III -La Chromatographie liquide haute performance

Les différents type de Chromatographie Liquide

L’appareillage

La chromatographie d’adsorption

La chromatographie de polarité de phase normale

La chromatographie de polarité de phase inverse

Les modes de travail

Les détecteurs

Les domaines d’application

La chromatographie planaire

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1- Les différents types de CL

Domaines d’application– Masse molaire élevée >10 000 g/mol

• Espèces non polaires : perméation sur gel

• Espèces polaires ou ioniques : filtration sur gel

– Espèces ioniques à faible masse molaire

• Echange d’ions– Petites molécules non ioniques

• Chromatographie de partage

Soluté

Phasestationnaire

Phase

mobile

3

2- L’appareillage2-1- Le chromatographe Chaque paramètre

chromatographique doit être

optimisé pour assurer l’analyse

qualitative et quantitative

– La phase mobile

– La phase stationnaire

– Dimension de la colonne

– Le volume d’injection

– Le traitement de l’échantillon

– Le débit de la phase mobile

– La température de la colonne

– Le détecteur

Pompes

Injecteur

Colonne

Détecteur

Solvants d’élution

Dégazeur

Collecte de

données

4

2-2- Les solvantsCompatibilité avec le système de détection

– Pas d’absorption aux longueurs d’onde de travail (détection par absorption)– Indice de réfraction de la phase mobile différent de celui des solutés (détecteur réfractomètres)

Miscibilité et solubilité des solutésViscosité

– Une augmentation de la viscosité diminue les coefficients de diffusion et de transfert de masse : diminution du nombre de plateaux théoriques

– La pression en tête de colonne augmente proportionnellement à la viscosité de la phase mobileTempérature d’ébullition

– Problème de dégazagePureté des solvants

– Alcanes transparents jusqu’à 190 nm mais les traces d’oléfines absorbent vers 250 nm– Oxygène dissout augmente la longueur d’onde limite de détection

Toxicité et dangerosité– Attention aux solvants chlorés et aromatiques

• Force éluante• Polarité• Coefficient de partage eau/octanol

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2-3- Les problèmes de dégazage et les dégazeurs

Détérioration de la colonne

Bruit lié à la pompe

Problème de détecteur

Les dégazeurs

• Dégazage à l’hélium

• Dégazage sous vide

• Dégazage par ultra sons

Efficacité du dégazage

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2-4- Les pompes– Assurent l’écoulement de la phase mobile dans la colonne– Doivent être près puissantes : P = 420 bars

• Viscosité des solvants• Granulométrie de la phase stationnaire

– Généralement pompes à pistons alternatifs• Petit volume interne• Pression de sortie élevée (700 bars)• Débit constant quelque soit la pression dans la colonne

– Attention aux propriétés physiques de remplissage des colonnes: doivent résister à de fortes pressions

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Pompe isocratique- 1 seul solvant délivré

- Travail en mode isocratique

Pompe binaire: 2 pompes Avantages

- Faible chambre de mélange

- Travail en mode gradient

- Mélange des solvants à haute pression

- Gradient le plus reproductible

(débit et composition extrême)

- Gradient le plus rapidement délivré

Inconvénients

- Plus complexe et plus cher

- Problèmes de cavitation avec certains solvants

Pompe quaternaire Avantages

- Maximum 4 solvants délivrés

- Travail en mode gradient

- Une seule tête de pompe

- Prix plus faible

Inconvénients

- Moins performants aux conditions extrêmes

- Gradient moins précis et reproductible

- Nécessite un dégazage en ligne

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2-5- L’injecteur

Vanne à haute pression à 6 voies– Injection brève pour ne pas perturber le régime

d’écoulement dans la colonne

– Grande reproductibilité

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2-6- La colonne• Généralement courtes et en acier inoxydable

– Longueur de 10 à 25 cm– Diamètre de 4 à 5 mm

• Elles sont remplies de phase stationnaire– Billes de 5 à 10 µm de diamètre– Phase liquide déposée sur des billes (silice)

• Nombre de plateaux théoriques varie de 1000 à 50000• Souvent précédée d’une colonne de garde

u

ColonneColonne Diamètre ddcc

Volume VC = VM + VS

Phase mobile (EluantPhase mobile (Eluant)) Viscosité Volume VM = Vi + Vp

Vi IntergranulaireVp Porosité (stagnation)

