Identificación funcional de citocromos involucrados en la … · 2013-07-08 · Identificación funcional de citocromos involucrados en la biotransformación in vitro de AFB1 por

Identificación funcional de citocromos involucrados en la biotransformación in

vitro de AFB1 por medio de sustratos modelo e inhibidores específicos en cuatro

especies de aves: gallinas, pavos, patos y codornices.

Hansen Wilber Murcia Gutiérrez

Instituto de Biotecnología

Universidad Nacional de Colombia


Facultad de Ciencias


Bogotá D.C., Enero 28 de 2010

Identificación funcional de citocromos involucrados en la biotransformación in

vitro de AFB1 por medio de sustratos modelo e inhibidores específicos en cuatro

especies de aves: gallinas, pavos, patos y codornices.

Hansen Wilber Murcia Gutiérrez

Código 186273

Trabajo de grado presentado para optar al título de Magister en Microbiología

Dirigido por:

Dr. Gonzalo Jair Díaz

Facultad de Medicina Veterinaria


Codirectora

MSc. María Constanza Lozano

Departamento de Farmacia



Facultad de Ciencias


Bogotá D.C., Enero 28 de 2010

NOTA DE ACEPTACIÓN

La presente tesis fue sustentada y aprobada para el grado de Maestría en Microbiología,

el 28 de enero de 2010.

En constancia firman:

Jurado: Alba Isabel Rodríguez

Facultad de Medicina


Jurado: Héctor Suarez Mahecha

ICTA


A quienes siempre han creído a mi,

A quienes han compartido las tristezas y alegrías en el camino,

A mi esposa, Marcela Palacios,

Al Ser Supremo (Dios).

AGRADECIMIENTOS

A la IFC (International Foundation for Science) por su apoyo financiero.

A la Universidad Nacional de Colombia por su apoyo logístico y académico.

A la Facultad de Ciencias y al Instituto de Biotecnología por formarme como

estudiante de maestría.

Al Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

por su apoyo financiero y logístico en la realización de este proyecto.

Al Dr. Gonzalo Díaz por su orientación.

Al laboratorio de Fisiología y Bioquímica del Instituto Nacional de Salud (INS),

especialmente a su Coordinadora Dr. Ángela Guerra.

Al laboratorio de Patología Aviar de la Facultad de Medicina Veterinaria y

Zootecnia.

Al Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Agronomía. Universidad

Nacional de Colombia.

Al Grupo de investigación en Proteínas del Departamento de Química. Universidad

Nacional de Colombia.

A Rocío Rojas y Amparo Cortez por su colaboración durante la fase experimental

del proyecto.

Un agradecimiento muy especial a Milena Cepeda quien fue un apoyo invaluable y

muy enriquecedor durante toda la trayectoria de este proyecto de investigación.

A mis compañeros de posgrado de Microbiología y Nutrición Animal por

enseñarme que nunca hay que desfallecer.

A Socorro Prieto por el gran cariño, apoyo, orientación y cientos de virtudes más

que fueron indispensables en todo momento.

A mi esposa Marcela Palacios, quien ha estado siempre conmigo a pesar de la

adversidad y las dificultades.

1

TABLA DE CONTENIDO

LISTA DE TABLAS ............................................................................................................. 4

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ 5

RESUMEN ............................................................................................................................. 8

MARCO TEORICO ............................................................................................................ 10

Las micotoxinas ................................................................................................................... 10

Aflatoxinas ........................................................................................................................... 12

Efectos de la AFB1 en la salud animal ................................................................................ 13

Alteración del DNA y carcinogenicidad .............................................................................. 15

Bioactivación de la AFB1 en aves y mamíferos ................................................................... 16

Citocromos P450 (CYP450) ................................................................................................ 18

Clasificación de las enzimas CYP450.................................................................................. 21

Nomenclatura de las enzimas CYPP450 .............................................................................. 22

Usos y aplicaciones de las CYP450 ..................................................................................... 24

Medición de la actividad de las citocromos P450 ................................................................ 25

OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................... 27

OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................................... 27

HIPOTESIS .......................................................................................................................... 28

MATERIALES Y METODOS ............................................................................................ 29

Reactivos .............................................................................................................................. 29

Obtención de las muestras de hígado ................................................................................... 29

Obtención de microsomas .................................................................................................... 30

Determinación de proteína en microplaca por el método del ácido bicinconínico. ............. 30

Determinación de la actividad enzimática frente a sustratos prototipo ................................ 31

Condiciones cromatográficas (HPLC) ................................................................................. 31

Determinación de parámetros enzimáticos (KM y Vmax). ..................................................... 33

Uso de inhibidores específicos contra diferentes citocromos .............................................. 34

Cuantificación de la expresión de CYP450 aviares por la técnica de Western Blot. ........... 34

2

Análisis estadístico ............................................................................................................... 35

RESULTADOS .................................................................................................................... 37

Separación de sustratos prototipo y productos de biotransformación. ................................. 37

Codorniz ............................................................................................................................... 40

Determinación de los parámetros enzimáticos KM y Vmax ............................................ 40

Estudios de inhibición ................................................................................................... 41

Correlación de las actividades frente a sustratos prototipo y la epoxidación de la aflatoxina B1. ................................................................................................................ 43

Detección de ortólogos humanos en microsomas de codorniz ..................................... 44

Pavo ...................................................................................................................................... 45

Determinación de parámetros enzimáticos KM y Vmax ................................................. 45



Detección de ortólogos humanos en microsomas de pavo ........................................... 48

Pato ....................................................................................................................................... 50




Detección de ortólogos humanos en microsomas de pato ............................................ 53

Pollo ..................................................................................................................................... 54


Ensayos de inhibición ................................................................................................... 54


Detección de ortólogos humanos en microsomas de pollo ........................................... 57

DISCUSION ........................................................................................................................ 59

Biotransformación de sustratos prototipo ..................................................................... 59

Uso de inhibidores específicos ..................................................................................... 61

Correlación entre biotransformación de sustratos prototipo y activación de la AFB1 . 62

3

Immunoblot de ortólogos aviares ................................................................................. 63

CYP450 involucradas en la producción de AFBO ....................................................... 63

CONCLUSIONES ............................................................................................................... 64

REFERENCIAS ................................................................................................................... 66

4

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Estrategias para reducir la exposición y el riesgo de presencia de aflatoxinas

(adaptado de Groopman et al., 2008). ...................................................................................11

Tabla 2. DL50 oral aguda de AFB1 en diferentes especies (adaptado de Díaz, 1996b). ......14

Tabla 3. Sustratos metabolizados por enzimas citocromo P450 en humanos (adaptado de

Omiecinski et al., 1999). .......................................................................................................23

Tabla 4. Diferentes formas de citocromos P450 relacionadas con el metabolismo de

xenobióticos. Abreviaturas: AAF=2-acetilaminofluoreno, EROD=etoxiresorufin O-

deetilasa, PB=fenobarbital, PAH=hidrocarburo aromático policíclico, TCDD=2,3,7,8-

tetraclorodibenzodioxina, β-NF=β-naftoflavona, IQ=2-amino-3-metilimidazol[4,5-

f]quinolina (Adaptado de Josephy, 1997). ............................................................................23

Tabla 5. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo, obtenidos con

microsomas de codorniz macho y hembra. ...........................................................................41

Tabla 6. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo obtenidos con

microsomas de pavo macho y hembra. .................................................................................45

Tabla 7. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo usados en las

cinéticas con microsomas de pato macho y hembra. ............................................................50


cinéticas con microsomas de pollo macho y hembra. ...........................................................54

5

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Rutas de biotransformación de la AFB1 (Modificado de Eaton y Gallagher,

1994). CYP450(s): citocromo P450(s); PHS: prostaglandina H-sintasa; GST(s): glutatión S-

transferasa(s); UDP-GT(s): UDP-glucuronosiltransferasa(s); ST: sulfotransferasas. ......... 16

Figura 2. Productos de oxidación de la AFB1 (Tomado de Guengerich et al., 1998). ....... 16

Figura 3. Reacciones catalizadas por monooxigenasas P450: a. hidroxilación de ácidos

grasos. b. epoxidación de estireno. c. hidroxilación de compuestos aromáticos. d.

deetilación de 7-etoxicumarina. e. acoplamiento de fenol en la biosíntesis de vancomicina.

f. ruptura de un enlace acil-carbono en la demetilación de lanosterol (Tomado de Urlager y

Eiben, 2006). ........................................................................................................................ 19

Figura 4. Diagrama esquemático de la citocromo P450 BM-3 en su conformación

parcialmente abierta. Se indican las hélices F y G y el “loop” que las une. Estas hélices se

deslizan sobre la superficie de la hélice I, lo que permite el movimiento abierto/cerrado

para el acceso al sitio activo (Tomado de Poulos, 2003). .................................................... 20

Figura 5. Aplicaciones y uso de las monooxigenasas P450 (Tomado de Urlager y Eiben,

2006). ................................................................................................................................... 25

Figura 6. Cromatograma de la separación de AFB1 y su producto de biotransformación

dhd-AFB1. Tiempo de retención dhd-AFB1 =7.8 min. Tiempo de retención AFB1 =12.4

min. ...................................................................................................................................... 38

Figura 7. Cromatograma de la separación de etoxiresorufina y su producto de

biotransformación resorufina. Tiempo de retención resorufina =3.7 min. Tiempo de

retención etoxiresorufina =7.3 min. ..................................................................................... 38

Figura 8. Cromatograma de la separación de metoxiresorufina y su producto de

biotransformación resorufina. Tiempo de retención resorufina = 3.7 min. Tiempo de

retención metoxiresorufin =5.9 min. .................................................................................... 38

Figura 9. Cromatograma de la separación de 7-hidroxicumarina y un producto de

biotransformación desconocido. Tiempo de retención 7-hidroxicumarina = 4.1 min. Tiempo

de retención producto desconocido = 1.8 min. .................................................................... 39

6

Figura 10. Cromatograma de la separación de nifedipina y su producto de

biotransformación nifedipina oxidada. Tiempo de retención nifedipina oxidada =14.2 min.

Tiempo de retención nifedipina =16.7 min. ......................................................................... 39

Figura 11. Cromatograma de la separación de debrisoquinona y su producto de

biotransformación 4-hidroxidebrisoquinona. Tiempo de retención 4-hidroxidebrisoquinona

= 4.0 min. Tiempo de retención debrisoquinona = 5.9 min. ................................................ 40

Figura 12. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con

citocromos de codornices en presencia de diferentes inhibidores específicos para

citocromos P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras

(n=6). .................................................................................................................................... 42



citocromos P450 humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de

AFBO. Los valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin

inhibidor). ............................................................................................................................. 43

Figura 14. Correlación de las actividad AFB1 epoxidasa y las diferentes actividades de las

CYP450 de codorniz con sustratos prototipo (n=12). .......................................................... 44

Figura 15. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de codorniz por la

técnica de Western Blot. Carriles 1 al 3: microsomas de machos. Carriles 4 al 6:

microsomas de hembras. Carriles 7 al 9: CYP450 humanas. Carril de la izquierda: patrones

de peso molecular. ................................................................................................................ 45


citocromos de pavos en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos

P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6). ...... 46



P450 humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de AFBO. Los

valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor). ............ 47

Figura 18. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pavo frente a los

diferentes sustratos prototipo (n=12). .................................................................................. 48

7

Figura 19. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pavo por la técnica

de Western Blot. Carriles 1 al 3: microsomas de machos. Carriles 4 al 6: microsomas de

hembras. Carriles 7 al 9: CYP450 humanas. Carril de la izquierda: patrones de peso

molecular. ............................................................................................................................. 49


citocromos de pato en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos P450

humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6). ................ 51



humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de AFBO. Los valores con

asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor). ................................ 52

Figura 22. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pato frente a los


Figura 23. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pato por la técnica



molecular. ............................................................................................................................. 54


citocromos de pollo en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos

P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6). ...... 55




valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor). ............ 56

Figura 26. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pollo frente a los


Figura 27. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pollo por la técnica



molecular. ............................................................................................................................. 58

8

RESUMEN

Las aflatoxina B1 (AFB1) es un metabolito secundario producido por algunas cepas de

Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus que crecen sobre diferentes tipos de granos

utilizados en alimentación de animales de granja. Al momento de ser ingeridas estas toxinas

son metabolizadas por un tipo de enzimas llamadas citocromo P450 (CYP450), una familia

de enzimas relacionadas con la biotransformación de productos endógenos y xenobióticos.

El producto de biotransformación es una molécula altamente reactiva conocida como

AFB1-8,9-epóxido (AFBO). Este producto es capaz de reaccionar con proteínas y ADN

produciendo efectos citotóxicos y mutagénicos respectivamente. Esto se ve representado en

problemas en la salud animal en general.

