6. Chromatographie (LC: Flüssigchromatographie) · 2 6.1 Einführung 6.2 Definition 6.3 Prinzip der Chromatographie 6.4 Systematik der Chromatographie 6.5 Das Chromatogramm und seine

1

6. Chromatographie

(LC: Flüssigchromatographie)

Analytische Chemie 2016/18

M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie

2

6.1 Einführung

6.2 Definition

6.3 Prinzip der Chromatographie

6.4 Systematik der Chromatographie

6.5 Das Chromatogramm und seine Aussagen

6.6 Das Chromatogramm - quantitativ

6.7 Das Chromatogramm - Parameter

6.8 Das Chromatogramm – Formeln

6.9 Bandenverbreiterung innerhalb der Säule

6.10 Partikelgröße vs. Trennstufenhöhe H [µm]

6.11 Partikelgrößenverteilung von 3 µm-Material

6.12 Chemische Modifizierung von Trennphasen


6. Chromatographie - Gliederung

3

6.1. Einführung

• Cvet, Farbenlehre,

• Synonym,

• Kryptonym, Krypta

• Farbe, chroma,

• “Boot-Rennen”


6. Chromatographie

4

⎜ 1906 Chromatographie

◊ Cbet (Tswett):

◊ russ.Botaniker;


5

6.1. Einführung

• “Boot-Rennen” der Chromatographie


6. Chromatographie

6

6.1. Einführung

cstationär K cmobil

K: Verteilungskoeffizient

cstationär : Konzentration einer Substanz in der stationären Phase

cmobil : Konzentration einer Substanz in der mobilen Phase


6. Chromatographie

7

6.1 Einführung


8

6.1 Einführung


9

6.2. Definition

• Ist ein Trennprozeß, bei dem das Probengemisch

zwischen 2 Phasen im chromatographischen Bett

(Trennsäule oder Ebene) verteilt wird.

• Die eine Hilfsphase - die stationäre Phase - ruht.

• Die andere Hilfsphase - die mobile Phase - strömt

daran im chromatographischen Bett vorbei.


6. Chromatographie

10

Proben-

aufgabe

Substanz 1

Substanz 2

Stat. Phase

Mob. Phase(Eluent)

Sign

al

t1 t2 tSubstanz 1t3 tSubstanz 2

ChromatogrammZeit

Detektion der Substanzen (Peaks)

Säule

Detek-tor

Detek-tor

Detek-tor


6.3 Prinzip der Chromatographie

11

Trennmethoden: Elektrophorese

Chromatographie

Chromatographie: LC - SFC - GC

LC: Säulenchromatograph.: HPLC, BioLC

Planarchromatographie: PC, DC, TLC


6.4 Systematik in der Chromatographie

12

Proben-aufgabe

t0 tR1 t R2

t0 Totzeit einer nicht retardierten Substanz S0

tR1 Retentionszeit der Substanz S1

tR2 Retentionszeit der Substanz S2

S0

S1

S2

Chromatogramm( qualitativ )

Signal

Retentionsszeitt R


6.5 Das Chromatogramm und seine Aussagen

13

Proben-aufgabe

h0 h1 h2

S0

S1

S2

A0 A1 A2

Signal

Zeit


6.6 Das Chromatogramm - quantitativ

14

Peakhöhe h

a b

Peakbreite

Peakbasisbreite wb

Tangenten

in halber Höhe

wh


6.7 Das Chromatogramm - Parameter

15

RR : Chromatographische Auflösung

α : Selektivität

N : Trennstufenzahl

k´ : Kapazitätsfaktor

14

( α - 1 ) Nk´

1 + k´

N

k´ α 2

k 1́

tR - t0

t0

k´

tR

σ

2

2 LH

6.8 Das Chromatogramm: Formeln

16

1. Ursache : Eddy-Diffusion (Streudiffusion)

Sieb Partikel Säule Mobile Phasestationäre Phase

ideal

real

Peakprofil zu Beginnder Trennung

Peakprofil nach der Trennung


17

2. Ursache : Strömungsverteilung

Partikel

Partikel

3. Ursache : Diffusion der Probemoleküle in der mobilen Phase

4. Ursache : Stoffaustausch zwischen mobiler " stagnierender mobiler " und " stationärer " Phase


18

Van-Deemter-Gleichung

H(HETP) A + Bu + C u

H : Bodenhöhe ( "high equivalent to a theoretical plate", HETP )

u : lineare Strömungsgeschwindigkeit

A : Eddy-Diffusion (Streudiffusion) + Strömungsverteilung

B : Längsdiffusion

C : Stoffaustauschphänomene



19

Van-Deemter-Kurve

H [µm]

u[cm/min]

