II Workshop del Programa TransNanoAvansens

Programa de I+D en Tecnología 2018, Comunidad de Madrid

12 de julio 2021

Alejandro Valverde De la Fuente

Grupo BIOUCM

Universidad Complutense de MadridAv. Complutense, s/n, 28040 Madrid

Grupo de Electroanálisis y Biosensores Electroquímicos

Investigadora principal: Dra. Susana Campuzano

(Bio)sensores

Dispositivos POC

(Point-Of-Care)

(Bio)sensores

PLATAFORMAS BIOSENSORAS PARA AUTOANTICUERPOS Y ANTÍGENOS PROTEICOS EN

ENFERMEDADES AUTOINMUNES Y DEGENERATIVAS

Antígenos proteicos: RANKL

Determinación de RANKLRegulador en la resorción ósea

Sobreexpresión de RANKL implica mayor degradación del hueso

Enfermedades degenerativas del tejido óseo

Artritis reumatoideOsteoporosis

Antígenos proteicos: RANKL

Diseño de la plataforma

A. Valverde et al., ChemElectroChem 7 (2020) 810-820 doi: 10.1002/celc.201902025

2e- BQ

HQ

HRPred

HRPox

H2O2

H2O

SPCE

i, A

Time, s

i α [RANKL]

H2O2

Detección amperométrica(Eapp= -0.2V vs electrodo pseudoreferencia de Ag)

1) p-ABA Injertado 2) EDC/Sulfo-NHS

3) Strep

4) bCAb

5) Agente bloqueante

6) Muestra(RANKL)

7) HRP-DAb-AuNPs/MWCNTs

Nanomaterial hibrido (AuNPs/MWCNTs) modificado con múltiples moléculas de anticuerpos y HRP

Amplificación de señal

200 400 600 800 10000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ab

so

rban

ce, a.u

.

Wavelength, nm

AuNPs

MWCNTs

AuNPs/MWCNTs

Antígenos proteicos: RANKL

Características analíticas

AuNPs (ɸ = 12 ± 4 nm) sobre MWCNTs

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8-200

-100

0

100

200

-i,

AE, V

MWCNTs

AuNPs/MWCNTs

AuNPs

SPCE

1 mM HQ PB 50 mM pH 6.0 (CV)

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8-200

-100

0

100

200

-i,

A

E, V

Efecto electrocatalítico sinérgico

5 mM [Fe(CN)6]-3/-4 y 0.1 KCl (CV)

-0.3 0.0 0.3 0.6 0.9-300

-150

0

150

300

-i,

A

E, V

MWCNTs

AuNPs/MWCNTs

AuNPs

SPCE

-0.3 0.0 0.3 0.6 0.9-300

-150

0

150

300

-i,

A

E, V

Parámetros Valores

Intervalo lineal, pg mL-1 10.4 - 1000

LOD, pg mL-1 (n=10)* 3.1

RSD, % (n=10) 4.0

Estabilidad nanomaterial, días 20

Estabilidad inmunosensor, días 30 0 200 400 600 800 1000 12000

2000

4000

6000

8000

-i,

nA

RANKL, pg mL-1

Pendiente: 5.4 ± 0.2 nA mL pg-1

Ordenada: 1,387 ± 44 nA

Curva de calibrado

*3xsb/pendiente

R2 = 0.995

Antígenos proteicos: RANKL

0 100 200 300 400 5000

1000

2000

3000

4000

-i,

nA

RANKL, pg mL-1

x27.9

x6.5HRP-DAb-MWCNTs

HRP-DAb-AuNPs/MWCNTs

HRP-IgG-DAb

HRP-DAb-AuNPs/MWCNTs

HRP-DAb-MWCNTs HRP-IgG-DAb

Factor de amplificación

Gran aumento de la sensibilidad con AuNPs/MWCNTs

5 µL de suero humano (90 min de ensayo)

Control CRC (III) CRC (IV) RA0

100

200

300

400

500

RA

NK

L i

n s

eru

m,

pg

mL

-1

Pools

Discriminación del potencial metastásico

0 100 200 300 400

0

100

200

300

400

500

Imm

un

osen

so

r

ELISA

Pendiente: 1.02 ± 0.03Ordenada: 1 ± 5

Excelente correlación con metodología ELISAClara sobreexpresión

de RANKL en RA

Detección de autoanticuerpos

Caracterización de la respuesta humoral

Detección precoz y seguimiento de enfermedades

Nivel sérico de autoanticuerpos en enfermedades autoinmunes y/o degenerativas

Autoanticuerpos: dsDNA

Artritis reumatoideSano

Determinación de AAbsfrente a dsDNA en suero

Perfil de inmunidad(IgGs, IgMs e IgAs)

AAbs reconocen DNA de cadena doble y su concentración sérica está relacionada con la gravedad de la enfermedad

Enfermedades autoinmunesLupus eritematoso sistémicoArtritis reumatoide

Autoanticuerpos: dsDNA

Diseño de la plataforma

Características analíticas

Parámetros Valores

Intervalo lineal, U mL-1 1 - 200

Pendiente, nA mL U-1 20.7 ± 0.6

Ordenada origen, nA 270 ± 40

LOD, U mL-1 (n=10)* 0.3

RSD, % (n=8) 3.3

*3xsb/pendiente0 50 100 150 200

0

1000

2000

3000

4000

5000

-i,

nA

Anti-dsDNA Ab isotypes, U/mL

Curva de calibradoR2 = 0.993

B. Arévalo et al., Biosens. Bioelectron 160 (2020) 112233 doi: 10.1016/j.bios.2020.112233

Btn-dsDNA: obtenido por PCR a partir de plásmido humano

45 min de ensayo

Autoanticuerpos: dsDNA

Aplicabilidad en muestras de suero

Artritis reumatoide

Sano

Suero

[AAbs-dsDNA]*, U mL-1

Inmunosensor(RSD, %)