Con este estudio se busca determinar el fundamento bioquímico de la diferente

susceptibilidad a la AFB1 en diferentes especies aviares comerciales como pollos, pavos,

patos y codornices. El proyecto investiga las diferencias cualitativas y cuantitativas del

metabolismo fase I de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) y busca determinar si existe

relación entre el metabolismo de la aflatoxina y los efectos observados in vivo. Los

alcances del proyecto incluyen la generación de información básica sobre el metabolismo

fase I de la aflatoxina en aves lo cual permitirá realizar la selección genética de aves

resistentes a la aflatoxina así como el posible control de la toxicosis mediante la

manipulación de las enzimas responsables de su metabolismo.

Al final del estudio se pudo evidenciar que el uso de sustratos prototipo e inhibidores

específicos para CYP450 humanas permitió cumplir con los objetivos planteados

identificando claramente ortólogos aviares y determinando el rol especifico de aquellos

ortólogos relacionadas con la producción de AFBO en pavo, codorniz, pato y pollo. Estos

resultados representan información novedosa acerca de la presencia de CYP450 con

funcionalidades similares a las CYP450 de humanos y otras especies de mamíferos y abre

el campo en la investigación y búsqueda de nuevos ortólogos no descritos con papeles

relevantes en la biotransformación de compuestos tóxicos, como es caso de esta

investigación. Debido a que en la literatura los estudios de este tipo donde se mencione la

existencia de ortólogos en aves de producción e importancia económica son escasos. Con

9

los resultados obtenidos de esta investigación se demostró que en todas las especies aviares

estudiadas la participación de los ortólogos 1A1 y 2A6 en la biotransformación de la

aflatoxina B1. Las correlaciones de actividades frente a sustratos prototipo corroboró la

importancia del ortólogo 2A6 en las cuatro especies aviares, acumulando evidencia a favor

de su rol en la producción de AFBO. Según la evidencia los ortólogos 1A2 y 3A4 no se

encuentran relacionados en la formación de AFBO.

10

MARCO TEORICO

Las micotoxinas

Las micotoxinas surgen como compuestos de interés toxicológico luego de descubrirse su

rol como agentes etiológicos de la “enfermedad X” de los pavos reportada en los años 60.

Esta enfermedad asociada al consumo de una harina de maní procedente de Brasil causó la

muerte de más de 100.000 pavitos en Inglaterra. Con el tiempo se descubrió que ciertas

sustancias tóxicas aisladas del alimento causaron dicha enfermedad. Estas sustancias se

denominaron “aflatoxinas” ya que el principal hongo productor de estas resultó ser

Aspergillus flavus (Sargeant et al., 1961). Después de las aflatoxinas se descubrieron otras

micotoxinas entre las cuales se incluyen los tricoticenos, la ocratoxina A, la zearalenona y

hacia finales de la década de los noventa un grupo de micotoxinas producidas por hongos

del género Fusarium a las cuales se les dio el nombre de fumonisinas (Bezuidenhout et al.,

1988).

La habilidad de las micotoxinas para inducir varios tipos de cáncer en animales domésticos

y de experimentación constituye una gran preocupación para la salud pública. En 1993 la

Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer clasificó las micotoxinas de

acuerdo a su carcinogenicidad, encontrando micotoxinas clasificables en el grupo 1

correspondientes a compuestos carcinógenos para humanos (como la aflatoxina B1), en el

grupo 2 correspondiente a compuestos posiblemente carcinógenos para humanos

(aflatoxina M1, ocratoxina, fumonisina B1) y en el grupo 3, correspondiente a compuestos

no carcinógenos para humanos (como zearalenona y tricoticenos) (Lesson et al., 1995).

Teniendo en cuenta que los metabolitos primarios son aquellas moléculas sintetizadas

durante el crecimiento del hongo, las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos

cuando la fase de crecimiento termina o cuando hay deficiencias en nutrientes esenciales.

Bajo estas condiciones los procesos de síntesis se encaminan hacia la producción de

pigmentos, antibióticos y micotoxinas, los cuales son excretados de manera abundante

durante la fase estacionaria de crecimiento del hongo. Cuando las micotoxinas son

producidas en granos o alimentos destinados a la alimentación de animales o humanos se

convierten en un peligro potencial tanto para la salud humana como para la salud y

producción animal (Díaz, 1995). Hasta el 2004 se habían detectado y clasificado como

11

micotoxinas más de 300 metabolitos secundarios provenientes de hongos filamentosos.

Estas sustancias son producidas principalmente por los géneros Aspergillus, Penicillium y

Fusarium. Se conoce que estos compuestos causan enfermedades severas incluyendo

ciertos tipos de cáncer, disminución de la respuesta inmune, e hiperestrogenismo, entre

otras (Bünger et al., 2004).

Después de haberse descubierto el efecto carcinogénico de las aflatoxinas, la búsqueda de

micotoxinas ha llevado a la identificación de más de 10 tipos de hongos toxigénicos, cuya

genética y metabolismo han sido descritos recientemente. Debido a esto se han generado

diferentes estrategias para inactivar o disminuir el impacto de la presencia de micotoxinas,

en especial de las aflatoxinas, en los lugares de almacenamiento (Tabla 1) (Groopman et

al., 2008).

Tabla 1. Estrategias para reducir la exposición y el riesgo de presencia de aflatoxinas

(adaptado de Groopman et al., 2008). Tipo de intervención Enfoque Resultado

Primario Condiciones de almacenamiento pos-

cosecha

Reducción en la exposición a aflatoxinas

medido por la reducción de los niveles de

aductos aflatoxina-albúmina.

Primario Agentes adsorbentes (aluminosilicatos) Reducción en la exposición a aflatoxina en

animales modelo y ensayos clínicos.

Primario Clorofilina Eficacia demostrada en modelos

experimentales y un 55% de reducción en

aductos aflatoxina-ADN urinarios en

ensayos clínicos humanos.

Secundario Polifenoles de té verde Prevención de cáncer demostrado en ratas

y reducción de biomarcadores (daño

oxidativo al ADN) en ensayos clínicos.

Secundario Ditioletiones (oltipraz) Eficacia demostrada en la prevención de

tumores hepáticos en ratas y modulación

de biomarcadores para aflatoxina,

prediciendo el efecto protector, según

ensayos clínicos.

Secundario Brotes de brócoli (sulforafano) Prevención de cáncer en modelos murinos.

Reducción dosis dependiente de aductos

aflatoxina-ADN en ensayos clínicos

humanos.

12

Diferentes factores afectan el crecimiento de los hongos toxigénicos, clasificándose estas

condiciones en intrínsecas y extrínsecas. Las condiciones intrínsecas hacen referencia a las

condiciones del sustrato sobre el cual crece el hongo e incluyen la composición de

carbohidratos, grasas, proteína, macro y microelementos, entre otros. Además de la

composición del grano existen otros factores como la actividad del agua (Aw), pH y

potencial de óxido-reducción (Díaz, 1996a).

Los factores extrínsecos están relacionados con la atmósfera en la cual se encuentra

almacenado el grano y puede crecer un hongo toxigénico como humedad de la atmósfera de

almacenamiento (óptima >70%), temperatura atmosférica la cual varia de acuerdo al hongo

y adecuado suministro de oxígeno, el cual no es un factor limitante en condiciones

normales de almacenamiento (Díaz, 1996a). Por lo general se afectan sustratos como el

maíz, el trigo, el sorgo, la torta de algodón, la cebada y el maní (Díaz, 1996b).

Los hongos toxigénicos se clasifican de acuerdo con el momento de infección en hongos de

campo (fitopatogénicos) que infectan las plantas antes de la cosecha y hongos de

almacenamiento (saprofíticos) que invaden los granos almacenados. Dentro del primer

grupo se encuentran los géneros Fusarium (el más común), Alternaria, Cladosporium,

Helminthosporium, Pullaria y Aspergillus. Entre los hongos saprofíticos los géneros más

importantes son Aspergillus y Penicillium (Díaz, 1996a).

Es importante anotar que la presencia del hongo toxigénico en un sustrato no implica por

necesidad la existencia de micotoxinas. Esto se debe a que generalmente solo un pequeño

porcentaje de las cepas de hongos posee la capacidad genética de sintetizar micotoxinas y a

que la producción de estos metabolitos ocurre solo bajo estrictas condiciones ambientales

que no siempre se cumplen (Díaz, 1996a).

Aflatoxinas

Las aflatoxinas (AF) son un grupo de metabolitos heterocíclicos sintetizados por algunas

cepas de Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus. La palabra aflatoxina se deriva del

principal hongo productor de esta (Aspergillus flavus) y del sufijo toxina. Los Aspergillus

son generalmente hongos de almacenamiento y por lo común no contaminan los granos

antes de la cosecha, sin embargo, condiciones de estrés en las plantas y daño producido por

13

insectos pueden dar lugar a la infección a nivel de campo y a la producción de AF en los

granos aún no cosechados (Díaz, 1996b).

Estudios realizados por el Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Medicina

Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia demostraron la presencia

de varias especies del género Aspergillus spp. en muestras de maíz y mazorca tomadas en la

región del atlántico colombiano, donde se encontraron niveles muy altos de aflatoxinas, en

especial la B1 y la B2. Al parecer la gran producción de estas micotoxinas y gran incidencia

de hongos aflatoxigénicos se encontraron relacionadas con aspectos medioambientales

como elevadas precipitaciones, plagas y diversidad de hongos aflatoxigénicos y cepas

presentes con gran capacidad de síntesis de aflatoxinas (Acuña et al, 2005), demostrando la

importancia de las condiciones tanto macro como microambientales para el crecimiento de

hongos micotoxigénicos y la producción de micotoxinas. En otro estudio se corroboró la

prevalencia del género Aspergillus spp. en granos de maíz y algodón, en especial las

especies A. flavus y A. parasiticus, este último capaz de producir las cuatro aflatoxinas de

ocurrencia natural (B1, B2, G1 y G2) (Díaz et al, 2009). Hasta el momento se han

identificado cerca de 18 tipos de aflatoxinas, siendo las únicas que se presentan de manera

natural la B1, B2, G1 y G2, mientras las demás aflatoxinas como M1, M2, P1, Q1, aflatoxicol,

etc. se presentan como productos del metabolismo (productos de biotransformación) de

sistemas microbianos o animales. La existencia de cepas aflatoxigénicas de Aspergillus spp.

y presencia de aflatoxinas ha sido reportada en los cinco continentes (Díaz, 1996b) donde

se han hecho grandes esfuerzos por controlar tanto el crecimiento del hongo toxigénico

como de la producción de la micotoxina (Díaz et al., 2009; Felix D’Mello et al., 1998).

Efectos de la AFB1 en la salud animal

Además de los efectos carcinógenos se conocen efectos adversos de las micotoxinas en la

salud en general tanto de animales de producción como mascotas. Dentro de los síntomas

se encuentran la reducción en la ganancia de peso, efectos adversos en la reproducción,

daño al sistema inmunológico, síntomas severos de intoxicación e incluso muerte cuando la

dosis de micotoxina es demasiado alta (Hussein y Brasel, 2001; Lesson et al., 1995).

14

Diferentes estudios han demostrado los efectos adversos sobre el sistema inmune de pollos

en estadios tempranos del desarrollo (Qureshi et al. 1998) y efectos hematológicos y

hepáticos significativos a altas concentraciones en adultos (Del Bianchi et al., 2005) y

durante el desarrollo, evaluando su efecto en enzimas séricas, renales y hepáticas (Quezada

et al., 2000). También se han presentado efectos hepatotóxicos a altas concentraciones en

codornices (Oliveira et al. 2002), además de afectar la producción de huevos (Ogido et al.,

2004).

Dentro de las aflatoxinas, la AFB1 se encuentra como un compuesto altamente tóxico para

la mayoría de las especies y en especial aquellas muy susceptibles como la trucha arco iris,

los gatos o los patos. En ensayos in vitro la toxicidad de la aflatoxinas G1, B2 y G2 es

aproximadamente 50, 20 y 10% de la que presenta la AFB1, respectivamente. Existen

diferencias de susceptibilidad entre animales de diferentes especies frente a la AFB1. Los

animales más susceptibles son el pato, el conejo y el gato, mientras que los más resistentes

son el pollo, ratón, hámster y rata (Tabla 2). En las aves la susceptibilidad varía teniendo

como más susceptibles a los patos, seguido de los pavos, gansos, faisanes y los pollos como

la especie aviar menos afectada. A su vez los animales jóvenes son más susceptibles que los

adultos y las hembras más resistentes que los machos (Díaz, 1996b).

