IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y PATOGENICIDAD DEL HONGO

IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y PATOGENICIDAD DEL HONGO ENTOMOPATÓGENO Paecilomyces cateniannulatus AISLADO DE Thaumastocoris

peregrinus (HEMIPTERA: THAUMASTOCORIDAE) EN RIO GRANDE DO SUL - BRASIL

Universidade Estadual PaulistaPrograma de Pós-Graduação em Proteção de Plantas

Trabajo presentado como parte de la tesis para la obtención del título de Maestría en Protección de Plantas UNESP, Facultd de Ciencias Agronómicas

Campus de Botucatu

Ing. Agr. María Lorena San Román LazoOrientador: Prof. Dr. Carlos Frederico Wilcken

Identificación, caracterización y patogenicidad del hongo entomopatógeno Paecilomyces cateniannulatus aislado de Thaumastocoris peregrinus

(Hemiptera: Thaumastocoridae) en Rio Grande do Sul - Brasil

• Introducción

• Objetivos

• Materiales y Métodos • Materiales y Métodos

• Resultados

• Conclusiones

Introducción

+ 25 millones de

Situación mundial de la plantación de Eucaliptos

3

+ 25 millones de

ha en el mundo

Según ABRAF (2013) en el 2012 el área total plantada con eucalipto en Brasil fue de 5.102.103 ha

Introducción

Orden: Hemiptera; Familia: Thaumastocoridae; Nombre común: Chinche del eucalipto.

•Insectos fitófagos, con aparato bucal suctor.

•Cada hembra, a lo largo de su vida, coloca 60 huevos aproximadamente.

•Las hembras ovipositan colocando huevos en forma gregaria.

•Ciclo de vida adulto 35 días, con 2 a 4 mm de longitud.

Thaumastocoris peregrinus Carpintero & Dellapé

4

•Las hembras ovipositan colocando huevos en forma gregaria.

•Hasta llegar adulto el insecto pasa por 5 estadios ninfales

San Román, L.

Introducción

Especies de eucalipto suceptibles

Eucalyptus Reacción

E.

camaldulensis+ + +

E. tereticornis + + +

E.

Eucalyptus Reacción

E. benthamii + + +

E. dunnii ++

E. grandis +

5

.

E.

camaldulensis x

E. grandis

+ + +

E. viminalis + +

E. grandis +

E. paniculata +

E. robusta +

E. saligna +

E. syderoxilon +

+ + + Suscep

+ + Interm

+ Poco sucep.

0 No atacada

+ + + Suscep

+ + Interm

+ Poco sucep.

0 Nao atacada

Uruguay ( Paysandú FO , 2009)

Sudáfrica (JACOBS e NESER, 2005)

Introducción

Estrategias de control para T. peregrinus

•Resistencia de Plantas

•Control químico

•Control biológico

- Enemigos naturales- Enemigos naturales

-Control microbiano

Nematodos, virus, bacterias, hongos

•La ocurrencia de epizootias con mortalidades naturales de T. peregrinus es fuentepara desarrollo de investigación y busqueda de agentes patógenos como hongos

•La caracterización, identificación y constatación de la patogenicidad de esoshongos constituye una herramenta importante como parte del control integrado deT. peregrinus

Introducción

Mecanismo de acción Hongo- Hospedero

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• Introducción

• Objetivos

• Materiales y Métodos • Materiales y Métodos

• Resultados

• Conclusiones

Objetivos

• Realizar la caracterización cultural, morfológica, patogénica

y molecular de Paecilomyces sp. aislado de T. Peregrinus.

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• Acompañar la colonización del insecto por el hongo vía MEB

(Microscopía Eletrónica de Barrido).



• Introducción

• Objetivos

• Materiales y Métodos• Materiales y Métodos

• Resultados

• Conclusiones

Materiales y Métodos

Lugar de realización del trabajoLaboratório de Control Biológico de Plagas Forestales yLaboratório de Fitopatología da FCA/UNESP – Campus de Botucatu.

Colecta de insectos y aislamiento del hongo T. peregrinus muertos y enfermos hallados en epizootia ocurrida en la empresa Stora Enso, en la región de Alegrete, RS, Nov. de 2011(Figura 1).

11

. empresa Stora Enso, en la región de Alegrete, RS, Nov. de 2011(Figura 1).

