldiri Reixac 15-21, 08028, Barcelona, Spain.
[email protected] / [email protected]
Las ribonucleotidil reductasas (RNRs) son las enzimas que catalizan la reducción de cada
ribonucleótido a su correspondiente desoxirribonucleótido. Pseudomonas aeruginosa, patógeno
oportunista responsable de muchas de las infecciones que padecen los pacientes de fibrosis quística,
es uno de los pocos microorganismos que codifica en su genoma para todas las clases descritas de
RNRs. Siendo éstas esenciales para la síntesis y reparación del ADN en todos los organismos,
necesitan una regulación extremadamente fina, tanto a nivel génico como a nivel de su actividad
enzimática, para evitar la acumulación de mutaciones durante el proceso de replicación.
Se han descrito tres clases de RNRs (I, II y III), diferenciadas por su estructura, mecanismo para la
generación del radical y metalocofactor utilizado. En P. aeruginosa encontramos RNRs Ia, II y III, lo
que permite a esta bacteria tener una gran versatilidad para crecer en condiciones ambientales
diferentes.
La clase Ia, codificada por los genes nrdAB, ve limitado su funcionamiento a condiciones aeróbicas;
la clase II, codificada por el gen nrdJab, es independiente de oxígeno, pero necesita
adenosilcobalamina, como cofactor, para la generación del radical1; por último, la clase III, codificada
por nrdDG, es sensible a oxígeno, actuando, por lo tanto, en condiciones anaeróbicas.
En estudios recientes, realizados en Escherichia coli2, se ha estudiado un nuevo factor de
trascripción, denominado NrdR, capaz de regular los genes de las RNRs. NrdR está formado por
dos dominios: un dominio zinc-finger, que permite la unión al ADN, y un dominio ATP-cone, que
tiene la capacidad de unir ATP/dATP3.
En este trabajo hemos identificado, en las regiones promotoras de los genes nrd y topA de P.
aeruginosa, las cajas de unión de NrdR. Se ha estudiado el papel diferencial que tiene NrdR en la
expresión de las distintas clases de RNRs durante el crecimiento (aeróbico o anaeróbico), siendo
éste clave para la regulación temporal de las distintas clases de RNR en esta bacteria. Mediante un
estudio transcriptómico, hemos estudiado NrdR como posible regulador global, así como su
importancia en la formación de biofilm o en el proceso de virulencia.
1. Sjoberg, B. M. Torrents, E. 2011. Shift in ribonucleotide reductase gene expression in
Pseudomonas aeruginosa during infection. Infection and immunity 79:2663-9.
2. Torrents, E.; et al, 2007. NrdR controls differential expression of the Escherichia coli
ribonucleotide reductase genes. J. Bacteriology, 189:5012-21.
3. Torrents, E. 2014. Ribonucleotide reductases: essential enzymes for bacterial life. Front. Cell.
Infect. Microbiol. 4:52.
31
S3-6
La topología del DNA regula la expresión génica global en Streptococcus pneumoniae
María-José Ferrándiz, Cristina Arnanz, Antonio J. Martín-Galiano, Carlos Rodríguez-
Martín & Adela G. de la Campa.
Unidad de Genética Bacteriana, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III and
CIBER Enfermedades Respiratorias. Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid,
Spain.
En Streptococcus pneumoniae el nivel de superenrollamiento del DNA se mantiene gracias a la
acción de tres topoisomerasas: DNA girasa que introduce superenrollamiento negativo y
topoisomerasas I y IV que relajan el DNA. A su vez, los cambios que afectan la topología del DNA
repercuten en la transcripción global del genoma. Así, la relajación inducida por novobiocina pone
de manifiesto 15 agrupamientos génicos con una respuesta transcripcional coordinada (dominios
con regulación positiva y dominios con regulación negativa).
Además, hay regiones con alto contenido AT que flanquean los dominios negativos (regiones
flanqueantes). En este trabajo analizamos la transcripción basal de los genes que componen estos
dominios, así como su grado de conservación en la especie y observamos que en las regiones
flanqueantes los genes están poco conservados y su transcripción es inferior a la media del
genoma. Además, se introdujo el cassette de la cloranfenicol acetil transferasa (cat) en diferentes
regiones del cromosoma (2 dominios con regulación positiva,dos negativa, dos no regulados y dos
regiones flanqueantes) y se midió la transcripción del gen cat tras inducir relajación, observándose
disminución en los dominios de regulación negativa, aumento en los de regulación positiva y sin
cambio en las regiones flanqueantes. Esto indica que la localización cromosómica determina la
respuesta transcripcional ante cambios en la topología. Por otro lado, los promotores de los genes
de las topoisomerasas localizados en dominios con regulación positiva (gyrB), negativa (topA) o no
regulados (gyrA y parE) se fusionaron bien a gfp o bien a cat y se clonaron en plásmido midiéndose
su respuesta a relajación tanto en el cromosoma como en el plásmido. En el caso de PgyrB y PtopA la
transcripción del cromosoma fue la esperada de acuerdo al dominio en el que se encuentran, sin
embargo, la del plásmido en ambos casos disminuía. Para PparE y PgyrA la expresión fue igual en
cromosoma y plásmido. Estos dos promotores llevan señales reguladoras específicas que en el
caso de PgyrA es una curvatura que actuaría como un sensor del nivel de superenrollamiento. Estos
resultados indican que la topología del DNA actúa como un regulador transcripcional global.
32
S3-7
La respuesta transcriptómica de Streptococcus pneumoniae a la
fluoroquinolona levofloxacina incluye la activación de un
transportador de hierro que contribuye a la letalidad
María-José Ferrándiz and Adela G. de la Campa
Unidad de Genética Bacteriana, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III and
CIBER Enfermedades Respiratorias, 28220 Majadahonda, Madrid, Spain. b Presidencia. Consejo
Superior de Investigaciones Científicas, Madrid, Spain.
Hemos estudiado la respuesta transcriptómica de Streptococcus pneumoniae a la levofloxacina en
condiciones en las que se inhibe la DNA topoisomerasa IV, pero no la DNA girasa. Aunque se
observó una respuesta transcripcional compleja, el resultado más sobresaliente fue la activación de
los genes del operón fatDCEB, implicado en la entrada de hierro (Fe2+
y Fe3+
) en la célula. Estos
fueron los únicos genes que variaron en todas las condiciones estudiadas (concentraciones 0.5
MIC y 10 MIC; tiempos 5, 15, y 30 min). A pesar de que la inhibición de la topoisomerasa IV por
levofloxacina no afectó al nivel global de superenrollamiento, sí que se observó incremento del nivel
de superenrollamiento global y de la transcripción de fatD tras tratamiento con un inhibidor de la
topoisomerasa I, mientras que se observó lo opuesto tras la inhibición de la girasa con novobiocina.
Puesto que fatDCEB está localizado en un dominio topológico cromosómico cuya transcripción se
inhibe por relajación del DNA, estudiamos la transcripción de un fragmento de 422-pb (que incluye
el promotor Pfat) localizado en posición 5´de fatDCEB fusionado al gen cat que se insertó en el
cromosoma a 106 Kb de su posición nativa: PfatfatD se activó en presencia de levofloxacina en su
localización nativa, mientras que no se observó cambio en la construcción Pfatcat. Estos resultados
sugieren que los cambios topológicos están efectivamente implicados en la transcripción de
PfatfatDCE. La activación de fatDCEB podría provocar el incremento del hierro intracelular y, por
tanto, la activación de la reacción de Fenton (Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ OH + OH°) con el consiguiente
incremento de las especies reactivas de oxígeno. De acuerdo con este modelo, hemos observado
una atenuación de la letalidad a la levofloxacina tanto en medio deficiente en hierro como en una
cepa con una deleción en el gen que codifica SpxB, la principal fuente de agua oxigenada. Además,
hemos observado un incremento en las especies reactivas de oxígeno y que estas contribuyen a la
letalidad del antibiótico. Existiría la posibilidad de incrementar la eficiencia de las fluoroquinolonas
elevando los niveles de hierro intracelular.
33
S3-8
Caracterización del sistema de dos componentes EupK/EupR implicado en la osmoadaptación de la bacteria halófila
Chromohalobacter salexigens.
Rosa García-Valero, Montserrat Argandoña, Joaquín J. Nieto y Carmen Vargas Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Sevilla, España. [email protected]
Introducción: Chromohalobacter salexigens es una bacteria halófila moderada capaz de crecer en
un amplio rango de salinidades siendo la acumulación citoplasmática de los bioestabilizadores
ectoina e hidroxiectoína, dos compuestos con gran interés industrial, su principal estrategia de
osmoadaptación. Para coordinar estos procesos, las células están equipadas con distintos sistemas
y mecanismos de detección de cambios en la salinidad del medio externo (osmodetección) y rutas
que traducen esos cambios en señales que pueden ser procesadas en la célula (transducción de
señales), y que inducen la respuesta celular necesaria para adaptarse a dichas condiciones. Estas
rutas de transducción de señales aún no han sido descritas en profundidad en bacterias halófilas.
Anteriormente se describió a EupR como el primer regulador de respuesta perteneciente a un
sistema de dos componentes implicado en la osmorregulación de bacterias halófilas y se propuso a
Csal0869 como su posible histidina quinasa asociada (EupK), una histidina quinada híbrida, con dos
dominios sensores, que le permitiría detectar tanto estímulos externos como internos e integrarlos
(1).
Métodos: Caracterización molecular del sistema de dos componentes EupK/EupR y su participación
en la regulación del metabolismo de las ectoínas (síntesis, degradación y transporte) en diferentes
condiciones de salinidad y de fuente de carbono (ectoínas y glucosa).
Resultados: Se ha confirmado la implicación del sistema EupK/EupR en la regulación de la
osmoadaptación a través del control del metabolismo de las ectoínas, así como del catabolismo de
la glucosa. Se ha observado que este sistema está asociado a otra histidina kinasa a través de
EupR y a otro regulador de respuesta a través de EupK.
Conclusiones: La histidina quinasa EupK y el regulador EupR forman un sistema de dos
componentes que forma parte de un sistema de regulación ramificado y/o cruzado. Este sistema
detectaría e integraría las señales que desencadenarían la respuesta celular necesaria para
adaptarse no sólo a la salinidad del medio sino también en función de la fuente de carbono (glucosa
o ectoína).
Referencias:
(1) Rodríguez-Moya y col. (2010). BMC Microbiol 10: 256.
Estudio subvencionado por los proyectos BIO2011-22833 (Ministerio de Economía y
Competitividad), Fondos FEDER y P11-CVI-7293 MO 724 (Junta de Andalucía).
34
S3-9
Phenotypic changes caused by the truncation of the 5’ UTR suggest a stringent translational regulation of the aminoglycoside
resistance methyltransferase ArmA Hoefer, A., Gutiérrez, B., Ovejero, C. M., Hidalgo, L., Carrilero, L., Santos-López, A., Thomas-Lopez, D., Bernabe C, Gonzalez-Zorn, B. Universidad Complutense de Madrid [email protected]
Introducción: In the last decade 16S rRNA methyltransferases conferring unusually high-level pan-
resistance tovaminoglycosides have been rapidly disseminating amongst clinically relevant Gram-
negative pathogens (1).
Métodos: Comprehensive in silico analysis of armA alongside other acquired and intrinsic
methylases was performed using CLC workbench. Expressional analysis of armA under the
regulation of its 5’ UTR was conducted using a lacZα reporter-construct fusion.
Resultados: Preliminary data regarding fitness cost and toxicity coupled with in silico modeling have
identified a putative regulatory domain in the 5’ UTR of armA, the most predominant 16S
methyltransferase worldwide (2). Fusion of the armA 5’ UTR to lacZα demonstrated a constitutive
expression of ArmA, suggesting that either there is no regulation in place or regulation is dependent
on a post-transcriptional mechanism as RT-RT-PCR confirms that armA is constitutively transcribed.
Subsequent co-transformation with a vector bearing the active ArmA methyltransferase in the same
bacterium, resulted in a complete inhibition of the lacZα product. In silico modelling suggests that the
ArmA methyltransferase may directly or indirectly interact with its own 5’ UTR to inhibit superfluous
translation of the gene product.
To further elucidate what type of mechanism is at play here, fitness cost, minimum inhibitory
concentration and growth curves of strains bearing one of four different armA genes with UTRs
ranging from 357nt before the start codon to a completely truncated 5’ UTR were conducted.
Conclusiones: Results obtained from the expressional analysis confirm the presence of a regulatory
domain within the 5’ UTR of armA. Furthermore phenotypic changes as a result of 5’ UTR truncation
coincide with the involvement of the 5’ UTR in the translational regulation of the ArmA methylase.
Referencias:
1. Gonzalez-Zorn, B., Casas, M., Porrero, M., Moreno, M., Courvalin, P., and Dominguez, L. (2005)
ArmA and aminoglycoside resistance in escherichia coli. Emerging Infectious Diseases.
2. Gutierrez, B., Escudero, J.A., San Millan, A., Hidalgo, L., Carrilero, L., Ovejero, C.M., Santos-
Lopez,A., Thomas-Lopez, D. and Gonzalez-Zorn, B. (2012) Fitness cost and interference of
Arm/Rmt aminoglycoside resistance with the RsmF housekeeping methyltransferases. Antimicrobial
agents and chemotherapy.
35
S3-10
La inestabilidad genómica asociada con los defectos en la sintesis de los
centros Fe-S en las células de Saccharomyces cerevisiae
Carlos Maria, Jordi Pijuan, Enrique Herrero and Gemma Bellí
Departamento de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina, Universidad de Lleida,
IRBLleida, España
Introducción: En la mitocondria ocurre la síntesis de los centros hierro-azufre (ISCs) que son co-
factores necesarios para varios procesos celulares esenciales, tales como la respiración hasta la
regulación de la expresión génica y el metabolismo del ADN-ARN (1). Mutaciones y deleciones en el
genoma mitocondrial, así como la inestabilidad del genoma nuclear, están implicados en diversas
enfermedades humanas (2). Estudios recientes han relacionado defectos en la biogénesis de ISC y
en el ensamblaje de proteínas ISC citosólicas con a la inestabilidad genómica nuclear (2,3). Las
células de Saccharomyces cerevisiae que carecen de la proteína mitocondrial glutaredoxina
monotiolica Grx5 son defectuosas en la maquinaria de la síntesis de ISC (4). Mediante el uso de un
mutante Δgrx5 de S. cerevisiae como modelo de estudio quisimos abordar la comprensión de la
relación entre la inestabilidad genómica y los defectos en la biosíntesis de ISCs.
Métodos: Frecuencia de recombinación y de mutación espontanea, determinación del hierro total
celular, viabilidad celular, estudios de ciclo (FACS), análisis de crecimiento y formación de “focis”.
Resultados: Las células mutantes Δgrx5 presentan unas altas frecuencias de recombinación y de
mutación espontánea. La formación de “focis” asociados a Rad52 se incrementa en las células
mutantes Δgrx5. Las células mutantes Δgrx5 y Δssq1 son hipersensibles a los agentes que dañan el
ADN. Las células del doble mutante Δgrx5Δssq1 muestran un efecto aditivo de hipersensibilidad a
agentes que dañan el ADN en comparación con los mutantes individuales. La ausencia de las
proteínas Grx5 y Ssq1 provoca un retraso en la progresión del ciclo celular de la fase S. Las células
mutantes Δgrx5 muestran una mayor hipersensibilidad a agentes que dañan el ADN cuando se
eliminan o Rad50 Rad52 [proteínas involucradas en la recombinación homóloga (HR)]. Y la
sobreexpresión de PRI2, RAD3 o NTG2 no puede rescatar a los defectos de sensibilidad de las
células que carecen Grx5 a agentes que dañan el ADN.
Conclusiones: La ausencia de la proteína mitocondrial Grx5 conduce a un aumento de la
inestabilidad genética. Esta inestabilidad del genoma no depende de la acumulación de hierro que
se produce en las células que carecen Grx5. Las células que no expresan Grx5 tienen mayores
niveles de daño constitutivo al ADN, que se asocia específicamente a la formación de “focis”
asociados a Rad52. Las células que carecen Grx5 y Ssq1 son hipersensibles a agentes que dañan
el ADN de forma aditiva. Esta sensibilidad es independiente del estado de estrés oxidativo
constitutivo que se produce en las células que carecen de Grx5. La ausencia de las proteínas Grx5
y Ssq1 provoca un retraso en la progresión del ciclo celular a través de la fase S. La vía de
reparación del ADN de HR podría desempeñar un papel importante en la reparación de los daños
en el ADN en las células del mutante Δgrx5.
Referencias: (1) Lill, R and Mühlenhoff, U. (2008). Annu. Rev. Biochem. 77, 669-700, (2) Veatch, JR
et al. (2009). Cell 137, 1247-1258, (3) Díaz de la Loza, MC et al. (2011). Nucleic Acids Res. 14,
6002-6015, (4) Molina-Navarro, MM et al. (2006). FEBS Lett. 580, 2273-2280.
36
S3-11
TolR, a novel two-component regulatory system involved in adaptation to aromatic compounds in Azoarcus sp. CIB
Zaira Martín-Moldes, Claudine Baraquet, Caroline S. Harwood, Mª Teresa Zamarro and Eduardo Díaz Department of Environmental Biology, Centro de Investigaciones Biológicas-CSIC, Madrid, Spain [email protected] Introduction: The catabolic processes performed in the absence of oxygen are becoming of great environmental interest,because many anoxic ecosystems are frequently contaminated with toxic
aromatic compounds. The facultativeanaerobe -proteobacterium Azoarcus sp. CIB has been used as model system to study many basic aspectson the biochemistry and genetics underlying the anaerobic metabolism of several aromatic compounds (1). Within the bss-bbs operon responsible for the peripheral pathway of the anaerobic degradation of toluene in strain CIB, we have identified an orphan gene, tolR, without homologues in other organisms. The N-Terminal region of TolR protein shows significant similarity to a sensor autokinase domain, while the C-Terminal region shows similarity to receiver-containing mresponse regulator with a c-di-GMP phosphodiesterase domain (2). Hence,TolR may become a new member of the transduction systems that incorporate all domains found in Classical Two-Component Regulatory Systems in one polypeptide. Methods: We have developed an in vivo approach for confirming the c-di-GMP phosphodiesterase (PDE) activity of tolR gene cloned in a lacZ-based reporter P.aeruginosa PAO1 strain (4). In vitro
approaches by using purified wild-type, mutated, and truncated forms of the TolR protein were used to demonstrate autokinase activity and trans-phosphorylation reactions. Results: TolR acts in vivo as a functional toluene-dependent c-di-GMP phosphodiesterase. The inactivation of tolR inAzoarcus sp. CIB significantly decreased resistance to a sudden toluene shock. Autokinase assays with purified TolR protein, and the TolRRR site-directed mutants, revealed the hydrocarbon-dependent phosphorylation at the His190 residue, and the key role of Phe79 in the recognition of the aromatic molecule. The toluene-dependent intramolecular phosphorelay in TolR, as well as the intermolecular phosphorelay between the artificially generated N-terminal and C-terminal independent supradomains of TolR have been demonstrated. Conclusions: TolR encodes the first HTCS described whose response regulator is not a transcriptional regulator but a c-di-GMP phosphodiesterase. Moreover, we show for the first time the effector-dependent induction of the intramolecular phosphorelay in a HTCS. The toluene-dependent control of the cellular c-di-GMP levels represents an unprecedented mechanism of bacterial adaptation to aromatic hydrocarbons. References: [1] Carmona, M., Zamarro, M.T., Blázquez, B., Durante-Rodríguez. G., Juárez, J.F., Valderrama, A., Barragán M.J.L., García, J.L. and Díaz, E. (2009). Microbiol Mol Biol Rev 73, 71-133 [2] Mikkelsen, H., Sivaneson, M. and Filloux, A. (2011). Environ. Microbiol. 13(7), 1666-1681 [3] Sonnenburg, E.D., Sonnenburg, J.L., Manchester, J.K., Hansen, E.E., Chiang, H.C. and Gordon, J.I. (2006). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:8834-8839. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:8834 [4] Baraquet, C., Murakami, K., Parsek, M.R. and Harwood, C. S. Nucl Acids Res. 40:7207-7218
37
S3-12
Influencia del regulador Fur2 en la osmoadaptación y la homeostasis del hierro en la bacteria halófila Chromohalobacter
salexigens
Emilia Naranjo, Montserrat Argandoña, Joaquín J. Nieto y Carmen Vargas Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla [email protected]
Introducción: Chromohalobacter salexigens es una bacteria halófila moderada utilizada como modelo en estudios de osmoadaptación. Además produce ectoínas frente al estrés osmótico y térmico, por lo que posee un interés biotecnológico añadido. Se ha comprobado que la homeostasis del hierro en esta bacteria está directamente relacionada con su capacidad de adaptación al estrés osmótico y por lo tanto, con la síntesis de ectoinas, a través del regulador global Fur. En el genoma de C. salexigens se han encontrado dos parálogos pertenecientes a la superfamilia Fur, Fur1, descrito anteriormente como activador de los genes de síntesis de ectoínas (1), y un segundo regulador denominado Fur2, siendo éste objeto del presente estudio. Métodos: Caracterización molecular del regulador Fur2 mediante la obtención de un mutante fur2 y un doble mutante fur1fur2 y su posterior estudio fenotípico en diferentes condiciones de salinidad y concentración de hierro. Resultados: En este estudio, se ha comprobado que Fur1 y Fur2 intervienen tanto en la regulación de la homeostasis del hierro como en la osmoadaptación de C. salexigens, actuando como represores de la síntesis de sideróforos a baja salinidad y como activadores a elevada salinidad. Los resultados indican que su relevancia en ambos procesos es diferente, ya que Fur2 tiene un papel más importante en la regulación de la síntesis de sideróforos, y también que dicha relevancia es dependiente de la salinidad, ya que la pérdida de Fur1 afecta en mayor medida al crecimiento a baja salinidad. También se ha comprobado que ambos regulan la expresión de los genes de síntesis de ectoínas pero de forma diferente en función de la salinidad y/o de la presencia de hierro. Conclusiones: Tanto Fur1 como Fur2 intervienen en la regulación de la homeostasis del hierro y de la osmoadaptación pero de forma diferente en función de las condiciones, destacando el doble papel de ambos reguladores como activadores o inhibidores en función de las mismas. Referencias: (1) Argandoña y col., (2010). Appl. Environ. Microbiol. 76:3575-3589. Este estudio ha sido subvencionado por los proyectos BIO2011-22833 (Ministerio de Economía y Competitividad), Fondos FEDER y P11-CVI-7293 MO 724 (Junta de Andalucía).