Tabla 2. DL50 oral aguda de AFB1 en diferentes especies (adaptado de Díaz, 1996b). Especie DL50 (mg/kg)

Conejo 0.3-0.5

Patito 0.34-0.56

Gato 0.55

Cerdo 0.62

Trucha arco iris

(intraperitoneal)

0.81

Perro 1.0

Cobayo 1.4-2.0

Oveja 2.0

Mico 2.2

Pollito 6.5-16.5

Ratón 9.0

Hámster 10.2

Rata 5.5-17.9

15

Alteración del DNA y carcinogenicidad

La AFB1 se bioactiva a través de las citocromos P450 a un metabolito electrofílico

altamente reactivo e inestable que una vez formado reacciona con macromoléculas,

especialmente con el ADN (produce alquilación del ADN). Este metabolito, conocido

como aflatoxina-8,9-epóxido (AFBO) es capaz de unirse a los residuos de guanina de los

ácidos nucleicos causando alteraciones irreversibles que pueden llevar a carcinogenicidad,

mutagenicidad y teratogenicidad (Do y Choi, 2007; Eaton y Gallager, 1994; Ferguson y

Philpott, 2008; Verma, 2004). La biotransformación de la AFB1 se inicia en las enzimas

citocromo P450 (CYP450) donde sufre oxidación a AFBO. La forma epóxido puede

conjugarse con glutatión para continuar con la vía de detoxificación o ser hidrolizada por

una epóxido hidrolasa para generar un hidrodiol (AFB1-8,9-dihidrodiol o dhd-AFB1), el

cual puede reaccionar fuertemente con proteínas y tener efectos citotóxicos. En los casos en

que el epóxido llega a conjugarse con glutatión, o la AFB1 no sufre epoxidación sino

adición grupos OH- y posterior conjugación con acido glucurónico o sulfato, los efectos

tóxicos de la molécula se ven neutralizados (Figura 1) (Eaton y Gallagher, 1994).

16

Figura 1. Rutas de biotransformación de la AFB1 (Modificado de Eaton y Gallagher,

1994). CYP450(s): citocromo P450(s); PHS: prostaglandina H-sintasa; GST(s): glutatión S-

transferasa(s); UDP-GT(s): UDP-glucuronosiltransferasa(s); ST: sulfotransferasas.

Se han reconocido que tanto la CYP1A2 como la 3A4 son capaces de oxidar la AFB1 tanto

a formas reactivas que incluyen la AFB1 endo-8,9-epóxido y AFB1 exo-8,9-epóxido (forma

mas toxica del epóxido), como a productos no activos que no son sustratos óptimos para

epoxidación, como la AFM1, AFQ1 (Figura 2) (Gallagher et al. 1996; Guengerich et al.,

1998, 1996).

Figura 2. Productos de oxidación de la AFB1 (Tomado de Guengerich et al., 1998).

Bioactivación de la AFB1 en aves y mamíferos

El hecho de que se presenten diferentes tipos de citocromos P450 capaces de transformar la

AFB1 a sus formas reactivas (fase I de detoxificación), además de una pobre conjugación

de estas formas reactivas con glutatión o sulfatos (fase II de detoxificación) hace que

diferentes especies de aves y de mamíferos presenten diferentes niveles de susceptibilidad.

En la mayoría de las especies de mamíferos la biotransformación de la AFB1 ocurre a

través de citocromos P450, encontrándose a las citocromo 1A1, 2A3, 2B7, 2C8, 2K1 y

3A3/4 implicadas en la activación hepática y producción de AFBO (Klein et al., 2003). En

17

humanos se han reportado estas mismas citocromos como agentes bioactivadores de la

AFB1 (Doi et al., 2002; Omiecinski et al, 1999) al igual que a la CYP2A6 (Pelkonen et al.,

2000).

Las enzimas citocromo P450 aviares parecen ser del mismo tipo de aquellas encontradas en

mamíferos, incluyendo la especie humana. Por ejemplo, estudios realizados por Nebbia et

al. (2003) demostraron la presencia de CYP2B1, 3E1, 1A1 y 3A4 en pollos. Asimismo,

Gorman et al. (1998), realizando “immunoblots” de microsomas extraídos de embriones de

pato y pollo encontraron la presencia de otólogos CYP1A1, 1A2, 1A4 y 1A5.

En pavos, especie altamente sensible a los efectos adversos de las aflatoxinas se ha

atribuido el efecto tóxico a la actividad de las enzimas CYP1A1 y 3A4, capaces de

biotransformar la AFB1 a su forma epóxido (Klein et al. 2000). En esta especie se ha

demostrado que el efecto es más pronunciado en aves jóvenes que en adultas y se ha

demostrando que cantidades relativamente bajas de AFB1 presentes en el alimento pueden

llegar a causar efectos deletéreos (Klein et al. 2002). También se ha encontrado un ortólogo

aviar de la citocromo 1A5 humana que ha presentado actividad metoxiresorufin O-

dealquilasa y oxidación del AFB1 (Yip y Coulombe Jr., 2006), lo cual ayuda a explicar la

alta susceptibilidad de los pavos, ya que el efecto de la aflatoxina depende de su oxidación

a la forma exo-epóxido.

En embriones de pollos como de patos y pavos se ha demostrado actividad EROD

(etoxiresorufin orto-deetilasa), los cual indica la presencia de citocromos 1A que no

necesariamente corresponden a ortólogos a los de mamíferos, pero que presentan una

actividad enzimática similar (Brunström y Halldin, 1998). Yip y Coulombe (2006)

demostraron la presencia de un ortólogo de pollos en pavos, la CYP1A5, con capacidad

tanto de oxidar la AFB1 a su forma epóxido como de producir AFM1. En patos, pollos,

pavos y codornices se demostró la capacidad de biotransformación de la AFB1 a su forma

AFBO (Lozano y Díaz, 2005), pero no se determinó cual o cuales de los ortólogos aviares

eran los responsables de la transformación de la aflatoxina a su forma epóxido.

Aunque las aflatoxinas y sus efectos tóxicos se conocen desde los años sesenta (Newberne

y Butler; 1969; Patterson, 1973), las enzimas responsables de su metabolismo en algunas

especies de mamíferos y en muchas especies aviares (especialmente pollos, patos, pavos y

18

codornices) no han sido caracterizadas de manera completa. Por esto es necesario investigar

cuales enzimas de la superfamilia de las citocromos P450 son las responsables del

metabolismo y bioactivación de la AFB1 en especies aviares de interés comercial.

Citocromos P450 (CYP450)

Las enzimas citocromo P450 son monooxigenasas, es decir, son enzimas que catalizan

reacciones en las cuales un átomo de oxígeno del oxígeno molecular (O2) es insertado en un

sustrato, mientras el otro átomo es reducido a agua. La estequiometria general de la

hidroxilación del sustrato por las citocromo P450 se representa en la siguiente ecuación:

NAD(P)H + H+ + O2 + R-H → NAD(P)+ + R-OH + H2O.

Las citocromo P450 son una gran familia de hemoproteínas involucradas en diferentes tipos

de reacciones oxidativas, distribuidas ampliamente en los grandes dominios de organismos

(archaea, bacteria y eucariotes) (Munro et al. 2007). Las enzimas citocromo P450 están

entre las proteínas con actividad REDOX más versátiles conocidas hasta ahora y catalizan

principalmente reacciones de hidroxilación de cadenas carbonadas, oxigenación de

heteroátomos, dealquilación y formación de epóxidos (Fig. 3) (Isin y Guenguerich, 2007).

Las CYP450 son muy conocidas por su papel en el metabolismo de medicamentos y en la

detoxificación de xenobióticos ya que la hidroxilación de estos compuestos por las P450s

les confiere mayor solubilidad para facilitar su excreción. Varias de estas enzimas se

pueden encontrar en microsomas y su expresión es inducida por una gran variedad de

moléculas orgánicas (Josephy, 1997). También intervienen en el metabolismo de hormonas

sexuales, vitamina D y ácidos biliares en mamíferos, ecdisona en insectos (Poulos, 2003),

terpenos en plantas y juegan un papel importante en microorganismos en el uso de varios

compuestos orgánicos como fuente de carbono y en la obtención de importantes productos

naturales como los antibióticos (Urlacher y Eiben, 2006).

19

Figura 3. Reacciones catalizadas por monooxigenasas P450: a. hidroxilación de ácidos

grasos. b. epoxidación de estireno. c. hidroxilación de compuestos aromáticos. d.

deetilación de 7-etoxicumarina. e. acoplamiento de fenol en la biosíntesis de vancomicina.

f. ruptura de un enlace acil-carbono en la demetilación de lanosterol (Tomado de Urlager y

Eiben, 2006).

Las citocromo P450 humanas tienen un peso molecular que oscila entre 40 y 50 KDa y

contienen un solo grupo heme. Se encuentran ancladas a membrana a excepción de algunas

que se encuentran solubles en el citosol (por lo general de microorganismos). La mayoría

de estas enzimas responsables del metabolismo de compuestos endógenos se encuentran en

las membranas de órganos esteroidogénicos como las glándulas adrenales, testículos,

ovarios y placenta. Las P450 relacionadas con la oxidación de xenobióticos están

ampliamente distribuidas con altas concentraciones presentes en el retículo endoplasmático

liso de células específicas del hígado, riñón, pulmón, cavidades nasales e intestinos, además

de presentarse en niveles importantes en otros tejidos (Josephy, 1997).

20

En general, aquellas P450s relacionadas con el metabolismo de compuestos endógenos,

como por ejemplo los esteroides, son muy específicas. Sin embargo, las citocromos

encargadas de la biotransformación de xenobióticos no lo son y son capaces de hidroxilar

una gran variedad de diversos compuestos sin ninguna relación estructural entre sí (Poulos,

2003; Urlacher y Eiben, 2006). Un tema importante sobre la actividad enzimática de las

P450s es entender como pueden adaptarse y acomodarse a diferentes sustratos teniendo en

cuenta la restricción que implica poseer el mismo tipo de plegamiento en todas las P450s.

La primera estructura obtenida de una CYP450 (Poulos et al., 1987) representó un

rompecabezas complejo en el que se pudo demostrar como la forma del sustrato accede a

un sitio activo inaccesible al exterior de la proteína (Figura 4). Interpretando su estructura

se encontró que ciertas α-hélices (F y G) y el “loop” que las conecta le confieren cierta

flexibilidad y presentan un movimiento abierto/cerrado que permite la entrada de los

sustratos y la salida de los productos (Poulos, 2003; Urlacher y Eiben, 2006).

Figura 4. Diagrama esquemático de la citocromo P450 BM-3 en su conformación

parcialmente abierta. Se indican las hélices F y G y el “loop” que las une. Estas hélices se

deslizan sobre la superficie de la hélice I, lo que permite el movimiento abierto/cerrado

para el acceso al sitio activo (Tomado de Poulos, 2003).

21

La estructura cristalina de algunas CYP450 se ha dilucidado, como la CYP2D6 (Rowland

et al., 2006) y la 3A4 (Ekroos y Sjögren, 2006; Yano et al., 2004) donde basado en los

alineamientos de secuencias se ha corroborado la existencia de este plegamiento general

constante entre las enzimas P450.

Aunque la homología en secuencia entre las proteínas P450 entre grupos taxonómicos es

comúnmente baja y puede ser menor del 20%, el creciente número de estructuras cristalinas

obtenidas de enzimas P450 ha demostrado que esta inusual variabilidad no excluye el

hecho de encontrar una gran conservación en la topografía general de estas proteínas y en

su plegamiento estructural (Urlacher y Eiben, 2006; Werck-Reichhart y Feyereisen, 2000),

razones que sugieren la probabilidad de encontrar ortólogos aviares de las CYP450

humanas con actividades catalíticas semejantes.

Clasificación de las enzimas CYP450

Las P450 han sido clasificadas en cuatro clases dependiendo de la forma como los

electrones provenientes del NAD(P)H son entregados al sitio catalítico. Las enzimas de la

clase I requieren tanto de una reductasa con dominio FAD como de una hierro-azufre

reductasa. La clase II (donde se encuentran las CYP450 de mamíferos y aves) solo requiere

de P450 reductasa con dominio FAD/FMN para la transferencia de los electrones. Las de la

clase III son autosuficientes y no requieren de un donador de electrones ya que catalizan el

rearreglo o la deshidratación de alquilhidroperóxidos o alquilperóxidos inicialmente

generados por dioxigenasas. Las P450 de la clase IV reciben electrones directamente del

NAD(P)H (Werck-Reichhart y Feyereisen, 2000).

La localización de las diferentes citocromos varía considerablemente. Todas las P450s de

procariotes son proteínas solubles mientras que la clase I de eucariotes se encuentran

asociadas con la membrana interna de la mitocondria y catalizan varios pasos en la

biosíntesis de hormonas esteroidales y vitamina D en mamíferos. Las P450 mitocondriales

también han sido encontradas en insectos y nemátodos, pero no en plantas. La clase II son

las más comunes en eucariotes. Tanto las P450s como las NADPH-P450 reductasas se

encuentran disociadas y se encuentran independientemente ancladas en la cara externa del

retículo endoplasmático por el extremo amino terminal. Tanto la clase I como la II de todos

22

los organismos participan en la detoxificación y en algunos casos la activación de

xenobióticos. Se ha demostrado su contribución en eventos carcinogénicos y son

determinantes en el metabolismo, tolerancia, selectividad y compatibilidad de

medicamentos y pesticidas (Tabla 3) (Werck-Reichhart y Feyereisen, 2000).

Nomenclatura de las enzimas CYPP450

La dificultad en purificar enzimas con formas estrechamente relacionadas entre sí como las

CYP450 hace que su estudio mediante la “bioquímica clásica” se haga muy complicado,

mientras la biología molecular ha brindado más herramientas para su clasificación. En los

años 80 se obtuvieron cDNAs para P450s inducidas en roedores por tratamientos con

agentes como el fenobarbital o la β-naftoflavona y el análisis de estas secuencias permitió

el desarrollo de una nomenclatura más clara para las P450.