Vitesse d’écoulement u

Phase stationnairePhase stationnaireParticules de taille moyenne dp

Volume VS

10

Porosité de la colonne

Intergranulaire

Intragranulaire

TotaleT

mT V

V

20

2

320

)1(180

p

T

ip

dK

dK

Facteur de résistance

Perméabilité spécifique de la colonne K0

Lη

ΔPK

t

Lu

0

m

Lois de Darcy

P = Pe-Ps : perte de charge L : longueur de colonne

En général : T = i

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2-7- Les détecteurs - Termes généraux et conceptsSélectivité

– Un détecteur non sélectif réagit avec la solution qui passe dans la cellule. quand un composé est élué…– Un détecteur sélectif ne réagit pas avec la solution mais mesure une réponse due à une propriété de la

molécule de soluté (i.e. UV absorbance) Sensibilité

– Plus petit signal détectable: signal/bruit=3Domaine de linéarité

– Pente et interception

Limite de détection et de quantification– Limite de détection = la plus petite quantité d’analyte qui peut être détectée (3 fois le bruit de fond)– Limite de quantification = la plus petite concentration d’analyte, dans une certaine matrice, qui peut être

mesurée (10 fois le bruit de fond)

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Détecteur linéarité sélectivité sensibilité

UV 5 moyenne 0,5 – 1,0 ng

Indice de réfraction 4 faible 1 – 5 µg

fluorescence 2 grande 10 – 100 pg

Conductivité faible 10 – 50 ng

électrochimique 2 grande 50 – 500 pg

Spectrométrie de masse 3-4 grande 10 – 100 fg

2-7-1- Détecteur UV-VisibleDétecteur le plus utilisé en HPLC

– Rempli un nombre important de critères du détecteur idéal

• Sensibilité

• Linéarité

• Réponse pas affectée par des fluctuations de température

• Sélectif et utilisable en gradient d’élution

Mesure de l’absorbance : loi de Beer-Lambert ClI

IlogA 0

Gamme de longueurs d’onde : 210 – 850 nm

– 180 – 380 nm : lampe deutérium

– 380 – 800 nm : lampe tungstène

2-7-2- Le détecteur à barrettes de diodes• Détection à une seule ou à plusieurs • Acquisition dynamique du spectre

• Obtenir le spectre de chaque composé

• Détection simultanée à 2 (pureté)

• Soustraction de (compensation de dérive de ligne de base)

• Déconvolution des spectres

Phénomène de co-élution de pics

Analyse de pureté de pics avec un D.A.D. ( diode array détector ) : déconvolution

2-7-3- Détecteur fluorimétriqueLuminescence

– Absorption d’un photon : augmentation de l’énergie – passage de S0 à un état singulet S1 ou S2

– Perte d’énergie selon différents processus

• Luminescence (état excité à état fondamental)

– Photoluminescence lorsque la lumière est source d’excitation

• Fluorescence

– Energie absorbée est distribuée en niveau de rotation et vibration

– Retour à l’état fondamental sans émission de lumière : relaxation

– Puis émission d’énergie

• phosphorescence

Emission se fait à supérieur

LampeSpectre entre 200 et 900 nm

Monochromateur à réseau concave

diffracte la lumière vers la cellule

Lentille et miroir focalisent et dirigent

la lumière vers le réseau d’émission

Cellule en quartz

Monochromateur disperse la lumière émise et la dirige

vers le photomultiplicateur

La lumière est collectée à angle

droit et focalisée par la lentille

Photocathode qui convertit les photons

en électrons

Photodiode mesure le spectre d’émission

3- La chromatographie d’adsorption

• Phase stationnaire solide

– Silice ou alumine

• Phase mobile

– Caractérisée par la force éluante ε0 : énergie d’adsorption du solvant par unité de surface

– ε0 pour l’alumine (ε0silice = 80% ε0

alumine)

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BAk 0ln Solvant ε0

Toluène 0,29

Ether éthylique 0,38

Chloroforme 0,40

Dioxane 0,56

Tetrahydrofurane 0,57

Acétate d’éthyle 0,58

Solvant ε0

Fluoroalcanes -0,25

Cyclohexane -0,2

n-hexane 0,01

CCl4 0,18

1-chlorobutane 0,26

Ether isopropylique

0,28

Solvant ε0

Nitrométhane 0,64

Acétonitrile 0,65

Méthanol 0,95

Éthanol 0,88

Ethylène glycol

1,11

eau élevée

Augmentation de ε0 de 0,05 unité diminue k d’un facteur compris entre 3 et 4

Ordre d’élution des composés

– Paraffines

– Oléfines

– Hydrocarbures aromatiques

– Halogénures, sulfures

– Éthers

– Dérivés nitrés

– Esters, aldéhydes, cétones

– Alcools, amines

– Sulfones

– Sulfoxydes

– Amides

– Acides carboxyliques

4- Chromatographie de partage4-1-Généralités

Peut être subdivisée en deux

– Chromatographie liquide/liquide (applications marginales)

