Embed Size (px)
Citation preview
1
II. Amaç ve Kapsam
Bu çalışmanın amacı, Clethrionomys cinsindeki allozimik varyasyonları jel
elektroforezi yöntemiyle belirlemek ve morfolojik olarak farklı olduğu belirlenen
populasyonların genetik farklılıklarını ortaya koymaktır. Ayrıca, farklı populasyonların
genetik mesafelerini belirlemek ve taksonların populasyon genetiğine katkı sağlamaktır.
Taksonomik problemleri çözmek, cinsin sistematiğine ve Türkiye faunasına katkıda
bulunmak projenin amaçları arasındadır.
Palaearktik bölgede Clethrionomys cinsinin C. glareolus, C. rutilus ve C. rufocanus
türleri yayılış göstermektedir (Ellerman and Morrison-Scott, 1951, Corbet, 1978). Bu
türlerden C. glareolus Türkiye’de yayılış göstermektedir. Neuhauser (1936) C. glareolus’u
Abant (Bolu), Karadere (Zonguldak) ve Tosya (Kastamonu)’dan, Osborn (1962), Felten et al
(1971), ve Çolak ve Kıvanç (1991) Uludağ (Bursa), Bürnük- Bektaşağa (Sinop), Akçakoca
(Bolu), Biçik (Giresun), Uludağ (Bursa), Düzce, Çat (Rize), Sümela (Trabzon)’dan
kaydetmişlerdir.. Çolak et al. (1997) ise bu türün karyolojik özelliklerini ortaya koymuşlardır.
Osborn (1962) ve Çolak ve Kıvanç (1991)’ a göre bu tür Türkiye’de kesintili yayılış
göstermektedir. Araştırıcılar Kuzey Anadolunun batı kesimiyle doğu kesimi arasında
morfolojik farkların bulunduğunu özellikle Şile örneklerinin farklı olduğunu ortaya
koymuşlardır. Bu kesintili yayılış biçimi türün farklı populasyonları arasındaki gen akışını
kesmektedir. Böylece bu populasyonlar birbirinden ayrı kalarak farklılaşmakta ve
evrimleşmektedirler. Bu gibi populasyonların bir çoğunun yok olma tehlikesiyle karşı karşıya
olduğu bilinmektedir. Bu özellikteki türlerin genetik yapıları üzerinde araştırmalar
yapılmaktadır. Leitner ve Hartl (1988) Doğu Avusturya’da yayılış gösteren C. glareolus’un
2
genetik varyasyonlarını çalışmışlar ve populasyonlar arasında genetik farklılığın yüksek
olduğunu ortaya koymuşlardır.
Hall and Semeonoff (1985), Britanya’daki 20 lokaliteden C. glareolus örneğinin
plazma esteraz polimorfizmini nişasta jel elektroforezi ile çalışmışlardır. Kuzey ve güney
populasyonlarında allel dağılımlarını karşılaştırmışlar ve bu allellerin populasyon
yoğunluğuna ve hayatta kalma üzerine etkilerini tartışmışlardır.
Borkowska (1999) Kuzey-doğu Polonya’daki C. glareolus’un 5 populasyonu
arasındaki genetik ve morfolojik varyasyonları elektroforetik olarak çalışmıştır. 37 enzim
lokusundan 14’ünün polimorfik olduğunu belirterek, farklı populasyonlarda polimorfik
lokusların oranları ve heterozigotluk oranlarını karşılaştırarak tüm populasyonlarda önemli
heterozigot eksikliği tespit edilmiştir. Ayrıca allel frekanslarında mevsimsel varyasyonun
bulunduğunu belirtmiştir.
Frisman ve arkadaşları (2002) Okhotsk denizi bölgesindeki Clethrionomys cinsine ait
kırmızı sırtlı sıçanların (C. rutilus, C. rex, C. rufocanus) genetik farklılaşması ve gen-coğrafik
varyasyon ilişkisini çalışmışlardır. 17 lokaliteden 159 örneğin 16 protein sistemini nişasta jel
elektroforezi ile incelemişlerdir. İncelenen 25 lokustan 6 lokusun monomorfik olduğunu
bildirmişlerdir. Türler ve populasyonlar arasında karşılaştırmalar yaparak taksonomik
problemlerin çözümüne çalışmışlardır.
Redeker ve arkadaşları (2006) Danimarka’nın doğusundaki üç ormandan topladıkları
161 Clethrionomys glareolus’un 9 mikrosatellit lokusunu incelemişlerdir. Populasyonların
içinde genetik çeşitliliği (diversity) yüksek bulmuşlardır. Spesifik habitat gereksinimleri olan
3
bu türün yaşadığı ormanların, doğal veya insan etkisiyle bozulmasının populasyonun
altyapılanmasına ve böylece populasyonlar arasında dağılım sınırlanmasına sebep olabilir. Bu
yüzden populasyonlar arasında “bariyer etki”sini incelemişlerdir. İnceledikleri 5 lokalitenin
birinde “darboğaz” benzeri durum için genetik kanıt bulunmuştur. Clethrionomys
glareolus’un sadece yıldan yıla değil aynı zamanda mevsimden mevsime bazen yüksek
yoğunluk dalgalanmaları sergilediği bilinmektedir. Bu yüzden, belirlenen darboğaz benzeri
durumun, yoğunluğun düşük olduğu evrede az sayıdaki birey yüzünden olabileceği
belirtilmiştir.
Gebczynski ve arkadaşları (1993) 21 lokus tarafından kodlanan proteinlerdeki
elektroforetik varyasyonu C. glareolus’un güney ve doğu Polonya’daki beş populasyonunda
analiz etmişlerdir. Populasyon içi varyasyonu yüksek populasyonlar arasında Nei’nin
ortalama mesafesini 0.193 bulmuşlardır. Nisbeten yüksek Fıs değerleri, yüksek seviyede
farklılaşmayı göstermektedir. Allel frekanslarındaki varyasyon yüksektir ve bu da önemli
coğrafik genetik heterojeniteyi göstermektedir. Genetik ve coğrafik mesafeler arasında
uyumlu bir ilişki tespit etmemişlerdir.
Yapılan literatür araştırmaları sonucu, Türkiye’de Clethrionomys cinsine ait
Clethrionomys glareolus türü ve bu türe ait C. glareolus ponticus alt türünün yayılış
gösterdiğini, bu cins üzerinde genetik (izozim ve allozim) araştırmaların yapılmadığını ortaya
koymuştur. Bu taksondaki genetik farklılaşmalar ve evrimsel değişikliklerin derecesi bu
çalışmada belirlenmeye çalışılmıştır.
4
III. Materyal ve Yöntem
Bu proje çalışması hem arazide hem de laboratuarda iki aşamalı olarak
yürütülmüştür. Canlı olarak laboratuvara getirilen örneklerden elektroforetik çalışmalarda
kullanılmak üzere kan ve doku alınmıştır. Alınan kan ve dokular elektroforetik çalışmalarda
kullanılmak üzere - 70 derecedeki derin dondurucuda saklanmıştır. Örneklerin teşhisi Çolak
ve Kıvanç (1991)’a göre yapılmıştır. Bu çalışmada değerlendirilecek örneklerin ağırlığı ile
beraber 4 dış karakterin (tüm boy, kuyruk, ard ayak ve kulak uzunluğu) ölçüsü alınmış ve
daha sonra örnekler standart müze materyali şeklinde tahnit edilerek Ankara Üniversitesi Fen
Fakültesinde korunmuştur. Çalışmada kullanılan örneklerin laboratuar numaraları ve
lokaliteleri Tablo 2.1’de listelenmiştir.
Canlı örneklerden karyotip çalışmalarını takiben, elektroforetik çalışmalarda
kullanılmak üzere kas, karaciğer, böbrek ve kalp doku örnekleri alınmıştır. Bu çalışmada
değerlendirilecek örneklerin ağırlığı ile beraber 4 dış karakterin (tüm boy, kuyruk, ard ayak ve
kulak uzunluğu) ölçüsü alınmıştır.
Nişasta jel elektroforezi yöntemi kullanılarak çalışılması planlanan 12 enzimin
(Esteraz, İzositrat dehidrojenaz, Malat dehidrojenaz, Malik enzim, Fosfoglukomütaz,
Alfagliserofosfat dehidrojenaz, Glukofosfat izomeraz, Nukleosid fosforilaz, Adenozin
deaminaz, 6- fosfoglukonat dehidrojenaz, Aconitaz, Hekzokinaz) yanı sıra 4 enzim sistemi
(Süperoksit dismutaz, Fumaraz, Glukoz 6 fosfat dehidrojenaz, Laktat dehidrojenaz) daha
çalışmaya dahil edilmiştir.
Elektroforez işleminde kas doku örnekleri kullanılmıştır. Kas dokuları, buz içine
yerleştirilmiş ependorf tüpte distile su içinde cam çubuk yardımıyla homojenize edilmiştir.
Homojenatlar hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için soğutmalı mikrosantrifüjde +4°C’de
12.000 rpm’de 3 dakika santrifüjlenmiştir. Homojenatlar nişasta jellere 3MM Whatman filtre
kağıtlarına emdirilerek yüklenmiştir. Homojenatlar Poliakrilamid jellere yüklenmeden önce
5
1:1 oranında %10’luk sükroz+brom fenol mavisi ile karıştırılmış ve bu karışımdan 20-30 µl
yüklenmiştir.
Tablo 2.1. Türkiye’nin çeşitli yerlerinden toplanan ve elektroforetik analizlerde kullanılan Clethrionomys glareolus örneklerinin laboratuar kayıt numaraları ve lokaliteleri.
Sıra Örnek No
LOKALİTE Sıra Örnek No
LOKALİTE Sıra Örnek No
LOKALİTE
1 4994 Şile-İstanbul 34 4931 “ 67 5092 “
2 4995 “ 35 3733 Uludağ-Bursa 68 5093 “
3 4996 “ 36 3711 “ 69 5094 “
4 4997 “ 37 5003 Küre-Kastamonu 70 5095 “
5 4998 “ 38 5004 “ 71 5096 “
6 4999 “ 39 5005 “ 72 5053 Sümela-Trabzon
7 5000 “ 40 5006 “ 73 5054 “
8 5001 “ 41 5007 “ 74 5063 “
9 5002 “ 42 5008 “ 75 5064 “
10 5023 “ 43 5050 “ 76 5065 “
11 5026 “ 44 3738 Zonguldak 77 5066 “
12 4988 Kandıra-İzmit 45 5055 Bürnük-Sinop 78 5168 Kızılcahamam
13 4989 “ 46 5081 “ 79 5169 “
14 4990 “ 47 5102 “ 80 5164 “
15 4991 “ 48 5103 “ 81 5236 Zonguldak
16 4992 “ 49 5104 “ 82 5237 “
17 4993 “ 50 5105 “ 83 5238 “
18 5016 Akçakoca-Düzce 51 5072 Göktepe-Sinop 84 5239 “
19 5018 “ 52 5073 “ 85 5240 “
20 5019 “ 53 5078 “ 86 5294 Kışla-Giresun
21 5020 “ 54 5079 “ 87 5302 Bicik-Giresun
22 5021 “ 55 5080 “ 88 5310 Ünye-Ordu
23 5022 “ 56 5087 “ 89 5322 “
24 5051 “ 57 5088 “ 90 5323 “
25 5010 Abant-Bolu 58 5089 “ 91 5325 Bulancak-Giresun
26 5011 “ 59 5090 “ 92 5330 Çat-Rize
27 5012 “ 60 5091 “ 93 5332 Çakallı-Samsun
28 5013 “ 61 5056 “ 94 5349 “
29 5014 “ 62 5057 Gürgentepe-Ordu 95 5350 Borça-Giresun
30 5015 “ 63 5061 “ 96 5290 "
31 5024 “ 64 5071 “ 97 5303 Bulancak Giresun
32 4928 “ 65 5058 Ulubey-Ordu 98 5307 Ünye-Ordu
33 4930 “ 66 5062 “ 99 5235 ZONGULDAK
6
Bu çalışmada Nişasta ve Poliakrilamid jel elektroforezi ile incelenen 16 enzim sistemi,
uluslar arası kod numaraları ve kısaltmaları Tablo 2.2’de verilmiştir.