En el pasado la nomenclatura se basaba en la movilidad electroforética, el λmax del

cromóforo o la especificidad en el sustrato encontrada por diferentes laboratorios, donde la

misma enzima era identificaba con diferentes nombres. Esta nomenclatura ha sido

modificada por un enfoque más sistemático y evolutivo. De esta forma, dos enzimas que

difieren muy poco en secuencia como las CYP2B1 y 2B2 se espera que tengan gran

semejanza estructural y funcional, mientras que enzimas con secuencias diferentes se

espera que no mantengan tal similitud. Así, se han asignando a la misma familia aquellas

enzimas que tengan homología en secuencia mayor al 40%. Si esta homología es mayor al

55% se consideran miembros de la misma subfamilia. Las enzimas individuales se

identifican por el número de la familia, la letra de la subfamilia y finalmente el número que

identifica la enzima dentro de la subfamilia (Tabla 4). Además, una forma de abreviar la

nomenclatura de estas enzimas es reemplazando citocromo P450 por las letras CYP450

(Josephy, 1997).

23

Tabla 3. Sustratos metabolizados por enzimas citocromo P450 en humanos (adaptado de

Omiecinski et al., 1999). Enzima/Sustratos

endógenos

Xenobióticos

activados

Xenobióticos

metabolizados

Inducibilidad Inhibidores

CYP1A1

Oxidación de ω-2

prostaglandina, 6β-

hidroxilación,

hidroxilación de17β-

estradiol-C2.

Benzo[a]pireno,

hidrocarbonos

policíclicos

aromáticos

7-etoxicumarina, 7-

etoxiresorufin, R-

warfarina 8-

hidroxilación

3-MC; βNF; TCDD;

omeprazol;

tabaquismo; algunos

vegetales

9-OH-ellipticina; 7,8-

benzoflavona; apigenina.

CYP1A2

hidroxilación de 17β-

estradiol-C2;

oxidación de

prostaglandina ω-1;

hidroxilación de

testosterona 6β.

2-AAF;

acetaminofen;

aflatoxina B1; MeIQ;

PhIP

Cafeína; 7-

etoxiresorufin;

fluoroquinolona 3´-

hidroxilación;

imipramina; 7-

metoxiresorufin;

fenacetina; teofilina;

tacrina; R-warfarina 6-

hidroxilación

3-MC; βNF; TCDD;

tabaquismo, algunos

vegetales

Furafilina; enoxacina; 7,8-

benzoflavona; fluvoxamina;

isosafrol; apigenina

CYP2A6

Aflatoxina B1;

Benzo[a]pireno;

nicotina; N-nitroso-

dietilamina; NNK

1,3-butadieno;

cumarina

Dietilditiocarbamato, 8-

metoxipsoraleno, mentofurano

CYP3A4

Hidroxilación de

testosterona 6β

(mayoría), 2β, 6α, 18,

16β, 15β;

hidroxilación de

cortisol 6β;

hidroxilación de

androstenediona 6β;

progesterona; DHEA -

3-sulfato; 17β-

estradiol-2-

hidroxilación

Acetaminofen;

aflatoxina B1;

Benzo[a]pireno 7,8-

dihidrodiol;

ciclofosfamida;

ifosfamida

Alfentanil,

aminodarona,

antipirina,

carbamazepina,

cloropromazina,

claritromicina,

clozapina, ciclosporina

A, dapsona,

dexametasona,

diazepam, diltiazem,

eritromicina,

etinilestradiol,

fluvastatina,

imiquimod, indinavir,

lidocaína, lovastatina,

midazolam, nelfinavir,

nifedipina, omeprazol,

Fenobarbital,

dexametasona,

rifampina, fenitoina,

carbamazepina

Triacetiloleandomicina (TAO),

claritromicina, eritromicina,

gestoden, midazolam,

ketoconazol, clotromazol,

naringenina,

Tabla 4. Diferentes formas de citocromos P450 relacionadas con el metabolismo de

xenobióticos. Abreviaturas: AAF=2-acetilaminofluoreno, EROD=etoxiresorufin O-

24

deetilasa, PB=fenobarbital, PAH=hidrocarburo aromático policíclico, TCDD=2,3,7,8-

tetraclorodibenzodioxina, β-NF=β-naftoflavona, IQ=2-amino-3-metilimidazol[4,5-

f]quinolina (Adaptado de Josephy, 1997).

Familia

P-450 Enzima

Nombres antiguos Sustrato típico o actividad

Rata Ratón Conejo

1 1A1 c P1 LM6 EROD, aril hidroxilasa

1A2 d P3 LM4 2-AAF, IQ, N-hidroxilación

2

2A1 a Testosterona, 7α-hidroxilasa (metabolismo esteroides)

2B1 b LM2 Hexobarbital, PB

2D6 UT-H Debrisoquinona, esparteina

2E1 j LM3a Dimetilnitrosamina, nifedipina

3 3A4 p nifedipina

4 4A1 P-452 Ω-hidroxilasa

Usos y aplicaciones de las CYP450

Tradicionalmente las P450 han sido aplicadas en la determinación del efecto de

medicamentos y otros xenobióticos en su actividad in vivo y en la producción de

metabolitos de carácter tóxico. Durante la década de los 90’s las P450 microbianas y

recientemente las de mamíferos han sido investigadas respecto a la producción de

químicos, fragancias, compuestos farmacéuticos y también su uso en biorremediación

(Figura 5) (Urlager y Eiben, 2006).

25

Figura 5. Aplicaciones y uso de las monooxigenasas P450 (Tomado de Urlager y Eiben,

2006).

Medición de la actividad de las citocromos P450

Si se desea hacer un estimativo de la actividad total en una muestra que contiene múltiples

citocromos P450, el ensayo ideal debe estar basado en un compuesto que sea un sustrato

comparable para todas las enzimas presentes. Sin embargo, ese “sustrato universal” no

existe. Por otra parte, si se decide determinar la actividad de una forma específica de

enzima (isoenzima) el ensayo debe fundamentarse en un compuesto que es sustrato sólo

para esa enzima. De nuevo, se disponen solo de sustratos enzima-específicos para algunas

formas de CYP450 (Tabla 3). Una forma de resolver la falta de sustratos enzima-

específicos es usar un solo sustrato que produzca varios metabolitos, cada uno de los cuales

es producido con cierta selectividad por un subgrupo de enzimas. La cuantificación de los

metabolitos producidos en la mezcla total separados, por ejemplo, por cromatografía

líquida de alta eficiencia (HPLC,) genera una estimación simultánea de las actividades de

26

varias enzimas. En resumen, no existe un ensayo universal para medir la actividad

enzimática de las P450, especialmente en fuentes crudas como microsomas hepáticos

(Josephy, 1997).

Aunque las citocromos en mamíferos y aves no son estrictamente ortólogos, se han

encontrado algunos inhibidores e inductores de expresión para algunas de estas enzimas

comunes a ambos grupos de vertebrados (Chauret et al., 1997) e inclusive peces (Renault et

al., 1999). Una de las principales ventajas de usar inhibidores selectivos de P450s

individuales es la posibilidad de observar en qué proporción cada P450 es responsable de

una reacción específica (Halpert et al., 1994; Pelkonen et al., 2008). Así, el uso de

inhibidores más o menos específicos y determinación de su efecto sobre la reacción de

interés se ha utilizado como estrategia muy importante en la identificación de enzimas

relacionadas con la transformación de sustratos específicos (Appiah-Opong et al, 2007;

Donato et al, 2004; Henderson et al, 2000; Peng et al, 2004).

El uso de sustratos prototipo y la determinación de su correlación con el metabolismo del

sustrato a investigar ha sido otra estrategia en muchos casos de gran ayuda para dilucidar el

papel de una enzima en la activación o transformación de sustratos (Kenworthy et al, 1999;

McManus et al, 1984; Quintieri et al, 2005; Sy et al, 2001;). De forma similar, la

cuantificación de la expresión de la proteína mediante immunoblot y la determinación de su

correlación con la actividad enzimática sobre el sustrato a investigar se ha utilizado como

alternativa complementaria a la correlación de actividades enzimáticas y uso de inhibidores

(Díaz y Squires, 2000).

Debido a que el conocimiento actual acerca de las enzimas involucradas en la

biotransformación de diferentes tóxicos y fármacos y su modulación en especies aviares de

producción es insuficiente (Šavlík et al., 2007) es necesario utilizar las herramientas que se

encuentren disponibles para profundizar en el conocimiento del papel de los ortólogos

CYP450 aviares en la transformación de xenobióticos como la AFB1 a formas tóxicas para

la salud animal.

27

OBJETIVO GENERAL

Identificar las enzimas citocromo P450 relacionadas con el metabolismo fase I de la

aflatoxina B1 (AFB1) en pollo (Gallus domesticus), pavo (Melleagridis gallopavo), pato

(Anas platyrhynchos) y codorniz (Coturnix japonica).

OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Determinar las condiciones óptimas de separación de sustratos prototipo y productos de

biotransformación utilizando la técnica de HPLC.

• Correlacionar la actividad enzimática de las diferentes citocromo P450 frente a la AFB1

y a diferentes sustratos prototipo.

• Identificar la actividad enzimática específica de las citocromo P450 involucradas en la

biotransformación de la AFB1 utilizando inhibidores específicos.

• Detectar ortólogos aviares por la técnica de Western Blot.

28

HIPOTESIS

En diferentes especies de mamíferos y en aves se ha demostrado la capacidad de

biotransformación de la aflatoxina B1 a su forma epóxido por parte de las CYP450. En

mamíferos estas enzimas han sido claramente identificadas y en pavos se han reportado la

CYP1A2 y la CYP3A4 como responsables. Sin embargo, debido a la falta de un mayor

conocimiento en aves de interés comercial como pollos, patos, pavos y codornices es

importante investigar el papel de los ortólogos aviares de citocromos P450 reportadas como

responsables en mamíferos del metabolismo de la aflatoxina B1. La hipótesis que se plantea

es que los ortólogos aviares de las enzimas CYP1A1/2, 2A6 y 3A4 metabolizan la

aflatoxina B1 a su forma epóxido, al igual que en humanos y mamíferos.

La estrategia a utilizar consiste en relacionar funcionalmente la actividad enzimática de los

diferentes ortólogos frente a diferentes sustratos prototipo específicos con el metabolismo

hepático fase I de la aflatoxina B1 in vitro. Específicamente se determinarán las actividades

etoxiresorufina etoxiresorufina-O-deetilasa (EROD) para las citocromos 1A1/2, 7-

metoxiresorufina-O-demetilasa (MROD) para la citocromo 1A2, 7-coumarina-O-

hidroxilasa para la citocromo 2A6, nifedipina oxidasa para la citocromo 3A4 y

debrisoquinona-4-hidroxilasa) para la citocromo 2D6. Adicionalmente, se emplearán

inhibidores específicos para CYP450 humanas como la α-naftoflavona (CYP 1A1/2),

furafilina (CYP 1A2), 8-metoxipsoralen (CYP 2A6) y troleandromicina (CYP 3A4) con los

cuales se busca determinar su efecto en la producción de la forma epóxido de la aflatoxina.

Por último se tendrá en cuenta la cantidad relativa de cada citocromo en los microsomas

hepáticos mediante la técnica de Immunoblot para correlacionarla con la actividad AFB1

epoxidasa de los mismos citocromos. Se espera que la información suministrada por la

utilización de estas tres estrategias distintas sirva para determinar cuales citocromo P450

están involucradas en la bioactivación de la aflatoxina B1 a su forma más tóxica.

29

MATERIALES Y METODOS

Reactivos

Los siguientes reactivos fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA):

AFB1, AFB2α, tween 20, glucosa 6-fosfato sal sódica, nicotinamida dinucleótido fosfato

(NADP+), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, ácido etilendiamintetracético (EDTA), ácido

bicinconínico, sulfato de cobre, sacarosa, glicina, glicerol, albúmina sérica bovina (BSA),

metoxiresorufina, α-naftoflavona, 8-metoxipsoralen, troleandomicina y 7-hidroxicumarina.

El Cloruro de sodio y el cloruro de magnesio hexahidratado se obtuvieron de Mallinckrodt

Baker (Phillipsburg, NJ, USA). El fosfato monobásico de sodio monohidratado y el fosfato

de sodio bibásico anhidro se obtuvieron de Merck (Darmstadt, Germany). La furafilina, la

nifedipina, nifedipina oxidada y los citocromos humanos CYP1A1, 1A2, 2A6 y 3A4 se

obtuvieron de BD-Biosciences (San José, CA, USA). La debrisoquinona sulfato, 4-

hidroxidebrisoquinona sulfato, cumarina, etoxiresorufina y resorufina sal sódica se

obtuvieron de MP Biomedicals (Solon, OH, USA). Los anticuerpos primarios (IgG de

conejo anti-CYP450 humanas) contra las citocromos 1A1, 1A2, 2A6 y 3A4 se obtuvieron

de AbCam (Cambridge, MA, USA). Los patrones de bajo peso molecular preteñidos

(fosforilasa B 106.5 KDa, albumina sérica bovina 97.6 KDa, ovoalbúmina 50.2 KDa,

anhidrasa carbónica 36.9 KDa, inhibidor de tripsina de soya 28.9 KDa y lisozima 19.9

KDa), membrana de PVDF, papel filtro, solución de acrilamida/bisacrilamida al 30%

(29:1), persulfato de amonio, TEMED, azul de bromofenol, kit de detección Opti-4CN IgG

de cabra contra IgG de conejo y dodecil sulfato de sodio (SDS) se obtuvieron de BioRad

(Hércules, CA, USA). El metanol, acetonitrilo, agua y otros solventes para la preparación

de las fases móviles se adquirieron de grado HPLC.