• Phase stationnaire retenue par adsorption sur le support

– Chromatographie liquide/phase greffée (majorité des applications)

• Phase stationnaire liée chimiquement au support

Support : à base de silice

• Particules uniformes

• Particules poreuses et mécaniquement stables

• Particules de diamètre de 3, 5 ou 10 µm

• Surface entièrement hydrolysée

20

21

Les phases stationnaires (Obtenues par réaction de silanisation)• Réaction d’un chlorosilane (mono, di ou tri) avec les groupements silanols

• Monochlorosilane fournit un matériel monomérique lié à la surface par une liaison simple (liaison silyl ether)

– Les phases monomériques sont très efficaces

– Celles produits avec des di- et tri-chlorosilane sont plus robustes

• Les phases greffées sont très utilisées car elles changes la chimie de surface et donc la sélectivité

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Les phases mobiles– Classées selon leur polarité:

indice de polarité de Snyder (P’) basée sur des mesures de solubilité

de la substance étudiée dans 3 solvants

– Dioxane (accepteur de proton à faible moment dipolaire)

– Nitrométhane (accepteur de proton à moment dipolaire élevé)

– Éthanol (donneur de proton à moment dipolaire élevé)

Solvant P’Toluène 2,4

Ether éthylique 2,8

Tetrahydrofurane 4,0

Chloroforme 4,1

Ethanol 4,3

Acétate d’éthyle 4,4

Solvant P’Fluoroalcanes <-2

Cyclohexane 0,04

n-hexane 0,1

1-chlorobutane 1,0

CCl4 1,6

Ether isopropylique 2,4

Solvant P’Dioxane 4,8

Méthanol 5,1

Acétonitrile 5,8

Nitrométhane 6,0

Ethylène glycol 6,9

eau 10,2

4-2- Chromatographie à polarité de phase normale (NP)Définition: la chromatographie en phase normale utilise une phase stationnaire plus polaire que la phase mobile

– Phase stationnaire: silice greffée cyano, diol et amino– Phase mobile: hexane, chloroforme, ethylacétate

• Les analytes polaires sont retenus plus longtemps dans la colonne que les composés moins polaires

• Le groupe le plus polaire guide la rétention

CH3 : les moins retenus Aromatiques : rétention plus

forte du fait des électrons Halogènes : moment dipolaire Ether Nitro Ester Aldéhyde Cétone Alcool : liaisons

hydrogène Amine Amides Acides

la polarité du solvant augmente dans le sens de la flèche

PHASENORMAL

E

adsorbant

polaire et

très polaire

la polarité

del'échanti

llonaugment

e

24

Optimisation de la phase mobile

Différents solvants peuvent modifier la sélectivité– Utilisation de nomographe

Exemple– Élution par 92% n-pentane – 8% methylacétate

• Faible sélectivité

• Durée correcte

– Remplacement par

• 62% n-pentane 38% methylènechloride

4-3- Chromatographie à polarité de phase inversée (RP)Définition : la chromatographie en phase inverse utilise une phase

stationnaire moins polaire que la phase mobile

– Phase stationnaire est hydrophobe et liée chimiquement à un support de silice: octadecylsilyl (C18), octylsilyl (C8) et C4

– Phase mobile: eau, acétonitrile, méthanol, THF, tampons

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la polarité du solvant augmente dans le sens de la flèche

PHASEINVERSÉE

adsorbantpeu

polaire

la polarité de

l'échantillon

augmente

L’eau est le solvant le plus faible car il est le plus polaire

- repousse les analytes hydrophobes vers la phase stationnaire

- les temps d’analyse sont longs

Le modificateur est moins polaire que l’eau

- l’analyte est moins repoussé vers la phase stationnaire

- temps de rétention plus faible

Plus on ajoute de modificateur plus les temps de rétention sont courts

Changer le modificateur change la sélectivité et la rétention (changement de polarité)

Changer le modificateur change la sélectivité et la rétention (changement de polarité)