Tablo 2. 2. Bu çalışmada incelenen enzimlerin adları, kısaltmaları, uluslar arası enzim kod numaraları No Enzim adı Kısaltma Enzim kodu
1. Esterase Est E.C. 3.1.1.1 2. Glucose-6- phosphate dehydrogenase G6pdh E.C. 1.1.1.49 3. Glucose-6- phosphate isomerase Gpi E.C. 5.3.1.9 4. Aconitase Aco E.C. 4.2.1.3 5. Glycerol-3-phosphate dehydrogenase
(α-Glycerophosphate dehydrogenase) α-Gpdh E.C. 1.1.1.8
6. Hexokinase Hk E.C. 2.7.1.1 7. Isocitrate dehydrogenase Idh E.C. 1.1.1.42 8. Lactate dehydrogenase Ldh E.C. 1.1.1.27 9. Malate dehydrogenase Mdh E.C. 1.1.1.37
10. Malic enzyme Me E.C. 1.1.1.40 11. Phosphoglucomutase Pgm E.C. 5.4.2.2 12. Superoxide dismutase Sod E.C. 1.15.1.1 13. Fumarase Fum E.C. 4.2.1.2 14. Phosphogluconate dehydrogenase Pgd E.C. 1.1.1.44 15. Adenosine deaminase Ada E.C. 3.5.4.4 16. Nükleoside phosphorylase Np E.C. 2.4.2.1
Nişasta jel elektroforezi yöntemi kullanılarak aşağıdaki enzim sistemlerinin analizleri
yapılmıştır (Hillis and Moritz, 1990, Harris and Hopkinson, 1976; Ayala ve ark. 1972):
Aconitase (Aco), Glucose-6- phosphate dehydrogenase (G6pdh), Glucose-6- phosphate
isomerase (Gpi), α-glycerophophate dehydrogenase (α-Gpdh), Isocitrate dehydrogenase
(Idh), Malate dehydrogenase (Mdh), Malic enzyme (Me), Phosphoglucomutase (Pgm),
Superoxide dismutase (Sod), Fumaraz (Fum), Phosphogluconate dehydrogenase (Pgd),
Adenosine deaminase (ADA) , Nükleoside phosphorylase (Np), Hexokinase (Hk), Lactate
dehydrogenase (Ldh).
7
Bu analizlerde % 10 - 11 oranında hidrolize patates nişastası (Sigma) kullanılmıştır.
Nişasta her bir enzim için uygun tamponla karıştırılmış, bek alevinde ısıtılarak kaynatılmış, su
trompu kullanılarak hava kabarcıklarının çıkarılmasını takiben jel kalıplarına dökülmüştür.
Jeller katılaştıktan sonra yüzey tabakası misina ipi ile kesilerek atılmış ve örnek
homojenatlarına batırılmış olan küçük filtre kağıtları düzgün bir sıra oluşturacak şekilde
nişasta jele batırılarak yüklenmiştir. Jel tabakaları enzime uygun tampon konulmuş
elektroforez tankına yerleştirilmiş ve tanktaki tampona batırılarak ıslatılmış emici temizlik
bezleri ile jel ve tampon arasında köprü oluşturulmuştur. Jellere 7-9 V/cm akım uygulanarak
2.5-5 saat koşturulmuştur. Elektroforezden sonra jeller her bir enzim için uygun tampon,
boya, substrat ve kofaktörleri içeren karışımlarda veya agar içeren karışım jel üzerine
yayılarak (agar overlay) 37°C’deki etüvde karanlık koşullarda bantlar belirinceye kadar
inkübe edilmiştir. Boyamadan sonra reaksiyonu durdurmak için jeller metanol-su-asetik asit
(45:45:10) karışımında fikse edilmiştir. Işıklı kutu üzerine yerleştirilen jellerin üzerine
konulan asetat kağıtları ile çizimleri ve değerlendirmeleri yapılarak dijital fotoğraf makinesi
ile fotoğrafları çekilmiştir.
Poliakrilamid jel elektroforezi (NATIVE-PAGE) yöntemi (Sambrook et al.,1989)
kullanılarak ise Esterase (Est), Hexokinase (Hk), Lactate dehydrogenase (Ldh) ve Malic
enzyme (Me) enzim sistemleri incelenmiştir. Poliakrilamid jeller; sıkıştırma jeli % 4, ayırma
jeli %7.5 oranında olmak üzere Sambrook ve arkadaşlarının (1989) yöntemine göre
hazırlanmıştır. Elektrot tamponu olarak Laemmli (1970)’nin tamponu kullanılmıştır.
Sıkıştırma jeline 80 V, ayırma jeline ise 150 V akım uygulanmış, izleme boyası jelin bitimine
0.5 cm kalınca elektroforez durdurulmuştur. Elektroforezden sonra jeller her bir enzim için
uygun tampon, boya, substrat ve kofaktörleri içeren karışımlarda 37°C’deki etüvde karanlık
koşullarda bantlar belirinceye kadar inkübe edilmiştir. Boyamadan sonra reaksiyonu
8
durdurmak için jeller metanol-su-asetik asit (45:45:10) karışımında fikse edilmiştir. Işıklı kutu
üzerine yerleştirilen jellerin üzerine konulan asetat kağıtları ile çizimleri ve değerlendirmeleri
yapılarak dijital fotoğraf makinesi ile fotoğrafları çekilmiştir.
İzozimler anoda en yakından başlanılarak numaralandırılmıştır. Allozimler ise en hızlı
göç eden allel A olacak şekilde mobilitelerine göre alfabetik olarak isimlendirilmişlerdir.
İstatistik analizlerde; [populasyonlar arası genetik uzaklık (D), polimorfik lokus sayısı
(P), lokus başına alel sayısı (A), gözlenen heterozigotluk (Ho), Hardy-Weinberg eşitliği
altında beklenen heterozigotluk (He), Shannon’un İnformation İndeksi (I) ve populasyonlar
arası farklılaşma miktarı (Fst) ] Popgen 32 (Yeh et al., 1999) programı kullanıldı.
9
III. Analiz ve Bulgular
Clethrionomys glareolus’un Yayılışı:
Türkiye’de kuzey Anadolu bölgesinde yayılış göstermektedir. Bu çalışmada toplanan
örneklerin alındığı lokaliteler Şekil 3.1’de gösterilmektedir.
Şekil 3. 1. Clethrionomys glareolus ’un Türkiye’deki yayılışı. 1. Uludağ-Bursa; 2. Kandıra- İzmit; 3. Şile-İstanbul; 4. Akçakoca-Düzce; 5. Abant-Bolu; 6. Zonguldak; 7.Kızılcahamam; 8. Küre- Kastamonu; 9. Bürnük-Sinop; 10. Göktepe-Sinop; 11. Çakallı-Samsun; 12. Ünye-Ordu; 13. Gürgentepe-Ordu; 14. Ulubey-Ordu; 15. Bulancak-Giresun; 16. Görele-Giresun; 17. Sümela-Trabzon; 18. İkizdere-Rize. Habitat Özellikleri:
Clethrionomys glareolus Rize’den Şile’ye kadar olan bir alanda ormanlarda yayılış
göstermektedir. Rize’de kayının dominant olduğu ve seyrek çam ormanlarının bulunduğu
alanlardan elde edildi. Zemini kayın yapraklarıyla kaplı ve düz olan alanları tercih
etmektedirler. Bu alanlarda orman altında yaygın bir şekilde kırmızı orman gülü
bulunmaktadır. Sümela’da bu hayvan ancak bir lokaliteden elde edildi. Zemini orman gülü
yaprağı ve kayın yapraklarıyla kaplı alanları tercih etmektedir. Ayrıca seyrek çam, fındık ve
kızıl ağaç bulunmaktadır. Orman altında çok yoğun bir şekilde kırmızı orman gülü
formasyonu mevcuttur (Şekil 3.2-3.6)
10
Şekil 3.2. Clethrionomys glareolus’un Şile/İstanbul’daki habitatı
Şekil 3. 3. Clethrionomys glareolus’un Zonguldak’taki habitatı
11
Şekil 3. 4. Clethrionomys glareolus’un Göktepe/Sinoptaki habitatı
Şekil 3. 5. Clethrionomys glareolus’un Sümela/Trabzon’daki habitatı
12
Şekil 3. 6. Clethrionomys glareolus’un İkizdere/ Rize’deki habitatı
Post Karakterleri:
101 örneğe ait postlar lokalite lokalite değerlendirildi. Uludağ’dan incelenen 7 postta
dorsal renk kırmızımsı kahverengidir. Bazı örneklerde (n=3) bu renk daha koyudur. Yanlara
doğru renk açılmaktadır. Karın altıyla vücut yanlarını ayıran belirgin bir hat yoktur. Kuyruk
iki renklidir. Üstte koyu kahverengi, alta ise açık renktedir. Karın altı kurşuni renkte olup
kahverengi izlidir. Bazı örneklerde (n=2) karın renginde kızıllaşmalar vardır ve ayaklar ön
arka ayaklar üste soluk beyaz ve ince kıllarla kaplıdır. Ayakların altı çıplaktır.
13
Şile (İstanbul)’den incelen 7 örnekte dorsalde çok belirgin koyuluk vardır. Kızılımsı
koyu kahverengidir. Bu renklenme Uludağ örneklerinde olduğu gibi burun ucundan kuyruğun
başlangıcına kadar devam etmektedir. N=4 örnekte karın altında kızıllaşmalar mevcuttur.
Kandıra (İzmit)’dan 7 örnek post özellikleri bakımından Şile örnekleriyle aynıdır. Akçakoca
(Düzce)’dan alınan 7 örnekten 3 tanesinde dorsalde kızıllaşma vardır. Diğer örnekler daha
açık renktedir. Diğer özellikleri bakımından Şile örnekleri gibidir. Zonguldak’tan alınan 7
örnekten 4 tanesinde dorsalde belirgin bir kızıllaşma vardır. Diğer özellikleri Şile
örneklerinde olduğu gibidir. Abant (Bolu)’tan 13 örneğin postu incelendi. 5 örnekte dorsalde
koyu kızıllık hakimdir. Diğer örnekler ise biraz daha soluktur. Karın altı soluk beyazımsıdır.