38
S3-13
El factor transcripcional Rim101 protege las células de Saccharomyces cerevisiae frente al estrés por selenito
Maria Pérez-Sampietro y Enrique Herrero Departamento de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina, Universidad de Lleida, Lleida [email protected] Introducción: Rim101, factor transcripcional de la familia PacC, regula la respuesta de células de
levadura a estrés por pH alcalino, toxicidad por Na+ y Li+, entre otros. Dicho regulador actúa como
represor de genes como NRG1 en estrés por pH alcalino y homeostasis del hierro [1]. La activación
de Rim101 requiere la proteólisis de su dominio C-terminal por la proteasa Rim13 en colaboración
con señalizadores como Rim8 o Rim20 [2]. Esta activación está conectada con las vesículas
endocíticas con la participación de los complejos ESCRT-I, II y III [3]. En respuesta a pH alcalino,
Rim101 regula la inducción de genes que, a la vez, están bajo control positivo por el factor Aft1 en
déficit de hierro [4,5]. Aproximaciones genéticas mostraron interacciones entre la vía regulada por
Rim101 y el regulón Aft1 [6]. Por otra parte, el selenio, en forma de selenito, es tóxico en levadura.
Su detoxificación tiene lugar en la vacuola. Así, mutantes en subunidades de la ATPasa vacuolar
son hipersensibles al selenito [7], señalando un rol esencial de la acidificación vacuolar en la
detoxificación de dicho elemento. Estudios transcriptómicos revelaron la inducción de algunos genes
del regulón Aft1 en condiciones de estrés por selenito [8].
Métodos: Análisis de la expresión génica por Northern blot, estudios fenotípicos mediante
determinación de sensibilidad de crecimiento, inmunodetección de proteínas por Western blot y
observación de la acidificación vacuolar mediante tinción con quinacrina.
Resultados: La hipersensibilidad del mutante _aft1 al selenito es rescatada por la adición de hierro,
fenotipo que no se observa en el caso del mutante _rim101, el cual también es sensible al agente.
La deleción de NRG1 en un mutante _rim101 rescata la sensibilidad de este último al selenito. El
complejo Rim8 y Rim13 participa en respuesta frente a selenito mediante la proteólisis de Rim101,
aunque estas proteínas también tienen roles independientes de Rim101 frente al agente. La función
aditiva también se observa cuando Rim101 protege a las células frente a estrés por NaCl. Aun así,
ni el selenito ni tampoco el NaCl causan proteólisis adicional de Rim101 por encima de la
constitutiva. Mutantes en componentes de los complejos ESCRT-0, I, II y III son hipersensibles a
selenito, y la ausencia a la vez de Rim101 revela un fenotipo de sensibilidad adicional. Además, la
supresión de NRG1 en el doble mutante _rim101_snf7 rescata parcialmente su sensibilidad al
agente. También, la expresión constitutiva de Rim101 en mutantes en ESCRT-0 y I rescata
parcialmente el fenotipo de sensibilidad. Finalmente, la acidificación vacuolar en un doble mutante
_rim101_snf7 se restaura cuando Rim101 se expresa constitutivamente durante un tratamiento con
selenito.
Conclusiones: Rim101 protege frente a la toxicidad por selenito, involucrando componentes de la vía
de respuesta frente pH alcalino. La maquinaria ESCRT también participa en dicha protección, de
manera parcialmente independiente de Rim101 e implicando la funcionalidad vacuolar.
Referencias: [1] Lamb, T.M., Mitchell, A.P. (2003) Mol. Cell. Biol. 23, 677-686. [2] Peñalva, M.A. et al. (2008)
Trends Microbiol. 16, 291-300. [3] Subramanian, S. et al. (2012) Eukaryot. Cell 11, 1201-1209. [4] Viladevall, L.
et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 43614-43624. [5] Kaplan, C.D., Kaplan, J. (2009) Chem. Rev. 109, 4536-4552.
[6] Berthelet, S. et al. (2010) Genetics 185, 1111-1128. [7] Mániková, D. et al. (2012) Chem. Res. Toxicol. 25,
1598-1608. [8] Salin, H. et al. (2008) BMC Genomics 9, 333.
39
S3-14
Building up a high quality genome-based metabolic model to optimize ectoines production in Chromohalobacter salexigens
Francine Piubeli, Montserrat Argandoña, Manuel Salvador, Carmen Vargas y Joaquín J. Nieto Department of Microbiology y Parasitology, Faculty of Pharmacy, University of Sevilla, [email protected]
Introduction: The broad salt-growing C. salexigens is a natural producer of ectoines, compatible
solutes with promising biotechnological applications in biomedicine, molecular biology,
dermopharmacy, etc. (1). However, the exploitation of this bacterium in industrial biotechnology
requires a comprehensive understanding of its physiology and genetics. The availability of its
genome sequence, and the development of high-throughput data, will allow us to gain this
understanding at the systems level. Genome-scale metabolic models are constructed by using a
combination of genome sequence- and detailed biochemical- information and they can be used for
analyzing and simulating the behavior of metabolism in response to different stimuli, or to design
rational metabolic engineering strategies to obtain improved strains. Additionally, genome-scale
metabolic models provide a platform on which high-throughput computational analysis of metabolic
networks can beperformed. In this work, we describe the development of an iterative process to build
up a robust metabolic model of C. salexigens with a high prediction power.
Methods: First, a robust core metabolic model was constructed including heat- and/or salinity-
dependent central- and ectoine(s)- metabolic pathways (transport, synthesis and degradation) and
other relevant pathways revealed from previous proteomics and metabolic analysis. These routes
were manually refined, gaps were filled and new pathways or new associations of genes-enzymes-
pathways not found in KEGG, EcoCyc or Pathway-tools, were included. Biomass component
synthesis pathways were also incorporated and preliminary FBA analysis was performed to assure
connectivity of the network. The second step was to scale-up this core model to a genome-based
one by manual refinement of the most relevant pathways involved in stress-related metabolism.
Results: This workflow allowed us to curate and re-annotate more than 250 wrong associated gene-
reactions, included in a previous genome-based metabolic model, and to add more than 200
reactions not present in that metabolic reconstruction, resulting in a high quality genome-based
metabolic model.
Conclusions: The high quality genome-based metabolic model developed will be used for reliable
prediction of improved ectoines production phenotypes.
References:
(1) Pastor et al. Biotechnol. Adv. 28: 782-821 (2010).
Research co-financially supported by BIO2011-22833 (Ministerio de Economía y Competitividad)
and P11-CVI-7293 MO (Junta de Andalucía) projects and FEDER grants.
40
S3-15
Glutaredoxinas de retículo endoplasmático/Golgi de Saccharomyces cerevisiae: relación con la homeostasis del calcio
y la maquinaria de secreción proteica
Judit Puigpinós, Fernando Santamaría, Celia Casas y Enrique Herrero Departamento de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina, Universidad de Lleida, Lleida. [email protected]
Introducción: Grx6 i Grx7 son dos glutaredoxinas (GRXs) localizadas en los compartimentos de
retículo endoplasmático (RE) y Golgi de la vía secretora1, responsables de la reducción de los
puentes disulfuro mixtos entre el glutatión y las proteínas. En estos compartimentos tiene lugar el
plegamiento y maduración de proteínas, un hecho estrechamente ligado al ambiente redox oxidante
del RE, donde participan las proteínas esenciales Ero1 y Pdi12,3. En este contexto, la actividad de
las GRXs podría contribuir a regular esa homeostasis redox.
La alteración de la homeostasis del Ca2+ en la vía secretora es una de las principales causas del
estrés de RE4. En presencia de este estrés, la célula induce la respuesta UPR (Unfolded Protein
Response) y una vía de señalización que promueve la entrada de Ca2+ en el citosol a través del
canal HACS de la membrana plasmática, activando proteínas como la calcineurina5. Ambas vías
operan en paralelo para restablecer la homeostasis iónica y favorecer la supervivencia celular.
Métodos: Métodos estándar para analizar el crecimiento de las células de levadura. Análisis de la
expresión génica por Northern blot. Determinación de actividad β-galactosidasa. Determinación de
los niveles de Ca2+ intracelular. Purificación de fracción vacuolar. Análisis del estado redox del RE
a través de una sonda sensible a redox (GFP*). Análisis de la secreción proteica por pulso y caza.
Resultados: El mutante Δgrx6 muestra una inducción constitutiva de la vía Crz1-calcineurina que se
corresponde con un incremento de los niveles de Ca2+ citosólicos y con alteraciones en la
sensibilidad frente a una deficiencia o exceso de Ca2+ extracelular. En condiciones de estrés, tanto
la falta de GRX6 como de GRX7 provocan cambios en la inducción de la UPR. La ausencia de
GRX6 o GRX7 contrarresta los fenotipos, tanto de defectos en el crecimiento como de secreción de
la carboxipeptidasa Y (CPY), de un mutante condicional con bajos niveles de expresión de Ero1,
como sucede en presencia del oxidante diamida, creando unas condiciones en el RE que
compensan la ausencia de la oxidasa Ero1. La alteración del estado redox del RE hacia un
ambiente más oxidante en ausencia de GRX6 o GRX7 se ha confirmado mediante una variante
GFP* sensible al estado redox.
Conclusiones: La ausencia de Grx6 causa una alteración de la homeostasis del Ca2+. La ausencia
de Grx6 o Grx7 crea unas condiciones oxidantes en el RE que contrarresta parcialmente la
deficiencia de Ero1.
Referencias:
1) Izquierdo et al., (2008). Eukaryot Cell, 7:1415-1426. 2) Kim et al., (2012). J Cell Biol, 196:713-725.
3) Frand, A. R., i Kaiser, C. A. (1998). Mol Cell, 1:161-170. 4) Cunningham, K. W. (2011). Cell
Calcium, 50:129-138. 5)Yoshimoto et al., (2002). J Biol Chem, 277:31079-31088.
41
S3-16
La heterogeneidad fenotípica limita la eficacia del tratamiento con
antibióticos
María Antonia Sánchez-Romero & Josep Casadesús
Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, 41080, España
La coevolución de las bacterias con compuestos naturales antibacterianos promueve la evolución de
mecanismos de resistencia, tradicionalmente clasificados en tres tipos: resistencia innata,
resistencia adquirida (por mutación o por transferencia horizontal) y resistencia adaptativa.
Hemos estudiado los mecanismos de resistencia a tres antibióticos bactericidas con diferentes
mecanismos de acción, kanamicina, ácido nalidíxico y rifampicina, en células de Salmonella enterica
serovar Typhimurium (estirpe SL1344). Para ello, hemos seleccionado colonias resistentes a
concentraciones letales del antibiótico y analizado la estabilidad del fenotipo resistente después de
un crecimiento no-selectivo. Las colonias resistentes a rifampicina mostraron una resistencia
estable, sugiriendo que el mecanismo implicado podría ser mutacional. Por el contrario, un
porcentaje de colonias resistentes a kanamicina y ácido nalidíxico mostraron una resistencia
reducida, sugiriendo que otro mecanismo, además del mutacional, habría contribuido a la
supervivencia bacteriana bajo una selección letal. El análisis de células individuales mediante
citometría de flujo revela heterogeneidad en la expresión del gen de la porina OmpC y proporciona
evidencias de que una reducida expresión de ompC confiere resistencia adaptativa a kanamicina.
En el caso de las colonias resistentes a ácido nalidíxico, las mutaciones en el gen gyrA estaban
presentes en todos los aislados. Sin embargo, el inhibidor de bombas PAβN reduce el nivel de
resistencia a ácido nalídixico de los mutantes, indicando que un flujo activo de salida de las bombas
contribuye a aumentar la resistencia a este antibiótico. La actividad de las bombas era heterogénea
y se encontró una correlación entre la alta actividad de las bombas y el aumento de la resistencia a
ácido nalídixico.
Tradicionalmente, la resistencia adaptativa implica cambios de expresión inducidos por respuestas a
señales ambientales. Este estudio proporciona evidencias de que fluctuaciones en la expresión de
células individuales y la actividad de ciertas funciones celulares críticas pueden inducir resistencia
adaptativa en ausencia de estímulos ambientales conocidos. Las diferencias fisiológicas preadaptan
a determinas células dentro de un cultivo isogénico a sobrevivir a una selección letal. Por lo tanto, la
heterogeneidad fenotípica debería ser tenida en cuenta a la hora de definir los factores que limitan
la eficacia del tratamiento con antibióticos.
42
S3-17
Operones solapantes: un nuevo mecanismo de coordinación de la
expresión de genes adyacentes.
Sonia Saenz, Nerea Bitarte, Begoña García, Maite Villanueva, Igor Ruiz de los
Mozos, Alejandro Toledo-Arana, Iñigo Lasa
Instituto de Agrobiotecnología. Universidad Pública de Navarra-Consejo Superior de Investigaciones
Científicas. Pamplona-31006, SPAIN
En un estudio previo caracterizamos el transcriptoma de Staphylococcus aureus combinando las
técnicas de tilling arrays y de RNA-seq (1). Nuestro análisis reveló que el genoma de S. aureus se
transcribe desde ambas cadenas generando RNAs solapantes en más del 50% de los genes. Este
solapamiento de RNAs se produce por la presencia de RNAs antisentidos no codificantes que
hibridan con los mRNAs, pero además un alto porcentaje ocurre entre las regiones 5’ de mRNAs de
genes adyacentes que se transcriben de forma divergente, entre las regiones 3’ de mRNAs de
genes adyacentes que se transcriben convergentemente, y por la presencia de operones
solapantes. Este último caso corresponde a genes, que encontrándose en la mitad de un operón, se
transcriben en dirección contraria. En todas estas situaciones los RNAs solapantes generan RNAs
de cadena doble (dsRNA) que son digeridos por la actividad de la endoribonuclesa RNasa III, tanto
en S. aureus como en otras bacterias Gram-positivas (1). Un estudio reciente realizado en
Escherichia coli, ha confirmado la existencia de un proceso similar de digestión de RNAs solapantes
mediado por la misma RNasa (2). En base a estos resultados, nuestra hipótesis de trabajo es que
este mecanismo de digestión de RNAs solapantes tiene una función reguladora que permite
coordinar la expresión de los genes adyacentes. Para explorar esta hipótesis, hemos elegido como
modelo al operon SA_01912-SA_01913-menCE cuya expresión solapa con la del gen
SAOUHSC_01914. Para estudiar la posible función de esta arquitectura de transcripción, se han
construido una serie de mutantes en los que los promotores de ambos mRNAs han sido, o mutados,
o sustituidos por promotores constitutivos. El efecto que la ausencia o la sobreexpresión de uno de
los RNA solapantes tiene sobre el otro se ha analizado por Northern y Western-blots. Los resultados
demuestran que la sobreexpresión o la ausencia de uno de los transcritos es capaz de modular los
niveles del otro transcrito solapante, coordinando la expresión de los mismos. Este trabajo pone en
evidencia la importancia que tiene la organización génica en el cromosoma que permite crear
mecanismos de regulación post-transcripcional a través de genes adyacentes.
1.Lasa I, et al. (2011) Genome-wide antisense transcription drives mRNA processing in bacteria.
PNAS 108: 20172–20177.
2. Lybecker M, et al (2014) The double-stranded transcriptome of Escherichia coli. PNAS 111: 3134–
3139.
43
S3-18
La proteína Hha: sola o acompañada?
Carla Solórzano, Sònia Paytubi, Cristina Madrid
Departament de Microbiologia, Universitat de Barcelona
Introducción: Las proteínas de la familia Hha/YmoA regulan, junto con la proteína H-NS, la
expresión de genes adquiridos horizontalmente en Enterobacterias. Estudios previos han
determinado que el residuo D48 de la proteína Hha es fundamental para su interacción con H-NS y
mutaciones sobre este residuo impiden la interacción entre ambas proteínas (1). Se ha determinado
que la proteína Hha D48N se une a StpA, parálogo de H-NS, incluso con mayor afinidad que la
proteína Hha. El empleo de un mutante en éste residuo (D48N) constituye una estrategia clave para
determinar el grupo de genes que son regulados por la proteína Hha de manera independiente a su
interacción con H-NS.
Métodos: Para este estudio se utilizó la cepa S. Typhimurium SV5015. Se han obtenido los
mutantes hha, hhaD48N, stpA y hhaD48N stpA. Se han realizado estudios transcripcionales de las
cinco cepas en cultivos en fase exponencial (OD600 0.6) y a 37ºC.
Resultados: Del conjunto de genes que presentaron distinta expresión en la cepa mutante hha
respecto a la cepa salvaje, solo 126 fueron considerados como genes presuntamente regulados por
Hha de manera independiente a H-NS o StpA. Este grupo se determinó considerando aquellos
genes desregulados en el mutante hha respecto a la cepa salvaje, y no se vieron afectados en la
cepa hhaD48N respecto la cepa salvaje. En este grupo se encuentran genes relacionados con la
síntesis de sideróforos, la motilidad, y la formación de biofilm. Se ha determinado el fenotipo de las
distintas cepas en relación a estas características. La cepa hha presenta una menor expresión de
sideróforos, así como una capacidad muy disminuida de formar biofilm. Respecto a la motilidad, la
mutación hha causa una disminución de la motilidad, que se complementa con el gen hha en trans,
mientras que la recuperación del fenotipo es mucho menor cuando se complementa con el gen
hhaD48N
Conclusiones: El conjunto de genes cuya expresión es regulada por la proteína Hha de forma
independiente a H-NS incluye genes que participan en procesos básicos para la célula, así como
genes asociados a la virulencia, lo que confirma la importancia de ésta proteína como regulador
transcripcional.
Referencias:
(1) Fernández de Alba C, et al. (2011) FEBS Letters 585: 1765-1770.
44
S3-19
A study of the central carbon metabolism pathways of slow and
fast growing brucellae
Amaia Zúñiga-Ripa, Thibault Barbier, Estrella Martínez-Gómez, Raquel Conde-
Álvarez, María Jesús Grilló, Jean Jacques Letesson, Maite Iriarte and Ignacio
Moriyón.
Institute for Tropical Health and Microbiology Department; University of Navarra, Pamplona, Spain;
Research Unit in Biology of Microorganisms – URBM, NARILIS, UNAmur, B-5000 Namur, Belgium;
Instituto de Agrobiotecnología, CSIC-UPNA-Gobierno de Navarra, Pamplona, Spain.