Figura1:A. T. peregrinus sobre hoja de eucalipto a campo. B. T. peregrinus

cubiertos con micelio y sanos, colectados en epizootia a campo.

A B


Test de patogenicidad en T. peregrinus

• Insectos adultos de T. peregrinus

obtenidos a partir de la cría en

laboratorio.

• A partir de generar aislamientos de

colonias puras (cultivos monosporicos)

.

colonias puras (cultivos monosporicos)

se obtuvieron concentraciones de

esporas para montar los bioensayos

• Micro aspersión Torre de PotterVol de 3 mL, de 106 esporas/mL. y15 lb/pol2, Testigo pulverizado con agua

destilada.

• El experimento fue montado em bloques

al azar con 4 repeticiónes y 10 insectos

por placa de petri conteniendo gel estéril.



• Cámara BOD a 25 °C e fotofase de 12 horas.

• Evaluaciones diarias del experimento, contando y retirando insectos muertos.

• Los insectos muertos son retirados y colocados en cámara húmeda para reaislar los hongos y confirmar de la mortalidad asocida.


Proceso de colonización del hongo en el insecto

• Acompañamiento de la colonización del aislamiento selecionado sobre el insecto.

• Tratmientos pulverizados con suspensión de esporas de 106 esporas/mL.

• Testigo pulverizado con agua destilada autoclavada.

14

. • Test de patogenicidad, insectos tratados en intervalos de tiempo pre- determinados2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 y 96 horas y testigo.

• Muestras de insectos preparadas y analizadas en MEB, Figura 3.

Figura 3. Muestras de T, peregrinus montadas en “stubs” (izq) y MEB - ESALQ/USP (der).


Caracterización morfológica

•La medición de los conidos se realizó utilizando un sistema de

vídeo-cámara adaptada al microscópio óptico y PC,

utilizando el programa EDN-2 para lámina micrografiada .

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•Se midieron 30 esporas de cada aisamiento.

Caracterización molecular del aislamiento selecionado

•La extracción de ADN del aislamiento patogénico,basada en el método modificado

Murray yThompson (1980).

•La amplificacíón de la región ITS del ADN del hongo selecionado fue realizada

utilizando los pares de primers ITS 1 e ITS 4.

•Para el PCR relacionado con α-elongasa se utilizaron los pares de primers EF1 e EF2.



• Introducción

• Objetivos• Objetivos

• Materiales y Métodos

• Resultados

• Conclusión

Resultados

Con base en las características biológicas de los cultivos, morfológicas y a las

secuencias de ADN extraídas del hongo, este fue identificado como Paecilomyces

cateniannulatus Liang

Caracteristicas morfológicas

• Velocidad de crecimento micelial : 10,7 mm/día.

• Características de la colonia

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• Características de la colonia

•Fiálides globosas en la posición basal, alargadas afinandose hacia el final donde

presentan conídios.

•Conídios de forma oval con dimensiones de (2, 0 -3,5 µm) 2,6 x 1,6 (0,8-2,5 µm).

Resultados

.


.

Figura 4. Mortalidad de ninfas y adultos de T. peregrinus a lo largo del tiempo,

después de la inoculación con esporas de Paecilomyces cateniannulatus en laboratorio (Temperatura 25 ± 1 oC , fotofase de 12 h).

Resultados

Proceso de colonización del hongo en el insecto vía MEB

Paecilomyces cateniannulatus

A= 2 hs

19

Resultados


B = 4 hs

20

Resultados


C= 8 hs

21

Resultados


D= 12 hs

22

Resultados


E=24 hs

23

Resultados


F= 48 hs

24

Resultados


G= 72 hs

25

Resultados


H= 96 hs

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• Introducción

• Objetivos• Objetivos

• Materiales y Métodos

• Resultados

• Conclusiones

Conclusiones

•Fue identificada la especie Paecilomyces cateniannulatus infectando T.

peregrinus, siendo esta primera ocurrencia del hongo entomopatógeno sobre

esta plaga forestal exótica en Brasil.

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•P. cateniannulatus es capaz de ingresar al cuerpo del insecto a partir de las 4

horas posteriores a la inoculación, por aberturas naturales del insecto y

penetrando la cutícula.

•En los test de patogenicidad realizados en condiciones de laboratorio P.

cateniannulatus se mostró altamente patogénico a T. peregrinus causando 50

% de mortalidad a los dos días posteriormente a la inoculación.

Gracias!

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