Diğer özellikleri bakımından Şile örnekleriyle aynıdır.
Küre (Kastamonu)’deki 7 örnekten 3 örnekte diğer lokalitelerden farklı olarak dorsal
renk belirgin bir şekilde açık kızıl renktedir. Bu örneklerin karın altları da daha beyazımsıdır.
Diğer özellikleri Şile örnekleriyle aynıdır.
Bürnük (Sinop)’ten alınan 6 örnekte dorsal farklı olarak sarımsı kızıldır. Bu renklenme
diğer lokalitelerden belirgin bir şekilde farklıdır. Karın altında sarımsı izler yoğunluktadır.
Göktepe (Sinop)’deki 11 örnek de Bürnük örneklerinde olduğu gibidir. Bu populasyonda
belirgin farklar vardır. Dorsalde parlaklık hakimdir. Karın altında sarımsı iz hakimdir.
Çakalllı (Samsun)’dan 2 örnekte dorsal renk açık kızılımsıdır. Sinop örneklerine göre
daha koyudur. Karın altı soluk beyazımsıdır.
Ünye, Ulubey ve Gürgentepe (Ordu)’den 13 örnekte n=4 örnek dorsalde koyu
kızılımsı diğer örneklerde koyu kahverengi kızılımsı izlidir. Karın altı kirli beyaz ve sarımsı
izlidir.
Giresun 5 örnekte dorsalde koyu kahverengi ancak çok belirgin bir kızıllaşma
mevcuttur. N= 2 örnekte kızıllaşma daha azdır. Sümela (Trabzon) 4 örnekten 3 tanesinde
dorsalde belirgin bir kızıllaşma var ancak renk bakımından örnekler koyudur.
14
İkizdere (Rize) n=5 örnekte dorsalde koyu renk hakimdir ve kızılımsıdır. Karın altı
belirgin bir şekilde koyudur ve sarımsı izlidir (Şekik 3.7).
Şekil 3. 7. İkizdere/Rize’den bir Clethrionomys glareolus örneği
Morfolojik Özellikleri
Morfolojik analizlerde, toplam 104 Clethrionomys örneğinin ağırlık ve 4 dış karakter ölçüsü
alındı (Tablo 3.1).
15
Tablo 3.1. Clethrionomys glareolus örneklerinin cinsiyet, ağırlık ve dış karakter ölçüleri.(Tüm boy, Kuyruk, Ardayak ve Kuyruk uzunlukları)
Örnek No LOKALİTE
Cinsiyet Ağırlık (gr)
Tüm boy uzunluğu
(cm)
Kuyruk uzunluğu
(cm)
Ard yak uzunluğu
(cm)
Kulak uzunluğu
(cm)
4994 Şile-İstanbul E 22
161 55 20 14
4995 “ D 23 160 51 18 16
4996 “ E 21 155 54 19 14
4997 “ D 22 151 51 19 15
4998 “ D 23 267 54 19 15
4999 “ E 24 157 52 19 14
5000 “ E 25 161 51 20 15
5001 “ E 21 157 52 20 15
5002 “ D 19 148 49 19 14
5023 “ E 20 151 46 20 14
5026 “ E 24 159 51 21 14
4988 Kandıra-Kocaeli D 21 152 48 20 15
4989 “ D 23 155 53 19 13
4990 “ D 22 154 52 19 14
4991 “ D 22 159 54 19 14
4992 “ D 19 149 48 19 14
4993 “ E 23 150 48 19 14
5016 Akçakoca-Düzce D 19 147 44 20 15
5018 “ D 22 148 47 20 14
5019 “ E 19 146 48 19 14
5020 “ E 21 157 53 20 16
5021 “ D 24 254 46 20 14
5022 “ D 21 145 43 18 13
5051 “ D 23 149 49 20 14
5010 Abant-Bolu E 20 145 46 19 13
5011 “ D 23 155 51 19 14
5012 “ D 27 165 51 20 15
5013 “ E 27 167 56 20 14
5014 “ E 26 161 56 19 14
5015 “ D 21 163 56 20 16
5024 “ E 20 150 49 20 14
4928 “ D 21 160 57 20 14
4930 “ D 25 162 57 19 15
4931 “ E 28 171 62 21 15
3733 Uludağ-Bursa E 17 138 48 19 13
3711 “ D 25 164 51 18 15
5003 Küre-Kastamonu E 23 157 52 18 14
5004 “ E 24 155 51 18 15
5005 “ D 26 161 54 19 16
16
Tablo 3. 1. Devam
Örnek No LOKALİTE
Cinsiyet Ağırlık (gr)
Tüm boy uzunluğu
(cm)
Kuyruk uzunluğu
(cm)
Ard yak uzunluğu
(cm)
Kulak uzunluğu
(cm) 5006 “ E 24 158 53 19 15
5007 “ D 22 160 58 19 15
5008 “ D 20 154 52 19 15
5050 “ E 19 150 51 19 13
5055 Bürnük-Sinop E 31 162 51 19 14
5081 “ E 29 162 53 19 15
5102 “ E 30 168 57 21 16
5103 “ D 23 149 48 19 15
5104 “ D 21 158 52 19 14
5105 “ D 23 153 47 20 15
5072 Göktepe-Sinop E 20 153 47 19 14
5073 “ D 15 138 43 17 14
5078 “ D 20 141 47 20 14
5079 “ E 20 148 47 20 16
5080 “ D 18 138 44 18 13
5087 “ D 17 141 47 19 14
5088 “ E 20 144 46 18 15
5089 “ D 17 132 39 17 14
5090 “ E 22 153 49 19 14
5091 “ D 17 146 48 19 14
5056 “ E 17 142 46 18 14
5057 Gürgentepe-Ordu E 26 152 47 19 13
5061 “ E 24 160 54 20 15
5071 “ D 21 148 53 19 16
5058 Ulubey-Ordu E 25 128 32 19 14
5062 “ E 24 154 54 20 15
5092 “ E 23 163 57 20 16
5093 “ D 17 153 49 19 14
5094 “ E 17 156 52 20 15
5095 “ D 22 157 51 21 16
5096 “ E 17 140 41 17 11
5053 Sümela-Trabzon D 18 150 54 21 15
5054 “ D 25 169 61 20 16
5063 “ D 20 149 40 18 11
5064 “ E 21 144 43 18 11
5065 “ D 34 164 58 20 16
5066 “ E 21 153 54 22 16
5168 Kızılcahamam E 13 134 44 19 14
5169 “ D 12 135 44 18 15
17
Tablo 3. 1. Devam
Örnek No LOKALİTE
Cinsiyet Ağırlık (gr)
Tüm boy uzunluğu
(cm)
Kuyruk uzunluğu
(cm)
Ard yak uzunluğu
(cm)
Kulak uzunluğu
(cm) 5164 “ E 18 133 47 19 16
5236 Zonguldak D 18 147 51 20 13
5237 “ E 20 151 51 20 13
5238 “ D 20 146 47 20 14
5239 “ E 25 154 48 19 10
5240 “ E 26 163 54 20 14
3738 “ E 29 164 61 21 14
5235 “ D 21 154 53 19 12
5294 Kışla-Giresun D - - - - -
5302 Biçik-Giresun E 24 153 56 21 15
5325 Bulancak-Giresun E 34 173 67 20 10
5303 “ E 28 142 41 21 16
5350 Borça-Giresun D 29 162 61 20 14
5310 Ünye-Ordu E 35 164 61 19 12
5322 “ E 36 185 68 19 12
5323 “ D 34 154 55 21 11
5307 “ D 20 147 55 21 14
5330 Çat-Rize D 25 173 72 24 15
5704 İkizdere-Rize E 24 134 48 17 9
5710 “ E 29 164 61 22 15
5711 “ D 28 170 62 20 16
5716 “ D 24 170 54 19 12
5717 “ D 28 180 62 20 13
5332 Çakallı-Samsun D 25 145 45 17 12
5349 “ E 19 145 48 20 13
5290 " E 27 158 57 19 11
18
Allozim Analizleri
Clethrionomys örneklerinin kas dokuları ile yapılması planlanan allozim analizinde 12
enzim sistemine (Aldolaz, Esteraz, Glukoz-6-fosfat dehidrojenaz, Glukoz-6-fosfat izomeraz,
Gliseraldehit-3- fosfat dehidrojenaz, Gliserol-3- fosfat dehidrojenaz, Heksokinaz, Izositrat
dehidrojenaz, Laktat dehidrojenaz, Malat dehidrojenaz, Malik enzim, Fosfoglukomutaz,
Süperoksit dismütaz, Fumarat dehidrojenaz) ilave olarak laboratuarımızda bulunan kimyasal
maddelerle 4 enzim sistemi (Fosfoglukonat dehidrojenaz, Adenozin deaminaz, Nükleozid
fosforilaz) daha incelenmiştir. Böylece toplam 16 enzim sistemi nişasta jel elektroforezi ile
incelenmiştir. Nişasta jel elektroforezi ile değerlendirilebilecek düzeyde aktivite bantları
sergilememiş olan Hekzokinaz enzimi ile bir lokus sergileyen Malik enzim, üç lokus
sergileyen Esteraz ve beş lokus sergileyen Laktat dehidrojenaz enzimleri daha kesin çözüm
sağlayan poliakrilamid jel elektroforezi (Native-PAGE) yöntemiyle de araştırılmıştır.
Jellerde gözlenen bant fenotiplerine göre belirlenen enzim lokuslarındaki genotipler EK-c’de
verilmiştir
İncelenen enzim sistemlerinden 10 enzim sistemi bir lokus tarafından kodlanırken,
Izositrat dehidrojenaz, süperoksit dismutaz, akonitaz ve malat dehidrojenaz enzimleri 2,
Esteraz enzimi 3, ve Laktat dehidrojenaz enzimi 5 izozime sahiptir. Ancak esteraz ve laktat
dehidrojenaz enzimi için kodlama yapan lokuslardan Est-2 ve Ldh-1 lokusları izlenebilir
sonuçlar vermediği için analiz edilememiştir. Böylece incelenen 16 enzim sistemi toplam 26
lokus sergilemiştir. Bu 26 lokusun 24’ü analiz edilmiştir.
Analiz edilen 24 lokus içinde 12 lokus (Idh-1, Sod-1, Sod-2, Aco-1, Aco-2, NP, Fum,
Mdh-m, G6pdh, Hk, Gpi, Est-3) monomorfiktir ve çalışılan tüm populasyonlarda aynı allel
için fikse olmuştur. Diğer 12 lokus ise polimorfiktir ve çalışılan populasyonların en az
19
birisinde veya daha fazlasında birden fazla allel sergilemiştir. Polimorfik lokuslardan, Idh-2
lokusunda A ve B olmak üzere 2 allel, α-Gpdh lokusunda A,B,C olmak üzere 3 allel, Me 2
allel (A ve B), Pgm 3 allel (A, B, C), Pgd 2 allel (A, B), Mdh-s 3 allel A, B, C), Ada 2 allel
(A, B), Est -1’de üç allel (A,B,C), Ldh-2, Ldh-3, Ldh-4, ve Ldh-5 lokuslarında ise üçer allel
(A, B, C) bu çalışmada tespit edilmiştir (Tablo 3.2).