Introducción: The brucellae are the agents of brucellosis, a worldwide-distributed zoonosis, that
behave as facultative intracellular parasites able to adjust their metabolism to extra and intracellular
environments. Brucella metabolism is imperfectly known and most work has been conducted with B.
abortus and B. melitensis that, like most brucellae, grow slowly. B. microti and the closely related B.
suis biovar 5 are fast growing, suggesting species differences in metabolic abilities.
Métodos: To analyze the glyoxylate and gluconeogenic pathways in fast and slow growing brucellae,
we constructed non-polar mutants in key enzymes of B. abortus and B. suis 5. We tested the
mutants in two minimal media (glutamate-lactate-glycerol and erythritol) and in a rich medium.
Finally, we studied their multiplication in macrophages and/or mice.
Resultados: Disruption of the hypothetical isocitrate lyase in either strain had no effect suggesting
that the glyoxylate cycle is not essential. In vitro, the B. suis 5 but not the B. abortus double Fbp-
GlpX mutant grew under gluconeogenic conditions, suggesting a third fructose-1,6-bisphosphatase
or an unknown gluconeogenic pathway. Fbp and GlpX were not essential in vivo even for B. abortus.
With regards to phosphoenolpyruvate synthesis, there were differences in PckA between these
strains but only PpdK was critical in both species in vivo. Although it is accepted that erythritol (a
Brucella preferred carbon source) is converted into dihydroxyacetone-phosphate, the B. abortus
double Fbp-GlpX mutant grew normally on this substrate. Finally, the B. abortus but not the B. suis 5
ppdK mutant was impaired on erythritol, suggesting that whereas B. suis 5 depends on Pyk to grow
on erythritol, this enzyme may not be active in B. abortus.
Conclusiones: The results suggest that: (i), whereas the upper gluconeogenic steps and the
glyoxylate cycle are not necessary in vivo, phosphoenolpyruvate synthesis is required; (ii), erythritol
is metabolized directly through the pentose cycle rather than through the accepted pathway; and (iii),
there is an evolutionary tendency towards reduction of metabolic activities from fast to slow growing
brucellae, consistent with the hypothesis that fast growing brucellae are closer to the ancestor.
Although B. abortus in commonly used, research focused on this species offers only a partial view of
the metabolism of Brucella.
45
S4-1
Study of the effect of the new tuberculosis vaccine candidate MTBVAC on bladder cancer cells
Samuel Álvarez-Arguedas, Carlos Martín, Nacho Aguiló Grupo de Genética de Micobacterias, Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Zaragoza, Spain [email protected]
Introduction: The use of Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) as treatment of superficial bladder cancer is one of the most successful immunotherapy for cancer (1). In the development of a new vaccine candidate for replacing the actual BCG (2), we studied the effect of our genetically attenuated strain of Mycobacterium tuberculosis MTBVAC on the viability of bladder cancer cell lines. Methods: The T24, J82 (both from human) and MB49 (from mouse) bladder tumour cell lines (3) were cultured at different multiplicities of infection (MOI) with BCG Pasteur-GFP or MTBVAC-GFP (these strains express the GFP constitutively). Percentage of infection and cell death at different time points were measured by Flow Cytometry. Additionally, we studied the localization and the basic characteristics of the organelles that contain the BCG or MTBVAC by the use of Confocal microscopy. Results: The study of percentage of infection shows a very significant increase in the case of MTBVAC vaccine at 96 hours and 7 days in contrast of the low percentages in BCG Pasteur-GFP. Moreover, the study of cell death by Flow Cytometry is in accordance with the observed results of infection. Finally, we have obtained images in which MTBVAC-GFP shows clearly their localization in the acid compartments ofthe cell inside while the BCG Pasteur-GFP are in not acidic organelles in the inner of the cell. The number of bacilli of MTBVAC-GFP in the inner of the any cell line of bladder cancer is significantly higher than BCG Pasteur-GFP and the integrity of the cells is worse, mainly at 7 days of infection. Conclusions: We show that our vaccine candidate MTBVAC is a promising potentially alternative to BCG in treatment of bladder cancer. References: 1. Brandau S, Suttmann H. Thirty years of BCG immunotherapy for non-muscle invasive bladder cancer: a success story with room for improvement. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie. 2007;61(6):299-305. 2. Arbues A, Aguilo JI, Gonzalo-Asensio J, Marinova D, Uranga S, Puentes E, et al. Construction, characterization and preclinical evaluation of MTBVAC, the first live-attenuated M. tuberculosis-based vaccine to enter clinical trials. Vaccine. 2013;31(42):4867-73. 3. Secanella-Fandos S, Luquin M, Julian E. Connaught and Russian strains showed the highest direct antitumor effects of different Bacillus Calmette-Guerin substrains. The Journal of urology.
2013;189(2):711-8. * Samuel Álvarez-Arguedas es beneficiario de una beca predoctoral del
Gobierno de Aragón (Referencia B023/13).
46
S4-2
Genomic engineering for the generation of an attenuated
enteropathogenic E. coli E2348/69 strain lacking all known
effectors of the type III secretion system
Massiel Cepeda and Luis Ángel Fernández
Department of Microbial Biotechnology. Centro Nacional de Biotecnología, CNB-CSIC. Darwin 3,
Campus UAM, Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is an enteric pathogen whose ability to cause disease in
humans is linked with its capacity to deliver a set of bacterial effector proteins into host epithelia,
subverting host-cell signaling pathways to promote infection. EPEC is endowed of an injection
system to deliver these effector proteins called type III secretion system (T3SS). All genes necessary
for the assembly of the T3SS are encoded in the Locus of Enterocyte Effacement (LEE). EPEC
effector genes are spread around the chromosome of EPEC, 6 of them (espF,map, tir, espG, espH,
espZ) are encoded in the LEE whereas 22 effectors are located outside the LEE, which are called
non-LEE effector (Nle) genes [1, 2]. EPEC effector proteins frequently have multiple functions during
infection, having the ability to act in redundant, synergic or antagonistic functions. Hence, to study
the biological role of individual effectors in pathogenesis, it would be of interest to have an EPEC-
derived bacterial strain with a functional T3SS devoid of all natural effectors. We have constructed a
collection of suicide and thermo-sensitive vectors for the deletion of all known LEE and non-LEE
effectors encoded in the genome of EPEC strain E2348/69. The deletion strategy is based on their
integration by homologous recombination and the marker-less resolution of co-integrants after I-SceI
digestion in vivo [3]. Using this strategy we have deleted all known effector genes found in the
genome of EPEC testing in every step the functionality of the T3SS. This attenuated strain may also
have application as a vaccine for EPEC infection.
References
1. Iguchi, A., et al., 2009. 191(1): p. 347-54.
2. Deng, W., et al., 2012. 11(9): p. 692-709.
3. Posfai, G., et al., 1999. 27(22): p. 4409-15.
47
S4-2bis
Terapia fágica: el caso de la lisozima Cpl-7 y su poder bactericida
Díez-Martínez R., de Paz HD., Bustamante N., García E., Menéndez M., García P. Departamento de Microbiología Molecular, Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Ramiro de Maeztu, Madrid / Departamento de Química-física Biológica, Instituto de Química-Física Rocasolano (CSIC), Madrid. [email protected]
Introducción: Streptococcus pneumoniae es uno de los principales patógenos causantes de enfermedades como neumonía, otitis o meningitis, entre otras, siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en niños y adultos en el mundo. La terapia fágica, es decir el uso de viriones o de sus productos fágicos, es hoy en día una importante alternativa para combatir bacterias multirresistentes a los antibióticos. Entre los productos fágicos más prometedores están las mureín-hidrolasas, reconocidas como agentes antibacterianos específicos cuando se añaden exógenamente. Estas enzimas se han denominado “enzibióticos”. En el sistema de neumococo, todas las mureín-hidrolasas (bacterianas y fágicas) descritas hasta la fecha dependen de la presencia de colina en la pared celular para su actividad exceptuando la lisozima Cpl-7, codificada por el bacteriófago Cp-7. Métodos: Se ha diseñado un nuevo gen sintético, denominado cpl-7S, que codifica una versión modificada en 15 aminoácidos del módulo de unión al sustrato. Las enzimas se han ensayado in vitro con paredes purificadas de neumococo o in vivo con bacterias resuspendidas en PBS pH 6.0, para evaluar su efecto bacteriolítico y bactericida. Además, se han utilizado embriones de pez cebra infectados con S. pneumoniae o Streptococcus pyogenes por inmersión en el medio E3. Resultados: Se ha mejorado la actividad bactericida de la lisozima Cpl-7 al introducir 15 mutaciones que han invertido el signo de la carga neta de la proteína (de ‒ 29.77 a ‒ 11.84). La variante
sintética, Cpl-7S, presenta una gran capacidad bactericida (con 5 μg ml─1) no solo frente a S.
pneumoniae (incluyendo cepas multirresistentes) sino frente a S. pyogenes y otros patógenos. Además, Cpl-7S resultó eficaz frente a bacterias Gram-negativas tales como Escherichia coli y Pseudomonas putida, en combinación con 0.01% de carvacrol (un aceite esencial). Por otra parte, se han validado estos resultados en un modelo de embriones de pez cebra infectados con S. pneumoniae o S. pyogenes. Así, una dosis única de 25 μg de Cpl-7S aumenta significativamente la tasa de supervivencia de dichos embriones, confirmando el efecto letal de Cpl-7S in vivo. Conclusiones: Los resultados apuntan una estrategia general para mejorar la actividad lítica de las mureínhidrolasas fágicas, cuando se añaden exógenamente, basada en modificar su carga neta y facilitar su interacción con el sustrato, es decir el peptidoglicano de la pared bacteriana. Referencias: [1] López R, García E (2004). Recent trends on the molecular biology of pneumococcal capsules, lytic enzymes, and bacteriophage. FEMS Microbiol. Rev. 28(5), 553–580. [2] Bustamante N, Campillo NE, García E, Gallego C, Pera B, Diakun GP, Sáiz JL, García P, Díaz JF, Menéndez M (2010). Cpl-7. a Lysozyme Encoded by a Pneumococcal Bacteriophage with a Novel Cell Wall-binding Motif. J Biol Chem. 285(43), 33184–33196 [3] Fischetti VA (2010). Bacteriophage endolysins: a novel anti-infective to control Gram-positive pathogens. Int J Med Microbiol. 300(6):357-62
48
S4-3
Enzibióticos a la carta: nuevas terapias contra las infecciones
bacterianas
García-Fernández E.1, Díez-Martínez R.1, de Paz H.D.1, García G.2, Menéndez M.2,
García P1.
1Departamento de Microbiología Molecular, Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC)
2Departamento de Química-física Biológica, Instituto de Química-Física Rocasolano (CSIC)
Introducción: Streptococcus pneumoniae constituye un importante patógeno humano causante de
algunas infecciones invasivas (meningitis y sepsis) así como enfermedades que afectan al tracto
respiratorio (otitis media, sinusitis y neumonía). El creciente aumento de cepas de S. pneumoniae
resistentes a los tratamientos antibióticos clásicos ha propiciado el empleo en los últimos años de
mureín-hidrolasas fágicas como “enzibióticos”para un tratamiento más eficaz contra esta bacteria
(1).La lisozima Cpl-1, codificada por el bacteriófago Cp-1, es hasta la fecha el enzibiótico que ha
demostrado presentar una mayor actividad bacteriolítica. Por otro lado, la lisozima Cpl-7 se
caracteriza por presentar un dominio de unión a sustrato independiente de colina, lo que le permite
reconocer un mayor rango de bacterias (2). Recientemente se ha demostrado que la variante Cpl-
7S, con una menor carga negativa que Cpl-7, presenta una mayor actividad bactericida que su
enzima parental (3).
Métodos: Con el objetivo de obtener nuevos enzibióticos con una mayor actividad lítica, se
sintetizaron genes codificantes de nuevas enzimas quiméricas a partir de la combinación de los tres
elementos estructurales (módulo catalítico, linker y módulo de unión) de las lisozimas Cpl-1 y Cpl-
7S. La actividad enzimática de estas nuevas proteínas se analizó tanto in vitro, sobre paredes de
neumococo marcadas radiactivamente con 3H-colina, como in vivo, sobre cultivos de S.
pneumoniae.
Resultados:Los experimentos de lisis realizados sobre cultivos de la cepa de S. pneumoniae R6
demostraron que la actividad bactericida de las quimeras está estrechamente relacionada con la
naturaleza del módulo de unión a sustrato que presenta. Los resultados obtenidos pusieron de
manifiesto que el efecto bactericida de Cpl-711 y Cpl-771, que presentan un dominio de unión a
colina, es superior al observado con la proteína parental Cpl-1, siendo Cpl-711 la mejor enzima
quimérica, provocando una reducción de 2-3 unidades logarítmicas en el número de células viables.
Por el contrario, tanto Cpl-117S como Cpl-177S, ambas portadoras del dominio de unión a la pared
celular de Cpl-7S, presentaron una peor actividad bactericida comparable a la de la proteína Cpl-7S.
Conclusiones:La quimera Cpl-711, una combinación de diferentes módulos entre las proteínas Cpl-1
y Cpl-7S, es capaz de mejorar la actividad lítica de Cpl-1, constituyendo una prometedora alternativa
para el tratamiento de las infecciones neumocócicas. Esto sugiere la posibilidad de sintetizar nuevas
y potentes enzimas líticas de pared frente a una variedad de patógenos bacterianos.
Referencias: (1). Hermoso, J.A., García, J.L., García P. (2007). Curr Opin Microbiol 10(5):461-72.; (2).
Bustamante, N., Campillo, N.E., García, E., Gallego, C., Pera, B., Diakun, G.P., Sáiz, J.L., García, P., DíazJ.F.,
Menéndez, M. (2010) J Biol Chem 285(43):33184-96. (3). Díez-Martínez, R., de Paz, H.D., Bustamante, N.,
García, E., Menéndez, M., García, P. (2013). Antimicrob Agents Chemother 57(11):5355-65.
49
S4-4
Efecto del flavonoide de la cerveza Xanthohumol en el
microorganismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae
V. Mascaraque, J.M. Rodríguez-Peña, J. Arroyo y C. Nombela.
Cátedra Extraordinaria de Bebidas Fermentadas. Departamento de Microbiología, II.
Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid (UCM) e Instituto Ramón y
Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS).
La cerveza es una de las bebidas fermentadas más consumidas a lo largo de la historia de la
humanidad. En los últimos tiempos, ha aumentado el interés general que existe por los beneficios
del consumo moderado de la misma. El xanthohumol (XN) es el principal prenil-flavonoide presente
en las glándulas de lupulina de la planta femenina del lúpulo, componente de la cerveza e
importante suministro de compuestos fenólicos. El XN posee una gran variedad de propiedades
farmacológicas, principalmente relacionadas con efectos quimiopreventivos, antioxidantes y
antiinflamatorios. Sin embargo, poco se conoce del mecanismo regulatorio implicado en dichas
acciones biológicas. Por ello, nuestro principal objetivo es estudiar el efecto del XN sobre la
viabilidad celular y los cambios que tienen lugar en el patrón de expresión génica, en el
microorganismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae.
Estudios realizados con la cepa silvestre S. cerevisiae BY4741 muestran que el efecto del XN sobre
la viabilidad celular depende de la concentración del compuesto, el tiempo de exposición y la
complejidad del medio de cultivo. En paralelo, para caracterizar el efecto del XN en la modulación
de la expresión génica, hemos analizado la respuesta transcripcional del genoma completo
mediante microarrays de DNA y validado los resultados mediante RT-qPCR. Los genes expresados
diferencialmente incluyen genes de respuesta a estrés, metabolismo, transporte, transducción de
señales, tráfico intracelular, plegamiento y degradación de proteínas.
En base a herramientas bioinformáticas, los factores de transcripción de respuesta a estrés, Msn2/4,
y el principal factor de transcripción relacionado con la respuesta dependiente de Ca2+/calcineurina,
Crz1, se han propuesto como factores que regulan un elevado porcentaje de los genes inducidos en
presencia de XN. La comparación del perfil transcripcional de los mutantes crz1Δ y msn2Δmsn4Δ
con el de la cepa silvestre, en presencia de XN, indica que la activación transcripcional del 69% y
65% de los genes, es dependiente de Crz1 y Msn2/4, respectivamente. Es de resaltar, además, que
el 50% del total de genes inducidos, depende tanto de Crz1 como de Msn2/4.
La extrapolación de estos datos, a organismos superiores, permitirá un mayor conocimiento de los
efectos del flavonoide de la cerveza Xanthohumol, sobre la salud humana.
50
S4-5
Detección de RNA de Mycobacterium tuberculosis en una población con elevada prevalencia de malaria
Menéndez M.C., Julca N., Martínez-Serna A., Garrido C., Marín-García P., Aguado M.C., Puyet A., Bautista J.M., De Mendoza C., García M.J., Díez A. Universidad Autónoma de Madrid. Universidad Complutense de Madrid. Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón. Hospital Puerta de Hierro, Majadahonda. Madrid, España [email protected], [email protected]
Introducción: La coinfección por varios patógenos en un mismo paciente puede ser relevante para
determinar el curso clínico del proceso infeccioso. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es, junto a
Plasmodium y Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), uno de los tres patógenos de relevancia
mundial ligado a la pobreza (1). Su asociación con VIH está bastante documentada, pero la
correspondiente con Plasmodium ha sido escasamente estudiada. Este trabajo tiene como objetivo
determinar el nivel de detección de Mtb viable en una población con alta endemia de Plasmodium,
así como evaluar la presencia de co-infección.
Métodos: Las muestras (sueros y sangre fijada en filtro) fueron recolectadas de pacientes que
acudian al Hospital de Asikuma (Ghana). El aislamiento de los ácidos nucleicos se realizó a partir de
sangre. Mycobacterium y Plasmodium se detectaron mediante PCR en tiempo real (2), en el primer
caso tanto DNA como RNA y en el segundo caso únicamente DNA (1). Las dianas se seleccionaron
para detectar de forma específica el estado metabólico de la bacteria (2). Mediante ELISA, se
detectaron anticuerpos de varios virus, incluido VIH, en suero de los mismos pacientes.
Resultados: Se incluyeron de muestras de un total de 240 pacientes (66 hombres y 174 mujeres). El
67,5% entre 16-40 años de edad y 15,4% superaban los 40 años.
Se detectó al menos 1 patogeno en el 48,3% de los casos. En la mayoría de ellos dicho patógeno
correspondía a Mtb (52%), seguido por Plasmodium en menor nivel (34%).
La co-infección más frecuente fue de Mtb únicamente con Plasmodium (59%). Hasta un 2,5% de los
pacientes fueron positivos para tres patógenos Mtb, Plasmodium y VIH o VHB (Virus de la Hepatitis
B).
Conclusiones: La coinfección que implica M.tuberculosis y Plasmodium es la más frecuente en esta
población. La coincidencia en el rango de la edad más prevalente, en ambas patologías, puede
influir en este resultado. La detección de M.tuberculosis con actividad metabólica, en muestras de
pacientes sin diagnóstico de enfermedad, puede deberse a la presencia de bacilos latentes.
Referencias:
1. Rantala et al, 2010, Malaria Journal. 9:269.
2. Cubero N. et al., 2013, Clin. Microbiol. Infect. 19:273-78
51
S4-6
Rapid analysis of antibiotic resistance patterns of multi-resistant Acinetobacter in gel microspheres with a CELLENA®
microencapsulator
A. Muñoz-Suano, F. Vilches, V. Venegas, G. Bou, M. McConnell, A. Cebolla, J.M. Cisneros Biomedal, S.L., Sevilla, Spain / Servicio de Microbiología-Instituto de Investigación Biomédica, Complexo Hospitalario Universitario A Coruña, A Coruña, Spain / Instituto de Biomedicina de Sevilla, Sevilla, Spain / Unidad Clínica de Enfermedades Infecciosas, Microbiología y Medicina Preventiva, Hospital Virgen del Rocío, Sevilla. [email protected]
Introducción: The main goal of this work was the development of an innovative protocol for the fast
determination of resistance patterns in Acinetobacter baumannii in gel microspheres by using a
Cellena(R) microencapsulator.
Métodos: The resistance patterns of clinical strains of A. baumannii were analyzed either by broth
microdilution or by the microencapsulation technology. A Cellena® Flow Focusing microencapsulator
was used to generate alginate gel microcapsules containing individual bacteria and then incubated in
different conditions. The antibiotics tested in this work were colistin and meropenem due to their high
interest in nosocomial infections. Cell proliferation, resulting in microcolony formation was monitored
by flow cytometry. Analysis of microcolony size in each condition was conducted and comparison
with the CMI determinations by broth microdilution was made.
