Il ciclo di Krebs e

la fosforilazione ossidativa

La respirazione cellulare

• Sono i processi molecolari in cui è coinvolto il consumo di O2 e la formazione di CO2 e H2O da parte della cellula.

• E’ suddivisa in 3 fasi:

• Fase 1: Produzione di acetil-CoA da parte di aminoacidi, acidi grassi e carboidrati

• Fase 2: Ossidazione dell’acetil-CoA (Ciclo di Krebs)

• Fase 3: Trasferimento degli elettroni e fosforilazione ossidativa (Catena respiratoria)

Il mitocondrio • Sono presenti 2 membrane: - membrana esterna che circonda

tutto l’organello - membrana interna con numerosi ripiegamenti, le creste. • Il compartimento interno, la

matrice, è una soluzione acquosa che contiene un’elevata concentrazione di enzimi e intermedi coinvolti nel metabolismo energetico.

• Sono i più importanti produttori di ATP

• Si riproducono per divisione di un mitocondrio preesistente

• Contengono DNA che codifica per alcune proteine specifiche della membrana mitocondriale interna.

Ciclo di Krebs (ciclo degli acidi tricarbossilici o dell’acido citrico)

• Processo ossidativo centrale della respirazione attraverso cui tutti i combustibili metabolici sono catabolizzati nei tessuti

• E’ localizzato nei mitocondri • E’ costituito da 8 tappe • Si possono distinguere due fasi: - ossidazione di 2 atomi di C a CO2 (dalla reazione 1 alla 4) - rigenerazione dell’ossalacetato (dalla reazione 5 alla 8) • 3 tappe sono irreversibili: - Formazione del citrato - Ossidazione dell’isocitrato - Ossidazione dell’α-chetoglutarato Sono tappe fortemente esoergoniche

• E’ una via anfibolica: entra sia nei processi anabolici sia in

quelli catabolici

Ciclo di Krebs

• Un gruppo acetilico, sotto forma di acetil-CoA (2 atomi di C), è introdotto nel ciclo, combinandosi con l’ossalacetato.

• 2 atomi di C escono dal ciclo sotto forma di CO2

a livello dell’ossidazione dell’isocitrato e dell’α-chetoglutarato.

• Alla fine del ciclo si

rigenera ossalacetato.

1.Formazione del

citrato Enzima: citrato

sintasi. La reazione è

fortemente esoergonica.

2. Formazione

dell’isocitrato attraverso il cis-aconitato. Enzima: aconitasi. La reazione è

reversibile

Reazioni del ciclo di Krebs: fase ossidativa

o

4. Ossidazione dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA e CO2. Enzima: complesso dell’α-chetoglutarato deidrogenasi. Sono reazioni essenzialmente irreversibili nella cellula. La decarbossilazione ossidativa determina la liberazione di CO2 e la riduzione di NAD+ a NADH.

3. Ossidazione dell’isocitrato ad α-chetoglutarato e CO2. Enzima: isocitrato deidrogenasi

Fase rigenerativa 5. Conversione del succinil-CoA a succinato Enzima: succinil-CoA sintetasi L’energia rilasciata dalla rottura del tioestere viene utilizzata per la sintesi di GTP, che può donare il suo gruppo fosforico a ADP per formare ATP, reazione catalizzata dalla nucleoside difosfato chinasi 6. Ossidazione del succinato a fumarato Enzima: succinato deidrogenasi (legata alla membrana). Gli elettroni passano dal FAD alla catena di trasporto degli elettroni della membrana mitocondriale interna.

7. Idratazione del fumarato per produrre malato

Enzima: fumarasi L’enzima è altamente

specifico e reagisce solo con il fumarato e non il suo isomero trans, il maleato.

8. Ossidazione del malato ad ossalacetato.

Enzima: malato deidrogenasi Una molecola di NAD+ viene

ridotta a NADH. Nonostante il ΔG della reazione sia positivo, l’equilibrio è spostato verso i prodotti grazie alla continua rimozione dell’ossalacetato.

Bilancio energetico del ciclo di Krebs • Nel ciclo di Krebs, l’energia

rilasciata dall’ossidazione di una molecola di acetil-CoA viene conservata riducendo contemporaneamente i trasportatori di elettroni NAD e FAD rispettivamente a NADH e FADH2 e producendo una molecola di ATP

• → rendimento totale di una molecola di Acetil-CoA= 3NADH + FADH2 + GTP = 10 ATP

CH3CO-CoA + 3H2O + 3NAD+ + GDP + FAD + Pi → 2CO2 + CoASH+ 3NADH + 3H+ + GTP + FADH2

Ossidazione di una molecola di glucosio

• Il rendimento del processo di ossidazione di una molecola di glucosio e` del 40% rispetto alla quantità di energia ricavabile dall’ossidazione completa di una molecola di glucosio (1160kj su 2840kj per mole di glucosio).

• Il rimanente 60% è utilizzato per la produzione di calore corporeo e per far si’ che la reazione proceda nel senso indicato.