Allozim analizi taze veya taze dondurulmuş doku örnekleriyle yapılabilir. Laboratuara
canlı getirilebilen 99 örnekten 94 örnek analiz edilebilir sonuçlar vermiştir. Diğer örnekler
morfolojik analizlerde kullanılmıştır. Bu örnekler toplandıkları lokalitelere göre analizlerde
kolaylık (populasyon sayısını azaltmak) açısından 8 gruba (populasyon) ayrılmıştır. Bu
gruplara dahil olan örnek sayısı (N) ve lokaliteler aşağıdaki gibidir:
Grup1 (N=11): Şile-İSTANBUL (11)
Grup2 (N=24): Kandıra-İZMİT (6) +Akçakoca-DÜZCE (7) +Uludağ-BURSA
( 2) +Zonguldak(7)
Grup3 (N=12): Abant-BOLU (10) +Kızılcahamam-ANKARA (2)
Grup4 (N=7) : Küre-KASTAMONU (7)
Grup5 (N=19): Bürnük-Göktepe-SİNOP (6+11)+Çakallı-SAMSUN (2)
Grup6 (N=13): Gürgentepe-Ulubey-Ünye-ORDU (3+6+4)
Grup7 (N=6): Kışla-Bicik-Bulancak-Borça-GİRESUN (1+1+2+2)
Grup8 (N=4): Sümela-TRABZON (4)
Polimorfik ve monomorfik lokusların populasyonlara (gruplara) göre allel frekansları
Tablo 3.2’de verilmiştir.
20
Tablo 3.2. Clethrionomys glareolus’un 8 populasyonunda gözlenen toplam 24 lokustaki allel frekansları
Lokus Allel Populasyonlar 1 2 3 4 5 6 7 8
IDH-1 A B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
IDH-2 A B C
- 1.0000
-
- 1.0000
-
- 1.0000
-
- 1.0000
-
- 1.0000
-
0.0385 0.9615
-
0.0833 0.9167
-
- 1.0000
- A-GPD A
B C
0.0455 0.9545
-
0.0455 0.9318 0.0227
0.0833 0.9167
-
- 1.0000
-
- 1.0000
-
0.0385 0.9615
-
- 1.0000
-
- 1.0000
- ME A
B C
- 1.0000
-
- 1.0000
-
- 1.0000
-
- 1.0000
-
0.0526 0.9474
-
- 1.0000
-
- 1.0000
-
- 1.0000
- PGM A
B C
- 1.0000
-
- 1.0000
-
- 0.9583 0.0417
- 1.0000
-
0.0526 0.8684 0.0789
- 1.0000
-
0.1667 0.8333
-
- 1.0000
- SOD-1 A
B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
SOD-2 A B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
ACO-1 A B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
ACO-2 A B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
PGD A B C
- 1.0000
-
0.0682 0.9318
-
0.1250 0.8750
-
0.4286 0.5714
-
- 1.0000
-
- 1.0000
-
- 1.0000
-
- 1.0000
- NP A
B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
FUM A B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
MDH-S A B C
- 1.0000
-
0.0227 0.9773
-
- 0.9583 0.0417
- 1.0000
-
0.0526 0.9474
-
- 1.0000
-
0.1667 0.8333
-
- 1.0000
- MDH-M A
B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
ADA A B C
0.4091 0.5909
-
0.5227 0.4773
-
0.5000 0.5000
-
0.5714 0.4286
-
0.3947 0.6053
-
0.3077 0.6923
-
0.7500 0.2500
-
0.5000 0.5000
-
21
Tablo. 3.2 . devam
Lokus Allel Populasyonlar 1 2 3 4 5 6 7 8
G6PDH A B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
HK A B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
GPI A B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
EST-1 A B C
0.7727 0.2273
-
0.5227 0.4773
-
0.6250 0.2917 0.0833
0.9286 0.0714
-
0.7632 0.2368
-
0.6154 0.3462 0.0385
0.0833 0.8333 0.0833
0.8750 0.1250
- EST-3 A
B C
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
1.0000 - -
LDH-2 A B C
- 0.9545 0.0455
0.5227 0.4318 0.0455
0.7778 0.2222
-
1.0000 - -
0.7895 0.2105
-
0.3846 0.6154
-
0.4167 0.5833
-
0.7500 0.2500
- LDH-3 A
B C
- 0.9545 0.0455
0.5000 0.4545 0.0455
0.7778 0.2222
-
1.0000 - -
0.7895 0.2105
-
0.3462 0.6538
-
0.5000 0.5000
-
0.7500 0.2500
- LDH-4 A
B C
- 0.9545 0.0455
0.5227 0.4318 0.0455
0.7778 0.2222
-
1.0000 - -
0.7895 0.2105
-
0.3462 0.6538
-
0.5000 0.5000
-
0.7500 0.2500
- LDH-5 A
B C
0.9545 0.0455
-
0.9091 0.0909
-
1.0000 - -
1.0000 - -
0.7368 0.2105 0.0526
0.3077 0.6154 0.0769
0.3333 0.6667
-
0.7500 0.2500
-
Enzim Özellikleri
1. Esteraz (Est, E.C. 3.1.1.1)
Poliakrilamid jel elektroforezi ile anoda göç eden 3 lokus belirlenmiştir. Bu lokuslardan Est-3
monomorfik olup çalışılan tüm örneklerde aynı allel için fikse olmuştur. Est-1 ve Est-2
lokuslarında polimorfizm tespit edilmiştir. Ancak Est-2 lokusu jellerde düşük aktivite
gösterdiğinden incelenen tüm bireylerde genotipleri tespit etmek mümkün olmamıştır ve bu
yüzden analizlere dahil edilmemiştir. Est-1 lokusunda ise üç allel tespit edilmiştir.
22
Bunlardan en hızlı göç eden allel A olarak, diğerleri ise azalan mobilitelerine göre alfabetik
olarak (B ve C) adlandırılmıştır. Bu lokusta heterozigot bireylerde gözlenen 2 bantlı fenotip
nedeniyle enzimin alt ünite yapısının monomerik olduğunu söyleyebiliriz. Bu lokusta A alleli
yüksek frekansta gözlenirken, C alleli düşük frekansta olup bu allel sadece 1 homozigot (CC)
ve iki heterozigot (1 BC ve 1 AC) bireyde gözlenmiştir (Şekil 3.8).
Şekil 3. 8. Clethrionomys glareolus örneklerinin Native-PAGE ile incelenmiş Esteraz enzimi zimogramı. Est-1, Est-2 ve Est-3 lokusları.
23
2. Glukoz-6- fosfat dehidrojenaz ( G6pdh, E.C. 1.1.1.49)
Nişasta jel ile incelenmiş ve Glukoz-6-fosfat dehidrojenaz enzimi anoda göç eden tek bir
monomorfik lokus sergilemiştir. İncelenen tüm bireyler G6pdh lokusunda aynı allel için fikse
olmuştur (Şekil 3. 9.).
Şekil 3. 9. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Glukoz-6-fosfat dehidrojenaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir monomorfik lokus (G6pdh).
3. Glukoz-6- fosfat izomeraz (Gpi, E.C. 5.3.1.9)
Nişasta jel ile incelenmiş ve Glukoz fosfat izomeraz enzimi anoda göç eden tek bir
monomorfik lokus sergilemiştir. İncelenen tüm bireyler Gpi lokusunda aynı allel için fikse
olmuştur (Şekil 3.10).
24
Şekil 3. 10. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Glukoz fosfat izomeraz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir monomorfik lokus (Gpi).
25
4. Aconitaz (Aco, E.C. 4.2.1.3)
Nişasta jel ile incelenmiş ve akonitaz enzimi bir anoda bir de katoda göç eden iki izozim
sergilemiştir. Anodal formu Aco-1 ve katodal formu ise Aco-2 olarak adlandırılmıştır.
İncelenen tüm bireyler her iki lokusta da monomorfiktir yani aynı allel için fikse olmuştur
(Şekil 3. 11).
Şekil 3. 11. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Akonitaz enzimi zimogramı. Anodal göç eden Aco-1 ve katodal göç eden Aco-2 lokusları.
26
5. α-Gliserofosfat dehidrojenaz (Gliserol-3- fosfat dehidrojenaz) (α-Gpdh, E.C. 1.1.1.8)
Nişasta jel ile incelenmiş ve α-Gliserofosfat dehidrojenaz enzimi anoda göç eden tek bir
polimorfik lokus sergilemiştir. Bu lokusta B alleli yüksek frekansta gözlenirken, A ve C
alelleri sadece heterozigot bireylerde düşük frekansta gözlenmiştir ( 6 AB ve 1 BCgenotip).
Heterozigot bireylerde gözlenen üç bantlı fenotip bu enzimin dimerik yapıda olduğunu
göstermektedir (Ortadaki bant altünitelerin rastgele bir araya gelmesinden oluşan heteromerik
banttır. (Şekil 3.12).
Şekil 3. 12. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş α-gliserofosfat dehidrojenaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir polimorfik lokus (α- Gpdh) ve A, B, C allelleri
27
6. Hekzokinaz (Hk, E.C. 2.7.1.1)
Nişasta jel ile incelendiğinde başarılı sonuç alınamamıştır (Şekil 3. 13). Poliakrilamid jel
elektroforezi ile incelendiğinde anoda göç eden 1 lokus belirlenmiştir. İncelenen tüm bireyler
Hk lokusunda aynı allel (A) için fikse olmuştur (Şekil 3. 14).
Şekil 3. 13. Clethrionomys glareolus örneklerinin Nişasta jel ile incelenmiş Hekzokinaz enzimi zimogramı. Hk lokusunun allelleri tanımlanamamıştır. Anodal ve katodal SOD aktivitesi akromatik zonlar şeklinde izlenmektedir.
Şekil 3. 14. Clethrionomys glareolus örneklerinin Native PAGE ile incelenmiş Hekzokinaz enzimi zimogramı. Monomorfik tek bir Hk lokusu.
28
7. İzositrat dehidrojenaz (Idh, E.C. 1.1.1.42)
Nişasta jel ile incelenmiş ve izositrat dehidrojenaz enziminin anoda göç eden iki izozimi
(Idh-1 ve Idh-2) tespit edilmiştir. Orijine (jele yükleme noktasına veya katoda) yakın olan
Idh-1 lokusu monomorfiktir ve incelenen tüm bireyler aynı allel için fikse olmuştur (Şekil
3.15). Anoda yakın olan Idh-2 lokusu ise düşük düzeyde polimorfizm göstermiştir. A alleli
sadece 6. (Ordu) ve 7. (Giresun) populasyonlarda birer bireyde (AB heterozigot genotipte)
gözlenirken, diğer populasyonlarda B alleli fikse olmuştur. Enzim dimerik yapıdadır (Şekil 3.
15).
Şekil 3. 15. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş İzositrat dehidrojenaz enzim zimogramı. Idh-1, Idh-2 lokusları.