Resultados: The Cellena microencapsulator allowed rapid determination of the resistance profile of
Acinetobacter baumannii with a good concordance with broth microdilution, 85% of concordance with
colistin (due to detection of heteroresistance) and 90% with meropenem. It also allowed for clonal
studies within a population allowing the identification of individual clones within a population with
deviations in the resistance pattern.
Conclusiones: The easiness and the speed of the process together with the traceability of the system
make this technique a powerful tool for the study and determination of resistance profiles in
multiresistant pathogens, and may provide the information for choosing the best antibiotic option in
severe hospital infections. Furthermore, the Cellena microencapsulation technology could represent
a robust tool for basic and applied research or monitoring in different fields of life science, including
environmental microbiology.
Referencias: Gómez-Herreros, F et al. Nucleic Acids Research, 2012, 1–12
52
S4-7
HOTDROPS: a new tool for high throughput screening of
thermostable enzymes
Ana Luísa Ribeiro, Aurelio Hidalgo and José Berenguer
Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa, Universidad Autónoma de Madrid, Calle Nicolás Cabrera 1, 28049 Madrid, Spain. [email protected]; jose.berenguer@ uam.es Thermostable enzymes (Thermozymes) have a wide number of industrial and biotechnological applications because of their overall inherent stability against chemical-physical insults. A higher operation temperature allows a greater bioavailability and solubility of organic compounds and thereby provides efficient bioremediation (1,2). Concomitantly, thermozymes are more stable in presence of different organic co-solvents used to increase the concentrations of substrates and products. The screening of large mutant libraries or metagenomic libraries for thermozymes with the desired functionality can be very complicated and time-consuming. This is mainly due to the low success of expression of thermostable enzymes from the genome of thermophiles in common mesophilic expression systems and technical and economical limitations of ultrahigh-throughput screening (HTS) methods that require complex and expensive equipment. The HOTDROPS project is a multidisciplinary effort funded by the EU that aims to develop an innovative HTS platform based on thermophilic expression systems and microfluidics to screen for naturally occurring thermostable enzymes in metagenomes and for the thermostabilization of industrial enzymes from mesophiles. In vitro compartmentalization (IVC) combined with microfluidic systems enable the HTS based on miniaturization of the reaction volume to microdroplets. Single bacterial cells or in vitro transcription/translation systems can be compartmentalized into these droplets, each expressing a different gene library variant. This nanotechnology approach makes it easier to control exactly the micro-reactor droplets' lifetime and allows for the addition of substrates and quenchers at a desired time point.
An in vitro screening at high temperature based on folding interference with a thermostable
fluorescent protein reporter is being developed for those proteins without an activity assay. This
strategy requires a flow-cytometry-based screening to sort the droplets in which the fluorescent
product is expressed from the rest of the emulsion.
After the screening process, the candidate proteins will be biochemically characterized and their
behavior will be evaluated in enzymatic and biological assays. With this data it will be possible to
scale-up and optimize their production by fermentation techniques. The HOTDROPS initiative aims
to create a cutting-edge and cost-effective platform to identify and improve enzymes with wide
applicability and industrial relevance.
References:
1. Becker P (1997) Determination of the kinetic parameters during continuous cultivation of the lipase
producing thermophile Bacillus sp. IHI-91 on olive oil. Appl. Microb. Biotechnol. 48, 184–190.
2. Demirijan D, Moris-Varas F, Cassidy C (2001) Enzymes from extremophiles. Curr. Opin. Chem. Boil.
5, 144–151.
53
S4-8
Controlled assembly of functional type III secretion system
injectisomes in non-pathogenic E. coli K-12
David Ruano-Gallego, Beatriz Álvarez and Luis Ángel Fernández
Centro Nacional de Biotecnología – CSIC. Madrid
[email protected] Enteropathogenic E. coli (EPEC) carries a type III secretion system (T3SS) that injects a set of
cytotoxic proteins, called effectors, into the cytoplasm of infected host cells to subvert the intestinal
epithelial barrier. One of these effectors is Tir, which binds to the adhesin Intimin on the bacterial
surface and triggers actin polymerization in the enterocyte forming a pedestal-like structure beneath
the attached bacterium. A protein complex assembled in the bacterial envelope, called the
injectisome, acts as a molecular syringe for the translocation of effectors. The genes responsible for
its assembly are located in a 35 kb genomic island called the Locus of Enterocyte Effacement (LEE),
which also encodes transcriptional regulators, some effectors and Intimin. These genes are
organized in five major operons (LEE1-LEE5) and smaller transcriptional units under complex
regulation responding to environmental signals.
In order to express functional injectisomes in a non-pathogenic E. coli strain (K-12), we reorganized
the protein-coding genes into operons lacking effectors and the complex regulation found in EPEC.
Five synthetic operons (sLEE1, sLEE2, sLEE3, sLEE4 and escD) have been integrated into different
sites of the chromosome of E. coli K-12 under the control of an heterologous inducible promoter
(Ptac) using a markerless strategy for genome edition. We demonstrate that the resulting strain,
named Synthetic Injector E. coli (SIEC), assembles functional injectisomes upon induction with IPTG
that secrete the translocator proteins (EspA, EspB, EspD) of the T3SS into the culture medium.
Assembly of injectisomes by SIEC has been also confirmed by cell fractionation and electron
microscopy. We tested the functionality of SIEC injectisomes to translocate proteins into mammalian
cells using a SIEC strain carrying an additional operon (sLEE5) -encoding intimin, Tir and its
chaperone CesT- to infect HeLa cells. Staining of actin filaments in the infected HeLa cells revealed
the formation of actin-rich pedestals beneath the bound bacteria, thus demonstrating the
translocation of Tir by SIEC injectisomes. These results open the possibility to specifically inject
individual effectors and heterologous proteins, such as single-domain antibodies and toxins, into the
cytoplasm of target mammalian cells using a non-pathogenic E. coli strain.
54
S4-9
Construction of new recombinant MTBVAC expressing tetanus,
diphtheria or pertussis toxin.
Esther Broset, Carlos Martín, Jesús Gonzalo-Asensio
Grupo de Genética de Micobacterias, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, Spain
CIBER enfermedades respiratorias. Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain
[email protected], [email protected]
Introduction: BCG vaccine is effective in reducing the rate of severe forms of tuberculosis (TB) but
confers variable protection against pulmonary TB in adults (1). For this reason, we have developed
MTBVAC, a new live attenuated vaccine candidate which is actually finishing phase I of clinical trials
(NCT02013245). For its adjuvant properties BCG has been previously proposed as a suitable vector
to deliver viral, bacterial and parasite antigens (2). In this context, here we propose the use of
MTBVAC as a multivalent recombinant vaccine against different infectious diseases including
diphtheria, tetanus and whooping cough.
Methods: Inactive toxins from Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani or Bordetella pertussis
were cloned into a mycobacterial integrative vector and transformed into MTBVAC (and BCG as
control). The amount of toxoid transcript was determinated by Real-Time PCR. Toxoid production in
each recombinant strain was confirmed by western blot using specific antibodies.
Results: Genetically inactivated diphtheria or pertussis toxoids (CRM197 or S1 respectively), or
Fragment C of tetanus toxin were cloned under the control of three mycobacterial promoters (antigen
85A, antigen 85B and hsp60). To promote the export of these antigens two signal sequences (ss)
were used: ssAntigen 85A and ssAntigen 85B. Finally 12 vectors were obtained, 12 rMTBVAC and
12 rBCG as control.
Preliminary results suggest that rMTBVAC strains produce higher levels of toxoid mRNA than rBCG.
In addition, our preliminary western blots show proper tetanus toxoid production.
Conclusions: In order to analyze the potential use of MTBVAC as vehicle vaccine, four heterologous
protein production systems have been explored. We combined three different promoters (antigen
85A, antigen 85B and the strong hsp60 promoter) with two different secretion sequences (ssAg85A
and ssAg85B) with the aim to determining the best combination. Further, our system allows toxoid
secretion to facilitate the immune system recognition.
Most heterologous expression experiments in Mycobacterium have been carried out in
Mycobacterium bovis BCG; a strain with significant less antigenic potential than the human pathogen
Mycobacterium tuberculosis. Using MTBVAC -an attenuated M. tuberculosis strain- we expect to
obtain a better immune response against multiple infections as a rationale to develop a multivalent
vaccine.
References:
(1) Fine, P.E. (1995) Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity.
Lancet 346: 1339-1345.
(2) Bastos et al. (2009). "Recombinant Mycobacterium bovis BCG." Vaccine 27(47): 6495-503.
*Funded by: Secretaría de Estado de Investigación, Desarrollo e Innovación del Ministerio de
Economía y Competitividad de España. Ref. BES-2012-052937.
55
S5-1
La emergencia de genotipos resistentes a penicilina en el serotipo 11A de Streptococcus pneumoniae se correlaciona con la evasión
de la respuesta inmune del huésped
Leire Aguinagalde Salazar1, Arnau Domenech
2, Irene Mata San Juan
1, Bruno Corsini
1, Mirian
Domenech3, Carmen Ardanuy
2, Josefina Liñares
2, Ernesto García
3, Asunción Fenoll
1, Jose
Yuste1
1Centro nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda,
2Servicio de
Microbiología, Hospital Universitario de Bellvitge, Barcelona, 3Centro de Investigaciones Biológicas,
CSIC, Madrid.
Introducción: Streptococcus pneumoniae también llamado neumococo es el principal agente
etiológico de las neumonías adquiridas en la comunidad y una importante causa de enfermedad
neumocócica invasiva (ENI) incluyendo sepsis y meningitis. Tras la implantación de la vacuna
conjugada 13-valente (PCV13), han aumentado los casos de ENI producidos por serotipos no
incluidos en la misma entre los que destaca el serotipo 11A. Las infecciones producidas por este
serotipo han sido tradicionalmente debidas al genotipo 62 (sensible a antibióticos). Sin embargo, se
ha observado recientemente un incremento de casos de ENI producidos por otros dos genotipos
(838 y 6521) que presentan altos niveles de resistencia a antibióticos β-lactámicos.
Métodos: El objetivo del trabajo ha sido caracterizar la patogenicidad de los genotipos del serotipo
11A estudiando su capacidad para evadir la inmunidad mediada por el sistema del complemento y
la fagocitosis mediada por neutrófilos humanos utilizando las técnicas de citometría de flujo y
microscopía confocal.
Resultados: La caracterización molecular de este serotipo ha permitido identificar la presencia de
tres genotipos con diferencias en su patrón de sensibilidad antibiótica a β-lactámicos, como son el
genotipo 62 (sensible) y los genotipos 838 y 6521 (resistentes). En este trabajo se ha confirmado
que el genotipo 838 es reconocido de un modo más eficiente por los mecanismos de defensa del
huésped lo que explicaría por qué es el genotipo que menos casos de ENI produce. Además se ha
observado que los aislados de los genotipos 62 y 6521 son capaces de reclutar reguladores
negativos del complemento incrementando de este modo su patogenicidad. Esto es de especial
relevancia para los aislados de genotipo 6521 ya que al presentar resistencia antibiótica suponen un
importante riesgo para el tratamiento de la infección neumocócica producida por estas cepas.
Conclusiones: Nuestros resultados confirman que los aislados clínicos de genotipo 6521 evaden de
un modo muy eficiente la inmunidad del complemento y la fagocitosis lo que explicaría por qué los
casos de ENI producidos por este genotipo están aumentando dramáticamente en los últimos años.
Esto es de especial relevancia ya que podrían suponer una seria amenaza en salud pública.
56
S5-2
From Genomes to Nucleotides:
Rethinking Virulence Networks in Mycobacterium tuberculosis
Jesús Gonzalo-Asensio1,2,*, Luis Solans1,2, Claudia Sala3, Stewart T. Cole3 and Carlos
Martín1,2
1 Grupo de Genética de Micobacterias, Facultad de Medicina, Universidad de Zaragoza, Zaragoza,
Spain. 2 CIBER de Enfermedades Respiratorias, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain.
3 Ecole
Polytechnique Fédérale de Lausanne, Global Health Institute, Station 19, Lausanne, Switzerland
Presenting autor: [email protected]
Introducción:
Since the original genome annotation of Mycobacterium tuberculosis in 1998, many works have
been focused on identifying regulatory networks of this intracellular pathogen. For over 15 years, we
work to decipher the PhoP virulence network known to control several pathogenic determinants.
Importantly, inactivation of the phoP gene substantially contributes to the attenuation of MTBVAC, an
attenuated vaccine candidate which is currently under clinical evaluation.
Métodos:
In this work, we combine high-throughput sequencing techniques (ChIP-seq and RNA-seq) to get an
unprecedented level of detail of the PhoP-related regulatory networks. Further, we report for the first
time the whole transcriptome of this pathogen inside macrophages, a physiologically relevant
intracellular niche.
Resultados:
Combining ChIP-seq and RNA-seq has allowed distinguishing between genes directly regulated by
PhoP and genes controlled through intermediate regulators. Previous works demonstrated that PhoP
regulates the 2% of the M. tuberculosis coding capacity. In this work, we demonstrate that most of
these PhoP-regulated genes are the result of indirect regulation via well-known transcription factors
(EspR, WhiB and DosR). It is well known that M. tuberculosis phoP mutants are unable to secrete
ESAT6, the major pathogenic determinant in M. tuberculosis. However, the molecular mechanism
responsible for this phenotype remained unanswered. Here, we establish EspR as an intermediate
regulator, which control the espACD operon, whose expression is essential for ESAT6 secretion. Our
results have also uncovered yet unknown regulatory mechanisms including a PhoP-regulated
ncRNA, which controls secretion of key antigens in M. tuberculosis.
Conclusiones:
Our results serve to exemplify the complexity of virulence networks. We demonstrate that PhoP,
EspR, WhiB, and DosR regulons are mutually interconnected and allow proposing a regulatory
network to explain the M. tuberculosis transcriptional response to environmental stresses found
inside macrophages. This network otherwise explain the attenuated phenotype of M. tuberculosis
phoP mutants and help to understand the vaccine features of MTBVAC.
57
S5-3
Evaluación de 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA reductasa y
fosfodiesterasa 4B como dianas terapeúticas frente a la infección
por Haemophilus influenzae
Javier Moleres1, Begoña Euba1,2, Pau Morey3, Víctor Segura4, José Leiva5, Juan Pablo
de Torres5, Junkal Garmendia1,2
1Instituto de Agrobiotecnología-CSIC-UPNA-Gob. Navarra,
2Centro Investigación Biomédica en Red
Enfermedades Respiratorias (CIBERES), 3Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin,
Germany, 4Centro Investigación Médica Aplicada (CIMA),
5Clínica Universidad de Navarra (CUN)
Email: [email protected]
Introducción: Haemophilus influenzae no tipificable (HiNT) es un patógeno oportunista, causante de
infección respiratoria en pacientes con patología pulmonar crónica. HiNT invade y persiste en
células alveolares en un nicho subcelular con características de endosoma tardío [1]. La infección
persistente y recurrente a pesar del uso antibiótico manifiesta la necesidad de explorar opciones
terapéuticas nuevas. Este trabajo, hemos caracterizado funciones celulares manipuladas por HiNT
para invadir el epitelio respiratorio, para identificar dianas celulares que permitan la modulación
terapéutica de funciones del sistema respiratorio esenciales en el control de la infección por HiNT.
Métodos: Hemos empleado neumocitos tipo II humanos A549 y el aislado clínico HiNT375 para
analizar los cambios en el transcriptoma del epitelio respiratorio en respuesta a la infección,
mediante microarray Affymetrix y análisis de categorías funcionales diferencialmente expresadas
mediante Ingenuity. Hemos empleado inhibidores farmacológicos específicos de las dianas
celulares identificadas mediante microarray, y analizado su efecto en la adhesión e invasión
bacteriana, y en la inflamación epitelial en respuesta a la infección.
Resultados: HiNT invade el epitelio respiratorio a través de balsas lipídicas [2], plataformas para
señalización celular dependiente de AMP cíclico (AMPc) mediada por adenilato ciclasas,
fosfodiesterasas (PDE) y proteína quinasa A (PKA). La infección epitelial por HiNT activa la
expresión de hmgcr, gen que codifica HMG-CoA reductasa, enzima implicada en la síntesis de
colesterol, y de la cascada PKA, que incluye pde4b, gen que codifica la isoforma PDE4B mayoritaria
en pulmón. Mediante los inhibidores específicos de uso clínico (fluva)statina y roflumilast, hemos
determinado que la depleción de colesterol y el aumento de AMPc bloquean el acceso de HiNT al
nicho intracelular en el que persiste.
Conclusiones: Las estatinas son fármacos inhibidores de HMG-CoA reductasa, administrados a
pacientes con hipercolesterolemia. El inhibidor de PDE4 roflumilast es un fármaco antiinflamatorio,
administrado a pacientes respiratorios graves. Los datos obtenidos en este trabajo sugieren el
beneficio del bloqueo farmacológico de HMG-CoA reductasa y/o PDE4 frente a la infección por
HiNT, lo que puede contribuir a ampliar el potencial terapéutico de estatinas y roflumilast.
Referencias: Morey et al. (2011) Microbiology 157: 234-250; López-Gómez et al. (2012)
Microbiology 158: 2384-2398
58
S5-4
Explorando el transcriptoma (ciano) bacteriano. RNAs no
codificantes.
Elvira Olmedo Verd1, Jan Mitschke2, Agustín Vioque1, Wolfgang R. Hess2 y Alicia M.
Muro-Pastor1
1Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. Universidad de Sevilla-CSIC, Américo Vespucio 49,
E-41092 Sevilla. 2Faculty of Biology, Genetics and Experimental Bioinformatics, University of
Freiburg, Schänzlestrasse 1, D-79104 Freiburg
Los mecanismos regulatorios orquestados por moléculas de RNA no codificantes están implicados
en prácticamente todos los aspectos de la fisiología bacteriana, incluyendo procesos de
adaptación a estrés o virulencia. Uno de los fenómenos de adaptación a estrés nutricional más
llamativos dentro del ámbito de las bacterias es la diferenciación de los heterocistos, un tipo celular
especializado en la fijación de nitrógeno atmosférico en cianobacterias filamentosas. En
condiciones de deficiencia en nitrógeno combinado, el crecimiento de estas bacterias fotosintéticas
depende del funcionamiento coordinado de dos tipos celulares interdependientes con funciones
metabólicas complementarias. Este fenómeno de diferenciación depende del establecimiento de
un patron transcripcional exclusivo de una pequeña proporción de las células del filamento
(aproximadamente 5-10% del total).
En nuestro laboratorio estamos interesados en definir los procesos regulatorios que conducen al
desarrollo de estas células especializadas y, en particular, nos interesan aquellos procesos que
puedan estar regulados por RNAs no codificantes. Hemos llevado a cabo un análisis
transcriptómico global de nuestro organismo modelo, Anabaena sp. PCC7120, mediante una
metodología basada en secuenciación de RNA total (RNA-Seq). El protocolo empleado nos ha
permitido asignar todas las posiciones en las que se inicia la transcripción, no sólo de RNAs
codificantes (mRNAs) sino también de pequeños RNAs (small RNAs, sRNAs) y transcritos
antisentido, que al igual que se ha descrito recientemente para otras bacterias, son
extraordinariamente abundantes en Anabaena (1).
Estamos analizando la posible función de varios sRNAs cuya transcripción está fuertemente
regulada por la disponibilidad de nitrógeno, lo que sugiere que podrían estar implicados en la
adaptación al estrés de carencia de nitrógeno. Algunos de estos sRNAs se transcriben
exclusivamente en las células que se diferencian como heterocistos (2) y sus regiones promotoras
contienen secuencias conservadas que podrían ser responsables de la transcripción exclusiva en
este tipo celular.
Referencias:
(1) Mitschke J., A. Vioque, F. Haas, W.R. Hess and A.M. Muro-Pastor (2011) Dynamics of
transcriptional start site selection during nitrogen stress-induced cell differentiation in Anabaena sp.
PCC 7120. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:20130-20135.
(2) Muro-Pastor A.M. (2014) The heterocyst-specific NsiR1 small RNA is an early marker of cell
differentiation in cyanobacterial filaments. mBio 5(3):e01079-14. doi:10.1128/mBio.01079-14
59
S5-5
Expresión y análisis funcional de proteínas de Brucella abortus en
la levadura Saccharomyces cerevisiae
María Rodríguez-Escudero1, Thais Lacerda3, Jean-Pierre Gorvel2, Suzana P. Salcedo3,
María Molina1, Víctor J. Cid1 e Isabel Rodríguez-Escudero1
Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid.