Obtención de las muestras de hígado

Todos los experimentos se realizaron a 4ºC a partir de microsomas obtenidos de muestras

de hígado de cada especie de ave. Los hígados se obtuvieron de 6 machos y 6 hembras de

aves adultas en buen estado de salud correspondientes a pavos (Melleagridis gallopavo) de

seis semanas de edad, codornices (Coturnix japonica) de siete semanas de edad, patos

30

(Anas platyrhynchos) raza Pekín de siete semanas de edad y pollos (Gallus domesticus) de

siete semanas de edad. Las aves se sacrificaron y los hígados se extrajeron inmediatamente,

se lavaron con PBS (fosfatos 20 mM, pH 7.4, NaCl 100 mM) y se almacenaron a -70ºC

hasta el momento de la extracción de los microsomas.

Obtención de microsomas

Para la obtención de los microsomas las muestras de hígado se descongelaron parcialmente,

se lavaron con abundante PBS frío (fosfatos 20 mM pH 7.4, NaCl 100 mM) y se secaron

suavemente. Se pesaron aproximadamente 5 g de la muestra fresca en tubos de centrifuga

mantenidos en hielo. Posteriormente se adicionaron 10 mL del buffer de extracción (PBS,

EDTA disódico 1 mM, sacarosa 250 mM) por cada 5 gramos de peso del tejido en relación

1:2. Se homogenizó por 30 segundos en un homogenizador de tejidos Cat X120 (IKA

Ultra-Turrax, Staufen, Alemania) y se centrifugó a 4°C por 30 minutos a 10000 x g. Luego

se transfirió el sobrenadante (volumen aproximado = 10 mL) a un tubo de ultracentrífuga

mantenido en hielo y se centrifugó por 90 minutos a 98000 x g.

Los sobrenadantes se separaron en alícuotas para ensayos posteriores y a cada pellet se

adicionó 3 mL de buffer de almacenamiento (buffer fosfatos 20 mM pH 7.4, EDTA

disódico 1 mM, sacarosa 250 mM, 20% de glicerol) se desprendió cuidadosamente de las

paredes del tubo con una espátula delgada y se transfirió a un homogenizador de tejidos

manual, donde se resuspendió el pellet completamente. La suspensión microsomal se

fraccionó en tubos de microcentrífuga que se almacenaron a -70°C hasta su posterior

utilización. Se dejó una alícuota para determinar el contenido de proteína.

Determinación de proteína en microplaca por el método del ácido bicinconínico.

La cuantificación de proteína se realizó por el método del acido bicinconínico adaptado

para microplacas (Smith et al., 1985; Redinbaugh and Turley, 1986). Para la determinación

de proteína se tomaron 20 µL de una dilución 1:10 de cada muestra de microsomas por

pozo y por duplicado. Para la curva de calibración se tomaron diferentes volúmenes de

estándar de BSA (albúmina sérica bovina) de concentración 1 mg/mL (2, 5, 10, 15 y 20 µL)

por duplicado y se completo a un volumen total de 20 µL con buffer fosfato 20 mM pH 7.4.

31

Luego se adicionaron 200 µL de reactivo de trabajo por pozo, el cual consta de una parte

del reactivo A (solución de sulfato de cobre pentahidratado al 4%) y 50 partes del reactivo

B (solución de ácido bicinconínico que contiene ácido bicinconínico, carbonato de sodio,

tartrato de sodio y bicarbonato de sodio en NaOH 0.1 N pH 11.25). Se incubó a 37°C por

30 minutos y se midió la absorbancia a 562 nm vs blanco.

Determinación de la actividad enzimática frente a sustratos prototipo

La determinación de la actividad enzimática de los microsomas se realizó en tubos de

microcentrífuga de 1.5 mL, cada incubación conteniendo glucosa 6-fosfato 5 mM, NADP+

0.5 mM, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa 0.5 UI y 2 µL de sustrato en DMSO equivalente

al 0.8% de fase orgánica en incubación (Busby et al., 1999), diferentes concentraciones de

proteína microsomal (20 µg para codornices, 50 µg para pavos, 75 µg para patos y 100 µg

para pollos) y buffer de incubación (buffer fosfato 50 mM pH 7.4, MgCl 5 mM, EDTA 0.5

mM) hasta un volumen de 250 µL. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 10 minutos

a 39ºC .Las reacciones se detuvieron con 250 µL de acetonitrilo a -20ºC (Blanchard, 1981),

luego de lo cual se centrifugó a 12.000 x g por 10 minutos. Una alícuota del sobrenadante

se analizó por HPLC como se describe en la sección de condiciones cromatográficas. La

cantidad de producto formado se cuantificó utilizando una curva de calibración con un

estándar del producto de cada actividad. Debido a la inestabilidad de la forma epóxido de la

AFB1 y su rompimiento a una forma más estable conocida como AFB1 dihidrodiol (dhd-

AFB1), la cantidad de epóxido formado se estimó por la cantidad de dhd-AFB1 presente en

la incubación. Como el dhd-AFB1 no se encuentra disponible comercialmente, la

cuantificación de este se realizó utilizando como estándar la aflatoxina B2α (AFB2α) debido

a sus características fluorométricas y espectrales semejantes (Neal et al, 1981) de acuerdo

con la metodología descrita por Lozano y Díaz (2005).

Condiciones cromatográficas (HPLC)

Las siguientes actividades enzimáticas prototipo se determinaron por cromatografía liquida

de alta eficiencia (HPLC): 7-etoxiresorufin-O-deetilasa (EROD) para las citocromos

1A1/1A2, 7-metoxiresorufin-O-demetilasa (MROD) para la citocromo 1A2, cumarina 7-

32

hidroxilasa para la citocromo 2A6 (Dierks et al., 2001), debrisoquinona 4-hidroxilasa para

la citocromo 2D6 y oxidación de nifedipina para la citocromo 3A4. La cantidad de

producto formado por cada actividad enzimática se cuantificó en un equipo Shimadzu

Prominence System (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD, USA) equipado con

un degasificador DGU-20A3, una bomba LC-20AB, un automuestrador SIL-20A HT, un

horno para columna CTO-20A, un detector UV/visible SPD-20AV, un detector de

fluorescencia RF-10A XL y un integrador CBM-20A, todos controlados por computador

utilizando el programa “LC Solutions”. Las separaciones se llevaron a cabo utilizando una

columna Alltech Alltima HP C18 5 µm de 150 mm x 3.0 mm de diámetro (Alltech

Associates Inc., Deerfield, IL, USA).

La separación de etoxiresorufina y resorufina (actividad 7-etoxiresorufina-O-deetilasa) se

llevó a cabo a temperatura ambiente a un flujo de 0.3 mL/min usando una fase móvil

isocrática consistente de 30% buffer fosfato (20 mM pH 7.4) y 70% metanol. Los analitos

se detectaron por fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 530 nm y de 580

nm de emisión (Leclercq et al., 1996; Mdegela et al., 2006). De cada incubación se realizó

una dilución 1:10 en agua y se inyectó un volumen de 5 µL en el cromatógrafo.

La separación de metoxiresorufina y resorufina (actividad 7-metoxiresorufin-O-demetilasa)

se realizó bajo las mismas condiciones cromatográficas utilizadas para la separación de la

etoxiresorufina y resorufina. De cada incubación se realizó una dilución 1:10 en agua y se

inyectó un volumen de 2 µL en el equipo.

La separación de la cumarina y su producto de biotransformación hidroxilado 7-

hidroxicumarina (actividad cumarina 7-hidroxilasa) se realizó a temperatura ambiente a un

flujo de 0.4 mL/min con una fase móvil isocrática consistente de 30% acetonitrilo y 70%

agua. Ambos analitos se monitorearon usando detección por fluorescencia a longitudes de

onda de excitación y de emisión de 325 y 452 nm respectivamente (Fink y Hoehler, 1970).

De cada incubación se realizó una dilución 1:100 en agua y se inyectó un volumen de 5 µL.

La separación de la debrisoquinona y la 4-hidroxidebrisoquinona (actividad debrisoquinona

4-hidroxilasa) se llevó a cabo a temperatura ambiente a un flujo de 0.3 mL/min con una

fase móvil isocrática consistente de 30% de metanol, 70% agua y 0.1% de acido fórmico.

33

La detección se realizó por fluorescencia a longitudes de onda de excitación y de emisión

de 210 y 290 nm respectivamente (Granvil et al., 2002; Pereira et al., 2000). De cada

incubación se inyectó un volumen de 5 µL sin diluir.

La separación de nifedipina y su producto oxidado se llevó a cabo a temperatura ambiente a

un flujo de 0.5 mL/min con una fase móvil isocrática consistente de 32% acetonitrilo y

68% agua. Los analitos se monitorearon por detección ultravioleta a una longitud de onda

de 270 nm (Shim et al., 1988). De cada incubación se inyectó un volumen de 5 µL sin

diluir.

La separación de la AFB1 y su producto de biotransformación AFBO en su forma dhd-

AFB1 se llevó a cabo a una temperatura de 40ºC y un flujo de 0.35 mL/min. La elución se

realizó en un gradiente lineal con A: agua y B: metanol acidificados con acido fórmico al

0.1%, de la siguiente manera: 0 minutos: 30% B; 7 minutos: 55% B; 7.01 minutos: 30% B;

14 minutos: 30% B. La detección de los analitos se realizó por fluorescencia a longitudes

de excitación y emisión de 365 y 425 nm, respectivamente (Gallagher et al., 1996; Lozano

y Díaz, 2005; Majerus y Zakaria, 1992). De cada incubación se realizó una dilución 1:100

en agua y se inyectó un volumen de 2 µL en el cromatógrafo.

Determinación de parámetros enzimáticos (KM y Vmax).

Para la estimación de los parámetros enzimáticos (KM – constante de Michaelis-Menten;

Vmax – velocidad máxima de producción) se tomaron 5 diferentes concentraciones de

sustrato específicos para citocromos P450 humanos. En la actividad 7-etoxiresorufina-O-

deetilasa (EROD) (CYP 1A2 y 1A1) se evaluaron concentraciones desde 4.8 µM a 0.3 µM

de etoxiresorufina. Para la actividad cumarina 7-hidroxilasa (CYP 2A6) desde 80 µM a 5

µM de cumarina. En la actividad 7-metoxiresorufina-O-deetilasa (MROD) (CYP 1A2)

desde 5.88 µM a 0.36 µM de metoxiresorufina. En la oxidación de nifedipina (CYP 3A4)

desde 71.0 µM a 4.4 µM de nifedipina. En la epoxidación de AFB1 se utilizaron

concentraciones desde 256 µM a 16 µM de AFB1. Para la actividad debrisoquina-4-

hidroxilasa (CYP2D6) (Eiermann et al. 1998; Yuan et al., 2002) se realizaron ensayos a

una concentración de 508.8 µM para determinar si existía actividad 2D6 en los

microsomas. Para establecer la posible participación de los ortólogos aviares en el

34

metabolismo de la AFB1 se correlacionó la actividad de las diferentes citocromo frente a los

sustratos prototipo (Stresser et al. 2002; Morse et al., 1999) contra la biotransformación de

la AFB1.

Uso de inhibidores específicos contra diferentes citocromos

Con el fin de obtener mayor información sobre el papel de cada ortólogo aviar en la

biotransformación de la AFB1 se utilizaron cuatro diferentes inhibidores específicos para

las CYP450 humanas: α-naftoflavona (CYP1A1/2) en concentraciones en incubación desde

22.95 µM hasta 1.43 µM, 8-metoxipsoralen (CYP2A6) desde 92.5 µM hasta 2.8 µM,

troleandromicina (CYP3A4) desde 122.8 µM hasta 7.6 µM (Pelkonen et al., 2008) y

furafilina (CYP1A2) desde 384.2 µM hasta 24 µM. Se adiciono 1µL de inhibidor en

DMSO para la α-naftoflavona y el 8-metoxipsoralen y 4 µL de inhibidor en DMSO para la

furafilina y la troleandomicina debido a su baja solubilidad a altas concentraciones del

inhibidor en la solución de incubación, más 1 µL se AFB1 en DMSO. Cada inhibidor se

probó en tres muestras de microsomas seleccionadas aleatoriamente de cada especie de ave

y de sexo, con cada incubación realizada por duplicado.