29
8. Laktat dehidrojenaz (Ldh, E.C. 1.1.1.27)
Nişasta jel elektroforezi ile incelendiğinde 5 lokus tarafından kodlanan bu enzim oldukça
karışık bant profili sergilemiş ve allelleri tanımlamakta güçlük çekilmiştir (Şekil 3. 16). Bu
yüzden daha keskin çözüm sağlayan Native-PAGE ile tekrar incelenmiştir (Şekil 3. 17)..
Poliakrilamid jel elektroforezi ile anoda göç eden 5 lokus belirlenmiştir ( Ldh-1, Ldh-2, Ldh-
3, Ldh-4 ve Ldh-5). Lokuslar orijinden başlanarak mobilitelerine göre numaralandırılmıştır.
Orijine en yakın olan Ldh-1 lokusu zorlukla izlenirken diğer dört lokus oldukça net
izlenebilmiştir. Değerlendirmedeki zorluk yüzünden Ldh-1 lokusu analizlere dahil
edilmemiştir. Ldh-1 lokusu dışında diğer tüm lokuslar polimorfik olup, her bir lokusta üçer
allel (A, B, C) gözlenmiştir. Heterozigot bireylerde gözlenen 5 bantlı fenotip enzimin tetramer
olduğunu açıkça göstermektedir (Ortadaki 3 heteromerik bant ile). Ayrıca incelenen 3. (Bolu)
populasyondaki bazı bireylerde muhtemelen lokuslar arası heteromerik bantlar yüzünden
oldukça karışık bant profili bu bireylerde allelleri belirlemeyi zorlaştırmıştır. Genotiplemede
hata yapmaktan kaçınmak için bu bireylerin Ldh lokusları değerlendirilmemiştir. (Şekil 3.
17).
Şekil 3. 16. Clethrionomys glareolus örneklerinin Nişasta jel ile incelenmiş Laktat dehidrojenaz enzimi zimogramı. Ldh-1, Ldh-2, Ldh-3, Ldh-4 ve Ldh-5 lokusları.
30
Şekil 3. 17. Clethrionomys glareolus örneklerinin Native PAGE ile incelenmiş Laktat dehidrojenaz enzimi zimogramı. Ldh-1, Ldh-2, Ldh-3, Ldh-4 ve Ldh-5 lokusları.
31
9. Malat dehidrojenaz (Mdh, E.C. 1.1.1.37)
Nişasta jel ile incelenmiş ve malat dehidrojenaz enzimi bir anoda (Mdh-s) bir de katoda
(Mdh-m) göç eden iki izozim sergilemiştir. Anodal formu sitozolik-malat dehidrojenaz (Mdh-
s) ve katodal formu ise mitokondriyal-malat dehidrojenaz (Mdh-m) olarak adlandırılmıştır.
Her iki lokusta da allelik bantların anodal yönünde daha az yoğunluklu subbantlar
belirlenmiştir. Mdh-m lokusunda incelenen tüm bireyler monomorfiktir yani aynı allel için
fikse olmuştur. Mdh-s lokusu ise polimorfik olup incelenen populasyonlarda 3 allel
gözlenmiştir. B alleli yüksek sıklıkta gözlenirken, A ve C allelleri nadir allellerdir.
Heterozigotlarda gözlenen 3 bantlı fenotip enzimin dimerik yapıda olduğunu göstermektedir
(Şekil 3. 18).
Şekil 3. 18. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Malat dehidrojenaz enzimi zimogramı. Anodal göç eden sitozolik Mdh-s, ve katodal göç eden mitokondriyal Mdh-m lokusları.
32
Şekil 3. 18. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Malat dehidrojenaz enzimi zimogramı. Anodal göç eden sitozolik Mdh-s, ve katodal göç eden mitokondriyal Mdh-m lokusları.
10. Malik enzim (Me, E.C. 1.1.1.40)
Nişasta jel ile incelenmiş ve allel tanımlamakta güçlük çekilmiştir. Malik enzimin anoda göç
eden tek bir izozimi tespit edilmiştir. (Şekil 3.19). Malik enzim ayrıca N-PAGE ile
incelenerek daha keskin bantlar elde edilmiş ve genotipler belirlenmiştir. Bu lokusta, 5.
(Sinop) populasyondan bir birey AA genotipine sahip olup, incelenen diğer tüm bireyler
monomorfiktir ve BB genotipine sahiptir. Bu lokusta heterozigot bireye rastlanmadığı için
enzimin altünite yapısı hakkında bir şey söylemek mümkün değildir. (Şekil 3. 20).
33
Şekil 3. 19. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Malik enzim zimogramı.
Şekil 3. 20. Clethrionomys glareolus örneklerinin Native PAGE ile incelenmiş Malik enzim zimogramı.
34
11. Fosfoglukomutaz (Pgm, E.C. 5.4.2.2)
Nişasta jel ile incelenmiş ve Fosfoglukomutaz enzimi anoda göç eden tek bir polimorfik
lokus sergilemiştir. Pgm lokusunda 3 allel belirlenmiş olup en yaygın allel B’dir. Bu lokusta
da allelik bantların anodal yönünde daha az yoğunluklu subbantlar belirlenmiştir. Boyama
süresinin artışıyla bantların sayısı ve yoğunluğu artmıştır. Heterozigotlarda heteromerik
bantların görülmemesi enzimin monomerik yapıda olduğuna işaret eder (Şekil 3. 21).
Şekil 3. 21. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Fosfoglukomutaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir lokus (Pgm).
35
12. Superoksit dismutaz (Sod, E.C. 1.15.1.1)
Superoksit dismutaz enzimi bazı enzimlerin boyanması sırasında akromatik zonlar halinde
kazara veya şans eseri gözlenebilen bir enzimdir. Poliakrilamid jel elektroforezi ile
incelendiğinde (Me ve Hk jellerinde) anoda göç eden 2 lokus (Sod-1 ve Sod-2) belirlenmiştir.
Süperoksit dismutaz enzimini incelemek için, hekzokinaz ve malik enzim jelleri
değerlendirildikten sonra ışığa maruz bırakılmış ve koyulaşan zemin üzerinde akromatik
zonlar (beyaz bantlar) halinde beliren Sod bantları değerlendirilmiştir. İncelenen tüm bireyler
Sod lokuslarında aynı allel için fikse olmuştur (Bk. Şekil 3. 14 ve Şekil 3. 20). Ayrıca nişasta
jellerinde incelenen Hk (Şekil 3. 20) ve G6pdh (Şekil 3.21 ve Bk. Şekil 3. 9) jellerinde bir
anodal ve bir de katodal hareket eden 2 Sod lokusu belirlenmiştir. Bu jellerde de incelenen
Clethrionomys örneklerinde polimorfizm gözlenmemiştir. Her iki lokusda da aynı allel fikse
olmuştur. Anodal enzimin aktiviesi kalın bantlar şeklinde daha yoğun olarak izlenmiştir.
Şekil 3. 21. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta ile incelenmiş G6pdh enzimi jeli ışığa maruz bırakıldıktan sonra akromatik zon şeklinde beliren Süperoksit dismutaz fenotipi. Anoda ve katoda göç eden iki Sod lokusu.
36
13. Fumaraz (Fumarat hidrataz) (Fum, E.C. 4.2.1.2)
Nişasta jel ile incelenmiş ve Fumaraz enzimi anoda göç eden tek bir monomorfik lokus
sergilemiştir. İncelenen populasyonlarda tüm bireyler Fum lokusunda aynı allel (A) için fikse
olmuştur. (Şekil 3. 22).
Şekil 3. 22. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Fumaraz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir monomorfik lokus (Fum).
37
14. Fosfoglukonat dehidrojenaz (Pgd, E.C. 1.1.1.44)
Nişasta jel ile incelenmiş ve Fosfoglukonat dehidrojenaz enzimi anoda göç eden iki allelli
(A,B) tek bir polimorfik lokus sergilemiştir. İncelenen populasyonlarda B alleli yüksek
frekansta gözlenirken A alleli 3 homozigot (4. grup- Kastamonu populasyonu) ve 6
heterozigot ( 2.grup- Akçakoca-Bolu; Uludağ-Bursa ve 3. grup- Abant-Bolu populasyonları)
bireyde izlenmiştir (Şekil 3. 23).
Şekil 3. 23. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Fosfoglukonat dehidrojenaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir lokus (Pgd).
38
15. Adenozin deaminaz (Ada, E.C. 3.5.4.4)
Nişasta jel ile incelenmiş ve Adenozin deaminaz enzimi anoda göç eden oldukça polimorfik
olan tek bir lokus sergilemiştir. İncelenen tüm populasyonlarda ADA lokusunda A ve B
allelleri tespit edilmiştir. Heterozigot bireylerde gözlenen iki bantlı fenotip enzimin
monomerik yapısını göstermektedir (Şekil 3.24).
Şekil 3. 24. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Adenozin deaminaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir polimorfik lokus (ADA).
39
16. Nükleozit fosforilaz (Np, E.C. 2.4.2.1)
Nişasta jel ile incelenmiş ve Nükleozit fosforilaz enzimi anoda göç eden tek bir monomorfik
lokus sergilemiştir. İncelenen tüm bireyler Np lokusunda aynı allel (A) için fikse olmuştur.
(Şekil 3.25).
Şekil 3. 25. Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Nükleozit fosforilaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir monomorfik lokus (Np).
40
İstatistik Analizler
İstatistiksel analizlerde; polimorfik lokus sayısı (P), lokus başına allel sayısı (A),
gözlenen heterozigotluk (Ho), Hardy-Weinberg eşitliği altında beklenen heterozigotluk (He),
populasyonlar arası genetik benzerlik (I:Identity) ve genetik uzaklık (D:distance),
Shannon’un İnformation İndeksi (I) ve populasyonlar arası farklılaşma miktarı (Fst) Popgen
32 (Yeh et al., 1999) programı kullanılarak analiz edildi.
Allozim çalışmaları sonucu 12 lokus polimorfik bulunmuştur. Polimorfik lokuslar
(Idh-2, α-Gpdh, Me, Pgm, Pgd, Mdh-s, Ada, Est -1, Ldh-2, Ldh-3, Ldh-4, ve Ldh-5)
incelenen populasyonlara göre 2 veya 3 allel göstermiştir. Polimorfik lokusların yüzdesi %
12’dir. Bu lokusların tüm populasyonlarda gösterdikleri alleller ve frekansları Tablo 3.2’de
gösterilmiştir.
Tüm lokuslarda görülen genik varyasyon istatistiklerinin özeti ve ortalamaları Tablo
3.3’de gösterilmiştir. Gözlenen ortalama allel sayısı (na)= 1.8333; Etkili allellerin ortalama
sayısı (ne)= 1.2490 ve ortalama Shannon informasyon indeksi (I)= 0.2168 olarak tespit
edilmiştir.
Tüm lokuslarda görülen heterozigotluk ve genetik çeşitlilik indeksleri ve ortalamaları
Tablo 3.4’de gösterilmiştir. Gözlenen ortalama heterozigotluk Ho (Obs_Het) = 0.0740;
beklenen heterozigotluk He (Exp_Het) = 0.1358; Nei’nin beklenen heterozigotluğu = 0.1350
ve ortalama heterozigotluk = 0.1001’dir.