IRYCIS1
Centre d´Immunologie de Marseille-Luminy, France2
Institute of Biology and Chemistry of
Proteins, Lyon3
Introducción: Brucella spp., es una bacteria patógena intracelular, Gram-negativa, causante de
infecciones en animales y en el hombre (Pappas et al., 2006). Posee un sistema de secreción
especializado de tipo IV (T4SS) que inyecta factores de virulencia bacterianos al interior de la célula
hospedadora, lo que favorece la supervivencia del patógeno (Celli et al., 2003).
Hemos utilizado la levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo para el estudio de proteínas
de Brucella, centrándonos en BnpA/B, dos proteínas de interés por su localización nuclear y BtpB,
un factor de virulencia con un dominio Toll/interleukin-1 receptor (TIR) (Salcedo et al., 2008).
Métodos: Crecimiento de levaduras. Observación microscópica de las fusiones de las proteínas a
GFP, DAPI, Cherry-Nop1, FM4-64 y faloidina. Inmunofluorescencia. Western-blotting. Mutagénesis
dirigida y al azar.
Resultados: Hemos reproducido en S. cerevisiae la localización nuclear de BnpA/B, demostrando
que depende de la importina α. Mediante mutagénesis dirigida de BnpA determinamos que la
práctica integridad de su estructura primaria es necesaria para su translocación nuclear y que ésta
no depende de una posible señal de localización nuclear detectada en su secuencia.
Por otra parte, la expresión de BtpB resulta muy tóxica para S. cerevisiae, causando una
disminución de la activación de MAPKs, inhibición de la endocitosis y despolarización del
citoesqueleto de actina. La expresión de su extensión N-terminal BtpB(N-139) no tiene efecto tóxico.
Sin embargo, el dominio TIR per se, BtpB(140-C) se localiza en microtúbulos y es responsable de
los efectos tóxicos e inhibitorios descritos. Además, hemos realizado mutaciones puntuales tanto de
manera dirigida a residuos conservados como al azar afectando la región C-terminal de la proteína
que implican una pérdida total o parcial de la función.
Conclusiones: Hemos definido regiones esenciales para la localización nuclear del posible efector
BnpA, así como dominios importantes para la interferencia de BtpB con funciones de la célula
eucariótica. Este trabajo demuestra la utilidad de la levadura para el estudio de dominios funcionales
en efectores bacterianos.
Referencias:
Pappas, G. et al. Lancet Infect Dis 6, 91-9 (2006)
Celli, J. et al. J. Exp Med 198, 545-56 (2003)
Salcedo, S. P. et al. Front Cell Infect Microbiol 3:28 (2013)
60
S5-6
Estudio de proteínas VgrG de Klebsiella pneumoniae utilizando la
levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo
Isabel Rodríguez-Escudero1, Víctor J. Cid1, José Antonio Bengoechea2, María Molina1
1Dpto. de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid. IRYCIS.
2School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences. Queen’s University. Belfast.
Introducción:
Klebsiella pneumoniae es una bacteria gram-negativa con un importante papel en infecciones
oportunistas, principalmente nosocomiales. Puede causar neumonías, infecciones del tracto
urinario, sepsis, infección de heridas quirúrgicas, etc (Podschun and Ullmann. 1998). Esta bacteria
parece poseer un sistema de secreción especializado de tipo VI (T6SS). Estos sistemas son
utilizados por bacterias patógenas para insertar sus factores de virulencia al interior del citoplasma
de la célula hospedadora. Se han descrito como componentes estructurales de este T6SS unas
proteínas con repeticiones en valina y glicina (VgrG), que podrían ser secretadas al interior de la
célula hospedadora (Silverman et al., 2012). En este trabajo describimos la expresión de cinco
VgrGs de dos cepas de K. pneumoniae en la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae. y sus
implicaciones funcionales
Métodos:
Crecimiento de levaduras. Observación microscópica de fusiones de las proteínas a GFP y de
Cherry-Ilv6. Western blotting.
Resultados:
De las VgrGs expresadas, solo VgrG4 inhibe drásticamente el crecimiento de las células de
levadura y altera la morfología mitocondrial, residiendo este efecto en su región carboxi-terminal, en
la que se encuentran algunos dominios conservados en esta familia de proteínas. Además, esta
proteína se localiza en zonas que co-localizan con marcadores de retículo endoplásmico
adyacentes a las mitocondrias.
Conclusiones: Este trabajo demuestra la utilidad de la levadura S. cerevisiae para el estudio
funcional e identificación de dianas de proteínas efectoras de sistemas de secreción bacterianos de
tipo VI.
Referencias:
Podschun, R. and Ullmann, U. Klebsiella spp. as nosocomial pathogens: epidemiology, taxonomy,
typing methods, and pathogenicity factors. (1998). Clin. Microb. Rev. 11: 589-603.
Silverman,J.M., Brunet, Y.R, Cascales, E., Mougous J.D. Structure and regulation of the type VI secretion system. (2012). Annu. Rev. Microbiol. 66: 453-72
61
S6-1
Mutagénesis inducida mediante el uso de antibióticos en
Acinetobacter baumannii
Luis M. Jara, Pilar Cortés, Germán Bou, Jordi Barbé y Jesús Aranda
Departament de Genètica i Microbiologia, Universitat Autònoma de Barcelona
Introducción: Acinetobacter baumannii es uno de los principales agentes causante de infecciones
nosocomiales, produciendo brotes alrededor de todo el mundo [1]. Alarmantemente, muchos
aislados clínicos son resistentes a casi todos los antibióticos de uso clínico, hecho que implica que
algunas infecciones de A. baumannii sean intratables [2]. En la cepa de A. baumannii ATCC 17978,
se han identificado 2 operones homólogos a umuDC (0636-7 y 1174-3) y un gen homólogo a umuD
[3], todos ellos implicados en la mutagénesis inducida por daño en el DNA [4, 5]. El objetivo de este
trabajo ha sido establecer la relación entre el tratamiento de este patógeno con distintos grupos de
antibióticos y su capacidad de generar mutagénesis mediante la inducción de genes que codifican
componentes de DNA polimerasas tendentes a error.
Métodos: La inducción de los genes que codifican componentes de DNA polimerasas tendentes a
error mediante el tratamiento con antibióticos se estudió a través de RT-PCR en tiempo real. Los
análisis de mutagénesis se realizaron determinando la frecuencia de aparición de clones resistentes
a rifampicina.
Resultados: Los datos obtenidos muestran que todos los genes identificados en la cepa A.
baumannii ATCC 17978 que codifican componentes de la DNA polimerasa V tendente a error
(UmuDC) se inducen en presencia de varios antibióticos de uso clínico pertenecientes a los grupos
de las quinolonas, los aminoglucósidos y las tetraciclinas. Sin embargo antibióticos pertenecientes a
los grupos de los β-lactámicos y de las polimixinas no los inducen. Además, la inducción de estos
genes se corresponde con un incremento de la tasa de mutagénesis en este patógeno.
Conclusiones: La utilización de carbapenemes o colistina frente a A. baumannii no comporta el
aumento de la generación de clones resistentes por mutaciones en el genoma de esta especie
bacteriana.
Referencias:
1. Antunes, L.C., P. Visca, and K.J. Towner, Acinetobacter baumannii: evolution of a global pathogen. 2014. Pathog Dis.
2. Gordon, N.C. and D.W. Wareham, Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii: mechanisms of virulence and resistance. 2010. Int J Antimicrob Agents. 35(3): p. 219-26.
3. Norton, M.D., A.J. Spilkia, and V.G. Godoy, Antibiotic resistance acquired through a DNA damage-inducible response in Acinetobacter baumannii. 2013. J Bacteriol. 195(6): p. 1335-45.
4. Aranda, J., et al., Identification of a DNA-damage-inducible regulon in Acinetobacter baumannii. 2013. J Bacteriol. 195(24): p. 5577-82.
5. Aranda, J., et al., Role of Acinetobacter baumannii UmuD homologs in antibiotic resistance acquired through DNA damage-induced mutagenesis. 2014. Antimicrob Agents Chemother. 58(3): p. 1771-3.
62
S6-2
Bases de la adaptación de un plásmido ColE1 a su hospedador en
un ensayo de evolución experimental
Bernabe-Balas C., Santos-Lopez A., Gutierrez B., Carrilero L., Martinez-Ovejero C.,
Thomas-Lopez D., Hoefer A., de la Cruz F., Gonzalez-Zorn B.
Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid
Introducción: Los plásmidos tipo ColE1 son replicones de pequeño tamaño movilizables, descritos
en las familias Enterobacteriaceae y Pasteurellaceae. Recientemente se ha puesto de manifiesto su
importancia en la resistencia a antibióticos. Por ejemplo, pB1000 se ha encontrado en Haemophilus
influenzae, H. parasuis, Pasteurella multocida y P. aerogenes (1,2), confiriendo fenotipo de
resistencia a β-lactámicos. Pese a ser 100% estable en la familia Pasteurellaceae, pB1000 se
pierde en menos de 30 generaciones en Escherichia coli.
En este trabajo, ponemos de manifiesto la adaptación de un plásmido ColE1 de Pasteurellaceae en
Enterobacteriacea mediante la adquisición de una secuencia de inserción y de al menos una
mutación en el origen de replicación (oriV).
Métodos: El plásmido pB1000 fue transformado en E. coli DH5α y seleccionado bajo presión
antibiótica. Seis evoluciones experimentales independientes fueron llevadas a cabo con los
transformantes. Durante 50 días, cada 24 horas, 106 UFCs fueron transferidas en medio líquido con
64 mg/l de ampicilina. La estabilidad de pB1000 fue medida en diferentes puntos de las evoluciones.
Así mismo, se congelaron las poblaciones a lo largo de las evoluciones, y se obtuvieron
extracciones plasmídicas, a partir de las cuales se realizaron mapeos del replicón y se secuenció el
origen de replicación del mismo.
Resultados: Durante los ensayos de evolución experimental, la estabilidad de pB1000 aumentó de
una tasa de pérdida del 60% cada 10 generaciones a ca. 4% cada 10 generaciones. La
secuenciación y el mapeo del plásmido revelaron que este aumento de estabilidad era debido a la
inserción de InsAB’ desde el cromosoma de E. coli, y la adquisición de entre una y dos mutaciones
en el oriV del replicón, las cuales se mantuvieron durante la evolución.
Conclusiones: La contribución de mutaciones en el oriV y la adquisición de una secuencia de
inserción amplían la estabilidad de pB1000 en E. coli, aumentando de este modo el rango de
hospedador del replicón.
Referencias:
1. San Millan A, et al. Beta-lactam resistance in Haemophilus parasuis is mediated by plasmid pB1000 bearing blaROB-1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 51, 2260-4 (2007).
2. San Millan A, et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53, 3399-404 (2009).
63
S6-3
MgrB inactivation is a common mechanism of colistin resistance in KPC carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae of
clinical origin
Antonio Cannatelli1§, Tommaso Giani1§, Marco Maria D’Andrea1, Vincenzo Di Pilato1, Fabio Arena1, Viola Conte1, Kyriaki Tryfinopoulou2, the COLGRIT Study Group3, Alkiviadis Vatopoulos2, 4 and Gian Maria Rossolini1,5,6* 1 Department of Medical Biotechnologies, University of Siena, Siena, Italy . 2 Central Public Health Laboratory, Hellenic Centre for Disease Control and Prevention (KEELPNO), Vari, Greece . 3 Members of the COLGRIT Study Group will list in the acknowledgement section . 4 Department of Microbiology, National School of Public Health, Athens, Greece . 5 Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, Florence, Italy. 6 Clinical Microbiology and Virology Unit, Florence Careggi University Hospital, Florence, Italy. § AC and TG equally contributed to this work *[email protected], [email protected] Introducción: Klebsiella pneumoniae producing KPC-type carbapenemases (KPC-KP) are multidrug-resistant pathogens. Colistin is a key component for treatment of severe KPC-KP infections. The emergence of polymyxin-resistant KPC-KP, however, has been reported (1-3). We recently showed that inactivation of the mgrB gene, encoding a negative regulator of the PhoQ/PhoP can be responsible for acquired colistin resistance in KPC-KP by upregulating PhoQ/PhoP which, in turn, activates Pmr LPS modification system (4). In this work we investigated the occurrence of mgrB alterations as a mechanism of resistance in a collection of colistin-resistant clinical isolates of KPC-KP collected during the ongoing Greek and Italian epidemics. Methods: The strains studied in this work included 66 nonreplicate colistin-resistant KPC-KP clinical isolates obtained during the period 2010 – 2012 from 23 centers (19 in Italy and four in Greece). Susceptibility testing was performed by broth microdilution. mgrB genes were detected by PCR. For complementation experiments, a pACYC184 derivative was used (4). qRT-PCR was used to measure the expression of the phoQ and pmrK genes. Results: In 35 strains (53%) several different nonsilent alterations of the mgrB coding sequence were detected, including inactivation by an insertion sequence (IS), missense or nonsense point mutations, and small deletions. Four additional strains had a larger deletion of the mgrB locus, while the remaining 27 strains (41%) did not show mgrB alterations. Transcriptional upregulation of the phoQ and pmrK genes was observed in all strains with mgrB mutated. Complementation experiments with a wild-type mgrB gene, restored colistin susceptibility and basal expression levels of phoQ and pmrK genes, in strains carrying different types of mgrB alterations. Conclusions: The majority of colistin-resistant isolates (39 of 66, 59%) carried alterations of the mgrB gene. These data underscore the role of this genetic mechanism in acquired colistin resistance by KPC-KP. Altogether, insertional inactivation of mgrB by insertion sequences, and especially by IS5-like elements, appeared to be the most common mechanism of mgrB alteration. These findings reflect the occurrence of several independent mutational events, and suggest that genetic alteration of mgrB may occur at relatively high frequency and without major consequences on fitness and virulence of the KPC-KP strain. References: [1] Bogdanovich T, Adams-Haduch JM, Tian GB, Nguyen MH, Kwak EJ, Muto CA, Doi Y. 2011.
Clin. Infect. Dis. 53:373–376. [2] Zagorianou A, Sianou E, Iosifidis E, Dimou V, Protonotariou E, Miyakis S, Roilides E, Sofianou D. 2012. . Euro Surveill. 17(7):pii=20088. http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=2008. [3] Mammina C, Bonura C, Di Bernardo F, Aleo A, Fasciana T, Sodano C, Saporito MA, Verde MS, Tetamo R, Palma DM. 2012. Euro Surveill 17:pii=20248. [4] Cannatelli A, D'Andrea MM, Giani T, Di Pilato V, Arena F, Ambretti S, Gaibani P, Rossolini GM. 2013. Antimicrob. Agents Chemother. 57:5521–5526.
64
S6-4
Un mutante espontáneo de Enterococcus faecalis sensible a cefalosporinas: en el camino de la identificación de nuevas vías de
resistencia
Carrilero L., Thomas-Lopez D., Matrat S., Kennedy S, Montero N., Gonzalez-Zorn, B. Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid
Introducción: Enterococcus faecalis es una bacteria habitual en la microbiota intestinal como comensal demultitud de animales, pero puede actuar como patógeno nosocomial dando lugar a infecciones dediversa gravedad. Complica su tratamiento la gran cantidad de resistencias a antibióticos quepresenta, como la resistencia intrínseca a las cefalosporinas, no estando del todo esclarecidos losmecanismos que la determinan. Al estudiar la antibiorresistencia de una librería de mutantes deinserción1, el mutante para el gen de la NADH peroxidasa, el gen EF1211, mostró un fenotipo desusceptibilidad a las metoximino cefalosporinas. Este gen participa en el estado redox de la bacteria, loque concuerda con la teoría del estrés oxidativo como último efector en el efecto letal de losantibióticos bactericidas. Resultados: Complementamos el mutante de inserción en el gen de la NADH peroxidasa mediante la pérdidadel plásmido que estaba interrumpiendo este gen. Una vez restablecido el genotipo silvestre para el gen de la NADH peroxidasa, la cepa continuaba mostrando sensibilidad frente a las metoximino cefalosporinas. Procedimos a la secuenciación del genoma de la cepa silvestre, del mutante de inserción para la NADH peroxidasa y del mutante complementado de la NADH peroxidasa. Estos dos últimos presentaban dos mutaciones puntuales que la cepa silvestre, resistente a cefalosporinas, no portaba. Las mutaciones eran con cambio de sentido y estaban en los genes EF0146 (relacionado con una proteína de exclusión) y EF2933 (regulador transcripcional Rex que reprime o no genes en función del estado redox de la célula). Estamos construyendo en la cepa WT mutantes individuales en el cromosoma para cada uno de los genes, y también introduciremos ambas mutaciones para ver si el fenotipo es fruto de la combinación de ambas. Conclusiones: El uso de bancos genómicos es adecuado para el estudio de diversas características, pero no debemos olvidar que se pueden dar otras mutaciones espontáneas que pueden generar fenotipo en el carácter de estudio. Además, la identificación y caracterización de determinantes intrínsecos de resistencia a cefalosporinas puede revertir en el descubrimiento de nuevas dianas en las lucha contra las infeccciones enterocócicas. Referencias: Rigottier-Gois L et al. Large-scale screening of a targeted Enterococcus faecalis mutant library identifies envelope fitness factors. PLoSOne. 2011;6(12):e29023. doi: 10.1371/journal.pone.0029023. Epub 2011 Dec 15
65
S6-5
Explorando de la interacción entre cepas bacterianas cercanas
mediante RNAseq
Pedro González-Torresa, Leszek Pryszczb, Fernando Santosa, Cristina Lópeza, Toni
Gabaldónb y Josefa Antóna.
aDepartamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Universidad de Alicante, Apartado 99, 03080
Alicante, España.bBioinformatics and Genomics Programme. Center for Genomic Regulation (CRG).
Dr Aiguader,88. Barcelona 08003, España.
Introducción: Numerosas especies procarioticas presentan una elevada diversidad intraespecífica, incluyendo en muchos casos cepas próximas que coexisten y presentan diferencias genómicas muy sutiles. Por si sólo, el contenido en genes no muestra una información precisa acerca del comportamiento bacteriano, ya que pequeñas variaciones en los mismos o en su contexto genómico pueden desencadenar diversas estrategias ecológicas [3]. Cepas genéticamente similares podrían presentar comportamientos diversos en respuesta a cambios ambientales.
Los cristalizadores de las salinas solares son un ejemplo de ambiente con elevada microdiversidad. Entre su microbiota destaca Salinibacter ruber, bacteria halófila extrema que puede representar el 30% de la población. Actualmente disponemos de los genomas completos anotados de dos cepas coaisladas de S.ruber, M8 y M31 DSM13588, los cuales se compararon en un estudio microevolutivo previo [1].
Métodos: En este estudio empleamos RNAseq [2] (Illumina Genome Analizer) para analizar el transcriptoma de ambas cepas por separado y en cultivo mixto con el objetivo de discernir qué efecto tienen estas diferencias genómicas a nivel transcripcional y, por comparación de ambas condiciones, si la presencia de una cepa afecta a los patrones transcripcionales y al crecimiento de la otra. Para ello se crecieron triplicados de cultivos puros y mixtos de ambas cepas, monitorizando el crecimiento (qPCR, DAPI, DO600) y la composición iónica del medio (ICP-MS).
Resultados: Alrededor del 98% de los genes se expresaron en ambas cepas, pudiendo identificar nuevos genes y caracterizar los operones presentes en ambos genomas. Entre los genes no expresados, se apreció un enriquecimiento en genes especiíficos de cepa, muchos de reciente adquisición. Se observaron elevados niveles de expresión en la isla genómica II, en genes relacionados con la alta demanda en crecimiento exponencial como proteínas ribosomales o chaperonas, factores sigma alternativos y la xantorrodopsina. Tras comparar la expresión de ambas cepas en cultivo puro, 165 genes mostraron diferencias significativas, destacando la presencia de transportadores de membrana, sistemas de transducción de dos componentes y proteínas de flagelo.
Por otra parte un total de 354 y 446 genes modificaron su expresión significativamente en M8 y M31 en cultivo mixto. De estos, tan sólo 89 lo hicieron en ambas cepas lo cual refleja que la presencia de una cepa cercana estaría induciendo cambios transcripcionales diferentes en cada una de ellas. Las principales variaciones se observaron a nivel de sistemas de dos componentes y transportadores, sugieriendo un elevado control y regulación a nivel transcripcional. En el caso de M31, se apreció además un aumento de expresión de proteínas ribosómicas, factores de elongación, biosíntesis de diversos aminoácidos y maquinaria de replicación.