A Bandenverbreiterung durch Eddy-Diffusion und Strömungsverteilung

A

B Bandenverbreiterung durch Längsdiffusion

B

C Bandenverbreiterung durch Stoffaustauschphänomene

C

Resultierende H-u-Kurve, Van-Deemter-Kurve

uoptimal

Hmin


20

10

20

30

40

50

60Tr

enns

tufe

nhöh

e H

(µm

)

Flußrate F (ml/min)Lineare Geschwindigkeit u (cm/s)

1,0

20 µm

10 µm

5 µm

3 µm

6.10 Partikelgröße vs. Trennstufenhöhe H [µm]

21

1 2 3 4 5 6

10

50

90

dp 90

dp 50dp 10

Korngröße (µm)

Teilc

hgrö

ßenv

erte

ilung

(%)

6.11 Partikelgrößenverteilung von 3µm-Material

22

OH + HOSi R OR + H OSi 2

1. Veresterung mit Alkohol

OH + SOClSi Cl + SO + HClSi 2

Cl + H NSi R NH R + HClSi

2

2

2. Umsetzung mit Thionylchlorid / Aminen



23

3. Umsetzung mit Chlorsilanen

OH + Cl SiSi R

CH 3

CH 3

O SiSi R + HCl

CH 3

CH 3



24

Funktionelle Gruppen am Silicagel

Octadecyl (ODS, C18)

Octyl

Hexyl

Trimethyl

Phenyl

Dimethylamino

Aminopropyl

Nitro

Nitril

Alkylnitril

Hydroxyl (Diol)

25

6.A

Säulenfüll-Apparatur,

HPLC-Apparatur


6. Chromatographie

26

Säulenfüllapparatur

Druckflüssigkeit

Pumpe(600 bar)

Slurry

Trennsäule/H

auptsäuleV S

N S

Waste

Filter

27

HPLC-Apparatur

Elutionsmittel-vorratsgefäß

He

Pumpe

Probenaufgabe

Inje

ktor

Vors

äule

Hau

ptsä

ule

Dämpfung

Manometer

Filter

Detektor 1

IntegratorPC

Chromatogramm

Fraktionssammler

Waste

Detektor 2

IntegratorPC

Chromatogramm


28

HPLC-Injektionsventil

1 2

3

45

6

EinlaßHochruck- Pumpe

Säule

Prob

esch

leife

Auslaß

Normaldruck

A : Füllen der Probeschleife bei Normaldruck

1 2

3

45

6

Hochruck- Pumpe

Säule

Prob

esch

leife

Normaldruck

Hochruck

B : Injektion der Probe auf die Säule unter Hochdruck


29

Mikrodurchflußküvette eines HPLC-Detektors

: 1mm

Säuleneluat

Kapillare

Küvettenablauf

: 0,15 mm

Kapillare: 0,5 mm

1cm d:

Küvetten-fenster

Küvetten-fenster

UV-LichtEm

pfängerAbsorptionPeak


30

Funktion einer Doppelkolbenpumpe in der HPLC

Dic

htun

g

Dichtung

Einlaßventil

Ven

tilku

geln

Kolben

Dichtung

Dichtung

Saphir

Dic

htun

g

Dichtung

Auslaßventil

Kolben

Dichtung

Dichtung

Saphir


31

Isokratische Elution und binäre Gradienten

10 20 30 40 50 60

10

50

100

Zeit (min)

Ace

toni

trilg

ehal

t(%)

isokratisch (z.B. ACN / Wasser 90:10)

stufenförmig

Gra

dien

tenv

erlä

ufe

konvex

konkav

linear

32

Flüssig-Chromatographie

Klassische Säulenflüssig-Flüssigchromatographie LC

Hochleistungsflüssig-chromatographie HPLC

Tswett 1906, Trennungvon Pflanzenfarbstoffen

Säulen 1m x 3 cm, Meter / cm-Bereich

25 cm x 4,6 mm(cm / mm-Bereich)

Korngrößed. Füllung

100- 200 µmoberer µm-Bereich

3-10 µmunterer µm-Bereich

Eluentför-derung

Hydrostatisch,Schlauchpumpe bismax 0,5 MPa (5 bar)

Hochdruckpumpen,1- max. 20 MPa

Säulen-material

Glas Stahl, gehärtetes Glas

StationärePhasen

Silikagel, Aluminium-oxid

Silikagel, Polymere

1965 / 68,HPLC


33

Flüssig-Chromatographie

Säulenfüll-druck

Hydrostatisch, wenige bar

40 - 80 MPa: Silikagel10-120 bar : Polymere

Säulenvor-druck

ca. 1 bar 20 - max. 200 bar

Flußrate

Analysenzeit Stundenbereich Minuten-(Sekunden)Bereich

Probemenge Gramm-Bereich Mikrogamm-Bereich

Bodenzahl 1-100 5000 -100 000

Anzahl derPeaks

2-10 5-50

mehrere ml / Stunde ml / min

Klassische Säulenflüssig-Flüssigchromatographie LC

Hochleistungsflüssig-chromatographie HPLC


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