41
Tablo 3. 3. Tüm lokuslarda genik varyasyon istatistiklerinin özeti (Nei, 1987)
Lokus Sample Size na* ne* I* IDH-1 188 1.0000 1.0000 0.0000 IDH-2 188 2.0000 1.0215 0.0589 A-GPD 188 3.0000 1.0776 0.1743
ME 188 2.0000 1.0215 0.0589 PGM 188 3.0000 1.0898 0.2055
SOD-1 188 1.0000 1.0000 0.0000 SOD-2 188 1.0000 1.0000 0.0000 ACO-1 188 1.0000 1.0000 0.0000 ACO-2 188 1.0000 1.0000 0.0000 PGD 188 2.0000 1.1357 0.2374 NP 188 1.0000 1.0000 0.0000
FUM 188 1.0000 1.0000 0.0000 MDH-S 188 3.0000 1.0662 0.1557 MDH-M 188 1.0000 1.0000 0.0000
ADA 188 2.0000 1.9919 0.6911 G6PDH 188 1.0000 1.0000 0.0000
HK 188 1.0000 1.0000 0.0000 GPI 188 1.0000 1.0000 0.0000
EST-1 188 3.0000 1.8976 0.7319 EST-3 188 1.0000 1.0000 0.0000 LDH-2 182 3.0000 2.0269 0.7561 LDH-3 182 3.0000 2.0329 0.7576 LDH-4 182 3.0000 2.0269 0.7561 LDH-5 182 3.0000 1.5881 0.6199
Ortalama 187 1.8333 1.2490 0.2168 St. Sapma 0.9168 0.4097 0.3055
* na = Gözlenen allel sayısı * ne = Etkili allel sayısı [Kimura and Crow (1964)] * I = Shannon's Information index [Lewontin (1972)]
42
Tablo 3. 4. Tüm lokuslarda heterozigotluk istatistiklerinin özeti
Lokus
Sample Size
Obs_Hom Obs_Het Exp_Hom* Exp_Het* Nei** Ave_Het
IDH-1 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 IDH-2 188 0.9787 0.0213 0.9788 0.0212 0.0211 0.0283 A-GPD 188 0.9255 0.0745 0.9276 0.0724 0.0720 0.0553
ME 188 1.0000 0.0000 0.9788 0.0212 0.0211 0.0125 PGM 188 0.9787 0.0213 0.9172 0.0828 0.0824 0.0743
SOD-1 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 SOD-2 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 ACO-1 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 ACO-2 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 PGD 188 0.9362 0.0638 0.8798 0.1202 0.1195 0.1045 NP 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000
FUM 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 MDH-S 188 0.9787 0.0213 0.9376 0.0624 0.0621 0.0627 MDH-M 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000
ADA 188 0.6596 0.3404 0.4994 0.5006 0.4980 0.4689 G6PDH 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000
HK 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 GPI 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000
EST-1 188 0.7447 0.2553 0.5245 0.4755 0.4730 0.3590 EST-3 188 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 LDH-2 182 0.7473 0.2527 0.4906 0.5094 0.5066 0.3297 LDH-3 182 0.7143 0.2857 0.4891 0.5109 0.5081 0.3292 LDH-4 182 0.7253 0.2747 0.4906 0.5094 0.5066 0.3288 LDH-5 182 0.8352 0.1648 0.6276 0.3724 0.3703 0.2503 Mean 187 0.9260 0.0740 0.8642 0.1358 0.1350 0.1001
St. Dev 0.1159 0.1159 0.2069 0.2069 0.2058 0.1504 * Expected homozygosty and heterozygosity were computed using Levene (1949) ** Nei's (1973) expected heterozygosity
Polimorfik lokusların sayısı : 12 Polimorfik lokusların oranı : % 50.00
İncelenen tüm lokuslarda gen akışı ve F-istatistiklerinin özeti (Nei, 1987) Tablo 3.5’de
gösterilmiştir. Buna göre ortalama Fis = 0.2882; ortalama Fit = 0.4714; ortalama Fst = 0.2574
ve Fst ‘den hesaplanan gen akışı (Nm) ortalama 0.7213’ tür.
43
Tablo 3. 5. Tüm lokuslarda gen akışı ve F-istatistiklerinin özeti (Nei, 1987)
Locus Sample Size Fis Fit Fst Nm* IDH-1 188 **** **** 0.0000 **** IDH-2 188 -0.0743 -0.0155 0.0548 4.3143 A-GPD 188 -0.0637 -0.0276 0.0340 7.1108
ME 188 1.0000 1.0000 0.0464 5.1429 PGM 188 0.7713 0.7932 0.0959 2.3564
SOD-1 188 **** **** 0.0000 **** SOD-2 188 **** **** 0.0000 **** ACO-1 188 **** **** 0.0000 **** ACO-2 188 **** **** 0.0000 **** PGD 188 0.5376 0.6631 0.2714 0.6712 NP 188 **** **** 0.0000 ****
FUM 188 **** **** 0.0000 **** MDH-S 188 0.7433 0.7657 0.0873 2.6134 MDH-M 188 **** **** 0.0000 ****
ADA 188 0.1656 0.2174 0.0621 3.7753 G6PDH 188 **** **** 0.0000 ****
HK 188 **** **** 0.0000 **** GPI 188 **** **** 0.0000 ****
EST-1 188 0.2921 0.4625 0.2406 0.7890 EST-3 188 **** **** 0.0000 **** LDH-2 182 0.3163 0.5459 0.3359 0.4943 LDH-3 182 0.2056 0.4721 0.3355 0.4951 LDH-4 182 0.2219 0.4825 0.3349 0.4964 LDH-5 182 0.4142 0.6179 0.3477 0.4691
Ortalama 187 0.2882 0.4714 0.2574 0.7213 * Nm = Fst ‘den hesaplanan gen akışı (Fst = 0.25(1 - Fst)/Fst.)
Nei (1972)’in orijinal genetik mesafe (D:distance) ve genetik benzerlik (I: identity)
değerleri Tablo 3.6’da gösterilmiştir. En yüksek benzerlik (I) değeri 0.9978 olup 5. Grup ve
8. Grup arasındadır. En düşük I değeri ise 0.8637 ile 1. ve 4. Gruplar arasındadır. En yüksek
ve en düşük mesafe (D) değerleri ise sırasıyla 0.1465 ve 0.0022 olarak bulunmuştur.
Genetik mesafe değerleri ve Cavalli–Sforza katsayısı kullanılarak oluşturulan dendrogram
(NJ: Neighbour-joining tree- yakın bağlantı ağacı) Şekil 3.26‘da gösterilmiştir.
44
Tablo 3. 6. Nei'nin orijinal Genetik benzerlik (I: identity) ve Genetik mesafe (D:distance) tahminleri (Nei, 1972)
=================================================================== pop ID 1 2 3 4 5 6 7 8 =================================================================== 1 **** 0.9605 0.9206 0.8637 0.9175 0.9664 0.9270 0.9259 2 0.0403 **** 0.9897 0.9574 0.9850 0.9766 0.9695 0.9862 3 0.0828 0.0104 **** 0.9857 0.9945 0.9519 0.9451 0.9936 4 0.1465 0.0436 0.0144 **** 0.9802 0.9093 0.8996 0.9805 5 0.0861 0.0151 0.0055 0.0200 **** 0.9633 0.9494 0.9978 6 0.0342 0.0236 0.0493 0.0951 0.0374 **** 0.9728 0.9662 7 0.0758 0.0309 0.0565 0.1059 0.0519 0.0276 **** 0.9484 8 0.0770 0.0139 0.0064 0.0197 0.0022 0.0344 0.0530 **** =================================================================== Nei's genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal).
Şekil 3. 26. Genetik mesafe değerleri ve Cavalli –Sforza katsayısı kullanılarak
oluşturulan dendrogram (NJ: Neighbour-joining tree- yakın bağlantı ağacı)
Grup1: Şile-İSTANBUL Grup2 Kandıra-İZMİT+Akçakoca-DÜZCE+Uludağ-BURSA+Zonguldak Grup3: Abant-BOLU +Kızılcahamam-ANKARA Grup4: Küre-KASTAMONU Grup5 : Bürnük-Göktepe-SİNOP+Çakallı-SAMSUN Grup6 : Gürgentepe-Ulubey-Ünye-ORDU Grup7 : Kışla-Bicik-Bulancak-Borça-GİRESUN Grup8 : Sümela-TRABZON
45
Dendrograma göre C. glareolus’a ait 8 populasyon üç küme oluşturdu (Şekil 3.26).
Buna göre birinci kümede SİNOP + SAMSUN (Grup 5), ikinci kümede TRABZON (Grup 8)
populasyonu yer alırken, üçüncü küme ise Grup 2 (Kandıra-İZMİT +Akçakoca-DÜZCE
+Uludağ-BURSA+ZONGULDAK), Grup 1 (Şile-İSTANBUL), Grup 6 (Gürgentepe-
Ulubey-Ünye-ORDU), Grup 7 (Kışla-Bicik-Bulancak-Borça-GİRESUN), Grup 3 (Abant-
BOLU +Kızılcahamam-ANKARA) ve Grup 4 (Küre-KASTAMONU) populasyonlarından
oluşmaktadır. Üçüncü kümedeki populasyonlar iki alt küme oluşturmuştur. Birinci
altkümede Grup 2, Grup 1, Grup 6, Grup 7 populasyonları yer alırken, Grup 3 ve Grup 4
populasyonları birlikte ikinci altkümeyi oluşturmuştur.
46
V. Sonuç ve Öneriler
Nişasta ve poliakrilamid jel elektroforezi yöntemleri ile, 94 örneğin 16 enzim
sistemine ait 24 lokus analiz edildi. Bu lokuslardan 12 tanesi polimorfik özellik gösterdi.
Diğer 12 lokus aynı allele fikse olmuş ve monomorfik özellikteydi. Polimorfik lokusların
oranı (P) % 50, lokus başına ortalama allel sayısı (A) 1.83, Shannon enformasyon indeksi
ise 0.2168’dir. Ortalama heterozigotluk 0.1001, Fst değeri 0.2574 ve gen akışı (Nm) ise
0.7213’tür.
Genetik mesafe değerlerine dayanılarak oluşturulan dendrograma göre incelenen
populasyonlar 3 küme oluşturdu. Birinci kümede SİNOP + SAMSUN, ikinci kümede
TRABZON populasyonu yer alırken, üçüncü küme ise iki altküme oluşturmuştur. Birinci
altkümede Kandıra-İZMİT +Akçakoca-DÜZCE +Uludağ-BURSA+ZONGULDAK, Şile-
İSTANBUL, Gürgentepe-Ulubey-Ünye-ORDU, Kışla-Bicik-Bulancak-Borça-GİRESUN
populasyonları yer alırken, ikinci altküme Abant-BOLU +Kızılcahamam-ANKARA ve
Küre-KASTAMONU populasyonlarından oluşmaktadır.