Cuantificación de la expresión de CYP450 aviares por la técnica de Western Blot.

La expresión de los diferentes citocromos en las cuatro especies de aves se cuantifico por la

técnica de Western Blot. Para la realización de los Immunoblot de las citocromo CYP1A1,

1A2 y 2A6 se utilizaron 100 µg de proteína microsomal mientras que para la detección de

la CYP3A4 se utilizaron solamente 30 µg de proteína. Cada muestra se trató previamente

para eliminar el glicerol y las sales del buffer de almacenamiento por dilución en 200µL de

una solución de agua-metanol 20:80 para ser agitados por 1 minuto y centrifugados a 14000

x g durante 15 minutos. El pellet se resuspendió en 10µL de buffer muestra (Tris-HCl 7

mM, pH 6.8, SDS 1.5%, glicerol 20%, β-mercaptoetanol 5%, azul de bromofenol 0.02%)

para posteriormente ser calentado a 92ºC por 5 minutos. Posteriormente se separaron en un

gel SDS-PAGE (T=10%, C=3.3%) (Laemmli, 1970) a un voltaje constante de 150 V en

buffer de separación (Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8.8) por 80 minutos. Las proteínas

se transfirieron luego a una membrana de PVDF en buffer de transferencia Dunn-Carbonato

35

(NaHCO3 10 mM, Na2CO3 3 mM, pH 9.9) a un voltaje constante de 100 V durante 2.5

horas. Luego de la transferencia la membrana se bloqueó con PBS-leche en polvo

descremada al 5% por una hora a temperatura ambiente y agitación constante. A

continuación se incubó con el anticuerpo primario (IgG de conejo anti-P450 humana) en

una dilución 1:1000 en PBS-leche en polvo descremada al 5% durante toda la noche a 4ºC

y agitación constante. Finalmente se realizaron tres lavados con PBS-Tween 0.1% cada uno

de 5 minutos y se incubó con el anticuerpo secundario correspondiente a IgG de cabra anti-

IgG de conejo acoplada a peroxidasa preparado en una dilución 1:2000 en PBS-leche en

polvo descremada al 5% por una hora a temperatura ambiente y agitación constante. Se

lavó 3 veces con PBS-Tween 0.1% por cinco minutos cada lavado y luego se realizó el

revelado de la membrana con el kit de detección BioRad Opti-4CN “goat anti-rabbit” hasta

que las bandas se hicieran visibles. La reacción se detuvo lavando repetidamente con agua

destilada. Cada membrana se dejo secar y se escaneó posteriormente con el equipo BioRad

Gel Doc XR. Las imágenes se analizaron con el programa “BioRad Quantity One 1-D

analysis software” versión 4.6.3 con el fin de cuantificar la cantidad de proteína según la

intensidad de las bandas

.

Análisis estadístico

Los parámetros enzimáticos KM y Vmax se determinaron por regresión no lineal usando el

método de Marquardt, ajustando los datos al modelo de Michaelis-Menten: V= Vmax [S] /

(KM + [S]), en donde V es la velocidad de la reacción enzimática, [S] representa la

concentración de sustrato, Vmax la velocidad máxima de la reacción y KM representa la

constante de Michaelis-Menten (Marangoni, 2003; Bisswanger, 2008). La regresión se

ajustó utilizando la función de peso ω = 1/yiα, donde yi es la velocidad para cada

concentración de sustrato y α la magnitud de la relación entre los residuales y la varianza

(Kakkar et al., 1999; Marangoni, 2003).

La producción de la AFB1 epóxido debido a la acción de las P450 aviares en presencia de

las diferentes concentraciones de inhibidor se expresa como el porcentaje de inhibición

promedio respecto al control sin inhibidor ± la desviación estándar.

36

Para determinar la correlación entre la actividad de los ortólogos P450 aviares frente a la

AFB1 y la cantidad de cada citocromo presente en los microsomas determinada por

Western Blot y la correlación frente a los sustratos prototipo se calculó los

correspondientes coeficientes de correlación de Pearson. Los cálculos estadísticos se

llevaron a cabo en el programa estadístico SAS (SAS Institute, 2008).

37

RESULTADOS

Separación de sustratos prototipo y productos de biotransformación.

El uso de sustratos prototipo específicos para las citocromo P450 humanas demostró la

presencia de ortólogos aviares con actividades: AFB1 epoxidasa donde se identificaron

tanto la aflatoxina como su epóxido en forma de dihidrodiol (Fig. 6), 7-etoxiresorufina-O-

deetilasa (EROD) (CYP1A1/1A2) donde se separaron por HPLC tanto la etoxiresorufina

como su producto de biotransformación resorufina (Fig. 7), 7-metoxiresorufina-O-

demetilasa (MROD) (CYP1A2) con la respectiva separación de metoxiresorufina y su

producto resorufina (Fig. 8), cumarina 7-hidroxilasa (2A6) donde solo la 7-hidroxicumarina

y otro producto de biotransformación que no pudo ser identificado produjeron fluorescencia

a la longitud de excitación y emisión utilizadas (Fig. 9) mientras la cumarina solo es

detectable por UV a 325 nm (dato no reportado) y oxidación de nifedipina (CYP3A4) con

la detección por UV tanto de nifedipina como de nifedipina oxidada (Fig. 10). El uso de

debrisoquinona no demostró algún tipo de actividad debrisoquinona 4-hidroxilasa (2D6) en

codornices y pavos mientras en patos y pollos se detectaron trazas la producción de 4-

hidroxidebrisoquinona (Fig. 11). Tanto en el caso de patos como en el de pollos no se

realizaron las respectivas cinéticas e inhibiciones debido a la baja actividad presentada por

este ortólogo.

38

Figura 6. Cromatograma de la separación de AFB1 y su producto de biotransformación

dhd-AFB1. Tiempo de retención dhd-AFB1 =7.8 min. Tiempo de retención AFB1 =12.4

min.

Figura 7. Cromatograma de la separación de etoxiresorufina y su producto de

biotransformación resorufina. Tiempo de retención resorufina =3.7 min. Tiempo de

retención etoxiresorufina =7.3 min.

Figura 8. Cromatograma de la separación de metoxiresorufina y su producto de

biotransformación resorufina. Tiempo de retención resorufina = 3.7 min. Tiempo de

retención metoxiresorufin =5.9 min.

39

Figura 9. Cromatograma de la separación de 7-hidroxicumarina y un producto de

biotransformación desconocido. Tiempo de retención 7-hidroxicumarina = 4.1 min. Tiempo

de retención producto desconocido = 1.8 min.

Figura 10. Cromatograma de la separación de nifedipina y su producto de

biotransformación nifedipina oxidada. Tiempo de retención nifedipina oxidada =14.2 min.

Tiempo de retención nifedipina =16.7 min.

40

Figura 11. Cromatograma de la separación de debrisoquinona y su producto de

biotransformación 4-hidroxidebrisoquinona. Tiempo de retención 4-hidroxidebrisoquinona

= 4.0 min. Tiempo de retención debrisoquinona = 5.9 min.

Teniendo estandarizadas las condiciones para la separación de sustratos y productos se

continuó con la determinación de los parámetros enzimáticos KM y Vmax. A continuación se

resumen los resultados obtenidos para las diferentes especies aviares estudiadas.

Codorniz

Determinación de los parámetros enzimáticos KM y Vmax

El uso de diferentes concentraciones de sustrato prototipo permitió determinar los

parámetros enzimáticos (KM y Vmax) que se calcularon por regresión no lineal. Los valores

de los respectivos parámetros para cada sustrato por sexos se presentan en la tabla 5.

41

Tabla 5. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo, obtenidos con

microsomas de codorniz macho y hembra.

Sustrato

Machos Hembras

KM (µM) Vmax

(pmol .µg proteína-1. min-1) KM (µM)

Vmax

(pmol .µg proteína-1. min-1)

AFB1 27.9 3.4 52.0 4.6

Etoxiresorufina 0.4 0.3 0.50 0.2

Metoxiresorufina 1.9 0.7 2.9 0.60

Cumarina 4.9 1.6 4. 6 1.1

Nifedipina 3.0 5.3 2.6 3.9

Estudios de inhibición

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0

Biotransformación de AFB1 (% control)

Concentración de a‐naftoflavona (µM)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 100,0 200,0 300,0 400,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)

Concentración de furafilina (µM)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 30,0 60,0 90,0 120,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)

Concentración de troleandomicina (µM)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)

Concentración de 8‐metoxipsoralen (µM)

42



citocromos P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras

(n=6).

La adición de α-naftoflavona y 8-metoxipsoralen, inhibidores específicos de las citocromo

P450 humanas CYP1A1/2 y CYP2A6, respectivamente, resultó en una inhibición

significativa de la biotransformación de la aflatoxina B1 a su forma epóxido (Fig. 12).

Cuando se usaron los inhibidores furafilina (para CYP1A2) y troleandomicina (para

CYP3A4) no se observó disminución en la formación del epóxido (Fig. 12 y 13).

La α-naftoflavona inhibió la formación del epóxido de la AFB1 a todas las concentraciones

utilizadas, con porcentajes de biotransformación respecto al control de 34.7, 25.0, 25.1,

25.2 y 18.7% para concentraciones del inhibidor de 1.4, 2.9, 5.7, 11.5 y 23.0 µM

respectivamente. El uso de 8-metoxipsoralen resultó en reducción en la producción de

AFBO en todas las concentraciones de inhibidor utilizadas con porcentajes de

biotransformación de 23.5, 19.8, 15.5, 13.0 y 10.1% para concentraciones del inhibidor de

2.89, 5.78, 11.57, 46.2 y 92.5 µM respectivamente (Fig. 13).

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

7.7

15.4

30.7

61.4

122.8

Biotransfomación de AFB1 (% control)

Conc

entr

ació

n de

trol

eand

omic

ina

(µM

)

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

2.9

5.8

11.6

46.3

92.5


Conc

entr

ació

n de

8‐m

etox

ipso

rale

n(µM

)

*

*

*

*

*

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

24.0

48.0

96.0

192.1

384.2


Conc

entr

ació

n de

fura

filin

a (µ

M)

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

1.4

2.9

5.7

11.5

23.0

Biotransfomación de AFB1 (% control)

Conc

entr

ació

n de

α‐n

afto

flavo

na (

µM) *

*

*

*

*

43



citocromos P450 humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de

AFBO. Los valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin

inhibidor).

Correlación de las actividades frente a sustratos prototipo y la epoxidación de la aflatoxina

B1.

La epoxidación de la aflatoxina B1 se graficó versus las actividades de las citocromo P450

de codorniz frente a los diferentes sustratos prototipo (Fig. 14). Ninguna de las actividades

resultó ser significativa a un nivel del 5% , a pesar que el caso de la actividad cumarina 7-

hidroxilasa se encontró cerca de presentar relación, con un coeficiente de correlación de

Pearson de 0.56 y un valor P=0.057.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00

7-et

oxire

soru

fina-

O-d

eetil

ació

n (n

mol

de

reso

rufin

a. m

g pr

otei

na-1

. min

uto-1

)

Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epoxido. mg proteina-1 . minuto-1)

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00

7-m

etox

ireso

rufin

a-O

-dem

etila

ción

(n

mol

de

reso

rufin

a. m

g pr

otei

na-1

. min

uto-1

)


0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00

Cum

arin

a 7-

hidr

oxila

ción

(n

mol

de

7-hi

drox

icum

arin

a. m

g pr

otei

na-1

. min

uto-1

)


0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00

Oxi

daci

ón d

e ni

fedi

pina

(n

mol

de

nife

dipi

na o

xida

da. m

g pro

tein

a-1. m

inut

o-1)


44

Figura 14. Correlación de las actividad AFB1 epoxidasa y las diferentes actividades de las

CYP450 de codorniz con sustratos prototipo (n=12).

Detección de ortólogos humanos en microsomas de codorniz

La detección de los ortólogos presentes en microsomas de codorniz se realizó por la técnica

de Western Blot (Fig. 15). No se puso evidenciar la presencia de los ortólogos de la familia

1A por colorimetría debido a la baja sensibilidad de este método de revelado, en contraste a

sistemas de revelado más sensibles como la quimioluminiscencia donde se ha podido

detectar perfectamente este ortólogo (Klein et al., 2000; Verbrugge, et al., 2001; Yip y

Coulumbe, 2006). Los ortólogos 2A6 y 3A4 se detectaron perfectamente con pesos

moleculares de 53.8±1.4 KDa y 53.6±0.8 KDa respectivamente.

45

Figura 15. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de codorniz por la

técnica de Western Blot. Carriles 1 al 3: microsomas de machos. Carriles 4 al 6:

microsomas de hembras. Carriles 7 al 9: CYP450 humanas. Carril de la izquierda: patrones

de peso molecular.

Pavo

Determinación de parámetros enzimáticos KM y Vmax

El uso de sustratos prototipo con citocromos P450 de pavos demostró la presencia de

ortólogos aviares en esta especie. Los valores de la constante de Michaelis-Menten (KM) y

velocidad máxima (Vmax) se presentan en la tabla 6.