Bilancio netto in ATP:

• Glicolisi: 4ATP+ 2NADH (2.5x2 ATP)-2ATP= 7

• Piruvato acetil-CoA: 2NADH (2.5 x 2)= 5

• Ciclo di Krebs: 6NADH (2.5x6) + 2 FADH2 (1.5 x 2) +2 GTP= 20 ATP

Totale= 32 ATP

Componenti del ciclo di krebs • Il ciclo di Krebs è il

cuore del metabolismo intermedio.

• E’ una via anfibolica:

• Catabolismo dei carboidrati, degli acidi grassi e degli aminoacidi

• Gli intermedi sono precursori per molte vie anaboliche.

• I composti utilizzati sono rimpiazzati mediante reazioni anaplerotiche.

(es. Carbossilazione del piruvato tramite CO2 per formare ossalacetato, catalizzata dalla piruvato carbossilasi).

Regolazione del ciclo di Krebs

Fattori che regolano la velocità del ciclo:

• disponibilità di substrato

• inibizione da accumulo di prodotti

• inibizione allosterica retroattiva (a feedback) dei primi enzimi del ciclo da parte degli ultimi intermedi

Regolazione del ciclo di Krebs

Tre tappe fortemente esoergoniche catalizzate da:

• Citrato sintasi • Isocitrato deidrognasi • α-chetoglutarato deidrogenasi

• NADH: ↓ le deidrogenasi • Accumulo di prodotti: ↓ delle

tre reazioni • ATP: ↓ citrato sintasi e

isocitrato deidrogenasi • ADP: ↑ citrato sintasi • Ca2+: ↑ isocitrato e α-

chetoglutarato deidrogenasi

La respirazione cellulare

• Fase 1: Produzione di acetil-CoA da parte di aminoacidi, acidi grassi e carboidrati

• Fase 2: Ossidazione dell’acetil-CoA (Ciclo di Krebs)

• Fase 3: Trasferimento degli elettroni (Catena respiratoria) e fosforilazione ossidativa

La Fosforilazione Ossidativa

• E’ la sintesi di ATP guidata dal trasferimento di elettroni all’ossigeno.

• Determina la riduzione dell’ossigeno molecolare ad acqua.

• Gli elettroni sono forniti da NADH e FADH2 (sotto forma di ioni idruro H-).

• Avviene nei mitocondri

Il flusso elettronico mitocondrile

• La membrana mitocondriale esterna è permeabile a piccole molecole e ioni grazie alla presenza di numerosi canali costituiti dalla proteina porina.

• La membrana mitocondriale interna è impermeabile a quasi tutti gli ioni e piccole molecole compresi i protoni; le specie chimiche che possiedono uno specifico trasportatore sono in grado di attraversare la membrana.

• In questa struttura sono localizzati la CATENA RESPIRATORIA e IL COMPLESSO ENZIMATICO CHE SINTETIZZA ATP

La Teoria Chemiosmotica di P. Mitchell (1961): Trasduzione di energia

attraverso gradienti protonici transmembrana

• La fosforilazione ossidativa è un flusso di elettroni attraverso intermedi proteici redox, trasportatori legati alla membrana mitocondriale che comprendono chinoni, citocromi e proteine ferro-zolfo.

• L’energia libera resa disponibile da questo flusso esoergonico di elettroni è accoppiata al trasporto endoergonico di protoni (H+) attraverso una membrana impermeabile ai protoni (la membrana mitocondriale interna); questo trasporto crea un potenziale elettrochimico (forza motrice protonica, differenza di concentrazione di protoni e di carica).

• Il flusso transmembrana di protoni in senso inverso, mediato da specifici canali protonici, fornisce l’energia libera per la sintesi di ATP.

Teoria chemiosmotica

La catena respiratoria • Gli elettroni sono incanalati in trasportatori di elettroni

universali (NADH) che interagiscono con la catena respiratoria.

• La catena respiratoria è costituita da una serie di trasportatori di elettroni, la maggior parte dei quali sono proteine integrali di membrana contenenti gruppi prostetici in grado di accettare e di donare uno o due elettroni.

•Ogni componente della catena può accettare elettroni dal trasportatore che lo precede e trasferirli a quello che lo segue, generando una sequenza specifica.

NADH + H+ + ½O2 →H2O + NAD+

Trasportatori di elettroni della catena respiratoria

• NAD • FAD/FMN • Ubichinone (coenzima Q): è una moleocola di piccole

dimensioni, lipofila, che diffonde liberamente attraverso la membrana e può agire da ponte tra trasportatori di elettroni meno mobili.

• Citocromi: sono proteine contenenti ferro che trasferiscono gli elettroni localizzati nella membrana interna. L’atomo di ferro è localizzato nel gruppo eme.