Clethrionomys glareolus en yaygın palearktik rodent türlerinden biridir. İngiliz
adalarından Baykal gölüne ve Kola Peninsula’dan Anadoluya kadar yayılış gösterir. Önceki
çalışmalar geniş alanları işgal eden türlerin daha küçük alanları işgal eden türlerle
karşılaştırıldığında daha yüksek genetik varyasyona sahip olduğunu göstermiştir. Ancak,
Clethrionomys glareolus‘un genetik özellikleri sadece birkaç populasyonda belirlenmiştir.
Polonya’daki bir orman populasyonunda H=0.032-0.042 ve P=%30 olarak belirlenmiştir.
Danimarka’daki bir populasyonda H=0.006 ve P=%12, Avusturya’daki populasyonlarda
H=0.028-0.085 ve P=%8-22’dir. Yugoslavya’daki Clethrionomys glareolus populasyonları
arasında genetik varyasyon (dissimilarity) bildirilmiş ancak H ve P değerleri verilmemiştir.
Bazı İsveç populasyonlarında genetik varyasyon bildirilmiş ve hepsinde komşu populasyonlar
arasındaki H ve P değerleri coğrafik olarak uzak populasyonlarda olduğu gibidir.
47
Hall ve Semeonoff (1985), Britanya’daki Clethrionomys glareolus örneklerinin
plazmasındaki esteraz polimorfizmini nişasta jel elektroforezi ile çalışmışlardır. Plazma
örneklerinde belirledikleri tek bir esteraz (Es-1) lokusunda üç allel (F,S,O) belirlemişlerdir.
Bu çalışmada Kuzey Anadolu’da yayılış gösteren C. glareolus örneklerinin kas dokularında
ise 3 Esteraz lokusu belirlenmiş ve bunlardan EST-1 lokusunda varyasyon bulunmuştur. Bazı
populasyonlarda 2 (A,B) bazılarında ise 3 allel (A,B,C) tespit edilmiştir. Hall ve Semeonoff F
allelinin kuzeyde S allelinin ise güneyde yaygın olduğunu belirtmişler ve S alleline sahip
hayvanların yüksek populasyon yoğunluğunda daha fazla hayatta kalabildiklerini
belirtmişlerdir. Araştırıcılar ayrıca, elektroforetik jellerdeki Es-1 lokusu ürünlerinin eserin ve
diazinon inhibitörlerine dirençli ve termal olarak stabil (62oC’de 15 dk) olduklarını
belirlemişlerdir. Bizim araştırmamızda allellerin dağılımı her populasyona göre değiştiği ve
coğrafik olarak ilişkili olmadığı ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada enzim karakterizasyonu
yapılmamıştır.
Borkowska (1999) Kuzey-doğu Polonya’daki Clethrionomys glareolus’un birbirine
minimum 10 km, maksimum 50 km uzaklıktaki 5 populasyonu arasındaki genetik ve
morfolojik varyasyonları çalışmıştır. Genetik polimorfizmi belirlemek için hayvanların kan
plazması, böbrek, karaciğer ve tükrük bezlerini kullanarak 37 enzim lokusunu nişasta, selüloz
asetat ve agaroz jel elektroforezi ile araştırmışlardır. 37 lokustan 14’ü polimorfik (Ldh-2, Me-
2, Dia, Cat, Aat2, Pgm-1, Pgm-2, Pgm-3, EstB3, EstD, Amyl-2, Pep-2, Acy, Mpi) bulunurken
bunlardan beşinin (Me-2, Dia, Pgm-3, EstB3, Amyl-2) tüm populasyonlarda polimorfik
olduğu bulunmuştur. Çalışılan populasyonlarda polimorfik lokusların oranı P: 0,162- 0,270
arasında; gözlenen ortalama heterozigotluk (Ho) ise 0,074-0,095 arasındadır ve tüm
48
populasyonlarda önemli heterozigot eksikliği tespit edilmiştir. Beş populasyonun dördünde
allel frekanslarında mevsimsel varyasyonun varlığı F istatistikleri ile gösterilmiştir. Bizim
çalışmamızda birbirine çeşitli uzaklıktaki 18 populasyon 8 grup altında toplanarak analiz
edilmiştir. Polimorfik lokusların oranı % 50 dir. Ldh, Est ve Pgm lokusları bu çalışmada da
polimorfiktir. Kuzey Anadolu populasyonlarındaki genetik varyasyon Kuzey doğu Polonya
populasyonlarından daha yüksek bulunmuştur. Ortalama gözlenen heterozigotluk ise 0.0740
olup, Kuzey doğu Polonya populasyonları ile aynıdır. ADA, EST ve LDH lokusları dışında
tüm lokuslarda önemli heterozigot eksikliği tespit edilmiştir. Polonya populasyonlarında
mevsimsel varyasyon rapor edilmiştir. Bizim örneklerimiz ise yaz aylarında toplandığı için
mevsimsel bir ilişki aranmamıştır.
Frisman ve arkadaşları (2002) Okhotsk denizi bölgesindeki Clethrionomys cinsi
kırmızı sırtlı sıçanların (C. rutilus, C. rex, C. rufocanus) genetik farklılaşması ve gen-coğrafik
varyasyon ilişkisini çalışmışlardır. 17 lokaliteden 159 örneğin kan ve böbrek dokularında 13
enzim ve 3 enzim olmayan protein olmak üzere 16 protein sistemini nişasta jel elektroforezi
ile incelemişlerdir. 16 proteini kodlayan 25 lokusu yorumlayabilmişler ve 6 lokusun ( Ldh-
reg, Mor-1, Mor-2, Aat-2, Sod-1, Sod-2) monomorfik olduğunu bildirmişlerdir. Bizim
çalışmamızda da her iki SOD lokusu monomorfik bulunmuştur. Frisman ve arkadaşlarının
çalışmasında Böbrek dokusunda Ldh 5 veya daha fazla (heterozigotlarda) aktivite zonu
göstermiştir. Yavaş mobiliteli 1 veya 2 bant gösteren Ldh-reg lokusu bazı lokalitelerden
yakalanan hayvanlarda izlemek mümkün olmamış ve bu yüzden bu lokus genetik indis
hesaplamalarından çıkarılmıştır. Bizim kas dokuları ile çalışmamızda da, Ldh 5 lokus
tarafından kodlandığı açıktır. Bazı örneklerde aktvite zonları yeterince ayırd edilemediği için
analizlerden çıkarılmıştır. Frisman ve arkadaşları Esteraz lokuslarında sadece maksimum
(EST-1) ve minimum (EST-4) anodal mobiliteli lokusları yorumlayabilmiş ve analizlerde
kullanmıştır. Biz de benzer şekilde sadece Est -1 ve Est-3 lokuslarını değerlendirebildik.
49
Esteraz ve Laktat dehidrojenaz lokuslarının Clethrionomys cinsine ait türlerde genel olarak
polimorfik olduğu söylenebilir ve populasyon karşılaştırmalarında kullanılabilir.
Gebczynski ve arkadaşları (1993) 21 lokus tarafından kodlanan proteinlerdeki
elektroforetik varyasyonu Clethrionomys glareolus’un güney ve doğu Polonya’daki beş
populasyonunda analiz etmişlerdir. Populasyon içi varyasyonu yüksek (P=%19-33.3; H=
0.039-0.067), populasyonlar arasında Nei’nin ortalama mesafesini 0.193 bulmuşlardır.
Nisbeten yüksek Fıs değerleri (0.306) yüksek seviyede farklılaşmayı göstermektedir. Allel
frekanslarındaki varyasyon (Fst, 0.137-0.572) yüksektir ve bu da önemli coğrafik genetik
heterojeniteyi göstermektedir. Genetik ve coğrafik mesafeler arasındaki ilişki uyumlu
değildir. Bizim çalışmamızda P ve H değerleri Polonya populasyonlarından yüksek
bulunmuştur. Fıs ve Fst değerleri de nisbeten yüksektir ve farklılaşmanın yüksek olduğunu
göstermektedir.
Gebczynski ve arkadaşları (1993)’nın çalışmasında polimorfik lokuslardan Ca, Es-1,
Gpi, Icd, Me, Mdh-1 lokusları 2 allel (A ve B), Pgd, Pgm, Sod, Ldh-1 lokusları ise 3 allel
(A,B,C) göstermiştir. Bizim çalışmamızda ise polimorfik lokuslardan, Idh-2, Me, Pgd, Ada
lokusları A ve B olmak üzere 2 allel, α-Gpdh, Pgm, Mdh-s, Est -1, Ldh-2, Ldh-3, Ldh-4, ve
Ldh-5 lokusları A,B,C olmak üzere 3 allel göstermiştir. Allelik varyasyon açısından Idh, Me,
Pgm Ldh lokusları Polonya ve Türkiye populasyonlarında benzerdir.
Çalışmamızda gen akışı değeri (Nm= 0.7213) oldukça yüksek bulunmuştur. Bu durum
ormanlık alanların tahribine bağlı olarak bu türün kesintili yayılış gösterdiğini ve morfolojik
farklılıkların azalan gen akışından olduğunu belirten morfolojik çalışmalarla çelişiyor
görünmektedir. Bürnük (Sinop)’ten alınan 6 örnekte dorsal farklı olarak sarımsı kızıldır. Bu
renklenme diğer lokalitelerden belirgin bir şekilde farklıdır. Göktepe (Sinop)’deki 11 örnek
de Bürnük örneklerinde olduğu gibidir. Bu populasyonda belirgin farklar vardır. Çakalllı
50
(Samsun)’dan 2 örnekte dorsal renk açık kızılımsıdır. Sinop örneklerine göre daha koyudur.
Allazim analizlerinde bir grup altında topladığımız bu örnekler dendogramda ayrı bir küme
oluşturmuştur ve bu farklılıkları genetik olarak da desteklenmiştir.
Rodent çalışmaları, çok sayıdaki genetik olarak farklı grupların, coğrafik mesafeler
boyunca farklılaşabileceğini göstermiştir. Gen akışının sadece nisbeten kısa mesafelerde
homojen populasyonlarda etkili olduğu varsayılır. Gebczynski ve arkadaşları (1993) gen akış
oranının türlerin göç eğilimlerine ve onların farklı komşu biyotopları “doyurma”
yeteneklerine bağlı olduğunu bildirmiştir. Clethrionomys glareolus sınırlı göç yeteneğine
sahiptir, göçleri düzenli ve üreme mevsimi ile ilişkilidir. Bu tür, görünüşte her ormanlık
mikrohabitatı işgal eder. Bunlar yeni ormanlaşmış alanlarda hızlı bir şekilde kolonize olur ve
bu şüphesiz populasyonun genetik varyasyonunu etkiler. Bunun tersine, bu türün tipik çevresi
olan büyük ormanların populasyonun genetik yapısını homojenize edebileceği beklenebilir.
Farklı büyüklükte, farklı coğrafik mesafelerde, doğal veya insan etkileri ile tahribat sonucu
kesintiye uğramış ormanlarda yaşayan Clethrionomys glareolus populasyonlarındaki genetik
varyasyonları belirlemek bu tür üzerindeki evrimsel etkilerin anlaşılmasında yararlı olacaktır.