Tabla 6. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo obtenidos con

microsomas de pavo macho y hembra. Sustrato Machos Hembras

KM (µM) Vmax


KM (µM) Vmax


AFB1 25.5 6.1 21.2 5.7



Cumarina 44.8 1.1 84.7 1.5

Nifedipina 26.3 6.1 18.7 6.9


Al igual que en el caso de codornices, la adición de α-naftoflavona y 8-metoxipsoralen

resultó en una gran reducción en la producción de AFBO (Fig. 16). No se obtuvo reducción

en la producción de AFBO con furafilina o troleandomicina (Fig. 16 y 17).

Con α-naftoflavona se tuvieron porcentajes de biotransformación de 15.2, 17.4 16.3, 15.4 y

17.3% para concentraciones del inhibidor de 5.7, 11.5, 23.0, 45.1, 91.81 µM

respectivamente. El uso de 8-metoxipsoralen resultó en porcentajes de biotransformación

46

del 40.2, 35.4, 31.8, 17.9 y 14.3% a concentraciones del inhibidor de 2.9, 5.8, 11.6, 46.3 y

92.5µM respectivamente (Fig. 17).



P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6).

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 100,0 200,0 300,0 400,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)


0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)Concentración de α‐naftoflavona (µM)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)


0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)

Concentración de troleandomicin (µM)

47




valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor).


B1.


de pavo frente a los diferentes sustratos prototipo (Fig. 18). La actividad cumarina 7-

hidroxilasa presentó una correlación muy fuerte y significativa al 5% con un valor para el

coeficiente de Pearson de 0.90.

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

24.0

48.0

96.0

192.1

384.2


Conc

entr

ació

n de

fura

filin

a(µM

)

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

5.7

11.5

23.0

45.9

91.8


Conc

entr

ació

n de

α‐n

afto

flavo

na (

µM)

*

*

*

*

*

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

7.7

15.4

30.7

61.4

122.8


Conc

entr

ació

n de

trol

eand

omic

in(µ

M)

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

2.9

5.8

11.6

46.3

92.5


Conc

entr

ació

n de

8‐m

etox

ipso

rale

n µM

)

*

*

*

*

*

48

Figura 18. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pavo frente a los

diferentes sustratos prototipo (n=12).

Detección de ortólogos humanos en microsomas de pavo

La detección de los ortólogos presentes en microsomas de pavo se realizó por la técnica de

Western Blot (Fig. 19). No se puso evidenciar la presencia de los ortólogos de la familia

1A, mientras los ortólogos 2A6 y 3A4 se detectaron perfectamente con pesos moleculares

de 56.6±2.4 KDa y 52.2±0.8 KDa respectivamente.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0

7-et

oxire

soru

fina-

O-d

eetil

ació

n (n

mol

de

reso

rufin

a. m

g pr

otei

na-1

. min

uto-1

)

Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-1)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0

7-m

etox

ireso

rufin

a-O

-dem

etila

ción

(n

mol

de

reso

rufin

a. m

g pr

otei

na-1

. min

uto-1

)


0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0

Cum

arin

a 7-

hidr

oxila

ción

(n

mol

de7

-hid

roxi

cum

arin

a. m

g pr

otei

na-1

. min

uto-

1 )


0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0

Oxi

daci

ón d

e ni

fedi

pina

(nm

ol d

e ni

fedi

pina

oxi

dada

. mg p

rote

ina-1

. min

uto-

1 )

Epoxidación de AFB1 (nmol deAFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-1)

49

Figura 19. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pavo por la técnica



molecular.

50

Pato


Al igual que el caso de codornices y pavos, el uso de sustratos prototipo permitió evidenciar

la existencia de los ortólogos 1A1, 1A2, 2A6 y 3A4 en patos. Los valores de los parámetros

enzimáticos (KM y Vmax) calculados por cada sustrato se presentan en la tabla 7.


cinéticas con microsomas de pato macho y hembra. Sustrato Machos Hembras

KM (µM) Vmax (pmol. µg proteína-1. min-1) KM (µM) Vmax (pmol. µg proteína-1. min-1)

AFB1 44.0 2.7 23.3 2.9



Cumarina 4.5 0.3 8.2 0.5

Nifedipina 48.5 4.8 91.3 9.5


Al igual que el caso de codornices y pavos, la α-naftoflavona y el 8-metoxipsoralen

presentaron una reducción evidente de la producción del epóxido (Fig. 20) mientras el uso

de furafilina y troleandomicina no arrojo diferencias entre las diferentes concentraciones de

inhibidor utilizadas y la producción del AFBO (Fig. 20 y 21).

El uso de α-naftoflavona como inhibidor redujo el porcentaje de biotransformación a un

67.5, 9.6 y 41.3% con concentraciones del inhibidor de 5.7, 11.5, 22.9 µM respectivamente.

Con 8-metoxipsoralen se redujo el porcentaje de biotransformación a un 29.7, 18.7, 17.8,

9.0 y 13.7% con concentraciones del inhibidor de 2.9, 5.8, 11.6, 46.3 y 92.5 µM

respectivamente (Fig. 21).

51



humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6).

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 50,0 100,0 150,0 200,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)


0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)

Concentración de α‐naftoflavona (µM)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)


0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 20,0 40,0 60,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)


0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

12.0

24.0

48.0

96.0

192.1


Conc

entr

ació

n de

fura

filin

a (µ

M)

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

1.4

2.9

5.7

11.5

23.0


Conc

entr

ació

n de

α‐n

afto

flavo

na (

µM)

*

*

*

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

2.9

5.8

11.6

46.3

92.5


Conc

entr

ació

n de

8‐m

etox

ipso

rale

n (µ

M)

*

*

*

*

*

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

3.8

7.7

15.4

30.7

61.4


Conc

entr

ació

n de

trol

eand

omic

ina

(µM

)

52



humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de AFBO. Los valores con

asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor).


B1.


de pavo frente a los diferentes sustratos prototipo (Fig. 22). Se encontraron valores de los

coeficientes de correlación de Pearson para las diferentes actividades de 0.81 para la

actividad 7-etoxiresorufin-O-deetilasa (EROD), de 0.82 para la actividad 7-

metoxiresorufin-O-demetilasa (MROD), de 0.68 para la actividad cumarina 7-hidroxilasa y

de 0.88 para la oxidación de nifedipina. En todos los casos se encontró una correlación

significativa a un nivel de significancia del 5%.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

7-et

oxire

soru

fina-

O-d

eetil

ació

n (n

mol

der

esor

ufin

a. m

g pr

otei

na-1

. min

uto-1

)

Epoxidación de AFB1 (nmol deAFB1 epóxido. mg proteina -1 . minuto-1)

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

7-m

etox

ireso

rufin

a-O

-dem

etila

ción

(n

mol

de

reso

rufin

a. m

g pr

otei

na-1

. min

uto-1

)


0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Cum

arin

a 7-

hidr

oxila

ción

(n

mol

de

7-hi

drox

icum

arin

a. m

g pr

otei

na-1

. min

uto-1

)


0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Oxi

daci

ón d

e ni

fedi

pina

(nm

ol d

e ni

fedi

pina

oxi

dada

. mg p

rote

ina-1

. min

uto-1

)


53

Figura 22. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pato frente a los


Detección de ortólogos humanos en microsomas de pato

La detección de los ortólogos presentes en microsomas de pato se realizó por la técnica de


1A. Los ortólogos 2A6 y 3A4 se detectaron perfectamente con pesos moleculares de

53.8±1.4 KDa y 50.3±0.8 KDa respectivamente.

54

Figura 23. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pato por la técnica



molecular.

Pollo


Los microsomas de pollo al igual que las otras tres especies aviares presentaron

biotransformación de los sustratos prototipo. En la tabla 8 se presentan los valores de KM y

Vmax calculados por cada sustrato y sexo.


cinéticas con microsomas de pollo macho y hembra. Sustrato Macho Hembra

KM (µM) Vmax (pmol .µg proteína-1. min-1) KM (µM) Vmax (pmol .µg proteína-1. min-1)

AFB1 121.7 1.5 220.0 2.6



Cumarina 10.1 0.2 20.0 0.4

Nifedipina 4.8 1.3 5.5 1.4

Ensayos de inhibición

Tanto α-naftoflavona como 8-metoxipsoralen produjeron reducciones significativas en la

biotransformación de la aflatoxina respecto al control en todas las concentraciones

utilizadas durante las incubaciones (Fig. 24). En el caso de furafilina y troleandomicina no

se presentó inhibición (Fig. 24 y 25).

55

El uso de α-naftoflavona redujo la epoxidación de la aflatoxina a porcentajes de 29.2, 14.3,

14.7, 15.8 y 16.5% en concentraciones del inhibidor de 1.4, 2.9, 5.7, 11.5 y 22.9 µM

respectivamente. En el caso de 8-metoxipsoralen la reducción llegó a un 22.0, 17.5, 15.1,

10.3 y 8.9% con concentraciones del inhibidor de 2.9, 5.8, 11.6, 46.3, 92.5 µM

respectivamente (Fig. 25).



P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6).

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 50,0 100,0 150,0 200,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1 (%

con

trol

)


0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1(%

con

trol

)

Concentración de α‐naftoflavona (µM)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

Biot

rans

form

ació

n de

AFB

1(%

con

trol

)


0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0

Biot

rans

form

ació

n A

FB1

(% c

ontr

ol)


56




valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor).


B1.


de pollo frente a los diferentes sustratos prototipo (Fig. 26). La actividad cumarina 7-

hidroxilasa mostro una fuerte relación con la producción de AFBO con un valor del

coeficiente de correlación de Pearson de 0.74 con un nivel de significancia del 5%.

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

12.0

24.0

48.0

96.1

192.1


Conc

entr

ació

n de

fura

filin

a (µ

M)

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

1.4

2.9

5.7

11.5

23.0

Biotransformacion de AFB1 (% control)

Conc

entr

ació

n de

α‐n

afto

flavo

na (

µM)

*

*

*

*

*

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

3.8

7.7

15.4

30.7

64.4

Biotransformacion de AFB1 (% control)

Conc

entr

ació

n de

trol

eand

omic

ina

(µM

)0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

control

2.9

5.8

11.6

46.3

92.5


Conc

entr

ació

n de

8‐m

etox

ipso

rale

n(µM

)

*

*

*

*

*

57

Figura 26. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pollo frente a los


Detección de ortólogos humanos en microsomas de pollo

La detección de los ortólogos presentes en microsomas de pollo se realizó por la técnica de


1A. Los ortólogos 2A6 y 3A4 se detectaron perfectamente con pesos moleculares de

53.8±1.4 KDa y 53.5±1.4 KDa respectivamente.

0,00

0,01

0,01

0,02

0,02

0,03

0,03

0,04

0,04

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

7-et

oxire

soru

fina-

O-d

eetil

ació

n (n

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de

reso

rufin

a. m

g pr

otei

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. min

uto-1

)


0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

7-m

etox

ireso

rufin

a-O

-dem

etila

ción

(n

mol

de

reso

rufin

a. m

g pr

otei

na-1

. min

uto-1

)

Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-

1)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Cum

arin

a 7-

hidr

oxila

ción

(n

mol

de

7-hi

drox

icum

arin

a. m

g pr

otei

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. min

uto-1

)


0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Oxi

daci

ón d

e ni

fedi

pina

(nm

ol d

e ni

fedi

pina

oxi

dada

. mg p

rote

ina-1

. min

uto-1

)

Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-

1)

58

Figura 27. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pollo por la técnica



molecular.

59

DISCUSION

Debido a la gran importancia que tienen las CYP450 en el metabolismo de sustancias

endógenas, medicamentos y xenobióticos como las micotoxinas, se ha hecho indispensable

conocer el papel que este tipo de enzimas juega en la activación de moléculas nocivas para

la salud humana y animal. Los inconvenientes que presenta la purificación de las CYP450

debido a sus semejanzas estructurales, ha dificultado el estudio y caracterización de cada

una de las CYP450. Además, la falta de estudios en ortólogos aviares ha hecho que la

investigación sobre su acción en diferentes tipos de sustratos se haga prioritaria. Además de

la incipiente información, los estudios realizados con extractos crudos de CYP450, como

son los microsomas, donde se encuentran toda la diversidad de formas de citocromos, no

permiten una caracterización individual por lo cual el uso de sustratos prototipo que puedan

ser biotransformados por formas aviares de estas enzimas nos permite hacer un primer

acercamiento funcional en la identificación de estas formas presentes en microsomas

hepáticos de aves de producción. Estudios realizados con microsomas y sustratos prototipo

o inhibidores específicos para las CYP450 humanas en microsomas de otras especies han

permitido la identificación de ortólogos que no necesariamente deben tener una semejanza

estructural o en secuencia con sus formas humanas.