Conclusiones: Diferencias sutiles a nivel genómico afectan considerablemente a los perfiles de expresión de las cepas M8 y M31 así como a la interacción entre ellas. De este modo cepas muy cercanas que coexisten en la naturaleza podrían presentar diversas respuestas a cambios ambientales y estar respondiendo de modo distinto ante la presencia de otras.
Referencias:
[1] ISME J. 2010;4:882–895. [2] Sorek R, Cossart P. Prokaryotic transcriptomics: a new view on regulation, physiology and pathogenicity. Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):9-16. doi: 10.1038/nrg2695. Epub 2009 Nov 24. [3] Wilmes P, Simmons SL, Denef VJ, Banfield JF.(2009) The dynamic genetic repertoire of microbial communities. FEMS Microbiol. 2009. Rev 33: 109–132.
66
S6-6
Búsqueda de nuevos genes de resistencia a radiación UVB y UVC mediante técnicas
metagenómicas en ambientes extremos
María Lamprecht Grandío, Salvador Mirete Castañeda, Verónica Morgante, José Eduardo
González Pastor.
Centro de Astrobiología (INTA-CSIC)
Introducción: Los microorganismos que viven en la zona superficial de ecosistemas acuáticos se
encuentran altamente expuestos a radiación ultravioleta (UV). Esta radiación puede producir daños
en la estructura del ADN, afectando a procesos esenciales como la replicación y la traducción (1),
por tanto, su supervivencia depende de una buena adaptación a la exposición continuada. El
objetivo de este trabajo es buscar en bibliotecas metagénomicas de ambientes acuáticos extremos
nuevos mecanismos de resistencia a radiación UVB y UVC.
Métodos: Para ello, se han utilizado bibliotecas de DNA extraído a partir de agua de Río Tinto
(Huelva) y de salinas de Es Trenc (Mallorca), con un tamaño medio de inserto de 1,8 y 2,9 kb,
respectivamente. (2) Usando el vector de alto número de copia, pBluescript SK II+ y la cepa
Escherichia coli DH10B como hospedador.
Resultados: Se han identificado 23 clones a partir de la biblioteca metagenómica de las salinas de
Es Trenc. Al analizar la secuencia del inserto, se ha determinado que todos los clones tienen el
mismo inserto, con un tamaño de 1545 pb y 3 posibles ORFs que presentan homología con genes
de origen bacteriano. Usando la biblioteca de agua de Río Tinto, se han identificado 6 clones con
resistencia a UVB, de los cuales hemos determinado que dos insertos tienen secuencia distinta con
una longitud de 2800 pb y 3200 pb aproximadamente. Finalmente, hemos identificado que estos
clones también presentan una resistencia significativa a UVC.
Conclusiones: Se han identificado genes de resistencia a UV de los microorganismos de las salinas
de Mallorca y del río Tinto que podrían constituir nuevos mecanismos de resistencia.
Referencias:
(1) The significance of the Dewar valence photoisomer as a UV radiation-induced DNA photoproduct in marine microbial communities. Meador J.A., Baldwin A.J., Pakulski J.D., Jeffrey W.H., Mitchell D.L., Douki T. 2014. Environmental microbiology. doi: 10.1111/1462-2920.12414
(2) Exploring the diversity of arsenic resistance genes from acid mine drainage microorganisms. Morgante V., Mirete S., de Figueras CG., Postigo CachoM., González-Pastor J.E. 2014. Environmental Microbiology. 10.1111/1462-2920.12505
67
S6-7
Adquisición de metiltransferasas del ARNr 16S, interferencia con
metilaciones intrínsecas y evolución hacia un ribosoma resistente
a aminoglucósidos
Belen GUTIERREZ 1, Cristina M OVEJERO 1, Andreas HOEFER 1, Laura CARRILERO 1,
Alfonso SANTOS-LOPEZ1, Daniel THOMAS-LOPEZ 1, Natalia MONTERO 1, Cristina
BERNABÉ-BALAS1 and Bruno GONZALEZ-ZORN1*.
1Departamento de Sanidad Animal y VISAVET, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense
de Madrid. [email protected]
Introducción: La metilación específica del ARNr 16S, previamente descrita en los actinomicetos productores de aminoglucósidos (1), ha emergido recientemente como mecanismo de resistencia a dichos antibióticos en patógenos Gram-negativos (2) expandiéndose rápidamente a nivel mundial. Métodos: Hemos consultado las bases de datos en GenBank, realizado alineamientos de proteínas mediante ClustalW y construido árboles filogenéticos mediante MEGA 5 con las diferentes metiltransferasas. A su vez, hemos reunido todos estos datos junto con los previamente obtenidos mediante espectrometría de masas MALDI y ensayos de competición. Resultados: La estructura global de las metilasas intrínsecas de los actinomicetos y de las metilasas adquiridas por bacterias patógenas que metilan en G1405 se encuentra altamente conservada. No obstante, el contenido en G+C tanto del genoma de los actinomicetos como el de sus metilasas intrínsecas de resistencia está comprendido entre 65-75%; mientras que el contenido en G+C de las metilasas adquiridas oscila entre el 30-67% al igual que el del genoma de sus patógenos portadores comprendido entre un 39% (A. baumanii y P. mirabillis) y un 66% (P.
aeruginosa). Dichas especies, ampliamente distribuidas y presentes en el suelo, podrían haber
adquirido estas metilasas a través de los actinomicetos productores de aminoglucósidos, adaptado el contenido G+C al de su propio genoma, y diseminado entre las diferentes especies patógenas. Además, hemos identificado que la adquisición de una metiltransferasa cromosómica no supone un coste biológico adicional para la bacteria, incluso en ausencia de antibióticos, llegando a desplazar a metilaciones intrínsecas. Es el caso de RmtC, identificada en un clon epidémico del Reino Unido en Salmonella enterica Serovar Virchow (3), y que en nuestro modelo cromosómico de Escherichia coli metila la posición m
7G1405 desplazando a la metilación fisiológica en m
5C1407 mediada por RsmF
(4). Además, dicho desplazamiento potencia la resistencia a aminoglucósidos. Resulta aún más sorprendente el desplazamiento de una de las metilaciones intrínsecas en la posición C1402, más conservadas que la metilación en C1407, mediado por RmtD en Pseudomonas aeruginosa (5). Conclusiones: El hecho de que las metilasas de resistencia adquiridas se antepongan a metilaciones endógenas conservadas del ribosoma nos lleva a plantearnos la evolución del ribosoma bacteriano hacia uno resistente a aminoglucósidos. Referencias: (1) Cundliffe, E. Annu Rev Microbiol 43, 207-233 (1989). (2) Wachino, J. & Arakawa, Y. Drug Resist Updat 15, 133-148 (2012). (3) Hopkins, K. L., Escudero, J. A., Hidalgo, L. & Gonzalez-Zorn, B. Emerg Infect Dis 16, 712-715 (2010). (4) Gutierrez B, Douthwaite S & Gonzalez-Zorn B. RNA biology 10:8, 1324-1332 (2013) (5) Gutierrez, B. et al. Antimicrob Agents Chemother 56:2335-41. (2012)
68
S6-8
Estudio del mecanismo de transporte del DNA extracelular en Bacillus subtilis.
Alejandra López Ibáñez de Aldecoa, J. Eduardo González-Pastor. Centro de Astrobiología, Madrid. [email protected]
Introducción: Bacillus subtilis es una bacteria gram-positiva que tiene la capacidad de liberar de
forma controlada copias de su DNA al medio extracelular (DNAe) mediante un transporte activo y en
respuesta a señales de quorum sensing (poblacionales) relacionadas con el fenómeno de
competencia [4]. En este estudio nos centramos en la identificación de las proteínas implicadas en
el transporte del DNAe a través de la membrana.
Métodos: Se tomó el sobrenadante de un cultivo de Bacillus subtilis en medio mínimo en el
momento correspondiente a la máxima producción de DNAe. Se precipitó el DNAe y se realizó el
crosslinking con formaldehído (FA) [1]. Se dializaron las muestras y se revirtió el enlace del FA con
calor (65º). Las muestras se trataron con DNAsa I para eliminar los agregados proteína-DNA y se
analizaron por SDS-PAGE y tinción de plata. Finalmente se identificaron las proteínas presentes en
las muestras por LC-MS/MS.
Resultados: Las proteínas identificadas que aparecen en mayor abundancia son OppA y Hag. La
primera es un transportador ABC de oligopéptidos implicado en el inicio de la esporulación, la
competencia y en el transporte de péptidos de pequeño tamaño [3]. La segunda, flagelina o Hag, es
una proteína que constituye el filamento del flagelo bacteriano [2].
Conclusiones: Dado que el tamaño de poro de OppA es demasiado pequeño para permitir el paso
de DNA, planteamos la hipótesis de que el flagelo pueda estar implicado en el transporte del DNAe.
Referencias:
1- Cascales E and Christie P.J. Definition of a bacterial type IV secretion pathway for a DNA
substrate. Science. 2004. 304(5674):1170-3.
2- Courtney CR, et al. Molecular characterization of the flagellar hook in Bacillus subtilis. J. Bacteriol.
2012. 194(17):4619-4629.
3- Rudner DZ, et al. The spo0K locus of Bacillus subtilis is homologous to the oligopeptide permease
locus and is required for sporulation and competence. J. Bacteriol.1991. 173(4):1388-1398.
4- Zafra O, et al. Extracellular DNA release by undomesticated Bacillus subtilis is regulated by early
competence. PlosOne. 2012. 7(11):e48716
69
S6-9
Extrapolation based approach to decipher the molecular
mechanisms of resistance to Colistin in Stenotrophomonas
maltophilia
Sònia Martínez-Servat1,2 , Daniel Yero1,2, Ferran Llanas, Pablo Rodríguez, Xavier
Daura1,3, and Isidre Gibert1,2
1 Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IBB), Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 08193
Bellaterra, Cerdanyola del Vallès (Barcelona). 2
Departament de Genètica i de Microbiologia,
Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 08193 Bellaterra, Cerdanyola del Vallès (Barcelona). 3
Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), E-08010 Barcelona.
[email protected] // [email protected]
Introduction: Colistin (polymixin E) is a cationic antimicrobial peptide and is being used increasingly
to treat infections by multiresistant Gram-negative isolates. Pseudomonas aeruginosa and
Stenotrophomonas maltophilia are opportunistic pathogens with similar recent reports of resistance
to colistin. While in some cases the mechanisms of resistance to colistin in P. aeruginosa are known,
for S. maltophilia this information is scarce. Our strategy is to extrapolate the predicted S. maltophilia
colistin resistome to the background of an annotated P. aeruginosa mutant library. Additionally, a
panel of clinical S. maltophilia isolates was screened for potential model strains to validate most
promising targets.
Methods: A BLAST search strategy for P. aeruginosa PAO1 and S. maltophilia K279a genomes was
applied to identify ortholog genes probably conferring resistance to colistin. P. aeruginosa mutants
were obtained from the PAO1 transposon mutant library at the University of Washington (UW). A set
of clinical isolates of S. maltophilia were obtained from diverse sources in Europe. Minimum
inhibitory concentrations were determined using a microdilution test or Etest® (Biomerieux).
Genotypic characterization was determined on the basis of PCR amplification and sequencing of the
genes of the MLST scheme for S. maltophilia.
Results: A data-mining approach was used to identify potential genes conferring resistance to colistin
in S. maltophilia. From this initial set of gene candidates, 58 orthologs were also present in the PAO1
genome with a mutant available at the UW library. Theses mutants were screened for their
susceptibilities to colistin and 32 genes were selected for the extrapolation based strategy in S.
maltophilia. To select S. maltophilia strains for mutational experiments a set of 81 clinical isolates
were characterized phenotipically and genotypically. Among these S. maltophilia isolates there was a
small fraction of colistin resistant strains and there was no a clear correlation between genotype and
colistin resistance. However, an additional mechanism of adaptive resistance to colistin appears to
be acting in almost all isolated.
Conclusions: This approach will certainly contribute to better understand the complex mechanism of
resistance to colistin present in S. maltophilia. Selected colistin resistant S. maltophilia strains will be
used to extrapolate the mutations previously validated in PAO1.
70
S6-10
Caracterización de replicones prevalentes en clones multirresistentes en
India.
Ovejero, C. M., Hidalgo, L., Goilo, D., Rahman, M., Gutiérrez, B., Carrilero, L., Santos-
López, A., Thomas-Lopez, D., Hoefer, A., Bernabé, C., Prasad, K. N., Gonzalez-Zorn,
B.
Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense Madrid
Introducción: La metilación del sitio A del ARNr 16S bacteriano confiere altos niveles de resistencia
a aminoglucósidos de relevancia clínica. Hasta la fecha han sido descritas en bacterias patógenas
Gram negativas diez metiltransferasas del ARNr 16S (ArmA, RmtA-H, NpmA). Se ha observado
frecuentemente la asociación de estas metiltransferasas con otros importantes genes de resistencia
en diferentes tipos de plásmidos. La adquisición de estos plásmidos por parte de clones “exitosos”
conduce a la emergencia de clones “de alto riesgo”, incrementando de una manera extremadamente
efectiva la diseminación de estos elementos resistentes. El objetivo de este estudio fue la
identificación y caracterización molecular de clones de “alto riesgo” obtenidos de 99 cepas clínicas
con altos niveles de resistencia a aminoglucósidos, procedentes de la India.
Métodos: Con el fin de identificar los clones más prevalentes realizamos la técnica de Electroforesis
en Gel de Campo Pulsado (PFGE) y analizamos los resultados con el programa informático
Bionumerics. Llevamos a cabo la detección por PCR de todos los genes de las metiltransferasas del
ARNr 16S junto con la detección de otros genes de resistencia que suelen asociarse a
metiltransferasas (blaNDM, blaCTX-M y qnr). Determinamos la susceptibilidad antimicrobiana por medio
de los métodos de difusión en disco y microdilución siguiendo la guía del Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI). Estamos llevando a cabo la caracterización plasmídica de los clones más
relevantes mediante las técnicas de replicon typing y S1-PFGE.
Resultados: Todos los aislados presentaron un perfil de multirresistencia. De las 99 cepas
analizadas, en 94 se detectó una o en algunos casos más de una metiltransferasa. El análisis del
PFGE reveló la presencia de 16 clones (39 aislados), la mayoría portaban la metiltransferasa junto
con blaNDM, y blaCTX-M (21 aislados, 53.8%), encontrándose distintas combinaciones en el resto de
clones. Por el momento, la caracterización de los plásmidos de estos 21 aislados muestra que rmtC
se encuentra junto a blaCTX-M en un plásmido IncA/C de un tamaño aproximado de 90kb.
Conclusiones: Los índices de resistencia antibiótica en la India son alarmantes. Hemos detectado la
presencia de un plásmido IncA/C diseminado entre diferentes clones multirresistentes que porta
genes de resistencia antibióticos de gran importancia clínica. La adaptación evolutiva de este tipo de
plásmido a su hospedador es de vital importancia, para conocer cómo se imponen estas bacterias
multirresistentes en la naturaleza.
Referencias:
Wachino J., et al. Exogenously acquired 16S rRNA methyltransferases found in
aminoglycoside-resistant pathogenic Gram-negative bacteria: An update. 2012, Drug
Resistance Updates, 15: 133-148.
71
S6-11
Resistance to aminoglycosides in clinical isolates of Corynebacterium striatum
Jesús Navas, Marta Fernández-Martínez, José Ramos-Vivas, Sana Alibi, Asma Ferjani, Jalel Boukadida, María Elicier Cano & Luis Martínez-Martínez Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria. Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, Instituto de Investigación Marqués de Valdecilla (IDIVAL). Santander. Laboratoire de Microbiologie–Immunologie, Unité de Recherche « Caractérisation Génomique des Agents Infectieux UR12SP34, CHU F. Hached, Sousse, Tunisie. [email protected]
Introduction: Corynebacterium striatum is an ubiquitous saprophyte of the human skin and mucous membranes, and an emerging nosocomial pathogen causing serious infections in patients with variant degrees of immuno-suppression or other underlying diseases. Several outbreaks of multidrug resistant C. striatum have been recently reported. The emergence of multi-resistant C.striatum is of particular concern, since therapeutic options are limited to vancomycin,oxazoidinones or lipopeptides. In this context, alternative compounds are needed. Aminoglycosides can be envisaged as a second-line or complementary antibiotics for the treatment of Corynebacterium infections. The aim of this study was to investigate the susceptibility to six aminoglycosides of two collections of C.striatum isolated at clinical centres in Santander and Sousse (Tunisia), respectively. The isolates were typed by means of PFGE to inquire about their clonal relatedness and possible spread of resistance mechanisms. The presence of genes related with the resistance phenotypes was investigated. Methods: Sensitivity assays: MIC’s of amikacin, gentamicin, kanamycin, netilmicin, streptomycin, and tobramycin, were determined using E-test strips and Mueller-Hinton agar. Plates were incubated at 37ºC for 16-20h. Results wereinterpreted according to breakpoints defined by either the CLSI or the EUCAST.Typing: The isolates were typed by means of PFGE using XbaI as a restriction enzyme. Detection of resistance genes: Search and mapping of aminoglycoside resistance genes was performed by sequencing the genomes of two C. striatum isolates and by PCR. Results: Susceptibility testing of C.striatum to six aminoglycosides: Netilmicin was active against all C. striatum. Gentamicin and amikacin showed good activity (1.6 and 4.7% resistant, respectively). Kanamycin and streptomycin were less active against our C. striatum (39% and 30% resistant, respectively). Molecular epidemiology of the C. striatum isolates: 46 major PFGE types were identified in the 64 C. striatum isolates. On these, PFGE types 3, 8, 34 and 46 could be further classified in 2 subtypes. Aminoglycoside resistance genes in the 64 C. striatum: The genes aphA1, aad5 (both encoding for kanamycin resistance) and strA-strB (streptomycin resistance) were found in the C. striatum CS5703 genome and detected by PCR in most of C. striatum isolates. Conclusions: - Netilmicin was the more active compound, followed by amikacin and gentamicin. - Our 64 C.striatum isolates were mostly not clonal. - Although use of aminoglycosides to treat infections caused by corynebacteria is circumstantial, a significant number of C. striatum included in this study were resistant, mainly to kanamycin and streptomycin. References:
Campanile F, Carretto E, Barbarini D, Grigis A, Falcone M, Goglio A, Venditti M, Stefani S. 2009. Clonal multidrug-resistant Corynebacterium striatum strains, Italy. Emerg. Infect. Dis. 15:75-78.