Redeker ve arkadaşları (2006) Danimarka’nın doğusundaki üç ormandan (5
lokaliteden) topladıkları 161 Clethrionomys glareolus’un dokularını kullanarak 9 mikrosatellit
lokusunu incelemişlerdir. Populasyonların içinde genetik çeşitliliği (diversity) yüksek
bulmuşlardır (Ho= 0,753-0,806). Bu türün başlıca yaşam alanı olarak ormanlar gibi spesifik
habitat gereksinimleri vardır. Bu yüzden ormanların doğal veya insan etkisiyle
fragmantasyonu, populasyonun altyapılanmasına ve böylece populasyonlar arasında kesintili
yayılışa sebep olabilir. Bunu araştıran Redeker ve arkadaşları (2006) iki komşu orman
arasında bulunan bir yolun Clethrionomys glareolus’un gen akışı üzerine herhangi bir bariyer
etkisi oluşturmadığını tespit etmişlerdir. 5 lokalitenin birinde darboğaz benzeri durum için
genetik kanıt bulunmuştur. Clethrionomys glareolus’un sadece yıldan yıla değil aynı zamanda
51
mevsimden mevsime bazen yüksek yoğunluk dalgalanmaları sergilediği bilinmektedir. Bu
yüzden, belirlenen darboğaz benzeri durumun, yoğunluğun düşük olduğu evrede az sayıdaki
birey yüzünden olabileceği belirtilmiştir.
Otoyollar, tarla vb zirai alanlar ve demiryolları gibi insan yapımı habitatlar birçok
türün hareketini sınırlayabilir, bu yüzden bunlar bazı türlerin davranış ve yayılış biçimini
etkileyen “bariyer etkisi” yaratabilir. Bugün habitat bozulması (fragmentation) yaşayan bitki
ve hayvanlar için en ciddi tehditlerden biri olarak düşünülebilir. Bu, alan kaybı, kalan alan
parçasındaki azalma, fragmanlar arasında artan mesafe ve fragmanın geometrisi (şekli) nin
neden olduğu populasyonun spatial yapılanması yüzündendir.
Habitat fragmantasyonunun en önemli negatif sonuçları:
1. Etkili populasyon büyüklüğündeki gerileme soyiçi üremeyi artırarak genetik çeşitliliği
azaltır.
2. Demografik populasyon dinamikleri ve türün global tükenme riskini artırabilen katastrofik
etkiler lokal tükenme riskini artırır.
3. Bireylerin göç yeteneğinde azalma ve buna bağlı olarak kolonize ve yeniden kolonize olma
yeteneğinde kayıplar
Fragmantasyonun etkisi çalışılan türe bağlıdır ve davranış, dağılım biyolojisi ve habitat
gereksinimleri gibi faktörlerden etkilenir. Ülkemizde de kuzey Anadoluda yapılmakta olan
otoyollar ve barajların etkisi zamanla birçok diğer canlılar kadar Clethrionomys glareolus’da
da populasyonun genetik yapısında değişikliğe yol açabilir. Bu yüzden moleküler tekniklerle
kısa sürede belirlenebilen genetik varyasyon çalışmaları ile bunun takip edilmesi ve genetik
çeşitliliğin sürdürülebilmesi için önlemler alınması gerekir.
Allozim ve protein elektroforezi çalışmaları bu türde genetik varyasyonun nisbeten
düşük olduğunu göstermiştir. Bunun tersine Clethrionomys glareolus’da mikrosatellitlerin
52
diğer pek çok rodent türünde olduğu gibi oldukça polimorfik olduğu bulunmuştur (Gockel et
al 1997; Redeker et al 2006)
Şimdilik Anadolu populasyonları arasında gen akışı olduğu görülse de kesintiye
uğramalarının üzerinden geçen zamana bağlı olarak, zamanla altpopulasyonların
gelişebileceği söylenebilir. Populasyon yoğunluğuna ve genetik sürüklenmeye bağlı olarak
bu populasyonlar farklı şekilde evrimleşebilir.
Bu çalışma Türkiye populasyonlarında gerçekleştirilmiş ilk genetik çalışmadır.
Sonuç olarak, C.. glareolus’un kuzey Anadolu’da yayılış gösteren populasyonları arasında
genetik farklılaşmaların belirgin olduğu buna karşın populasyonların genetik farklılıkları ile
coğrafik mesafeler arasında belirgin bir ilişkinin olmadığı söylenebilir. Çok daha kesin
sonuca ulaşabilmek için örnek sayısını artırmak ve daha fazla polimorfik lokus incelemek
gerekmektedir.
Bundan sonraki çalışmalarda, allozim çalışmalarının yanında DNA düzeyinde diğer
moleküler teknikleri uygulayarak ileri çalışmaların yapılmasıyla türün evrimine ve
populasyon genetiğine katkılar sağlanabilir.
53
VI. Kaynaklar
Ayala, F.J., Powell, J.R., Tracey, M.L., Maurano, C.A. and Perez-Salas, S., 1972. Enzyme variability in the Drosophila willistoni Group. IV. Genic variation in natural populations of Drosophila willistoni. Genetics, 70: 113-139. Borkowska, A. 1999. Genetic and morphological variation among populations of the bank vole Clethrionomys glareolus from North-eastern Poland: The seasonal aspect. Zeitschrift fur Saugetierkunde. Volume 64, Issue 5, Pages 285-297. Corbet,G. B., 1978, The Mammals of the Palaearctic region: a taxonomic review. Brit.
Mus. Nat. Hist., Cornell Univ. Press, London. Çolak, E., and Kıvanç, E. 1991, Distribution and Taxonomic Status of genus
Clethrionomys Tiselius, 1850 (Mammalia: Rodentia) in Nort Anatolia. Commun. Fac. Univ. Ank. Series C.V.9:1-16.
Çolak, E., YİĞİT, N., Özkurt, Ş., Sözen, M. 1997, Karyotype of Clethrionomys
glareolus (Schreber, 1780) in Turkey. Tr. J. Zoology 21:123-125. Ellerman, J.R., 1948, Key to the rodents of South-West Asia in the British Museum
Collection. Proc. Zool. London. 118: 765- 816. Ellerman, J. R., and T. C. S. Morrison- Scott, 1951, Checklist of the Palaearctic and
Indian mammals 1758- 1951. Trustees of the British Museum (Natural History), London, 810 pp.
Felten, H., Spitzenberger, F. and Storch, G., 1971, Zur Kleinsaugerfauna West-
Anatolien. Teil I. Senckenbergiana Biol. 52 (6): 393-424. Filippucci, M.G., 1992 , Allozymic variation and divergence among European, Middle
East and North Africa species of the genus Apodemus (Rodentia, Muridae). Isr. J. Zoology. 38 (3-4): 193-218.
Frisman, L.V., Kartavtseva, I. V., Pavlenko, M. V., Kostenko, V. A., Suzuki, H., Iwasa, M., Nakata, K., and Chernyavskii, F. B. 2002. Gene-Geographic Variation and Genetic Differentiation in Red-Backed Voles of the Genus Clethrionomys (Rodentia: Cricetidae) from the Region of the Sea of Okhotsk. Russian Journal of Genetics. 38(5): 538-547. Gebczynski, M., Ratkiewicz, M., and Dryden, G. L. 1993. Electrophoretic Variation Among the Five Polish Populations of the Bank Vole. Biochemical Systematics and Ecology. 21(8): 825-831. Gockel, J., Harr, B., Schlötterer, C., Arnold, W., Gerlach, G., Tautz, D. 1997. Isolation and characterization of microsatellite loci from Apodemus flavicollis (rodentia, muridae) and Clethrionomys glareolus (rodentia, muridae). Mol. Ecol. 6:597-599. Hall, S. J. G. and Semeonoff, R. 1985. Plasma esterase polymorphism in the bank vole, Clethrionomys glareolus in Britain. J. Zool. Lond. (A) 207: 213-222.
54
Harris, H. and Hopkinson, D. A. 1976. Handbook of enzyme electrophoresis in human
genetics. North-Holland Publishing Company, Amsterdam; Oxford American Elsevier Publishing Company, Inc., New York. Hillis, D.M. and Moritz, C., 1990, Molecular Systematics. p. 45-127. Sinauer Associated Inc.
USA.
Leither, M. and Hartl, G., 1988. Genetic variation in the Bank Vole Clethrionomys glareolus: biochemical differentiation among populations over short geograhic distances. Acta Theorologica (33) 16: 231-245.
Nei, M. 1972. Genetic Distance Between Populations. American Naturalist. 106:283-292.
Nei, M., 1978. Molecular population genetics and evolution, Amsterdam (North Holland Publ. Co.) Nei, M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. Columbia Uni. Press, New York.
Neuhauser, G., 1936, Die Muriden von Kleinasien. Zeit. Sauget.11: 161-236. Osborn, D.J., 1962, Rodents of the subfamily Microtinae from Turkey. J. of Mammalogy
43: 515-529. Redeker, S., Andersen, L. W., Pertoldi, C., Madsen, A. B., Jensen, T. S., and Jorgensen, J. M. (2006). Genetic structure, habitat fragmentation and bottlenecks in Danish bank voles (Clethrionomys glareolus). Mamm. Biol. 71(3):144-158. Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning, a laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. (1989).
Spitzenberger, F., Englisch, H., Hammer, S., Hartl, G. b., Suchentrunk, F. 1999.
Morphological and genetic diffrentiation of bank voles, Clethrionomys glareolus,
from the Eastern Alps. Folia Zoologica. Volume 48, Issue SUPPL. 1, Pages 69-94
Yeh, C.F., Yang, R., Boyle, T. POPGENE Version 1.31. Windows base software for Population Genetics Analysis. (1999)
55
VII. Ekler
a) Mali Bilanço ve Açıklamaları
Bütçe Kodu
Ödenek Adı Hareket Tarihi
Gider Miktarı
0-03-2 Tüketime Yönelik Mal ve Malzeme Alımları 23/09/2004 3,882.200 0-03-2 Tüketime Yönelik Mal ve Malzeme Alımları 23/09/2004 13,511.000 0-03-3 Yolluklar 24/08/2004 480.000 2-03-2 Tüketime Yönelik Mal ve Hizmet Alımları 06/07/2004 339.840 2-03-3 Yolluklar 13/10/2004 480.000 Toplam Gider 18,693.040 Toplam Ödenek 19,300.000 Kalan 606.960
b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar (BAP Demirbaş numaraları dahil )
Projede kapsamında “Makine ve Teçhizat” satın alınmamıştır.
c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları)
Clethrionomys örneklerinin 24 enzim lokusundaki genotipleri EK c.’ de
sunulmaktadır.
d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar)
Proje verileri özeti Haziran 2008’de yapılacak olan Ulusal Biyoloji
Kongresinde bildiri olarak sunulmak üzere gönderilmiştir.
e) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler
Değerlendirmeler ve İstatistik veriler ancak tamamlandığından proje verileri
SCI kapsamındaki dergilere sunulmak üzere yayına hazırlanmaktadır.
56
EK-c. Clethrionomys örneklerinin 24 enzim lokusundaki genotipleri