Biotransformación de sustratos prototipo

En el caso puntual de este estudio, el uso de sustratos prototipo permitió detectar y

cuantificar productos de biotransformación que son comúnmente encontrados con el uso de

CYP450 humanas gracias a que se encontraron las condiciones cromatográficas adecuadas

que permitieran la separación de cada sustrato prototipo y de su producto de

biotransformación respectivo por cromatografía de alta eficiencia (HPLC). Al observar que

se podía encontrar actividades homologas a las humanas en aves, se continuó con la

determinación de parámetros enzimáticos KM y Vmax. Esto demostró la presencia de

citocromos capaces de biotransformar los cuatro sustratos prototipo con microsomas

hepáticos obtenidos de las cuatro especies aviares bajo estudio, confirmando la presencia

de ortólogos aviares de las CYP450 1A1, 1A2, 2A6 y 3A4 humanas con capacidad de

actuar sobre la etoxiresorufina, la metoxiresorufina, la cumarina y la nifedipina

60

respectivamente. También se comprobó que estos ortólogos son sensibles a cambios en la

concentración del sustrato corroborando que los ortólogos tienen el comportamiento típico

de una enzima. Respecto a los parámetros enzimáticas se encontró que los ortólogos

CYP450 de pavo presentaron la afinidad más alta por la AFB1 representado en un bajo

valor de KM para ambos sexos (25.5 y 21.2 µM para machos y hembras respectivamente),

mientras los ortólogos CYP450 de pato (44.0 y 23.3 µM para machos y hembras

respectivamente) y codorniz (27.9 y 52.0 µM para machos y hembras respectivamente)

presentaron un nivel medio de afinidad y en pollos se encontró una baja afinidad (121.7 y

220.0 µM para machos y hembras respectivamente). Al observar los valores de velocidad

máxima, se encuentra que los pavos presentan las tasas de biotransformación más altas

tanto para machos como para hembras (6.1 y 5.7 pmol .µg proteína-1. min-1

respectivamente), seguido de las codornices (3.4 y 4.6 pmol .µg proteína-1. min-1 para

machos y hembras respectivamente) y patos (2.7 y 2.9 pmol .µg proteína-1. min-1 para

machos y hembras respectivamente) con valores intermedios. Los ortólogos de pollo

presentaron tasas mucho menores que las tres especies aviares antes mencionadas (1.5 y 2.6

pmol .µg proteína-1. min-1 para machos y hembras respectivamente). Estos resultados

sugieren que la razón por la cual especies como pavo o codorniz son tan sensibles a los

efectos de la AFB1 es el hecho que en la fase I de detoxificación de la toxina están

involucradas ortólogos CYP450 aviares con gran afinidad por la toxina y con la capacidad

de convertir la toxina a AFBO a tasas muy altas. Es importante resaltar el metabolismo fase

I se encuentra acompañado del metabolismo fase II, donde el compuesto bioactivado puede

sufrir conjugación con otros compuestos como el glutatión o sulfatos para continuar con el

proceso de excreción. Por esto es necesario determinar el rol de las enzimas responsables

de la fase II teniendo en cuenta que existen ortólogos que bioactivan la toxina en la fase I

para determinar exactamente el por que de la sensibilidad diferencial entre las aves

estudiadas. Los resultados obtenidos con microsomas hepáticos se encuentran en

concordancia con los hallazgos realizados por Lozano y Díaz (2006), donde se reportó que

pavos y codornices presentaban las mayores tasas de biotransformación de la AFB1,

seguidos por patos y pollos, respaldando los resultados obtenidos en esta investigación

61

donde la afinidad por la toxina y las tasas de biotransformación son mayores en pavo

seguido de codorniz, pato y finalmente pollo.

Uso de inhibidores específicos

Teniendo en cuenta que existen ortólogos aviares 1A1, 1A2, 2A6 y 3A4 y que se presenta

la activación de la AFB1 a AFBO, se requiere de otra herramienta que permita discriminar

el papel de cada uno de los ortólogos aviares en la biotransformación de la toxina. Por esto

se utilizaron inhibidores específicos para CYP450 humanas, donde se demostró que la

actividad enzimática de los ortólogos 1A1 y 2A6 en las cuatro especies aviares se podía

inhibir fuertemente con el uso de α-naftoflavona y 8-metoxipsoralen respectivamente.

Hasta el momento no se ha encontrado reportes en la literatura donde se relacione a estos

ortólogos aviares en la producción de AFBO, inclusive no se encontraron reportes donde se

relacione la CYP1A1 con la producción de AFBO tanto en humanos como en otras especies

de mamíferos (Omiecinski et al., 1999), por lo cual se presenta información novedosa

acerca de las formas aviares de estas enzimas relacionadas con la producción de la forma

epóxido de la toxina. En contraste, la furafilina y la troleandomicina, inhibidores

específicos de las CYP450 1A2 y 3A4 humanas no produjeron algún tipo de reducción en

la formación de AFBO usando los ortólogos aviares. En la literatura se ha reportado que

tanto la furafilina como la troleandomicina son inhibidores fuertes de la actividad de las

CYP1A2 (Kunze y Trager, 1993; Sesardic et al., 1990) y 3A4 (Jousserandot et al., 1995;

Mansuy et al., 1995) humanas respectivamente. Hasta el momento no se han encontrado

reportes donde se demuestre el efecto de estos inhibidores sobre los ortólogos aviares. Para

corroborar la acción inhibitoria de estos dos compuestos se realizaron ensayos de inhibición

en las cuatro especies de aves utilizando metoxiresorufina como sustrato y diferentes

concentraciones de furafilina para corroborar su efecto sobre la actividad del ortólogo 1A2,

como también se utilizó nifedipina y diferentes concentraciones de troleandomicina para

corroborar su efecto sobre la actividad del ortólogo 3A4 (datos no reportados). En ambos

casos se encontró que estos inhibidores redujeron significativamente la actividad de estas

enzimas respecto del control (sin inhibidor), con lo cual se demuestra su efecto inhibitorio

sobre la producción de resorufina en el caso de la CYP1A2 y de nifedipina oxidada en el

62

caso de la CYP3A4. Reportes en pavo han demostrado la importancia del ortólogo 3A4 en

la bioactivación de la toxina con el uso de 17-α-etinilestradiol como inhibidor de la

CYP3A4 y de α-naftoflavona para las CYP1A (Klein et al, 2000). En este punto hay que

recalcar que se están presentando los primeros reportes del efecto de estos inhibidores en

otólogos aviares y es probable que la furafilina o la troleandomicina no presenten una gran

eficiencia o especificidad como inhibidor de la CYP1A1 y 3A4, por lo que es necesario el

uso de otro tipo de inhibidores específicos que corroboren el papel tanto de las enzimas que

en los resultados demostraron estar relacionadas con la producción de AFBO (ortólogos

1A1 y 2A6) como de las enzimas que según este estudio no demostraron actividad en la

activación de la AFB1. En el estudio realizado por Klein et al en el año 2000 con los

ortólogos 1A de pavo hay que notar que no se utilizó un inhibidor diferencia que permitiera

evidenciar el accionar de las CYP1A1 y de la CYP1A2 como la furafilina, inhibidor

especifico de la CYP1A2. Según esto no se podría afirmar cual de las enzimas 1A estaría

involucrada en la activación de la AFB1. Es importante resaltar que las CYP1A2 y 3A4 han

sido reportadas como unas de las principales CYP450 responsables de la biotransformación

de la AFB1 y otros xenobióticos en mamíferos y humanos (Doi et al., 2002; Klein et al.,

2003; Omiecinski et al, 1999) pero este estudio demuestra que en el caso de pavo, codorniz,

pato y pollo estos ortólogos no se encuentran relacionados con la activación de la AFB1.

Correlación entre biotransformación de sustratos prototipo y activación de la AFB1

La correlación las actividades de los ortólogos aviares frente a la producción de AFBO

demostró una fuerte relación de la actividad cumarina 7-hidroxilasa (CYP 2A6) y la

epoxidación de AFB1 en todas las especies estudiadas. Este resultado corrobora los

hallazgos obtenidos con inhibidores donde se comprobó que la CYP2A6 juega un rol

importante en la activación de la AFB1. Los resultados encontrados para la actividad EROD

(CYP1A1) no demostró correlacionarse con la epoxidación de AFB1 (a excepción de pato)

debido muy probablemente al hecho de utilizar un sustrato que puede ser metabolizado por

dos enzimas, la CYP1A1 y 1A2, hecho que no permite evidenciar la relación de la

CYP1A1 directamente con la formación de AFBO. Un caso excepcional se encontró con

pato, donde las actividades de correspondientes a cada sustrato prototipo utilizado se

63

correlacionó con la producción de AFBO. Este resultado puede ser un indicio de la relación

de los ortólogos 1A2 y 3A4 en la activación de la AFB1.

Immunoblot de ortólogos aviares

La detección de los ortólogos aviares por la técnica de Western Blot permitió evidenciar

claramente la expresión de los ortólogos 2A6 y 3A4 en las cuatro especies aviares. La

expresión de las CYP1A1/2 no pudo determinarse debido a la baja sensibilidad del método

de revelado (100 pg de proteína) y muy probablemente a la baja expresión proteica de estos

ortólogos en microsomas aviares. En algunos casos se evidencio la presencia de proteínas

inmunoreactivas con pesos cercanos a los a los 85 KDa. En estudios anteriores se ha podido

visualizar e identificar estos ortólogos utilizando como método de revelado

quimioluminiscencia (Kein et al., 2000; Verbrugge, et al., 2001; Yip y Coulumbe, 2006) ya

que esta forma de revelado es más sensible que la colorimetría (1-3 pg de proteína). En el

caso de las CYP2A6 y 3A4 donde se encontraron cantidades cuantificables de proteína se

realizó la correlación de la cantidad relativa de proteína versus la actividad cumarina 7-

hidroxilasa y nifedipina oxidasa respectivamente, donde no se encontró alguna dependencia

entre las variables correlacionas en ninguna de las aves estudiadas. Es probable que al no

existir diferencias grandes en la expresión de proteína entre individuos de la misma especie,

representado en la intensidad de las bandas encontrada por individuo, la correlación de la

cantidad de proteína relativa versus su actividad enzimática no resulte en algún tipo de

relación entre estas variables.

CYP450 involucradas en la producción de AFBO

En definitiva, las técnicas utilizadas permitieron identificar las enzimas CYP450

relacionadas con el metabolismo fase I de la aflatoxina B1 (AFB1) en pollo (Gallus

domesticus), pavo (Melleagridis gallopavo), pato (Anas platyrhynchos) y codorniz

(Coturnix japonica). De los ortólogos propuestos en la hipótesis de trabajo (1A1/2, 2A6 y

3A4) como posibles bioactivadores de la AFB1, se pudo relacionar a los ortólogos 1A1 y

2A6 según los resultados obtenidos.

64

CONCLUSIONES

• En las cuatro especies aviares se pudieron identificar ortólogos de las CYP450 1A1/2,

2A6 y 3A4 humanas.

• Las CYP450 de pavos presentan la mayor afinidad por la AFB1, seguido de codorniz y

pato con una afinidad intermedia y pollo con la menor afinidad.

• Las CYP450 de pavo presentan la mayor tasa de biotransformación de la AFB1 seguido

de codorniz, pato y pollo con la menor tasa.

• Los ortólogos aviares 1A1 y 2A6 están relacionados con la epoxidación de la aflatoxina

B1 en las cuatro especies aviares, según los resultados obtenidos por inhibiciones

hechas con α-naftoflavona y 8-metoxipsoralen respectivamente, teniendo en cuenta que

el ortólogo 1A1 no ha sido reportado tampoco en humanos u otras especies de

mamíferos.

• Se pudo confirmar la relación del ortólogo 2A6 en la formación de AFBO para las

cuatro especies aviares, al encontrase correlación entre la actividad cumarina 7-

hidroxilasa y la producción de AFBO. Esta actividad no se ha reportado previamente en

ninguna especie aviar.

• Respecto a los ortólogos 1A2 y 3A4 no se encontró que estos ortólogos jugaran un

papel relevante en la epoxidación de la AFB1 para las cuatro especies aviares, según los

resultados obtenidos con inhibidores

• Existe evidencia en patos del posible papel de las CYP1A2 y 3A4 en la formación de

AFBO, según los coeficientes de correlación encontrados entre las actividades

metoxiresorufin-O-demetilasa y nifedipina oxidasa frente a la producción de AFBO.

• No se encontró relación entre la actividad del ortólogo CYP1A2 de pavos y la

activación de la AFB1, a diferencia de los reportes publicados en años anteriores.

• No se encontró evidencia en pavos, codornices y pollos que relacione los ortólogos

CYP1A2 y 3A4 con la formación de AFBO, a pesar de estar reportada la CYP3A4 en

humanos y pavos.

65

• Por la técnica de Western Blot se pudo demostrar la presencia de ortólogos 2A6 y 3A4

en los microsomas hepáticos obtenidos de las especies aviares estudiadas.

• El método de revelado por colorimetría en la técnica de Western Blot no permitió

evidenciar la presencia de ortólogos CYP1A en microsomas aviares.

• Finalmente, el uso de otros sustratos como metoxiresorufina y nifedipina demostró el

efecto inhibitorio de la furafilina y la troleandomicina en la actividad de los ortólogos

aviares 1A2 y 3A4 respectivamente.

66

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