ELISA (RSD, %)

Individuos sanos (Control)

8 ± 2 (1.1) 8 ± 1 (4.4)

13 ± 3 (3.8) 15 ± 3 (3.2)

19 ± 4 (3.4) 16 ± 6 (5.4)

Pacientes con RA

1000 ± 40 (4.4) 1100 ± 60 (5.3)

1770 ± 90 (5.3) 1740 ± 80 (4.3)

2430 ± 50 (2.2) 2300 ± 100 (5.8)

Discriminación de pacientes con artritis reumatoide

*valor medio ± ts/ 𝑛, n = 3, α = 0.05

Autoanticuerpos: AQP4

Determinación de AAbsfrente a AQP4 en suero

Proteína de canal de agua expresada en los

astrocitos del SNC

En preparación para publicación

Enfermedades autoinmunes y/o neurodegenerativasNeuromielitis ópticaEnfermedad de AlzheimerEsclerosis lateral amiotrófica (ELA)Enfermedad de Parkinson

AAbs se unen a la proteína AQP4 alterando su función

(daño cerebral)

Autoanticuerpos: AQP4

Strep-MBs

b-AQP4

AAbs-AQP4

anti-Human-IgG-HRP

Diseño de la plataforma Características analíticas

Parámetros Valores

Intervalo lineal, pg mL-1 30 – 2500

RSD, % (n=10) 2.5

LOD, pg mL-1 (n=10)* 8.8

Tiempo de ensayo, min 90

Suero

[AAbs-AQP4]*, ng mL-1

Inmunosensor(RSD, %)

ELISA (RSD, %)

Individuos sanos (Control)

156 ± 7 (2.6) 170 ± 20 (6.1)

170 ± 10 (3.6) 160 ± 20 (6.1)

190 ± 10 (3.5) 200 ± 20 (6.2)

Pacientes con AD

1600 ± 100 (4.6) 1500 ± 200 (5.9)

3300 ± 300 (4.6) 3200 ± 300 (5.8)

1300 ± 100 (4.0) 1300 ± 200 (6.9)

Aplicabilidad en muestras de suero

*3xsb/pendiente

LOD 45 veces inferior que metodología ELISA y tiempo de ensayo 3 veces más corto

Sobreexpresión de AAbs-AQP4 en AD

*valor medio ± ts/ 𝑛, n = 3, α = 0.05

Autoanticuerpos: Diagnóstico de AD

Bioplataforma amperométrica multiplexada para diagnóstico de Enfermedad de Alzheimer

Detección de AAbs específicos en suero de pacientes diagnosticados

con AD e individuos sanos

Firma de autoanticuerpos

Panel de biomarcadores

Autoanticuerpos: Diagnóstico de AD

HaloTag-MBs

Péptido HaloTagexpresado en fago

MBs modificadas con péptido HaloTag

Muestra suero

HRP-anti-human-IgG

AAb

Detección amperométrica

(Eapp= -0.20 V vs. electrodo pseudoreferencia de Ag)

H2O HRP red

HRP ox

HQ red

HQ ox

2e-

H2O2

i, n

A

t, s

AD

CT

SPCE

Aislamiento y marcaje de AAbs-AD

MBs modificadas

HaloTag-MBs

Péptido HaloTagAD-serorreactivo

HRP-anti-human-IgG

AAb-AD

Phage DisplayVisualización de fagos

1. Identificación de los péptidos expresados en fagos más inmunoreactivos

2. Clonación y expresión como proteínas 6xHisHalotag

Autoanticuerpos: Diagnóstico de AD

p< 0.0007 p< 0.002 p< 0.0007

p< 0.0003 p< 0.0006 p< 0.0004

Control

AD

p< 0.002

Péptido AUC, % Sensibilidad, % Especificidad, %

94AS (NUPR1) 92.0 90.0 80.04K16 (PYGB) 97.0 100.0 80.0

4N8 (ANTXR1) 98.0 100.0 90.044AM (OR8J1) 96.0 100.0 80.0

APP+1 95.0 100.0 90.0UBB+1 90.0 90.0 90.0

Todos los péptidos 100.0 100.0 100.0

Alta sensibilidad y selectividad para discriminación de AD

Dilución suero 1/1000

Detección amperométrica

en SP8CE

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

CT

AD

-i,

nA

0

2

4

6

8

10

AD

/CT

ra

tio

WE1 WE2 WE3 WE4 WE5 WE6 WE7 WE8

Autoanticuerpos: Diagnóstico de AD

Discriminación de pacientes con AD mediante la detección multiplexada de AAbs en suero

Diagnóstico fiable y mínimamente invasivo

(dispositivos POC)

WE1

No peptide

WE5

94AS (NUPR1)

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0B

A

B

WE3

APP+1

WE7

4K16 (PYGB)

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

BWE2

724AS (control peptide)

WE6

44AM (OR8J1)

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

WE4

UBB+1

WE8

4N8 (ANTXR1)

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

0 100 200 300 400

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

B

A

B

20 s

100 nA

20 s

500 nA

20 s

500 nA20 s

500 nA

20 s

500 nA20 s

500 nA

20 s

500 nA

20 s

500 nA

Fácil implementación en placas electroquímicas de 96xELISA

Aceptado hoy y propuesta de portada principal en revista

Agradecimientos

II Workshop del Programa TransNanoAvansens

Programa de I+D en Tecnología 2018, Comunidad de Madrid

12 de julio 2021

Alejandro Valverde De la Fuente