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S6-12
El comportamiento de plásmidos ColE1 durante la cohabitación
Alfonso Santos-Lopez, Cristina Bernabe-Balas, Alvaro San Millan, Rafael Ortega-Huedo, Belen Gutierrez, Laura Carrilero, Cristina Martinez Ovejero, Daniel Thomas-Lopez, Andreas Hoefer, Bruno Gonzalez Zorn. Departamento de Sanidad Animal y VISAVET, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid [email protected] Introducción: En 2009 se identificó por primera vez en la familia Pasteurellaceae la capacidad de los plásmidos ColE1 para conferir fenotipo de multirresistencia a antibióticos mediante la cohabitación (1). Recientemente, numerosos estudios están poniendo de manifiesto la importancia de los plásmidos ColE1 en la resistencia a antibióticos (2, 3). Sin embargo, hasta el momento no se conoce bien el comportamiento de estos replicones cuando cohabitan en una misma bacteria. Para ello, en este trabajo transformamos los plásmidos pB1000, pB1005 y pB1006, que portan blaROB-1, strA y tet(O) respectivamente, en Haemohilus influenzae RdKW20 combinándolos de todas las maneras posibles, y analizamos el número de copias, el nivel de resistencia y la carga biológica que suponen los plásmidos para la bacteria portadora. Métodos: Se realizaron ensayos de Concentración Mínima Inhibitoria, análisis del número de copias plasmídicas mediante PCR cuantitativa y se determinó el fitness de las cepas portadoras de plásmidos mediante ensayos de competición directa. Resultados: La resistencia a antibióticos mostrada por los replicones resultó independiente de la cohabitación. No existen, por tanto, interferencias en la expresión de los genes portados por los plásmidos ColE1 cuando estos cohabitan en una misma célula. Del mismo modo, el número de copias plasmídica se mantuvo independientemente de si los plásmidos cohabitaban o no. El hecho de que existan diferencias en los RNAs que regulan la expresión de los plásmidos, permite a los replicones mantener su número de copias de manera independiente. Finalmente los ensayos de competición determinaron que el coste biológico asociado a estos replicones viene determinado por el número total de copias de plásmidos que se encuentren en la bacteria. Conclusiones: La expresión y replicación de los plásmidos ColE1 no depende del resto de los plásmidos ColE1 con los que cohabita. El número total de plásmidos ColE1 presentes en la bacteria determinan el coste biológico asociado a estos replicones. Referencias:
1. San Millán, A. et al. 2009. Multiresistance in Pasteurella multocida Is Mediated by Coexistence of Small Plasmids. Antimicrob. Agents Chemother. 53: 339-404. 2. Pallechi, L. et al. 2011. Characterization Of Small ColE-like Plasmids Mediating Widespread Dissemination of the qnrB19 Gene In Commensal enterobacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 54:678-682 3. Kehrenberg C, et al. 2007. Complete nucleotide sequence of a small qnrS1-carrying plasmid from Salmonella enterica subsp. enterica Typhimurium DT193. J Antimicrob Chemother 60: 903-5
73
S6-13
Metagenómica de ambientes hipersalinos: nuevos microorganismos abundantes en salinas
Ana B. Fernández, María José León, Cristina Sánchez-Porro, Antonio Ventosa Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Sevilla 41012 [email protected]
Introducción: Una salina consiste de una serie de estanques poco profundos unidos entre sí, de manera que el agua del mar va gradualmente concentrándose hasta precipitar el cloruro sódico principalmente y otras sales. En los estanques a medida que va aumentando la salinidad va disminuyendo la diversidad procariota y solo unas pocas especies microbianas presentes son abundantes, convirtiendo a las salinas en un modelo excelente para el estudio de las comunidades microbianas. Las salinas de Santa Pola, Alicante, han sido ampliamente estudiadas desde el punto de vista microbiológico a través de técnicas tanto dependientes de cultivo como de técnicas moleculares independientes de cultivo. Recientemente, hemos utilizado una aproximación metagenómica para obtener más información sobre la biodiversidad procariótica tanto filogenómica como metabólica presente a lo largo del gradiente de salinidad de esta salina. Métodos: Se han estudiado muestras de agua de estanques con concentraciones salinas de 13, 19, 33 y 37% procedentes de las salinas de Santa Pola, Alicante, y de un estanque de la salina de Isla Cristina con 21% de sales totales, a partir de las cuales se obtuvo el ADN metagenómico de la comunidad procariota y se secuenció mediante pirosecuenciación 454. Resultados: Nuestros resultados confirman el predominio de la arquea cuadrada Haloquadratum walsbyi y de la bacteria halófila Salinibacter ruber en los estanques con mayor concentración de sales en la salina de Santa Pola, mientras que en los estanques concentradores intermedios de ambas salinas existe una mayor diversidad de especies pertenecientes a nueve taxones superiores. El ensamblamiento de contigs a partir de las secuencias metagenómicas nos ha permitido detectar la abundante presencia de nuevos representantes de Archaea y Bacteria en estanques concentradores intermedios, como la nanohaloarquea “Candidatus Haloredivivus” y una nueva Gammaproteobacteria relacionada filogenéticamente con el género Alkalilimnicola, que podría constituir un nuevo género y especie.
Conclusiones: El análisis metagenómico llevado a cabo en ambas salinas nos ha permitido
desarrollar distintas estrategias y medios de cultivo enfocados al aislamiento de nuevos
representantes abundantes en las salinas, como la nueva bacteria halófila moderada perteneciente
a las clase Gammaproteobacteria a la que hemos designado como Spiribacter salinus.
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S7-1
The two faces of cyanobacterial FurA: a global regulator and a
novel redox sensor
Laura Botello-Morte1, M. Teresa Bes1, Begoña Heras2, M. Luisa Peleato1 and María F.
Fillat1
1 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Sciences, and Institute for
Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza, Zaragoza, Spain
2 Department of Biochemistry, La Trobe University, Melbourne, Australia.
Introducción:
The global regulator FurA (ferric uptake regulator) from the filamentous, nitrogen-fixing
cyanobacterium Anabaena PCC 7120 links iron homeostasis to nitrogen metabolism and the
oxidative stress response, among other processes. FurA contains five conserved cysteine residues,
whose redox state is critical for the protein to be transcriptionally active. Four cysteines are arranged
in two redox CXXC motifs (C101VKC104 and C141PKC144), which indeed constitute an essential,
canonical signature present in the active site of many thiol-disulfide oxidoreductases.
Métodos:
Biochemical and microbiological approaches were used to analyze the putative contribution of both
CXXC motifs to redox properties and functionality of FurA.
Resultados:
For the first time for a Fur family member, Anabaena FurA was described to exhibit disulfide
reductase activity, contrary to other Fur homologs from heterotrophic bacteria evaluated. The
presence of several redox states of FurA in vivo, together with the disulfide reductase activity of the
protein and the redox potential values of its CXXC motifs which were similar to that of bacterial
cytoplasm, lead us to propose FurA as a novel CXXC-based redox sensor in Anabaena.
Additionally, some potential FurA-interacting partners were identified by GST-pull down experiments
and confirmed in vivo by bacterial two-hybrid assays, namely the putative amidase All1140, the
histone-like HU and another FurA molecule. Interestingly, FurA was able to interact with the
photosynthetic electron carriers ferredoxin and flavodoxin as well.
Conclusiones:
Overall, these data evidence that FurA plays a dual role in cyanobacteria, since it takes part in the
redox-signalling networks in Anabaena, in addition to working as a global regulator.
Referencias:
Botello-Morte et al. 2014. Antioxidants and Redox Signaling, 20(9):1396-406.
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S7-2
Caracterización funcional de las quinasas AbrC1 y AbrC2 del sistema atípico de dos componentes AbrC de Streptomyces
coelicolor
Héctor Rodríguez, Sergio Rico, Elsa Franco, Ana Yepes, Ramón I. Santamaría y Margarita Díaz Instituto de Biología Funcional y Genómica (IBFG)/Departamento de Microbiología y Genética. Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)/Universidad de Salamanca. [email protected]
Introducción: Los sistemas de dos componentes (SDC) constituyen mecanismos de respuesta a estímulos ambientales ycontrolan la expresión de genes pueden afectar a la síntesis de antibióticos en Streptomyces. En el trabajopresentado se estudió el papel de dos histidína quinasas: AbrC1 (codificada por el gen SCO4598) y AbrC2(codificada por el gen SCO4597) que junto con el regulador de respuesta AbrC3 (codificado por el genSCO4596) constituyen un SDC atípico que interviene en la regulación de la síntesis de antibióticos [1, 2]. Estosgenes están codificados en la cadena negativa del genoma y entre cada gen existe una región intergénica contamaño suficiente para contener un promotor independiente para cada uno de ellos. Métodos: Con el fin de estudiar la participación de ambas quinasas en la regulación de la producción de antibióticos sehan obtenido mutantes individuales de cada quinasa así como un mutante de deleción de ambas y se hanestudiado sus fenotipos en diferentes medios. Además, se han realizado estudios de expresión de ambosgenes en diferentes condiciones mediante q-RT-PCR. Las capacidades fosforilativas de ambas proteínas seha estudiado indirectamente sobreexpresando el regulador en diferentes cepas (la toxicidad producida por elregulador depende de su nivel de fosforilación) y también fosforilaciones in vitro utilizando para ello fósforomarcado radiactivamente. Resultados: La deleción ΔabrC1 genera una cepa que superproduce actinorhodina (ACT) en los medios NB, NMMP y LB y de CDA en medio NA en relación a la cepa silvestre. Sin embargo el mutante de deleción ΔabrC2 y el doble mutante ΔabrC1/C2 mostraron niveles de producción de antibióticos similares a los de esta cepa parental. Los estudios de expresión indican que ambas quinasas se expresan y lo hacen a niveles similares y que son cotranscritas compartiendo un mismo promotor. En cuanto a las capacidades fosforilativas de las quinasas, su capacidad para autofosforilarse ha sido confirmada utilizando fósforo marcado radiactivamente. Además, se observó (indirectamente) que el regulador se encuentra más fosforilado en el mutante simple ΔabrC1. Conclusiones: Se ha observado que ambas quinasas son funcionales a nivel transcripcional y capaces de fosforilar al regulador. La eficiencia de la quinasa AbrC2 para fosforilar el regulador es mayor que la de la quinasa AbrC1 (inferida a partir de la producción de antibióticos de los mutantes individuales de las quinasas y la toxicidad derivada de la sobreexpresión del regulador) y ambas son capaces de autofosforilarse, habiéndose identificadoen ambas el residuo fosforilable. Referencias:
1. Rico S, Santamaría RI, Yepes A, Rodríguez H, Laing E, Bucca G, Smith CP, Díaz M. Appl Environ Microbiol 2014. 2. Yepes A, Rico S, Rodríguez-García A, Santamaría RI, Díaz M. PLOS ONE 2011, 6:e19980.
76
S7-3
Mapa funcional de la proteína GreA en Escherichia coli.
Llorenç Fernàndez-Coll, Tania Gaviria & Carlos Balsalobre
Departament de Microbiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Avda. Diagonal 643,
08028 Barcelona
Introducción:
Se ha descrito que la alarmona ppGpp, así como su cofactor DksA o los factores Gre (GreA/B)
influyen en la regulación génica mediante la interacción con el canal secundario de la ARN
polimerasa (espacio definido entre la subunidad y ’ del holoenzima). Debido al papel de ppGpp
en la respuesta estricta, mutantes incapaces de producir ppGppº, así como para su cofactor
DksA, son cepas auxotróficas en medio mínimo M9. Vinella et al (2012), describieron que la
sobreexpresión de GreA, si bien tiene un efecto tóxico en LB, permite rescatar a la bacteria de
esta auxotrofía. En nuestro grupo de investigación hemos descrito (Aberg et al 2009) que en
mutantes ∆dksA se produce una inducción en la expresión de fliC -subunidad principal del flagelo-
dependiente de GreA. Esto nos permitió sugerir que existe una posible competencia entre DksA y
los factores Gre para interaccionar con la RNApol.
Métodos y Resultados:
Para discernir que aminoácidos son necesarios para la actividad y/o capacidad de unión a la
ARNpol de GreA, hemos obtenido, mediante Error-prone PCR, una colección de alelos de greA. Se
seleccionaron aquellos que su sobreexpresión no produce un efecto toxico en el crecimiento
bacteriano. Hemos obtenido una colección de 20 mutantes puntuales que cumplen este requisito
repartidos por los distintos dominios de GreA. Posteriormente, hemos determinado la actividad de
los mutantes GreA mediante el efecto que tienen sobre el gen fliC, así como su capacidad de
revertir la auxotrofia en M9 de los mutantes ∆dksA o ppGppº.
Conclusiones:
Estos experimentos nos han permitido inferir un mapa funcional de la proteína GreA, identificando
dominios importantes para su actividad catalítica, función regulatoria y unión a la ARN polimerasa.
Referencias:
Vinella, Potrykus, Murphy, Cashel. Effects on growth by changes of the balance between
GreA, GreB, and DksA suggest mutual competition and functional redundancy in
Escherichia coli. J Bacteriol. 194(2):261-73. (2012)
Aberg, Fernández-Vázquez, Cabrer-Panes, Sánchez, Balsalobre. Similar and divergent
effects of ppGpp and DksA deficiencies on transcription on Escherichia coli. J Bacteriol.
191(10):3226 -36. (2009)
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S7-4
Caracterización de la interacción entre las proteínas RecA y CheW
de Salmonella enterica
Oihane Irazoki, Andrés Magán, Montserrat Llagostera, Jordi Barbé y Susana Campoy
Departament de Genètica i de Microbiologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de
Barcelona
La proteína RecA es una ATPasa dependiente de DNA que está presente en la mayoría de los
miembros del dominio Bacteria. Dicha proteína, aparte de ser la recombinasa principal en bacterias,
involucrada en la recombinación homóloga y en los mecanismos de reparación por recombinación1,
es también la proteína encargada de activar el sistema SOS, una respuesta génica global frente a
lesiones en el DNA2. Incrementando su catálogo de funciones, se ha asociado a dicha proteína con
el movimiento en enjambre3,4
, también conocido como swarming, un movimiento poblacional
especializado y altamente coordinado que muchas especies bacterianas llevan a cabo sobre las
superficies semisólidas. Nuestro grupo de investigación ha demostrado que el movimiento en
enjambre de Salmonella enterica está estrechamente relacionado con la concentración existente de
la proteína RecA y que es necesario que dicha concentración esté en equilibrio con la de CheW,
una proteína que acopla los receptores de quimotaxis con la cadena de fosforilación responsable de
los cambios de giro del flagelo4.
En el presente trabajo, se ha determinado de forma inequívoca, y mediante ensayos de co-
inmunoprecipitación, la interacción directa entre las proteínas RecA y CheW. Además, partiendo de
las estructuras tridimensionales resueltas existentes en las bases de datos para ambas proteínas,
se han realizado estudios de modelaje, identificando los posibles residuos que estarían involucrados
en dicha interacción. Finalmente, se han realizado ensayos in vivo para determinar la implicación
real en la interacción de los residuos identificados y corroborar así los modelos generados.
Los resultados obtenidos no sólo han permitido determinar las características de la interacción entre
las proteínas RecA y CheW, sino que también permiten hipotetizar sobre el posible encaje de dicha
interacción en la estructuración de los receptores de quimiotaxis de S. enterica, en los que no sólo
CheW sinó también RecA tienen un papel crucial.
Referencias 1 Lusetti, S.L,, and Cox, M.M.,. 2002. Annu Rev Biochem 71: 71-100
2 Sassanfar, M. and Roberts, J.W.1990. J Mol Biol 212: 79-96
3 Gomez-Gomez, J.M., et al. 2007. BMC Biol 5: 14
4 Medina-Ruiz, M., et al. 2010. Infect Immun 78: 3217-3225
78
S7-5
Vías de toxicidad del prionoide RepA-WH1 en Escherichia coli
Laura Molina-García, María Moreno-del Álamo y Rafael Giraldo Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC)
[email protected], [email protected], [email protected]
Introducción: Las amiloidosis son enfermedades degenerativas (Parkinson, Alzheimer y proteinopatíasespongiformes transmisibles, entre otras) resultado de la agregación de proteínas anormalmente plegadas en oligómeros y fibras amiloides proteotóxicos. Se basan en el cambio conformacional de proteínas que pasan desde un estado soluble a otro agregado incrementando su estructura β-laminar. Los agregados actúan posteriormente como moldes promoviendo dicha transición en moléculas adicionales de proteína nativa. La proteína RepA-WH1 experimenta un cambio conformacional tras unirse a secuencias específicas de DNA que permite controlar alostéricamente su amiloidogénesis invitro (1). Además, la expresión de una variante hiperamiloidogénica de WH1 (A31V), induce una proteinopatía amiloide en E. coli: la proteína se acumula en las células a modo de inclusiones citoplásmicas transmisibles verticalmente de naturaleza amiloide que causan una reducción de la viabilidad celular (2). Nuestros resultados ponen de manifiesto que DnaK, la chaperona Hsp70 de E. coli, contribuye al proceso de amiloidogénesis in vivo, mientras que ClpB (Hsp104), no parece contribuir a la transmisión de propagones durante la división celular (3). Métodos: Se han realizado estudios transcriptómicos, proteómicos y fisiológicos de la respuesta diferencial de E.coli a la expresión de variantes de RepA-WH1 con distinta toxicidad. Resultados: Se han desarrollado análisis genómicos mediante microarrays de Affimetrix para estudiar la respuesta diferencial de toxicidad entre la variante hiperamiloidogénica RepA-WH1(A31V) y unavariante menos tóxica que tiende a formar cuerpos de inclusión RepA-WH1(ΔN37). Además se han realizado estudios proteómicos para valorar la coagregación diferencial de proteínas con ambas variantes de RepA. Los resultados obtenidos apuntan a que los procesos implicados son: daño a la membrana, producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) que llevan a la depleción de los centros ferro-sulfurosos y a un estrés oxidativo generalizado. Asímismo, se ha realizado una validación fisiológica de estos estudios “ómicos” en los que se han estudiado la integridad de la membrana (resistencia a gentamicina), la respiración celular, los niveles de hierro intra y extracelulares y la hipersensibilidad a peróxido de hidrógeno, confirmando todos ellos la ruta de toxicidad arriba indicada. Conclusiones: El prionoide sintético RepA-WH1 es un sistema minimalista potencialmente útil para estudiar los distintos factores implicados en los procesos genéricos de amiloidogénesis y para la búsqueda de posibles inhibidores de proteinopatías de interés clínico. Referencias:
1. Giraldo R (2007). Proc Natl Acad Sci USA 104: 17388-17393. 2. Fernández-Tresguerres ME, et al., (2010). Mol Microbiol 77: 1456-1469. 3. Gasset-Rosa F, et al., (2014). Mol Microbiol 91(6):1070-87
79
S7-6
Importancia de los mutantes individuales del sistema de dos componentes AbrA1/A2 de Streptomyces coelicolor en la
producción de antibióticos y diferenciación Antoraz S., Rico S., Rodríguez H., Díaz M., Santamaría R.I.
Instituto de Biología Funcional y Genómica (CSIC / USAL) C/ Zacarías González 2, 37007 Salamanca. Spain. [email protected] Introducción: El género Streptomyces es el mayor productor de antibióticos conocido. Dicha producción se encuentra altamente regulada a diferentes niveles, lo cual le permite responder rápidamente a las variables condiciones nutricionales y físico-químicas que encuentra en su hábitat natural, el suelo. Los Sistemas de Dos Componentes (SDC), constituyen la principal vía de señalización en bacterias y están formados por una Histidina Quinasa (HK) y un Regulador de Respuesta (RR). Previamente en nuestro laboratorio se identificó el sistema AbrA1/A2 en Streptomyces coelicolor, un SDC que forma parte de un operón junto a otros dos genes que codifican un sistema de transporte ABC. La deleción del sistema AbrA1/A2 produce un aumento de la producción de los antibióticos actinorrodina (ACT), undecilprodigiosina (RED) y antibiótico dependiente de calcio (CDA), así como acelera la diferenciación morfológica (1). En este trabajo se estudió la importancia de la HK AbrA1 y del RR AbrA2 por separado en la producción de antibióticos en S.coelicolor. Métodos: Los mutantes ΔabrA1 y ΔabrA2 se obtuvieron reemplazando dichos genes por un cassette de resistencia a apramicina y fueron comprobados por Southern Blot. El análisis morfológico de los mutantes se realizó en diferentes medios tanto sólidos como líquidos. Resultados: El fenotipo de los mutantes individuales resultó altamente dependiente del medio. Aunque en algún caso ambos presentaban fenotipos similares al mutante doble ΔabrA1/A2, mayor producción de ACT, RED y CDA, en otros el mutante de la HK era parecido a la cepa silvestre, o ambos mutantes presentaban un fenotipo intermedio entre la cepa silvestre y el mutante de todo el sistema. Durante este estudio también se observó un retraso en la germinación de los mutantes ΔabrA1/A2 y ΔabrA2. Sin embargo, no presentaban diferencias en las curvas de crecimiento obtenidas durante varios días. Conclusiones: La eliminación de tan sólo uno de los componentes del sistema en la mayoría de los casos no conlleva un fenotipo como el del mutante doble, por lo que en esos casos podría estar dándose una regulación cruzada con otras HK o RR ajenos al sistema AbrA1/A2. La red reguladora de Streptomyces adquiere por lo tanto un mayor nivel de complejidad si tenemos en cuenta las posibles interacciones entre los componentes de distintos sistemas. Referencias:
(1) Yepes et al. PLOS ONE 6(5): e19980. doi:10.1371/journal.pone.0019980
80
S7-7
Positive selection and compensatory adaptation interact to
stabilize non-transmissible plasmids
A. San Millan, R. Peña-Miller, M. Toll-Riera, Z.V. Halbert, A.R. McLean, B.S. Cooper
and R.C. MacLean.
Department of Zoology, University of Oxford, Oxford, United Kingdom.
Plasmids are catalysts of bacterial evolution that permit adaptation to novel selective pressures, such
as antibiotics. However, it remains challenging to understand how plasmids can persist over the long
term as a result of fitness costs associated with plasmid carriage. Classical models predict that
horizontal transfer is necessary for plasmids to persist [1,2], but whole genome sequencing has
recently revealed that almost half of plasmids are non-transmissible [3]. Here we use a combination
of mathematical modelling and experimental evolution coupled to whole genome sequencing to
investigate how a simple, non-transmissible plasmid, pNUK73, can be maintained in populations of
the pathogenic bacterium P. aeruginosa. We find that positive selection for plasmid-encoded
antibiotic resistance and compensatory adaptation allow pNUK73 to become rapidly stabilized.