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Utilisation d’un nomographe

– Permet de sélectionner un autre solvant

– Pour une durée d’élution à peu près identique( isoéluotropique)

– Pour une sélectivité différente

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Rétention en chromatographie de phase inverse

Le caractère hydrophobe est le premier indicateur d’une rétention– le caractère hydrophobe s’exprime par

log P (partition entre eau – octanol) – plus log P est grand plus le composé est hydrophobe

L’ordre d’élution est gouverné par la solubilité et le nombre d’atome de carbone– moins le composé est soluble, plus la rétention est grande– la rétention augmente avec le nombre d’atomes de carbone– les composés ramifiés sont élués plus rapidement que leurs isomères linéaires– les insaturations diminuent la rétention

L’ordre général d’élution est:– les espèces ioniques sont élués avec les volumes vides– acides forts– acides faibles– bases faibles – dipôles permanents – dipôles induits – aliphatiques

Rétention croissante

Solubilité dans l’eau croissante

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5- Les modes de travailMode isocratique

– la composition de la phase mobile reste inchangée

– Certains problèmes peuvent survenir• grande diversité de polarité des analytes• temps d’élution long• mauvaise sensibilité pour les composés

très retenus car les pics sont larges• possibilité de rétention irréversibles

conduisant à des contaminationsMode à gradient d’élution

– la composition de la phase mobile change au cours de l’analyse

– la composition initiale est choisie pour séparer les composés les plus rapidement élués

– la force d’élution est augmentée pour éluer les composés avec une sélectivité optimum

– la composition finale est choisie pour éluer l’ensemble des composés dignes d’intérêt

– il est possible d’augment la force éluante pour éliminer les composés très retenus pouvant conduire à des contaminations

  Phase normale ( LC-NP) Phase inverse (LC-RP)

Gradient d’élution

Polarité croissante de l’éluant    

Polarité décroissante de l’éluant  

 Exemple

  Hexane + proportion croissante d’acétate d’éthyle 

 Eau + proportion croissante d’acétonitrile

Ordre d’élution Les solutés les moins polaires sont les plus rapides

Les solutés les plus polaires sont les plus rapides

6- Optimisation

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L’efficacité a une grande influence sur la résolution Les paramètres ayant une influence sur l’efficacité sont

Longueur de la colonne (doubler la longueur double N) Taille des particules dP

Volume vides Débit )(

5,0.( )1

µmdscmu

popt

pdH 3min

Le meilleur moyen de modifier la rétention est dechanger la force du solvant

– une augmentation de 10% du modificateur diminue k d’un facteur 2 ou 3

– Le gain maximal de la résolution est quand k est compris entre 1 et 5

La sélectivité a une grande influence sur larésolutionLes paramètres ayant une influence sur la sélectivité sont

La phase mobile La température La phase stationnaire

Exercice d’application :Les facteurs de rétentions de 2 solutés sur une colonne C18 (L = 15 cm ; dC = 4,6 mm; = 70% )

sont respectivement 0,96 et 1,07 ; La phase mobile est un mélange H2O/MeOH 40/60 ; Le temps mort est tm = 2,3 min

On décide de doubler la longueur de colonne en conservant le même débit ; A ) Déterminer :- Le volume mort de la colonne - Les temps de rétention et le temps mort du système- Les facteurs de rétention

B ) Comment vont évoluer les paramètres suivant :- La sélectivité- L’efficacité- La résolution

7- La chromatographie de surface ou planaire• Elle peut se faire

– Sur papier

– Sur couche mince (plaque d’aluminium ou de verre sur laquelle est déposée la phase stationnaire)

• Elle exploite les phénomènes:

– D’adsorption

– De partage

– D’échange d’ions

• La phase stationnaire

– Silice, alumine, cellulose

– Plus un composé est polaire plus il sera fortement adsorbé

• La phase mobile

– Solvants plus ou moins polaires purs ou en mélange

– Plus l’éluant est polaire plus les composés se déplacent rapidement

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CCM (Chromatographie sur Couche Mince)

Principe: adsorption– La phase stationnaire solide est fixée sur un support adsorbant inerte.

– La phase mobile, non miscible avec la phase stationnaire, migre par capillarité.

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Révélation– UV

– Diiode, permanganate, ou autres réactifs chimiques spécifiques

• Rapport frontal Rf

• Résolution R

• Efficacité N

)1(distance

distance toujours

H

h

solvantleparparcourue

solutéleparparcourueRf i

12

122

hhR

hi

H2

16

i

ihN