• Proteine ferro-zolfo: il ferro è associato ad atomi di zolfo di residui di cisteina della proteina; trasferiscono un elettrone per volta

Trasferimento di elettroni • Nella catena respiratoria i trasportatori sono organizzati in 4

complessi e gli elettroni sono trasferiti da un complesso all’altro. • Complesso I (NADH deidrogenasi): dal NADH all’ubichinone→ gli

elettroni vengono ceduti dal NADH al gruppo FMN e poi ai centri Fe-S del complesso I che li trasferisce all’ubichinone, determinando uno spostamento di protoni dalla matrice allo spazio intermembrana.

• Complesso II (succinato deidrogenasi): dal succinato all’ubichinone → gli elettroni vengono trasferiti dal succinato all’ubichinone dalla succinato deidrogenasi, l’unico enzima del ciclo di Krebs legato alla membrana mitocondriale.

• Complesso III : da ubichinone a citocromo c→ l’ubichinone-citocromo c ossidoreduttasi catalizza il trasferimento di elettroni dall’ubichinone al citocromo c rilasciando protoni nello spazio intermembrana.

Complesso IV: riduzione dell’O2→ il complesso enzimatico della citocromo ossidasi trasferisce elettroni dal citocromo c all’O2 che viene ridotto ad acqua e contemporaneamente pompa protoni nello spazio intermembrana.

Sintesi di ATP: fosforilazione di ADP

• Il trasferimento di elettroni lungo la catena respiratoria è accompagnato da un pompaggio di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna che porta ad una differenza di concentrazione di protoni.

Il gradiente elettrochimico (forza motrice protonica) generato rappresenta la conservazione di parte dell’energia liberata dalle ossidazioni. La forza motrice protonica viene utilizzata per la sintesi di ATP catalizzata dall’ATP sintasi.

ATP sintasi • L’ATP sintasi è un

complesso enzimatico formato da due componenti principali, la porzione di membrana F0 e l’unità F1 che sintetizza ATP ed è costituita da varie subunità. Le due unità formano il canale attraverso cui si genera il flusso di protoni dallo spazio intermembrana alla matrice mitocondriale.

Meccanismo di sintesi dell’ATP • Nell’unità F1 l’enzima possiede tre siti di legame dei nucleotidi

adeninici tra loro equivalenti. • In un dato momento uno dei tre siti è nella conformazione T

(legame forte), un altro è nella conformazione L (legame debole) e il terzo è nella conformazione O (aperto o vuoto, legame molto debole).

• All’inizio di un ciclo catalitico una molecola di ATP è legata al sito T mentre il sito L lega ADP + Pi.

• La forza motrice protonica, passando attraverso il canale, determina emissione di energia che altera la conformazione: il sito T si converte nel sito O con dissociazione di ATP e il sito L in T dove ADP e Pi si convertono in ATP.

• Il sito O diventa sito L e lega anche se debolmente ADP e Pi. • Il ciclo ricomincia con il canale ruotato di una subunità. • L’ATP non può essere rilasciato da un sito se ad un altro sito non vi

sono legati ADP + Pi.

Regolazione della fosforilazione ossidativa

• La velocità della fosforilazione ossidativa è regolata dal rapporto [ATP]/[ADP].

• Questo rapporto è normalmente molto elevato ([ATP] > [ADP]).

• Quando all’interno della cellula la velocità di qualche processo che richiede energia, e che quindi consuma elevate quantità di ATP, tende ad aumentare, il rapporto diminuisce per un aumento della concentrazione di ADP.

• Avendo a disposizione più ADP la velocità della fosforilazione ossidativa aumenta, determinando la rigenerazione di ATP.

La produzione di calore • I mitocondri del grasso bruno (presente nel neonato

e nei mammiferi che vanno in letargo) utilizzano ATP per produrre calore.

• La membrana interna di questi mitocondri contiene una proteina chiamata termogenina o proteina disaccoppiante. Questa proteina genera una via di ritorno dei protoni nella matrice senza dover attraversare l’ATP sintasi.

• Per effetto di questo cortocircuito, l’energia prodotta dalle ossidazione non viene conservata sotto forma di ATP ma dissipata come calore, che contribuisce a mantenere la temperatura del corpo.

Quesiti: 1) Quale è la funzione del ciclo di Krebs? Dove avviene e quale è il prodotto di partenza e di

arrivo del ciclo?

2) In quali fasi può essere suddiviso il ciclo Krebs e quali sono gli enzimi chiave del ciclo?

3) Quali sono i fattori che regolano la velocità del ciclo di Krebs?

4) Perché è considerato una via anfibolica?

5) Quale è il significato delle reazioni anaplerotiche? Fare almeno un esempio di tali reazioni

6) Quale funzione hanno Catena respiratoria e fosforilazione ossidativa

7) Quali sono i principali trasportatori di elettroni nella catena respiratoria

8) Come avviene la produzione di ATP nel processo di fosforilazione ossidativa? Quale è

l’enzima chiave e quali sono i fattori che stimolano la produzione di ATP?

9) Quali sono le caratteristiche del grasso bruno?