Compensatory adaptation by Pseudomonas aeruginosa recovers the cost associated with plasmid
carriage, but compensation alone is not sufficient to maintain the plasmid as a result of segregational
loss of plasmids. Positive selection mediated by exposure to antibiotics is necessary to increase
plasmid frequency and offset the effects of segregational loss. Crucially, we find that feedback
occurs between these processes. Positive selection increases the efficacy of selection for
compensatory adaptation by increasing the population size of plasmid-bearing lineages.
Compensatory adaptation, in turn, increases the effect of positive selection on plasmid stability by
slowing the rate at which the plasmid is lost between episodes of positive selection. Our study
provides a new understanding of how plasmids can persist in bacterial populations, and it helps to
explain why plasmid-mediated resistance can be maintained in bacterial populations after antibiotic
use is stopped.
References:
1. Stewart FM, Levin BR (1977) The Population Biology of Bacterial Plasmids: A PRIORI Conditions
for the Existence of Conjugationally Transmitted Factors. Genetics 87: 209-228.
2. Bergstrom CT, Lipsitch M, Levin BR (2000) Natural selection, infectious transfer and the existence
conditions for bacterial plasmids. Genetics 155: 1505-1519.
3. Smillie C, Garcillán-Barcia MP, Francia MV, Rocha EP, de la Cruz F (2010) Mobility of plasmids.
Microbiol Mol Biol Rev 74: 434-452.
81
S7-8
Disruption of a phospholipid transporter affects the intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa to antimicrobial agents
targeting bacterial membranes
Daniel Yero1,2, Sònia Martinez-Servat1,2, Lionel Costanero1, Oscar Conchillo1, Mario Ferrer-Navarro1, Xavier Daura1,3, and Isidre Gibert1,2 1 Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IBB), Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 08193
Bellaterra, Cerdanyola del Vallès (Barcelona). 2
Departament de Genètica i de Microbiologia, Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 08193 Bellaterra, Cerdanyola del Vallès (Barcelona).
3 Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), E-08010 Barcelona.
[email protected]; [email protected] Introduction The emergence of multidrug-resistant Gram-negative bacteria that cause nosocomial infections is a growing problem worldwide. Particularly, P. aeruginosa displays high intrinsic resistance to disinfectants, organic solvents and a wide variety of antibiotics. We have previously identified a set of upregulated genes in a clinical persistent strain that shows resistance to multiple antibiotics. One of these genes encodes for the periplasmic component (Ttg2D) of an ABC transporter probably involved in maintaining phospholipids asymmetry in the outer membrane by homology with the ortholog system in Escherichia coli. Methods Mutants were obtained from the PAO1 transposon mutant library at the University of Washington. For complementation the entire ttg2 operon (ttg2ABCD) was cloned into the cloning vector pBBR1MCS-5. Antimicrobial susceptibility was tested by using Etest (Biomerieux) and the method to assess solvent tolerance involved overlaying solvent onto agar plates. Biofilm production was measured by staining with crystal violet in polystyrene plates. Slow killing assay of Caenorhabditis elegans by P. aeruginosa was used as a criterion for strain virulence. Recombinant Ttg2D was produced in E. coli using the pET28b vector and 3D structure determined by X-ray crystallographic techniques. Results As expected, P. aeruginosa mutants in the ttg2 operon were more sensitive to organic solvents and the combined action of SDS and EDTA. Moreover low concentration of EDTA significantly affected biofilm formation of all the ttg2 mutants. Additionally, mutations in individual components of ttg2 operon increased the sensitivity to the antibiotic colistin. All these phenotypes could be successfully reverted by complementation with the cloned full operon ttg2. Despite the Ttg2D sequence variation among Gram-negative species, 3D structural studies corroborated this protein participates in the phospholipids transport across the membranes in P. aeruginosa. Mutants in each ttg2 component killed C. elegans faster than the parent strain, probably indicating a different membrane composition could increase their virulence potentials. Conclusions Obtaining data indicates that the P. aeruginosa ttg2 operon products are involved in a resistance mechanism probably taking part in maintaining the permeability of the outer membrane. Interestingly, this mechanism could be involved in the intrinsic resistance to Colistin, a re-emerging antibiotic for multidrug-resistant Gram-negative bacterial infections.
82
S7-9
Secuenciación y análisis de Enterococcus faecalis JH2-2: diferencias con la cepa clínica V583 en los determinantes de
virulencia y de resistencia a antibióticos
Thomas-Lopez D.1, Carrilero L.1, Matrat S.2, Montero N.1, Gutiérrez B.1, Ovejero C. M.1, Santos-Lopez A.1, Hoefer, A.1, Bernabe-Balas C.1, Moyano Ortega G.1, Kennedy S.3, Gonzalez-Zorn B.1
1 Departamento de Sanidad Animal y VISAVET, Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid, España.
2 INRA, UR454 Microbiologie, Centre de Clermont-Ferrand-Theix, Saint-Genès-Champanelle, Francia.
3 Unité MetaGenoPolis, INRA, Domaine de Vilvert, Jouy-en-Josas, Francia.
Introducción: A pesar de ser uno de los principales responsables de endocarditis y septicemias en hospitales1,
Enterococcus faecalis es un microorganismo relativamente desconocido en lo referente a su metabolismo oxidativo, su patogénesis inicial, su virulencia y sus diferentes mecanismos de resistencia a antibióticos. De hecho, la EFSA (European Food Safety Authority) desaconseja por esta razón el uso de los enterococos con fines alimentarios
2.
En nuestro laboratorio hemos secuenciado el genoma completo de la cepa JH2-2, una de las más frecuentemente usadas en el laboratorio, y hemos comparado in silico con el genoma de la cepa clínica V583
3
aquellos determinantes que han sido descritos como claves en la virulencia de E. faecalis in vivo1
y en su resistencia a antibióticos, comprobando por antibiogramas dichas diferencias. Métodos: La cepa JH2-2
4 fue secuenciada en la Unidad MetaGenoPolis (INRA, Francia). Los genomas de las
especies JH2-2 y V583 fueron comparados utilizando la aplicación BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y el programa Serial Cloner 2.6.1 Los antibiogramas fueron realizados en medio BHI agar, siguiendo las directrices de EUCAST. Resultados: En JH2-2 están ausentes importantes factores encontrados en cepas clínicas, como son la citolisina, las proteínas de sustancia de agregación (AS) o las proteínas PblA y PblB, implicadas en el desarrollo de la endocarditis. Sí contiene, en cambio, la adhesina de colágeno Ace o la cocolisina (antiguamente denominada gelatinasa). También posee fragmentos de genoma proveniente de otras especies, como la toxina exfoliativa A (de S. aureus). Además, hoy en día se sabe que la inusual capacidad de E. faecalis para resistir el estrés oxidativo también es una de las claves de su virulencia
5. Hemos comprobado que JH2-2 posee prácticamente los mismos genes que
V583 para dicha resistencia. Por último, la comparación de los determinantes de resistencia a antibióticos revelan ciertas diferencias entre ambas cepas, como es la secuencia de rpoB posiblemente responsable de la resistencia de JH2-2 a rifampicina. Conclusiones: La información obtenida de este trabajo permitirá profundizar en el conocimiento de unos de los principales patógenos nosocomiales, además de ayudar a determinar qué cepas son seguras para su uso en la industria alimentaria. Referencias: 1. C. A. Arias, B. E. Murray. The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance. Nat. Rev. Microbiol. 10, 266-278 (2012). 2. EFSA BIOHAZ Panel. Scientific Opinion on the Maintenance of the List of QPS Biological Agents Intentionally Added to Food and Feed (2013 Update). EFSA Journal. 11(11):3449, 108 Pp. (2013). 3. I. T. Paulsen et al. Role of mobile DNA in the evolution of vancomycin-resistant E. faecalis. Science. 299, 2071-2074 (2003). 4. A. E. Jacob, S. J. Hobbs. Conjugal transfer of plasmid-borne multiple antibiotic resistance in Streptococcus faecalis var. zymogenes. J. Bacteriol. 117, 360-372 (1974). 5. E. Riboulet et al., Relationships between oxidative stress response and virulence in Enterococcus faecalis. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 13, 140-146 (2007)
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S7-10
Molecular Epidemiology of Acinetobacter baumannii Strains Isolated from Spanish Hospitals.
Dahdouh, E.1,2, Hernández, N.1, Gómez-Gil, R.3, Mingorance, J.3, Daoud, Z2., Suárez, M.1 1Department of Animal Health, Faculty of Veterinary Medicine, Complutense University, Madrid, Spain.
2Department of Clinical Microbiology, Faculty of Medicine and Medical Sciences, University of Balamand,
Lebanon. 3Molecular Microbiology Group. Research Institute, La Paz University Hospital, Madrid, Spain.
[email protected], [email protected], [email protected] The wide array of intrinsic resistance mechanisms and the heightened ability to acquire resistance makes Acinetobacter baumannii a dangerous bacterium [1]. Molecular characterization of the Acinetobacter clones causing nosocomial infections is an important step in determining treatment approaches and implementing infection control interventions [2]. It is therefore our aim in this study to characterize Acinetobacter baumannii clones that have been causing blood stream infections over a 5 year period in a Spanish Hospital. 59 bloodstream clinical isolates were isolated from patients in different wards of “Hospital La Paz, Madrid” between 2009 and 2013. Antibiotic Susceptibility Testing (AST) was performed according to CLSI guidelines. Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) was then carried on. The presence of the OXA-51-Like, OmpA, and CsuE genes, were tested for by PCR. Finally, the rate of biofilm formation for selected strains was studied. The AST showed that 17.07% were sensitive to Carbapenems while 6 strains (8.47%) were intermediately resistant. Two of the tested strains (3.39%) were resistant to Colistin and Carbapenems. The PFGE analysis showed the presence of 7 distinct clusters and 5 independent isolates. Some clones persisted from year to year, have a slightly changing susceptibility patterns, and were found in different wards. Interestingly, 1 isolate, which is a part of a group of 9 identical clones, was susceptible to Carbapenems while the rest of the clones of this group were resistant to these antibiotics. This clone was also found to have a slower rate of biofilm formation than another Carbapenem resistant clone of that group. The PFGE also revealed that isolates belonging to two separate clusters were responsible for 2 outbreaks in the year 2012 and a third cluster was found to cause an outbreak in 2011. The highest number of isolates was in 2009 (50.85%), probably due to the increase in the number of Klebsiella pneumoniae infections over the subsequent years. Finally, the PCR showed that all strains expressed OmpA, 8 strains were negative for OXA-51-Like, and 4 strains were negative for CsuE. In conclusion, MDR Acinetobacter baumannii strains were found to cause several outbreaks in the “La Paz” Hospital in Madrid. The strains causing the outbreaks spread to different wards and even persisted throughout subsequent years. These findings could help in fine tuning treatment approaches and infection control. References: 1. McConnell MJ, Actis L, Pachón J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors
contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 2013 Mar;37(2):130-55. 2. Antonietta Lambiase, Ornella Piazza, Fabio Rossano, Mariassunta Del Pezzo, Rosalba Tufano,
Maria Rosaria Catania. Persistence of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii strains in an Italian intensive care unit during a forty-six month study period. New Microbiol. 2012 Apr;35 (2):199-206
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CONFERENCIA INAUGURAL
Why Study Nitrogenase?
Luis M. Rubio
Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas, Universidad Politécnica de Madrid, Campus de
Montegancedo, E-28223-Pozuelo de Alarcón (Madrid), Spain
Biological N2 fixation, catalyzed by nitrogenase enzymes, is an essential part of the N cycle that
accounts for about two-thirds of the total fixed N2 (most of the remainder is due to the Haber–Bosch
process) and can be split into a natural component of the biosphere and an anthropogenic
component promoted for agricultural purposes.
Nitrogenase is one of the most heavily studied proteins. This is not only due to its enormous
ecological and agronomical importance but also because it serves as model to study metalloprotein
biosynthesis and catalysis.
1,2 This talk reviews some of the most important contributions that
nitrogenase studies have made to basic science, from establishing the existence of universal cellular
machineries for the assembly of iron-sulfur clusters,3 to finding biologically unprecedented carbon-
iron coordination chemistry or a new role for iron-sulfur clusters in metal trafficking.4
The awareness that biological nitrogen fixation could be used as alternative to the synthetic N
fertilizers in the implementation of modern sustainable agricultural practices is another underlying
driving force of nitrogenase studies. The extensive use of synthetic N fertilizers in developed
countries poses enormous environmental threats that must be addressed. In contrast, N fertilization
is scarcely used in Sub-Saharan Africa deriving in very low crop yields, poverty and hunger.
An ambitious challenge of plant biotechnology is to increase cereal crop productivity by engineering
plants to fix their own nitrogen, i.e. by functional expression of bacterial N2 fixation (nif) genes in the
plant. The apparent complexity of nitrogenase biosynthesis and its sensitivity to O2 and are the main
barriers identified so far.5 However, recent advances in our understanding of nitrogenase
biosynthesis6 offer a new perspective over this ambitious agronomical objective.
Finally, nitrogenase is also regarded as a promising source of bio-H2. A new strategy to improve
nitrogenase H2 production by implementing high throughput selection of randomly generated variants
with altered catalytic properties will be discussed.
References:
1. Rubio and Ludden (2008), Annu. Rev. Microbiol. 62: 93-111.
2. Hoffman BM et al. (2013), Acc. Chem. Res. 46: 587-595.
3. Johnson DC et al. (2005). Annu. Rev. Biochem. 74: 247-281.
4. Dos Santos PC and Dean DR (2008). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105: 11589-11590.
5. Curatti L and Rubio (2014) Plant Science. In Press.
6. Curatti L et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104: 17626-17631.
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NOMBRE COMUNICACIÓN PÁGINA(s)
Acebo País, Paloma S1-1, S2-10 10, 25
Aguinagalde, Leire S5-1, S2-2 17, 55
Ainsa Claver, Jose Antonio
Aires Maria, José Carlos S3-10 35
Álvarez Arguedas, Samuel S4-1 45
Amblar Esteban, Mónica S1-1, S2-10 10, 25
Aragón Fernández, Virginia
Aranda Rodríguez, Jesús S6-1 61
Argandoña Bertrán, Montserrat S3-1, S3-8, S3-12,S3-14 26, 33, 38, 39
Berenguer, José S3-2, S4-7 27, 52
Bernabé Balas, Cristina S3-9, S3-2, S6-7, S6-10, S6-12, S7-9
34, 62, 67, 70, 72, 82
Blázquez Gómez, Jesús S2-8 23
Blesa Esteban, Alba S3-2 27
Botello Morte, Laura S7-1 74
Broset Blasco, Esther S4-9 54
Caballero, Carlos S3-3 28
Camino Gutiérrez, Eliazar Organización
Campoy Sánchez, Susana S7-4 71
Cannatelli, Antonio S6-3 63
Carrilero, Laura S3-9, S6-2, S6-4, S6-7, S6-10, S6-12, S7-9
34, 62, 64, 67, 70, 72, 82
Cepeda Molero, Massiel S4-2 46
Cervera Alamar, Mercedes S1-2, S2-7, S3-4 11, 22, 29
Conde Alvarez, Raquel S2-1, S3-19 16, 44
Corsini, Bruno S2-2, S5-1 17, 55
Costas Romero Coloma S2-8 23
Crespo Puig, Anna S3-5 30
Díaz Martínez,Margarita S7-2, S7-6 75, 79
Díez Martínez, Roberto S4-2, S4-3 47, 48
Echeverz Sarasua, Maite S1-3 12
Escolano, Marisol S2-2, S2-5 17, 20
Fernández Coll, Llorenc S2-6, S7-3 21, 76
Fernández Herrero, Luis Angel S4-2, S4-8 46, 53
Ferrándiz Avellano, María José S2-10, S3-6, S3-7 25, 31, 32
García Fernández, Esther S4-3 48
García García, María Jesús S4-5 50
García Valero, Rosa S3-8 33
Gaviria Cantin, Tania S2-6, S7-3 21, 76
Gibert González, Isidre S1-4, S6-9, S7-8 13, 69, 81
Giraldo Suárez, Rafael S7-5 18
González de la Campa,Adela S2-3, S2-5, S2-10, S3-6, S3-7 18, 20, 25, 31, 32
González Torres, Pedro Iñaki S6-5 65
González Pastor, Jose Eduardo S6-6, S6-8 66, 68
González-Zorn, Bruno S3-9, S6-2, S6-4, S6-7, S6-10, S6-12, S7-9
34, 62, 64, 67, 70, 72, 82
Gonzalo Asensio, Jesús S4-9, S5-2 54, 56
Gutiérrez Soriano, Belén S1-2, S3-9, S6-2, S6-7, S6-10, S6-12, S7-9
11, 34, 62, 67, 70, 72, 82
Guzmán, Katerina S2-7, S3-4 22, 29
Hoefer, Andreas S3-9, S6-2, S6-7, S6-10, S6-12, S7-9
34, 62, 67, 70, 72, 82
Huedo Moreno, Pol S1-4 13
Irazoki Sánchez, Oihane S7-4 77
Jara Salazar, Luis S6-1 61
Jiménez Cid, Victor S5-5, S5-6 59, 60
87
Julca Paz, Natalia Irene S4-5 50
Lasa Uzcudum, Iñigo S1-3, S1-6, S2-7, S3-3, S3-17 12, 15, 22, 28, 42
Lopes Ribeiro, Ana Luisa de Jesus S4-7 52
Lopez Ibañez, Alejandra S6-8 68
Martín Brieva, Humberto
Martín Galiano, Antonio Javier S2-3, S2-5, S3-6 18, 20, 31
Martín Moldes, Zaira S3-11 36
Martínez Gómez, Estrella S3-19 44
Martínez Ovejero, Cristina S6-2, S6-7, S6-10, S6-12, S7-9 62, 67, 70, 72, 82
Martínez Servat, Sonia S1-4, S6-9, S7-8 13, 69, 81
Mascaraque Martín, Victoria S4-4 49
Moleres Apilluelo, Javier S5-3 57
Molina García, Laura S7-5 78
Moyano Ortega, Gabriel S7-9 82
Munóz Suano, Alba S4-6 51
Muro Pastor, Alicia María S5-4 58
Naranjo Fernández, Emilia S3-12 37
Nieto Gutiérrez, Joaquin J. S3-1, S3-8, S3-12, S3-14 26, 33, 37, 39
Navas Méndez, Jesús S6-11 71
Pérez Sampietro, María S3-13 38
Piubeli, Francine Amaral S3-14 39
Puigpinós Roig, Judit S3-15 40
Rivas Pérez, Elena
Rodríguez Beltrán, Jerónimo S2-8 23
Rodríguez Escudero, Isabel S5-5, S5-6 59, 60
Rodríguez Escudero, María S5-5 59
Ruano Gallego, David S4-8 53
Rubio, Luis M. Conferencia Inaugural 84
Sáenz Lahoya, Sonia S3-17 42
Salvador Bescós, Miriam S2-1 16
Salvador Russo, Joan Organización
San Martín Fernández de Heredia, Manuel
Organización
San Millan Cruz,Alvaro S6-12, S7-7 72, 80
Sánchez Romero, María Antonia S3-16 41
Sangari García, Felix Javier S2-9 24
Santamaría Martos, Fernando S3-15 40
Santamaría, Ramón S7-2, S7-6 75, 79
Santos López, Alfonso S3-9, S6-2, S6-7, S6-10, S6-12, S7-9
34, 62, 67, 70, 72, 82
Solórzano, Carla Daniela S3-18 43
Suárez, Mónica S7-10 83
Taglialegna, Agustina S1-6 15
Thomas López, Daniel S3-9, S6-2, S6-4, S6-7, S6-10, S6-12, S7-9
34, 62, 64, 67, 70, 72, 82
Toledo-Arana, Alejandro S1-6, S2-7, S3-3 15, 22, 28
Tormo Mas, María Angeles S1-2, S2-7 10, 22
Torrents Serra, Eduard S1-5, S2-4, S3-5 14, 19, 30
Valencia, Astrid Secretaría técnica
Vallés Rapp, Cristina Comité organizador
Ventosa Ucero, Antonio S6-13 73
Wilton Pereira, Joanna S2-10 25
Yero Corona, Daniel S1-4, S6-9, S7-8 13, 69, 81
Yuste, José Enrique S2-2, S2-5, S5-1 17, 20, 55
Zúñiga Ripa, Amaia S3-19 44
